CN107201349A

CN107201349A - 一种表达菜豆环氧化物水解酶的工程菌及应用

Info

Publication number: CN107201349A
Application number: CN201710474195.7A
Authority: CN
Inventors: 邬敏辰; 王瑞; 宗迅成; 阚婷婷; 刘艳
Original assignee: Jiangnan University
Current assignee: Jiangnan University
Priority date: 2017-06-21
Filing date: 2017-06-21
Publication date: 2017-09-26

Abstract

本发明公开了一种表达菜豆环氧化物水解酶的工程菌及应用，属于生物工程技术领域。本发明提供了一种环氧化物水解酶及表达该酶的重组大肠杆菌。本发明的环氧化物水解酶能够催化外消旋对氯环氧苯乙烷(rac‑pCSO)生成(R)‑对氯苯基乙二醇(pCPED)，在转化率达99.7％时产物对映体过剩值为85.1％ee_p。与其它植物来源的环氧化物水解酶相比与提高了10倍。

Description

一种表达菜豆环氧化物水解酶的工程菌及应用

技术领域

本发明涉及一种表达菜豆环氧化物水解酶的工程菌及应用，属于生物工程技术领域。

背景技术

环氧化物水解酶(Epoxide hydrolases,EHs)能水解动力学拆分和对映归一性水解外消旋环氧化物生成具有光学活性的环氧化物或单一构型的邻二醇，因其来源广泛，全细胞即可催化且不需要金属离子和辅酶的参与等优点而受到广泛关注。手性环氧化物和邻二醇是合成手性化合物的重要中间体，在医药、农药和功能性材料的合成等方面有着重要的应用价值如对氯环氧苯乙烷((R)-pCSO)和对氯苯基乙二醇((R)-pCPED)是合成神经保护剂依利罗地的重要中间体,依利罗作为一种谷氨酸拮抗剂对缺血性脑中风有很好的效果。

目前生产手性环氧化物和邻二醇的方法主要有化学法、酶法和化学-酶法，但化学方法存在化学试剂昂贵，后处理复杂及对环境会造成危害等问题。EHs催化的外消旋环氧化物的动力学拆分和归一性水解具有很明显的优势：1、来源广，广泛存在于植物、动物和微生物中。 2、不需要金属离子和辅酶的参与。3、对不同底物表现出不同的立体选择性。已有多种来源的编码环氧化物水解酶的基因被克隆并实现了异源表达，其中对映选择性高的环氧化物水解酶多被应用于外消旋环氧化物的动力学拆分，其理论产率仅为50％，对映和区域选择性高且互补的双酶或单酶催化的对映归一性水解的理论产率可高达100％。单酶催化的对映归一性水解是制备高产率手性邻二醇的最理想途径，但目前仅有少数的EHs对特定的某种或某类底物具备此特性。不同来源的EHs的活性及对不同环氧化物底物的对映选择性有很大的差异，因此寻找更高活性，更好催化特性的新型EHs依然是目前研究发展的趋势。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种环氧化物水解酶，如(a)或(b)所示：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有环氧化物水解活性的由(a)衍生的蛋白质。

本发明的第二个目的是提供编码所述环氧化物水解酶的基因。

在本发明的一种实施方式中，所述基因序列如SEQ ID NO.1所示。

本发明的第三个目的是提供一种基因工程菌，所述基因工程菌以大肠杆菌为宿主，表达 SEQ ID NO.1所示基因。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌以pET-28a(+)为载体。

在本发明的一种实施方式中，所述宿主为E.coli BL21、E.coli JM109、E.coliDH5α、或 E.coli TOP10。

在本发明的一种实施方式中，所述基因工程菌按如下步骤构建：(1)将SEQ IDNO.1 所示基因片段与pUCm-T连接，构建重组质粒pUCm-T-pveh3；(2)将pUCm-T-pveh3与pET-28a(+)质粒用Nde I和Not I进行双酶切，在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pET-28a(+)-pveh3；(3)将pET-28a(+)-pveh3转化入宿主中。

本发明的第四个目的是提供一种制备环氧化物水解酶的方法，是将所述基因工程菌接种至含100μg/mL卡那霉素的LB培养基中，按2～5％的接种量接种至LB培养基中，培养温度为37℃、转速220rpm，时间为2～2.5h,OD₆₀₀为0.6～0.8，加IPTG至终浓度为0.05～0.1mM 进行诱导，16～35℃条件下诱导表达8～10h。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是将诱导后的菌体离心，收集菌体，用100mM 磷酸盐缓冲液进行悬浮，制备成100～200mg/mL的菌悬液。

