CN102978220A

CN102978220A - 环氧化物水解酶基因、编码酶、载体、工程菌及应用

Info

Publication number: CN102978220A
Application number: CN2012104550730A
Authority: CN
Inventors: 郑裕国; 薛锋; 柳志强; 邹树平; 胡忠策; 沈寅初
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2012-11-13
Filing date: 2012-11-13
Publication date: 2013-03-20
Anticipated expiration: 2032-11-13
Also published as: CN102978220B

Abstract

本发明公开了一种源自于壤霉菌ZJB120203的环氧化物水解酶基因、编码酶、载体、重组基因工程菌，以及在制备重组环氧化物水解酶中的应用；本发明环氧化物水解酶基因可与表达载体连接构建得到含该基因的表达重组质粒pET28a-EH，再转化至大肠杆菌BL21中，获得重组大肠杆菌，该重组大肠杆菌含有重组环氧化物水解酶，可以利用重组大肠杆菌为酶源，以外消旋环氧氯丙烷、外消旋的苯基环氧乙烷为底物，进行生物转化反应制备高光学纯度的S-环氧氯丙烷和R-苯基环氧乙烷。

Description

环氧化物水解酶基因、编码酶、载体、工程菌及应用

（一）技术领域

本发明涉及一种从壤霉菌ZJB120203中提取的环氧化物水解酶基因、编码酶、载体、工程菌及应用。

（二）背景技术

环氧化物水解酶（EC 3.3.2.3）是一组功能相似的酶系，能够立体选择性催化环氧化合物生成光学活性的环氧化物和相应邻位二醇。作为一种水解酶它具有一般水解酶的特点如：1. 反应不需要辅酶的协助。2. 具有广泛的来源。3. 在非水溶剂中仍具有催化活力。4. 这些反应常常显示出化学、区域和立体对映选择性，能够对同类型广泛的底物进行作用。

环氧化物水解酶广泛存在于自然界中，在哺乳动物、昆虫、微生物和植物中均有发现。哺乳动物环氧化物水解酶参与了体内有害异体物质的代谢，并有调控血压等功能；植物环氧化物水解酶能参与角质以及抗菌物质的合成；昆虫环氧化物水解酶具有分解代谢昆虫发育过程中重要的化合中间体保幼激素以及代谢植物释放的化学预防化合物的重要功能；而微生物是环氧化物水解酶的重要的来源。由于微生物种类的多样性、生长速度快、易于培养和产量高等优点，从微生物中筛选获得环氧化物水解酶是目前主要的途径。

近年，已从多种微生物中发现了环氧化物水解酶，如Rhodococcus equi，Rhodococcus ruber，Mycoplana rubra ，Bacillus megaterium, Diplodia gossipina，Streptomyces striana, Rhodotorula glutinis, Bacillus subtilis, Sphingomonas echinoides ，Rhodotorula araucariae，Rhodosporidium toruloides，Agrobacterium radiobacter，Mycobacter tuberculosis，Aspergillus niger，Caulobacter crescentus，Trichosporon loubierii，Sphingomonas sp， Novosphingobium aromaticivorans，Saccharomyces cerevisiae等。其中部分环氧化物水解酶的基因已被克隆并在不同的宿主（大肠杆菌、毕赤酵母、耶氏酵母等）中表达，获得产酶活力较高的基因工程菌，并应用于不对称拆分外消旋环氧化物。另外，在手性环氧氯丙烷的制备和手性苯基环氧乙烷中也有广泛应用。

手性环氧氯丙烷和手性苯基环氧乙烷在医药、农药、化工、材料等领域应用广泛。随着手性药物行业的发展，使得手性环氧氯丙烷和苯基环氧乙烷作为一种重要医药中间体的地位更加突出。目前，合成手性环氧氯丙烷和苯基环氧乙烷主要有化学法和生物法拆分两大类。生物法拆分法具有反应条件温和、环境友好的优点，但是具有高效拆分外消旋环氧氯丙烷和苯基环氧乙烷的活性微生物报道较少，因此，筛选高选择性的新微生物菌株，并通过基因工程技术获得能够选择性水解外消旋的环氧氯丙烷和苯基环氧乙烷的环氧化物水解酶基因，构建高效表达的基因工程菌有着重要的意义。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种从壤霉菌ZJB120203中提取的环氧化物水解酶基因、含有该基因的重组载体、该重组载体转化得到的重组基因工程菌，以及其在制备重组环氧化物水解酶中的应用，重组环氧化物水解酶制备手性环氧氯丙烷和手性苯基环氧乙烷的应用。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种来源于壤霉菌（Agromyces sp.）ZJB120203的环氧化物水解酶基因，所述环氧化物水解酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示，GenBank登录号：JX467176。

所述环氧化物水解酶基因由如下方法得到：

利用PCR技术，在简并引物1（YKSCAYGGYTGGCCMGG）、引物 2（SARYGCRGCAAAGTGTCC）的作用下以来源于壤霉菌（Agromyces sp.）ZJB120203菌株中的总基因组DNA为模板克隆长约0.8kb的环氧化物水解酶基因片段。将该片段连接到pMD18-T载体上，获得克隆载体pMD18-T-EHP，将载体转化大肠杆菌获得含载体pMD18-T-EHP的重组大肠杆菌。对重组质粒测序，并进行BLAST比对，根据同源性较高的环氧化物水解酶基因序列为参考设计引物3和4，在引物3 (ATGACCGCGGTGAGTCCCAC)、引物4(TCATTGTTCAT TTCCTC TCAATTGG)的作用下，以来源于壤霉菌ZJB120203菌株的总基因组DNA为模板克隆长约1.2kb的环氧化物水解酶基因片段。将该片段连接到pMD18-T载体上获得克隆载体pMD18-T-EH和转化了pMD18-T-EH的重组大肠杆菌。对重组质粒测序，并利用软件对测序结果进行分析，该序列含有一个长为1167bp的开放阅读框（核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示）。

