CN111057735B

CN111057735B - 一种解淀粉芽孢杆菌酯酶在拆分N-BOC-DL-α-氨基丁酸甲酯中的应用

Info

Publication number: CN111057735B
Application number: CN202010008780.XA
Authority: CN
Inventors: 郑建永; 李琪; 汪钊; 章银军
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2020-01-06
Filing date: 2020-01-06
Publication date: 2021-10-15
Anticipated expiration: 2040-01-06
Also published as: CN111057735A

Abstract

本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌酯酶在拆分N‑BOC‑DL‑α‑氨基丁酸甲酯制备N‑BOC‑L‑α‑氨基丁酸甲酯的应用，所述解淀粉芽孢杆菌酯酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，以发酵培养获得的湿菌体经冷冻干燥后得到的冻干菌体为催化剂，外消旋N‑BOC‑α‑氨基丁酸甲酯为底物，以pH7.5磷酸缓冲溶液为反应介质，在20‑60℃、1000rpm条件下进行拆分制备N‑BOC‑L‑α‑氨基丁酸甲酯，对映体过量值>99％，N‑BOC‑L‑α‑氨基丁酸甲酯的质量收率达到95.6％。

Description

一种解淀粉芽孢杆菌酯酶在拆分N-BOC-DL-α-氨基丁酸甲酯中的应用

(一)技术领域

本发明属于生物酶催化领域，涉及一种酯酶立体选择性催化水解外消旋N-BOC-α-氨基丁酸甲酯对映体合成单一构型N-BOC-L-α-氨基丁酸甲酯的应用。

(二)背景技术

α-氨基丁酸(L-α-aminobutyric acid,ABA)是一种非天然手性氨基酸，具有很高的药理学意义，不仅能够抑制人体神经信息传递、加强葡萄糖磷酸酯酶的活性以及促进脑细胞代谢，还是重要的医药与化工原料的中间体。L-α-氨基丁酸及其衍生物(S)-2-氨基丁酰胺、(S)-2-氨基丁醇是多个手性药物(如抑菌抗结核药乙胺丁醇盐酸盐、新型抗癫痫药物左乙拉西坦和布瓦西坦、内皮素拮抗因子和连氮丝菌素类抗生素等)的关键中间体，在制药工业中应用广泛。现今制药产业中，如果具有手性结构的药物分子要应用到市场中则必须对不同手性的药物分子性质研究清楚，这些药物的光学纯度对于治疗的安全性及效率显得至关重要，如R型的左乙拉西坦没有抗癫痫活性，(R,R)型的乙胺丁醇会导致失明。随着药物市场的不断发展，一些关键性药物市场普及程度提高，对于手性药物中间体的需求也将日益扩大，目前L-α-氨基丁酸的制备已成为研究热点，因此需要寻求更加高效廉价并对环境污染少可持续的L-α-氨基丁酸合成工艺。

文献报道的制备L-α-氨基丁酸的主要方法包括化学法和生物法。化学法分化学合成法(有脱硫反应法、α-卤代酸的氨解法、丁酮酸还原法(外消旋)和氨化水解反应法)和化学拆分法。综合以上几种化学方法可知在这些工艺途径中均存在着反应环境苛刻、条件复杂、有副产物生成、产物纯度不高且化学毒性物质对环境不友好等问题，不利于工业化生产。生物法分为生物酶法和生物发酵法，生物酶法催化制备手性氨基酸避免了化学法存在的大部分缺点，具有立体选择性高、反应条件温和、生产成本低、污染少等优点，慢慢取代一些化学法成为新的发展方向。N-BOC-L-α-氨基丁酸甲酯是一种重要的生化试剂，用于合成多肽或模拟肽和保护氨基酸单体，N-BOC-L-α-氨基丁酸甲酯可以通过简单的化学水解获得L-α-氨基丁酸。因此，我们提供了一种酯酶催化水解拆分N-BOC-DL-α-氨基丁酸甲酯来高效生产N-BOC-L-α-氨基丁酸甲酯的有效方法，该反应条件温和无毒性、催化剂易得成本低、光学纯度和转化率高，对其进一步的工业生产应用奠定了坚实的实验基础。

