CN110257352A - 一种环氧化物水解酶及其用途 - Google Patents

一种环氧化物水解酶及其用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种新的环氧化物水解酶，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。该环氧化物水解酶不仅大大提高了酶的温度稳定性并维持高酶活性，同时在酶底物的ee值效果上也取得了显著的进步。

Description

一种环氧化物水解酶及其用途
技术领域
本发明属于生物领域，具体涉及一种环氧化物水解酶及其用途。
背景技术
环氧化物通过选择性开环可以制备具有光学活性的手性醇类化合物及选择性保留具有重要价值的环氧化物。如作为神经保护药关键性合成子的(R)－4－氯苯基乙二醇可经环氧化物水解酶水解相应的环氧化物制备而得。与之类似，茚环类环氧化物经环氧化物水解酶催化开环水解也可以制得抗艾滋病药物齐夫而定的重要中间体物质:(1R，2S)－环氧化合物和(1R，2R)－二醇。环氧化物水解酶广泛存在于自然界中，在植物、动物、真菌和细菌中均存在环氧化物水解酶，其催化环氧化物水解反应相比化学催化有诸多优点，如选择性高、催化效率高、环境友好等，因此引起了广泛关注。
环氧化物水解酶是可以将水分子选择性地加成至环氧环上，从而生成邻二醇类化合物的一种酶，它还可通过水解人体内环氧化物从而降低人体患癌症的几率。在活细胞中，芳香族和脂肪族的环氧化物均可被环氧化物水解酶水解，获得二醇，取得解毒和信号调节作用。
自HECHTBERGER等报道了利用来源于红球菌的环氧化物水解酶选择性地催化1，2－环氧庚烷不对称水解生成相应的R－二醇后，在水相中不同来源的环氧化物水解酶催化不同结构的环氧化物不对称水解的研究相继出现。21世纪初，我国的研究人员在产环氧化物水解酶的菌株筛选方面做了大量工作.曲音波课题组从全国多地收集到的长期被石油、动物油或植物油污染的土壤或水样中分离得到一株产环氧化物水解酶的类产碱假单胞菌，该菌可用于拆分苯基缩水甘油酸乙酯.研究发现，在添加吐温60的反应体系中，该菌全细胞催化的底物浓度可达78mmol/L，且产物的光学纯度达98％，但产率较低(33％)。孙万儒课题组从土壤样品中筛选出一株产环氧化物水解酶的黑曲霉菌株，利用该菌株催化外消旋环氧苯乙烷不对称水解，得到(R)－1，2－苯基乙二醇的光学纯度大于99％，但随着反应时间的延长，底物的非酶水解严重，导致产物的光学纯度明显下降。许建和课题组从土壤中筛选出一株产环氧化物水解酶的巨大芽孢杆菌，该菌具有较高的对映体选择性，可选择水解(R)－缩水甘油苯基醚，对映体选择率E值高达47.8％，可选择性地水解(R)－缩水甘油苯基醚，后期他们还报道了绿豆中存在环氧化物水解酶的事实。国外同样也对产环氧化物水解酶的菌株进行了筛选研究.DUARAH等从土壤里筛选到一株塔宾曲霉，该菌株具有反应速度快、选择性高等优点，反应45min可将外消旋的环氧苯乙烷水解成光学纯度达97％的(R)－苯乙二醇，且底物的转化率高达99％.同时还研究了苯环上的氯取代对反应的影响，结果表明，取代后底物的转化率不受影响，但是产物的光学纯度以及反应时间受到严重影响.
