CN101921742B

CN101921742B - 一种具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的(+)γ-内酰胺酶及其编码基因与应用

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Publication number: CN101921742B
Application number: CN2010102101973A
Authority: CN
Inventors: 王建军; 吴胜
Original assignee: Institute of Microbiology of CAS
Current assignee: Institute of Microbiology of CAS
Priority date: 2010-06-23
Filing date: 2010-06-23
Publication date: 2012-09-12
Anticipated expiration: 2030-06-23
Also published as: CN101921742A

Abstract

本发明公开了一种具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的(+)γ-内酰胺酶及其编码基因与应用，其是来源于氧化烃微杆菌(Microbacteriumhydrocarbonoxydans)的(+)γ-内酰胺酶及其编码基因，还提供了该(+)γ-内酰胺酶水解拆分消旋体γ-内酰胺的应用。本发明所述(+)γ-内酰胺酶是如下(a)或(b)的蛋白质：(a)由序列表中的SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列组成的蛋白质；(b)将序列表中的SEQ ID NO：1氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的由SEQ ID NO：1衍生的蛋白质。利用该(+)γ-内酰胺酶水解拆分消旋体γ-内酰胺可以获得光学纯度为99.5％的(-)γ-内酰胺，收率大于39％。

Description

一种具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的(+)γ-内酰胺酶及其编码基因与应用

技术领域

本发明属于酶工程领域，具体涉及一种具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的(+)γ-内酰胺酶及其编码基因，以及该(+)γ-内酰胺酶的应用。

背景技术

目前，资源、能源和环境危机已经威胁到人类的生存与发展。生物转化是以微生物或酶作为催化剂，以可再生资源取代不可再生资源，大规模生产人类所需的化学品、医药、能源、材料等的有效手段。

(-)γ-内酰胺是合成抗艾滋病药物阿巴卡韦以及抗甲型流感及禽流感药物帕拉米韦的重要的中间体。目前合成手性(-)γ-内酰胺的方法主要分为化学合成法，手性助剂共结晶法和生物酶促转化法。化学法方法成本高、步骤烦琐，而且催化过程中使用的重金属催化剂严重污染环境。以手性助剂为拆分剂的方法收率较低，且终产物中有拆分剂残留。生物酶法在合成手性(-)γ-内酰胺中，具有节约能源，效率高，对环境友好的特点。

酶法拆分消旋体γ-内酰胺

能够水解拆分消旋γ-内酰胺的酶被称为γ-内酰胺酶。γ-内酰胺酶属于酰胺酶的一种，γ-内酰胺酶主要应用于(-)γ-内酰胺的手性合成中，(-)γ-内酰胺是制备阿巴卡韦及帕拉米韦的关键手性中间体。

目前所报道的γ-内酰胺酶对消旋γ-内酰胺的拆分过程中存在的缺点主要是，γ-内酰胺酶对消旋γ-内酰胺酶底物的拆分不具有绝对选择性，所以拆分效果依赖于拆分反应的过度反应，即需要超过50％的反应转化率。这种不具绝对选择性的酶很容易造成产物光学活性降低或者目的光学产物的损失。此外，虽然来源于硫磺矿硫化叶菌的γ-内酰胺酶具有绝对选择性，但是其最适反应温度过高(80℃)，利用此酶进行生产过程的能耗很大。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的(+)γ-内酰胺酶及其编码基因。该(+)γ-内酰胺酶具有绝对选择性，可用于消旋体γ-内酰胺的拆分，制备获得光学纯的(-)γ-内酰胺。

为解决上述技术问题，本发明所采用的技术方案是：

本发明所提供的(+)γ-内酰胺酶被命名为MHlac，来源于氧化烃微杆菌L29-9(Microbacterium hydrocarbonoxydans)CGMCC No.2085。

(+)γ-内酰胺酶MHlac是如下(a)或(b)的蛋白质：

(a)由序列表中的SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列组成的蛋白质；

(b)将序列表中的SEQ ID NO：1氨基酸残基序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的由SEQ IDNO：1衍生的蛋白质。

其中，序列表中的SEQ ID NO：1由150个氨基酸残基组成。

上述(+)γ-内酰胺酶的编码基因也属于本发明的保护范围。它可具有下述核苷酸序列之一：

(a)序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列；

(b)编码序列表中SEQ ID NO：1蛋白质序列的多核苷酸。

其中，序列表中的SEQ ID NO：2由450个碱基组成，其编码序列为自5’端第1到第450位碱基，编码具有序列表中SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列的蛋白质。

