CN105505904A - 腈水解酶突变体、基因、载体、工程菌及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种腈水解酶突变体、基因、载体、工程菌及制备R-扁桃酸的应用，所述突变体是将SEQ？ID？NO.2所示氨基酸序列的第190位丝氨酸进行定点突变获得的；本发明所述的腈水解酶突变体(氨基酸序列为SEQ？ID？NO.12所示)较亲本腈水解酶(氨基酸序列为SEQ？ID？NO.2所示)比酶活提高3.0倍，对映体选择性从94％提高到大于99％。结果表明，腈水解酶突变体(氨基酸序列为SEQ？ID？NO.12所示)能够用少量湿菌体(10g/L)在30min内完全水解100mM扁桃腈，对映体选择性大于99％。可用于工业化生产医药中间体R-扁桃酸。

Description

腈水解酶突变体、基因、载体、工程菌及应用
(一)技术领域
本发明涉及一种腈水解酶，特别涉及一种利用基因突变获得的腈水解酶突变体及其在制备医药中间体(R)-扁桃酸中的应用。
(二)背景技术
腈水解酶(EC3.5.5.1)：腈水解酶超级家族中一类重要的工业用酶，含有一个特定的空间结构，蛋白结构单元由一个α-β-β-α的三明治结构组成，腈水解酶的这种结构已经通过X-ray衍射技术得到确认。根据蠕虫NiFhit晶体结构分析，其活性部位含有Glu-Lys-Cys3个残基，Brenner小组推测整个腈水解酶大家族可能是通过Glu-Lys-Cys3个残基来催化的。腈水解酶的反应机理如图1所示，腈水解酶先攻击CN共价键，形成酶与底物共价结合的中间体，继而加上一分子的水，并放出一分子的氨，当加上第二分子的水时，生成酸和酶。腈水解酶的半胱氨酸残基上的巯基具有很强的亲核性，使整个过程类似于一般化学反应中碱催化下的氰基水解。腈水解酶的主要功能在于水解腈类化合物生成相应的羧酸。按照催化底物的不同，可以将腈水解酶分为三大类，即脂肪腈水解酶(aliphaticnitrilase)、芳香腈水解酶(aromaticnitrilase,主要水解芳香腈、杂环腈)和芳基脂肪腈水解酶(arylaliphaticnitrilase)。利用腈水解酶的催化活性是降解环境污染中高毒性腈的有效途径。故腈水解酶不但能应用于环境污染问题，而且能生产重要的医药中间体。在自然界中，腈水解酶来源广泛，主要有细菌，丝状真菌，酵母，植物等，并以细菌为主要来源。从生物技术应用角度，微生物腈水解酶作为绿色催化剂更具有商业价值。
扁桃酸(mandelicacid)又称作苦杏仁酸、苯乙醇酸或α-羟基苯乙酸。其中光学纯(R)-扁桃酸(式Ⅰ)是一种重要的精细化工中间体和手性药物前体，广泛应用于多种光学活性药物的合成，如头孢菌素和半合成青霉素等抗生素、抗肿瘤药物、减肥药物、农药及其他药物。(R)-扁桃酸还是重要的手性拆分剂和手性催化剂，而且还能用于测定手性物质的绝对构型及光学纯度等。(R)-扁桃酸被称为“万能”拆分剂，其对醇胺类药物的拆分效果优秀，如止咳药甲吗南的中间体八氢异喳琳衍生物，并且以(R)-扁桃酸为催化剂可将芳香族及脂肪族醛均不对称转化成为相应手性醇。据统计，国际上已有部分公司有能力合成光学纯(R)-扁桃酸，主要有日东化学公司、日本山川药品公司以及德国瓦克公司等。目前，国内也已经有部分企业能够生产光学纯的扁桃酸，但还没有出现规模化生产单一构型的报道。因此，加大力度对单一构型扁桃酸的研究开发，打破国外企业对手性(R)-扁桃酸的市场垄断，并寻找适合我国工业化生产的方法意义重大。与此同时，研究出新的生产工艺用于(R)-扁桃酸和其他手性药物的工业生产，不仅对满足我国光学活性药物产品市场的需要具有实际意义，而且对解决手性技术领域所存在的多种问题也具有重大的理论指导意义。
(Ⅰ)(R)-扁桃酸
由于生物酶对底物有高度的立体选择性，具有严格的区域选择性和对映体选择性，可直接将化学合成的外消旋衍生物、潜手性化合物或前体转化成单一对映异构体的光学活性产物。生物催化的手性反应还具有效率高、反应条件温和、反应步骤少、产品光学纯度高等优点，并且生物催化过程能耗低、无毒、无污染，符合21世纪“绿色化学”的要求，被认为是手性药物生产取得突破的关键技术。腈水解酶是一类可以将腈转化成相应酸的酶，当以扁桃腈为底物时，腈水解酶将其不对称水解成(R)-扁桃酸，并且它的理论动力学反应产物收率是100％，生产合成路线如图2。
Yamamoto等人报道来源于AlcaligenesfaecalisATCC8750的扁桃腈水解酶(Appl.Environ.Microbiol1991,57:3028-3032)能够催化外消旋扁桃腈的动态动力学水解拆分得到扁桃酸，得率为91％，对映体过量值为100％。Rossi等对来源于AlcaligenesfaecalisATCC8750进行了固定化和修饰，固定化后的腈水解酶能高度选择性水解扁桃腈成(R)-扁桃酸，pH为8.5时，收率为99％，产物ee值为99％(Journalofagriculturalandfoodchemistry.2004,52(26):8155-8162)。
