CN101591664A - 一种高对映体选择性环氧化物水解酶及其编码的基因 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物技术领域，公布了利用RT－PCR方法克隆一种来源于真菌黄孢原毛平革菌BKM－F1767株系(Phanerochaete chrysosporium BKM－F1767)中的环氧化物水解酶基因(PchEHA)，公布PchEHA编码区核苷酸序列和氨基酸序列。提供了含有该基因的克隆质粒pTEHA和重组表达质粒pET28EHA，以及包含PchEHA基因的基因工程菌株大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28EHA，并由此制备的重组环氧化物水解酶。本发明中的重组环氧化物水解酶对多种类型的环氧化物具有催化活性，而且表现出不同程度的对映体选择性，其中对环氧苯乙烷表现出高度的对映体选择性。本发明中的重组环氧化物水解酶可以应用于手性环氧化物外消旋混合物的动力学拆分及环氧化物的不对称催化等领域。

Description

一种高对映体选择性环氧化物水解酶及其编码的基因

技术领域

本发明属于生物技术领域，涉及一种白腐真菌黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporiumBKM-F1767)来源的具有对映体选择性的环氧化物水解酶，包括这种环氧化物水解酶的核苷酸序列及重组环氧化物酶，以及重组酶在手性环氧化物外消旋混合物拆分及不对称催化方面的应用。

背景技术

环氧化物水解酶(Epoxide hydrolase EC 3.3.2.3)是一类催化环氧化物水解生成相应的邻二醇的一类酶的总称，在酶学分类上，环氧化物水解酶与酯酶，蛋白酶，脂肪酶，脱卤素酶等同属于α/β折叠类水解酶(Fretland and Omiecinski，2000)。环氧化物水解酶广泛存在于自然界中，并在多种动物，植物，细菌及真菌中发现(Barth et al.2004a，b)，在不同的生物体内发挥不同的生理功能，主要包括：参与哺乳动物内源或外源毒性物质的分解代谢；植物中参与角质的合成，并与某些胁迫反应(干旱胁迫，病原体侵染)相关；在昆虫中，参与昆虫激素的代谢并控制昆虫的发育。此外，在人体内环氧化物水解酶与多种疾病，如炎症反应、癌症、高血压等有相(Morisseau and Hammock，2005)。

光学纯的环氧化物及其邻二醇是有机合成工业中的重要的中间体，在制药，精细化工，农药等领域具有广泛的用途(Archelas.and Furstoss，1998)。目前光学纯的环氧化物或邻二醇的制备主要有不对称化学催化和生物转化两种方法。在化学催化中，应用合适的催化剂进行不对称环化反应或水解反应可以获得某一构型环氧化物及其邻二醇，但是也存在着许多问题，如催化反应条件苛刻、反应底物狭窄、催化剂中重金属污染等。生物转化依赖于环氧化物水解酶在催化环氧化物水解的过程中对底物具有特异的立体化学选择性，这一特点使环氧化物水解酶在反应过程中对手性环氧化物不同的对映异构体具有不同的反应速率，在一定的反应条件下利用催化反应动力学的差异，可以将某一环氧化物外消旋混合物中的某一构型的对映体水解而保留另一构型的对映体从而获得单一构型的环氧化物，不但实现手性环氧化物水解酶的动力学拆分，而且利用这种立体化学选择性也可获得特定构型的邻二醇产物(De Vries and Janssen，2003)。与化学催化相比较而言，酶催化过程条件温和，几乎无环境污染，符合“绿色化学”的趋势，因此利用环氧化物水解酶对制备光学纯的环氧化物或邻二醇是一种极具潜力的方法(Archelas.and Furstoss，2001)。随着生物技术的发展，开发利用生物转化技术生产光学纯的手性环氧化物及其邻二醇逐渐得到重视并逐渐成为研究热点。