所述提供环氧化物水解酶基因的壤霉菌（Agromyces sp.）ZJB120203，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，保藏编号CCTCC No：M 2012299，保藏日期2012年7月25日。

所述壤霉菌（Agromyces sp.）ZJB120203的获取方法为：本发明从浙江、江苏、安徽等地采取土样，共取土样40份。筛选的具体方法：称取土壤样品5g，加入50mL无菌水制成土壤悬浮液，取1.0mL上清液，加入到筛选培养基中，于30℃、150rpm/min摇床上振荡培养4天。之后取该培养液进行梯度稀释，取10^-4、10^-5、10^-6的梯度稀释液涂布到LB固体培养基上，置30℃恒温培养箱培养3天。挑取生长出的单菌落接种到液体发酵培养基中进行培养。在30℃摇床上培养2天，离心收集菌体，并用磷酸盐缓冲液洗涤。菌体用于转化，转化条件如下：磷酸盐缓冲液（200Mm，pH 8.0）中加入菌体，环氧氯丙烷50mM，置于30℃水浴摇床转化30min，取1ml转化液，乙酸乙酯萃取后，气相检测分析。

本发明筛选得到的壤霉菌ZJB120203菌株，按《常见细菌系统鉴定手册》以及《伯杰氏细菌鉴定手册（第八版）》的生理生化鉴定，菌株的形态为短杆状，扫描电镜下放大可以清楚地观察到其大小约为1.0~1.2×0.4~0.6 μm，无芽孢，幼龄革兰氏阳性，老培养物革兰氏阴性，有鞭毛，在LB 平板、牛肉膏蛋白胨平板上30℃培养24 h，菌落呈圆形光滑状、湿润、透明、边缘整齐、乳白色、易挑取。

16S rDNA 序列分析：以提取到的细胞总DNA为模板，利用引物: p16S-8: 5'-aga gtt tga tcc tgg ctc ag-3' 和 p16S-1541: 5'-aag gag gtg atc cag ccg ca-3'扩增菌株的16S rDNA基因，将基因产物同T载体连接，经测序确认该片段实际长度为1423bp，将该序列与GenBank中相关数据进行相似性分析发现，该菌与壤霉菌（Agromyces sp.）的同源性最高 (homology, 99%/1423 bps, based on 16S rDNA)。

生理生化鉴定结合分子鉴定，可确认该菌株ZJB120203为壤霉菌（Agromyces sp.）。

任何对SEQ ID NO：1所示核苷酸序列进行一个或多个核苷酸的取代、缺失或插入处理获得的核苷酸序列，只要其与该核苷酸具有90%以上的同源性，均属于本发明的保护范围。

本发明提供一种由所述环氧化物水解酶基因编码的环氧化物水解酶。

进一步，所述SEQ ID NO：1所示核苷酸序列编码的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示：

1 MTAVSPTPFE IAVPDEVLDD LYKRLANTRF PASIEGGGWS YGTDVGYLQR LVDYWRTDFN

61 WREAERRLND LPQYRARIQD VDLHFVHVPG KGPAPTPLLF VHGWPGSFSE VSKIIGPLTD

121 PAAHGGDPEN SFSVVAPSLP GFGFSSDIGR PGMNPGTMAE ILAELMTDVL GYSEFVGQGG

181 DWGSTVLTRL AHAHPDLVTG LHLNYSSVQP SMIDAAPLSA AEQQYLSANQ EWSAREGAYN

241 SLQSTKPQSL AVALNDSPAG LAAWLVEKYR SWSDCNGDVE SSFSSDELLT QVMIYWVTQS

301 IGSSSRLYAE RAREGWTFPP GEIIDVPTAY ARFPAEIRRP PAEWLERMFR LERFTDMPRG

361 GHFAALEVPD LLVADLREFQ NQLRGNEQ

任何对SEQ ID NO：2所示氨基酸序列中氨基酸进行缺失、插入或替换的处理获得的多肽片段或其变体，只要其与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列具有95%以上同源性，均属于本发明的保护范围。

本发明涉及含所述环氧化物水解酶基因的重组载体，及用所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。

本发明根据测序结果设计胞内表达引物5 (CGCCATATGACCGCGG

TGAGTCCCAC)和引物6 (ATTTGCGGCCGC TCATTGTTCATTT

CCTCTCAATTGG），以克隆载体pMD18-T-EH为模板，通过PCR扩增得到了用于胞内表达的环氧化物水解酶基因。本发明将环氧化物水解酶基因同表达载体pET28a 连接，构建了含有环氧化物水解酶基因的胞内表达重组质粒pET28a-EH。将胞内表达重组质粒pET28a-EH转化至大肠杆菌BL21菌株中，获得含有重组质粒pET28a-EH的重组大肠杆菌BL21/pET28a-EH，以重组基因工程菌为酶源进行生物催化和转化。