Rustler等人报道了来源于PseudomonasfluorescensEBC191的重组菌在pH为5时，能够水解扁桃腈，并且保持高的对映体选择性(EnzymeMicrobTech40(2007)598-606)。Kiziak等人将来源于PseudomonasfluorescenEBC191的腈水解酶基因克隆到表达载体pJOE2775中，并在大肠杆菌中表达。重组腈水解酶用于水解扁桃腈生成(R)-扁桃酸，但ee值仅有31％，且有19％的副产物酰胺生成(Microbiology-Sgm.2005,151:3639-3648)。
Wang等人报道基于系统发育的酶与底物特异性预测，从BurkholderiacenocepaciaJ2315中筛选得到一株新的腈水解酶BCJ2315(BMC.Biotechnology13(2013)13-14)，其水解扁桃腈生产(R)-扁桃酸的对映体选择性有98.7％，无副产物。重组EscherichiacoliM15/BCJ2315湿菌体(10mg/ml)能够在1h内完全水解100mM扁桃腈。
虽然目前在利用腈水解酶催化生产(R)-扁桃酸方面已有一定的进展，但是，发现的腈水解酶在工业生产中仍然存在着许多问题如高浓度的底物抑制，许多反应参数需要进一步改进。所以行业仍需要具有更高活性，更严格对映选择性，更宽特异性或更好稳定性的新腈水解酶，以降低生产工业生产成本。新酶的发现主要是基因组挖掘和宏基因组方法。蛋白质工程的目的是改变对底物特异性，酶活性以及立体选择性。
(三)发明内容
本发明目的是通过定点突变的方法对腈水解酶基因进行改造，改造后的腈水解酶工程菌在催化外消旋扁桃腈的酶活性以及立体选择性方面都有提高，使其符合工业化生产(R)-扁桃酸的应用需求。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种腈水解酶突变体，所述突变体是将SEQIDNO.2所示氨基酸序列的第190位丝氨酸进行定点突变获得的，优选将第190位丝氨酸突变为甘氨酸(Ser190Gly，核苷酸序列为SEQIDNO.11所示，氨基酸序列为SEQIDNO.12所示)或精氨酸(Ser190Arg，核苷酸序列为SEQIDNO.9所示，氨基酸序列为SEQIDNO.10所示)。
本发明涉及一种所述腈水解酶突变体的编码基因，由所述腈水解酶突变体编码基因构建的重组载体，以及由所述重组载体转化制备的重组基因工程菌。
此外，本发明还提供一种所述腈水解酶突变体在催化扁桃腈制备(R)-扁桃酸中的应用，具体所述应用为：以含腈水解酶突变体编码基因的重组工程菌经诱导培养后离心获得的湿菌体用pH7.5、0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液悬浮制成的菌悬液为酶源，以外消旋扁桃腈为底物，以pH为4-9(优选pH值为7.5Tris-HCl)的pH缓冲液为反应介质，在30-70℃(优选40℃)、200rpm条件下反应(反应过程中优选流加1M氨水维持反应液pH为7.5)，反应结束后，获得含(R)-扁桃酸的混合液，将混合液分离纯化，获得(R)-扁桃酸。所述湿菌体的用量以反应介质体积计为1-10g/L，所述底物用量以反应介质体积计为20～100mmol/L。
本发明所述湿菌体按如下方法制备：将含腈水解酶突变体编码基因的重组工程菌接种至含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、150rpm/min振荡培养10h；培养液以体积浓度2％接种量接种到新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、150rpm/min振荡培养至菌体OD600＝0.6～0.8，加入终浓度0.5mM的IPTG，28℃、150rpm/min诱导培养10h，于4℃、9000rpm/min离心10min，收集湿菌体。
本发明所述的腈水解酶突变体可以以工程菌全细胞形式使用，也可以是未经纯化的粗酶形式使用，也可以是部分纯化的或完全纯化的酶的形式使用。还可以利用本领域已知的固定化技术将本发明的腈水解酶突变体制成固定化酶或者固定化细胞形式的固化酶。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明所述的腈水解酶突变体(氨基酸序列为SEQIDNO.12所示)较亲本腈水解酶(氨基酸序列为SEQIDNO.2所示)比酶活提高3.0倍，达到1.87U/mg，对映体选择性从94％提高到大于99％。结果表明，腈水解酶突变体(氨基酸序列为SEQIDNO.12所示)能够用少量湿菌体(10g/L)在30min内完全水解100mM扁桃腈，对映体选择性大于99％。可用于工业化生产医药中间体(R)-扁桃酸。