(三)发明内容

本发明目的是为了解决现有方法的不足，通过筛选产酯酶微生物，提供一种廉价高效的立体选择性酯酶在生物法拆分N-BOC-DL-α-氨基丁酸甲酯制备N-BOC-L-α-氨基丁酸甲酯中的应用。本发明利用新筛选的酯酶催化立体选择性水解反应拆分制备高光学纯度的N-BOC-L-α-氨基丁酸甲酯，催化剂易得成本低，ee值和转化率高，路线短操作简便，开发成本低廉、适合产业化放大工艺路线，具有很大的社会意义和经济价值。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种解淀粉芽孢杆菌酯酶在拆分N-BOC-DL-α-氨基丁酸甲酯制备N-BOC-L-α-氨基丁酸甲酯中的应用(如图1所示)，所述酯酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述酯酶编码基因核苷酸序列为SEQ ID NO.2所示。

本发明所述应用的具体方法为：将含解淀粉芽孢杆菌酯酶基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体冷冻干燥后得到的粗酶粉为催化剂，以外消旋N-BOC-DL-α-氨基丁酸甲酯为底物，以pH7.5磷酸缓冲溶液为反应溶剂，在20-60℃、600-1000rpm条件下进行拆分反应，反应完全后，将反应液分离纯化，制备获得N-BOC-L-α-氨基丁酸甲酯。所述催化剂用量以缓冲液体积计为10g/L-200g/L(优选50g/L)，所述底物体积用量以缓冲液体积计为1％-20％(V/V)(优选10％)。

进一步，优选反应时间为10min-360min，更优选反应条件为45℃、1000rpm反应120min。

进一步，所述缓冲液为pH 7.5，0.2mM的Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲溶液。

进一步，所述催化剂按如下方法制备：将含解淀粉芽孢杆菌酯酶编码基因的工程菌(优选大肠杆菌BL21)接种在LB培养基中，37℃培养OD₆₀₀至为0.4-0.6，加IPTG至终浓度0.02mM，30℃培养10-12h，菌液8000rpm，4℃离心10min，收集菌体，再用PBS缓冲液洗涤菌体2次，8000rpm，4℃离心10min，收集菌体，冻干(优选真空冷冻干燥机在冷阱-80℃，真空度20Pa下冻干)，得到酯酶粗酶粉；所述LB培养基组成：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 5g/L，溶剂为去离子水，pH值自然。

进一步，本发明所述反应液分离纯化的方法为：反应结束后，反应液先用2M HCl酸化至pH 2.0，然后用等体积乙酸乙酯萃取，分液漏斗分离出有机相，再经纯水洗涤两次，饱和NaCl洗涤两次，干燥，旋蒸，得到最终产物N-BOC-L-α-氨基丁酸甲酯。

本发明所述酯酶基因源自解淀粉芽孢杆菌WZZ002(Bacillusamyloliquefaciens)WZZ002，该菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC NO.M 2013366，保藏日期2013年8月8日，地址：中国武汉，武汉大学，430072，已在先前申请专利(中国专利CN104212738A)中提交了相关菌种保藏信息并披露了其遗传资源来源。本发明从解淀粉芽孢杆菌WZZ002出发，提取其全基因组，根据NCBI查得的解淀粉芽孢杆菌基因组GenBank：QEY94963.1碱基序列，设计上游引物和下游引物，进行PCR，得到碱基基因序列，测序结果为SEQ ID NO.2片段。

上游引物为：

5'-AAGAAGGAGATATACCATGGATGACAAAACTTACCGTTCAAACCCGCT-3'

