CN102827850A

CN102827850A - 短链脱氢酶cpe基因、编码酶、载体、重组工程菌及应用

Info

Publication number: CN102827850A
Application number: CN2012103200335A
Authority: CN
Inventors: 殷晓浦; 谢恬; 王秋岩; 谌容; 裴晓林; 曹丹; 赵淑娟
Original assignee: Hangzhou Normal University
Current assignee: Hangzhou Normal University
Priority date: 2012-08-31
Filing date: 2012-08-31
Publication date: 2012-12-19

Abstract

本发明公开了一种短链脱氢酶CPE基因、基因编码酶、载体、重组工程菌及基因编码酶在不对称还原羰基化合物中的应用，本发明短链脱氢酶CPE的转化率和e.e.值都较高，同时Km值比较低的还原酶，可以在底物浓度较低的情况下保持较长时间的酶活，在实际工业化生产中就可以减少酶的加量，降低成本；而且在加入低浓度的底物同时就可以达到最大反应速度，这样在实际工业化生产中就可以缩短单位重量产品的生产周期，减少能耗和人工成本。

Description

短链脱氢酶CPE基因、编码酶、载体、重组工程菌及应用

（一）技术领域

本发明涉及一种短链脱氢酶及应用，特别涉及短链脱氢酶CPE基因、编码酶、载体、重组工程菌及在不对称还原羰基化合物中的应用。

（二）背景技术

β羟基酯是医药、农药、材料及其它精细化工原料的重要组成部分，如4-氯-3-羟基丁酸乙酯（CHBE），是一种重要的有机合成的中间体，分子中有三个功能基团（-OH，-Cl，-COOH），可经由氯的置换反应，还原反应等，引入多种药物中间体。其手性单体（R/S）-CHBE都是非常有前景的手性物质。R-CHBE可以作为合成L-肉毒碱，(-)-大内酰亚胺A，R-γ-氨基-β-羟基丁酸的关键中间体，还可以转化为负霉素。(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯，可用于合成HGM-CoA还原酶抑制剂（他汀类药物，2007年全球销售额达到160亿美金）和β-1,4-二氢吡啶类钙离子通道阻断剂等药物，具有重要的应用价值和广阔的市场。

目前以4-氯乙酰乙酸乙酯为原材料来制备CHBE主要有化学法（手性钌催化剂还原法）和生物催化法两种方法。化学不对称合成方法采用手性催化剂如2,2’-二联苯膦基-1,1’-联萘钌配合物(2,2’-bos(dipHenyIpHospHino)-1,1’-binapHthyl ruthenium complex)作为不对称还原催化剂，该方法反应条件苛刻，需使用高压氢，对反应器要求较高；反应须在高温下进行，能耗比较高；所用的含铑或钌的催化剂价格昂贵且不易获得，因此成本较高；同时由于以金属为催化剂，使得很多制备的药物中金属含量超标，达不到安全使用的标准，无形中增加了生产成本。生物催化法在制备高对映体过量的手性化合物方面具有效率高、成本低、装置简单、对环境污染小等优势，近年来受到广泛关注。生物不对称还原方法利用可以还原4-氯乙酰乙酸乙酯的重组酶，例如短链脱氢酶，酮还原酶等来不对称还原得到手性的4-氯-3-羟基丁酸乙酯。

微生物是羰基还原酶和醇脱氢酶的好来源，大量的文献报道了微生物来源的酶法制备手性CHBE的情况。

1990年Shimizu S等人（Microbial asymmetric reduction of ethyl4-chloro-3-oxobutanoate to optically active ethyl 4-chloro-3-hydroxybutanoate.Biotechnology Lett,1990,12(8):593-596）用微生物菌体进行COBE的还原反应生成(S)-CHBE，产率为85％，光学纯度91％e.e.。同年，Sakayu S等人（Stereoselective reduction of ethyl4-chloro-3-oxobutanoate by a microbial aldethde reductase in an organicsolvent-water dipHasic system.Appl Environ Microbiol,1990,56(8):2374-2377）用能同时表达乙醛还原酶和葡萄糖脱氢酶基因的大肠杆菌转化细胞作为催化剂，在有机溶剂-水(乙酸正丁酯-水50mL/50mL)两相体系中催化反应，50小时后，(R)-CHBE的摩尔转化率为62.5％，e.e.值为92.2％。

1999年Yasohara等（Synthesis of optically active ethyl4-chloro-3-hydroxybutanoate by microbial reduction.Appl MicrobiolBiotechnol,1999,51:847-851）在葡萄糖存在下从200株酵母菌中筛选到了13株有COBE还原为(S)-CHBE能力的菌株，但所得到的结果并不理想，产率低，还原的立体选择性不高且随培养条件而改变。于是考察在水/乙酸正丁酯的双相体系中用细胞丙酮干粉进行还原反应，发现Candidamagnoliae在葡萄糖、NADP和GDH的水／乙酸正丁酯的双相体系中可还原90g/L的(S)-CHBE。当细胞经热处理后，还原的立体选择性增加到99％e.e.。

2001年Saratani Y等人报道（Stereoselective reduction of ethyl4-chloro-3-oxobutanoate by fungi.Biosci Biotechnol Biotechem,2001,65(7):1676-1679）从4个属的具有(S)-对映体还原能力的8个真菌中，筛选出了一株高产率、高光学活性的菌株IF0318555。用其制备的无细胞提取物和细胞丙酮干粉进行COBE的还原转化，得到了99％e.e.的理想结果，但摩尔转化率仅为64％。并证实在IF0318555中至少有两个或多个NADPH的氧化还原酶可将COBE还原为高e.e.的(S)-型对映体，而(R)-型选择酶几乎不存在。