(四)附图说明
图1腈水解酶催化机理示意图。
图2腈水解酶催化外消旋扁桃腈，生成(R)-扁桃酸的合成路线图。
图3为重组大肠杆菌Ser190Gly的蛋白电泳图，泳道1为超声破粹后的混合悬液，泳道2为纯蛋白，泳道3为标准蛋白。
图4为亲本和第190位丝氨酸突变体催化扁桃腈活性及对映体选择性对比图。
图5为温度对重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28b-Ser190Gly催化的影响图。
图6为pH对重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28b-Ser190Gly催化的影响图。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1：亲本腈水解酶的基因合成
亲本腈水解酶的基因(GeneBank:AY487562)，为了使该基因连接到载体pET28b后可以表达带有His-tag的蛋白，切除其终止密码子，并以E.coli的密码子偏好性为参照对其序列进行优化，并且在起始密码子处引入NcoI，从而在甲硫氨酸后插入甘氨酸。新设计的腈水解酶基因(tegi)的序列如SEQIDNO.1所示(氨基酸序列为SEQIDNO.2所示)，基因合成工作委托上海旭冠生物科技发展有限公司完成，基因合成后连接到表达载体pET28b中。
实施例2：突变体库的构建
以实施例1获得的SEQIDNO.1所示核苷酸序列的亲本序列为模板，分别以下列核苷酸序列(表1)为引物进行PCR扩增，分别获得将SEQIDNO.2所示氨基酸序列的第190位丝氨酸突变为丙氨酸，亮氨酸，缬氨酸，甘氨酸，苏氨酸，半胱氨酸，精氨酸，赖氨酸，组氨酸，谷氨酸的单突变体。
表1：引物
PCR反应体系为：
PCR程序设定为：95℃预变性5min；95℃变性15s，55℃退火30s，72℃延伸7min，30个循环；72℃终延伸10min，4℃保藏。
PCR结束后，取20μLPCR产物经0.9％琼脂糖凝胶电泳检测。对检测结果为阳性的PCR产物，加入DpnI，37℃酶切3h。
酶切反应体系如下：
Dpn I 1μL
10×buffer 2μL
DNA 10μL
ddH2O 7μL
Total 20μL
酶切结束后，酶切产物在恒温金属浴65℃灭活10min。转化大肠杆菌感受态BL21(DE3)中，涂布于含50μg/mLKan的LB平板上，37℃培养10～12h。
实施例3：突变体库的筛选
(1)挑取实施例2培养的单菌落到50mL的LB液体培养基中(含50ug/mL卡那霉素)，放入37℃、摇床转速为150rpm的条件下培养10h，再取种子液以体积浓度2％的接种量转接到100mL的LB液体培养基中，在37℃、摇床转速为150rpm的条件下培养，当菌体的浓度OD600达到0.6-0.8的时候加入终浓度为0.5mM的IPTG。然后放入28℃，150rpm的摇床上培养8小时，离心收集菌体，再用0.85％的生理盐水洗菌体两次。经测序确定为阳性突变的重组大肠杆菌，保藏于甘油管中(甘油终浓度15％)。
(2)酶活的测定及酶活定义
称取按实施例3(1)制备的静息细胞0.2g(湿重)，悬浮于10mLTris-HCl缓冲液(pH7.5、0.1M)中，获得菌悬液。反应于150mL规格的摇瓶中进行，20mL体系中：19mL(pH7.5、0.1M)的磷酸缓冲液、1mL菌悬液、20mM扁桃腈，温度40℃，转数200rpm，反应5min，10μl(6MHCl)终止反应。取1mL反应液，8000rpm/min离心，0.22μm膜过滤后用HPLC液相色谱仪检测(R)-扁桃酸的浓度。确定为正向突变的重组大肠杆菌，保藏于甘油管中(甘油终浓度15％)。
腈水解酶酶活定义是指样品在扁桃腈浓度为20mM、反应介质为pH7.5，0.1MTris-HCl缓冲液，反应温度为40℃的条件下，每分钟从反应体系中生成1μmol(R)-扁桃酸所需的酶量，即为一个酶活单位，以U表示。
(3)液相检测方法
HPLC扁桃酸液相检测方法：采用高效液相法分析(DionexUltiMate3000,USA)，分离检测的色谱柱为反相手性柱(型号AstecChirobioticTMR250×4.6mm,Sigma,USA)，流动相为0.5％AcOH-CH3CN(12:88,v/v)，流速为1mL/min，检测波长为215nm。
