CN106047834A - 一种对映选择性提高的宇佐美曲霉环氧化物水解酶突变体 - Google Patents

一种对映选择性提高的宇佐美曲霉环氧化物水解酶突变体 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种对映选择性提高的宇佐美曲霉环氧化物水解酶突变体，属于酶工程和生物催化技术领域。本发明基于理性设计对宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)环氧化物水解酶(AuEH2)进行分子改造，结合基因的定点饱和突变方法，获得多个对映选择性提高的环氧化物水解酶突变体。本发明获得的6个对映选择性提高的突变体：AuEH2A250I、AuEH2A250M、AuEH2A250Y、AuEH2A250S、AuEH2A250L和AuEH2A250V催化外消旋环氧苯乙烷(rac‑SO)的对映体比率(E值)相比野生型，从16分别提高至48、27.2、23.9、21.8、20.0和19.4。

Description

一种对映选择性提高的宇佐美曲霉环氧化物水解酶突变体
技术领域
本发明涉及一种对映选择性提高的宇佐美曲霉环氧化物水解酶突变体，属于酶工程和生物催化技术领域。
背景技术
手性环氧化物和邻二醇是合成手性药物、农业、香料及精细化工等行业各种活性物质的重要中间体，具有广阔的应用前景和市场需求。光活性的手性化合物具有不同于外消旋体的独特性质，其在生物体内的代谢途径、代谢速率、药理及毒性等方面的差异，使其在化学和生命科学产业有着崭新和特殊的用途。20世纪60年代，震惊世界的“反应停事件”已经充分说明获得光学纯化合物的必要性。传统的化学法拆分环氧化物往往需要重金属类有毒物质作为催化剂，不仅面临着环境的巨大挑战，且很难获得高产率的手性纯化合物。环氧化物水解酶(Epoxide hydrolases,EHs)是一类催化水分子立体选择性的加成环氧化物水解为相应1,2-二醇的水解酶类，是一种典型α/β折叠型水解酶。然而，不同来源的EHs的性质均存在很大的差异，自然界筛选到的具有EHs活性的微生物往往存在产酶活低、对映选择性较低及稳定性差等缺陷，往往不能满足工业化应用的需求。
目前，研究较多的微生物EH主要来自于黑曲霉(Aspergillus niger)、黏红酵母(Rhodotorula glutinis)、放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter AD1)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas sp.)和芽孢杆菌属(Bacillus sp.)，这些EH对一些特定的底物具有较高的催化活性和高对映选择性。近年来，分子生物学技术，如定点突变、饱和突变、错易PCR和DNA shuffling等也用于改造EHs的催化活性、稳定性、对映选择性等性质，并通过高通量筛选获得优良突变酶。
从宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)克隆了一种环氧化物水解酶(AuEH2)，并实现其在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中异源表达，可对映选择性水解动力学催化多种环氧化物制备高光学纯的手性环氧化物(J Ind Microbiol Biotechnol,2015，42(5):671-680；公开号:CN102994470A)。但该重组酶对环氧化物的对映选择性并不高，从而限制了其在高附加值药物前体的手性合成中的应用潜力。通过同源建模分析该酶的蛋白质结构，并通过定点饱和突变技术对AuEH2进行分子改造，提高其对映选择性，具有较强的工业化应用价值。
发明内容
本发明要解决的第一个技术问题是提供一种对映选择性提高的环氧化物水解酶(AuEH2)突变体。
所述突变体是(a)或(b)或(c)：
(a)在SEQ ID NO.1所示序列基础上，将第250位丙氨酸(A)分别突变为异亮氨酸(I)，甲硫氨酸(M)，酪氨酸(Y)，丝氨酸(S)，亮氨酸(L)或缬氨酸(V)；
