CN103122355B - 重组耐热醛酮还原酶基因、编码酶、载体、工程菌及应用 - Google Patents
重组耐热醛酮还原酶基因、编码酶、载体、工程菌及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN103122355B CN103122355B CN201210535657.9A CN201210535657A CN103122355B CN 103122355 B CN103122355 B CN 103122355B CN 201210535657 A CN201210535657 A CN 201210535657A CN 103122355 B CN103122355 B CN 103122355B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- enzyme
- recombinant heat
- recombinant
- aldehyde ketone
- ketone reductase
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 title claims abstract description 79
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 title claims abstract description 79
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 title claims abstract description 30
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 14
- 101001110310 Lentilactobacillus kefiri NADP-dependent (R)-specific alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 title abstract description 11
- 125000002485 formyl group Chemical class [H]C(*)=O 0.000 title abstract 7
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 77
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 claims abstract description 32
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 23
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 claims abstract description 14
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 11
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 10
- 108010031132 Alcohol Oxidoreductases Proteins 0.000 claims description 85
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 claims description 85
- 102000005751 Alcohol Oxidoreductases Human genes 0.000 claims description 56
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims description 33
- VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N n-Hexane Chemical compound CCCCCC VLKZOEOYAKHREP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 28
- -1 Hexose phosphate Chemical class 0.000 claims description 27
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 24
- 210000001082 somatic cell Anatomy 0.000 claims description 21
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical group CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 18
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 17
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 17
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 15
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 claims description 13
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 13
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 13
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 12
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 12
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 11
- AOWPVIWVMWUSBD-RNFRBKRXSA-N [(3r)-3-hydroxybutyl] (3r)-3-hydroxybutanoate Chemical compound C[C@@H](O)CCOC(=O)C[C@@H](C)O AOWPVIWVMWUSBD-RNFRBKRXSA-N 0.000 claims description 10
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims description 9
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims description 8
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims description 8
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 claims description 8
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 claims description 7
- 238000010926 purge Methods 0.000 claims description 7
- KZJRKRQSDZGHEC-UHFFFAOYSA-N 2,2,2-trifluoro-1-phenylethanone Chemical compound FC(F)(F)C(=O)C1=CC=CC=C1 KZJRKRQSDZGHEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229940087189 2,2,2-trifluoroacetophenone Drugs 0.000 claims description 6
- XXRCUYVCPSWGCC-UHFFFAOYSA-N Ethyl pyruvate Chemical compound CCOC(=O)C(C)=O XXRCUYVCPSWGCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- NBBJYMSMWIIQGU-UHFFFAOYSA-N Propionic aldehyde Chemical compound CCC=O NBBJYMSMWIIQGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 claims description 6
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 claims description 6
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims description 6
- WRQNANDWMGAFTP-UHFFFAOYSA-N Methylacetoacetic acid Chemical compound COC(=O)CC(C)=O WRQNANDWMGAFTP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 5
- 150000001728 carbonyl compounds Chemical class 0.000 claims description 5
- QKLCQKPAECHXCQ-UHFFFAOYSA-N ethyl phenylglyoxylate Chemical compound CCOC(=O)C(=O)C1=CC=CC=C1 QKLCQKPAECHXCQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 claims description 5
