CN101522892A - 对映选择性环氧化物水解酶和用其制备对映纯环氧化物的方法 - Google Patents

对映选择性环氧化物水解酶和用其制备对映纯环氧化物的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及分离自海洋微生物的对各种环氧化物底物具有高对映选择性的对映选择性环氧化物水解酶蛋白，以及通过采用所示环氧化物水解酶制备具有高对映纯度的环氧化物的方法。本发明的对映选择性水解蛋白可用于以较高的产率制备具有高度生物活性的对映纯环氧化物。

Description

对映选择性环氧化物水解酶和用其制备对映纯环氧化物的方法
发明领域
本发明涉及对映选择性环氧化物水解酶和用对映选择性环氧化物水解酶水解各种环氧化物底物从而制备具有对映纯活性的环氧化物的方法。
发明背景
很多生物活性物质如药物以不同的对映体形式存在，只有特定的对映体才具有所需功效，其余的对映体会导致严重的不良反应。在安全性和生物活性方面，必须得到单一对映体，因此，可对合成对映纯生物活性物质进行许多研究。
对映纯环氧化物和邻二醇为制备对映纯生物活性化合物如药用化合物、肽类和功能性食品的通用合成中间体(Grogan，et al.，FEMSMicrobiol.Lett.，141：239-243，1996；Arahira，et al.，Eur.J.Biochem.，267：2649-2657，2000)，因为这些化合物具有优良的反应性并可诱导各种反应。
特别地，可用手性化学催化剂和酶制备对映纯环氧化物，只有单一对映体是通过用环氧化物水解酶进行选择性水解得到外消旋底物中的各个对映体来制备的。在不久的将来，该方法可被用于商业，因为其可将廉价的外消旋底物变为具有高附加值的对映纯环氧化物。环氧化物水解酶只对映选择性地将外消旋环氧化物底物中的(R)或(S)-对映体水解为二醇而剩下其他类型的对映体，从而得到对映纯环氧化物。此外，环氧化物水解酶对(R)或(S)-对映体的对映选择性取决于微生物和底物结构。
环氧化物水解酶(EHase；EC 3.3.2.3)为常见的酶，已从各种来源如细菌、酵母、真菌、昆虫、植物和哺乳动物中分离(Weijers，et al.，J.Mol.Catal.B Enzym.，6：199-214，1999；Archelas，& Furstoss，Curr.Opin.Chem.Biol.，5：112-119，2001)。由于在通过对映选择性EHase的动力学拆分来制备对映纯环氧化物中的潜在应用，已对几种EHase进行研发(Tokunaga，et al.，Science，277：936-938，1997)。
但是，对映选择性EHases的数量有限，这需要研究开发新型对映选择性EHases用于在药学工业中制备对映纯环氧化物。
大多数EHases为α/β水解酶家族成员，该家族包括蛋白酶、脂肪酶、酯酶、脱卤素酶和过氧化物酶(Nardini，& Dijkstra，Curr.Opin.Struct.Biol.，9：732-737，1999；Rick，et al，.J.Am.Chem.Soc.，121：7417-7418，1999)。α/β区域由被α螺旋环绕的核心—平行或混合β层构成。这些酶的特征为采用两步机理，其中酶的催化亲核部分先进攻共价中间体的极性亲电底物，然后再将其水解(Yamada，et al.，J.Biol.Chem.，275：23082-23088，2000)。α/β水解酶折叠酶的保守催化三元体(triad)由亲核残基(Asp或Ser)、酸性残基(Asp或Glu)和保守组氨酸残基构成。亲核基团适合保守的氨基酸序列基序，Sm-X-Nu-Sm(Sm＝小残基，X＝任何残基，Nu＝亲核基团)。其它保守的氨基酸序列为包含酶的含氧的阴离子洞(oxyanion hole)的HGXP基序(Ollis，et al.，Protein Eng.，5：197-211，1992)。
但是，EHases中一级序列的保守性仅限制在关键区域的2或3个氨基酸，这使得通过同源检索进行筛选比较困难。
发明简述
本发明的发明者通过筛选来自各种海洋环境的赤细菌(Erythrobacter sp.)、鞘氨醇细菌(Sphingopyxis sp.)、新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium sp.)和红细菌(Rohdobacterium sp.)，分析它们基因组的ORF序列确定候选基因，并表达候选基因发现了具有高对映选择性水解活性的环氧化物水解酶。
本发明的目的为提供来自海洋环境的可产生高对映纯环氧化物的对映选择性环氧化物水解酶蛋白。
本发明的另外的目的为提供通过采用对各种环氧化物底物具有高对映选择性的环氧化物水解酶蛋白制备对映纯环氧化物的方法。
本发明的另一目的为提供来自各种海洋环境的具有对映选择性水解酶活性的赤细菌(Erythrobacter sp.)、鞘氨醇细菌(Sphingopyxissp.)、新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium sp.)和红细菌(Rohdobacteriumsp.)及筛选它们的方法。
为了这些目的，本发明提供了分离自海滨赤细菌(Erythrobacterlitoralis)的对映选择性环氧化物水解酶蛋白，其具有以下特征：1)通过SDS-PAGE方法测定，分子量为30-45kDa；2)最适pH为6.5-8.0；和3)最适温度为40-60℃。优选地，所述蛋白包含SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列、SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列或SEQ IDNO：17所示的氨基酸序列。更优选地，SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列由SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列编码，SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列由SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列编码，SEQ IDNO：17所示的氨基酸序列由SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列编码。
此外，本发明提供了分离自鞘氨醇细菌(Sphingophyxis alaskensis)的对映选择性环氧化物水解酶蛋白，其具有以下特征：1)通过SDS-PAGE方法测定，分子量为45-50kDa；2)最适pH 7.0-8.0；和3)最适温度为30-40℃。优选地，所述蛋白具有SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列，更优选地，其由SEQ ID NO：29所示的核苷酸序列编码。
在另一方面，本发明提供了分离自食芳香物新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium aromaticivorans)的对映选择性环氧化物水解酶蛋白，其具有以下特征：1)通过SDS-PAGE方法测定，分子量为40-45kDa；2)最适pH为7.0-8.0；和3)最适温度为30-40℃。优选地，所述蛋白具有SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列，更优选地，其由SEQ ID NO：31所示的核苷酸序列编码。
在另外的方法，本发明提供了分离自红细菌(Rohdobacterium sp.)HTCC2654的对映选择性环氧化物水解酶蛋白，其具有以下特征：1)通过SDS-PAGE方法测定，分子量为35-40kDa；2)最适pH为7.0-8.0；和3)最适温度为30-40℃。优选地，所述蛋白具有SEQ IDNO：32所示的氨基酸序列，更优选地，其由SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列编码。
在又一方面，本发明提供了通过采用对映选择性环氧化物水解酶蛋白制备对映纯环氧化物的方法。
