CN104962540A

CN104962540A - 一种腈水解酶、编码基因、载体及应用

Info

Publication number: CN104962540A
Application number: CN201510381618.1A
Authority: CN
Inventors: 郑裕国; 郑仁朝; 张琴; 柳志强; 徐明波
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2015-06-30
Filing date: 2015-06-30
Publication date: 2015-10-07

Abstract

本发明公开了一种来源于芜菁(Brassica rapa)的腈水解酶，编码基因及其在生物催化制备普瑞巴林手性中间体(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的应用，所述腈水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；本发明提供了一种高区域、高立体选择性水解制备(S)-3-氰基-5-甲基己酸的新腈水解酶，该腈水解酶水解底物浓度可达1M以上，且ee值保持在99％以上。通过该腈水解酶可制备普瑞巴林的重要手性中间体——(S)-3-氰基-5-甲基己酸；本发明中所述(S)-3-氰基-5-甲基己酸的制备方法具有原子经济性高、条件温和、环境友好等优点，具有较高的工业化应用潜力。

Description

一种腈水解酶、编码基因、载体及应用

(一)技术领域

本发明涉及一种腈水解酶，特别涉及一种生物催化制备普瑞巴林关键手性中间体(S)-3-氰基-5-甲基己酸的腈水解酶及在制备(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的应用。

(二)背景技术

腈水解酶(Nitrilase，EC 3.5.5.1)是一种重要的腈化合物转化酶，催化腈化合物水解为相应的羧酸。氰基的传统化学水解通常需要强酸、强碱及高温回流等条件，还伴有大量无机盐的形成，不仅给分离纯化带来困难，还造成环境污染。腈水解酶生物催化不仅高效、反应条件温和、环境友好，还具有严格的立体和区域选择性等独特优势，在高附加值医药化学品的合成中具有巨大应用潜力。

普瑞巴林(Pregabalin)，化学名(S)-(+)-3-氨甲基-5-甲基己酸(I)，是一种钙离子通道调节剂，能有效阻断电压依赖性钙通道，减少神经递质的释放(Curr.Opin.Pharmacol.2006,6:108-113)。普瑞巴林对癫痫、神经病理性疼痛疗效良好，且具有使用剂量低、副作用小、持续时间长、耐受性强等特点。已成为全球畅销药市场的“重磅炸弹”，市场前景广阔。

普瑞巴林巨大的市场潜力促使其合成新工艺的开发成为研究热点。普瑞巴林为手性药物，其S-型异构体(I)的药理活性为R-型异构体(Ⅱ)10倍。因此，关键手性中间体的合成是普瑞巴林合成新工艺开发的关键。美国辉瑞公司Xie等报道了一株来源于Arabidopsis thaliana腈水解酶AtNit1(J.Mol.Catal.B:Enzym.2006,41:75-80)。该腈水解酶催化外消旋异丁基丁二腈水解合成(S)-3-氰基-5-甲基己酸(Ⅲ)，具有较高的区域和立体选择性。该路线中未被水解的R-异丁基丁二腈可外消旋回用，是一条原子经济性较高的普瑞巴林关键手性中间体合成工艺。

(三)发明内容

本发明的目的是提供一种能够严格区域、立体选择性水解外消旋异丁基丁二腈(IBSN)制备(S)-3-氰基-5-甲基己酸的新腈水解酶，而且该酶具有更高的催化活力和底物耐受能力，更适用于工业化制备该手性中间体。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种来源于十字花科芸薹属植物芜菁(Brassica rapa)的腈水解酶(BrNit)，所述腈水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

1 MSGSEEMSKA LNATTPGFPD IPSTIVRATI VQASTVYNDT PKTIEKAEKFIAEAASDGAQ

61LVVFPEAFIA GYPRGYRFGI GVGVHNEAGR DCFRRYHASAIVVPGPEVDK LAEIARKYKV

121YLVMGAMEKD GYTLYCTALF FSSEGRFLGK HRKVMPTSLERCIWGFGDGS TIPVYDTPLG

181KLGAAICWEN RMPLYRTSLY GKGIELYCAP TADGSKEWQSSMMHIAIEGG CFVLSACQFC

241LRKDFPDHAD YLFTDWYPDQ HQEAIVSQGG SVIISPLGKILAGPNFESEG LITADLDLGD

301VARAKLYFDV VGHYSRPEIF NLTVNETPKK PVTFVSKSVKAEDDSEPQDK

任何对SEQ ID NO：1所示氨基酸序列中氨基酸进行缺失、插入或替换的处理获得的多肽片段或其变体，只要其与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列具有95％以上同源性，均属于本发明的保护范围。