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 claims description 5
- WMPDAIZRQDCGFH-UHFFFAOYSA-N 3-methoxybenzaldehyde Chemical compound COC1=CC=CC(C=O)=C1 WMPDAIZRQDCGFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- YGHRJJRRZDOVPD-UHFFFAOYSA-N 3-methylbutanal Chemical compound CC(C)CC=O YGHRJJRRZDOVPD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- AMIMRNSIRUDHCM-UHFFFAOYSA-N Isopropylaldehyde Chemical compound CC(C)C=O AMIMRNSIRUDHCM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 230000009514 concussion Effects 0.000 claims description 4
- BGTOWKSIORTVQH-UHFFFAOYSA-N cyclopentanone Chemical compound O=C1CCCC1 BGTOWKSIORTVQH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 claims description 4
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 claims description 4
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 claims description 4
- 238000000638 solvent extraction Methods 0.000 claims description 4
- VZGOSDDTMGRQAY-UHFFFAOYSA-N 1,2,3,4,5-pentafluorobenzene pentan-3-one Chemical compound C(C)C(=O)CC.FC=1C(=C(C(=C(C1)F)F)F)F VZGOSDDTMGRQAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Chemical group CC(C)CC(C)=O NTIZESTWPVYFNL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- UIHCLUNTQKBZGK-UHFFFAOYSA-N Methyl isobutyl ketone Natural products CCC(C)C(C)=O UIHCLUNTQKBZGK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- KQWWVLVLVYYYDT-UHFFFAOYSA-N ethyl 3-oxohexanoate Chemical compound CCCC(=O)CC(=O)OCC KQWWVLVLVYYYDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 claims description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 12
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 abstract description 4
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 abstract description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 abstract description 2
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 abstract 1
- 239000000543 intermediate Substances 0.000 abstract 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 29
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 17
- 238000000034 method Methods 0.000 description 17
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 13
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 10
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 9
- 239000000047 product Substances 0.000 description 9
- 238000006722 reduction reaction Methods 0.000 description 9
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 8
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 8
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 7
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 7
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 7
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 6
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 6
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 6
- LEAHFJQFYSDGGP-UHFFFAOYSA-K trisodium;dihydrogen phosphate;hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].OP(O)([O-])=O.OP([O-])([O-])=O LEAHFJQFYSDGGP-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 6
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- ZTVIKZXZYLEVOL-DGKWVBSXSA-N 2-hydroxy-2-phenylacetic acid [(1R,5S)-8-methyl-8-azabicyclo[3.2.1]octan-3-yl] ester Chemical group C([C@H]1CC[C@@H](C2)N1C)C2OC(=O)C(O)C1=CC=CC=C1 ZTVIKZXZYLEVOL-DGKWVBSXSA-N 0.000 description 5
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 5
- 238000013016 damping Methods 0.000 description 5
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 5
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 5
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 5
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 5
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 5
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M sodium hydroxide Inorganic materials [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 5
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 239000002585 base Substances 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 238000011160 research Methods 0.000 description 4
- 108010084932 tryptophyl-proline Proteins 0.000 description 4
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M Potassium hydroxide Chemical compound [OH-].[K+] KWYUFKZDYYNOTN-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 3