本发明的第五个目的是提供一种制备(R)-pCPED的方法，是将所述环氧化物水解酶以 25～40U/mmol底物的添加量加入至外消旋pCSO中，于18～22℃反应1～10h。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是以酶液、酶粉或基因工程菌细胞的形式进行反应。

在本发明的一种实施方式中，所述方法是以所述的基因工程菌为催化剂，每950μL的菌悬液中加入50μL终浓度10mmol/L的外消旋pCSO，在20℃反应；所述菌悬液的浓度为200 mg/mL。

本发明还提供所述环氧化物水解酶在食品、医药、化工领域的应用。

有益效果：本发明的环氧化物水解酶能够催化外消旋对氯环氧苯乙烷(rac-pCSO)生成 (R)-对氯苯基乙二醇(pCPED)，在转化率达99.7％时产物对映体过剩值为85.1％ee_p。与其它植物来源的环氧化物水解酶相比提高了10倍。

附图说明

图1为环氧化物水解酶催化(R,S)-pCSO反应进程曲线。

图2为不同pH下环氧化物水解酶的活性。

图3为重组环氧化物水解酶对外消旋pCSO的水解反应进程。

具体实施方式

(R,S)-pCSO由本实验室合成；(R)-pCPED和(S)-pCPED购自上海TCI公司；流动相均购自美国TEDIA天地试剂公司，手性液相色谱柱AS-H(4.6×250mm,5μm)购自大赛璐药物手性技术(上海)有限公司。

环氧化物水解酶的测定及酶活性单位定义：500μL的反应体系中，450μL 100mg/mL的菌悬液与25μL的底物(R,S)-pCSO反应，精确反应20min后取样60μL于1mL乙酸乙酯中萃取，干燥过膜后通过高效液相色谱仪检测。本测定条件下，以每分钟水解1μmol rac-pCSO所需的酶量定义为1个环氧化物水解酶的活性单位(U)。

底物、产物测定方法：采用高效液相色谱仪、Chiralcel AS-H和紫外检测器分析，流动相为正己烷/异丙醇(80:20,v/v)，流速为0.8mL/min，检测波长为220nm，柱温为30℃，(R)-pCSO、 (S)-pCSO、(R)-pCPED和(S)-pCPED的出峰时间分别为6.240、6.967、7.909和8.923min。

底物ee_s＝[(R_a-S_a)/(R_a+S_a)]×100％；产物ee_p＝[(R_b-S_b)/(R_b+S_b)]×100％；E＝ln[(1-c)× (1-ee_s)]/ln[(1-c)×(1+ee_s)]。其中R_a和S_a分别表示(R)-pCSO和(S)-pCSO浓度，R_b和S_b分别表示(R)-pCPED和(S)-pCPED浓度。c表示底物转化率。

实施例1菜豆环氧化物水解酶基因的获得及表达质粒的构建

根据NCBI所公布cDNA序列设计特异性引物，PvEH2-F:CATATGATGGAGGGAATACACAGCACAAAG，含Nde I酶切位点，PvEH2-R：CTAGAGTCAAAACTTGTTGATAAAATCAT AAAATGT，含Not I酶切位点。提取菜豆胚芽总RNA。以菜豆总RNA为模板，Oligo dT-Adaptor 为引物，逆转录合成cDNA第一链；以该链为模板、PvEH2-F和M13Primer M4为引物，进行第一轮PCR：94℃变性2min，30个循环(94℃30s、50℃30s和72℃70s)；再以第一轮PCR产物为模板、PvEH3-F和PvEH3-R为引物，进行第二轮PCR：94℃变性2min，30 个循环(94℃30s、52℃30s和72℃70s)，72℃延长10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析、割胶回收目的基因，与pUCm-T连接，转化E.coli JM109，经蓝白斑筛选、SacⅠ酶切鉴定和DNA测序。将测序正确的重组质粒命名为pUCm-T-pveh3。将测序正确的 pUCm-T-pveh3与pET-28a(+)质粒均用Nde I和Not I进行双酶切，割胶回收的酶切产物在T4 DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pET-28a(+)-pveh3，并对重组质粒进行序列测定；将pET-28a(+)-pveh3转化入E.coli BL21(DE3)中。

