KR100802535B1 - 입체선택적 에폭사이드 가수분해 활성이 우수한 어류유전자재조합 생촉매 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 라세믹 에폭사이드에 대한 입체선택적 가수분해 활성이 우수한 유전자재조합 생촉매 개발에 관한 것으로서, 본 발명은 어류 에폭사이드 가수분해 효소 유전자를 클로닝하여 대장균에 발현한 고활성 재조합 효소를 개발하고, 이를 이용하여 고효율로 스티렌 옥사이드 등의 광학활성 에폭사이드를 제조함으로써 종래에 미생물 효소의 낮은 에폭사이드 가수분해 효소(epoxide hydrolase) 활성으로 인해 유발되는 수율 저하, 낮은 광학순도 및 제조공정 생산성 저하 문제점을 해결한것이다.
광학활성 에폭사이드, 밀치, 에폭사이드 가수분해 효소, 입체선택성

Description

입체선택적 에폭사이드 가수분해 활성이 우수한 어류 유전자재조합 생촉매 {RECOMBINANT FISH ENANTIOSELECTIVVE EPOXIDE HYDROLASE BIOCATALYST}
도 1A 및 1B는 밀치의 에폭사이드 가수분해효소 mRNA 서열 및 단백질의 아미노산 서열이다.
도 2는 밀치의 에폭사이드 가수분해 효소 유전자를 클로닝하여 발현한 다음 SDS-PAGE (A)와 면역 검증 (B)결과를 보여주는 사진이다.
도 3은 본 발명에 따른 실시예로 밀치의 에폭사이드 가수분해 효소를 재조합한 생촉매를 사용하여 초기 농도 20 mM의 라세믹 스틸렌 옥사이드로부터 광학활성 (S)-스틸렌 옥사이드를 제조하는 그림 (○, (S)-스티렌 옥사이드; ●, (R)-스티렌 옥사이드; ▲, enantiomeric excess(%))이다.
도 4는 본 발명의 일실시예에 따른 재조합 생촉매의 에폭사이드 가수분해활성에 미치는 반응 pH의 영향을 나타내는 그래프이다.
도 5는 본 발명의 일실시예에 따른 재조합 생촉매의 에폭사이드 가수분해활성에 미치는 반응온도의 영향을 나타내는 그래프이다.
본 발명은 밀치의 에폭사이드 가수분해효소 (epoxide hydrolase, EH), 이를 암호화하는 뉴클레오타이드 서열, 또는 상기 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 미생물에서 발현하여 재조합 생촉매를 개발하고 이를 이용한 광학활성 에폭사이드 제조 방법에 관한 것이다.
의약품을 포함한 많은 생리활성물질들은 여러 종류의 광학이성질체(enantiomer)가 존재하는데, 이들 중 특정 이성질체는 인체에 유익하지만, 다른 이성질체는 경우에 따라서 심각한 부작용을 유발함이 보고 된 바 있다. 광학이성질체들의 생리활성 차이가 존재함에 따라 순수한 광학활성 물질의 합성에 대한 많은 연구가 진행되고 있다 [R. A. Sheldon, Chirotechnology, Marcel Dekker. New York. 1993]. 광학활성 물질의 합성에 사용될 수 있는 대표적인 합성 중간체인 광학활성 에폭사이드는 에폭사이드 고리(epoxide ring)의 불안정성 및 산소 원자의 전기음성도에 의한 극성으로 인하여 친전자성 반응, 친핵성 반응, 산·염기반응, 산화·환원 반응 등 다양한 반응을 유도할 수 있다 [N. Kasai, T. Suzuki, Y. Furukawa, J. Mol. Catal. B: Enzym. 4, 237, 1998].