微生物是环氧化物水解酶的重要来源。由于微生物丰富的多样性、生长速度快、易于培养和产量高等优点，从微生物来源获得环氧化物水解酶是目前主要的途径，大量的研究集中在从微生物中筛选满足工业应用要求的环氧化物水解酶，并且取得了一些进展(Steinreiber and Faber，2001)。国内外有大量关于产环氧化物水解酶微生物筛选，环氧化物酶纯化及基因克隆，表达的文献报道。而且从自然界微生物中筛选到一些对特定环氧化物具有高对映体选择性的环氧化物水解酶，并对这些酶的催化性质进行了系统的分析。不同来源的环氧化物水解酶在底物特异性、对映体选择性、催化效力等方面存在显著的差异(Smit and Labuschagné，2006)。目前在市场上已有来源于黑曲霉(Aspergillus niger)，放射土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)，紫红红球菌(Rhodococcus rhodochrous)及人的环氧化物水解酶酶制剂产品出售，但是一方面这些环氧化物水解酶的底物作用范围有限，另一方面这些酶制剂产量小并且价格十分昂贵，无法满足大规模工业应用的要求。除了直接从自然界中筛选之外，利用分子进化技术对天然的环氧化物水解酶进行改造以提高天然环氧化物水解酶酶的酶学性质尤其是对映体选择性，通过一系列改造也获得了一些酶学性质得到显著改善的突变酶。

黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)属于白腐担子真菌，P.chrysosporium是研究木质素降解机制的模式生物，在P.chrysosporium中存在多个可能的环氧化物水解酶编码基因，这一方面说明环氧化物水解酶参与的代谢的复杂性，另一方面也提供一个筛选具有高对映体选择性环氧化物水解酶的来源。由于有研究表明真菌来源的环氧化物水解酶往往对底物具有较高的对映体选择性(Smit，2004)。因此，从P.chrysosporium中可能筛选到具有高对映体选择性的环氧化物水解酶。本发明首次从P.chrysosporium克隆表达了一个环氧化物水解酶基因，并对重组酶的催化性质进行了详细的分析研究。结果表明，该环氧化物水解酶对供试的几种环氧化物表现出不同的水解效率，而且也对几种供试的R/S型对映体表现出程度不同的水解。因此，该环氧化物水解酶在环氧化物的手性折分和不对称催化方面具有极大的应用潜力。

发明内容

为了寻找能够满足生物催化要求具有高对映体的环氧化物水解酶，本发明通过基因工程技术从白腐真菌黄孢原毛平革菌(P.chrysosporium)获到一个对多种类型的环氧化物具有催化活性并对环氧苯乙烷具有高对映体选择性的环氧化物水解酶PchEHA。本发明从P.chrysosporium BKM-F1767克隆获得了该环氧化物水解酶PchEHA基因完整的编码区序列，将编码区序列克隆到pMD18-T载体中，并对PchEHA编码区进行了序列测定，如序列表SEQ ID NO1所示，PchEHA编码区长1005bp，编码334个氨基酸残基。

本发明的另一个目的是提供包括环氧化物水解酶PchEHA基因的表达载体，在获得完整正确的PchEHA编码区序列的基础上构建了含PchEHA基因编码区的原核表达质粒pET28EHA。将pET28EHA转化E.coli BL(DE3)菌株，获得了表达PchEHA的基因工程菌株E.coli BL(DE3)/pET28EHA，该菌株经过培养，基因诱导表达操作获得了具有生物学活性的重组环氧化物水解酶，因此，本发明的再一目的是提供了包含SEQ ID NO2所示氨基酸序列的重组环氧化物水解酶。所以包含本发明所述基因的表达载体及细胞株系均属于本发明的范围。