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 3
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 3
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 229910021642 ultra pure water Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000012498 ultrapure water Substances 0.000 description 3
- ROLXPVQSRCPVGK-XDTLVQLUSA-N Ala-Glu-Tyr Chemical compound N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O ROLXPVQSRCPVGK-XDTLVQLUSA-N 0.000 description 2
- OKIKVSXTXVVFDV-MMWGEVLESA-N Ala-Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](C)N OKIKVSXTXVVFDV-MMWGEVLESA-N 0.000 description 2
- AJBVYEYZVYPFCF-CIUDSAMLSA-N Ala-Lys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O AJBVYEYZVYPFCF-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- LSMDIAAALJJLRO-XQXXSGGOSA-N Ala-Thr-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O LSMDIAAALJJLRO-XQXXSGGOSA-N 0.000 description 2
- YXXPVUOMPSZURS-ZLIFDBKOSA-N Ala-Trp-Leu Chemical compound C1=CC=C2C(C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)NC(=O)[C@H](C)N)=CNC2=C1 YXXPVUOMPSZURS-ZLIFDBKOSA-N 0.000 description 2
- BIOCIVSVEDFKDJ-GUBZILKMSA-N Arg-Arg-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O BIOCIVSVEDFKDJ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- MFAMTAVAFBPXDC-LPEHRKFASA-N Arg-Asp-Pro Chemical compound C1C[C@@H](N(C1)C(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCN=C(N)N)N)C(=O)O MFAMTAVAFBPXDC-LPEHRKFASA-N 0.000 description 2
- KMFPQTITXUKJOV-DCAQKATOSA-N Arg-Ser-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O KMFPQTITXUKJOV-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- RYQSYXFGFOTJDJ-RHYQMDGZSA-N Arg-Thr-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O RYQSYXFGFOTJDJ-RHYQMDGZSA-N 0.000 description 2
- ULBHWNVWSCJLCO-NHCYSSNCSA-N Arg-Val-Glu Chemical compound OC(=O)CC[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCCN=C(N)N ULBHWNVWSCJLCO-NHCYSSNCSA-N 0.000 description 2
- XVBDDUPJVQXDSI-PEFMBERDSA-N Asn-Ile-Glu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCC(=O)O)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)N XVBDDUPJVQXDSI-PEFMBERDSA-N 0.000 description 2
- LSJQOMAZIKQMTJ-SRVKXCTJSA-N Asn-Phe-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O LSJQOMAZIKQMTJ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- UJGRZQYSNYTCAX-SRVKXCTJSA-N Asp-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CC(O)=O UJGRZQYSNYTCAX-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- BYLPQJAWXJWUCJ-YDHLFZDLSA-N Asp-Tyr-Val Chemical compound [H]N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(O)=O BYLPQJAWXJWUCJ-YDHLFZDLSA-N 0.000 description 2
- FEJCUYOGOBCFOQ-ACZMJKKPSA-N Cys-Asp-Gln Chemical compound C(CC(=O)N)[C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)O)NC(=O)[C@H](CS)N FEJCUYOGOBCFOQ-ACZMJKKPSA-N 0.000 description 2
- FGYPOQPQTUNESW-IUCAKERBSA-N Gln-Gly-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N FGYPOQPQTUNESW-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- JNENSVNAUWONEZ-GUBZILKMSA-N Gln-Lys-Asn Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(O)=O JNENSVNAUWONEZ-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- RLZBLVSJDFHDBL-KBIXCLLPSA-N Glu-Ala-Ile Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(O)=O RLZBLVSJDFHDBL-KBIXCLLPSA-N 0.000 description 2
- DIXKFOPPGWKZLY-CIUDSAMLSA-N Glu-Arg-Asp Chemical compound [H]N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(O)=O DIXKFOPPGWKZLY-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- ZOXBSICWUDAOHX-GUBZILKMSA-N Glu-Asn-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O ZOXBSICWUDAOHX-GUBZILKMSA-N 0.000 description 2
- VAZZOGXDUQSVQF-NUMRIWBASA-N Glu-Asn-Thr Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(=O)N)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N)O VAZZOGXDUQSVQF-NUMRIWBASA-N 0.000 description 2
- AUTNXSQEVVHSJK-YVNDNENWSA-N Glu-Glu-Ile Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](N)CCC(O)=O AUTNXSQEVVHSJK-YVNDNENWSA-N 0.000 description 2
- GXMXPCXXKVWOSM-KQXIARHKSA-N Glu-Ile-Pro Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N1CCC[C@@H]1C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N GXMXPCXXKVWOSM-KQXIARHKSA-N 0.000 description 2