附图简述
通过参考以下详述并结合附图，可以更深入地理解本发明，从而明白无误地领会本发明的整体意义及其许多相关优点。
图1A所示为各种环氧化物底物类型，其中A、B、C、D分别表示苯乙烯氧化物(SO)、缩水甘油基苯基醚(GPE)、1，2-环氧己烷(EX)和1，2-环氧丁烷(EB)。
图1B所示为赤细菌(Erythrobacter spp.)JCS358对外消旋SO底物的水解活性的气相色谱分析，其中A和B分别表示(S)-苯乙烯氧化物和(R)-苯乙烯氧化物。
图2所示为赤细菌(Erythrobacter spp.)JCS358对外消旋SO底物的动力学拆分率，其中○、●和□分别表示(R)-苯乙烯氧化物面积、(S)-苯乙烯氧化物面积和对映体过量(％)。
图3A-3C所示为纯化的EEH1蛋白的氨基酸序列与已知蛋白的氨基酸序列间的序列比对。
图4A和4B所示为从EEH1和EEH2中纯化的氨基酸序列与已知蛋白的氨基酸序列间的序列比对。
图5所示为环氧化物水解酶(EHase)的系统发生分析。
图6所示为用SDS-PAGE从海滨赤细菌(Erythrobacter litoralis)HTCC2594中分离的三种EHase的纯度，其中图A表示纯化的EEH1，图B表示纯化的EEH2和EEH3。
图7A和7B所示为pH和温度对纯化的rEEH1、rEEH2和rEEH3对活性的影响，其中○、●和
Figure A200680046194D0008143409QIETU
分别表示EEH1、EEH2和EEH3。
图8所示为对映选择性EHases(EEH1、EEH2和EEH3)对外消旋SO底物的水解活性的气相色谱分析。
图9所示为用SDS-PAGE从食芳香物新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium aromaticivorans)分离的EHase的纯度。
发明详述和优选实施方案
现在将更详细地解释本发明。
本发明提供了得自海滨赤细菌(Erythrobacter litoralis)、鞘氨醇细菌(Sphingophyxis alaskensis)、食芳香物新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium aromaticivorans)和红细菌的纯化对映选择性环氧化物水解酶蛋白。
赤细菌(Erythrobacter sp.)、鞘氨醇细菌(Sphingopyxis sp.)、新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium sp.)和红细菌(Rohdobacterium sp.)通过筛选选择，然后排列它们基因组中的ORF序列以选择候选基因。对各种底物具有高对映选择性的对映选择性水解酶蛋白从候选基因的表达产物中分离和纯化。更具体而言，具有高对映选择性的对映选择性水解酶通过采用下面的筛选方法从微生物中分离，所述微生物包括赤细菌(Erythrobacter sp.)、鞘氨醇细菌(Sphingopyxis sp.)、新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium sp.)和红细菌(Rohdobacterium sp.)，它们得自于各种海洋环境。所述筛选方法包括以下步骤：
1)从各种海洋环境中制备感兴趣的样品；
2)通过在滋养培养基中培养样品来选择阳性株；
3)通过分析所述株基因组中的ORF核苷酸序列确定候选基因，将所得的核苷酸序列与已知环氧化物水解酶核苷酸序列进行序列比对；和
4)通过将候选基因导入表达载体并培养该载体来从候选基因检测具有高对映选择性水解活性的环氧化物水解酶。
筛选方法步骤1中的感兴趣的样品不特别限定，但可为得自各种海洋环境的海洋沉积物、海绵和海藻，所述海洋环境如韩国Gangwon-Do的Hoogin、Ulleungdo(岛)、Dokdo(岛)、Busan的Taejongdae和Gyeonggi-do的Sihwa以及日本的Kagoshima。可直接从收集的海洋沉积物中或在滋养培养基中培养后来分离所述株。
筛选方法步骤2中的滋养培养基不特别限定，优选为1wt％苯乙烯氧化物(SO)或烷烃混合物(nC8、C10、nC12、nC13、nC14、nC15、nC16、C17、nC18和环己烷(Sigma，MO，USA)在1L海水的矿物盐培养基(MM2)中混合。
在筛选方法中，步骤3中的细菌选自海滨赤细菌(Erythrobacterlitoralis)、赤细菌2216.25.25、赤细菌(Erythrobacter aquimaris)SW-110、赤细菌(Erythrobacter gaetabuli)、Alterierythrobacterepoxidivorans、赤细菌(Erythrobacter luteolus)SW-109、赤细菌MBIC3031和长赤细菌(Erythrobacter longus)。所述微生物可为选自海滨赤细菌(Erythrobacter litoralis)HTCC2594、赤细菌AKS329、赤细菌(Erythrobacter aquimaris)JCS325、赤细菌(Erythrobacter gaetbuli)JCS340 JCS325、赤细菌JCS340、赤细菌JCS350、赤细菌JCS358、Alterierythrobacter sp.JCS350、赤细菌(Erythrobacter aquimaris sp.)JCS360、赤细菌(Erythrobacter aquimaris sp.)JCS364、赤细菌(Erythrobacter luteolus sp.)JCS368、赤细菌HJ239、长赤细菌(Erythrobacter longus sp.)DokDo 15、海滨赤细菌(Erythrobacterlitoralis)DMS8509和赤细菌(Erythrobacter geatbuli)KCTC12227(表2)的赤细菌，但并不限于此。
可通过Ensoltek(www.ensoltek.com)生产的ProteinFinder和BLAST程序来进行开放阅读框架分析，但并不限于此。此外，保守环氧化物水解酶氨基酸序列的分析方法以及本发明的新型环氧化物水解酶可通过采用CLUSTAL W程序来进行(Thompson，et al.，Nucleic.Acids.22：4673-4680，1994)，但并不限于此。
步骤3)中的候选基因包括得自海滨赤细菌(Erythrobacter litoralis)HTCC2594的由SEQ ID NO：13表示的EEH1基因、由SEQ ID NO：16表示的EEH2基因和由SEQ ID NO：18表示的EEH3基因，得自鞘氨醇细菌(Sphingophyxis alaskensis)的由SEQ ID NO：29表示的sEEH基因，得自食芳香物新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium aromaticivorans)的由SEQ ID NO：31表示的nEEH基因和得自红细菌的由SEQ IDNO：33表示的rEEH基因，但并不限于此。此外，候选基因可为完全开放阅读框或其衍生自该基因的片段。
在筛选方法的步骤4中，表达载体可为先有技术中采用的任何表达载体，如pET-24a(+)。
在步骤4中，对各种环氧化物底物的水解活性分析通过基于提取自反应混合物的环氧化物的分光光度法分析和非提取的二醇的分光光度法定量或气相色谱来进行。
当四(4)种候选株从海洋环境种筛选出以后，从候选株中分离并纯化对各种环氧化物底物具有高对映选择性水解活性的环氧化物水解酶。通过本领域常用的通用分离和纯化方法分离并纯化环氧化物水解酶。例如，在富集有卡那霉素(50ug/ml)的LB培养基中进行接种培养后，向主培养基中加入1％培养株，培养3小时，向其中加入IPTG至终浓度为1mM。为了纯化表达基因产物，要将His-Tag加入候选基因，然后用Talon树脂(Clontech、Co.)分裂。
此外，通过分析基因组DNA中的ORF序列来分析纯化的环氧化物水解酶蛋白的编码基因，从海滨赤细菌(Erythrobacter litoralis)HTCC2594中分离出1.122bp基因(EEH1，SEQ ID NO：14)、870bp基因(EEH2，SEQ ID NO：16)和888bp基因(EEH3，SEQ ID NO：18)。