本发明中的环氧化物水解酶的氨基酸序列不仅包括SEQ ID NO2所示的序列，而且包括由SEQ IDNO2所示的序列经过一个或数个氨基酸残基突变、添加、缺失衍生出的且具有与PchEHA相同催化性质的蛋白质。除此之外本发明中SEQ ID NO1所示环氧化物水解酶基因序列可以通过常规的分子生物学操作连接于各种商品化的表达载体和其他表达载体上，并在适宜的宿主细胞中实现表达，从而获得包含SEQ ID NO2所示氨基酸序列的重组酶。因此本发明亦提供了构建包含SEQ ID NO1所示序列及其衍生序列的其它表达质粒的可能，包括原核系统和真核系统的表达质粒。因此利用这些表达载体构建的包含SEQ ID NO1序列或由PchEHA衍生的序列的表达质粒中的环氧化物水解酶编码序列亦属于本发明的保护范围。

本发明中的重组酶可以通过将pET28EHA转化E.coliBL(DE3)菌株，并对准化细胞经诱导培养后，从宿主细胞中纯化得到重组的环氧化物水解酶。获得的重组蛋白对多种环氧化物表现出催化活性，对测试的环氧化物表型出不同程度的对映体选择性，并且对环氧苯乙烷两种不同构型的对映体表现出高的对映体选择性。因此本发明中的重组环氧化物水解酶可以应用于手性环氧化物外消旋混合物的动力学拆分，制备光学纯的环氧化物，除此之外，本发明中的高对映体选择性的环氧化物水解酶还可应用于环氧化物的不对称催化。

附图说明

图1环氧化物水解酶的诱导表达和纯化结果图。其中泳道1是蛋白质Marker；泳道1是E.coliBL21(DE3)/pET28EHA未诱导的上清蛋白；泳道3是经IPFG诱导后的上清蛋白；道3是经亲和层析纯化后重组酶。

图2重组环氧化物水解酶对几种环氧化物的水解。水解反应体系为150μl的0.1M Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)；反应温度37℃，时间30min。重组环氧化物水解酶的用量分别是10，20和40μg(从左到右)；底物浓度分别为环氧苯乙烷30mM(A)，环氧氯丙烷12mM(B)，1，2-环氧丁烷120mM(C)。水解反应起始时的数量计为100％。

图3重组环氧化物水解酶对四种R-/S-型环氧化物对映体的选择性水解。水解反应在150μl的0.1MTris-HCl缓冲液(pH 9.0)；反应温度37℃，时间30min。R-/S-型底物浓度分别为环氧苯乙烷30mM(A)，环氧氯丙烷15mM(B)，1，2-环氧丁烷200mM(C)，对甲苯磺酸缩水甘油酯12mM(D)。水解反应起始时的数量计为100％。对环氧苯乙烷底物，重组酶的用量左图为20μg，右图为40μg；对其他环氧化物底物，酶的用量左图为60μg，右图为120μg。

图4重组环氧化物水解酶对R-/S-型环氧苯乙烷(上图)和R/S型对甲苯磺酸缩水甘油酯(下图)的水解动力学。水解反应在150μl的0.1M Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)；反应温度37℃；对R-/S-型环氧苯乙烷底物，酶的用量为10μg，对R/S型对甲苯磺酸缩水甘油酯，酶的用量为40μg；○表示(R)型环氧化物，◇表示(S)型环氧化物。

具体实施方式

实施例1：从P.chrysosporium中克隆环氧化物水解酶PchEHA编码区序列

P.chrysosporium BKM-F1767的培养及RNA提取：将P.chrysosporium BKM-F1767接种于PDA平板上，38℃培养5天，待平板上形成大量的分生孢子后，用0.1％的无菌Tween-20溶液将孢子从平板上洗下，涡旋分散后纱布过滤。滤过液4000rpm离心5min，用无菌水洗涤2次，重新悬浮孢子，将浓度调节到A₆₀₀≈1.0。将制备好的孢子悬液50mL的Kirk低氮培养基中，分别接种3ml孢子悬液，39℃充氧静置培养，设置3个平行样，在培养后第48h和72h，过滤收集菌丝体用于提取细胞总RNA。P.chrysosporium总RNA使用TRIZOL试剂盒(Invitrogen公司)提取，操作步骤参照试剂盒说明书进行，将提取的RNA用DNase I(TakaRa公司)处理除去DNA后，溶解于去离子甲酰胺中，-20℃条件下保存。RNA的质量和浓度分别用甲醛变性胶琼脂糖凝胶电泳检测和紫外分光光度计测定。