- SOEPMWQCTJITPZ-SRVKXCTJSA-N Glu-Met-Lys Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N SOEPMWQCTJITPZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- WVWZIPOJECFDAG-AVGNSLFASA-N Glu-Phe-Cys Chemical compound C1=CC=C(C=C1)C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)O)N WVWZIPOJECFDAG-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- DTPOVRRYXPJJAZ-FJXKBIBVSA-N Gly-Arg-Thr Chemical compound C[C@@H](O)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CN)CCCN=C(N)N DTPOVRRYXPJJAZ-FJXKBIBVSA-N 0.000 description 2
- SOEATRRYCIPEHA-BQBZGAKWSA-N Gly-Glu-Glu Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O SOEATRRYCIPEHA-BQBZGAKWSA-N 0.000 description 2
- QSVMIMFAAZPCAQ-PMVVWTBXSA-N Gly-His-Thr Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O QSVMIMFAAZPCAQ-PMVVWTBXSA-N 0.000 description 2
- CCBIBMKQNXHNIN-ZETCQYMHSA-N Gly-Leu-Gly Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(O)=O CCBIBMKQNXHNIN-ZETCQYMHSA-N 0.000 description 2
- UHPAZODVFFYEEL-QWRGUYRKSA-N Gly-Leu-Leu Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CN UHPAZODVFFYEEL-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 2
- GJHWILMUOANXTG-WPRPVWTQSA-N Gly-Val-Arg Chemical compound [H]NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O GJHWILMUOANXTG-WPRPVWTQSA-N 0.000 description 2
- SBVMXEZQJVUARN-XPUUQOCRSA-N Gly-Val-Ser Chemical compound NCC(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O SBVMXEZQJVUARN-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 2
- JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N H-Gly-Phe-OH Natural products NCC(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=CC=C1 JBCLFWXMTIKCCB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YADRBUZBKHHDAO-XPUUQOCRSA-N His-Gly-Ala Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O YADRBUZBKHHDAO-XPUUQOCRSA-N 0.000 description 2
- SKYULSWNBYAQMG-IHRRRGAJSA-N His-Leu-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CNC=N1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O SKYULSWNBYAQMG-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- CWJQMCPYXNVMBS-STECZYCISA-N Ile-Arg-Tyr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCN=C(N)N)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)O)N CWJQMCPYXNVMBS-STECZYCISA-N 0.000 description 2
- GYAFMRQGWHXMII-IUKAMOBKSA-N Ile-Asp-Thr Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)O)N GYAFMRQGWHXMII-IUKAMOBKSA-N 0.000 description 2
- CDGLBYSAZFIIJO-RCOVLWMOSA-N Ile-Gly-Gly Chemical compound CC[C@H](C)[C@H]([NH3+])C(=O)NCC(=O)NCC([O-])=O CDGLBYSAZFIIJO-RCOVLWMOSA-N 0.000 description 2
- GTSAALPQZASLPW-KJYZGMDISA-N Ile-His-Trp Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)N[C@@H](CC2=CNC3=CC=CC=C32)C(=O)O)N GTSAALPQZASLPW-KJYZGMDISA-N 0.000 description 2
- YSGBJIQXTIVBHZ-AJNGGQMLSA-N Ile-Lys-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O YSGBJIQXTIVBHZ-AJNGGQMLSA-N 0.000 description 2
- WSSGUVAKYCQSCT-XUXIUFHCSA-N Ile-Met-Leu Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)O)N WSSGUVAKYCQSCT-XUXIUFHCSA-N 0.000 description 2
- IITVUURPOYGCTD-NAKRPEOUSA-N Ile-Pro-Ala Chemical compound CC[C@H](C)[C@H](N)C(=O)N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O IITVUURPOYGCTD-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 2
- GNXGAVNTVNOCLL-SIUGBPQLSA-N Ile-Tyr-Gln Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(C=C1)O)C(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)N GNXGAVNTVNOCLL-SIUGBPQLSA-N 0.000 description 2
- JZBVBOKASHNXAD-NAKRPEOUSA-N Ile-Val-Ser Chemical compound CC[C@H](C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)O)N JZBVBOKASHNXAD-NAKRPEOUSA-N 0.000 description 2
- 108010065920 Insulin Lispro Proteins 0.000 description 2
- PMGDADKJMCOXHX-UHFFFAOYSA-N L-Arginyl-L-glutamin-acetat Natural products NC(=N)NCCCC(N)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(O)=O PMGDADKJMCOXHX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- KWTVLKBOQATPHJ-SRVKXCTJSA-N Leu-Ala-Lys Chemical compound C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)N KWTVLKBOQATPHJ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 2
- PVMPDMIKUVNOBD-CIUDSAMLSA-N Leu-Asp-Ser Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O PVMPDMIKUVNOBD-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- CLVUXCBGKUECIT-HJGDQZAQSA-N Leu-Asp-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O CLVUXCBGKUECIT-HJGDQZAQSA-N 0.000 description 2
- WIDZHJTYKYBLSR-DCAQKATOSA-N Leu-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O WIDZHJTYKYBLSR-DCAQKATOSA-N 0.000 description 2