含有本发明基因的表达载体、细胞系及宿主菌均属于本发明的保护范围。

本发明所述的(+)γ-内酰胺酶MHlac是通过如下方法制备的：培养氧化烃微杆菌获得细胞，获得的细胞进行总DNA提取，提取的总DNA用Sau3AI内切酶进行酶切，酶切后的DNA用0.8％的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳后回收3kbp～6kbp的条带。回收的条带用T4连接酶连接到用BamHI内切酶处理的pUC19质粒上。连接产物转化E.coli DH5α，转化产物涂到加有50μg/mL氨苄青霉素和1mM IPTG的LB平板上，转化的菌落培养18小时。准备和平板同样大小的滤纸，用2mg/mL的γ-内酰胺甲醇溶液浸透，甲醇挥发干之后将此滤纸覆盖在转化平板上30分钟之后，将此滤纸放入37℃的培养箱反应4小时。反应结束之后将溶解在丙酮里的2％茚三酮喷洒到滤纸上，在80℃放置5分钟，阳性克隆的周围有褐色的晕圈。通过此方法筛选到一个阳性克隆。将此克隆测序后设计引物进行PCR，构建好的蛋白基因含有氨基端和羧基端的组氨酸标签蛋白。将构建好的表达载体导入宿主细胞，表达得到γ内酰胺酶MHlac。

本发明所述的(+)γ-内酰胺酶MHlac还可以通过化学合成(+)γ-内酰胺酶MHlac的编码基因，通过常规基因操作手段将此化学合成的基因构建到表达载体，并导入大肠杆菌宿主细胞得到转化子，培养该转化子，表达得到(+)γ-内酰胺酶MHlac。

用于构建含有上述γ内酰胺酶编码基因的重组表达载体都可以为基因工程领域中的质粒表达载体，可行的载体包括pET系列载体，pUC系列载体，pGEX系列载体等。宿主细胞选择与上述表达载体相应的宿主。如大肠杆菌E.coilBL21(DE3)等。表达后的蛋白可以进一步利用公认已知的纯化方法进行纯化。

本发明所述的(+)γ-内酰胺酶MHlac可以用于消旋的γ-内酰胺的拆分，获得99.6％光学纯的(-)γ-内酰胺。该(+)γ-内酰胺酶在进行消旋γ-内酰胺的拆分前，为了提高反应效率，可以利用Ni-NTA琼脂糖法制备固定化的γ-内酰胺酶。

具体反应为：

将消旋体γ-内酰胺底物加入到0.5M，pH6.0～pH8.5的磷酸缓冲液中，该消旋体γ-内酰胺在该缓冲液中的浓度为0.06mol/L～0.93mol/L，然后在此缓冲液中加入固定化的(+)γ-内酰胺酶，该固定化(+)γ-内酰胺酶与缓冲液的质量体积比为2g～10g∶1L，在20℃～40℃转化1～6小时，制得(-)γ-内酰胺。所述固定化(+)γ-内酰胺酶可以通过下述方法制备获得：所述(+)γ-内酰胺酶用Ni-NTA(镍氮川三乙酸)法进行固定，固定化的条件为：将(+)γ-内酰胺酶溶解在结合缓冲液中(50mM TrisHCl，20mM咪唑，50mMNaCl，pH8.0)，所述(+)γ-内酰胺酶在该缓冲液中的浓度为1-4g/L，然后将用同样缓冲液平衡后的Ni-NTA琼脂糖加入到γ-内酰胺酶的溶液中，所述Ni-NTA琼脂糖与(+)γ-内酰胺酶溶液的体积比控制在1∶1～10，固定化时间2～3小时，固定化温度为4℃。

本发明的有益效果主要体现在：本发明提供了一种拆分消旋体γ-内酰胺活性的(+)γ-内酰胺酶及其编码基因。该(+)γ-内酰胺酶具有绝对选择性，可用于拆分消旋体γ-内酰胺制备(-)γ-内酰胺，产率大于39％，光学纯度大于99.5％。

下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细的说明。

附图说明

图1以微杆菌基因组为模板PCR扩增MHlac的DNA电泳图，

泳道1，MHlac PCR产物；泳道M，DNA分子量标准；

图2重组MHlac的表达及纯化SDS-PAGE图，

泳道1，pET30空质粒的表达对照，泳道2，pETMHlac的表达，泳道3，pETMHlac的纯化，泳道M，蛋白分子量标准；

图3重组MHlac拆分外消旋消旋γ-内酰胺HPLC图谱。

A酶拆分获得的(-)γ-内酰胺HPLC分析图谱；B消旋体γ-内酰胺的HPLC分析图谱；其中，1乙酸乙酯溶剂峰，2内标苯甲酸，3(+)γ-内酰胺，4(-)γ-内酰胺。