Kizaki等人（Synthesis of optically pure ethyl(s)-4-chloro-3-hydroxybutanoate by Escherichia coli transformant cellscoexpressing the carbonyl reductase and glucose dehydrogenase genes.ApplMicrobiol brotechnol,2001,55:590-595.）将基因工程的方法用于(S)-CHBE的生产研究。他们用同时表达Candida magnoliae的羰基还原酶(S1)和Bacillus megtertum的葡萄糖脱氢酶(GDH)基因的大肠杆菌细胞，在有机溶剂/水的双相体系中进行反应，有机相中(S)-CHBE积浓度可达430g/L，克分子产量为85%。在水的单相体系中，通过连续添加COBE，该菌种可累积(S)-CHBE达208g/L。这两种情况下，(S)-CHBE的光学纯度均为100%e.e.。

许多专利也报道了COBE还原CHBE菌株的筛选。如US5413921筛选的Alternaria solam IFO7516可将COBE还原为(S)-CHBE，产率98.3%(约9.5g/L)，光学纯度97%e.e.。

US5559030从几十株酵母菌、细菌、乳酸细菌中筛选出的Lactobacillus所得(S)-对映体的浓度为10mg/mL，光学纯度99.0%e.e.；US5700670和US5891685也在其专利中列举了大量能够用于制备光学活性的CHBE的微生物，并列举了其所属的种类。

国内这方面的研究起步较晚，浙江大学蒋群等（4-氯乙酰乙酸乙酯不对称生物还原反应的研究.第二届生物化工学术会议论文集（杭州），2002:435-438）用海藻酸钙包埋法固定化面包酵母，在邻苯二甲酸二丁酯溶液中催化COBE的不对称还原，生成76%e.e.的(R)-CHBE；南昌大学陆豫等（酵母菌立体专一性还原的研究.南昌大学学报（理科版）,2000,24(1),59-64）用COBE为底物经酵母还原得到59.6%e.e.的(S)-CHBE；黄和等（面包酵母催化羰基不对称还原合成手性醇的研究.生物加工过程,2004,2(2):52-55）以COBE为模型底物考察了而包酵母对β-羰基酯中的羰基不对称还原情况，产物以(S)-CHBE为主；陕西师范大学的张敏等（(s)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的不对称合成.精细化工中间体,2004,34（1）:33-37）同样以面包酵母为还原剂，COBE为原料，选择性的合成(s)-CHBE，反应收率为60.5%,e.e.值为98.5%；西北大学的闫婕等（酵母细胞催化4-氯-乙酰乙酸乙酯的不对称还原反应.现代化工,2004,24(4):46-48）用酵母催化COBE生成(S)-CHBE，其产率及e.e.值分别为91.7%和97.8%。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种短链脱氢酶CPE基因、基因编码酶、载体、重组工程菌及基因编码酶在不对称还原羰基化合物中的应用，现有技术中用来催化4-氯乙酰乙酸乙酯（COBE）还原生成S-4-氯-3-羟基丁酸乙酯（(S)-CHBE）的酮还原酶/醇脱氢酶的Km值都比较高，这就意味着，这些酶只有在底物浓度较高的情况下才能达到最大反应速度，而较高的底物浓度对酶的活力会有较大的影响。本发明将通过生物信息学和基因组发掘的手段，开发转化率和e.e.值都较高，同时Km值比较低的还原酶，即短链脱氢酶CPE，该还原酶可以在底物浓度较低的情况下保持较长时间的酶活，同时又能达到最大反应速度，尤其适合工业化流加底物连续生产的模式。

本发明采用的技术方案是：

本发明利用生物信息学手段在NCBI基因数据库中进行筛选和分析，确定在近平滑假丝酵母（Candida parapsilosisCDC317）基因组中的假定蛋白基因CPAR2601530(GenBank Accession No.CCE39733.1)为脱氢／还原酶的候选研究对象，通过序列分析初步确定该基因编码的蛋白是一种短链脱氢酶（short chain dehydrogenase/reductase），命名为CPE。

因此，本发明提供一种短链脱氢酶CPE基因，所述基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，所述短链脱氢酶CPE基因的获取方法为：用酵母基因组DNA提取试剂盒从近平滑假丝酵母（Candidapara psilosisCDC317）中提取近平滑假丝酵母基因组DNA作为PCR扩增模板进行PCR扩增，PCR扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的基因，即获得短链脱氢酶CPE基因。