- FIYMBBHGYNQFOP-IUCAKERBSA-N Leu-Gly-Gln Chemical compound CC(C)C[C@@H](C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCC(=O)N)C(=O)O)N FIYMBBHGYNQFOP-IUCAKERBSA-N 0.000 description 2
- QNBVTHNJGCOVFA-AVGNSLFASA-N Leu-Leu-Glu Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O QNBVTHNJGCOVFA-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- JLWZLIQRYCTYBD-IHRRRGAJSA-N Leu-Lys-Arg Chemical compound [H]N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O JLWZLIQRYCTYBD-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- IRMLZWSRWSGTOP-CIUDSAMLSA-N Leu-Ser-Ala Chemical compound CC(C)C[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](C)C(O)=O IRMLZWSRWSGTOP-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- JGKHAFUAPZCCDU-BZSNNMDCSA-N Leu-Tyr-Leu Chemical compound CC(C)C[C@H]([NH3+])C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C([O-])=O)CC1=CC=C(O)C=C1 JGKHAFUAPZCCDU-BZSNNMDCSA-N 0.000 description 2
- XFIHDSBIPWEYJJ-YUMQZZPRSA-N Lys-Ala-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](N)CCCCN XFIHDSBIPWEYJJ-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 2
- DCRWPTBMWMGADO-AVGNSLFASA-N Lys-Glu-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O DCRWPTBMWMGADO-AVGNSLFASA-N 0.000 description 2
- YKBSXQFZWFXFIB-VOAKCMCISA-N Lys-Thr-Lys Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H]([C@H](O)C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(O)=O YKBSXQFZWFXFIB-VOAKCMCISA-N 0.000 description 2
- XBAJINCXDBTJRH-WDSOQIARSA-N Lys-Val-Trp Chemical compound CC(C)[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CCCCN)N XBAJINCXDBTJRH-WDSOQIARSA-N 0.000 description 2
- ONGCSGVHCSAATF-CIUDSAMLSA-N Met-Ala-Glu Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(O)=O ONGCSGVHCSAATF-CIUDSAMLSA-N 0.000 description 2
- YLBUMXYVQCHBPR-ULQDDVLXSA-N Met-Leu-Tyr Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 YLBUMXYVQCHBPR-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 2
- 101710157860 Oxydoreductase Proteins 0.000 description 2
- BFYHIHGIHGROAT-HTUGSXCWSA-N Phe-Glu-Thr Chemical compound [H]N[C@@H](CC1=CC=CC=C1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O BFYHIHGIHGROAT-HTUGSXCWSA-N 0.000 description 2
- TXPUNZXZDVJUJQ-LPEHRKFASA-N Pro-Asn-Pro Chemical compound C1C[C@H](NC1)C(=O)N[C@@H](CC(=O)N)C(=O)N2CCC[C@@H]2C(=O)O TXPUNZXZDVJUJQ-LPEHRKFASA-N 0.000 description 2
- AHXPYZRZRMQOAU-QXEWZRGKSA-N Pro-Asn-Val Chemical compound CC(C)[C@H](NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@@H]1CCCN1)C(O)=O AHXPYZRZRMQOAU-QXEWZRGKSA-N 0.000 description 2
- DEDANIDYQAPTFI-IHRRRGAJSA-N Pro-Asp-Tyr Chemical compound [H]N1CCC[C@H]1C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC1=CC=C(O)C=C1)C(O)=O DEDANIDYQAPTFI-IHRRRGAJSA-N 0.000 description 2
- AUQGUYPHJSMAKI-CYDGBPFRSA-N Pro-Ile-Val Chemical compound CC(C)[C@@H](C(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)CC)NC(=O)[C@@H]1CCCN1 AUQGUYPHJSMAKI-CYDGBPFRSA-N 0.000 description 2
- GBUNEGKQPSAMNK-QTKMDUPCSA-N Pro-Thr-His Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@@H]2CCCN2)O GBUNEGKQPSAMNK-QTKMDUPCSA-N 0.000 description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 2
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 2
- ZOHGLPQGEHSLPD-FXQIFTODSA-N Ser-Gln-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O ZOHGLPQGEHSLPD-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- UOLGINIHBRIECN-FXQIFTODSA-N Ser-Glu-Glu Chemical compound [H]N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O UOLGINIHBRIECN-FXQIFTODSA-N 0.000 description 2
- 102000009105 Short Chain Dehydrogenase-Reductases Human genes 0.000 description 2
- 108010048287 Short Chain Dehydrogenase-Reductases Proteins 0.000 description 2
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- XEVHXNLPUBVQEX-DVJZZOLTSA-N Thr-Trp-Gly Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CNC2=CC=CC=C21)C(=O)NCC(=O)O)N)O XEVHXNLPUBVQEX-DVJZZOLTSA-N 0.000 description 2
- HIINQLBHPIQYHN-JTQLQIEISA-N Tyr-Gly-Gly Chemical compound OC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 HIINQLBHPIQYHN-JTQLQIEISA-N 0.000 description 2
- VSYROIRKNBCULO-BWAGICSOSA-N Tyr-Thr-His Chemical compound C[C@H]([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC1=CN=CN1)C(=O)O)NC(=O)[C@H](CC2=CC=C(C=C2)O)N)O VSYROIRKNBCULO-BWAGICSOSA-N 0.000 description 2