姚瑶等采用RT-PCR和THSO-PCR扩增侧翼未知DNA序列技术从绿豆(Vignaradiata)中克隆了一种新型环氧化物水解酶Vr EH3的基因Vreh3,Vreh3编码区DNA序列长度为1178bp,包含2个142bp和79bp的内含子,以及957bp的开放阅读框,编码318个氨基酸。VrEH3的理论相对分子质量和等电点分别为36.2×103和5.59；保守的催化三联体为Asp101-Asp262-His297。将Vreh3与表达载体p ET-28a(+)连接,转化大肠杆菌BL21(DE3)获得重组Vr EH3。该酶可对映归一性水解外消旋环氧苯乙烷((R,S)-SO)产生(R)-苯基乙二醇,得率高达79.4％,对映体过量值(e.e.值)为94.7％。
王瑞从菜豆(Phaseolus vulgaris)基因组中扩增了一种编码PvEH3的基因pveh3,并将其在大肠杆菌E.coli BL21(DE3)中成功实现异源表达；采用定点和迭代突变技术对PvEH3进行分子改造,以获得高活力和高区域选择性的PvEH3突变体；通过构建双相催化体系解除底物对最优突变体PvEH3G170E/F187L/P237L的抑制作用。以菜豆总RNA为模板,采用逆转录PCR和巢式PCR技术扩增了一条新型环氧化物水解酶的编码基因pveh3,其长度为957bp,编码318个氨基酸。一级和三维结构分析表明PvEH3属于α/β水解酶超家族,其催化三联体为D101-H297-D262,两个保守质子供体为Y150和Y232。SDS-PAGE结果显示PvEH3的表观分子量为36.1kDa,催化特性研究表明PvEH3能催化对氯环氧苯乙烷(pCSO)的对映归一性水解,产物(R)-对氯苯乙二醇(pCPED)的对映体过量值(eep)为85.1％。PvEH3对(S)-和(R)-pCSO的区域选择性系数αS和βR分别为87.0％和98.0％。
目前报道的能生产环氧化物水解酶的微生物有很多种。工业生产中常用的是具有较高酶活性的红球菌属。然而该酶极不稳定，对温度特别敏感，在35℃保温30min后，酶活力只有原来的60％，这极大限制了生物催化剂的使用效率。
发明人此前研究发明了一种环氧化物水解酶(参见CN201010253607.2)，虽然活性以及耐温性能得到了一定的提高，但是仍在工业化生产中存在一些缺陷。因此，如何提高酶的温度稳定性并维持高酶活性，是目前急需解决的一个问题。
发明内容
本发明提供一种改进的环氧化物水解酶。
具体的，本发明提供的环氧化物水解酶EH-G，其相应的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示.具体的氨基酸序列为：
其核苷酸序列如下：
该酶的催化机理为:先由酶的帽子结构中2个酪氨酸残基将环氧化物中的1个O原子质子化，再经酶的1个天冬氨酸残基进攻该部分被质子化的环氧化物，形成1个共价结合的中间体，然后落入酶活性中心的1个水分子受到组氨酸残基和另一个天冬氨酸残基的活化，失去1个质子，形成1个羟基，该羟基进而进攻乙二醇－单酯－酶中间体，酪氨酸被还原，环氧化物被水解生成二醇。
改造的酶通过在该酶的帽子结构中改构增加2个酪氨酸残基以及在活性中心边缘增加一个组氨酸残基来分别增加将环氧化物中的O原子质子化的能力，同时也提高落入酶活性中心的1个水分子受到组氨酸残基活化的能力。
更进一步的，提供一种扩增该酶的引物对，其序列如F1：
CATATGatgcaactgaacaatgcgaa(SEQ ID NO：7)和R1：
CTCGAGtcaatcgataccggcagttc(SEQ ID NO:8)所示。
更进一步的，提供一种表达目的蛋白的方法，将SEQ ID NO：4连接pET-32a(+)载体，然后转化E.coli BL21(DE3)进行IPTG诱导表达。
更进一步的，本发明提供一种验证酶活性的方法，具体的为在2mL EP管中加入100mg酶和150μL磷酸钾缓冲液(100mmol/L，pH 7.0)，25℃预热5min；加入50μL(R，S)-SO(200mmol/L)，25℃反应3.5h后8000r/min离心2min，取100μL上清液于1mL乙酸乙酯(含1mmol/L的正己醇作为内标)，激烈震荡，8000r/min离心2min，吸取上层有机相，经无水硫酸镁干燥，过0.22μm有机膜，进行气相色谱分析。具体的气相色谱分析方法为：样品分析采用气相色谱仪GC-2010、手性气相色谱柱CYCLOSIL-B和氢火焰离子化检测器。进样口和检测器温度均为250℃；初始柱温100℃，以5℃/min升温至210℃；载气为氮气，流速2.0mL/min，分流比1∶50。在此检测条件下，正己醇、(R)-SO、(S)-SO、(S)-PED和(R)-PED的保留时间分别为3.742、6.357、6.483、17.409min和17.524min。(R)-PED摩尔产率＝(S/RS0)×100％，e.e.＝[(S-R)/(S+R)]×100％；其中：S和R分别代表(S)-和(R)-PED的最终摩尔浓度，RS0代表(R，S)-SO的初始摩尔浓度。
更进一步的，本发明提供一种验证酶最适温度的方法，在缓冲液pH为7.0的条件下测定EH在不同温度条件下(10-60℃)催化pCSO水解的比活力，以最高比活力为100％，计算不同温度条件下EH的相对酶活力。
附图说明
图1为本发明环氧化物水解酶纯化过程的SDS-PAGE图，泳道1/3/5分别是EH、EH-G和EH-T三种目的蛋白并且条带大小相同，泳道2和4的对照，没有目的蛋白出现。
图2为酶活性结果图。A为EH，B为EH-G。