下游引物为：

5'-TGTCGACGGAGCTCGAATTCTGCTTGAAACAGGATGCGGCGT-3'。

本发明所述酯酶的编码基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：

ATGACAAAACTTACCGTTCAAACCCGCTGCGGCGCACTGAAAGGAACTGCCGGCCGCGGTGCCCGCACATGGAAGGGCATACCGTACGCGAAGCCGCCCGTCGGAGAGCTGAGATTTAAAGCGCCGGAGCCGCCCGCACCTTGGGACGGCATAAAACATGCCGATTCGTTCGGGCCGATTTGTCCGCAGCCGGATGATATGCTGTCCATATCGTTTTCCGGAGATATACCGCCTCAATCTGAAGATTGCCTTTACCTCAACGTTTTCGCCCCCGATTCAGAGGGCGAAAAAAAGCCTGTCATGGTATGGATACACGGCGGGGCATTTTATTTAGGTGCCGGAAGCGAACCGCTTTACGACGGATCTGCCCTTGCCGCTGACGGAGATGTCATTGTCGTGACACTCAATTACAGGCTCGGACCGTTAGGCTTTTTACATTTGTCTTCTATTCATGACGCGTATTCCGCCAATATCGGGCTGCTCGATCAGATCGCCGCGCTGCGCTGGGTGAGGGACAATATCTCCGAATTTGGAGGAGACCCGGATAACGTTACGATATTTGGTGAATCGGCAGGCGGCATGAGCATCGCTGCGCTTATGGCAATGCCTGACGCAAAAGGCCTGTTTCATAAAGCCATTTTAGAAAGCGGCGCCTCTCATACGATGCCGGCGGATATGGCAAAAGACATCGCGGCGGCATTTATTCATGAAGCCGGCACTGATCAATTGCAGGAGCTTTCCGTTAATGACCTGCTTAAGACTGCGGATAAAGTGCGGCGCTCACTGGATCAAAACATTTTTCAGCTTTTGTTTCAGCCCGCCATCGATCCGGCCACATTGCCTGCTGAACCGGTGAAAGCCATAGCAGACGGGGCCGCAGAAGGCATACCTATGATCATCGGAACCAATCGTGATGAAGCATATTTGTTTTTCACCCCTGATACAGACATTCACTCCGAGAAAAAGCAGCAAGATTATTTGCATTATCACCTCGGAGAAAACTGCACCGAGCAAGCGGCAGATTTATATCCGCATTCATTAAAGGGACAAATCGATATGATGACGGATCTGATTTTCTGGCGGCCGGCTGTCGCTTTCGCACAAGGACAGTCGCAACACGCACCGGTCTGGATGTACCGCTTTGATTGGCATGGCGAAACACCGCCGTTTCATAAAGCCGTTCACGCTCTGGAATTGCCGTTTGTGTTCGGAAACTTTGATTCTTTGAGAAAGACGCTGCAAGAGCCGCTCGGTGATGACGCAGAACAGCTTTCCAAACAAATTCAATCCGCATGGCTCGCTTTTGCAAAAACCGGAAACCCGAACACCTCTCACTTCAATTGGCCTGAATATGAAACCGATTCACGCGAAACTTTGCTTTTCAACACGGATACCGCTGTCGAAAGTGATCCCGATTCAGCAAAACGCCGCATCCTGTTTCAAGCA

由于核苷酸序列的特殊性，任何SEQ ID NO.2所示多核苷酸的变体，只要其与该多核苷酸具有70％以上同源性、且具有相同的功能，均属于本发明保护范围之列。所述多核苷酸的变体是指一种具有一个或多个核苷酸改变的多核苷酸序列。此多核苷酸的变体可以是天然发生的等位变异体或非天然发生的变异体，包括取代变异体、缺失变异体和插入变异体。如本领域所知的，等位变异体是一个多核苷酸的替换形式，它可能是一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入，但不会从实质上改变其编码的氨基酸的功能。

另外，可与SEQ ID NO：2所示多核苷酸序列杂交的多核苷酸(至少具有50％同源性，优选具有70％同源性)，也在本发明保护范围之列，特别是在严格条件下可与本发明所述核苷酸序列杂交的多核苷酸。所述“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2SSC，0.1％SDS，60℃；或(2)杂交时加用变性剂，如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清，0.1％Ficoll，42℃；或(3)仅在两条序列之间的同源性至少在95％以上，更好是97％以上时才发生杂交。并且，可杂交的多核苷酸编码的蛋白与SEQ ID NO：1所示的蛋白有相同的生物学功能和活性。

本发明还涉及含有解淀粉芽孢杆菌酯酶编码基因的重组载体，以及利用所述重组载体转化得到的重组基因工程菌，所述工程菌将SEQ ID NO.2所示基因连接至载体pET-28a(+)，转化至大肠杆菌BL21感受态细胞，获得基因工程菌。