本发明还涉及环氧化物水解酶基因在制备重组环氧化物水解酶中的应用，具体为：构建含有所述环氧化物水解酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养（通常以IPTG为诱导剂），培养液分离得到含有重组环氧化物水解酶的菌体细胞。

本发明还涉及一种含所述环氧化物水解酶基因的环氧化物水解酶在制备手性环氧化物中的应用，所述应用为：以含环氧化物水解酶的重组基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体为酶源，以外消旋环氧化物为底物，于pH 6~10缓冲液的反应体系中进行转化反应，在20~ 40℃条件下转化反应结束后，获得的转化反应液即为含手性环氧化物的混合液，将混合液分离纯化，获得手性环氧化物。

进一步，优选所述含所述环氧化物水解酶基因的环氧化物水解酶在制备手性环氧化物中应用为：以含环氧化物水解酶的重组基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体为酶源，以外消旋环氧化物为底物，于pH 6~10缓冲液的反应体系中进行转化反应，在20~ 40℃、50~250r/min条件下转化反应0.05~ 4h，反应结束后，获得的转化反应液即为含手性环氧化物的混合液，将混合液分离纯化（所述分离纯化方法采用本领域公知的常规操作即可），获得手性环氧化物；所述底物的初始浓度为0.05~80g/L，所述湿菌体的质量用量以菌体干重计为0.05~ 0.4g/g底物。

进一步，所述底物为外消旋环氧氯丙烷或外消旋苯基环氧乙烷。

进一步，所述酶源按如下步骤制备：将来源于壤霉菌（Agromyces sp.）ZJB120203的SEQ ID NO：1所示环氧化物水解酶基因构建载体，再将载体转化大肠杆菌，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离获得含环氧化物水解酶的菌体细胞，具体为将含有胞内表达重组质粒pET28a-EH的重组大肠杆菌BL21/pET28a-EH接种至含有50μg/ml 卡那霉素抗性的LB液体培养基，在37℃培养12h，再以1%接种量（v/v）接种到新鲜的含有50μg/ml卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养至菌体浓度OD₆₀₀约0.6左右，再向LB液体培养基加入终浓度为0.5mM的IPTG，28℃诱导培养10h后，将培养液在4℃、8000rpm离心10min，弃去上清液，收集沉淀，即获得含有重组环氧化物水解酶的湿菌体，即为含有胞内表达重组质粒的重组大肠杆菌BL21/pET28a-EH湿菌体。

更进一步，所述含所述环氧化物水解酶基因的环氧化物水解酶在制备手性环氧化物中的应用为：以SEQ ID NO：1所示环氧化物水解酶基因制备的重组基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体为酶源，以外消旋苯基环氧乙烷或外消旋环氧氯丙烷为底物，于pH 7-9的缓冲液的反应体系中进行转化反应，在25-35℃、100-200r/min条件下转化反应0.1-2h，获得相应的R-苯基环氧乙烷（ee≧99%）或S-环氧氯丙烷(ee≧99%)；所述底物初始浓度为1-60g/L，所述酶源的用量以湿菌体的干重计为0.1-0.3g/g底物。

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种来源于壤霉菌（Agromyces sp.）ZJB120203的环氧化物水解酶基因，该环氧化物水解酶基因可与表达载体连接构建得到含该基因的表达重组质粒pET28a-EH，再转化至大肠杆菌BL21中，获得重组大肠杆菌，该重组大肠杆菌含有重组环氧化物水解酶，可以利用重组大肠杆菌为酶源，以外消旋环氧氯丙烷或外消旋的苯基环氧乙烷为底物，进行生物转化反应制备相应高光学纯度的S-环氧氯丙烷(ee≧99%)或R-苯基环氧乙烷(ee≧99%)。

（四）附图说明

图1为克隆载体pMD18-T-EH物理图谱；

图2 为pET28a-EH重组质粒物理图谱；

图3 为环氧化物水解酶基因PCR扩增低熔点琼脂糖凝胶（argrose）电泳图；其中，泳道2~5为利用引物1和引物2扩增得到的环氧化物水解酶基因片段，泳道1为 DL2000 DNA Marker；

图4 为环氧化物水解酶基因PCR扩增 argrose 电泳图；其中，泳道2~4为利用引物3和引物4扩增得到的环氧化物水解酶基因片段，泳道1为 DL2000 DNA Marker；

图5 阳性重组质粒pET28a-EH的酶切结构图；其中，泳道1为 DL 2000 DNA Marker片段；泳道2为环氧化物水解酶基因；泳道3为pET28a-EH/NdeI样品；泳道4为pET28a-EH/Not I样品；泳道5为pET28a-EH/Nde I and Not I样品；

图 6 为环氧化物水解酶SDS-PAGE 图：泳道1为蛋白质分子量 Marker，泳道2为 E.coli BL21，泳道3为未诱导的E.coli BL21/pET28a-EH，泳道4为IPTG 诱导的E.coli BL21/pET28a-EH。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1壤霉菌（Agromyces sp.）ZJB120203的获取

本发明从浙江、江苏、安徽等地取土样，共取土样40份。筛选的具体方法：称取土壤样品5g，加入50mL无菌水制成土壤悬浮液，取1.0mL上清液，加入到筛选培养基中，于30℃、150rpm/min摇床上振荡培养4天。之后取该培养液进行梯度稀释，取10^-4、10^-5、10^-6的梯度稀释液涂布到固体培养基上，置30℃恒温培养箱培养3天。挑取生长出的单菌落接种到液体发酵培养基中进行培养。在30℃摇床上培养2天，离心收集菌体，并用磷酸盐缓冲液洗涤。菌体用于转化，转化条件如下：磷酸盐缓冲液（200mM，pH 8.0）中加入菌体，环氧氯丙烷50mM，置于30℃水浴摇床转化30min，取1ml转化液，乙酸乙酯萃取后，气相检测分析。