上游引物设计Nco Ⅰ酶切位点，下游引物设计Hind Ⅲ酶切位点，具体引物序列如下：

上游引物P1：

5’-ATATCCATGGCTCACCACCACCACCACCACATGACAGCAAAGGTTATTGTCTCTG3’。

下游引物P2：

5’GCGAAGCTTCTACAATGCACCACTT TTACTCTTT3’。

PCR扩增反应条件：94℃5min；94℃30s，58℃40s，72℃1min20s，25个循环；72℃10min；4℃恒温。

所述核苷酸序列SEQ ID No.1为：

ATGACAGCAAAGGTTATTGTCTCTGGAGGAACAGGTTTTATTGCTCAACACATTCTCAAACAGTTATTAAACCATAATTACAATGTTGTAACCACAGTTAGATCACAAGCTAAAGGTGATCATTTATTAAAATTGTTTAATTCACCATCTAGTTTGAGCTATGAAATTGTTGAAGATGTTGGTAAACCAGGTGCATTTGATCAAGTGTTGGAAAAGAATCAAGATGCCACAGTTTTCTTGCATACGGCATCGCCATTCCATTATAAAGCTACTGATGTAGCCAAGGAATTGTTGGAGCCAGCAGTTGAAGGTACCAAGAATGCATTAAAGGCAATTCAAAAATATGGGAAAAACATCAAAAATGTTGTAATTACCTCATCTTTTGCCGCTGTTGGTTCTGCTGACAAGACTACTGATCCTAAAGTTGTGTTTACTGAACAAGATTGGAATGATATTACATGGGATGAAGCTGTAAAAAATGTTGTTAATGGATATAGAGGTTCAAAGACATTTGCTGAACGTGCAGCATGGGATTTCATCAAGGAAAATGATTCTCCTTTTAAATTGACAACGGTGAATCCTGGTTTTACATTTGGACCTCAATTGTTTACTTCAGAAATAAAAGATCAATTAAACACATCATCAGAAGTGATTAATTCAATAGTAAAGTTGAAACCAAATGATCCAATCCCAACATTCAAGGGTAATTGGATTGATGTACGTGATGTGGCAAAAGCTCATGTTGTTGCATTTGAAAACCCAAAAGCAGCTGGTCAAAGATTGATTTTAGCTGCAGGTACTTTTACTGAACAATCAATTGTTGATTTGATCAATGCCAAGTTTCCCAATTTGAATCTTCCTAAAGGTGAACCAGGTGCTGATTTAAAGATTAAAAAGGAAGGATTGGCATCAGTTGACAACTCAAAGACTAAAGAAATCTTGGGGTATGAGTTTATTGATCTTGATAAATCAGTTACTGATTCTGTGCAACAAATCTTGGATGCTAAAAAGAGTAAAAGTGGTGCATTGTAG

本发明还提供一种由所述短链脱氢酶CPE基因编码的短链脱氢酶CPE。

进一步，所述短链脱氢酶CPE的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。

所述氨基酸序列SEQ ID No.2为：

MTAKVIVSGGTGFIAQHILKQLLNHNYNVVTTVRSQAKGDHLLKLFNSPSSLSYEIVEDVGKPGAFDQVLEKNQDATVFLHTASPFHYKATDVAKELLEPAVEGTKNALKAIQKYGKNIKNVVITSSFAAVGSADKTTDPKVVFTEQDWNDITWDEAVKNVVNGYRGSKTFAERAAWDFIKENDSPFKLTTVNPGFTFGPQLFTSEIKDQLNTSSEVINSIVKLKPNDPIPTFKGNWIDVRDVAKAHVVAFENPKAAGQRLILAAGTFTEQSIVDLINAKFPNLNLPKGEPGADLKIKKEGLASVDNSKTKEILGYEFIDLDKSVTDSVQQILDAKKSKSGAL

本发明提供一种含有所述短链脱氢酶CPE基因的重组载体。

进一步，所述重组载体按如下方法制备：将短链脱氢酶目的基因与pET21d载体连接，获得连接产物CPE-21d重组载体，即为含有短链脱氢酶CPE基因的重组载体。将重组载体转化E.coli DH5α感受态细胞中，然后在含100mg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃下180r/min摇床培养1h，将培养液离心，弃部分上清，取沉淀与剩余上清混匀后涂布含有100mg/ml氨苄青霉素的LB固体平板，37℃培养箱放置16h，获得单菌落。挑取平板上的单菌落加到10μL灭菌水中，将单菌落混合液加到5mL含100mg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃、180r/min摇床培养16h，取培养液用普通质粒提取试剂盒提取CPE-21d重组质粒，即获得含有短链脱氢酶CPE基因的重组质粒。

本发明还提供一种含有所述短链脱氢酶CPE基因或重组载体的重组基因工程菌。

本发明提供一种所述短链脱氢酶CPE基因在制备重组短链脱氢酶CPE中的应用。

进一步，所述的应用为：构建含有所述短链脱氢酶CPE基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离纯化获得含有重组短链脱氢酶CPE的菌体细胞。

更进一步，所述短链脱氢酶CPE基因在制备重组短链脱氢酶CPE中的应用为：将重组质粒CPE-21d转化感受态细胞E.coli BL21（DE3）菌株，挑单菌落进行PCR验证后获得所述重组基因工程菌的单菌落，将重组基因工程菌的单菌落于含100mg/ml氨苄青霉素的LB培养基上37℃培养12h至OD₆₀₀=0.6，加入IPTG终浓度为0.1mmol/L，25℃诱导表达15h，将诱导培养液分离纯化，获得含重组的短链脱氢酶的菌体细胞。