상기 에폭사이드(epoxide)는 키랄 구조를 가지고, 폴리에테르 폴리올, 글리콜, 글리콜 에테르, 계면 활성제, 작용 유체(functional fluid), 연료 첨가물 등의 제조에 유용한 화학 중간 생성물의 중요한 부분을 구성하므로 유기 합성에 있어서 중요한 화합물이다. 또한, 광학이성질체가 공존하는 에폭사이드의 라세믹체(racemic mixture)와 달리 광학적으로 순수한 에폭사이드는 고가 의약품 제조용 중간체 또는 특정의 광학 특성을 가진 물질의 생산을 위한 중간체로 이용이 가능하 다.
에폭사이드 가수분해효소는 라세믹 에폭사이드 기질로부터 (R)- 또는 (S)-이성질체 중 한 가지 광학이성질체만을 입체선택적으로 디올로 가수분해시켜 제거시키고 나머지 이성질체만을 남겨 광학적으로 순수한 에폭사이드를 제조하는데 이용할 수 있는 효소이다. [P. Besse, H. Veschambre, Tetrahedron 50 (1994) 8885; N. Kasai, T. Suzuki, Y. Furukawa, J. Mol. Cat. B: Enzy. 4 (1998) 237; E. J. de Vries, D. B. Janssen, Current Opinion Biotechnol. 14 (2003) 414.]. 에폭사이드 가수분해효소를 바이오촉매로 사용하면 가격이 저렴한 라세믹 에폭사이드 기질로부터 고부가가치의 광학활성 에폭사이드를 제조할 수 있다. 광학적으로 순수한 에폭사이드는 고가 의약품 제조용 중간체로 널리 사용되어 왔다 [A. Archelas, R. Furstoss, Current Opinion in Chem. Biol. 5 (2001) 112; E. Y. Lee, S. -S. Yoo, H. S. Kim, S. J. Lee, Y.-K. Oh, S. Park, Enzy. Microbial Technol. 35 (2004) 624; W. J. Choi, E. C. Huh, H. J. Park, E. Y. Lee, C. Y. Choi, Biotechnol. Techniques 12 (1998) 225.].
특히, 에폭사이드 가수분해효소는 보조인자(cofactor)가 필요 없으며 비교적 안정된 구조를 가지고 있어 상업적으로 유용한 효소이다. 에폭사이드 가수분해효소에 의한 입체선택적 가수분해 반응 메카니즘을 살펴보면, 효소 활성점에 존재하고 있는 두 개의 tyrosine이 epoxide ring과 수소결합을 형성하여 기질을 촉매 활성점 부위에 위치시키고, aspartic acid, histidine 등이 catalytic triad를 이루면서 촉매 활성점을 구성하여 가수분해 반응을 진행시킨다 [A. Steinreiber, K. Faber, Current Opinion in Biotechnol. 12 (2001) 552].
에폭사이드 가수분해효소는 효모, 곰팡이, 곤충, 식물, 포유류 등에서 다양하게 발견되고 있다 [C. A. G. M. Weijers, J. A. M. de Bont, J. Mol. Catal. B: Enzy. 6 (1999) 199; M. Arahira, V. H. Nong, K. Udaka, C. Fukazawa, Eur. J. Biochem. 267 (2000) 2649; A. Y. H. Lu, G. T. Miwa, Annu. Rev. Pharmacol. Toxicol. 20 (1980) 513.]. 상업적 특성이 우수한 에폭사이드 가수분해효소 생촉매를 개발하기 위해서는 여러 가지 에폭사이드에 대해 우수한 입체선택적 가수분해 활성이 있는 새로운 에폭사이드 가수분해효소들을 선별하고, 고활성 유전자재조합 에폭사이드 가수분해효소 생촉매를 개발해야한다 [M. Arand, B. M. Hallberg, J. Zou, T. Bergfors, F. Oesch, M. J. van der Werf, J. A. de Bont, T. A. Jones, S. L. Mowbray, EMBO. J. 22 (2003) 2583; M. Nardini, I. S. Ridder, H. J. Rozeboom, K. H. Kalk, R. Rink, D. B. Janssen, B. W. Dijkstra, J. Biol. Chem. 274 (1999) 14579; J. Zou, B. M. Hallberg, T. Bergfors, F. Oesch, M. Arand, S. L. Mowbray, T. A. Jones, Structure 8 (2000) 111; H. Visser, C. A. G. M. Weijers, A. J. J. van Ooyen, J. C. Verdoes, Biotechnol. Lett. 24 (2002) 1687.].