鞘氨醇细菌(Sphingophyxis alaskensis)的sEEH基因(SEQIDNO：29)、食芳香物新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium aromaticivorans)的nEEH基因(SEQ ID NO：31)和红细菌(Rohdobacterium sp.)HTCC2654的rEEH基因(SEQ ID NO：33)分别被分离。此外，每个基因被导入表达载体pET-24a(+)，转化BL21-CodonPlus(DE3)-RP(Novagen)，然后进行SDS-PAGE电泳。因此，所述水解酶为分离自海滨赤细菌(Erythrobacter litoralis)HTCC2594的41kDa-大小的蛋白(rEEH1、SEQ ID NO：13)、33.4kDa-大小的蛋白(rEEH2、SEQ ID NO：15)和34.5kDa-大小的蛋白(rEEH3，SEQ ID NO：17)，分离自鞘氨醇细菌(Sphingophyxis alaskensis)的49kDa-大小的蛋白(sEEH，SEQID NO：28)，分离自食芳香物新鞘氨醇杆菌Novosphingobiumaromaticivorans)的43kDa-大小的蛋白(nEEH，SEQ ID NO：30)和分离自鞘氨醇细菌(Sphingophyxis alaskensis)的36kDa、43kDa-大小的(rEEH，SEQ ID NO：32)分离自红细菌(Rohdobacterium sp.)HTCC2654(图9)。
本发明提供了分离自海滨赤细菌(Erythrobacter litoralis)HTCC2594的对映选择性环氧化物水解酶蛋白，其具有以下特征：
1)通过SDS-PAGE方法测定，分子量为30-45kDa；
2)最适pH为6.5-8.0；和
3)最适温度为40-60℃。
优选地，分离自海滨赤细菌(Erythrobacter litoralis)的rEEH1、rEEH2和rEEH3水解酶分子量分别为41kDa(SEQ ID NO：13所示的多肽)、33.4kDa(SEQ ID NO：15所示的多肽)和34.5kDa(SEQ IDNO：17所示的多肽)(图6A和图6B)，最适pH分别为6.5(rEEH1)、7.5(rEEH2)和8.0(rEEH3)(图7A)，最适温度分别为50℃(rEEH1)、55℃(rEEH2)和45℃(rEEH3)(图7B)。
本发明提供了分离自鞘氨醇细菌(Sphingophyxis alaskensis)的对映选择性环氧化物水解酶蛋白，其具有以下特征：
1)通过SDS-PAGE方法测定，分子量为45-50kDa；
2)最适pH为7.0-8.0；和
3)最适温度为30-40℃。
优选地，rEEH水解酶的分子量为49kDa(SEQ ID NO：28所示的多肽)(见Fig.9)，最适pH为约7，最适温度为30-40℃。
本发明提供了分离自食芳香物新鞘氨醇杆菌(Novosphingobiumaromaticivorans)的对映选择性环氧化物水解酶蛋白，其具有以下特征：
1)通过SDS-PAGE方法测定，分子量为40-45kDa；
2)最适pH为7.0-8.0；和
3)最适温度为30-40℃。
优选地，rEEH水解酶的分子量为43kDa(SEQ ID NO：30所示的多肽)(见Fig.9)，最适pH为7.0-8.0，最适温度为30-40℃。
本发明提供了分离自红细菌(Rohdobacterium sp.)HTCC2654的对映选择性环氧化物水解酶蛋白，其具有以下特征：
1)通过SDS-PAGE方法测定，分子量为35-40kDa；
2)最适pH为7.0-8.0；和
3)最适温度为30-40℃。
优选地，rEEH水解酶的分子量为36kDa(SEQ ID NO：32所示的多肽)(见图9)、最适pH为7.0-8.0；最适温度为30-40℃。
在本发明的另一方面，提供了通过采用对各种环氧化物底物具有高对映选择性的对映选择性环氧化物水解酶蛋白制备高对映纯环氧化物的方法。
在一个实施方案中，可将2-100mM的外消旋苯乙烯氧化物与纯化的酶如EEH1、EEH2、EEH3、sEEH、nEEH和rEEH、重组E.coli或野生型株在各自的最适条件下反应(由气相色谱确定)，然后应用所产生的环氧化物。
在本发明中，对映选择性环氧化物水解酶的底物没有特别限定，其实例为苯乙烯氧化物(SO)、缩水甘油基苯基醚(GPE)、环氧氯丙烷(ECH)、环氧氟丙烷(EF)、1，2-环氧丁烷(EB)和1，2-环氧己烷(EX)。
具有SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列、SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列或SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列的水解酶，可在pH 6.5-8.0和40-60℃的温度下进行制备。
具有SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列、SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列或SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列的水解酶，可在pH7.0-8.0和30-40℃的温度下进行制备。
下面的实施例中示例了本发明实际的和目前优选的实施方案。但是，本领域熟练技术人员应了解，可在本发明的精神和范围内对本公开进行修正和改进。
<实施例1>
筛选对映选择性环氧化物水解酶(EHase)-产生微生物
<1-1>材料和试剂
图1中显示了本发明所用的环氧化物，其中外消旋苯乙烯氧化物购自Fluka Co.，纯(R)-苯乙烯氧化物、纯(S)-苯乙烯氧化物和所有其它外消旋环氧化物均分别购自Aldrich Co.。Chiraldex γ-三氟乙酰基环糊精(G-TA)毛细管GC柱购自Astec Co.(Whippany，NJ)，其它培养基组分购自Merck和Difco Co。
<1-2>样品制备
海洋沉积物、海绵和海藻样品收集自Hujin(深～20m；37o 51’N，129o 45’E)、Ulleungdo(深～758.7m；38o 00’N，131o 27’E)、Dokdo(深～620m；37o 14’N，131o 45’E)、Taejongda(深～20m；35o 14’N、129o 45’E)、Sihwa(Yellow sea、Korea)和Kagoshima湾(深100～200m；31o 90’N，130o 48’E)。其中，采用各种方法如抓取(grab)、中心采样(core sampler)和配套水下呼吸器潜水(scuba diving)来收集沉积物样品。采样后，立即将0.3g冷冻的沉积物在研钵中研磨，然后在富含营养物的培养基中孵育。样品在与所有法定团体的正式合约下采集。
<1-3>株分离
将1％的SO底物、环氧氯丙烷或烷烃混合物(nC8、nC10、nC12、nC13、nC14、nC15、nC16、nC17、nC18和环己烷，Sigma Chemical Co.、St Louis、MO、USA)与1L矿物盐培养基的海水(MM2)混合(Ferrara-Guerrero et al.，Handbook of methods in microbial ecology.Lewis Publishers，Florida and p9-19，1993)来制备富含营养物的培养基。在25℃下培养7天后，分离克隆物。通过在25℃下在ZoBell琼脂中连续接种和孵育来纯化分离物。分离的株用于下面的筛选步骤。
<1-4>株培养