本发明酯酶氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：

MTKLTVQTRCGALKGTAGRGARTWKGIPYAKPPVGELRFKAPEPPAPWDGIKHADSFGPICPQPDDMLSISFSGDIPPQSEDCLYLNVFAPDSEGEKKPVMVWIHGGAFYLGAGSEPLYDGSALAADGDVIVVTLNYRLGPLGFLHLSSIHDAYSANIGLLDQIAALRWVRDNISEFGGDPDNVTIFGESAGGMSIAALMAMPDAKGLFHKAILESGASHTMPADMAKDIAAAFIHEAGTDQLQELSVNDLLKTADKVRRSLDQNIFQLLFQPAIDPATLPAEPVKAIADGAAEGIPMIIGTNRDEAYLFFTPDTDIHSEKKQQDYLHYHLGENCTEQAADLYPHSLKGQIDMMTDLIFWRPAVAFAQGQSQHAPVWMYRFDWHGETPPFHKAVHALELPFVFGNFDSLRKTLQEPLGDDAEQLSKQIQSAWLAFAKTGNPNTSHFNWPEYETDSRETLLFNTDTAVESDPDSAKRRILFQA

由于氨基酸序列的特殊性，任何含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的多肽的片段或其变体，如其保守性变体、生物活性片段或衍生物，只要该多肽的片段或多肽变体与前述氨基酸序列同源性在90％以上、且具有相同的酶活性，均属于本发明保护范围之列。具体的，所述改变可包括氨基酸序列中氨基酸的缺失、插入或替换；其中，对于变体的保守性改变，所替换的氨基酸具有与原氨基酸相似的结构或化学性质，如用亮氨酸替换异亮氨酸，变体也可具有非保守性改变，如用色氨酸替换甘氨酸。

本发明所述蛋白的片段、衍生物或类似物是指基本上保持本发明所述的蛋白酶相同的生物学功能或活性的蛋白，可以是下列情形：(I)一个或多个氨基酸残基被保守或非保守氨基酸残基(优选的是保守氨基酸残基)取代，并且取代的氨基酸可以是也可以不是由遗传密码子编码的；(Ⅱ)一个或多个氨基酸残基上的某个基团被其它基团取代；(Ⅲ)成熟蛋白与另一种化合物(比如延长蛋白半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合；(IV)附加的氨基酸序列融合进成熟的蛋白而形成的蛋白序列(如用来纯化此蛋白的序列或蛋白原序列)。

所述蛋白可以是重组蛋白、天然蛋白或合成蛋白，可以是纯天然纯化的产物，或是化学合成的产物，或使用重组技术从原核或真核宿主(例如：细菌、酵母、高等植物、昆虫和哺乳动物细胞)中产生。根据重组生产方案所用的宿主，本发明的蛋白可以是糖基化的。本发明的蛋白还可以包括或不包括起始的甲硫氨酸残基。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种解淀粉芽孢杆菌酯酶，该酯酶编码基因可与表达载体连接构建得到含该基因的胞内表达重组质粒，再转化至大肠杆菌菌株中，获得重组大肠杆菌，再利用重组大肠杆菌或重组酯酶为生物催化剂催化拆分N-BOC-DL-α-氨基丁酸甲酯，可以得到产物N-BOC-L-α-氨基丁酸甲酯，对映体过量值>99％和转化率达到49.75％，N-BOC-L-α-氨基丁酸甲酯的收率达到95.6％。目前现有的化学研究方法如化学合成法和化学拆分法等的转化率为20％-30％，收率一般在50％-60％。本发明得到的转化率为49.75％，比现有方法高20％-30％；质量收率为95.6％，比现有方法高30％-40％。本发明生物催化的手性合成反应具有条件温和、效率高，高度的化学选择性、区域选择性以及对映体选择性等优点，而且生物催化过程具有无毒、无污染和能耗低等特点，是一种环境友好的合成方法。

(四)附图说明

图1为酯酶对映选择性水解拆分N-BOC-DL-α-氨基丁酸甲酯的反应示意图；

图2为N-BOC-DL-α-氨基丁酸甲酯标准品的气相色谱图；

图3为N-BOC-L-α-氨基丁酸甲酯标准品的气相色谱图；

图4为酯酶催化N-BOC-DL-α-氨基丁酸甲酯水解反应50min的气相色谱图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此，本领域的普通技术人员根据这些实施方式所做出的方法上的变换均包含在本发明的保护范围内。