RT-PCR：反转录参照宝生物工程(大连)有限公司Reverse Transcriptase M-MLV试剂盒的操作说明进行，以反转录得到的cDNA样品为模板，采用常规PCR方法从中扩增PchEHA，PCR引物设计参考联合基因研究所(Joint Genome Institute，JGI)中Phanerochaete chrysosporium v2.0数据库中预测的P.chrysosporium RP78中的一个环氧化物水解酶基因序列(Phchr1/scaffold_15：590151-59130，genemodel：fgenesh1_pg.C_scaffold_15000173)。引物序列为(由上海生物工程有限公司合成)。

上游序列：5′-CGGATCCATGGACGCGAGCCTCTTCAAG-3′(画线部分为BamHI位点)

下游序列：5′-CAAGCTTCTACTGTCCTCCTGAGGCGAAGC-3′(画线部分为HindIII位点)

PCR反应：反应条件为94℃预变性3分钟，94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸1分钟，循环30次，最后72℃延伸10分钟。PCR产物用0.8％琼脂糖电泳检测后用DNA胶回收试剂盒(上海生工)回收目标片段，将回收的片段连入pMD18-T载体中(TakaRa公司)，转化E.coli JM109感受态细胞，挑取阳性克隆并提取质粒，质粒用BamHI和HindIII(TaKaRa公司)进行酶切验证，重组质粒中插入序列再经测序鉴定，得到含PchEHA编码区序列的质粒pTEHA。PchEHA编码区序列如序列图SEQ IDNO1所示，推导的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。

实施例2：环氧化物水解酶PchEHA表达载体的构建

用BamH I和Hind III对质粒pTEHA进行双酶切，琼脂糖电泳检测后回收其中环氧化物PchEHA的编码区片断，将pET-28a(+)(Novagen公司)用BamH I和Hind III进行酶切并进行胶回收以制备载体。将回收的环氧化物PchEHA的编码区片断与制备的pET-28a(+)载体进行连接，连接产物转化E.coliJM109，挑选阳性克隆并提取质粒，对质粒进行琼脂糖凝胶电泳检测，经电泳检测确定含有插入片断的质粒用BamH I和Hind III进行酶切鉴定。从而得到含PchEHA的表达质粒，并将其命名为pET28EHA。

实施例3：环氧化物水解酶PchEHA在大肠杆菌中的表达及纯化

将重组表达质粒pET28EHA转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞得到表达重组酶的基因工程菌株E.coli BL21(DE3)/pET28EHA、过夜培养后挑取单菌落进行诱导表达。诱导表达操作参照PET System操作手册。具体步骤为：将含有pE28EHA的E.coli BL21(DE3)单菌落接种于3ml LB液体培养基(含50μg/ml卡那霉素)中，37℃条件下220r/min振荡培养过夜；取2.5ml培养液(1％)接入到250ml新的LB液体培养基中(接种8瓶，共2L)，37℃条件下；220r/min振荡培养至OD₆₀₀约为0.5；加入0.5mM IPTG，在18℃条件下诱导表达；培养16-20h后，离心10分钟(4000r/min)收集菌体，将细菌细胞重悬于25ml细胞破碎缓冲液中[20mM Tris-HCl，pH 7.5，250mM NaCl，0.5mM PMSF，10％glycerol(V/V)]；将细胞悬液置于冰水中，用压力细胞破碎仪或超声波破碎细胞，在4℃条件下10000rpm/min离心5min，转移上清于另一离心管中。对裂解液上清进行SDS-PAGE(12％)检测重组蛋白的表达(见附图1)。