(4)突变体库的筛选结果如图4，最终获得的高活性和对映体选择性的单突变体为Ser190Lys(核苷酸序列为SEQIDNO.3所示，氨基酸序列为SEQIDNO.4所示)，单突变体Ser190Ala(核苷酸序列为SEQIDNO.5所示，氨基酸序列为SEQIDNO.6所示)，单突变体Ser190Val(核苷酸序列为SEQIDNO.7所示，氨基酸序列为SEQIDNO.8所示)，单突变体Ser190Arg(核苷酸序列为SEQIDNO.9所示，氨基酸序列为SEQIDNO.10所示)和单突变体Ser190Gly(核苷酸序列为SEQIDNO.11所示，氨基酸序列为SEQIDNO.12所示)，即获得重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28b-Ser190Lys，重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28b-Ser190Ala，重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28b-Ser190Val，重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28b-Ser190Arg和重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28b-Ser190Gly。
较亲本活力和对映体选择性提高的单突变体具体结果见图4及下表：
实施例4：出发菌株和突变株催化高浓度扁桃腈对比
将实施例3中构建的重组大肠杆菌(含核苷酸序列为SEQIDNo.3所示，含核苷酸序列为SEQIDNo.5所示，含核苷酸序列为SEQIDNo.7所示，含核苷酸序列为SEQIDNo.9所示及含核苷酸序列为SEQIDNo.11所示的大肠杆菌BL21(DE3))和出发菌株(含SEQIDNO.1的大肠杆菌BL21(DE3))，接种至50mLLB液体培养基中(含有卡那霉素50μg/mL)，37℃、150rpm/min振荡培养10h；培养液以2％(v/v)接种量接种到新鲜的含有50μg/mL卡那霉素的100mLLB液体培养基中，37℃、150rpm/min振荡培养至菌体浓OD600＝0.6～0.8，加入终浓度0.5mMIPTG，28℃、150rpm/min诱导培养10h后。于4℃、9000rpm/min离心10min，收集湿菌体(静息细胞)作为转化用酶。
以外消旋扁桃腈为底物，进行转化反应生产(R)-扁桃酸。具体操作如下：分别取每个突变体的静息细胞0.1g(湿重)，悬浮于1ml、pH7.5、0.1MTris-HCl缓冲液，制成菌悬液，反应于150mL规格的摇瓶中进行，10mL体系：100mM扁桃腈，1ml菌悬液，9mLpH7.5、0.1M的磷酸缓冲液，温度40℃，转数200rpm，每隔5分钟取100μl反应液，用10μl6MHCl终止反应(反应过程中优选流加1M氨水维持反应液pH为7.5)，8000rpm离心，0.22μm膜过滤后用HPLC液相色谱仪检测(R)-扁桃酸的浓度。
原始菌株和突变株催化扁桃腈的结果对比如下表所示：
菌株核苷酸序列编号 转化时间min 转化率％ 对映体选择性％
SEQ ID No.1 30 60 94.0
SEQ ID No.3 30 71 96.2
SEQ ID No.5 30 74 98.1
SEQ ID No.7 30 78 98.6
SEQ ID No.9 30 90 >99.0
SEQ ID No.11 30 100 >99.0
实施例5：重组大肠杆菌Ser190Gly的蛋白纯化及电泳
将实施例3中构建的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28b-Ser190Gly，接种至50mLLB液体培养基中(含有卡那霉素50μg/mL)，37℃、150rpm/min振荡培养10h；培养液以2％(v/v)接种量接种到新鲜的含有50μg/mL卡那霉素的100mLLB液体培养基中，37℃、150rpm/min振荡培养至菌体浓OD600＝0.6～0.8，加入终浓度0.5mMIPTG，28℃、150rpm/min诱导培养10h。于4℃、9000rpm/min离心10min，收集湿菌体。采用超声破碎方法对湿菌体进行超声破碎，制备获得无细胞抽提液，使用Ni-NTA琼脂糖凝胶柱进行纯化，使用洗脱液(50mMNaH2PO4·2H20、300mMNaCl、300mM咪唑，pH8.0)进行洗脱，收集纯蛋白，取20μL上述无细胞抽提液和纯蛋白，加20μLSDS缓冲液混合，沸水浴加热5min，取8μL进行SDS-PAGE电泳分析。由图3可知目的蛋白大小在39KDa左右。