本发明筛选得到的菌株ZJB120203，按《常见细菌系统鉴定手册》以及《伯杰氏细菌鉴定手册（第八版）》的生理生化鉴定，菌株的形态为短杆状，扫描电镜下放大可以清楚地观察到其大小约为1.0~1.2×0.4~0.6 μm，无芽孢，幼龄革兰氏阳性，老培养物革兰氏阴性，有鞭毛，在LB 平板、牛肉膏蛋白胨平板上30℃培养24 h，菌落呈圆形光滑状、湿润、透明、边缘整齐、乳白色、易挑取。

所述筛选培养基终浓度组成：0.2% (v/v)环氧氯丙烷，0.1%（NH₄）SO₄，0.1% K₂HPO₄, 0.1% Na₂HPO₄·2H₂O，0.2% NaH₂PO₄·12H₂O，0.05% MgSO₄·7H₂O， 0.001% FeSO₄·7H₂O，0.001% CuSO₄·5H₂O，0.001% MnSO₄·5H₂O，溶剂为水，pH自然；

所述固体LB培养基终浓度组成：1% 蛋白胨，0.5% 酵母粉，1% NaCl , 2% 琼脂，溶剂为水，pH 7.0；

所述发酵培养基终浓度组成：1% 甘油，0.5% 蛋白胨，1% 酵母粉，0.1%（NH₄）SO₄，0.1% K₂HPO₄，0.1% Na₂HPO₄·2H₂O，0.2% NaH₂PO₄·12H₂O，0.05% MgSO₄·7H₂O，0.001% FeSO₄·7H₂O，0.001% CuSO₄·5H₂O，0.001% MnSO₄·5H₂O，0.1% CaCO₃，溶剂为水，pH自然。

筛选得到的菌株ZJB120203，进行生理生化及BIOLOG鉴定（见表1和表2），并按精编分子生物学实验指南方法提取染色体DNA，以提取到的细胞总DNA为模板，利用引物: p16S-8: 5'-aga gtt tga tcc tgg ctc ag-3' 和 p16S-1541: 5'-aag gag gtg atc cag ccg ca-3'扩增菌株的16S rDNA基因，将基因产物同T载体连接后，委托上海生工对该菌16S rDNA扩增及测序，得到该菌株的16S rDNA序列后，在NCBI网站上用BLAST检索GenBank中相关菌株的16S rRNA基因序列，并进行同源性比对。基于形态、生理生化特征和16S rDNA序列及系统发育学分析等方面的鉴定，确定该菌为壤霉菌，拟命名为壤霉菌（Agromyces sp.）ZJB120203，此株菌已于2012年7月25日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC No：M 2012299。