图3为温度对环氧化物水解酶稳定性影响的效果图。
有益效果
相对于现有技术，本发明的有益效果在于：通过蛋白空间结果设计以及筛选技术得到一种新的DNA分子，其主体核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，编码具有如SEQ ID NO:3所示氨基酸序列的环氧化物水解酶。该环氧化物水解酶不仅大大提高了酶的温度稳定性并维持高酶活性，同时在酶底物的ee值效果上也取得了显著的进步。
具体实施方式
实施例1最后酶序列的获得
利用Chembio3D Ultra 12.0软件模拟底物(R)-pCSO的三维结构并进行能量最小化处理，在己知亲核攻击位点为D101的前提下利用AutoDock 4.2软件将SEQ ID NO：1的酶(其核苷酸如SEQ ID NO：2所示)与(R)-pCSO进行分子对接模拟，并利用Gromacs 4.5软件将对接复合物进行动力学模拟。采用PyMOL软件找出(R)-pCSO周围12埃以内的氨基酸位点。发现，通过在该酶的帽子结构中改构增加2个酪氨酸残基以及在活性中心边缘增加一个组氨酸残基来分别增加将环氧化物中的O原子质子化的能力，同时也提高落入酶活性中心的1个水分子受到组氨酸残基活化的能力。并设计获得了EH-G酶，其相应的氨基酸序列如SEQ IDNO：3所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示；对照的改构酶EH-T酶，其相应的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。采用全基因合成获得相应的基因。
实施例2酶的表达与纯化
以F1： CATAT Gatgcaactgaacaatgcgaa(SEQ ID NO：7)和R1： CTCGAG tcaatcgataccggcagttc(SEQ ID NO:8)为引物，下划线分别是Nde I和XhoI限制性酶切位点。分别以全合成的SEQ ID NO：2/4/6为模板，扩增条件为94℃3min，35个循环(94℃35s，56℃25s，72℃65s)，72℃10min，获得EH、EH-G、EH-T基因编码区cDNA序列，PCR产物回收后与pUCm-T连接，转化E.coli JM109，测序正确的重组质粒命名为pUCm-T-EH、pUCm-T-EH-G、pUCm-T-EH-T。
用Nde I和Xho I双酶切pUCm-T-EH、pUCm-T-EH-G、pUCm-T-EH-T，割胶回收目的基因EH、EH-G、EH-T，与经同样双酶切的pET-32a(+)连接，获得重组表达质粒pET-32a(+)-EH，pET-32a(+)-EH-G，pET-32a(+)-EH-T，转化E.coli BL21(DE3)，经过PCR鉴定，分别获得阳性的工程菌命名为E.coliBL21/pET-32a(+)-EH、E.coliBL21/pET-32a(+)-EH-G、E.coliBL21/pET-32a(+)-EH-T。在IPTG终浓度0.2mmol/L，16℃诱导表达重组目的蛋白。1000mL诱导发酵液经8000r/min离心收集菌体，用5mL磷酸钾缓冲液(100mmol/L，pH 7.0)悬浮，采用Ni柱进行目的蛋白纯化。不含目的基因的pET-32a(+)转化E.coli BL21(DE3)作为空白对照，命名为E.coli/pET-32a(+)。结果如图1所示：三种目的蛋白均得到了表达，并且条带大小相同，泳道2和4的对照，没有目的蛋白出现。
实施例3酶活性验证
在2mL EP管中加入100mg酶和150μL磷酸钾缓冲液(100mmol/L，pH7.0)，25℃预热5min；加入50μL(R，S)-SO(200mmol/L)，25℃反应3.5h后8000r/min离心2min，取100μL上清液于1mL乙酸乙酯(含1mmol/L的正己醇作为内标)，激烈震荡，8000r/min离心2min，吸取上层有机相，经无水硫酸镁干燥，过0.22μm有机膜，进行气相色谱分析。具体的气相色谱分析方法为：样品分析采用气相色谱仪GC-2010、手性气相色谱柱CYCLOSIL-B和氢火焰离子化检测器。进样口和检测器温度均为250℃；初始柱温100℃，以5℃/min升温至210℃；载气为氮气，流速2.0mL/min，分流比1∶50。在此检测条件下，正己醇、(R)-SO、(S)-SO、(S)-PED和(R)-PED的保留时间分别为3.742、6.357、6.483、17.409min和17.524min。(R)-PED摩尔产率＝(S/RS0)×100％，e.e.＝[(S-R)/(S+R)]×100％；其中：S和R分别代表(S)-和(R)-PED的最终摩尔浓度，RS0代表(R，S)-SO的初始摩尔浓度。具体的结果如图2所示，EH-G的酶解效果为99.8％ees，30.5％yield，99.70％eep，69.5％yield，而EH酶解效果为99.4％ees，18.5％yield，99.5％eep，81.5％yield，从结果可以看出EH-G酶不仅具有较好的对映选择性，且具有良好的对映体归一性。本领域熟知，从99.4％ees变为99.8％ees在本领域已经是非常不容易的。相反空白对照和EH-T均没有相应的酶解效果。
实施例4温度稳定性分析