具体实施方式

以下实施例中的实验方法如无特别说明均为常规方法。

实施例1本发明的(+)γ-内酰胺酶MHlac基因的获得

(1)氧化烃微杆菌(Microbacterium hydrocarbonoxydans)基因组质粒文库的建立及筛选

将保藏的氧化烃微杆菌L29-9(Microbacterium hydrocarbonoxydans)，CGMCC No.2085(该微杆菌的相关信息及保藏情况已在公开号为CN101113423A的中国专利申请中公布)的安培管管口打碎后加入1mL液体营养肉汁琼脂培养基(蛋白胨10g/L，牛肉浸取物3g/L，NaCl 5g/L，蒸馏水1L，pH7.0)，然后将菌株的悬浮液接入100mL同样的培养基培养，摇床条件为220转/分钟，30℃，48小时。培养完成后用离心机12000转/分钟离心收集菌体。

纯化提取来自氧化烃微杆菌的基因组DNA，采用细菌基因组提取试剂盒(上海生工)提取，操作方法按照试剂盒提供的说明书进行。用Sau3AI内切酶酶切该基因组DNA至2kb-6kb之间的片段。回收这些片段，连入到通过同样处理的pUC19质粒上。连接产物转化大肠杆菌E.coli DH5α，转化产物涂到加有50μg/mL氨苄青霉素和1mM IPTG的LB平板上，转化的菌落培养18小时。准备和平板同样大小的滤纸，用2mg/mL的γ内酰胺甲醇溶液浸透，甲醇挥发干之后将此滤纸覆盖在转化平板上30分钟之后，将此滤纸放入37℃的培养箱反应4小时。反应结束之后将溶解在丙酮里的2％茚三酮喷洒到滤纸上，在80℃放置5分钟，阳性克隆的周围有褐色的晕圈。通过此方法筛选到一个阳性克隆。

提取质粒，BamHI酶切表明插入重组质粒上来自基因组的片段为3kb，将带有此片段的质粒样品进行DNA测序，测序工作在北京华大基因进行。测序结果表明在该片段上有一个完整的ORF阅读框架，Blast分析表明未见与此序列同源性相关的基因。将该ORF阅读框架编码的蛋白命名为MHlac。这个基因的DNA序列如SEQ ID NO：2所示，相应的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。

(2)引物设计

根据上述基因序列设计引物，引物序列如下(由上海生工合成)；

MHlac上游引物：

5`-GGGAATTCCATATGGCGAACGATCCCGCGACCATGCCCGC-3`

下划线表示NcoI酶切位点

MHlac下游引物：

5`-CCTCGAGGAGGAAGGTCTTCAGTGCGGCGTTGAC-3`

下划线表示XhoI酶切位点

(3)PCR扩增及基因克隆

使用细菌基因组提取试剂盒(上海生工)提取微杆菌基因组，操作方法按照试剂盒提供的说明书进行，以此基因组DNA作为模板进行PCR扩增，PCR反应体系为：1μL基因组DNA(180μg/mL)，3μL dNTP(10mM，上海生工)，1单位(U)的tag酶(申能博彩)，各1μL的上下游引物(10μM)，用ddH₂O补至50μL。PCR条件为：第一步热变性95℃，5分钟，第二步热变性95℃，30秒，第三步退火50℃，30秒，第四步延伸72℃，2分钟，第五步延伸72℃，10分钟，第二步到第四步之间设置30个循环，PCR反应结束后电泳检测(见附图1)。

PCR产物经胶回收试剂盒(上海生工)回收，操作方法按照试剂盒提供的说明书进行，样品回收后分别用NcoI和XhoI酶切，连入相同酶切的pET30质粒。构建好的载体为pETMHlac。

实施例2重组蛋白表达和纯化

将构建好的质粒pETMHlac通过电转化法导入大肠杆菌E.coil BL21(DE3)，获得转化子E.coil BL21(pETMHlac)。将转化子接种到LB液体培养基(含有卡那霉素)的试管中，37℃过夜培养，按1％的转种量转接到含有400mL的LB液体培养基(含卡那霉素)中，37℃培养，待OD值为0.6-0.8时，加入终浓度为1mM的IPTG进行诱导培养3小时，离心收集菌体。将菌体悬浮在结合缓冲液中(50mM TrisHCl，20mM咪唑，50mMNaCl，pH8.0，)，进行超声波破碎(300W，超声3秒，间隔1秒，共90个循环)，14000RPM离心，收集上清液，上清液加入1mL的Ni-NTA亲和柱(Novogen)，结合后用5mL洗涤缓冲液(50mM TrisHCl，100mM咪唑，50mMNaCl，pH8.0，)进行洗涤，之后用5mL洗脱缓冲液(50mMTrisHCl，250mM咪唑，50mMNaCl，pH8.0，)进行洗脱。洗脱后的蛋白用20mMTris HCl缓冲液透析，透析后的蛋白冷冻干燥后(Flexdry冷冻干燥仪，美国)收集。SDS-PAGE检测表明蛋白的纯度在95％以上(见图2，泳道3)。