表1. 菌株对Biolog GENⅢ板上71种碳源的利用能力

Figure 2012104550730100002DEST_PATH_IMAGE002

表2. 菌株对Biolog GENⅢ板上23种化学物质的化学敏感性

菌株ZJB120203 16S rDNA序列，SEQ ID NO：3所示：

1 CGAACGATGA ACTTGGAGCT TGCTCTGGGG GATTAGTGGC GAACGGGTGA GTAACACGTG

61 AGTAACCTGC CCTGGACTCT GGGATAACTT CGAGAAATCG GAGCTAATAC CGGATAGGAC

121 CTTGCACCGC ATGGTGTGGG GTGGAAAGTT TTTCGGTTTG GGATGGACTC GCGGCCTATC

181 AGCTTGTTGG TGAGGTAATG GCTCACCAAG GCGTCGACGG GTAGCCGGCC TGAGAGGGTG

241 ACCGGCCACA CTGGGACTGA GACACGGCCC AGACTCCTAC GGGAGGCAGC AGTGGGGAAT

301 ATTGCACAAT GGGCGCAAGC CTGATGCAGC AACGCCGCGT GCGGGATGAC GGCCTTCGGG

361 TTGTAAACCG CTTTTAGTAG GGAAGAAGCC TTCGGGTGAC GGTACCTGCA GAAAAAGGAC

421 CGGCTAACTA CGTGCCAGCA GCCGCGGTAA TACGTAGGGT CCGAGCGTTG TCCGGAATTA

481 TTGGGCGTAA AGAGCTCGTA GGCGGTTTGT CGCGTCTGCT GTGAAAACTA GAGGCTCAAC

541 CTCTAGCCTG CAGTGGGTAC GGGCAGACTT GAGTGGTGTA GGGGAGACTG GAATTCCTGG

601 TGTAGCGGTG GAATGCGCAG ATATCAGGAG GAACACCGAT GGCGAAGGCA GGTCTCTGGG

661 CACTTACTGA CGCTGAGGAG CGAAAGCGTG GGGAGCGAAC AGGATTAGAT ACCCTGGTAG

721 TCCACGCCGT AAACGTTGGG CGCTAGATGT GGGGACCTTT CCACGGTTTC CGTGTCGTAG

781 CTAACGCATT AAGCGCCCCG CCTGGGGAGT ACGGCCGCAA GGCTAAAACT CAAAGGAATT

841 GACGGGGGCC CGCACAAGCG GCGGAGCATG CGGATTAATT CGATGCAACG CGAAGAACCT

901 TACCAAGGCT TGACATACAC GAGAACGGGC CAGAAATGGT CAACTCTTTG GACACTCGTG

961 AACAGGTGGT GCATGGTTGT CGTCAGCTCG TGTCGTGAGA TGTTGGGTTA AGTCCCGCAA

1021 CGAGCGCAAC CCTCGTCGCA TGTTGCCAGC ACGTTATGGT GGGGACTCAT GTGAGACTGC

1081 CGGGGTCAAC TCGGAGGAAG GTGGGGATGA CGTCAAATCA TCATGCCCCT TATGTCTTGG

1141 GCTTCACGCA TGCTACAATG GCCGGTACAA AGGGCTGCGA TGTCGTAAGG CGGAGCGAAT

1201 CCCAAAAAGC CGGTCTCAGT TCGGATTGAG GTCTGCAACT CGACCTCATG AAGTCGGAGT

1261 CGCTAGTAAT CGCAGATCAG CAACGCTGCG GTGAATACGT TCCCGGGCCT TGTACACACC

1321 GCCCGTCAAG TCATGAAAGT CGGTAACACC CGAAGCCGGT GGCCTAACCC TTGTGGAGGG

1381 AGCCGTCGAA GGTGGGATCC GGTGATTAGG ACTAAGTCGA ACA

实施例2：环氧化物水解酶基因的克隆

用核酸快速提取仪提取壤霉菌（Agromyces sp.）ZJB120203菌体的总基因组DNA，以该基因组DNA为模板，在引物1(YKSCAYGGYTGGCCMGG)和引物2(SARYGCRGCAAAGTGTCC) 的作用下进行PCR扩增，PCR反应体系各组分加入量（总体积100μL）：10×Taq DNA Polymerase Buffer 10μL(Mg²⁺)，10mM dNTP mixture（dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mM）0.5μL，浓度为50μM的克隆引物1、引物2各0.5μL，基因组DNA 1μL，Taq DNA 聚合酶 1μL，无核酸水86.5μL。

采用Biorad的PCR仪，PCR反应条件为：预变性94℃ 3min，然后进入温度循环94℃ 30s，60℃ 30 s，72℃ 1.5min，共30个循环，最后72℃延伸10min，终止温度为8℃。

取10μL PCR反应液用0.9%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图3所示。从图3中看出，在800bp左右出现明显条带。切胶回收该片段并纯化，直接同T 载体进行连接，得到克隆重组质粒pMDT-18-EHP。将该重组质粒电转化至大肠杆菌JM109中，利用篮白斑筛选系统进行筛选，随机挑取白色克隆测序，利用软件分析测序结果，结果表明：经引物1和引物2扩增到的核苷酸序列长度为799bp。

实施例3：环氧化物水解酶基因的获得

用核酸快速提取仪提取壤霉菌ZJB120203菌体的总基因组DNA，以该基因组DNA为模板，在引物3(ATGACCGCGGTGAGTCCCAC)和引物 4(TCATTGTTCATTTCCTCTCAATTGG) 的作用下进行PCR扩增。PCR反应体系各组分加入量（总体积100μL）：10×Pfu DNA Polymerase Buffer 10μL，10mM dNTP mixture（dATP、dCTP、dGTP和dTTP各2.5mM）0.5μL，浓度为50μM的克隆引物3、引物4各0.5μL，基因组DNA 1μL，Pfu DNA Polymerase 1μL，无核酸水86.5μL。

取10μL PCR反应液用0.9 %琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图4所示，从图4可以看出，在1200bp处出现明显特异性条带。切胶回收该片段并纯化，利用Taq DNA 聚合酶向片段5’端引入碱基A。在T4 DNA 连接酶作用下将该片段同T 载体进行连接，得到克隆重组质粒pMDT-18-EH见图1。将该重组质粒电转化至大肠杆菌JM109中，利用篮白斑筛选系统进行筛选，随机挑取白色克隆测序，利用软件分析测序结果，结果表明：经引物3和引物4扩增到的核苷酸序列长度为1167bp ，其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示，该序列编码一个完整的开放阅读框。

实施例4：重组大肠杆菌BL21/pET28a-EH的制备

根据实施例2分析结果设计引物5(CGCCATATGACCGCG GTGAGTCCCAC)和引物6（ATTTGCGGCCGCTCATTGTTCATTT CCTCTCAATTGG），并分别在引物5和引物6中引入了Nde I和Not I限制性酶切位点（横线位置）。在引物5和引物6的引发下，利用高保真Pfu DNA 聚合酶（fermentas）进行PCR扩增，获得长为1167bp的环氧化物水解酶基因片段（其核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示），测序后利用Nde I和Not I限制性内切酶（fermentas）对扩增片段进行处理，并利用T4 DNA 连接酶（TaKaRa）将该片段同用相同的限制性内切酶处理的商业化载体 pET28a（Invitrogen）进行连接，构建胞内表达载体pET28a-EH。将构建的胞内表达载体pET28a-EH电转化至大肠杆菌BL21（Invitrogen）中，涂布于新鲜的含有50μg/ml卡那霉素抗性的LB平板，37℃下培养过夜，随机挑取克隆抽提质粒进行酶切鉴定，鉴定结果见图5所示，从图5可以看出阳性重组质粒pET28a-EH单酶切在3泳道和4泳道出现单一的与预期相符的条带，双酶切后5泳道出现两条带，一条带与目的基因片段大小一致。该结果说明目的基因已经克隆至pET28a的NdeI和Not I位点。