在缓冲液pH为8.0的条件下测定EH和EH-G在不同温度条件下(10-60℃)放置30min的条件下，计算催化pCSO水解的比活力，以最高比活力为100％，计算不同温度条件下EH和和EH-G的相对酶活力。结果如图3所示，由温度稳定性曲线可知当野生型在35摄氏度保温30min后，残余酶活力为61％，40摄氏度保温30min之后只剩下1.2％的活力。EH-G最高相对酶活出现在35摄氏度保温30min的条件，在45摄氏度保温30min时还有接近50％的酶活。从图3可以看出，EH-G酶活高活性区段比野生型有更好的温度范围。由此可见，EH-G具有较好的热稳定性具有更好的工业适用性。
实施例5pH稳定性分析
将实施例2中纯化得到的EH-G酶和EH酶分别于pH 5.O,pH 6.O,pH 7.O,pH 8.O,pH9.O,pH 10.0及室温下放置30min后，于pH 8.0的条件下，按照上述检测方法测定酶的活性，并根据对照组计算残余活力。对照组实验为:EH-G酶和EH酶不经过30min的pH梯度放置，直接于pH8.0测酶活，对应的酶活定义为100。结果显示，EH-G酶在pH5.0,pH6.0,pH10.0放置30min后，残余活力分别是15.6、19.2和16.2；EH酶在pH5.0,pH6.0,pH10.0放置30min后，残余活力分别是11.2、13.2和13.8。EH-G酶和EH酶在pH9残余活力分别是88.9和81.5。这说明pH对EH-G酶和EH酶稳定性的影响基本一致，EH-G酶的在pH8-9具有更好的稳定性。
尽管本发明的内容已经通过上述优选实施例作了详细介绍，但应当认识到上述的描述不应被认为是对本发明的限制。在本领域技术人员阅读了上述内容后，对于本发明的多种修改和替代都将是显而易见的。因此，本发明的保护范围应由所附的权利要求来限定。
序列表
<110> 陕西斯戴木生物科技有限公司
<120> 一种环氧化物水解酶及其用途
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 253
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 1
Met Gln Leu Asn Asn Ala Asn Asp Asn Thr Gln Phe Arg Ala Leu Leu
1 5 10 15
Phe Asp Val Gln Gly Thr Leu Thr Asp Phe Arg Ser Thr Leu Ile Glu
20 25 30
His Gly Leu Ser Ile Leu Gly Asp Arg Val Asp Arg Glu Leu Trp Glu
35 40 45
Glu Leu Val Asp Gln Trp Arg Gly Cys Tyr Arg Asp Glu Leu Asp Ser
50 55 60
Leu Val Lys Gln Glu Lys Trp Arg Ser Val Arg Ala Val Tyr Arg Asp
65 70 75 80
Ser Leu Ile Asn Leu Leu Ala Lys Phe Ser Asp Ser Phe Cys Ala Thr
85 90 95
Ser Ala Glu Val Glu Leu Leu Thr Asp Gly Trp Glu Arg Leu Arg Ser
100 105 110
Trp Pro Asp Val Pro Ser Gly Leu Glu Gln Leu Arg Ser Lys Tyr Leu
115 120 125
Val Ala Ala Leu Thr Asn Ala Asp Phe Ser Ala Ile Val Asn Val Gly
130 135 140
Arg Ser Ala Lys Leu Gln Trp Asp Ala Val Leu Ser Ala Gln Leu Phe
145 150 155 160
Gly Ala Tyr Lys Pro His Arg Ser Thr Tyr Glu Gly Ala Ala Thr Leu
165 170 175
Leu Gly Ile Ala Pro Ser Glu Ile Leu Met Val Ala Ser His Ala Tyr
180 185 190
Asp Leu Glu Ala Ala Arg Glu Val Gly Ala Gly Thr Ala Tyr Val Arg
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Arg Pro Leu Glu Tyr Gly Pro Thr Gly Arg Thr Glu Asp Val Pro Asp
210 215 220
Gly Arg Phe Asp Phe Leu Val Asp Ser Ile Ser Glu Leu Ala Asp Gln
225 230 235 240
Leu Gly Cys Pro Arg Leu Gly Gly Thr Ala Gly Ile Asp
245 250
<210> 2
<211> 762
<212> DNA
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agagtggatc gagaactctg ggaggaattg gtcgaccaat ggcgcggctg ctatcgagac 180
gagctcgatt ccttggtcaa acaggagaaa tggcgctcgg tccgcgccgt gtaccgagat 240
tctcttatca atcttctcgc aaaattctct gacagtttct gcgccacctc ggccgaagtg 300