海滨赤细菌(Erythrobacter litoralis)HTCC2594在含0.5％蛋白胨、0.1％酵母提取物和75％海水(pH 7.5)的ZoBell 2216E肉汤(Oppenheimer & Zobell，1952)培养基中在30℃下培养1天。鞘氨醇细菌(Sphingopyxis alaskensis)和食芳香物新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium aromaticivorans)在含0.5％蛋白胨和0.3％酵母提取物的营养培养基中在30℃下培养。红细菌(Rohdobacterium sp.)HTCC2654在海产物肉汤(marine broth)2216(Difco)培养基中在25℃下培养。将细菌细胞悬浮于含20％丙三醇的ZoBell 2216E肉汤培养基中，在-80℃下保存备用。大肠杆菌DH5α和大肠杆菌BL21-CodonPlus(DE3)-RIL细胞(Stratagene，LaJolla，CA)分别用于质粒持续培养和基因表达。所述细胞在含适当抗生素的Luria-Bertani(LB)肉汤培养基中在37℃下培养。
<1-5>EHase产生株的鉴定
用如上所述的方法，本发明的一个实施方案共从海洋环境中分离出181株。在这181株中，通过分光光度法测定显示31株可水解SO底物(表1)。用气相色谱法(GC)分析了这些株的对映选择性EHase的水解活性之后，最终显示有1株，JCS358，可优先水解SO的(R)-环氧化物(表1和图1B)。
[表1]
产生对映选择性EHase的海洋微生物的筛选以及对得自微生物的16S rRNA基因的序列分析
Figure A200680046194D00161
aα-pro：α-变形菌；bγ-pro：γ-变形菌；cG.P：革兰氏阳性；dCFB：嗜纤维菌属-黄杆菌属-拟杆菌属(Cytophaga-Flavobacteria-Bacteroides)
<1-6>得自JCS358株的16S rRNA的序列分析
本发明的一个实施方案通过对所述株的基因组DNA序列上的16S rRNA基因序列分析来完成。通过PCR从基因组DNA扩增16SrRNA基因(Weisburg，et al.，J.Bacterioaol.，173：697-703，1991)，采用SEQ ID NO：2(5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′，27F)和SEQ IDNO：3(5′-AAGGAGGTGATCCAGCCGCA-3′，1518R)。DNA测序用自动测序仪(ABI 3100)采用BigDye终止子试剂盒(PE AppliedBiosystems，Foster City，CA)来进行。
结果表明属于赤细菌(Erythrobacter spp.)的JCS358株与赤细菌(Erythrobacter gaetbuli)具有98％的相似性(表2)。由于已知赤细菌(Erythrobacter spp.)为需氧异养α-变形菌，通常存在于各种海洋环境如海水、沉积物和滩涂中，要检测对环氧化物底物具有对映选择性水解活性的株是否通常在赤细菌(Erythrobacter spp.)中发现，本发明的一个实施方案检测了分离自各种海洋环境的9种其它赤细菌株的水解活性，其中所述株保存在KORDI保藏所(collection)或得自各培养物保藏所(culcture collections)(Anzai，et al.，Int.J Syst.Evol.Microbiol.，50：1563-1589，2000；Denner，et al.，Int.J Syst.Evol.Microbiol.，52：1655-1661，2002；Shiba & Simidu，Int.J Syst.Bacteriol.，32：211-217，1982；Yoon，et al.，Int.J Syst.Evol.Microbiol.，53：1169-1174，2003和Yurkov，et al.，Int.J Syst.Bacteriol.，44：427-434，1994)。
如表2所示，10株中的7株(AKS 329、JCS 325、JCS 340、JCS350、JCS 358、JCS 360和JCS 364)对SO底物显示出高对映选择性水解活性的对映体过量值。在这7株赤细菌株中，所述株的EHase的动力学偏好大都偏向(R)-SO。这些结果表明赤细菌(Erythrobacterspp.)可代谢环氧化物底物，并对精炼(fine)与环氧化物相关的新型酶具有价值。
[表2]
赤细菌(Erythrobacter spp.)的对映选择性EHase对各种环氧化物底物的活性
Figure A200680046194D00181
aee(％)：对映体过量，
babs.Conf.：绝对构型，指孵育后剩余的环氧化物，
cAD：水解的(S)-和(R)-对映体，
dX：未检测到EHase活性，
eND：不确定。
<1-7>赤细菌(Erythrobacter spp.)对各种环氧化物底物的水解活性分析
所述株的EHase活性通过基于提取自反应混合物的环氧化物的分光光度法分析和非提取二醇的分光光度法定量测定(Bhatnagar，etal.，J.Biochem.Biophys.Methods.，50：1-13，2001)。将分离的株在含30ml ZoBell培养基的烧瓶中在25℃下振摇培养。孵育24小时后，在4℃以4,300xg离心20分钟除去上清液。全细胞用10mM的磷酸钠缓冲液(pH 6.8)洗涤两次，然后将悬浮于10mM of磷酸钠缓冲液(pH 6.8)中的0.04g全细胞与含二甲基甲酰胺的4mM SO混合，所得混合物在30℃在孵育15分钟。然后，加入40μl NaIO4母液(用200mM的NaIO4在DMF中的溶液储存)，然后立即涡旋2分钟。以16,500xg离心90秒后，用分光光度法在290nm对上清液进行定量。
同样，对映选择性EHase活性测定通过气相色谱(GC)分析如下进行。将0.2g通过分光光度法测定具有EHase活性的全细胞与2mMSO在盛有1ml Tris-HCl(100Mm，pH 8.0)的10ml管形瓶中混合，在30℃下孵育15小时。用2ml己烷提取反应混合物，然后将提取物在chiraldex γ-三氟乙酰基环糊精柱(0.25mm ID，30m length；Astec，Adv.，Tech.，USA；van Loo et al.，2004)上用装有FID检测器(Hewlett-Packard，Avondale，PA，USA)的GC系统分析。
对外消旋SO的GC分析中的保温箱温度、注射器温度和检测器温度分别为90℃、220℃和230℃。对图1A所示的其它环氧化物底物的水解同样用上述方法测定。
表2中显示了这10株对图1A中所示的各种环氧化物底物的水解活性的结果，该结果表明有7株赤细菌可以不同的对映体过量值优先水解(S)-GPE，其与对SO的对映选择性水解活性相反。与SO和GPE相反，1，2-环氧己烷(EX)和1，2-环氧丁烷(EB)的(R)-和(S)-环氧化物可被大多数株水解(表2)。
<1-8>用赤细菌JCS 358对外消旋SO的动力学拆分
2mM外消旋SO的动力学拆分以批模式(batch mode)采用赤细菌(Erythrobacter spp.)JCS 358在30℃下检测。外消旋SO的初始浓度为2mM，采用0.2g全细胞。孵育24小时后，定期移去反应混合物，用己烷提取后，残留的环氧化物用GC分析。
如图2所示，可观察到用JCS 358株进行的外消旋SO的动力学拆分。其中，对(R)-SO底物的水解速率比对(S)-SO底物的要快，16小时后，(S)-SO的对映纯度从0增至99％。但是，动力学拆分2mM的SO需要16小时的事实表明由赤细菌(Erythrobacter spp.)JCS 358株产生的EHase的内源性水平不足以有效地对外消旋SO进行动力学拆分。
<实施例2>
得自海滨赤细菌(Erythrobacter litoralis)HTCC2594株的EHase基因的鉴定和系统进化分析
<2-1>得自海滨赤细菌(Erythrobacter litoralis)HTCC2594株的ORF序列分析
为了鉴别来自海滨赤细菌(Erythrobacter litoralis)HTCC2594株的EHase基因，对于上述株(其基因组序列已由Moore foundation(www.Moore.org)公开)的ORF序列的各序列(Sm-X-Nu-X-Sm-Sm基序和H-G-P)用Ensoltek(www.ensolteck.com)的ProteinFinder程序和BLAST程序进行分析。同样，候选EHase和已知EHase的氨基酸序列的成对对比用CLUSTAL W程序(Thompson、et al.、Nucleic.Acids.22：4673-4680、1994)加以分析。用通用方法分析推定的EHase活性位点残基是否存在于候选株中。为了这一目的，选择含有开环酪氨酸、HGXP基序和Sm-X-Nu-Sm-Sm(Sm＝小残基，X＝任何残基，Nu＝亲核基团)基序的序列，并与已知EHase序列进行序列比对。