实施例6：温度对重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28b-Ser190Gly催化的影响
将实施例5中诱导表达后的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28b-Ser190Gly湿菌体作为转化用酶，以外消旋扁桃腈为底物，进行转化反应生产(R)-扁桃酸。具体操作如下：静息细胞0.2g(湿重)，悬浮于10mLpH7.50.1MTris-HCl缓冲液，制成菌悬液，反应于150mL规格的摇瓶中进行，20mL体系：19mLpH7.5、0.1M的磷酸缓冲液、1mL菌悬液、20mM扁桃腈，温度30、35、40、45、50、55、60、65、70℃，转数200rpm，反应5min(反应过程中优选流加1M氨水维持反应液pH为7.5)，10μl6MHCl终止反应。取1mL反应液，8000rpm离心，0.22μm膜过滤后用HPLC液相色谱仪检测(R)-扁桃酸的浓度。由图5可知，表达的腈水解酶在50℃条件下具有最高催化效率。
实施例7：pH对重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET28b-Ser190Gly催化的影响
将实施例5中诱导表达后的大肠杆菌BL21(DE3)/pET28b-Ser190Gly湿菌体作为转化用酶，以外消旋扁桃腈为底物，进行转化反应生产(R)-扁桃酸。具体操作如下：静息细胞0.2g(湿重)，悬浮于10mLpH7.50.1MTris-HCl缓冲液中，制成菌悬液，反应于150mL规格的摇瓶中进行，20mL体系：19mL0.1M缓冲液(pH4.0、4.5、5.0、5.5、6.0柠檬酸缓冲液；pH6.0、6.5、7.0、7.5磷酸缓冲液；pH7.5、8.0、8.5、9.0Tris-HCl缓冲液)、1mL菌悬液、20mM扁桃腈，温度40℃，转数200rpm，反应5min(反应过程中优选流加1M氨水维持反应液pH为7.5)，10μl6MHCl终止反应。取1mL反应液，8000rpm离心，0.22μm膜过滤后用HPLC液相色谱仪检测(R)-扁桃酸的浓度。由图6可知，表达的腈水解酶在0.1MTris-HCl缓冲液(pH7.5)的条件下具有最高催化效率。
本发明不受上述具体文字描述的限制，本发明可在权利要求书所概括的范围内做各种改变，这些改变均在本发明的范围内。

Claims (8)

1.一种腈水解酶突变体，其特征在于所述突变体是将SEQIDNO.2所示氨基酸序列的第190位丝氨酸进行单点突变获得的。
2.如权利要求1所述腈水解酶突变体，其特征在于所述突变体是将第190位丝氨酸突变为甘氨酸或精氨酸。
3.一种权利要求1所述腈水解酶突变体的编码基因。
4.一种由权利要求3所述编码基因构建的重组载体。
5.一种由权利要求4所述重组载体转化制备的重组基因工程菌。
6.一种权利要求1-2之一所述腈水解酶突变体在催化扁桃腈制备(R)-扁桃酸中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述的应用为：以含腈水解酶突变体编码基因的重组工程菌经诱导培养后离心获得的湿菌体用pH7.5、0.1mol/L的Tris-HCl缓冲液悬浮制成的菌悬液为酶源，以外消旋扁桃腈为底物，以pH4.0-9.0的pH缓冲液为反应介质构成反应体系，在30-70℃、200rpm条件下反应，反应完全后，获得含(R)-扁桃酸的混合液，将混合液分离纯化，获得(R)-扁桃酸；所述湿菌体的用量以反应体系总体积计为1-10g/L，所述底物用量以反应体系总体积计为20～100mmol/L。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于所述湿菌体按如下方法制备：将含腈水解酶突变体编码基因的重组工程菌接种至含终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、150rpm/min振荡培养10h；培养液以体积浓度2％接种量接种到新鲜的含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、150rpm/min振荡培养至菌体OD600＝0.6～0.8，加入终浓度0.5mM的IPTG，28℃、150rpm/min诱导培养10h，于4℃、9000rpm/min离心10min，收集湿菌体。
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