进一步，为实现腈水解酶在大肠杆菌等原核生物中的可溶性异源表达，通过基因工程常规操作，以全合成的方法获得了对应于所述SEQ ID NO：1氨基酸序列的该腈水解酶的核苷酸序列，如SEQ ID NO：2所示。

1ATGTCTGGCTCTGAAGAAATGTCCAAAGCTCTGAATGCTACCACTCCAGGTTTCCCGGAC

61ATCCCTAGCACCATCGTTCGCGCCACGATCGTTCAGGCTTCCACTGTATACAACGACACT

121CCTAAAACCATCGAAAAAGCTGAAAAATTCATCGCGGAAGCTGCTAGCGACGGTGCGCAG

181CTGGTGGTCTTTCCGGAAGCTTTCATCGCTGGTTACCCGCGTGGCTATCGTTTCGGCATC

241GGTGTAGGTGTGCACAACGAGGCGGGCCGTGATTGTTTCCGCCGCTATCATGCTAGCGCG

301ATCGTTGTCCCGGGTCCGGAGGTTGATAAACTGGCAGAAATTGCTCGTAAATACAAAGTC

361TACCTGGTAATGGGTGCCATGGAGAAAGATGGTTATACCCTGTACTGTACTGCGCTGTTT

421TTCAGCTCTGAAGGTCGTTTCCTGGGCAAGCACCGCAAAGTCATGCCGACGTCTCTGGAA

481CGTTGCATCTGGGGCTTCGGTGATGGTTCTACTATCCCGGTCTACGACACCCCGCTGGGC

541AAGCTGGGCGCCGCAATCTGTTGGGAAAACCGCATGCCGCTGTACCGTACTAGCCTGTAC

601GGCAAAGGTATCGAGCTGTATTGCGCTCCGACTGCCGATGGCTCTAAAGAATGGCAGTCC

661TCCATGATGCACATCGCTATCGAAGGCGGTTGTTTCGTTCTGTCTGCTTGCCAATTCTGC

721CTGCGCAAAGACTTCCCGGACCACGCTGACTATCTGTTTACCGATTGGTACCCGGATCAG

781CACCAGGAAGCGATTGTAAGCCAGGGTGGTTCTGTTATCATTAGCCCACTGGGTAAAATC

841CTGGCGGGTCCGAACTTCGAGTCTGAGGGCCTGATCACTGCAGATCTGGATCTGGGCGAT

901GTAGCGCGTGCAAAACTGTATTTCGATGTTGTTGGTCACTACTCCCGCCCTGAGATTTTT

961AATCTGACGGTTAACGAGACTCCGAAGAAACCGGTTACTTTCGTTTCCAAGTCCGTAAAA

1021GCTGAGGACGACTCTGAGCCGCAGGACAAA

任何对SEQ ID NO：2所示核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入处理获得的核苷酸序列，只要其与该核苷酸具有90％以上的同源性，均属于本发明的保护范围。

本发明提供一种由所述重组腈水解酶编码基因构建的重组载体。

本发明还提供一种由所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。

具体地，本发明将腈水解酶编码基因BrNit同表达载体pET-28b(+)连接，构建了含有腈水解酶基因BrNit的表达重组质粒pET-28b(+)-BrNit。将表达重组质粒pET-28b(+)-BrNit转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株中，获得含有重组质粒pET-28b(+)-BrNit的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28b(+)-BrNit。以重组菌为酶源，进行生物催化。

本发明还涉及所述的腈水解酶在生物催化制备普瑞巴林手性中间体(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的应用，具体地，所述的应用为：以含腈水解酶编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体为生物催化剂，以外消旋异丁基丁二腈(IBSN)为底物，以pH值为6.0～10.0的缓冲液为反应介质构成转化体系，在25～45℃、200rpm条件下进行区域和立体选择性水解，反应完全后，将反应液分离纯化得到(S)-3-氰基-5-甲基己酸。

反应式如下：

进一步，所述缓冲液优选为Gly-NaoH缓冲液(pH 10.0)、Tris-HCl缓冲液(pH8.0-8.5)或磷酸钾缓冲液(pH6.0)，更优选pH 8.0的Tris-HCl缓冲溶液。