MHlac的单体分子量为18kDa，在生理条件下以三聚体形式存在，表观分子量为54kDa。酶的最适反应温度为30℃，最适反应pH值为7.0，催化反应不需要金属离子作为激活剂。

实施例3(+)γ-内酰胺酶的固定

所述固定化(+)γ-内酰胺酶是通过下述方法制备获得的：所述(+)γ-内酰胺酶用Ni-NTA琼脂糖法进行固定，固定化的条件为：将(+)γ-内酰胺酶溶解在结合缓冲液中(50mM TrisHCl，20mM咪唑，50mMNaCl，pH8.0)，所述(+)γ-内酰胺酶在该缓冲液中的浓度为4g/L，然后将Ni-NTA琼脂糖加入到(+)γ-内酰胺酶的溶液中，此Ni-NTA琼脂糖使用前用上述结合缓冲液反复洗涤并且浸泡3小时以上，所述(+)γ-内酰胺酶溶液与Ni NTA琼脂糖的体积比控制在1∶1，固定化时间2小时，固定化温度为4℃。

实施例4重组γ内酰胺酶在消旋的γ-内酰胺拆分中的应用

(1)反应转化率测定和对映体手性分析方法

γ内酰胺酶的活性测定和对映体的分析采用手性HPLC方法。色谱柱型号为Daicel公司Chiralpark AS-H(250×4.6mm)；流动相为乙腈；流速为0.6mL/分钟；检测波长为230nm；产物的定量方法采用内标法，内标物为苯甲酸。

(2)固定化酶催化水解消旋γ-内酰胺

将消旋γ-内酰胺底物首先溶解在乙腈中，然后加入到1L，0.5M，pH7.5的磷酸缓冲液中，该消旋γ-内酰胺在磷酸缓冲液中的浓度为0.5mol/L，然后，加入10g固定化的MHlac酶，将反应液加入到4L发酵罐中，控制温度在30℃，通气量1L/min，转化时间为1小时。用手性HPLC检测反应进程，控制转化率。对于转化反应，反应到达50％即可终止反应，过滤留存固定化MHlac酶，反应液用乙酸乙酯萃取，萃取液旋转蒸发仪蒸干，获得收率为39％、光学纯度为99.5％的(-)γ-内酰胺。(见图3)

实施例5重组γ内酰胺酶在消旋的γ-内酰胺拆分中的应用

(1)反应转化率测定和对映体手性分析方法

(2)固定化酶催化水解消旋γ-内酰胺

将消旋γ-内酰胺底物首先溶解在乙腈中，然后加入到1L，0.5M，pH7.0的磷酸缓冲液中，该消旋γ-内酰胺在磷酸缓冲液中的浓度为0.8mol/L，然后，加入10g固定化的MHlac酶，将反应液加入到4L发酵罐中，控制温度在30℃，通气量1L/min，转化时间为1.5小时。用手性HPLC检测反应进程，控制转化率。对于转化反应，反应到达50％即可终止反应，过滤留存固定化MHlac酶，反应液用乙酸乙酯萃取，萃取液旋转蒸发仪蒸干，获得收率为40％、光学纯度为99.6％的(-)γ-内酰胺。

显然，本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无法对所有的实施方式予以穷举。凡是属于本发明的技术方案所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之列。