实施例2重组菌的诱导表达

将E.coli BL21-pveh3单菌落接种于2mL含100μg/mL卡那霉素的LB培养基中，于37℃、 220r/min培养过夜；取2mL培养液转接于100mL相同的培养基中，培养至OD₆₀₀为0.6～0.8 时，添加IPTG(终浓度0.05mmol/L)，25℃诱导8h。收集菌体，按每g湿菌体用5mL磷酸钾缓冲液(K₂HPO₄-KH₂PO₄,100mmol/L,pH 7.0)悬浮得到菌浓为200mg/mL的菌悬液。

实施例3重组菌的诱导表达温度优化

按实施例2的方法，区别在于，调整诱导温度为16～35℃。如图1所示，当温度从16℃ 升高到22℃时，相对酶活性也随之增加。当温度继续增加时，相对酶活性开始降低，当温度为35℃时，相对酶活性仅为22℃时的60％。说明最适诱导温度为22℃。

实施例4磷酸盐pH的优化

按实施例2的方法，区别在于，调整磷酸钾缓冲液的pH为3.0～10.0。如图2所示，当pH 从3.0提高到7.0时，相对酶活也随之提高。但是当pH从7.0提高到10.0时，随着pH的升高相对酶活迅速下降，pH为10.0时的相对酶活仅为pH为7.0时的10％。

实施例5 PvEH3催化外消旋pCSO的对映归一性水解

在1.5mL EP管中加入950μL菌悬液，其酶活力为1.72U/g湿菌体，25℃保温5min，再加入50μL pCSO(终浓度10mmol/L)进行反应(实际反应量为32.6U/mmol底物)。定时取样50μL至1mL乙酸乙酯中萃取，上层有机相经无水硫酸镁干燥后过0.22μm有机滤膜，采用高效液相色谱仪Waters e2695(美国Waters公司)对样品进行手性分析。底物和产物均通过HPLC进行检测。以E.coli/pET-28a菌悬液为对照，进行上述相同的反应和分析。结果如图3所示，在反应进行至3h时，(S)-pCSO转化了98％，(R)-pCSO转化了47％，说明PvEH3 优先催化(S)-pCSO水解。当反应时间为7h时，转化率为99.3％，当反应时间为8h时，转化率为99.6％，即底物几乎完全转化为产物，产物的对映体过量值为85.1％。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 江南大学

<120> 一种表达菜豆环氧化物水解酶的工程菌及应用

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 957

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atggagggaa tacagcacaa agaagtggaa gtaaatggca tcaaaatgca tgttgcagag 60