进一步，所述底物初始浓度为0.15～2.0mol/L缓冲液，优选0.5mol/L；所述反应体系中生物催化剂的质量用量以湿菌体的重量计为10～50g/L缓冲液，优选20g/L，所述湿菌体含水质量为70～90％。

本发明所述湿菌体的制备方法为：将含腈水解酶编码基因的重组基因工程菌接种至含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，在37℃培养12h，再以体积浓度2％接种量接种至新鲜的含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至菌体浓度OD₆₀₀值为0.4～0.8，再向LB液体培养基中加入终浓度为0.2mM的IPTG，28℃诱导培养10h后，将培养液在4℃、12000rpm离心5min，弃去上清液，收集含有重组腈水解酶的湿菌体。

本发明所述转化反应液采用一系列的有机溶剂(二氯甲烷、乙酸乙酯等)进行萃取、旋蒸得到纯度较高的(S)-3-氰基-5-甲基己酸，优选乙酸乙酯，具体优选为：将转化液离心去除大肠杆菌细胞，减压蒸馏至1/3体积，80℃保温40min，使蛋白质变性，离心去除变性蛋白；为了更好地去除变性蛋白，可使用循环水式真空泵进行再次抽滤，收集澄清的滤液；然后加入2倍体积(减压蒸馏后样品)的乙酸乙酯进行萃取，收集下层水相，用2M HCl调节下层水相收集液pH至4.0，再次加入2倍体积的乙酸乙酯萃取，弃下层水相，收集上层有机相并进行旋转蒸发除去乙酸乙酯，得到呈油状的(S)-3-氰基-5-甲基己酸。

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种高区域、高立体选择性水解制备(S)-3-氰基-5-甲基己酸的新腈水解酶，该腈水解酶水解底物浓度可达1M以上，且ee值保持在99％以上。通过该腈水解酶可制备普瑞巴林的重要手性中间体——(S)-3-氰基-5-甲基己酸；本发明中所述(S)-3-氰基-5-甲基己酸的制备方法具有原子经济性高、条件温和、环境友好等优点，具有较高的工业化应用潜力。

(四)附图说明

图1为pET28b-BrNit重组质粒物理图谱。

图2为腈水解酶SDS-PAGE图；其中M：蛋白质分子量标记，1：诱导表达目的蛋白。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

以下实施例所用主要实验材料来源为：

大肠杆菌宿主菌株E.coli BL21(DE3)购自Invitrogen公司，表达载体pET-28b(+)购自Novagen公司，限制性内切酶Xho I和Xba I购自Fermentas公司，T4DNA连接酶和卡那霉素均购自大连宝生物有限公司；异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)为Promega公司产品。DNA Marker和染色剂Gold View购自TaKaRa公司；AxygenDNA凝胶回收试剂盒、质粒抽提试剂盒、PCR纯化试剂盒购自Axygen生物技术有限公司。

实施例1：腈水解酶的获得

利用蛋白质PDB和NCBI数据库数据对腈水解酶基因序列进行筛选，得到一个腈水解酶基因(NCBI Reference Sequence:NP_001288810.1)。该腈水解酶来源于十字花科芸薹属植物芜菁(Brassica rapa)，根据该腈水解酶的氨基酸序列，并依据大肠杆菌偏好的密码子进行密码子优化，根据表达载体pET28b(+)的特点设计了酶切位点Xho I和Xba I，通过基因工程的常规操作以全合成的方法合成了该段腈水解酶基因BrNit(SEQ ID NO：2所示)，编码酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

实施例2：重组表达载体pET28b(+)-BrNit的构建以及重组工程菌的构建

利用Xho I和Xba I限制性内切酶对BrNit基因片段进行双酶切以及回收处理，并利用T4DNA连接酶将该片段与用相同的限制性内切酶处理的商业化载体pET28b(+)在16℃下进行连接16h，从而构建得到胞内重组表达载体pET28b(+)-BrNit。将构建的胞内表达载体pET28b(+)-BrNit转化至E.coli BL21(DE3)(Invitrogen)受体菌中，涂布于含卡那霉素(终浓度为50μg/mL)的LB琼脂平板上，37℃下培养过夜，第二天于平板上长出的菌落中随机挑取克隆并抽提质粒进行琼脂糖凝胶电泳鉴定，获得重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-BrNit。