- UOUIMEGEPSBZIV-ULQDDVLXSA-N Val-Lys-Tyr Chemical compound CC(C)[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@H](C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 UOUIMEGEPSBZIV-ULQDDVLXSA-N 0.000 description 2
- KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N alpha-L-glutamyl-L-glutamic acid Natural products OC(=O)CCC(N)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O KOSRFJWDECSPRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010013835 arginine glutamate Proteins 0.000 description 2
- 108010008355 arginyl-glutamine Proteins 0.000 description 2
- 108010040443 aspartyl-aspartic acid Proteins 0.000 description 2
- 108010047857 aspartylglycine Proteins 0.000 description 2
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 2
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 238000009792 diffusion process Methods 0.000 description 2
- RXKJFZQQPQGTFL-UHFFFAOYSA-N dihydroxyacetone Chemical compound OCC(=O)CO RXKJFZQQPQGTFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 125000004494 ethyl ester group Chemical group 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 2
- 108010063718 gamma-glutamylaspartic acid Proteins 0.000 description 2
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 2
- 108010055341 glutamyl-glutamic acid Proteins 0.000 description 2
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 2
- 108010067216 glycyl-glycyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N glycyl-glycyl-glycine Natural products NCC(=O)NCC(=O)NCC(O)=O XKUKSGPZAADMRA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010089804 glycyl-threonine Proteins 0.000 description 2
- 108010050848 glycylleucine Proteins 0.000 description 2
- 108010081551 glycylphenylalanine Proteins 0.000 description 2
- 108010025306 histidylleucine Proteins 0.000 description 2
- 108010034529 leucyl-lysine Proteins 0.000 description 2
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 2
- 239000000463 material Substances 0.000 description 2
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 2
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- 108010090894 prolylleucine Proteins 0.000 description 2
- 238000012797 qualification Methods 0.000 description 2
- 108010033670 threonyl-aspartyl-tyrosine Proteins 0.000 description 2
- 108010061238 threonyl-glycine Proteins 0.000 description 2
- 108010051110 tyrosyl-lysine Proteins 0.000 description 2
- 108010003137 tyrosyltyrosine Proteins 0.000 description 2
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 2
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 108010020056 Hydrogenase Proteins 0.000 description 1
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 1
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 1
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 1
- 229920000297 Rayon Polymers 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M Sodium bicarbonate-14C Chemical compound [Na+].O[14C]([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-DEQYMQKBSA-M 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N [Na].[Cl] Chemical compound [Na].[Cl] DPDMMXDBJGCCQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000003905 agrochemical Substances 0.000 description 1
- 239000003513 alkali Substances 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 1
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 1
- 125000002915 carbonyl group Chemical group [*:2]C([*:1])=O 0.000 description 1
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000004927 clay Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M coomassie brilliant blue Chemical compound [Na+].C1=CC(OCC)=CC=C1NC1=CC=C(C(=C2C=CC(C=C2)=[N+](CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=2C=CC(=CC=2)N(CC)CC=2C=C(C=CC=2)S([O-])(=O)=O)C=C1 NKLPQNGYXWVELD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 150000003997 cyclic ketones Chemical class 0.000 description 1
- 238000004042 decolorization Methods 0.000 description 1
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 1
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 description 1
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 1
- LZCLXQDLBQLTDK-SCSAIBSYSA-N ethyl (2R)-lactate Chemical compound CCOC(=O)[C@@H](C)O LZCLXQDLBQLTDK-SCSAIBSYSA-N 0.000 description 1
- 239000002024 ethyl acetate extract Substances 0.000 description 1