重组环氧化物水解酶PchEHA的纯化使用通用电器公司(GE)的AKTA primer层析系统。简要操作步骤如下：用10×柱体积(CV)水洗涤Hitrap^TM柱(Amersham公司)，将0.1mol/L的NiSO₄过柱，流速1mL/min；电导指示平衡后，用10×CV水洗涤，再用10×CV的缓冲液A[0.1M磷酸钾盐缓冲液，pH 7.5，250mM NaCl，10mM咪唑，10％甘油(V/V)]平衡，流速为1mL/min；平衡完成后将细胞破碎液上清上样(上样前10000r/min离心5分钟)，流速为1ml/min。用10×CV的缓冲液A洗脱杂蛋白，流速为1ml/min；然后利用混合梯度洗脱目标蛋白，洗脱液中咪唑浓度从0mM渐升到500mM，洗脱流速为1ml/min，收集洗脱峰对应的洗脱液。收集的洗脱液放入透析袋中在1L透析液(50mM磷酸钾盐缓冲液，pH7.5，1mM DTT，0.1mMEDTA)中透析24h，中间换透析液1次。透析后将洗脱液冻干，保存于4℃，称取适量冻干的蛋白质溶于保存缓冲液[100mM磷酸钾盐缓冲液，pH 7.5，50％甘油(V/V)]。利用SDS-PAGE(12％)检测重组蛋白的纯度以及蛋白质浓度，定量以BSA为标准，应用AlphaImager软件分析计算。环氧化物水解酶诱导表达及纯化过程见附图1。

实施例4：重组环氧化物水解酶PchEHA的酶学性质鉴定

环氧化物水解酶活性测定方法参照文献[唐燕发等，分析科学学报(2002)18：142-145]进行，其原理为4-(对硝基)苄基吡啶与环氧化物反应后生成的中间体经碱化可产生蓝色、紫色或棕色芳甲烷类染料，利用此显色反应可测定环氧化物的含量。以不含环氧化物水解酶的样品为空白对照，通过绘制的标准曲线计算反应后体系中剩余的环氧化物的量，从而根据环氧化物水解酶催化环氧化物减少的量来计算环氧化物的酶活性。具体步骤为：在1.2ml的反应体系(0.1M Tris-HCl)中，加入适量的环氧苯乙烯，环氧氯丙烷，环氧丁烷，对甲苯磺酸缩水甘油(四种底物均溶于二甲基亚砜中)及其R-/S-型两种对映体，最后加入适量的重组酶启动水解反应。在不同的反应时间，从反应体系中取出150μl的反应液，加入等体积的50mmol/L 4-(对硝基)苄基吡啶；混合均匀后，在80℃水浴反应10min，立即置于流水中冷却至室温。吸取200μl反应液加入到2.8ml的0.1M磷酸钾盐缓冲液(pH＝8.0)中，混合均匀，再加入1ml试剂B(40％三乙胺(v/v)显色。测定A₅₆₅的光密度值并记录数据。

实验结果表明PchEHA对环氧苯乙烯，环氧氯丙烷，环氧丁烷均具有活性(见附图2)，并且对这些环氧化物的R/S型对映体表现出不同程度的催化选择性(如附图所示3)。进一步的动力学分析表明，重组的环氧化物水解酶对R-/S-型环氧苯乙烷两种对映体表现出高度的选择性，因为对R型对映体的催化活性明显大于S-型(如附图4上所示)，因此可以应用于环氧苯乙烷类环氧化物外消旋混合物的动力学拆分，用以制备光学纯的环氧化物对映体。但该酶对R/S型对甲苯磺酸缩水甘油酯的选择性较低(如附图4下所示)，这也反映了环氧化物水解酶对不同底物的特异性。