结果如图3A-3C所示，图中将纯化的EEH1蛋白的氨基酸序列与已知蛋白的氨基酸序列进行比对，其中所述已知蛋白的检索号如下：
EPH1(胶红类酵母菌(Rhodotorula glutinis))，AAF64646；
Ephx1(大鼠(Rattus norvegicus))，P07687；
EPHX1(人(Homo sapiens))，AAH08291；
Eph1(红酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous))，AAF18956；
hyl1(黑曲霉(Aspergillus niger))，CAB59813和
EEH1(海滨赤细菌(Erythrobacter litoralis)HTCC2594)。
结果如图4A-4B所示，图中将纯化的EEH2和EEH3蛋白的氨基酸序列与已知蛋白的氨基酸序列进行比对，其中所述已知蛋白的检索号如下：
人(Homo sapiens)(EPHX2、Human sEH)，AAH11628；
大鼠(Rattus norvegicus)(Ephx2、Rat sEH)，CAA46211；
马铃薯(Solanum tuberosum)(pEHSt和马铃薯sEH)，AAA81890；
大豆(Glycine max)(sEHGm和大豆sEH)，CAA55293；
短根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)(ephA)，BAC46379；
海滨赤细菌(Erythrobacter litoralis)HTCC2594(EEH2)和
海滨赤细菌(Erythrobacter litoralis)HTCC2594(EEH3)。
海滨赤细菌(Erythrobacter litoralis)HTCC2594的ORF序列分析表明，所选的三个基因是1.122bp(eeh1，SEQ ID NO：14)、870bp(eeh2，SEQ ID NO：16)和888bp(eeh3，SEQ ID NO：18)。同样，还确定了大多数EHases含有共有的Sm-X-Nu-X-Sm-Sm基序、催化性三元体(triad)和含氧的阴离子洞(图3-图4)。首先，eeh1基因显示出与人微粒体EHase的35％的相似性，并含有GGD173WGS基序、催化性三元体(Asp173、Glu324和His351)和含氧的阴离子洞HGXP(HGW99P)(图3A-3C)。相反，eeh2和eeh3基因显示出与含Sm-X-Nu-X-Sm-Sm基序(对于eeh2，为VHD107YGV，对于eeh3，为AHD106WGA)、催化性三元体(对于eeh2，为Asp107、Glu250和His269；对于eeh3，为Asp106、Glu251和His270)和EHase中保守的含氧的阴离子洞HGXP的可溶性EHase的相似性(Arahira等，2000；Kaneko等，2002；Knehr等，1993；Stapleton等，1994和Strausberg等，2002；图4A and 4B)。
<2-2>系统发生学分析
为进行EHase的系统发生分析，将来自SwissProt或EMBL蛋白数据库的已知序列与eeh1、eeh2和eeh3基因的序列进行对比。用CLUSTAL W程序计算系统发生学距离，并用分子进化基因分析3.1软件绘制系统发生树(The Biodesign Institute，Tempe，AZ；Kumar等，2004)。所得结果表明，图5通过对EHase的系统发生分析绘制，其中蛋白检索号如下：
胶红类酵母菌(Rhodotorula glutinis)(AAF64649)；
大鼠(Rattus norvegicus)(P07687)；
人(Homo sapiens)(AAH08291)；
红酵母(Xanthophyllomyces dendrorhous)(AAF18956)；
黑曲霉(Aspergillus niger)(CAB59813)；
人(Homo sapiens)(AAH11628)；
大鼠(Rattus norvegicus)(CCA46211)；
马铃薯(Solanum tuberosum)(AAA81890)；
大豆(Glycine max)(CAA55293)；
放射形土壤杆菌(Agrobactrium radiobacter)sEEH(O31243)；
棒状杆菌(Corynebacterium spp.)sEEH(O52866)和
卤代烷脱卤素酶(P22643)。
如所示，用经改进的邻接(neighbor-joining)法，参照以下株的已知EHase的ORF对三个ORF进行系统发生分析：胶红类酵母菌(Rhodotorula glutinis)(EPH1；Visser等，2000)、大鼠(Rattusnorvegicus)(Ephx1，大鼠mEH；Falany等，1987)、人(Homo sapiens)(EPHX1，人mEH；Strausberg等，2002)、红酵母(Xanthophyllomycesdendrorhous)(Eph1；Visser等，1999)、黑曲霉(Aspergillus niger)(hyl1；Arand等，1999)、人(Homo sapiens)(EPHX2、人sEH；Strausberg等，2002)、大鼠(Rattus norvegicus)(Ephx2、Rat sEH；Knehr等，1993)、马铃薯(Solanum tuberosum)(pEHSt和马铃薯；sEH；Stapleton等，1994)、大豆(Glycine max)(sEHGm和大豆sEH；Arahira等，2000)、放射形土壤杆菌(Agrobactrium radiobacter)sEEH(Rink等，1997)、棒状杆菌(Corynebacterium spp.)sEEH(Misawa等，1998)和卤代烷脱卤素酶(Janssen等，1989)。所得结果表明，eeh1与带有微粒体EHase的组相关，而eeh2和eeh3与可溶性EHase相关(图5)。综上所述，本发明的来自海滨赤细菌(Erythrobacter litoralis)HTCC2594的ORF是对环氧化物底物有水解活性的EHase。
<2-3>eeh基因的克隆
为了从海滨赤细菌(Erythrobacter litoralis)HTCC2594株克隆EHase编码基因，用基因组DNA提取试剂盒(Promega，USA)分离上述株的基因组DNA，并用侧翼带有限制性酶Nde I和Xho I/Not I位点的正向(F)和反向(R)引物组扩增，分别如表3所示。
[表3]克隆eeh基因的引物组
 
引物 序列 SEQ ID NO：
eeh1F(F) 5′-CGACCCGGCATATGAGCGAGATCAGGCCCTTCGTTCT-3′ 4
eeh1R(R) 5′-CTCCACATCTCGAGTCGCATGAGTGAAAAACAGGCGCG-3′ 5
eeh2F(F) 5′-CGACCCGGCATATGGCCGGACCAAGCCTGGGCGAATGG-3′ 6
eeh2R(R) 5′-CTCCACATCTCGAGGCGTGCGAGCCAATCCAGCGTCACGC-3′ 7
eeh3F(F) 5′-CGACCCGGCATATGCCCGATCCTGCGAGCGGGATT-3′ 8
eeh3R(R) 5′-CTCCACATGCGGCCGCGGATGCCGGAGCGGGCTTAGG-3′ 9
eeh1RX(R) 5`-CTCCACATCTCGAGCTATCGCATGAGTGAAAAACAGGC-3’ 10
eeh2RX(R) 5`-CTCCACATCTCGAGTTAGCGTGCGAGCCAATCCAGCGTCACGC-3’ 11
eeh3RX(R) 5`-CTCCACATGCGGCCGCTCAGGATGCCGGAGCGGGCTTAG-3’ 12