gaattgctga ccgatggttg ggaacgtctt cggtcgtggc cggacgtccc ctctggattg 360
gaacagctgc ggtctaagta cctcgtcgcg gcactgacga atgcggactt ttctgccatc 420
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<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
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<211> 759
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 4
atgcaattaa ataacgctaa tgataacact cagtttcgtg ccttgctttt cgacgttcaa 60
ggtaccctca cagattttcg ctatacgcta attgaacatg gcctgtctat cttaggagac 120
cgagtcgatt acgagttgtg ggaagagctt gtagaccagt ggcgggggtg ttatagagat 180
gaactcgact ccctagtgaa acaagagaag tggaggtcag ttcgtgcagt ctaccgcgat 240
tcgctgataa atttattggc gaaattcagt gacagctttt gcgctacttc tgccgaagta 300
gagcttctca ccgatggttg ggaacgacta cggtcctggc ctgacgtgcc ctcaggcctg 360
gagcagttaa gatcgaagta tttggttgca gcgcttacaa acgctgattt cagtgcccac 420
gtcaatgtag gaaggagcgc aaaactccaa tgggacgcgg tgctatctgc tcagctgttt 480
ggggcctaca agccacatcg ttccacgtat gaaggtgcag cgactttatt gggcattgct 540
ccgtcagaga tccttatggt tgcctcgcac gcatacgatc tcgaagcggc tcgcgaggtc 600
ggagccggga ccgcatatgt acgacggcct ctagaatacg gtcccacagg cagaacggag 660
gacgtgccag atggaaggtt cgactttctg gttgatagta taagcgaatt agcggaccaa 720
ttggggtgtc cgcgtcttgg tggcactgct ggaattgat 759
<210> 5
<211> 253
<212> PRT
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 5
Met Gln Leu Asn Asn Ala Asn Asp Asn Thr Gln Phe Arg Ala Leu Leu
1 5 10 15
Phe Asp Val Gln Gly Thr Leu Thr Asp Phe Tyr Ser Thr Leu Ile Glu
20 25 30
His Gly Leu Ser Ile Leu Gly Asp Arg Val Tyr Arg Glu Leu Trp Glu
35 40 45
Glu Leu Val Asp Gln Trp Arg Gly Cys Tyr Arg Asp Glu Leu Asp Ser
50 55 60
Leu Val Lys Gln Glu Lys Trp Arg Ser Val Arg Ala Val Tyr Arg Asp
65 70 75 80
Ser Leu Ile Asn Leu Leu Ala Lys Phe Ser Asp Ser Phe Cys Ala Thr
85 90 95
Ser Ala Glu Val Glu Leu Leu Thr Asp Gly Trp Glu Arg Leu Arg Ser
100 105 110
Trp Pro Asp Val Pro Ser Gly Leu Glu Gln Leu Arg Ser Lys Tyr Leu
115 120 125
Val Ala Ala Leu Thr Asn Ala Asp Phe Ser Ala Ile Val Asn Val Gly
130 135 140
Arg Ser Ala Lys Leu Gln Trp Asp Ala Val Leu Ser Ala Gln Leu Phe
145 150 155 160
Gly Ala Tyr Lys Pro His Arg Ser Thr Tyr Glu Gly Ala Ala Thr Leu
165 170 175
Leu Gly Ile Ala Pro Ser Glu Ile Leu Met Val Ala Ser His Ala Tyr
180 185 190
Asp Leu Glu Ala Ala Arg Glu Val Gly Ala Gly Thr Ala Tyr Val Arg
195 200 205
Arg Pro Leu Glu Tyr Gly Pro Thr Gly Arg Thr Glu Asp Val Pro Asp