에폭사이드 가수분해효소에 관한 중요한 특허 등록내용을 살펴보면, 프랑스의 Furstoss, 네덜란드 Janssen 그룹에서 각각 곰팡이(fungi) 및 Agrobacterium radiobacter의 에폭사이드 가수분해효소를 이용하여 광학활성 에폭사이드 제조에 대한 특허를 등록하였다(PCT 출원번호 PCT/FR00/01217). 특허 범위는 곰팡이 및 Agrobacterium 유래의 EH 효소를 이용한 광학활성 에폭사이드 제조기술, 유전자재조합 에폭사이드 가수분해효소 제조 기술 개발 등을 포함하고 있다. 따라서 에폭사이드 가수분해효소 개발 및 이를 활용한 광학활성 에폭사이드 제조관련에 대한 이들 특허들은 토양 미생물들인 A. niger 및 A. radiobacter유래의 에폭사이드 가수분해효소를 활용한 광학활성 에폭사이드 제조가 주된 특허 내용이다.
그러나, 위에서 언급한 종래의 특허에서는 미생물 유래의 에폭사이드 가수분해효소를 토양 유래의 박테리아, 효모, 곰팡이 등의 미생물계 전반에서 찾아내어 관련 유전자를 클로닝하여 재조합 에폭사이드 가수분해 효소를 개발하고, 이를 이용하여 광학활성 에폭사이드를 제조하는 기술이 주를 이루고 있다. 즉, 에폭사이드 가수분해효소 활성이 있는 미생물 생촉매를 사용하거나 효소 자체를 분리정제과정을 거쳐 생촉매로 사용하였다. 그러나, 미생물 생촉매의 경우 활성이 낮으며 정제된 에폭사이드 가수분해효소들은 분리·정제과정에서의 활성 손실, 비용 증가 등의 문제점 등이 있었다.
본 발명은 상기와 같은 종래기술의 문제점을 해결하기 위한 것으로, 기존 연구 및 발명에서 개발된 낮은 활성의 미생물 생촉매의 단점을 극복한 것으로서 활성이 높은 어류 유래의 에폭사이드 가수분해효소를 제공하는 것이다.
또한 본 발명의 목적은 고활성 효소 생촉매 개발을 위한 분리정제 과정에서의 비용 증가 및 활성 손실 문제점을 해결하기 위하여, 고효율로 어류 유래의 에폭사이드 가수분해효소를 발현시킨 재조합 전세포 (whole-cell) 생촉매를 제공하는 것이다.
본 발명이 또 다른 목적은 효소활성이 우수한 어류 유래 에폭사이드 가수분해 효소를 미생물에서 발현시킨 어류 유래의 재조합 에폭사이드 가수분해효소 및 이의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 상기 어류 유래 입체선택적 에폭사이드 가수분해효소, 또는 형질전환체를 이용하여 라세믹 에폭사이드를 기질로 하여 입체선택적 에폭사이드를 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 SEQ ID NO: 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 밀치(Mugil cephalus)의 입체선택적 에폭사이드 가수분해효소(enantioselective epoxide hydrolase)에 관한 것이다. 상기 가수분해효소는 SEQ ID NO: 1에 기재된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 아미노산 서열인 것이다.
본 발명은 SEQ ID NO: 2에 기재된 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드로 이루어지는, 밀치(Mugil cephalus)의 입체선택적 에폭사이드 가수분해효소(enantioselective epoxide hydrolase)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다. 바람직하게는 상기 유전자서열은 SEQ ID NO: 1에 기재된 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드이다.