以环氧苯乙烷为底物，对PchEHA的酶学性质进行了分析，结果表明该酶的最适反应温度为40℃，最适pH值为9.0。在浓度为2mM的条件下，金属离子Mg²⁺，Al³⁺，Mn²⁺，Ca²⁺，Ba²⁺，Fe²⁺，Fe³⁺，Co²⁺对PchEHA酶的催化活性影响不明显，而Cu²⁺，Hg²⁺，Cd²⁺对PchEHA具有较强的抑制作用。在反应体系有机溶剂含量为10％(V/V)的条件下，丙酮，二甲基亚砜，乙醇，甲酰胺对酶催化活性影响不明显，甲醇，乙腈对酶活性具有中等强度抑制作用，PchEHA对金属离子鳌和剂(EDTA-Na₂，5mM)不敏感，氧化剂过氧化氢(H₂O₂，5mM)对酶活性具有较弱的抑制作用。

参考文献

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序列表

<110>四川大学

<120>一种高对映体选择性环氧化物水解酶及其编码的基因

<160>2

<210>1

<211>1005

<212>DNA

<213>黄孢原毛平革菌BKM-F1767(P chrysosporium BKM-F1767)

<220>

<221>CDS

<222>(1)...(1005)

<400>1

ATGGACGCGA GCCTCTTCAA GGACTTCAAG ACCTCCCGCG GCTTCAACTA CCACTACTTC 60

TACTCGCCCG CGAAGGGCCC GAGGCCCACG CTCTTCTTCC TCCATGGGAA CCCCAGCGTC 120

GCCACGGATT GGGCGCAGAT CGTGCCGCAC TTCACAAGCA GGGGTTACGG TGTCCTCGCG 180

CCCGACATGC TGGGATACGG AGACACCGAC AAGCCGACGG ACCCGGCGTT GTATGTCTCG 240

AGCGGCATGT GCAGGAACCT CGTCGACCTC CTGGACCATG AGGGCCTCGA GAAGGTCATC 300

GCAATCGGCC ATGACTGGGG CTGCTTGTCG GTCTCGCGAC TGGCGAGCTA TTATCCCGAA 360

CGGGTCATCG CGTATGCCTT CCTTGCAGCG TCCTTCATCG GCCCCATCCC GCCCATCCCC 420

TTCGACGCTT TCCTGGAATA CATCAAGCAG CAGGTGGGGT ACGAGCTGTA CGGCTACTGG 480

AAGTTCTACA GCGAGCCTGG CCTGGACCAG TTCGTGCGGG ACCACTTGGA TACGTTCCTG 540

AGTATCCTCT GGCCCAGCGA CCCCGCCGTC TGGAAGACGC GTCTCGCGCC GACGGGCGCG 600

CTGAAGCAGT CCGCGCTCGA GGGCTGGACG GCGCCGCTCG CGCCGTACAT CACTGAGGAA 660

TTCAAGAAGC ACCACGTCGA GGTTTTCAAT AAGAACGGCT TTGAGGCGCC CGCATGCTAC 720

TACAGGATCA TGACGAGCGG GCTGCAGGCG GAGGACGACA AACAAATCCT ACCGGAGCGT 780

GCGGTCCCGC CGAAAGATGC GCCCGTGTTC TTCGGCGCGG CAAACAAGGA CTACATTTGC 840

ATCCCCGCGT TGGCGTATGC GACGTTCAAG AAGGACGAGT GGAAGGACCA CAAGATCACG 900

ATCAAGGAGT ACGACGCGGA CCACTGGCTG ATCCTCTCCC ATGCAGACCA GGTCAGTCGG 960

GACCTGGAGG CGTGGATTGA GGGCTTCGCC TCAGGAGGAC AGTAG                 1005

<160>2

<210>2

<211>334

<212>RPT

<213>黄孢原毛平革菌BKM-F1767(Phanerochaete chrysosporium BKM-F1767)

<220>

<223>(1)...(334)