实施例1解淀粉芽孢杆菌WZZ002发酵，全基因组提取，酯酶基因克隆和工程菌构建

1、解淀粉芽孢杆菌WZZ002发酵条件：

斜面培养基组成：麦芽糖5g/L，牛肉膏5g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏1g/L，无水MgSO₄0.5 g/L，琼脂粉23g/L，溶剂为去离子水，pH7.0。

种子培养基组成：麦芽糖5g/L，牛肉膏5g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏1g/L，NaCl 0.5g/L，溶剂为去离子水，pH7.0。

将解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)CCTCC NO.M 2013366接种至斜面培养基，37℃培养12h，获得斜面菌种。

将斜面菌种在无菌条件下，用接种环接于50mL的种子培养基，于30℃、200rpm恒温摇床培养24h，获得解淀粉芽孢杆菌菌液。

2、解淀粉芽孢杆菌CCTCC NO.M 2013366全基因组的提取：

取1ml上述解淀粉芽孢杆菌菌液，使用全式金公司的EasyPure Bacteria GenomicDNA Kit试剂盒高效率地提取全基因组。

3、解淀粉芽孢杆菌酯酶基因的克隆：

根据NCBI查得的解淀粉芽孢杆菌基因组在GenBank：QEY94963.1碱基序列的基础上，分别设计上游引物和下游引物，以全基因组为模板，进行PCR，得到核苷酸序列为SEQ IDNO.2所示的基因片段，测序验证正确。SEQ ID NO.2所示基因片段的编码蛋白氨基酸序列为SEQ ID NO.1所示。

上游引物为：

5'-AAGAAGGAGATATACCATGGATGACAAAACTTACCGTTCAAACCCGCT-3'；

下游引物为；

5'-TGTCGACGGAGCTCGAATTCTGCTTGAAACAGGATGCGGCGT-3'。

4、大肠杆菌工程菌的构建：

将该SEQ ID NO.2所示的基因片段连接至载体pET-28a(+)，转化至大肠杆菌BL21感受态，获得含酯酶的大肠杆菌工程菌，记为大肠杆菌工程菌B3。

实施例2含酯酶的大肠杆菌工程菌B3的发酵培养

将实施例1获得的大肠杆菌工程菌B3接种在LB培养基中，37℃培养OD₆₀₀至0.5(大概培养2h)，加IPTG至终浓度0.02mM，30℃培养10-12h。300mL菌液8000rpm，4℃离心10min，收集菌体，再用PBS缓冲液洗涤菌体2次，8000rpm，离心10min，收集菌体。将收集的菌体使用真空冷冻干燥机(冷阱-80℃，真空度20Pa)冻干后得到酯酶粗酶粉，记为酯酶B3，放于4℃冰箱保存。LB培养基组成：胰蛋白胨10g/L、酵母粉5g/L、NaCl 5g/L，溶剂为去离子水，pH自然。

实施例3酶催化拆分N-BOC-DL-α-氨基丁酸甲酯的反应

称取0.05g实施例2方法制备的酯酶B3于2mL EP管中，加入1mLNa₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液(pH7.5、0.2mM)作为反应溶剂，然后加入100uL底物N-BOC-DL-α-氨基丁酸甲酯，以不加酯酶为空白对照，置于45℃，1000rpm恒温混匀仪中反应50min。反应结束后，反应液经2mMHCl酸化，再加入1mL乙酸乙酯，涡旋振荡器振荡充分萃取，离心(10000rpm，5min)，得到含有N-BOC-L-α-氨基丁酸甲酯的有机相。取700μL乙酸乙酯层通过气相色谱检测菌体的立体选择性及酶催化水解活性。

具体气相分析条件：采用Agilent7890A气相色谱仪，BGB-175手性毛细管色谱柱(30.0m×0.25mm×0.25um)，FID检测器；检测条件为柱温从初始温度110℃(恒温保持2min)升温至150℃(恒温保持2min)，升温速率2℃/min，进样温度250℃，检测器温度250℃，空气流量和氢气流量分别为300mL/min和30mL/min。载气为高纯N₂；尾吹气流量25.0mL/min；分流比30:1，进样体积为1uL。气相结果所示，N-BOC-D-α-氨基丁酸甲酯和N-BOC-L-α-氨基丁酸甲酯的保留时间分别为20.268min和20.503min(如图2所示)。