实施例5：含有重组环氧化物水解酶的菌体细胞的制备

将实施例4获得的含有胞内表达重组质粒pET28a-EH的重组大肠杆菌BL21/pET28a-EH接种至含有50μg/ml 卡那霉素抗性的LB液体培养基，在37℃培养12h，再以1%接种量（v/v）接种到新鲜的含有50μg/ml卡那霉素抗性的LB液体培养基中，37℃培养至菌体浓度OD₆₀₀约0.6左右，再向LB液体培养基加入终浓度为0.5mM的IPTG，28℃诱导培养10h后，将培养液在4℃、8000rpm离心10min，弃去上清液，收集沉淀，即获得含有重组环氧化物水解酶的湿菌体，即含有胞内表达重组质粒的重组大肠杆菌BL21/pET28a-EH湿菌体。

同时以未诱导的大肠杆菌BL21和未诱导的重组大肠杆菌BL21/pET28a-EH作为对照，分别取20μl培养液与上样缓冲液混合后煮沸10min，进行SDS-PAGE电泳分析，结果见图6所示，从图6可以看出经IPTG诱导后，含有重组质粒pET28a-EH的大肠杆菌在43KDa处出现明显表达条带，与目的蛋白大小吻合，进一步证明重组表达载体pET28a-EH构建成功。

实施例6：重组环氧化物水解酶在制备S-环氧氯丙烷中的应用

以实施例5方法获得的含有胞内表达重组质粒的重组大肠杆菌BL21/pET28a-EH湿菌体作为转化用酶，以外消旋的环氧氯丙烷为底物，进行生物转化反应制备S-环氧氯丙烷。

转化体系组成及转化操作如下：在10mL磷酸盐缓冲液（pH 8）中加入0.2g湿菌体（菌体干重为0.019g）和0.5%（v/v）的外消旋的环氧氯丙烷(终浓度为5.9g/L)构成反应体系，30℃、150r/min条件下摇床反应，反应5min取样检测酶活，30min后加入丙酮中止反应，采用气相色谱Agilent 6890N检测转化反应液中底物的摩尔转化率及对映体过剩值ee%。

同样条件下，以大肠杆菌BL21湿菌体和大肠杆菌BL21/pET28a湿菌体分别代替上述重组大肠杆菌BL21/pET28a-EH湿菌体作为对照。

气相色谱Agilent 6890N色谱柱类型：BGB-175毛细管柱；色谱条件：柱温90℃，进样室温度220℃，FID检测器220℃，氦气流量为1.6mL/min；分流比为 40:1。

酶活单位（U）定义为：在30℃、pH 8.0条件下，在1min内催化1μmol 环氧氯丙烷所需要的酶量定义为1U。根据体系中环氧氯丙烷的消耗量推知重组菌酶活。测定结果见表3。

表3：环氧化物水解酶活力测定结果

菌株/质粒	酶活(U/g (wet cells))
		大肠杆菌BL21	0
大肠杆菌BL21/pET28a	0
		大肠杆菌BL21/pET28a-EH	92.4

反应30min后，反应液乙酸乙酯萃取后气相检测，S-环氧氯丙烷对映体过量值（ee）≧99%。

实施例7：重组环氧化物水解酶在制备R-苯基环氧乙烷中的应用

以实施例5中获得的含有胞内表达重组质粒的重组大肠杆菌BL21/pET28a-EH湿菌体作为转化用酶，以外消旋的苯基环氧乙烷为底物，进行转化反应制备R-苯基环氧乙烷。

转化体系组成及转化操作如下：10mL磷酸盐缓冲液（pH 8）中加入0.2g湿菌体（菌体干重为0.019g）和0.5%（v/ v）的外消旋的苯基环氧乙烷（终浓度为5.25g/L），30℃摇床150r/min条件下反应，10min后取样检测酶活，120min后加入丙酮中止反应。

采用气相检测转化反应液中苯基环氧乙烷的浓度及ee值。各成分的量用气相色谱Agilent 6890N测定，色谱柱类型：GT-A毛细管柱；色谱条件：柱温110℃，进样室温度220℃，FID检测器230℃，氦气流量为1.6mL/min；分流比为 40:1。酶活单位（U）定义为：在30℃、pH 8.0条件下，在1min内催化1μmol 苯基环氧乙烷所需要的酶量定义为1U。根据体系中苯基环氧环氧乙烷的消耗量推知重组菌酶活。测定结果见表4。

表4：环氧化物水解酶活力测定结果

菌株/质粒	酶活(U/g (wet cells))
		大肠杆菌BL21	0
大肠杆菌BL21/pET28a	0
		大肠杆菌BL21/pET28a-EH	20.1

反应120min后，反应液乙酸乙酯萃取后气相检测，R-苯基环氧乙烷对映体过量值（ee）≧99%。

由以上实验结果可知，本发明得到的含有环氧化物水解酶基因的重组大肠杆菌具有较强的产环氧化物水解酶能力，可直接以含酶的菌体细胞为酶源进行生物催化或者转化反应。环氧化物水解酶（SED ID NO. 2）作为转化用酶，可以利用外消旋环氧氯丙烷和外消旋苯基环氧乙烷为底物，进行生物转化反应制备高光学纯度（对映体过量值（ee）≧99%）的S-环氧氯丙烷和R-苯基环氧乙烷。

SEQUENCE LISTING

<110> 浙江工业大学

<120> 环氧化物水解酶基因、编码酶、载体、工程菌及应用

<130>

<160> 3

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1167

<212> DNA

<213> Agromyces sp.