如表3所示，在正向和反向引物中带下划线的序列分别表示NheI和Xho I/Not I位点。为了确定eeh1、eeh2和eeh3基因的表达不带有His-标签，eeh1RX、eeh2RX和eeh3RX的反向引物也设计成如表3所示。PCR后，扩增的DNA片段用限制酶Nhe I和Xho I/Not I进行酶切，并将片段与用限制酶Nhe I和Xho I/Not I酶切过的质粒pET-24a(+)载体进行连接，然后将载体转化到大肠杆菌DH5α中。所得重组载体再导入BL21-CondonPlus(DE3)-RP(Novagen)中进行表达。
<2-4>eeh基因的表达
为了确定用上述实施方案中的方法制备的eeh基因表达载体是否在细胞中表达，将转化体在37℃培养，并在光密度(O.D，600nm)值达到0.4-0.6时添加1mM IPTG进行诱导。诱导后3h，5,000xg离心20min收集细胞，重悬于缓冲液[50mM磷酸盐(pH 7.0)、0.5MKCl和10％丙三醇]中，然后超声破裂细胞。细胞碎片通过15,000xg离心30min用His-Bind纯化试剂盒(Novagen Co.)除去。可溶性级分装载于用结合缓冲液[500mM NaCl、20mM磷酸盐(pH 7.0)和5mM咪唑]预平衡的Ni-次氮基三乙酸(Ni-NTA)柱中。用洗涤缓冲液[500mM NaCl、20mM磷酸盐(pH 7.0)和60mM咪唑]洗涤后，用洗脱缓冲液[500mM NaCl、20mM磷酸盐(pH 7.0)和1M咪唑]洗脱结合的酶，然后用50mM(pH 7.0)的磷酸盐缓冲液透析。蛋白纯度用Laemmli所述的变性SDS-PAGE确定(1970)。蛋白浓度用含标准蛋白BSA的Bio-Rad蛋白分析试剂盒通过Bradford法检测(Bradford，1976)。
所得结果表明，纯化的rEEH1、rEEH2和rEEH3的分子量分别为41kDa(rEEH1，SEQ ID NO：13)、33.4kDa(rEEH2，SEQ ID NO：15)和34.5kDa(rEEH3，SEQ ID NO：17)(图6A和6B)。
<2-5>pH和温度对EHase活性的影响
pH对EHase活性的影响用50mM乙酰乙酸钠缓冲液(pH 4.0-6.0)、50mM MES缓冲液(pH 6.0-7.0)、50mM磷酸盐缓冲液(pH7.0-9.0)和50mM Glycine缓冲液(pH 9.0-10.0)加以检测，EHase活性的最适反应温度于pH 7.5在10-70℃温度范围内检测。
pH对EHase(rEEH1、rEEH2和rEEH3)活性的影响在pH 4.0-10.0范围内加以检测，所得结果显示，rEEH1、rEEH2和rEEH3对苯乙烯氧化物的最优活性分别出现在pH 6.5、7.5和8.0(图7A)。也就是说，EHase在中性pH基本稳定，而在pH 6.0不稳定(图7A)。
同样的，温度对EHases(rEEH1、rEEH2和rEEH3)活性的影响在10 to 70℃范围内测定。所得结果表明，rEEH1、rEEH2和rEEH3的水解速率分别在50℃、55℃和45℃时最大(图7B)。也就是说，在10-50℃范围内活性是增加的，过了最适温度后，明显下降(图7B)。
<实施例3>
克隆和表达来自鞘氨醇细菌(Sphingopyxis alaskensis)、食芳香物新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium aromaticivorons)和红细菌(Rohdobacterium sp.)HTCC2594的基因
用以上实施方案2所述的方法分析来自鞘氨醇细菌(Sphingopyxis alaskensis)、食芳香物新鞘氨醇杆菌(Novosphingobiumaromaticivorans)和红细菌(Rohdobacterium sp.)HTCC2594的ORF序列后，将每个具有EHase活性的基因分别用表4中所示正向和反应引物组克隆。
表4：用于克隆各株EHase基因的引物组
 
引物 序列 SEQ ID NO：
SPF1(F) 5`-CGACCCGGCATATGTCCCCCGCCAAATCAATTTCGC-3` 19
SPRH1(R) 5`-CTCCACATGCGGCCGCCTTCTTCTCGCGCAAGGGG-3` 20
NVF1(F) 5`-CGACCCGGCATATGAATGTTGCGCCTTTCGTTGTCG-3` 21
NVRH1(R) 5`-CTCCACATGCGGCCGCGCACATCAGGGAAAACGCGG-3` 22
RBF2(F) 5`-CGACCCGGCATATGAACGACAAGACCTTTATCGAGACGAACGGC-3` 23
RBRH2(R) 5`-CTCCACATCTCGAGTTACAAGGCTGAAAAGAACACTCGCAAATC-3` 24
SPRNH1(R) 5`-CTCCACATGCGGCCGCTCACTTCTTCTCGCGCAAGGG-3 25
NVRNH1(R) 5`-CTCCACATGCGGCCGCCTAGCACATCAGGGAAAACGCG-3` 26
BRNH2(R) 5`-CTCCACATCTCGAGTCAAAGCGTGGCGAGCCAGTCGATGA-3` 27
如表4所示，为了确定sEEH、rEEH和rEEH基因的表达不带有His-标签，SPRNH1(SEQ ID NO：25)、NVRNH1(SEQ ID NO：26)和RBRNH2(SEQ ID NO：27)的反向引物也设计成如表4所示。
结果表明来自鞘氨醇细菌(Sphingopyxis alaskensis)的neeh基因(SEQ ID NO：31)、来自食芳香物新鞘氨醇杆菌(Novosphingobiumaromaticivorans)的reeh基因(SEQ ID NO：33)、来自红细菌(Rohdobacterium sp.)HTCC2594的seeh基因(SEQ ID NO：29)分别得到分离。
将基因克隆到pET-24a(+)表达载体中后，将所述载体导入BL21-CondonPlus(DE3)-RP(Novagen)中，然后通过SDS-PAGE将其分离。结果表明，纯化的sEEH、nEEH和rEEH的分子量分别为49kDa(sEEH、SEQ ID NO：28)、43kDa(nEEH、SEQ ID NO：30)和36kDa(rEEH、SEQ ID NO：39)(图9)。同样，sEEH、nEEH和rEEH的最优活性出现在中性pH和适度温度(30-40℃)条件下。
<实施例4>
动力学参数和底物选择性测定
rEEH1、rEEH2、rEEH3、sEEH、nEEH和rEEH的动力学参数用(R)-或(S)-苯乙烯氧化物底物通过GC分析测定。将100ul的纯化EHase与各种浓度的(R)-或(S)-苯乙烯氧化物在含1ml磷酸钾缓冲液(100mM、pH 8.0)的10ml管中混合，并在30℃于200rpm振摇孵育。提取混合物用2ml的己烷提取，对于对映体纯的苯乙烯氧化物的对映体过量[ee；ee＝100 X(S-R)/(S+R)]用chiraldex γ-三氟乙酰基环糊精(G-TA)GC毛细管柱分析。见表5和图8。其中，图8所示为对映选择性EHases(rEEH1、rEEH2和rEEH3)对外消旋苯乙烯氧化物的水解活性的GC分析。
实线：SO，
黑体实线：用rEEH1孵育的SO，
长虚线：用rEEH2孵育的SO，
点线：用rEEH3孵育的SORSO。
结果显示，纯化的rEEH1对(R)-苯乙烯氧化物的VmaxR和KmR分别为2.3umol/min和2.9mM，而纯化的rEEH1对(S)-苯乙烯氧化物的Vmaxs和Kms分别为1.18umol/min和2.3mM(表5和图8)。这些结果显示出，rEEH1中(R)-苯乙烯氧化物的水解快于(S)-苯乙烯氧化物的水解。也就是说，对映体的水解速率越快，也就意味着rEEH1越具对映选择性。相反，纯化的rEEH3对(S)-苯乙烯氧化物的VmaxS和KmS分别为0.43umol/min和3.71mM，而纯化的rEEH3对(R)-苯乙烯氧化物的VmaxR和KmR分别为0.29umol/min和2.61mM(表5和图8)。这些结果揭示出，rEEH3中的(S)-苯乙烯氧化物水解快于(R)-苯乙烯氧化物。另一方明，纯化的rEEH2对(S)-苯乙烯氧化物的VmaxS和KmS分别为0.12umol/min和6.18mM，而纯化的rEEH2对(R)-苯乙烯氧化物的VmaxR和KmR分别为0.11umol/min和5.49mM(表5和图8)。这些结果表明，rEEH2中(S)-苯乙烯氧化物和(R)-苯乙烯氧化物两者的水解速率相同。