- SAXHIDRUJXPDOD-UHFFFAOYSA-N ethyl hydroxy(phenyl)acetate Chemical compound CCOC(=O)C(O)C1=CC=CC=C1 SAXHIDRUJXPDOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940116333 ethyl lactate Drugs 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 125000000468 ketone group Chemical group 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000011259 mixed solution Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000002547 new drug Substances 0.000 description 1
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L potassium carbonate Substances [K+].[K+].[O-]C([O-])=O BWHMMNNQKKPAPP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 235000015320 potassium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940093916 potassium phosphate Drugs 0.000 description 1
- 239000012474 protein marker Substances 0.000 description 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 1
- 238000000197 pyrolysis Methods 0.000 description 1
- 239000010453 quartz Substances 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 1
- 238000006479 redox reaction Methods 0.000 description 1
- 230000008929 regeneration Effects 0.000 description 1
- 238000011069 regeneration method Methods 0.000 description 1
- 230000000284 resting effect Effects 0.000 description 1
- 238000010079 rubber tapping Methods 0.000 description 1
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 1
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N silicon dioxide Inorganic materials O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000017550 sodium carbonate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- 238000007669 thermal treatment Methods 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000010626 work up procedure Methods 0.000 description 1
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
- Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
- Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
- Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种重组耐热醛酮还原酶基因、基因编码酶、重组载体、工程菌及基因编码酶在制备光学手性醇中的应用，所述重组耐热醛酮还原酶基因具有与SEQ ID No.1所示核苷酸序列90%以上同源性；本发明所涉及的重组耐热醛酮还原酶具有高活性、热稳定性好，60℃处理 15小时后仍较为稳定，残余相对酶活高达99%；本发明的重组耐热醛酮还原酶高效高选择性地制备手性醇类化合物；由于本发明的重组耐热醛酮还原酶具有较高的热稳定性，可以回收利用，并且反应体系中只需要额外添加少量的辅酶，极大地降低了生产的成本，且反应条件温和，对环境友好，操作简便，在合成药物手性中间体方面具有很好的工业应用前景。
Description
（一）技术领域
本发明涉及一种重组耐热醛酮还原酶基因、基因编码酶、重组载体、工程菌及基因编码酶在制备光学手性醇中的应用。
（二）背景技术
单一构型手性药物及其中间体的合成与药理学研究是现代有机合成工业和医药工业中的一个热点研究领域。手性药物己成为国际新药研究与开发的新方向之一。手性醇是各种药物合成过程中的重要中间体，其合成成为热门的研究课题。
酮还原酶是普遍存在于自然界中的一类氧化还原酶，能使含羰基物质（如酮酯、酮酸等）不对称还原生成手性醇，广泛应用于医药、化学、农药等领域。选用酮还原酶催化生成手性醇，具有比化学法更高的化学、立体和区域选择性，反应条件更温和、更绿色环保。
嗜热菌来源的酶对高温、高压、高盐度等具有耐受性，同时还能经受常见的变性剂和有机试剂的作用而不至失活。所以嗜热菌来源的酮还原酶引起了越来越广泛的关注。这类酮还原酶易纯化、易于工业操作，可能对某些条件复杂或高应用价值的反应具有催化作用，工业前途广阔。
（三）发明内容
本发明目的是提供一种重组耐热醛酮还原酶基因、基因编码酶、重组载体、工程菌及基因编码酶在制备光学手性醇中的应用。
本发明采用的技术方案是：
本发明涉及一种重组耐热醛酮还原酶基因，所述重组耐热醛酮还原酶基因具有与SEQ ID No.1所示核苷酸序列90%以上同源性，优选所述基因 核苷酸序列为SEQ ID No.1所示，所述重组耐热醛酮还原酶基因还包括SEQ ID No.1所示核苷酸序列经过一个或几个核苷酸序列取代、缺失或添加获得的核苷酸序列。
进一步，SEQ ID No.1所示核苷酸序列全长为927bp，其编码序列从第一个碱基起至第924碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA，该序列无内含子。
所述SEQ ID No.1所示核苷酸序列为：
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60
atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtcgcggat ccatgctgta taaagaactg 120
ggtcgtaccg gcgaagaaat tccggcactg ggtctgggta cctggggtat cggcggtttt 180
gaaacgccgg attatagccg cgatgaagaa atggtggaac tgctgaaaac cgcaattaaa 240
atgggttaca cccatatcga tacggcggaa tattacggcg gtggccacac ggaagaactg 300
attggcaaag ccatcaaaga ttttcgtcgc gaagatctgt tcattgtgag caaagtttgg 360
ccgacccatc tgcgtcgcga tgatctgctg cgttctctgg aaaacaccct gaaacgcctg 420
gatacggatt atgttgatct gtacctgatt cactggccga atccggaaat cccgctggaa 480
gaaaccctga gtgcgatggc cgaaggtgtg cgtcagggcc tgattcgcta tatcggcgtt 540
agcaactttg atcgtcgcct gctggaagaa gccattagca aatctcagga accgatcgtg 600
tgcgatcagg ttaaatataa cattgaagat cgtgatccgg aacgcgatgg tctgctggaa 660
ttctgtcaga aaaatggcgt gaccctggtt gcatacagtc cgctgcgtcg cacgctgctg 720
agcgaaaaaa ccaaacgtac gctggaagaa atcgcgaaaa atcatggtgc caccatttac 780
cagatcatgc tggcatggct gctggcgaaa ccgaacgtgg ttgccattcc gaaagcaggc 840
cgtgtggaac acctgcgcga aaatctgaaa gcgacggaaa tcaaactgtc tgaagaagaa 900
atgaaactgctggatagtctgggctaa 927
本发明提供一种由所述重组耐热醛酮还原酶基因编码的重组耐热醛酮还原酶。
进一步，所述重组耐热醛酮还原酶具有与SEQ ID No.2所示的氨基酸序列90%以上的同源性，优选所述重组耐热醛酮还原酶的氨基酸序列为 SEQ ID No.2所示。
由于密码子的兼并性，编码SEQ ID No.2的氨基酸序列的碱基序列不仅仅局限于SEQ ID No.1，如：不同于SEQ ID No.1，但编码的氨基酸序列与SEQ ID No.1所编码的氨基酸序列相同的核苷酸序列；或者是在保持由该重组耐热醛酮还原酶催化活性的前提下，由插入、缺失或替换如序列表中 SEQ.ID NO：2所示的氨基酸序列中至少一个氨基酸而得到的变异的氨基酸序列。
所述氨基酸序列SEQ.ID NO ：2为：
Met Leu Tyr Lys Glu Leu Gly Arg Thr Gly Glu Glu Ile Pro Ala Leu