(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有环氧化物水解酶活性的由(a)衍生的蛋白质；
(c)与(a)限定的氨基酸序列具有85％及以上同源性且具有环氧化物水解酶活性的蛋白质。
本发明还提供一种表达所述AuEH2突变体的基因工程菌，所述基因工程菌的构建方法包括以下步骤：以携带编码宇佐美曲霉AuEH2的基因的重组质粒为模板，设计并合成引物，通过PCR进行定点突变，得到携带编码突变体的基因的重组质粒，转化表达宿主。
在本发明的一种实施方式中，所述携带编码宇佐美曲霉AuEH2的基因的重组质粒是携带编码宇佐美曲霉AuEH2的基因的pET-28a(+)。
在本发明的一种实施方式中，所述表达宿主是E.coli BL21(DE3)。
本发明还提供一种获得所述AuEH2突变体的方法，是将表达所述AuEH2突变体的基因工程菌种子液以含卡那霉素抗性的LB培养基培养至对数中后期，加入IPTG诱导重组基因的高效表达AuEH2突变体。
本发明还提供一种应用所述AuEH2突变体生产(S)-环氧苯乙烷的方法，是以所述突变体或表达所述突变体的基因工程菌为催化剂，在缓冲体系中催化外消旋环氧苯乙烷生成(S)-环氧苯乙烷。
在本发明的一种实施方式中，所述缓冲体系可以是单水相或者水相与有机相构成的双相体系。
本发明基于理性设计对宇佐美曲霉(Aspergillus usamii)环氧化物水解酶(AuEH2)进行分子改造，结合基因的定点饱和突变方法，获得多个对映选择性提高的环氧化物水解酶突变体。本发明获得的6个对映选择性提高的突变体：AuEH2A250I、AuEH2A250M、AuEH2A250Y、AuEH2A250L、AuEH2A250S和AuEH2A250V催化外消旋环氧苯乙烷(rac-SO)的对映体比率(E值)相比野生型，从16分别提高至48.2、37.2、34.0、30.0、27.4和25.4，应用所述AuEH2突变体水解动力学拆分外消旋环氧苯乙烷生产(S)-环氧苯乙烷的对映体过量率(ee值)>99％。该发明提供的突变体高对映选择性的特点，有利于提高其催化产物手性环氧化物和邻二醇的对映纯度和产率，从而降低生产成本，具有较大应用潜力。
附图说明
图1 AuEH2(WT)与AuEH2突变体对映体比率(E)
具体实施方式
(R,S)-SO购自上海TCI公司；(S)-SO和(R)-SO购自上海安耐吉公司；其他试剂均为分析纯。手性气相色谱柱CYCLOSIL-B(30m×0.25mm×0.25μm)为美国Agilent科技公司产品。
实施例1：定点饱和突变实施
(1)以重组质粒pET-28a(+)-Aueh2的构建方法参见专利公开号CN102994470A的专利申请)为模板，A250X-F和pET28-R为引物，利用PrimeSTAR DNA聚合酶(购自TaKaRa)进行第一轮PCR扩增(95℃4min；98℃10s，55℃5s，72℃3.5min，30个循环；72℃10min)获得一段大引物A250X-1st；以大引物A250X-1st作为引物，重组质粒pET-28a(+)-Aueh2为模板进行第二轮PCR扩增(95℃4min；98℃10s，55℃10s，72℃3.5min，25个循环；72℃10min)；A250X-2st PCR产物经Dpn I消化(37℃,2h)模板pET-28a(+)-Aueh2后转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布卡那霉素抗性LB平板37℃培养12-16h，获得重组子文库。
A250X-F：TTTGGCAGTGGTTACGTCGAGCATGGTAC
pET28-R：GCCTTACTGGTTAGCAGAATG
其中N代表A、T、C和G任意碱基，K代表T或G碱基，该简便并密码子可编码随机20种氨基酸，只需筛选94个重组子可包含>95％的覆盖率。
(2)挑取上述LB平板96个单菌落于卡那霉素抗性LB培养基中37℃培养12h，一部分培养液加20％(v/v)甘油保种，-80℃保藏，另一部分培养液以2％的接种量转接至新鲜的装有含卡那霉素抗性1mL LB培养基的96孔的深孔板中，37℃条件下培养2h后，加入0.2mMIPTG诱导剂25℃培养8h，诱导重组基因的高效表达，重组细胞经8000rpm离心收集菌体，-80℃保藏。以同样诱导方法获得E.coli/pET-28a(+)-Aueh2重组菌体作为阳性对照，E.coli/pET-28a重组菌体作为空白对照。