本发明提供一种由所述短链脱氢酶CPE基因编码的短链脱氢酶CPE在不对称还原羰基化合物中的应用，所述的应用为：在pH值为6.0~8.0的PBS缓冲溶液中，以前手性羰基化合物为底物，以含短链脱氢酶CPE基因的重组基因工程菌发酵培养获得的含湿菌体发酵液离心，取沉淀进行超声破碎后再离心获得的上清液为催化剂，在有机溶剂、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶和还原型辅酶NADPH的作用下，在20~40℃进行生物转化反应，反应完全后，将反应液用乙酸乙酯萃取，取有机层用无水硫酸镁干燥，过滤，滤液即为含光学活性手性醇粗品，所述粗品经纯化获得光学活性手性醇；所述前手性羰基化合物为4-氯乙酰乙酸乙酯，所述有机溶剂为二甲基亚砜；所述短链脱氢酶CPE的酶活为2.97U/mg，所述上清液的体积用量以含湿菌体发酵液中湿菌体的质量计为40mg/ml底物，所述葡萄糖的质量用量以底物的体积用量计为20mmol/ml，所述葡萄糖脱氢酶的酶活为10U/mg，葡萄糖脱氢酶的质量用量以底物的体积用量计为0.05mg/ml，所述还原型辅酶NADPH的质量用量以底物的体积用量计为50mg/ml，所述有机溶剂与底物的体积比为15:1。

更进一步，所述的应用为：将含短链脱氢酶CPE基因的基因工程菌发酵培养获得的酶作为酶源与二甲基亚砜、pH值7.0的PBS缓冲液、pH值为7.0的10mg/ml还原型辅酶NADPH的PBS缓冲液、1.5mol/L的葡萄糖水溶液和pH值为7.0的0.0075mg/ml葡萄糖脱氢酶的PBS缓冲液混合，以4-氯乙酰乙酸乙酯作为底物构成反应体系，在30℃、180rpm条件下摇床转化反应20h，反应完全后，将反应液用乙酸乙酯萃取，取有机层用无水硫酸镁干燥，过滤，滤液即为含S-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的粗品，所述粗品经纯化得到S-4-氯-3-羟基丁酸乙酯；所述酶源来自于含短链脱氢酶CPE基因的重组基因工程菌发酵培养后获得的含湿菌体发酵液离心，取沉淀进行超声破碎后再离心获得的上清液，所述上清液的体积用量以含湿菌体发酵液中湿菌体的质量计为40mg/ml底物，所述反应体系中底物的初始体积浓度为1%，所述二甲基亚砜与底物的体积比为15：1，PBS缓冲液与底物的体积比为40：1、还原型辅酶NADPH的PBS缓冲液与底物的体积比为5：1，葡萄糖水溶液与底物的体积比为10：1，葡萄糖脱氢酶的PBS缓冲液与底物的体积比为5：1。

进一步，所述酶源的获得方法为：将含短链脱氢酶CPE基因的重组基因工程菌接种至含100mg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基a中，37℃震荡培养12h后，获得培养液，将培养液以体积浓度1%的接种量接种到含100mg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基b中，37℃震荡培养至OD值为0.6，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，25℃诱导表达15h，将获得的诱导培养液离心，取沉淀置于pH=7.0的PBS缓冲液中超声破碎细胞10min后在4℃、12000rpm/min离心10min，取上清液，即为酶源。

所述含S-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的粗品分离纯化的方法采用本领域公知的方法即可，比如高压液相分离纯化。

本发明所述含100mg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基a和含100mg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基b均为含100mg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基，为便于区分不同步骤所用培养基不同而命名。

与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：本发明短链脱氢酶CPE对底物的转化率和产物的e.e.值都较高，同时Km值比较低的还原酶，可以在底物浓度较低的情况下保持较长时间的酶活，在实际工业化生产中就可以减少酶的加量，降低成本；而且在加入低浓度的底物同时就可以达到最大反应速度，这样在实际工业化生产中就可以缩短单位重量产品的生产周期，减少能耗和人工成本。

（四）附图说明

图1短链脱氢酶CPE的SDS-PAGE分析图，其中泳道M为蛋白分子量标准，泳道1为诱导前菌体破碎上清，泳道2为诱导前菌体破碎沉淀，泳道3为诱导后菌体破碎上清，泳道4为诱导后菌体破碎沉淀，泳道5为纯化后的短链脱氢酶CPE；

图2短链脱氢酶CPE的pH选择性；

图3短链脱氢酶CPE的pH稳定性；

图4温度对短链脱氢酶CPE活力和稳定性的影响，曲线a为温度对短链脱氢酶CPE活力的影响，曲线b为短链脱氢酶CPE热稳定性曲线；

图5短链脱氢酶CPE还原产物的高效液相色谱图：峰a表示溶剂，峰b表示底物COBE，峰c表示杂质1，峰d表示产物（R）-CHBE，峰e表示产物（S）-CHBE，峰f表示杂质2。

（五）具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

实施例1短链脱氢酶CPE基因、基因编码酶、载体、重组基因工程菌的制备

1、材料

（1）菌种和质粒

菌种：近平滑假丝酵母（Candida parapsilosis CDC317）购自美国典型微生物菌种保藏中心（ATCC），编号MYA-4646），质粒pET21d来源于Novagen(Madison,WI,USA)，E.coli DH5α、E.coli BL21(DE3)购于北京全式金生物技术有限公司。

（2）试剂

pMD-19T试剂盒、Taq酶、dNTP mixture（单核苷酸混合物）、IPTG、high-ligation（高效连接酶）、限制性内切酶购于TAKARA公司、4-氯乙酰乙酸乙酯(COBE)购于Alfa Aesar，酵母基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、普通质粒小提试剂盒、普通DNA产物纯化试剂盒购于TIANGEN公司，Lowry法蛋白定量分析试剂盒购于Thermo公司。