实施例4反应温度对酶动力学水解拆分N-BOC-DL-α-氨基丁酸甲酯的影响

在pH 7.5，0.2mM的Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲溶液1mL中，加入终浓度50g/L的实施例2方法制备的酯酶B3，100μL N-BOC-DL-α-氨基丁酸甲酯，于恒温混匀仪不同温度(20-60℃)，1000rpm条件下反应50min，取反应液按实施例3方法检测N-BOC-L-α-氨基丁酸甲酯的对映体过量值和转化率，结果见表1所示。

结果说明，在反应温度为45℃时，N-BOC-DL-α-氨基丁酸甲酯的对映体过量值最高，其ee值>99％。当反应温度高于45℃或者低于45℃时，催化转化率和对映体过量值都会下降，说明温度对酯酶B3的光学选择性具有很大的影响。

表1反应温度对对酶催化反应的影响

实施例5反应时间对酶动力学水解拆分N-BOC-DL-α-氨基丁酸甲酯的影响

在pH 7.5，0.2mM的Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲溶液1mL中，加入终浓度50g/L实施例2方法制备的酯酶B3，100μL N-BOC-DL-α-氨基丁酸甲酯，于恒温混匀仪45℃，1000rpm条件下反应不同时间(10min-360min)，取反应液按实施例3方法检测N-BOC-L-α-氨基丁酸甲酯的对映体过量值和转化率，结果见表2所示。

结果表明，反应120min后，产物N-BOC-L-α-氨基丁酸甲酯的对映体过量值已达到最高，对映体过量值>99％，转化率为49.75％，当反应时间大于120min，转化率增大，将导致产物N-BOC-L-α-氨基丁酸甲酯的对映体过量值降低。

表2反应时间对酶催化反应的影响

实施例6不同酯酶水解拆分N-BOC-DL-α-氨基丁酸甲酯的效果比较

在pH 7.5，0.2mM的Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲溶液1mL中，加入终浓度50g/L的不同酯酶(实施例2方法制备的酯酶B3、Novozym 435、Lipozyme TL IM、Lipozyme RM IM)，100μlN-BOC-DL-α-氨基丁酸甲酯，于恒温混匀仪45℃，1000rpm条件下反应120min，取反应液按实施例3方法检测N-BOC-L-α-氨基丁酸甲酯的对映体过量值和转化率，结果见表3所示。在45℃反应120min后，Novozym435对N-BOC-D-α-氨基丁酸甲酯构型没有水解作用，反而对N-BOC-L-α-氨基丁酸甲酯这种构型能进行一定程度水解，而TL IM、RM IM对底物的水解活性和对映体选择性不高。而当酯酶B3催化反应时，产物N-BOC-L-α-氨基丁酸甲酯的ee值>99％，转化率为49.75％，说明酯酶粗酶粉B3具有良好的立体选择性。

表3不同酯酶催化N-BOC-DL-α-氨基丁酸甲酯的拆分效果

实施例7N-BOC-L-α-氨基丁酸甲酯的分离提取

在50mL圆底烧瓶中加入10mL pH 7.5，0.2mM的Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲溶液，称取0.5g实施例3方法制备的酯酶B3，再加入终浓度10％(V/V)的N-BOC-DL-α-氨基丁酸甲酯，用200mM NaOH水溶液进行流加滴定反应，控制反应pH维持在7.5，在磁力搅拌器45℃，600rpm条件下反应120min。反应结束后，反应液先用2M HCl进行酸化至pH 2.0，然后用等体积乙酸乙酯进行萃取，分液漏斗分离出有机相，再经纯水洗涤两次，饱和NaCl洗涤两次，干燥，旋蒸，得到最终产物，并称重为0.462g，气相色谱图见图4所示，出峰时间为20.494min；N-BOC-L-α-氨基丁酸甲酯标准品的气相色谱图见图3所示，出峰时间为20.608min，结果表明产物N-BOC-L-α-氨基丁酸甲酯ee值>99％，质量收率达到95.6％。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种解淀粉芽孢杆菌酯酶在拆分N-BOC-DL-α-氨基丁酸甲酯中的应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 482

<212> PRT

<213> 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)