aaaggagagg gtcctgtggt cttgttcctc catggcttcc ctgaactgtg gtattcctgg 120

cgccaccaga ttctggctct cagttcccga ggatatcgcg ctgttgcacc agatctacgt 180

ggctacggtg acacagaggc accagcttca atgagcagct acagctgctt tgacatagtg 240

ggtgatctgg ttgcgcttat agaccttctg ggtgttgatc aagtcttcct tgtggctcat 300

gactggggtg ccatcatagg ttggtacctc tgcatgtttc gccccgacag agtcaaggcc 360

tatgtctgcc tcagtgtgcc tttactccac cgaaaccccg agatcagaac cgtcgatgcc 420

atgcgtgcta tgtacggaga cgactactac atctgcagat ttcagaaacc aggagaaatg 480

gaagctcaga tggctgaagt tgggactggg tatgtgctca aaaacatcct cacaactcgc 540

aaacctggtc ctccaatctt tcccaaggga gagtacggaa ctggattcaa cccagatatg 600

actaattcct taccctcttg gctctcacaa catgatcttg cttattatgt ttccaaattt 660

cagaaaacgg gcttcactgg acccttgaac tattacagaa atatgaaccc aaattgggag 720

ctgacagcac cgtggagtgg agcgaaaata aaagtgccgg taaagttcat cacaggtgat 780

ttggacatgg tatacacctc actgaacatg aaggagtaca tccatggtgg aggtttcaaa 840

gaagatgtgc caaatctaga agaagtgatt gtgcagaaag gagtagctca cttcaataat 900

caagaagcag ctgaggaaat caatactcac atttatgatt ttatcaacaa gttttga 957

<210> 2

<211> 318

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 2

Met Glu Gly Ile Gln His Lys Glu Val Glu Val Asn Gly Ile Lys Met

1 5 10 15

His Val Ala Glu Lys Gly Glu Gly Pro Val Val Leu Phe Leu His Gly

20 25 30

Phe Pro Glu Leu Trp Tyr Ser Trp Arg His Gln Ile Leu Ala Leu Ser

35 40 45

Ser Arg Gly Tyr Arg Ala Val Ala Pro Asp Leu Arg Gly Tyr Gly Asp

50 55 60

Thr Glu Ala Pro Ala Ser Met Ser Ser Tyr Ser Cys Phe Asp Ile Val

65 70 75 80

Gly Asp Leu Val Ala Leu Ile Asp Leu Leu Gly Val Asp Gln Val Phe

85 90 95

Leu Val Ala His Asp Trp Gly Ala Ile Ile Gly Trp Tyr Leu Cys Met

100 105 110

Phe Arg Pro Asp Arg Val Lys Ala Tyr Val Cys Leu Ser Val Pro Leu

115 120 125

Leu His Arg Asn Pro Glu Ile Arg Thr Val Asp Ala Met Arg Ala Met

130 135 140

Tyr Gly Asp Asp Tyr Tyr Ile Cys Arg Phe Gln Lys Pro Gly Glu Met

145 150 155 160

Glu Ala Gln Met Ala Glu Val Gly Thr Gly Tyr Val Leu Lys Asn Ile

165 170 175

Leu Thr Thr Arg Lys Pro Gly Pro Pro Ile Phe Pro Lys Gly Glu Tyr

180 185 190

Gly Thr Gly Phe Asn Pro Asp Met Thr Asn Ser Leu Pro Ser Trp Leu

195 200 205

Ser Gln His Asp Leu Ala Tyr Tyr Val Ser Lys Phe Gln Lys Thr Gly

210 215 220

Phe Thr Gly Pro Leu Asn Tyr Tyr Arg Asn Met Asn Pro Asn Trp Glu

225 230 235 240

Leu Thr Ala Pro Trp Ser Gly Ala Lys Ile Lys Val Pro Val Lys Phe

245 250 255

Ile Thr Gly Asp Leu Asp Met Val Tyr Thr Ser Leu Asn Met Lys Glu

260 265 270

Tyr Ile His Gly Gly Gly Phe Lys Glu Asp Val Pro Asn Leu Glu Glu

275 280 285

Val Ile Val Gln Lys Gly Val Ala His Phe Asn Asn Gln Glu Ala Ala

290 295 300

Glu Glu Ile Asn Thr His Ile Tyr Asp Phe Ile Asn Lys Phe

305 310 315

<210> 3

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

catatgatgg agggaataca cagcacaaag 30

<210> 4

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

ctagagtcaa aacttgttga taaaatcata aaatgt 36

Claims

1.一种环氧化物水解酶，其特征在于，如(a)或(b)所示：

(a)氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

2.编码权利要求1所述环氧化物水解酶的基因。

3.一种基因工程菌，其特征在于，以大肠杆菌为宿主，表达SEQ ID NO.1所示基因。

4.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，以pET-28a(+)为载体。

5.根据权利要求3所述的基因工程菌，其特征在于，所述宿主为E.coli BL21、E.coliJM109、E.coli DH5α、或E.coli TOP10。

6.构建权利要求4或5所述基因工程菌的方法，其特征在于，按如下步骤构建：(1)将SEQID NO.1所示基因片段与pUCm-T连接，构建重组质粒pUCm-T-pveh3；(2)将pUCm-T-pveh3与pET-28a(+)质粒用Nde I和Not I进行双酶切，在T4DNA连接酶的作用下进行连接，得到重组质粒pET-28a(+)-pveh3；(3)将pET-28a(+)-pveh3转化入宿主中。

7.一种制备环氧化物水解酶的方法，其特征在于，是表达SEQ ID NO.2所示环氧化物水解酶的重组大肠杆菌接种至培养基中，培养至OD₆₀₀为0.6～0.8，加IPTG至终浓度为0.05～0.1mM进行诱导，于16～35℃条件下诱导表达8～10h。

8.一种制备(R)-对氯苯基乙二醇的方法，其特征在于，将权利要求1所述的环氧化物水解酶以25～40U/mmol底物的添加量加入至外消旋对氯环氧苯乙烷中，于18～22℃反应1～10h。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述环氧化物水解酶是以酶液、酶粉或基因工程菌细胞的形式进行反应。

10.权利要求1所述的环氧化物水解酶在食品、医药、化工领域的应用。