<400>1

Met Asp Ala Ser Leu Phe Lys Asp Phe Lys Thr Ser Arg Gly Phe

1                5                   10                  15

Asn Tyr His Tyr Phe Tyr Ser Pro Ala Lys Gly Pro Arg Pro Thr

                 20                  25                  30

Leu Phe Phe Leu His Gly Asn Pro Ser Val Ala Thr Asp Trp Ala

                 35                  40                  45

Gln Ile Val Pro His Phe Thr Ser Arg Gly Tyr Gly Val Leu Ala

                 50                  55                  60

Pro Asp Met Leu Gly Tyr Gly Asp Thr Asp Lys Pro Thr Asp Pro

                 65                  70                  75

Ala Leu Tyr Val Ser Ser Gly Met Cys Arg Asn Leu Val Asp Leu

                 80                  85                  90

Leu Asp His Glu Gly Leu Glu Lys Val Ile Ala Ile Gly His Asp

                 95                 100                 105

Trp Gly Cys Leu Ser Val Ser Arg Leu Ala Ser Tyr Tyr Pro Glu

                110                 115                 120

Arg Val Ile Ala Tyr Ala Phe Leu Ala Ala Ser Phe Ile Gly Pro

                125                 130                 135

Ile Pro Pro Ile Pro Phe Asp Ala Phe Leu Glu Tyr Ile Lys Gln

                140                 145                 150

Gln Val Gly Tyr Glu Leu Tyr Gly Tyr Trp Lys Phe Tyr Ser Glu

                155                 160                 165

Pro Gly Leu Asp Gln Phe Val Arg Asp His Leu Asp Thr Phe Leu

                170                 175                 180

Ser Ile Leu Trp Pro Ser Asp Pro Ala Val Trp Lys Thr Arg Leu

                185                 190                 195

Ala Pro Thr Gly Ala Leu Lys Gln Ser Ala Leu Glu Gly Trp Thr

                200                 205                 210

Ala Pro Leu Ala Pro Tyr Ile Thr Glu Glu Phe Lys Lys His His

                215                 220                 225

Val Glu Val Phe Asn Lys Asn Gly Phe Glu Ala Pro Ala Cys Tyr

                230                 235                 240

Tyr Arg Ile Met Thr Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Asp Lys Gln

                245                 250                 255

Ile Leu Pro Glu Arg Ala Val Pro Pro Lys Asp Ala Pro Val Phe

                260                 270                 275

Phe Gly Ala Ala Asn Lys Asp Tyr Ile Cys Ile Pro Ala Leu Ala

                275                 280                 285

Tyr Ala Thr Phe Lys Lys Asp Glu Trp Lys Asp His Lys Ile Thr

                290                 295                 300

Ile Lys Glu Tyr Asp Ala Asp His Trp Leu Ile Leu Ser His Ala

                305                 310                 315

Asp Gln Val Ser Arg Asp Leu Glu Ala Trp Ile Glu Gly Phe Ala

                320                 325                 330

Ser Gly Gly Gln

Claims (4)

1.一种来源于真菌黄孢原毛平革菌BKM-F1767株系(Phanerochaete chrysosporium BKM-F1767)的编码环氧化物水解酶的基因，其具有：

(a)序列表SEQ ID NO1所示的核苷酸序列；

(b)根据遗传密码简并性由SEQ ID NO1所示核苷酸序列衍生的具有编码与序列表SEQ ID NO2所示氨基酸序列相同的多核苷酸序列。

2.由权利要求1所示的基因编码的环氧化物水解酶，其特征为：

(a)序列表SEQ ID NO2所示的氨基酸序列以及具有与SEQ ID NO2所示氨基酸序列至少90％同源性的蛋白质。

(c)将SEQ ID NO2所示氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代、缺失、添加等突变所衍生的具有相同催化性质的蛋白质(酶)。

3.一种用于表达权利要求1所述的编码环氧化物水解酶基因的工程菌株。其是将权利要求1所述的基因经过克隆、转化到埃希氏大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)菌株所获得的表达重组环氧化物水解酶的工程菌株E.coil BL21(DE3)/pE28EHA。

4.权利要求2所述的环氧化物水解酶在手性环氧化物外消旋混合物动力学拆分及其在环氧化物的不对称催化中的应用。

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