210 215 220
Gly Arg Phe Asp Phe Leu Val Asp Ser Ile Ser Glu Leu Ala Asp Gln
225 230 235 240
Leu Gly Cys Pro Arg Leu Gly Gly Thr Ala Gly Ile Asp
245 250
<210> 6
<211> 759
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 6
atgcaattaa ataacgctaa tgataacact cagtttcgtg ccttgctttt cgacgttcaa 60
ggtaccctca cagattttta ttctacgcta attgaacatg gcctgtccat cttaggagac 120
cgcgtctacc gagagttgtg ggaagagctt gtagatcagt ggcgggggtg ttatagagac 180
gaactcgatt cactagtgaa acaagagaag tggaggtcgg ttcgtgcagt ctaccgcgac 240
agtctgataa atttattggc gaaattcagc gattcttttt gcgctacttc cgccgaagta 300
gagcttctca ccgacggttg ggaacgacta cggtcatggc ctgatgtgcc ctcgggcctg 360
gagcagttaa gaagtaagta tttggttgca gcgcttacaa acgctgactt cagcgccatt 420
gtcaatgtag gaaggtctgc aaaactccaa tgggatgcgg tgctatccgc tcagctgttt 480
ggggcctaca agccacaccg ttcaacgtat gaaggtgcag cgactttatt gggcatcgct 540
ccgtcggaga tacttatggt tgccagtcat gcatacgacc tcgaagcggc tcgcgaggtc 600
ggagccggga ccgcatatgt acgacggcct ctagaatacg gtcccacagg cagaacggag 660
gatgtgccag acggaaggtt cgattttctg gttgacagca tttctgaatt agcggatcaa 720
ttggggtgtc cgcgtcttgg tggcactgct ggaatcgac 759
<210> 7
<211> 26
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 7
catatgatgc aactgaacaa tgcgaa 26
<210> 8
<211> 26
<212> DNA
<213> 2 Ambystoma laterale x Ambystoma jeffersonianum
<400> 8
ctcgagtcaa tcgataccgg cagttc 26

Claims (6)

1.一种环氧化物水解酶EH-G，其特征在于：其相应的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。
2.一种环氧化物水解酶EH-G的基因，其特征在于：其序列如SEQ ID NO：4所示。
3.一种引物对，其序列分别为CATATGatgcaactgaacaatgcgaa(SEQ ID NO：7)和R1：CTCGAGtcaatcgataccggcagttc(SEQ ID NO:8)所示。
4.一种表达目的蛋白的方法，其特征在于；将SEQ ID NO：4和核酸连接pET-32a(+)载体，然后转化E.coli BL21(DE3)进行IPTG诱导表达。
5.一种验证酶活性的方法，其特征在于：在2mL EP管中加入100mg权利要求1的酶和150μL磷酸钾缓冲液(100mmol/L，pH7.0)，25℃预热5min；加入50μL(R，S)-SO(200mmol/L)，25℃反应3.5h后8000r/min离心2min，取100μL上清液于1mL乙酸乙酯(含1mmol/L的正己醇作为内标)，激烈震荡，8000r/min离心2min，吸取上层有机相，经无水硫酸镁干燥，过0.22μm有机膜，进行气相色谱分析。具体的气相色谱分析方法为：样品分析采用气相色谱仪GC-2010、手性气相色谱柱CYCLOSIL-B和氢火焰离子化检测器。进样口和检测器温度均为250℃；初始柱温100℃，以5℃/min升温至210℃；载气为氮气，流速2.0mL/min，分流比1∶50。在此检测条件下，正己醇、(R)-SO、(S)-SO、(S)-PED和(R)-PED的保留时间分别为3.742、6.357、6.483、17.409min和17.524min。(R)-PED摩尔产率＝(S/RS0)×100％，e.e.＝[(S-R)/(S+R)]×100％；其中：S和R分别代表(S)-和(R)-PED的最终摩尔浓度，RS0代表(R，S)-SO的初始摩尔浓度。
6.一种验证酶最适温度的方法，在缓冲液pH为7.0的条件下测定权利要求1所述的酶在不同温度条件下(10-60℃)催化pCSO水解的比活力，以最高比活力为100％，计算不同温度条件下该酶的相对酶活力。
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