<400> 1

Met Thr Lys Leu Thr Val Gln Thr Arg Cys Gly Ala Leu Lys Gly Thr

1 5 10 15

Ala Gly Arg Gly Ala Arg Thr Trp Lys Gly Ile Pro Tyr Ala Lys Pro

20 25 30

Pro Val Gly Glu Leu Arg Phe Lys Ala Pro Glu Pro Pro Ala Pro Trp

35 40 45

Asp Gly Ile Lys His Ala Asp Ser Phe Gly Pro Ile Cys Pro Gln Pro

50 55 60

Asp Asp Met Leu Ser Ile Ser Phe Ser Gly Asp Ile Pro Pro Gln Ser

65 70 75 80

Glu Asp Cys Leu Tyr Leu Asn Val Phe Ala Pro Asp Ser Glu Gly Glu

85 90 95

Lys Lys Pro Val Met Val Trp Ile His Gly Gly Ala Phe Tyr Leu Gly

100 105 110

Ala Gly Ser Glu Pro Leu Tyr Asp Gly Ser Ala Leu Ala Ala Asp Gly

115 120 125

Asp Val Ile Val Val Thr Leu Asn Tyr Arg Leu Gly Pro Leu Gly Phe

130 135 140

Leu His Leu Ser Ser Ile His Asp Ala Tyr Ser Ala Asn Ile Gly Leu

145 150 155 160

Leu Asp Gln Ile Ala Ala Leu Arg Trp Val Arg Asp Asn Ile Ser Glu

165 170 175

Phe Gly Gly Asp Pro Asp Asn Val Thr Ile Phe Gly Glu Ser Ala Gly

180 185 190

Gly Met Ser Ile Ala Ala Leu Met Ala Met Pro Asp Ala Lys Gly Leu

195 200 205

Phe His Lys Ala Ile Leu Glu Ser Gly Ala Ser His Thr Met Pro Ala

210 215 220

Asp Met Ala Lys Asp Ile Ala Ala Ala Phe Ile His Glu Ala Gly Thr

225 230 235 240

Asp Gln Leu Gln Glu Leu Ser Val Asn Asp Leu Leu Lys Thr Ala Asp

245 250 255

Lys Val Arg Arg Ser Leu Asp Gln Asn Ile Phe Gln Leu Leu Phe Gln

260 265 270

Pro Ala Ile Asp Pro Ala Thr Leu Pro Ala Glu Pro Val Lys Ala Ile

275 280 285

Ala Asp Gly Ala Ala Glu Gly Ile Pro Met Ile Ile Gly Thr Asn Arg

290 295 300

Asp Glu Ala Tyr Leu Phe Phe Thr Pro Asp Thr Asp Ile His Ser Glu

305 310 315 320

Lys Lys Gln Gln Asp Tyr Leu His Tyr His Leu Gly Glu Asn Cys Thr

325 330 335

Glu Gln Ala Ala Asp Leu Tyr Pro His Ser Leu Lys Gly Gln Ile Asp

340 345 350

Met Met Thr Asp Leu Ile Phe Trp Arg Pro Ala Val Ala Phe Ala Gln

355 360 365

Gly Gln Ser Gln His Ala Pro Val Trp Met Tyr Arg Phe Asp Trp His

370 375 380

Gly Glu Thr Pro Pro Phe His Lys Ala Val His Ala Leu Glu Leu Pro

385 390 395 400

Phe Val Phe Gly Asn Phe Asp Ser Leu Arg Lys Thr Leu Gln Glu Pro

405 410 415

Leu Gly Asp Asp Ala Glu Gln Leu Ser Lys Gln Ile Gln Ser Ala Trp

420 425 430

Leu Ala Phe Ala Lys Thr Gly Asn Pro Asn Thr Ser His Phe Asn Trp

435 440 445

Pro Glu Tyr Glu Thr Asp Ser Arg Glu Thr Leu Leu Phe Asn Thr Asp

450 455 460

Thr Ala Val Glu Ser Asp Pro Asp Ser Ala Lys Arg Arg Ile Leu Phe

465 470 475 480

Gln Ala

<210> 2

<211> 1446

<212> DNA

<213> 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)