在rEEH1、rEEH2和rEEH3的催化有效性(kcat/Km)中，rEEH1的水解活性看起来比rEEH2和rEEH3高约60-550倍(表5)。这些结果表明，全细胞的对映选择性活性产生于rEEH1的优势活性。
[表5]rEEH1、rEEH2和rEEH3对(R)-和(S)-苯乙烯氧化物的水解的动力学参数
Figure A200680046194D00271
Figure A200680046194D00281
同样，rEEH1、rEEH2和rEEH3对图1中所示各种环氧化物底物的底物选择性与表4中的相同。结果表明，纯化的rEEH1对映选择性水解单取代的环氧化物的本体(bulky)环的C-1位，但以类似的速率水解(R)-和(S)单取代环氧化物的脂链。相反，纯化的rEEH3对映选择性水解脂族环氧化物的C-1位和苯乙烯氧化物，但未发现有对映选择性差异。
[表6]rEEH1、rEEH2和rEEH3对各种环氧化物底物的对映选择性水解活性
Figure A200680046194D00282
*N.D：未确定
通过非线性回归分析采用Sigma Plot程序评价动力学参数，检测rEEH1、rEEH2、rEEH3、sEEH、nEEH和rEEH对图1所示各种底物的对映选择性水解活性。参见表6。结果表明，rEEH水解(R)-对映纯苯乙烯氧化物，而nEEH和sEEH不具对映选择性。
[表7]从各个株中纯化的酶对(R)-和(S)-苯乙烯氧化物的动力学参数
Figure A200680046194D00291
a、b、和c：分别从鞘氨醇细菌(Sphingopyxis alaskensis)、食芳香物新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium aromaticivorans)和红细菌(Rohdobacterium sp.)HTCC2654中纯化的酶。
因此，从赤细菌(Erythrobacter sp.)、鞘氨醇细菌、新鞘氨醇杆菌和红细菌中纯化的EHases可用于在药学工业中用生物工艺制备对映纯环氧化物。
现在已根据优选实施方案详细描述了本发明，本领域种熟练技术人员应了解在不偏离本发明所附的权利要求的精神和范围的情况下，可对其进行各种变通和取代。
序列表
<110>Korea Ocean Research & Development Institue
<120>ENANTIOSELECTIVE EPOXIDE HYDLROLASE AND METHOD，用于PREPARING AN
     ENANTIOPURE EPOXIDE USING THE SAME
<130>OPP20061788KR
<150>KR 10-2005-0094580
<151>2005-10-07
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<151>2006-10-02
<160>33
<170>Kopatentln 1.71
<210>1
<211>1450
<212>DNA
<213>JCS358 16S rRNA序列
<400>1
Figure A200680046194D00301
Figure A200680046194D00321
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物，用于JCS358(27F)的16S rRNA
<400>2
Figure A200680046194D00322
<210>3
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物，用于JCS358(1518R)的16S rRNA
<400>3
Figure A200680046194D00323
<210>4
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物，用于EEH1基因
<400>4
Figure A200680046194D00331
<210>5
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物，用于EEH1基因
<400>5
Figure A200680046194D00332
<210>6
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物，用于EEH2基因
<400>6
Figure A200680046194D00333
<210>7
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物，用于EEH2基因
<400>7
Figure A200680046194D00341
<210>8
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物，用于EEH3基因
<400>8
Figure A200680046194D00342
<210>9
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物，用于EEH3基因
<400>9
Figure A200680046194D00343
<210>10
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物，用于不带有His-tag的EEH1
<400>10
Figure A200680046194D00351
<210>11
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物，用于不带有His-tag的EEH2
<400>11
Figure A200680046194D00352
<210>12
<211>39
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物，用于不带有His-tag的EEH3
<400>12
Figure A200680046194D00361
<210>13
<211>373
<212>PRT
<213>rEEH1的氨基酸序列
<400>13
Figure A200680046194D00371
Figure A200680046194D00381
<210>14
<211>1122
<212>DNA
<213>EEH1的核苷酸序列
<400>14
Figure A200680046194D00382
Figure A200680046194D00391
<210>15
<211>289
<212>PRT
<213>rEEH2的氨基酸序列
<400>15
Figure A200680046194D00401
<210>16
<211>870
<212>DNA
<213>EEH2的核苷酸序列
<400>16
Figure A200680046194D00412
Figure A200680046194D00421
<210>17
<211>295
<212>PRT
<213>rEEH3的氨基酸序列
<400>17
Figure A200680046194D00422
Figure A200680046194D00431
Figure A200680046194D00441
<210>18
<211>888
<212>DNA
<213>EEH3的核苷酸序列
<400>18
Figure A200680046194D00442
Figure A200680046194D00451
<210>19
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物，用于鞘氨醇细菌(Sphingopyxis alaskensis)(SPF1)
<400>19
Figure A200680046194D00452
<210>20
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物，用于鞘氨醇细菌(Sphingopyxis alaskensis)(SPRH1)