<400> 1

atgaccgcgg tgagtcccac gccgttcgag atcgccgtgc cagacgaggt acttgacgac 60

ctctacaagc ggctcgccaa cactcgattt cctgcgtcga tagaaggtgg aggatggtcc 120

tacggcaccg atgtcgggta tctccagcgt ctggtcgact actggcgcac cgatttcaat 180

tggcgtgaag ccgagcggcg tctgaacgac ctcccgcagt atcgcgcgcg gatccaggac 240

gtcgacctcc actttgtcca tgtccctgga aagggaccgg ctccgacgcc gctcctgttc 300

gtgcacggtt ggccaggatc cttctcggag gtttccaaga tcatcggccc gttgaccgat 360

ccggcggcac acggcggcga tccggaaaac tccttctccg tggtcgcgcc gagcctccca 420

ggctttggat tttcgtcaga tatcggacgt cctggtatga atccgggcac catggcggag 480

atactcgccg agctcatgac ggacgttctc ggttattccg aattcgtcgg gcagggcggc 540

gactggggtt ctaccgtcct cacccgactc gcacacgcgc accccgacct cgtgaccggc 600

ctgcacctta actacagctc ggtacagccc agcatgatcg atgctgcccc gctcagcgca 660

gccgagcagc agtacctcag tgcgaaccag gaatggagcg cgcgcgaggg tgcgtataac 720

agtctgcagt cgacgaagcc ccagagcctc gcagtcgcac tcaacgattc gcccgcgggg 780

ctcgcggcgt ggctggtgga gaagtaccgc agctggtcgg actgcaacgg tgatgttgaa 840

agctcgttct cgtcagacga actgttgacg caagtgatga tctattgggt gacccagtcc 900

attggatcct catcccggct gtacgccgaa cgagcgcggg aagggtggac ttttcctccg 960

ggcgagatca tcgacgtgcc cactgcgtac gctcgattcc ccgccgaaat tcgacgaccg 1020

ccggccgagt ggttggagcg gatgtttcgg ctcgagcgct tcacagatat gcctcgcggt 1080

ggacacttcg ccgcgttgga ggtgcccgac ctcttggtcg ccgacctccg tgaattccag 1140

aaccaattga gaggaaatga acaatga 1167

<210> 2

<211> 388

<212> PRT

<213> Agromyces sp.

<400> 2

Met Thr Ala Val Ser Pro Thr Pro Phe Glu Ile Ala Val Pro Asp Glu

1 5 10 15

Val Leu Asp Asp Leu Tyr Lys Arg Leu Ala Asn Thr Arg Phe Pro Ala

20 25 30

Ser Ile Glu Gly Gly Gly Trp Ser Tyr Gly Thr Asp Val Gly Tyr Leu

35 40 45

Gln Arg Leu Val Asp Tyr Trp Arg Thr Asp Phe Asn Trp Arg Glu Ala

50 55 60

Glu Arg Arg Leu Asn Asp Leu Pro Gln Tyr Arg Ala Arg Ile Gln Asp

65 70 75 80

Val Asp Leu His Phe Val His Val Pro Gly Lys Gly Pro Ala Pro Thr

85 90 95

Pro Leu Leu Phe Val His Gly Trp Pro Gly Ser Phe Ser Glu Val Ser

100 105 110

Lys Ile Ile Gly Pro Leu Thr Asp Pro Ala Ala His Gly Gly Asp Pro

115 120 125

Glu Asn Ser Phe Ser Val Val Ala Pro Ser Leu Pro Gly Phe Gly Phe

130 135 140

Ser Ser Asp Ile Gly Arg Pro Gly Met Asn Pro Gly Thr Met Ala Glu

145 150 155 160

Ile Leu Ala Glu Leu Met Thr Asp Val Leu Gly Tyr Ser Glu Phe Val

165 170 175

Gly Gln Gly Gly Asp Trp Gly Ser Thr Val Leu Thr Arg Leu Ala His

180 185 190

Ala His Pro Asp Leu Val Thr Gly Leu His Leu Asn Tyr Ser Ser Val

195 200 205

Gln Pro Ser Met Ile Asp Ala Ala Pro Leu Ser Ala Ala Glu Gln Gln

210 215 220

Tyr Leu Ser Ala Asn Gln Glu Trp Ser Ala Arg Glu Gly Ala Tyr Asn

225 230 235 240

Ser Leu Gln Ser Thr Lys Pro Gln Ser Leu Ala Val Ala Leu Asn Asp

245 250 255

Ser Pro Ala Gly Leu Ala Ala Trp Leu Val Glu Lys Tyr Arg Ser Trp

260 265 270

Ser Asp Cys Asn Gly Asp Val Glu Ser Ser Phe Ser Ser Asp Glu Leu

275 280 285

Leu Thr Gln Val Met Ile Tyr Trp Val Thr Gln Ser Ile Gly Ser Ser

290 295 300

Ser Arg Leu Tyr Ala Glu Arg Ala Arg Glu Gly Trp Thr Phe Pro Pro

305 310 315 320

Gly Glu Ile Ile Asp Val Pro Thr Ala Tyr Ala Arg Phe Pro Ala Glu

325 330 335

Ile Arg Arg Pro Pro Ala Glu Trp Leu Glu Arg Met Phe Arg Leu Glu

340 345 350

Arg Phe Thr Asp Met Pro Arg Gly Gly His Phe Ala Ala Leu Glu Val

355 360 365

Pro Asp Leu Leu Val Ala Asp Leu Arg Glu Phe Gln Asn Gln Leu Arg

370 375 380

Gly Asn Glu Gln

385

<210> 3

<211> 1423

<212> DNA

<213> Agromyces sp.