<400> 2

atgacaaaac ttaccgttca aacccgctgc ggcgcactga aaggaactgc cggccgcggt 60

gcccgcacat ggaagggcat accgtacgcg aagccgcccg tcggagagct gagatttaaa 120

gcgccggagc cgcccgcacc ttgggacggc ataaaacatg ccgattcgtt cgggccgatt 180

tgtccgcagc cggatgatat gctgtccata tcgttttccg gagatatacc gcctcaatct 240

gaagattgcc tttacctcaa cgttttcgcc cccgattcag agggcgaaaa aaagcctgtc 300

atggtatgga tacacggcgg ggcattttat ttaggtgccg gaagcgaacc gctttacgac 360

ggatctgccc ttgccgctga cggagatgtc attgtcgtga cactcaatta caggctcgga 420

ccgttaggct ttttacattt gtcttctatt catgacgcgt attccgccaa tatcgggctg 480

ctcgatcaga tcgccgcgct gcgctgggtg agggacaata tctccgaatt tggaggagac 540

ccggataacg ttacgatatt tggtgaatcg gcaggcggca tgagcatcgc tgcgcttatg 600

gcaatgcctg acgcaaaagg cctgtttcat aaagccattt tagaaagcgg cgcctctcat 660

acgatgccgg cggatatggc aaaagacatc gcggcggcat ttattcatga agccggcact 720

gatcaattgc aggagctttc cgttaatgac ctgcttaaga ctgcggataa agtgcggcgc 780

tcactggatc aaaacatttt tcagcttttg tttcagcccg ccatcgatcc ggccacattg 840

cctgctgaac cggtgaaagc catagcagac ggggccgcag aaggcatacc tatgatcatc 900

ggaaccaatc gtgatgaagc atatttgttt ttcacccctg atacagacat tcactccgag 960

aaaaagcagc aagattattt gcattatcac ctcggagaaa actgcaccga gcaagcggca 1020

gatttatatc cgcattcatt aaagggacaa atcgatatga tgacggatct gattttctgg 1080

cggccggctg tcgctttcgc acaaggacag tcgcaacacg caccggtctg gatgtaccgc 1140

tttgattggc atggcgaaac accgccgttt cataaagccg ttcacgctct ggaattgccg 1200

tttgtgttcg gaaactttga ttctttgaga aagacgctgc aagagccgct cggtgatgac 1260

gcagaacagc tttccaaaca aattcaatcc gcatggctcg cttttgcaaa aaccggaaac 1320

ccgaacacct ctcacttcaa ttggcctgaa tatgaaaccg attcacgcga aactttgctt 1380

ttcaacacgg ataccgctgt cgaaagtgat cccgattcag caaaacgccg catcctgttt 1440

caagca 1446

Claims

1.一种解淀粉芽孢杆菌酯酶在拆分N-BOC-DL-α-氨基丁酸甲酯制备N-BOC-L-α-氨基丁酸甲酯中的应用，其特征在于所述酯酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述酯酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

2.如权利要求1所述的应用，其特征在于所述应用的方法为：以含所述解淀粉芽孢杆菌酯酶编码基因的工程菌经发酵培养获得的湿菌体冻干后的酯酶粗酶粉为生物催化剂，以外消旋N-BOC-DL-α-氨基丁酸甲酯为底物，以pH7.5缓冲液为反应溶剂，在20-60℃、600-1000rpm条件下进行拆分反应，反应完全后，将反应液分离纯化，获得N-BOC-L-α-氨基丁酸甲酯。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述催化剂用量以缓冲液体积计为10g/L-200g/L，所述底物体积用量以缓冲液体积计为1%-20%。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于反应时间为10min-360min。

5.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述缓冲液为pH 7.5，0.2 mM的Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲溶液。

6.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述催化剂按如下方法制备：将含解淀粉芽孢杆菌酯酶编码基因的工程菌接种在LB培养基中，37℃培养OD₆₀₀至为0.4-0.6，加IPTG至终浓度0.02 mM，30℃培养10-12 h，菌液8000 rpm，4℃离心10min，收集菌体，再用PBS缓冲液洗涤菌体2次，8000rpm，4℃离心10min，收集菌体，冻干，得到酯酶粗酶粉。

7.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述反应液分离纯化的方法为：反应结束后，反应液先用2M HCl酸化至pH 2.0，然后用等体积乙酸乙酯萃取，分液漏斗分离出有机相，再经纯水洗涤两次，饱和NaCl洗涤两次，干燥，旋蒸，得到最终产物N-BOC-L-α-氨基丁酸甲酯。