2、短链脱氢酶CPE基因的获得

（1）模板基因组DNA的提取

用酵母基因组DNA提取试剂盒从近平滑假丝酵母（Candidaparapsilosis CDC317）中提取近平滑假丝酵母基因组DNA，作为目的基因的模板。

（2）短链脱氢酶CPE基因的获得

上游引物P1：

5’-ATATCCATGGCTCACCACCACCACCACCACATGACAG

CAAAGGTTATTGTCTCTG3’。

下游引物P2：

5’GCGAAGCTTCTACAATGCA CCACTTTTACTCTTT3’。

采用PCR方法进行目的基因模板片段的扩增。

PCR反应体系为25μL，反应体系组成：

反应条件：94℃5min；94℃30s，58℃40s，72℃1min20s，25个循环；72℃10min；4℃恒温。PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目的基因。

将回收的目的基因经PCR验证和DNA序列测序证实，得到的基因片段是目的基因CPE片段，与CPAR2_601530(GenBank编号No.CCE39733.1)序列相同。在NCBI的核酸数据库中进行比对，找到了CPE序列中的属于短链脱氢酶（short-chain dehydrogenase/reductase,SDR）家族的保守序列及相似的二级结构模块（表1所示），因此可以判定CPE是短链脱氢酶家族中的一员，命名为短链脱氢酶CPE基因，核苷酸序列见SEQ ID No.1所示。

表1CPE和其他家族成员二级结构模块对比表

在模块中，‘a’代表一个芳香族残基，‘c’代表带电残基，‘h’代表疏水性残基，‘p’代表一个极性残基，‘x’代表任意残基。下划线表示的是保守氨基酸位点。中括号内的表示是可变氨基酸位点。经典短链脱氢酶和拓展短链脱氢酶二级结构模块是基于3α,20β-hydroxysteroiddehydrogenase(PDB数据库编号2hsd)和UDP-galactose 4-epimerase(PDB数据库标号1ek6)构建的。

3、CPE-T克隆质粒的构建

a、T载体的连接

短链脱氢酶CPE目的基因与pMD-19T载体（购于TAKARA公司）连接，连接反应体系如下：

pMD-19T载体 0.8μL

溶液I 5μL

DNA 5μL

将连接反应体系（DNA即为步骤2获得的SEQ ID No.1所示的短链脱氢酶CPE基因，溶液I为pMD-19T载体试剂盒（购于TAKARA公司）自带的溶液I混匀后，于16℃的低温水浴中进行连接反应16h，获得连接产物CPE-T克隆载体，即为含有短链脱氢酶CPE基因的克隆载体。

b、CPE-T克隆载体转化

连接产物CPE-T克隆载体转化E.coli DH5α感受态细胞中，转化步骤如下：

将10μL上述步骤a的连接产物加到50μL感受态细胞中，混匀后冰浴30min，然后42℃水浴中热击90s，再冰浴1min，加入1mL含100mg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃下180r/min摇床培养1h，将培养液在4000r/min离心3min，弃上清800μL，取沉淀与剩余上清混匀后涂布含100mg/ml的LB固体培养基平板，在37℃培养箱放置16h，获得单菌落。

挑取平板上的单菌落加到10μL灭菌水中，取1μL进行PCR验证，将验证后剩余的目的单菌落混合液9μL加到5mL含100mg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃、180r/min摇床培养16h，取培养液用普通质粒提取试剂盒提取CPE-T克隆质粒，即获得含有短链脱氢酶CPE基因的克隆质粒。

4、短链脱氢酶CPE的获取

（1）表达质粒的构建

利用限制性内切酶Nco Ⅰ和Hind Ⅲ对克隆质粒CPE-T和质粒pET21d分别进行酶切，酶切回收后的DNA片断通过粘性末端连接，连接产物转化E.coli DH5α感受态细胞，通过PCR阳性筛选和质粒提取试剂盒获得CPE-21d表达质粒，方法如下：

a、双酶切与连接

克隆质粒CPE-T和质粒pET21d分别进行双酶切，反应体系如下：

反应体系混匀后，37℃水浴3h，用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收克隆质粒CPE-T酶切产物，用普通DNA产物纯化试剂盒回收质粒pET21d酶切产物，将两者在16℃进行连接，连接反应体系如下：

pET21d酶切产物 5μL

CPE-T酶切产物 5μL

Ligation High 10μL

将连接反应体系混合后，在16℃反应过夜，获得连接产物CPE-21d重组载体。

b、CPE-21d重组载体的转化

连接产物CPE-21d重组载体转化到E.coli DH5α感受态细胞中，步骤同CPE-T克隆载体转化操作，获得单菌落。

挑取平板上的单菌落加到10μL灭菌水中，取1μL进行PCR验证，取验证后剩余的目的单菌落9μL加到5mL含100mg/ml氨苄青霉素的LB培养基中，37℃、180r/min摇床培养16h，最后取培养液用普通质粒小提取试剂盒提取CPE-21d重组质粒。

（2）基因的表达，即短链脱氢酶CPE的获取

将重组质粒CPE-21d转化感受态细胞E.coli BL21菌株，步骤同CPE-T克隆载体转化操作，获得单菌落。

挑取平板上的单菌落加到10μL灭菌水中，取1μL进行PCR验证，经过验证的目的单菌落剩余9μL加到7mL含100mg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃震荡培养12h后，获得培养液，取部分培养离心，分别对上清液和沉淀进行凝胶电泳分析，见图1所示，取1mL菌液（即培养液）转接到100mL含100mg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基中，37℃震荡培养3h至OD值为0.6，加入IPTG至最终浓度为1mmol/L，25℃诱导表达15h，获得的诱导培养液，取部分诱导培养液离心，分别对上清液和沉淀进行凝胶电泳分析，见图1所示。