序列表

<110>中国科学院微生物研究所

<120>一种具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的(+)γ-内酰胺酶及其编码基因与应用

<130>

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>150

<212>PRT

<213>Microbacterium hydrocarbonoxydans

<400>1

Ala Asn Asp Pro Ala Thr Met Pro Ala Phe Pro Val Leu Val Gln Pro

1 5 10 15

Ser Gly Leu Arg Phe Glu Ala Asp Ala Asp Ser Thr Leu Leu Ala Ala

20 25 30

Ala Gln Ala Ala Gly Ile Lys Leu Pro Ser Ser Cys Arg Asn Gly Thr

35 40 45

Cys Arg Ala Cys Met Cys Leu Met Leu Glu Gly Glu Ile Ala Tyr Arg

50 55 60

Ile Glu Trp Pro Gly Leu Ser Arg Asp Glu Lys Glu Glu Gly Trp Ile

65 70 75 80

Leu Pro Cys Val Ala Gln Ala Arg Ser Pro Leu Glu Ile Gln Ser Leu

85 90 95

Gln Ala Ala Pro Leu Glu Pro Ala Pro Pro Ala Ile Asp Ala Thr Ala

100 105 110

Arg Arg Phe His Lys Ala Val Pro Val Ala Thr Tyr Val Glu Val Glu

115 120 125

Gly Ala Pro His Gly Leu Leu Trp Thr His Ala Asp Glu Val Asn Ala

130 135 140

Ala Leu Lys Thr Phe Leu

145 150

<210>2

<211>450

<212>DNA

<213>Microbacterium hydrocarbonoxydans

<400>2

gcgaacgatc ccgcgaccat gcccgccttt cccgtcctgg tgcaaccgtc cggcctgcgc 60

ttcgaggcgg atgccgattc gaccctgctg gcggccgccc aggccgccgg catcaagctg 120

cccagttcct gccgcaacgg cacctgtcgc gcctgcatgt gcctgatgct ggaaggcgag 180

atcgcctacc gcatcgaatg gccgggcctg tcgcgcgacg agaaggaaga gggctggatc 240

ctgccgtgcg tggcgcaggc ccgttcgcca ctggaaatcc agtcgttgca ggccgcgccg 300

ctggaacccg cgccgccggc gatcgacgcg accgcccgcc gcttccacaa ggcagtgccc 360

gtcgcgacct acgtcgaggt cgaaggcgcc ccgcacggtc tgctctggac ccacgccgac 420

gaggtcaacg ccgcactgaa gaccttcctc 450

<210>3

<211>40

<212>DNA

<213>人工合成序列上游引物

<400>3

gggaattcca tatggcgaac gatcccgcga ccatgcccgc 40

<210>4

<211>34

<212>DNA

<213>人工合成序列下游引物

<400>4

cctcgaggag gaaggtcttc agtgcggcgt tgac 34

Claims

1.一种具有拆分消旋体γ-内酰胺活性的(+)γ-内酰胺酶，是由序列表中的SEQ ID NO：1的氨基酸残基序列组成的蛋白质。

2.权利要求1所述的(+)γ-内酰胺酶的编码基因。

3.根据权利要求2所述的编码基因，其特征在于：所述(+)γ-内酰胺酶的编码基因是序列表中SEQ ID NO：2所示的核苷酸序列。

4.含有权利要求2或3所述的(+)γ-内酰胺酶编码基因的重组表达载体。

5.含有权利要求2或3所述的(+)γ-内酰胺酶编码基因的转基因细胞系。

6.含有权利要求2或3所述的(+)γ-内酰胺酶编码基因的宿主菌。

7.权利要求1所述的(+)γ-内酰胺酶在拆分消旋体γ-内酰胺制备(-)γ-内酰胺中的应用，其特征在于，所述应用为：将消旋体γ-内酰胺底物加入到0.5M，pH6.0～pH8.5的磷酸缓冲液中，该消旋体γ-内酰胺在该缓冲液中的浓度为0.06mol/L～0.93mol/L，然后在此缓冲液中加入固定化的(+)γ-内酰胺酶，该固定化酶与缓冲液的质量体积比为2g～10g∶1L，在20℃～40℃转化1～6小时，制得(-)γ-内酰胺；

其中，所述固定化的(+)γ-内酰胺酶是通过下述方法制备获得的：所述(+)γ-内酰胺酶用Ni-NTA琼脂糖法进行固定，固定化的条件为：将(+)γ-内酰胺酶溶解在结合缓冲液溶液中，所述(+)γ-内酰胺酶在该缓冲液中的浓度为1-4g/L，然后将用同样缓冲液平衡后的Ni-NTA琼脂糖加入到(+)γ-内酰胺酶的溶液中，所述Ni-NTA琼脂糖与(+)γ-内酰胺酶溶液的体积比控制在1∶1～10，固定化时间2～3小时，固定化温度为4℃，其中所述结合缓冲液为含有50mM TrisHCl，20mM咪唑，50mMNaCl，pH值为8.0的缓冲液。

8.权利要求2或3所述的(+)γ-内酰胺酶编码基因在拆分消旋体γ-内酰胺制备(-)γ-内酰胺中的应用。