(3)将获得的重组菌体加入1mL的50mM磷酸钾缓冲液(pH＝7.0)悬浮，500μL菌悬液用于催化外消旋环氧苯乙烷，采用硝基苄基吡啶(NBP)的分光光度法进行酶活性进行初步筛选,获得36个具有环氧化物水解酶活性的突变子。
(4)将(3)所述具有环氧化物水解酶的突变子的菌悬液，采用手性气相色谱测定其对映选择性，具体实施方法如实施例2所述。将对映体选择性提高的突变子送上海生工测序，确定突变体的核苷酸和氨基酸序列。结果筛选获得6个对映选择性提高的突变体，AuEH2A250I、AuEH2A250M、AuEH2A250Y、AuEH2A250L、AuEH2A250S和AuEH2A250V催化外消旋环氧苯乙烷(rac-SO)的对映体比率(E值)从16分别提高至48.2、37.2、34、30.1、27.4、和25.4。
实施例2：重组AuEH2及AuEH2突变酶对映选择性的测定
在1.5mL EP管中加入500μL菌悬液和450μL磷酸钠缓冲液(pH 7.5)，10℃保温5min，再加入50μL rac-SO(终浓度10mmol/L)进行反应。定时取样50μL至1mL乙酸乙酯(含1mmol/L正己醇作为内标)中萃取，样品分析采用气相色谱仪GC-2010(日本Shimadzu公司)、手性气相色谱柱和氢火焰离子化检测器。分析条件为：进样口和检测器温度250℃；初始柱温100℃，以5℃/min升温至195℃；载气为氮气，流速3.0mL/min，分流比1:50。正己醇、(R)-环氧苯乙烷和(S)-环氧苯乙烷的保留时间分别为3.477、5.959和6.065min。底物e.e.s＝[(S-R)/(R+S)]×100％；E＝ln[(1-c)×(1-e.e.s)]/ln[(1-c)×(1+e.e.s)]。其中：R和S表示(R)-和(S)-环氧苯乙烷浓度，c表示rac-SO转化率。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims (10)

1.一种环氧化物水解酶突变体，其特征在于，所述环氧化物水解酶突变体是(a)或(b)或(c)：
(a)在SEQ ID NO.1所示序列基础上，将第250位丙氨酸分别突变为异亮氨酸、甲硫氨酸、酪氨酸、丝氨酸、亮氨酸或缬氨酸；
(b)在(a)限定的氨基酸序列中经过取代、缺失或者添加一个或几个氨基酸且具有环氧化物水解酶活性的由(a)衍生的蛋白质；
(c)与(a)限定的氨基酸序列具有85％及以上同源性且具有环氧化物水解酶活性的蛋白质。
2.一种表达权利要求1所述环氧化物水解酶突变体的基因工程菌，其特征在于，以携带编码宇佐美曲霉环氧化物水解酶的基因的重组质粒为模板，设计并合成引物，通过PCR进行定点突变，得到携带编码突变体的基因的重组质粒，转化表达宿主。
3.根据权利要求2所述的基因工程菌，其特征在于，所述携带编码宇佐美曲霉环氧化物水解酶的基因的重组质粒是携带编码宇佐美曲霉环氧化物水解酶的基因的pET-28a(+)，所述表达宿主是E.coli BL21(DE3)。
4.一种获得权利要求1所述环氧化物水解酶突变体的方法，其特征在于，是将权利要求4所述的基因工程菌种子液以含卡那霉素抗性的LB培养基培养至对数中后期，加入IPTG诱导重组基因的高效表达环氧化物水解酶突变体。
5.一种应用权利要求1所述环氧化物水解酶突变体生产(S)-环氧苯乙烷的方法，其特征在于，是以所述环氧化物水解酶突变体或表达所述环氧化物水解酶突变体的基因工程菌为催化剂，在缓冲体系中催化外消旋环氧苯乙烷生成(S)-环氧苯乙烷。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述缓冲体系可以是单水相或者水相与有机相构成的双相体系。
7.权利要求1所述环氧化物水解酶突变体在手性生物催化中的应用。
8.权利要求2所述的基因工程菌在手性生物催化中的应用。
9.编码权利要求1所述环氧化物水解酶突变体的基因。
10.携带权利要求9所述基因的载体或细胞。
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