实施例3：含有腈水解酶BrNit菌体细胞的制备

将实施例2构建的基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28b(+)-BrNit接种至含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，在37℃培养12h，再以2％接种量(v/v)接种至新鲜的含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至菌体浓度OD₆₀₀约0.6左右，再向LB液体培养基中加入终浓度为0.2mM的IPTG，28℃诱导培养10h后，将培养液在4℃、12000rpm离心5min，弃去上清液，收集含有重组腈水解酶的湿菌体，即含有胞内表达重组腈水解酶的大肠杆菌BL21(DE3)/pET28b-BrNit湿菌体。然后进行SDS-PAGE电泳验证目的蛋白大小及表达情况(见图2)。

实施例4：重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-BrNit在(S)-3-氰基-5-甲基己酸制备中的应用

在本实施例中，按照实施例3方法获得含有胞内表达重组腈水解酶的大肠杆菌BL21/pET28b-BrNit湿菌体作为酶源，以外消旋IBSN为底物，进行生物转化反应制备(S)-3-氰基-5-甲基己酸。

转化体系组成及转化操作如下：在10mL Gly-NaoH缓冲液(pH＝10.0)中加入0.2g湿菌体和终浓度500mM外消旋异丁基丁二腈构成反应体系。35℃、200rpm条件下反应，每隔1h取样，每次取500μL样品，加入200μL 2mol/L HCl中止反应，并用800μL乙酸乙酯萃取，振荡后离心(12000×g，2min)，吸取上清，在上清液中加入无水硫酸钠干燥，样品供气相色谱分析。反应4h，转化率达到为48.0％，产物(S)-3-氰基-5-甲基己酸的ee值大于98％。

反应液中底物及产物的含量由气相色谱法测定。气相色谱型号为GC-14C(Shimadzu，Japan)，所用毛细管柱型号为BGB-174(BGB Analytik，Switzerland)。色谱条件为：进样量1.0μL，进样口、检测器温度均为220℃，柱温为160℃保持30min；载气为氦气，流速为1.6mL/min，分流比为30:1。对映体过量值(ee)、转化率(c)的计算参考Rakels等(Enzyme Microb Technol,1993,15:1051)的计算方法。

实施例5：重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-BrNit在(S)-3-氰基-5-甲基己酸制备中的应用

在本实施例中，以按照实施例3方法获得的重组基因工程菌为酶源，在100mLTris-HCl缓冲液(pH＝8.0)中加入5g湿菌体(终浓度50g/L)和终浓度1.0M外消旋异丁基丁二腈构成反应体系。30℃、200rpm条件下反应，每隔1h取样，每次取500μL样品，加入200μL 2mol/L的HCl和800μL乙酸乙酯萃取，振荡后离心(12000×g，2min)，吸取上清，在上清液中加入无水硫酸钠干燥，样品供气相色谱分析。反应8h，转化率达到40.0％，产物(S)-3-氰基-5-甲基己酸的ee值大于99.0％。

实施例6：重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-BrNit在(S)-3-氰基-5-甲基己酸制备中的应用

在本实施例中，以按照实施例3方法获得的重组基因工程菌为酶源，在10mL磷酸钾缓冲液(pH＝6.0)中加入0.1g湿菌体(终浓度10g/L)和150mM外消旋异丁基丁二腈构成反应体系。25℃、200rpm条件下反应，每隔1h取样，每次取500μL样品，加入200μL 2mol/L的HCl和800μL乙酸乙酯萃取，振荡后离心(12000×g，2min)，吸取上清，在上清液中加入无水硫酸钠干燥，样品供气相色谱分析。反应4h，转化率达到15.6％，产物(S)-3-氰基-5-甲基己酸的ee值大于99.0％。

实施例7：重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-BrNit在(S)-3-氰基-5-甲基己酸制备中的应用

在本实施例中，以按照实施例3方法获得的重组基因工程菌为酶源，在10mLTris-HCl缓冲液(pH＝8.5)中加入0.1g湿菌体(终浓度10g/L)和150mM外消旋异丁基丁二腈构成反应体系。45℃、200rpm条件下反应，每隔1h取样，每次取500μL样品，加入200μL 2mol/L的HCl和800μL乙酸乙酯萃取，振荡后离心(12000×g，2min)，吸取上清，在上清液中加入无水硫酸钠干燥，样品供气相色谱分析。反应4h，转化率达到28.3％，产物(S)-3-氰基-5-甲基己酸的ee值大于97.8％。