본 발명은 밀치(Mugil cephalus)의 입체선택적 에폭사이드 가수분해효소(enantioselective epoxide hydrolase)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터로 형질전환된 미생물에서 수용성 형태로 상기 재조합 입체선택적 에폭사 이드 가수분해 효소를 생산하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 상기 밀치(Mugil cephalus)의 입체선택적 에폭사이드 가수분해효소(enantioselective epoxide hydrolase)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터에 관한 것이다. 추가적으로 본 발명은 상기 벡터로 형질전환된 형질전환체에 관한 것이며 예를 들면, 대장균, 슈도모나스(Pseudomonas) 속 균주, 또는 효모일 수 있다.
또한 본 발명은 1) 상기 밀치(Mugil cephalus)의 입체선택적 에폭사이드 가수분해효소(enantioselective epoxide hydrolase), 및
2) 상기 형질전환체 세포, 세포 배양물, 및 배양액로 이루어지는 군에서 선택된 것을 이용하여 라세믹 에폭사이드 화합물을 입체선택적 에폭사이드로 제조하는 방법에 관한 것이다.
이하 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 한다.
본 발명은 밀치의 에폭사이드 가수분해효소 (epoxide hydrolase, EH), 이를 암호화하는 뉴클레오타이드서열, 또는 상기 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터로 형질전환된 미생물에서 발현하여 재조합 생촉매를 개발하고 이를 이용한 광학활성 에폭사이드 제조 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로 본 발명에서는 최초로 어류로부터 에폭사이드 가수분해효소를 RT-PCR 및 RACE 기법으로 클로닝하였고 기존의 미생물 생촉매 대비 약 40배 이상의 높은 활성을 가지는 재조합 어류 에폭사이드 가수분해효소 생촉매를 개발하였으며, 이들을 이용하여 고부가가치 스틸렌 옥사이드, 에피클로로하이드린(epichlorohydrin)등의 광학활성 에폭사이드를 제조하 는 방법에 관한 것이다.
에폭사이드 가수분해효소는 라세믹 에폭사이드 기질로부터 (R)- 또는 (S)-이성질체 중 한 가지 광학이성질체만을 입체선택적으로 디올로 가수분해시켜 제거시키고 나머지 이성질체만을 남겨 광학적으로 순수한 에폭사이드를 제조하는데 이용할 수 있는 효소이다. 밀치의 에폭사이드 가수분해효소 유전자는 1410개의 염기로 구성되어 있으며, 469개의 아미노산으로 번역되며, 약 54.1 kDa의 분자량을 가지고 있다(도 1). 본 발명에 따른 밀치의 에폭사이드 가수분해효소의 아미노산 서열을 SEQ ID NO:2에 기재되어 있으며, 이를 암호화나는 핵산서열은 SEQ ID NO: 1에 기재되어 있으며, SEQ ID NO:2에 기재된 단백질이 mRNA 서열을 SEQ ID NO: 2에 기재하였다. 상기 본 발명에 따른 밀치의 에폭사이드 가수분해효소를 암호화하는 서열을 SEQ ID NO:1 핵산서열을 포함할 수 있으며, 상기 효소의 활성을 유지하는 한, 본 기술이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 알려진 방법으로 뉴클레오타이드 결실, 치환, 삽입 등으로 변형할 수 있다.