（3）表达产物的鉴定及蛋白浓度测定

a、酶源的制备

将步骤（2）发酵培养物（即诱导培养液）在4℃，6000rpm/min离心15min，所得沉淀0.4g悬浮于10mL去离子水中，4℃，6000rpm/min离心15min，弃上清、所得沉淀悬浮于10mL PBS缓冲液（pH=7.0）中4℃、6000rpm/min离心15min，弃上清、将沉淀悬浮于10mL PBS缓冲液（pH=7.0）中超声破碎细胞10min后在4℃、12000rpm/min离心10min，收集上清（即含重组短链脱氢酶CPE的溶液）并进行凝胶电泳分析，见图1所示，沉淀用10mL PBS缓冲液（pH=7.0）悬浮，获得表达产物悬浮液；

b、表达产物的鉴定

取40μL上述步骤a制备的表达产物悬浮液，加入10μL 5×LoadingBuffer（上样缓冲液）煮沸5min，并用15%SDS-PAGE蛋白胶进行蛋白电泳，检测目的蛋白表达，结果见图1所示，从图1看出目的蛋白得到了过量表达。

c、表达产物蛋白浓度测定

用Lowry法蛋白定量分析试剂盒测定上述步骤a制备的上清液的蛋白浓度，在750nm处测定吸光度值并用标准蛋白浓度公式计算出蛋白浓度值。

d、表达产物蛋白纯化

镍柱（规格是250＊15cm）再生后，取经孔径0.45μm的滤膜过滤后的步骤a制备的上清液20mL上样，4℃电脑恒温层析柜（常规陈列柜亦可，在4℃下静置即可）中孵育4h。4h后，排出柱中的液体（上样液和上清液的混合液）20mL进行凝胶电泳分析，检测上清液中目的蛋白是否被吸附上，并用咪唑终浓度分别50、150、250和500mM的上样缓冲液逐一进行梯度洗脱镍柱，分别收集洗脱液，并分别在280nm处测吸光度值，再分别取洗脱液40μL进行15%SDS-PAGE蛋白电泳和蛋白浓度测定。根据蛋白浓度值及蛋白电泳图的结果将含目的蛋白浓度较高的洗脱液在透析膜（截留分子量1KD）中进行透析，以pH7.0的PBS缓冲液为透析液，4℃电脑恒温层析柜中透析12h，取截留液，获得纯化的表达蛋白，即短链脱氢酶CPE，纯化结果见表2所示。经IPTG诱导后，目的蛋白在大肠杆菌宿主细胞中得到了过量表达，占菌体总蛋白的35％以上（见图1所示），经过纯化的CPE蛋白纯度在90％以上。

表2重组大肠杆菌来源的CPE的纯化

a用Bradford蛋白检测方法检测蛋白浓度，以小牛血清为标准蛋白

b目的蛋白的量由蛋白电泳图中目的蛋白占总蛋白的比例计算

c菌体总蛋白是从100ml培养液中收集的E.coli BL21(DE3)细胞破碎后所得的

实施例2短链脱氢酶CPE的酶学性质测定

1、最适温度酶活测定

取1.5ml离心管，各加入100μL DMSO，5μL COBE，380μL PBS（pH=7.0），分别在20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃保温10min后，再加入10mg/ml NADPH的PBS溶液5μL(pH 7.0)和实施例1步骤（3）方法制备的上清液10μL（将湿菌体浓度为4mg/mL发酵培养液100ml离心获得），在340nm处测吸光值，制作酶活动力学曲线，结果见图4所示。

检测结果（图4中曲线a所示）表明短链脱氢酶CPE的最适温度是40℃，而在35℃以下或者40℃以上酶活下降较快。

2、最适pH酶活测定

取1.5ml离心管，各加入100μL DMSO，5μL COBE，380μL不同pH的缓冲液，pH分别为2、2.5、3、3.5、4、4.5、5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、10.5、11、11.5、12、12.5、13，再加入实施例1步骤（3）方法制备的10μL上清液（将湿菌体浓度为4mg/mL发酵培养液100ml离心获得）、10mg/ml NADPH的PBS混合液(pH 7.0)5μL，在30℃下340nm处测吸光值，制作酶活动力学曲线，结果见图3所示。检测结果表明短链脱氢酶CPE的最适pH是pH 5.5，在pH 4.5和8.0之间酶活都在60％以上。

所用缓冲液为醋酸钠(0.1M,pH 3.0to pH 6.0)，咪唑-HCl盐酸(0.1M,pH 6.0to pH 7.5),三羟乙基胺-HCl盐酸(0.1M,pH 7.5to pH 8.5),氨基乙酸-NaOH氢氧化钠(0.1M,pH 8.5to pH 11.0)和Na₂HPO₃-NaOH磷酸氢二钠-氢氧化钠(0.1M,pH 11.0to pH 13.0)。

3、pH稳定性酶活测定

取1.5ml离心管，各加入25μL PBS缓冲液，pH分别为3、4、5、6、7、8、9、10、11、12，再加入实施例1步骤（3）方法制备的25μL上清液（将湿菌体浓度为4mg/mL发酵培养液100ml离心获得），4℃保温1h后，各加入酶活反应体系如下：