实施例8：重组基因工程菌E.coli BL21(DE3)/pET28b-BrNit在(S)-3-氰基-5-甲基己酸制备中的应用

在本实施例中，按照实施例3方法获得的重组基因工程菌作为生物催化剂，在10mL Tris-HCl缓冲液(pH＝8.0)中分别加入0.2g和0.5g湿菌体(终浓度分别为20g/L及50g/L)，底物IBSN浓度为2.0M构成反应体系。35℃、200rpm条件下反应，每隔1h取样，每次取500μL样品，加入200μL 2mol/L的HCl和800μL乙酸乙酯萃取，振荡后离心(12000×g，2min)，吸取上清，在上清液中加入无水硫酸钠干燥，样品供气相色谱分析。反应20h，转化率分别达到18.2％和20.0％，产物(S)-3-氰基-5-甲基己酸ee值大于98.5％。

实施例10：(S)-3-氰基-5-甲基己酸的分离纯化

按照实施例5获得的转化液，离心去除大肠杆菌细胞，减压蒸馏至1/3体积。80℃保温40min，使蛋白质变性，离心去除变性蛋白；为了更好地去除变性蛋白，可使用循环水式真空泵进行再次抽滤，收集澄清的滤液。然后加入2体积(减压蒸馏后样品)的乙酸乙酯进行萃取，收集下层水相。用2M HCl调节下层水相收集液pH至4.0。再次加入2体积的乙酸乙酯萃取，弃下层水相。收集上层有机相并进行旋转蒸发除去乙酸乙酯，得到呈油状的(S)-3-氰基-5-甲基己酸(ee>99.5％)。

由上述实验结果可知，本发明得到的含有腈水解酶基因的重组大肠杆菌具有较强的催化水解能力，可直接以含酶的菌体细胞为酶源进行生物催化或者转化反应。腈水解酶BrNit作为生物催化剂，可以利用外消旋异丁基丁二腈为底物，进行生物转化反应制备高光学纯度(S)-3-氰基-5-甲基己酸。针对本发明得到的重组基因工程菌可通过发酵，进一步扩大反应体系，具有很大的工业化应用前景。

上述实施例只为说明本发明的技术特点以及构思，其目的在于让熟悉此项技术的人士能够了解本发明的内容并据以实施，并不能以此限制本发明的保护范围。凡根据本发明精神实质所做的等效变化或修饰，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种腈水解酶，其特征在于所述腈水解酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.一种编码权利要求1所述腈水解酶的基因，其特征在于所述编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：2所示。

3.一种由权利要求2所述编码基因构建的重组载体。

4.一种由权利要求3所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。

5.一种权利要求1所述腈水解酶在生物催化制备普瑞巴林手性中间体(S)-3-氰基-5-甲基己酸中的应用。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述的应用为：以含腈水解酶编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体为生物催化剂，以外消旋异丁基丁二腈为底物，以pH值为6.0～10.0的缓冲液为反应介质构成转化体系，在25～45℃、200rpm条件下进行水解反应，反应完全后，将反应液分离纯化得到(S)-3-氰基-5-甲基己酸。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述缓冲液为Gly-NaoH缓冲液、Tris-HCl缓冲液或磷酸钾缓冲液。

8.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述反应体系中底物初始浓度为0.15～2.0mol/L缓冲液，生物催化剂的质量用量以湿菌体的重量计为10～50g/L缓冲液。

9.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述湿菌体的制备方法为：将含腈水解酶编码基因的重组基因工程菌接种至含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基，在37℃培养12h，再以体积浓度2％接种量接种至新鲜的含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃培养至菌体浓度OD₆₀₀值为0.4～0.8，再向LB液体培养基中加入终浓度为0.2mM的IPTG，28℃诱导培养10h后，将培养液在4℃、12000rpm离心5min，弃去上清液，收集含有重组腈水解酶的湿菌体。

10.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述反应液分离纯化的方法为：将反应液离心，上清液减压蒸馏至1/3体积，80℃保温40min，离心，取上清液加入乙酸乙酯进行萃取，收集下层水相，调节pH至4.0，再次加入乙酸乙酯萃取，弃下层水相，收集上层有机相并进行旋转蒸发除去乙酸乙酯，得到呈油状的(S)-3-氰基-5-甲基己酸。