본 발명은 본 발명에 따른 상기 밀치의 에폭사이드 가수분해 효소를 암호화하는 유전자를 벡터에 도입하고, 상기 벡터를 관련 숙주에 도입하여 형질전환체를 제조한다. 본 발명에 따른 벡터, 또는 형질전환체의 제조는 통상의 유전공학적 방법에 따라 제조된다. 상기 벡터는 사용하는 숙주에 따라 적절히 선택할 수 있으며 대장균의 경우 pCOLD 벡터 (Takara, Japan)을 사용할 수 있으며 이 벡터는 도입된 외래 유전자를 형질전환체에서 수용성 형태로 고효율로 발현가능하게 하므로 바람직하다. 효모의 발현벡터로는 갈락토스를 암호화하는 유전자인 GAL1의 프로머터를 외래 유전자의 발현에 이용할 수 있는 pYES2(Invitrogen사)등을 사용할 수 있다. 상기 형질전환체는 대장균, 바실러스속 균주 및 슈도모나스속 균주와 같은 원핵세포, 또는 효모, 곰팡이 등의 진핵세포 등을 포함하나 이에 한정되는 의도는 아니다.
본 발명은 상기 형질전환체를 배양하여 입체선택적 에폭사이드 가수분해효소 활성을 갖는 폴리펩티드를 제조할 수 있다. 배양조건은 형질전환체의 종류에 따라 당업자가 적절힌 선택할 수 있다. 또한 발현된 효소는 종래 알려진 여러 가지 방법으로 정제할 수 있지만, 정제하지 않고 전세포 또는 이의 배양물 형태로 사용할 수도 있다.
본 발명의 효소를 이용하거나, 상기 형질전환체 세포, 이의 배양물 등을 이용하여 라세믹 에폭사이드를 입체선택적 에폭사이드로 제조할 수 있다.
하기 실시예를 들어 본 발명을 더욱 자세히 설명하고자 하나, 본 발명의 보호범위가 하기 실시예로 한정되는 의도는 아니다.
<실시예 1>
밀치( Mugil cephalus) 에폭사이드 가수분해효소 클로닝, 발현 및 염기서열 결정
1-1: 밀치의 전체 RNA 분리
분리 정제한 밀치의 전체 RNA로부터 cDNA 합성을 위하여 RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends)법을 사용하였다. 탈인산화 반응, decapping 반응, ligation 반응 및 역전사효소(RT)를 이용하여 42℃에서 50분간 역전사반응을 하였 으며, 70℃에서 15분간 효소를 불활성화 시키고 RNase H를 처리하여 37℃에서 20분간 RNA를 가수분해한 후 M. cephalus 의 cDNA 라이브러리를 얻었다.
1-2: 에폭사이드 가수분해효소의 cDNA 합성
Mugil cephalus cDNA library로부터 에폭사이드 가수분해효소 유전자를 증폭시키기 위하여 PCR (Polymerase Chain Reaction)을 사용하였다. PCR에 사용된 primer들은 GenBank에 보고되어 있는 여러 가지 mammalian microsomal 에폭사이드 가수분해효소들과 D. rerio (제브라피쉬) 에폭사이드 가수분해효소의 염기서열 및 단백질 서열을 참조하여 제작하였다. 하기 표 1에 사용한 프라이머 서열을 기재하였다.
밀치의 표적 mEH 증폭에 사용된 프라이머 서열
프라이머 명명 서열 서열번호
GeneRacer 5' Primer 5'-CGACTGGAGCACGAGGACACTGA-3' 4
GeneRacer 3' Primer 5'-GCTGTCAACGATACGCTACGTAACG-3' 5
GeneRacer 5' Nested Primer 5'-GGACACTGACATGGACTGAAGGAGTA-3' 6
GeneRacer 3' Nested Primer 5'-CGCTACGTAACGGCATGACAGTG-3' 7
* mEHFmix(470-502) 5'-TGATGGTTSACKGCTGGCC-3' 8
* mEHFmix(991-1025) 5'-GAGAAGTTYTCCACCTGGAC-3' 9
3mMCEHMR-1 5'-AGTCCAGTAGATCATGACATTTGT-3' 10
3mMCEHMR-2 5'-CAGGCTGAATTTTCTTTCCAGC-3' 11
5mMCEHF-1(XhoⅠ) 5'-GCCTCGAGATGCAAAGACTGGAGCTTTTGAAG -3' 12
5mMCEHF-2(XhoⅠ) 5'-GTCTCGAGAGGAGAAAAGTGAAAACCATTC-3' 13
3mMCEHR(EcoRⅠ) 5'-GCGAATTCTCAGAACTTCTTCTCCAC-3' 14
* S=G+C, K=T+G, Y=T+C
1-3: E. coli에서 에폭사이드 가수분해효소 발현
E. coli에 M. cephalus 의 에폭사이드 가수분해효소 유전자를 발현시키기 위하여 pColdⅠ/MCEH plasmid DNA를 정제하여 BL21 competent cell에 0.1-0.5 ㎍ 재조합 DNA를 섞은 다음 전기적 충격을 가한 후 1 ㎖의 LB (Luria-Bertani) 배지를 첨가하여 1시간 동안 37 ℃ shaking incubator에서 반응을 통해 형질전환체를 얻었다.