<400> 3

cgaacgatga acttggagct tgctctgggg gattagtggc gaacgggtga gtaacacgtg 60

agtaacctgc cctggactct gggataactt cgagaaatcg gagctaatac cggataggac 120

cttgcaccgc atggtgtggg gtggaaagtt tttcggtttg ggatggactc gcggcctatc 180

agcttgttgg tgaggtaatg gctcaccaag gcgtcgacgg gtagccggcc tgagagggtg 240

accggccaca ctgggactga gacacggccc agactcctac gggaggcagc agtggggaat 300

attgcacaat gggcgcaagc ctgatgcagc aacgccgcgt gcgggatgac ggccttcggg 360

ttgtaaaccg cttttagtag ggaagaagcc ttcgggtgac ggtacctgca gaaaaaggac 420

cggctaacta cgtgccagca gccgcggtaa tacgtagggt ccgagcgttg tccggaatta 480

ttgggcgtaa agagctcgta ggcggtttgt cgcgtctgct gtgaaaacta gaggctcaac 540

ctctagcctg cagtgggtac gggcagactt gagtggtgta ggggagactg gaattcctgg 600

tgtagcggtg gaatgcgcag atatcaggag gaacaccgat ggcgaaggca ggtctctggg 660

cacttactga cgctgaggag cgaaagcgtg gggagcgaac aggattagat accctggtag 720

tccacgccgt aaacgttggg cgctagatgt ggggaccttt ccacggtttc cgtgtcgtag 780

ctaacgcatt aagcgccccg cctggggagt acggccgcaa ggctaaaact caaaggaatt 840

gacgggggcc cgcacaagcg gcggagcatg cggattaatt cgatgcaacg cgaagaacct 900

taccaaggct tgacatacac gagaacgggc cagaaatggt caactctttg gacactcgtg 960

aacaggtggt gcatggttgt cgtcagctcg tgtcgtgaga tgttgggtta agtcccgcaa 1020

cgagcgcaac cctcgtcgca tgttgccagc acgttatggt ggggactcat gtgagactgc 1080

cggggtcaac tcggaggaag gtggggatga cgtcaaatca tcatgcccct tatgtcttgg 1140

gcttcacgca tgctacaatg gccggtacaa agggctgcga tgtcgtaagg cggagcgaat 1200

cccaaaaagc cggtctcagt tcggattgag gtctgcaact cgacctcatg aagtcggagt 1260

cgctagtaat cgcagatcag caacgctgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc 1320

gcccgtcaag tcatgaaagt cggtaacacc cgaagccggt ggcctaaccc ttgtggaggg 1380

agccgtcgaa ggtgggatcc ggtgattagg actaagtcga aca 1423

Claims

1.一种环氧化物水解酶基因，其特征在于所述环氧化物水解酶基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。

2.一种由权利要求1所述环氧化物水解酶基因编码的环氧化物水解酶。

3.如权利要求2所述的环氧化物水解酶，其特征在于所述环氧化物水解酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示。

4.一种含权利要求1所述环氧化物水解酶基因的重组载体。

5.一种由权利要求4所述重组载体转化得到的重组基因工程菌。

6.一种权利要求1所述环氧化物水解酶基因在制备重组环氧化物水解酶中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述的应用为：将含所述环氧化物水解酶基因构建载体，再将载体转化大肠杆菌，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离获得含环氧化物水解酶的菌体细胞。

8.一种含权利要求2所述环氧化物水解酶基因的环氧化物水解酶在制备手性环氧化物中的应用，其特征在于所述应用为：以含环氧化物水解酶的重组基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体为酶源，以外消旋环氧化物为底物，于pH 6~10缓冲液的反应体系中进行转化反应，在20~ 40℃条件下转化反应结束后，获得的转化反应液即为含手性环氧化物的混合液，将混合液分离纯化，获得手性环氧化物。

9.如权利要求8所述含权利要求1所述环氧化物水解酶基因的环氧化物水解酶在制备手性环氧化物中的应用，其特征在于所述应用为：以含环氧化物水解酶的重组基因工程菌经诱导培养获得的湿菌体为酶源，以外消旋环氧化物为底物，于pH 6~10缓冲液的反应体系中进行转化反应，在20~ 40℃、50~250r/min条件下转化反应0.05~ 4h，反应结束后，获得的转化反应液即为含手性环氧化物的混合液，将混合液分离纯化，获得手性环氧化物；所述底物的初始浓度为0.05~80g/L，所述湿菌体的质量用量以菌体干重计为0.05~0.4g/g底物。

10.如权利要求8或9所述含权利要求1所述环氧化物水解酶基因的环氧化物水解酶在制备手性环氧化物中的应用，其特征在于所述底物为外消旋环氧氯丙烷或外消旋苯基环氧乙烷。