混匀后，在30℃下340nm处测吸光值，制作酶活动力学曲线，结果见图2所示。在pH 4.0到9.0之间孵育60分钟之后，CPE的酶活还能保持60％以上，说明该酶在广泛的pH范围内具有比较好的稳定性，具有工业化生产的应用价值。

4、热稳定性酶活测定

取1.5ml离心管，各加入实施例1步骤（3）方法制备的上清液10μL（将湿菌体浓度为4mg/mL发酵培养液100ml离心获得），分别在0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃保温20-30min。另取1.5ml离心管，各加入100μL DMSO，5μLCOBE，380μL PBS（pH=7.0），再加入在上述各个温度下预热20-30min的上清液、10mg/mL的NADPH的PBS缓冲液(pH=7.0)5μL，在340nm处测吸光值，制作酶活动力学曲线，结果见图4所示。热稳定性检测结果表明35℃孵育30分钟后，CPE酶活还能保持90％以上；40℃孵育30分钟后，CPE酶活还能保持80％以上。热稳定性即在各个温度下孵育一段时间后CPE残留酶活百分比。

实施例3短链脱氢酶CPE还原COBE

COBE还原反应体系如下：

葡萄糖脱氢酶75U/L，按文献报道的枯草芽孢杆菌来源的重组葡萄糖脱氢酶(周丽萍,赵燕,王卉放,丁建霞,枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶的克隆和表达,江苏大学学报(医学版),2004,14(1),7-10.)

上清液是将湿菌体浓度为4mg/mL发酵培养液5ml离心获得。

将还原反应体系混匀后30℃、180rpm摇床反应过夜，反应结束后，将反应液用3mL乙酸乙酯萃取两次，取有机层层用无水Mg₂SO₄脱水，过滤，获得滤液2.5ml左右，即为含S-4-氯-3-羟基丁酸乙酯（S-CHBE）产物的混合液，滤液用高压气相色谱GC分析S-CHBE产物含量，色谱条件为：进样量:0.5μL，进样口:200℃，检测器:230℃，载气为N₂，分流比20：1，流量:1.5mL/min。柱温从90℃以6℃/min升温，至150℃保留2min，以10℃/min升温至180℃，保留5min。结果见图5所示。

取1ml滤液减压旋蒸至0.01ml后用1mL异丙醇溶解，过膜（滤膜孔径为0.2μm），取10μl滤液测定对映体过量值(e.e.)，色谱柱Chiralcel OB-H(4.6×250mm)，流动相：正己烷/异丙醇=88/12，流速0.8mL/min，柱温25℃，检测波长：210nm。结果见图5所示。

用高效气相色谱检测CHBE含量，所得数据经处理后得到CHBE的摩尔转化率为91.9％。用高效液相色谱检测产物CHBE的e.e.值，COBE,(R)-CHBE和(S)-CHBE的保留时间分别是6.2minutes,8.0minutes和8.7minutes。从图5中可以看到S型异构体的e.e.值在99％以上。

SEQUENCE LISTING

<110> 杭州师范大学

<120> 短链脱氢酶CPE基因、编码酶、载体、重组工程菌及应用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 1032