재조합 BL21 형질전환체들은 암피실린 (50 ㎍/㎖)이 함유된 LB plate에서 16 시간동안 37℃에서 배양하여 positive colony를 얻을 수 있었다.
최종적으로 얻은 밀치의 에폭사이드 가수분해효소 유전자는 1410개의 염기로 구성되어 있으며, 469개의 아미노산으로 번역되며, 약 54.1 kDa의 분자량을 가지고 있다(도 1). 도 1는 밀치의 에폭사이드 가수분해 효소 유전자를 클로닝하여 발현한 다음 SDS-PAGE (A)와 면역 검증 (B)을 한 그림으로서, 1번 lane과 2번 lane은 발현벡터만을 대장균에 형질전환 시킨 대조군이며, 3번 lane과 4번 lane은 밀치의 에폭사이드 가수분해 효소 유전자가 삽입된 재조합 플라스미드를 형질전환시킨 대장균 시료이며, 면역 검증을 통해 밀치의 에폭사이드 가수분해 효소가 효율적으로 발현된 것을 보여준다.
실시예 2
라세믹 스티렌 옥사이드 기질에 대하여 어류 유전자재조합 생촉매를 이용하여 광학활성 (S)-스티렌 옥사이드를 회분식으로 제조하는 방법
밀치의 에폭사이드 가수분해효소 유전자를 재조합한 대장균 생촉매를 이용하여 20 mM의 라세믹 스티렌 옥사이드(styrene oxide) 기질로부터 광학활성 (S)-스티렌 옥사이드를 제조하였다. 재조합 생촉매 20 mg (DCW/ml)를 인산염 완충용액에 넣고 pH 7.5, 반응온도 30℃에서 입체선택적 가수분해 반응을 실시한 결과, 약 120분 반응을 통해 광학순도 99% 이상의 광학활성 (S)-스티렌 옥사이드를 제조할 수 있었다. 수율은 이론수율(50%) 대비 15.4% (수율 100%로 보았을 때 30.8%임)이상이었다 (도 2). 도 2은 본 발명에 따른 실시예로 밀치의 에폭사이드 가수분해 효소를 재조합한 생촉매를 사용하여 초기 농도 20 mM의 라세믹 스틸렌 옥사이드로부터 광학활성 (S)-스틸렌 옥사이드를 제조하는 그림 (○, (S)-스티렌 옥사이드; ●, (R)-스티렌 옥사이드; ▲, enantiomeric excess(%)).