<400>20
Figure A200680046194D00453
<210>21
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物，用于食芳香物新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium aromaticivorans)(NVF1)
<400>21
Figure A200680046194D00461
<210>22
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物，用于食芳香物新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium aromaticivorans)(NVRH1)
<400>22
Figure A200680046194D00462
<210>23
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物，用于红细菌(Rhodobacterales bacterium)HTCC2654(RBF2)
<400>23
Figure A200680046194D00463
<210>24
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>正向引物，用于红细菌(Rhodobacterales bacterium)HTCC2654(RBRH2)
<400>24
<210>25
<211>37
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物，用于不带有His-tag的sEEH(SPRNH1)
<400>25
Figure A200680046194D00472
<210>26
<211>38
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物，用于不带有His-tag的nEEH(NVRNH1)
<400>26
Figure A200680046194D00473
<210>27
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>反向引物，用于不带有His-tag的rEEH(RBRNH2)
<400>27
Figure A200680046194D00481
<210>28
<211>448
<212>PRT
<213>sEEH的氨基酸序列
<400>28
Figure A200680046194D00482
Figure A200680046194D00491
Figure A200680046194D00501
<210>29
<211>1347
<212>DNA
<213>sEEH的核苷酸序列
<400>29
Figure A200680046194D00521
<210>30
<211>377
<212>PRT
<213>nEEH的氨基酸序列
<400>30
Figure A200680046194D00522
Figure A200680046194D00531
Figure A200680046194D00541
<210>31
<211>1134
<212>DNA
<213>nEEH的核苷酸序列
<400>31
Figure A200680046194D00542
<210>32
<211>320
<212>PRT
<213>rEEH的氨基酸序列
<400>32
Figure A200680046194D00561
Figure A200680046194D00571
<210>33
<211>963
<212>DNA
<213>rEEH的核苷酸序列
<400>33
Figure A200680046194D00572
Figure A200680046194D00581

Claims (16)

1.一种分离自海滨赤细菌(Erythrobacter litoralis)的对映选择性环氧化物水解酶蛋白，其具有以下特征：
1)通过SDS-PAGE法测定的分子量为30-45kDa；
2)最适pH为6.5-8.0；和
3)最适温度为40-60℃。
2.权利要求1的对映选择性环氧化物水解酶蛋白，其中所述蛋白具有如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列或如SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列。
3.权利要求2的对映选择性环氧化物水解酶蛋白，其中SEQID NO：13所示的氨基酸序列由SEQ ID NO：14所示的核苷酸序列编码；SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列由SEQ ID NO：16所示的核苷酸序列编码；SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列由SEQ ID NO：18所示的核苷酸序列编码。
4.一种分离自鞘氨醇细菌(Sphingophyxis alaskensis)的对映选择性环氧化物水解酶蛋白，其具有以下特征：
1)通过SDS-PAGE法测定的分子量为45-50kDa；
2)最适pH为7.0-8.0；和
3)最适温度为30-40℃。
5.权利要求4的对映选择性环氧化物水解酶蛋白，其中所述蛋白具有如SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列。
6.权利要求5的对映选择性环氧化物水解酶蛋白，其中所述蛋白由SEQ ID NO：29所示的核苷酸序列编码。
7.一种分离自食芳香物新鞘氨醇杆菌(Novosphingobiumaromaticivorans)的对映选择性环氧化物水解酶蛋白，其具有以下特征：
1)通过SDS-PAGE法测定的分子量为40-45kDa；
2)最适pH为7.0-8.0；和
3)最适温度为30-40℃。
8.权利要求7的对映选择性环氧化物水解酶蛋白，其中所述蛋白具有如SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列。
9.权利要求8的对映选择性环氧化物水解酶蛋白，其中所述蛋白由SEQ ID NO：31所示的核苷酸序列编码。
10.一种分离自红细菌(Rohdobacterium sp.)HTCC2654的对映选择性环氧化物水解酶蛋白，其具有以下特征：
1)通过SDS-PAGE方法测定的分子量为35-40kDa；
2)最适pH为7.0-8.0；和
3)最适温度为30-40℃。
11.权利要求10的对映选择性环氧化物水解酶蛋白，其中所述蛋白具有如SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列。
12.权利要求11的对映选择性环氧化物水解酶蛋白，其中所述蛋白由SEQ ID NO：33所示的核苷酸序列编码。
13.一种制备对映纯环氧化物的方法，所述方法为使用权利要求1-12中任一项的对映选择性环氧化物水解酶。
14.权利要求13的制备对映纯环氧化物的方法，其中所述环氧化物底物选自α-甲基苯乙烯氧化物、苯乙烯氧化物、缩水甘油基苯基醚、环氧氯丙烷、环氧氟丙烷、1，2-环氧丁烷和1，2-环氧己烷。
15.权利要求13的制备对映纯环氧化物的方法，其中所述环氧化物水解酶具有如SEQ ID NO：13所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO：15所示的氨基酸序列或如SEQ ID NO：17所示的氨基酸序列；其最适pH为6.5-8.0，最适温度为40-60℃。
16.权利要求13的制备对映纯环氧化物的方法，其中所述环氧化物水解酶具有如SEQ ID NO：28所示的氨基酸序列、如SEQ ID NO：30所示的氨基酸序列或如SEQ ID NO：32所示的氨基酸序列；其最适pH为7.0-8.0，最适温度为30-40℃。
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