<212> DNA

<213> Candida parapsilosis

<400> 1

atgacagcaa aggttattgt ctctggagga acaggtttta ttgctcaaca cattctcaaa 60

cagttattaa accataatta caatgttgta accacagtta gatcacaagc taaaggtgat 120

catttattaa aattgtttaa ttcaccatct agtttgagct atgaaattgt tgaagatgtt 180

ggtaaaccag gtgcatttga tcaagtgttg gaaaagaatc aagatgccac agttttcttg 240

catacggcat cgccattcca ttataaagct actgatgtag ccaaggaatt gttggagcca 300

gcagttgaag gtaccaagaa tgcattaaag gcaattcaaa aatatgggaa aaacatcaaa 360

aatgttgtaa ttacctcatc ttttgccgct gttggttctg ctgacaagac tactgatcct 420

aaagttgtgt ttactgaaca agattggaat gatattacat gggatgaagc tgtaaaaaat 480

gttgttaatg gatatagagg ttcaaagaca tttgctgaac gtgcagcatg ggatttcatc 540

aaggaaaatg attctccttt taaattgaca acggtgaatc ctggttttac atttggacct 600

caattgttta cttcagaaat aaaagatcaa ttaaacacat catcagaagt gattaattca 660

atagtaaagt tgaaaccaaa tgatccaatc ccaacattca agggtaattg gattgatgta 720

cgtgatgtgg caaaagctca tgttgttgca tttgaaaacc caaaagcagc tggtcaaaga 780

ttgattttag ctgcaggtac ttttactgaa caatcaattg ttgatttgat caatgccaag 840

tttcccaatt tgaatcttcc taaaggtgaa ccaggtgctg atttaaagat taaaaaggaa 900

ggattggcat cagttgacaa ctcaaagact aaagaaatct tggggtatga gtttattgat 960

cttgataaat cagttactga ttctgtgcaa caaatcttgg atgctaaaaa gagtaaaagt 1020

ggtgcattgt ag 1032

<210> 2

<211> 343

<212> PRT

<213> Candida parapsilosis

<400> 2

Met Thr Ala Lys Val Ile Val Ser Gly Gly Thr Gly Phe Ile Ala Gln

1 5 10 15

His Ile Leu Lys Gln Leu Leu Asn His Asn Tyr Asn Val Val Thr Thr

20 25 30

Val Arg Ser Gln Ala Lys Gly Asp His Leu Leu Lys Leu Phe Asn Ser

35 40 45

Pro Ser Ser Leu Ser Tyr Glu Ile Val Glu Asp Val Gly Lys Pro Gly

50 55 60

Ala Phe Asp Gln Val Leu Glu Lys Asn Gln Asp Ala Thr Val Phe Leu

65 70 75 80

His Thr Ala Ser Pro Phe His Tyr Lys Ala Thr Asp Val Ala Lys Glu

85 90 95

Leu Leu Glu Pro Ala Val Glu Gly Thr Lys Asn Ala Leu Lys Ala Ile

100 105 110

Gln Lys Tyr Gly Lys Asn Ile Lys Asn Val Val Ile Thr Ser Ser Phe

115 120 125

Ala Ala Val Gly Ser Ala Asp Lys Thr Thr Asp Pro Lys Val Val Phe

130 135 140

Thr Glu Gln Asp Trp Asn Asp Ile Thr Trp Asp Glu Ala Val Lys Asn

145 150 155 160

Val Val Asn Gly Tyr Arg Gly Ser Lys Thr Phe Ala Glu Arg Ala Ala

165 170 175

Trp Asp Phe Ile Lys Glu Asn Asp Ser Pro Phe Lys Leu Thr Thr Val

180 185 190

Asn Pro Gly Phe Thr Phe Gly Pro Gln Leu Phe Thr Ser Glu Ile Lys

195 200 205

Asp Gln Leu Asn Thr Ser Ser Glu Val Ile Asn Ser Ile Val Lys Leu

210 215 220

Lys Pro Asn Asp Pro Ile Pro Thr Phe Lys Gly Asn Trp Ile Asp Val

225 230 235 240

Arg Asp Val Ala Lys Ala His Val Val Ala Phe Glu Asn Pro Lys Ala

245 250 255

Ala Gly Gln Arg Leu Ile Leu Ala Ala Gly Thr Phe Thr Glu Gln Ser

260 265 270

Ile Val Asp Leu Ile Asn Ala Lys Phe Pro Asn Leu Asn Leu Pro Lys

275 280 285

Gly Glu Pro Gly Ala Asp Leu Lys Ile Lys Lys Glu Gly Leu Ala Ser

290 295 300

Val Asp Asn Ser Lys Thr Lys Glu Ile Leu Gly Tyr Glu Phe Ile Asp

305 310 315 320

Leu Asp Lys Ser Val Thr Asp Ser Val Gln Gln Ile Leu Asp Ala Lys

325 330 335

Lys Ser Lys Ser Gly Ala Leu

340

Claims

1.一种短链脱氢酶CPE基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列为SEQID No.1所示。

2.一种由权利要求1所述短链脱氢酶CPE基因编码的短链脱氢酶CPE。

3.如权利要求2所述短链脱氢酶CPE的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。

4.一种含有权利要求1所述短链脱氢酶CPE基因的重组载体。

5.一种含有权利要求1或4所述短链脱氢酶CPE基因或重组载体的重组基因工程菌。

6.一种权利要求1所述短链脱氢酶CPE基因在制备重组短链脱氢酶CPE中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于所述的应用为：构建含有所述短链脱氢酶CPE基因的重组载体，将所述重组载体转化至大肠杆菌中，获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离纯化获得含有重组短链脱氢酶CPE的菌体细胞。

8.一种由权利要求1所述短链脱氢酶CPE基因编码的短链脱氢酶CPE在不对称还原羰基化合物中的应用，其特征在于所述的应用为：将含有短链脱氢酶CPE基因的基因工程菌发酵培养获得的酶作为酶源与二甲基亚砜、pH值7.0的PBS缓冲液、pH值为7.0的10mg/ml还原型辅酶NADPH的PBS缓冲液、1.5mol/L的葡萄糖水溶液和pH值为7.0的0.0075mg/ml葡萄糖脱氢酶的PBS缓冲液混合，以4-氯乙酰乙酸乙酯作为底物构成反应体系，在30℃、180rpm条件下摇床转化反应20h，反应完全后，将反应液用乙酸乙酯萃取，取有机层用无水硫酸镁干燥，过滤，滤液即为含S-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的粗品，所述粗品经纯化获得S-4-氯-3-羟基丁酸乙酯；所述酶源来自于含短链脱氢酶CPE基因的重组基因工程菌发酵培养后获得的含湿菌体发酵液离心，取沉淀进行超声破碎后再离心获得的上清液，所述上清液的体积用量以含湿菌体发酵液中湿菌体的质量计为40mg/ml底物，所述反应体系中底物的初始体积浓度为1%，所述二甲基亚砜与底物的体积比为15：1，PBS缓冲液与底物的体积比为40：1、还原型辅酶NADPH的PBS缓冲液与底物的体积比为5：1，葡萄糖水溶液与底物的体积比为10：1，葡萄糖脱氢酶的PBS缓冲液与底物的体积比为5：1。

9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述酶源的获得方法为：将含短链脱氢酶CPE基因的重组基因工程菌接种至含100mg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基a中，37℃震荡培养12h后，获得培养液，将培养液以体积浓度1%的接种量接种到含100mg/ml氨苄青霉素的LB液体培养基b中，37℃震荡培养至OD值为0.6，加入IPTG至终浓度为1mmol/L，25℃诱导表达15h，将获得的诱导培养液离心，取沉淀置于pH=7.0的PBS缓冲液中超声破碎细胞10min后在4℃、12000rpm/min离心10min，取上清液，即为酶源。