실시예 3
3-1: 재조합생촉매의 에폭사이드 가수분해 활성에 대한 반응 pH의 영향
재조합 생촉매 0.05g(wet weight base)을 pH 7.5의 완충용액에 10 mM 라세믹 styrene oxide가 들어있는 반응 혼합물에 혼합하고 30℃에서 30분간 반응시킨 후 가수분해활성을 GC로 측정하였다. 그림과 같이 반응용매의 pH 7 및 8에서 모두 초기반응 속도 및 광학순도가 높게 나타났으며 이는 (S)-styrene oxide를 포함한 광학적으로 순수한 에폭사이드 에난시오머를 얻기 위한 최적 pH가 중성 또는 약 염기성인 것으로 나타났다. 해양미생물인 Sphingomonas echinoides EH-983의 EH의 경우 pH 7에서 최적 가수분해활성을 나타내었으며, 담수어인 Zebrafish의 EH를 재조합한 대장균의 경우 pH 6에서 최적 가수분해활성을 나타내었다. 이 실험에서 사용한 pH 5는 100 mM 초산 완충용액, pH 6, 7, 8은 100 mM 인산완충용액을 사용하였다. 상기 실험결과를 도 4에 나타냈다.
3-2: 재조합생촉매의 에폭사이드 가수분해 활성에 대한 반응온도의 영향
재조합 생촉매 0.05g(wet weight base)을 pH 7.5의 100mM 완충용액에 10 mM 라세믹 styrene oxide가 들어있는 반응 혼합물에 혼합하고 20℃, 30℃ 및 40℃에서 30분간 반응시킨 후 가수분해활성을 가스크로마토그래프(GC)로 측정함으로써 온도의 영향을 측정한 결과 그림과 같이 40℃에서 에폭사이드에 대한 가수분해활성이 우수하였다. 생촉매의 조효소액을 각 온도별로 2시간 정도 놓아두었다가 가수분해활성을 측정하여 효소안정성을 관측한 결과 40℃ 부터는 효소안정성이 떨어지는 것으로 나타났다. 상기 실험결과, 생촉매의 에폭사이드 가수분해활성에 미치는 반응온도의 영향을 도 5에 나타냈다.
3-3: 기질 특이성
본 발명의 생촉매에 대해 여러가지 라세믹 에폭사이드를 사용하여 기질특이성을 시험한 것이다. 생촉매 20 mg (DCW/ml)을 20 mM 기질이 들어있는 반응 혼합물에 혼합하고 30℃에서 60 분간 반응시킨 후 기질의 가수분해 활성을 GC로 측정하여 계산한 것이다. 기질을 라세믹 styrene oxide로 사용하였을 때 (R)-styrene oxide를 선택적으로 가수분해하여 99% ee 값을 가지는 광학순도의 (S)-styrene oxide를 15%(이론수율 50%) 이상 얻을 수 있었으나 라세믹 Indene oxide의 경우 가수분해활성은 높았으나 (R)-form과 (S)-form을 거의 비슷한 수준으로 가수분해하여 순수한 광학활성의 indene oxide를 얻을 수 없었다. 라세믹 limonene-1,2-epoxide 및 glycidol을 기질로 사용한 경우 20시간을 반응시켜도 거의 가수분해 되지 않았다.
밀치 라세믹 에폭사이드 가수분해 효소의 기질특이성 시험
기질 상대적 가수분해활성(%)
스티렌 옥사이드 (Styrene oxide) 100
인덴 옥사이드 (Indene oxide) 25
리모넨-1,2-에폭사이드 (Limonene-1,2-epoxide) trace
글리시딜 (2,3-에폭시-1-프로판올) Gycidol (2,3-epoxy-1-propanol) trace
본 발명의 효소는 다른 기질들보다 styrene oxide에 대하여 높은 광학분할 특성이 있는 것으로 나타났으며 20℃-40℃, pH 7~8에서 광범위하게 활성이 우수한 것으로 나타났다.
기존의 연구 및 발명에 의하면, 에폭사이드 가수분해효소 활성이 있는 미생물 생촉매를 사용하거나 효소 자체를 분리정제과정을 거쳐 생촉매로 사용하였으나, 미생물 생촉매의 경우 활성이 낮으며 정제된 에폭사이드 가수분해효소들은 분리·정제과정에서의 활성 손실, 비용 증가 등의 문제점 등을 고활성의 어류 유래의 에폭사이드 가수분해효소 유전자재조합 생촉매 개발을 통해 해결할 수 있었다. 본 발명에서는 어류 유래의 에폭사이드 가수분해효소 유전자원 확보를 위해 밀치(Mugil cephalus)로부터 에폭사이드 가수분해효소 유전자를 최초로 클로닝하고 대장균에서 고효율로 발현시킨 생촉매를 개발함으로써, 라세믹 스틸렌 옥사이드 등의 기질로부터 99% 이상의 광학순도를 가지는 광학적으로 순수한 (S)-스티렌 옥사이드를 얻을 수 있었으며, 다양한 라세믹 에폭사이드에 대한 입체선택적 가수분해 공정에 활용될 수 있다.
서열목록 전자파일 첨부

Claims (8)

  1. SEQ ID NO: 2에 기재된 아미노산 서열로 이루어지는 밀치(Mugil cephalus)의 입체선택적 에폭사이드 가수분해효소(enantioselective epoxide hydrolase).
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 가수분해효소는 SEQ ID NO: 1에 기재된 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 아미노산 서열인 것인 입체선택적 에폭사이드 가수분해효소.
  3. SEQ ID NO: 2에 기재된 아미노산 서열을 암호화하는 뉴클레오타이드로 이루어지는, 밀치(Mugil cephalus)의 입체선택적 에폭사이드 가수분해효소(enantioselective epoxide hydrolase)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드.
  4. 제 3 항에 있어서, 상기 유전자서열은 SEQ ID NO: 1에 기재된 염기서열로 이루어지는 폴리뉴클레오타이드.
  5. 제3항 또는 제4항에 따른 밀치(Mugil cephalus)의 입체선택적 에폭사이드 가수분해효소(enantioselective epoxide hydrolase)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터로 형질전환된 미생물에서 수용성 형태로 상기 재조합 입체선택적 에폭사이드 가수분해 효소를 생산하는 방법.
  6. 제3항 또는 제4항에 따른 밀치(Mugil cephalus)의 입체선택적 에폭사이드 가수분해효소(enantioselective epoxide hydrolase)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터로 형질전환된 형질전환체.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 형질전환체는 대장균, 바실러스속 균주, 슈도모나스(Pseudomonas) 속 균주, 또는 효모인 것인 형질전환체.
  8. 1) 제1항 또는 제2항에 따른 밀치(Mugil cephalus)의 입체선택적 에폭사이드 가수분해효소(enantioselective epoxide hydrolase), 및 2)제3항 또는 제4항에 따른 밀치(Mugil cephalus)의 입체선택적 에폭사이드 가수분해효소(enantioselective epoxide hydrolase)를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 벡터로 형질전환된 형질전환체 세포, 상기 세포의 세포 배양물, 및 배양액으로 이루어지는 군에서 선택된 것을 이용하여 라세믹 에폭사이드 화합물로부터 에폭사이드 에난시오머를 제조하는 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102289133B1 (ko) * 2020-04-03 2021-08-13 경희대학교 산학협력단 다이올 생산용 형질전환 메탄자화균 및 이의 용도

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH02602A (ja) * 1987-10-30 1990-01-05 Devars Ms Co ソリッドステート電池
KR20070039463A (ko) * 2005-10-07 2007-04-12 한국해양연구원 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소 및 이를 이용한광학순도 에폭사이드의 제조방법

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH02602A (ja) * 1987-10-30 1990-01-05 Devars Ms Co ソリッドステート電池
KR20070039463A (ko) * 2005-10-07 2007-04-12 한국해양연구원 광학선택적 에폭사이드 가수분해효소 및 이를 이용한광학순도 에폭사이드의 제조방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR102289133B1 (ko) * 2020-04-03 2021-08-13 경희대학교 산학협력단 다이올 생산용 형질전환 메탄자화균 및 이의 용도

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