1 5 10 15
Gly Leu Gly Thr Trp Gly Ile Gly Gly Phe Glu Thr Pro Asp Tyr Ser
20 25 30
Arg Asp Glu Glu Met Val Glu Leu Leu Lys Thr Ala Ile Lys Met Gly
35 40 45
Tyr Thr His Ile Asp Thr Ala Glu Tyr Tyr Gly Gly Gly His Thr Glu
50 55 60
Glu Leu Ile Gly Lys Ala Ile Lys Asp Phe Arg Arg Glu Asp Leu Phe
65 70 75 80
Ile Val Ser Lys Val Trp Pro Thr His Leu Arg Arg Asp Asp Leu Leu
85 90 95
Arg Ser Leu Glu Asn Thr Leu Lys Arg Leu Asp Thr Asp Tyr Val Asp
100 105 110
Leu Tyr Leu Ile His Trp Pro Asn Pro Glu Ile Pro Leu Glu Glu Thr
115 120 125
Leu Ser Ala Met Ala Glu Gly Val Arg Gln Gly Leu Ile Arg Tyr Ile
130 135 140
Gly Val Ser Asn Phe Asp Arg Arg Leu Leu Glu Glu Ala Ile Ser Lys
145 150 155 160
Ser Gln Glu Pro Ile Val Cys Asp Gln Val Lys Tyr Asn Ile Glu Asp
165 170 175
Arg Asp Pro Glu Arg Asp Gly Leu Leu Glu Phe Cys Gln Lys Asn Gly
180 185 190
Val Thr Leu Val Ala Tyr Ser Pro Leu Arg Arg Thr Leu Leu Ser Glu
195 200 205
Lys Thr Lys Arg Thr Leu Glu Glu Ile Ala Lys Asn His Gly Ala Thr
210 215 220
Ile Tyr Gln Ile Met Leu Ala Trp Leu Leu Ala Lys Pro Asn Val Val
225 230 235 240
Ala Ile Pro Lys Ala Gly Arg Val Glu His Leu Arg Glu Asn Leu Lys
245 250 255
Ala Thr Glu Ile Lys Leu Ser Glu Glu Glu Met Lys Leu Leu Asp Ser
260 265 270
Leu Gly Gln
275
本发明提供一种含有所述重组耐热醛酮还原酶基因的重组载体。
所述重组载体可通过本领域常规方法将本发明的重组耐热醛酮还原酶基因的核苷酸序列连接于各种载体上构建而成。所述的载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选质粒为 pET28a。较佳的，可通过下述方法制得本发明的重组表达载体：将重组耐热醛酮还原酶基因产物和表达载体pET28a均分别用限制性内切酶BamHⅠ和NotⅠ双酶切双酶切，形成互补的粘性末端，经T4 DNA连接酶连接，形成含有本发明的重组耐热醛酮还原酶基因的重组表达质粒 pET28a- tadh2。
本发明还提供一种含有所述重组耐热醛酮还原酶基因或所述重组载体的重组基因工程菌。
进一步，所述重组基因工程菌可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主微生物中制得。所述的宿主微生物可为本领域常规的各种宿主微生物，只要能满足重组质粒可稳定地自行复制，且所携带的本发明的重组耐热醛酮还原酶基因可被有效表达即可。较佳的，宿主菌是大肠杆菌，更佳的为重组大肠埃希氏菌(E.coli)BL21(DE3)。本发明的重组表达转化体（即重组基因工程菌）可以按照本领域的常规方法制备而得，一般将前述重组载体 pET28a- tadh2转化至 E.coli BL21(DE3)中，即可得本发明优选的重组基因工程菌株，即 E.coli BL21(DE3)/ pET28a- tadh2。
本发明所述重组耐热醛酮还原酶基因在制备重组耐热醛酮还原酶中的应用为：构建含重组耐热醛酮还原酶基因的重组载体，将所述重组载体转化至所述宿主体内，将获得的重组基因工程菌进行诱导培养，培养液分离纯化得到含重组耐热醛酮还原酶的菌体细胞。
此外，本发明还提供一种由所述重组耐热醛酮还原酶基因编码的重组耐热醛酮还原酶在制备光学活性手性醇中的应用：所述应用是在pH值为6.0~9.0的缓冲溶液中，以前手性羰基化合物为底物，以重组耐热醛酮还原酶为酶源，加入葡萄糖、葡萄糖脱氢酶和辅酶NADP+或辅酶NAD +构成反应体系进行生物转化反应，反应完全后，将反应液后处理获得所述光学活性手性醇；所述前手性羰基化合物为酮酯、芳香酮酯、酮酸或脂肪醛酮。
进一步，所述反应液后处理方法为：反应完全后，将反应液用有机溶剂萃取，取上层有机相，用氮气吹扫除去溶剂，获得所述光学活性手性醇。
进一步，所述重组耐热醛酮还原酶是以含重组耐热醛酮还原酶的重组基因工程菌发酵培养获得的菌体细胞或菌体细胞破碎后的上清液冻干后的酶粉作为酶源，以含重组耐热醛酮还原酶的重组基因工程菌发酵培养获得的菌体细胞为催化剂时，所述催化剂的质量用量以菌体细胞的干重计为 1~10 g/L（即酶源的用量为1～ 50U/L反应体系），优选5 g/L。
进一步，本发明所述重组耐热醛酮还原酶基因编码的重组耐热醛酮还原酶在制备光学活性手性醇中的应用优选按如下方法进行：在pH值为6.0~9.0的缓冲溶液中，以前手性羰基化合物为底物，以含重组耐热醛酮还原酶的重组基因工程菌发酵培养获得的菌体细胞或菌体细胞经细胞破碎后的上清液冻干后的酶粉作为酶源，加入葡萄糖、葡萄糖脱氢酶和辅酶NADP+或辅酶NAD+构成反应体系，在20~ 50℃进行生物转化反应，反应完全后，将反应液用有机溶剂萃取，取上层有机相，用氮气吹扫除去溶剂，获得所述光学活性手性醇；所述底物为酮酯、芳香醛酮或脂肪醛酮，优选酮酯或脂肪醛酮，最优选为酮酯。
所述的不对称还原反应的各条件可按本领域此类反应的常规条件进行选择，所述底物优选如下：酮酯、脂肪族酮及其他含酮基化合物或醛类化合物，更优选为苯甲酰甲酸乙酯、2-氧代-4-苯基丁酸乙酯4-氯乙酰乙酸乙酯、乙酰乙酸乙酯或2,2,2-三氟苯乙酮等。
更进一步，所述的应用推荐按如下步骤进行：将含重组耐热醛酮还原酶的重组基因工程菌发酵培养获得的菌体细胞或菌体细胞经细胞破碎后的上清液冻干获得的酶粉作为酶源，悬浮于pH值6.0~9.0的缓冲溶液中，分别加入底物、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶和辅酶NADP+或辅酶NAD+构成反应体系，在20~ 50℃下磁力搅拌5~36h，反应结束后，反应液用有机溶剂萃取，取上层有机相，用氮气吹扫除去溶剂（或用其它方法蒸干溶剂即可），获得所述光学活性手性醇；所述底物为4-甲基-2-戊酮、环戊酮、2,2,2-三氟苯乙酮、五氟苯乙酮、丙醛、异丁醛、异戊醛、苯甲醛、3-甲氧基苯甲醛、4-氯乙酰乙酸乙酯、乙酰乙酸乙酯、2-甲基乙酰乙酸乙酯、丙酮酸乙酯、2-氧代-4-苯基丁酸乙酯、丙酮酸乙酯、丁酰乙酸乙酯或苯甲酰甲酸乙酯，优选为苯甲酰甲酸乙酯、2-氧代-4-苯基丁酸乙酯4-氯乙酰乙酸乙 酯、乙酰乙酸乙酯或2,2,2-三氟苯乙酮；所述萃取用有机溶剂为乙酸乙酯、正己烷或氯仿；所述底物的初始浓度为1～ 100g/L反应体系（优选5~10g/L），所述酶源的用量为1～ 50U/L反应体系（优选20U/L），所述葡萄糖与底物的质量比为1~2:1（优选2:1），所述葡萄糖脱氢酶的用量为1～ 50U/L反应体系（优选30U/L），所述辅酶NADP+或辅酶NAD+的终浓度为0.1~1.0mmol/L反应体系（优选0.25~1 mmol/L反应体系）。
本发明所述含重组耐热醛酮还原酶的重组基因工程菌发酵培养获得的菌体细胞制备方法为：将含重组耐热醛酮还原酶的重组基因工程菌株（E.coli BL21(DE3)/pET28a- tadh2）接种至含30μg/ml卡那霉素的 LB培养基中培养，在37℃、180r/min下震荡培养12h，然后将培养液以体积比1:100接种至新鲜的含30μg/ml卡那霉素的 LB培养基中，在37℃、180r/min下震荡培养至培养液的光密度 OD600达到 0.5~ 0.7(优选0.6)时，向培养液中加入终浓度为 0.1~1mmol/L(优选0.5mmol/L)的异丙基 -β-D-硫代吡喃半乳糖苷 (IPTG)，25℃、100r/min下继续诱导 8~24小时（优选15h），将诱导培养液离心，获得菌体细胞。将菌体细胞重新悬浮于预冷的Tris-HCl缓冲液(Tris-HCl浓度为10～100mM，pH6.0~8.0，优选20Mm，pH8.0)后进行细胞超声破碎，离心收集上清液，再冻干（-80℃干燥48h）就能得到本发明的重组耐热醛酮还原酶的酶粉，即酶源。
本发明由所述重组耐热醛酮还原酶基因编码的重组耐热醛酮还原酶在制备光学活性手性醇中的应用中所述反应液的 pH为 6~ 9，通过使用磷酸盐缓冲液进行控制。所述的磷酸盐缓冲液较佳的如磷酸 -磷酸钾或磷酸 -磷酸钠缓冲液。磷酸盐缓冲液的浓度较佳的为0.05-0.2mol/L，所述的浓度是指缓冲溶液中共轭酸碱的总浓度。反应过程中也可以滴加碱液，如碳酸钠、碳酸钾、碳酸氢钠、碳酸氢钾、氢氧化钠、氢氧化钾、氨水等的水溶液以维持反应液 pH恒定在 pH 6-9的范围。
本发明中，优选重组耐热醛酮还原酶的酶粉为反应催化剂，需要加入辅酶 NADP+或NAD+ 的用量较佳的不超过 1.0mmol/L，能达到极其优良的效果。如果用静息细胞作催化剂则不需要加入辅酶，只需要利用细胞内所含的辅酶即可。
本发明所述重组耐热醛酮还原酶的酶活力单位的定义为：每分钟消耗1mmol底物所需要的酶量为一个酶活单位（1U）。
本发明中，所述的生物转化反应的温度较佳的为 20～ 50℃。所述的生物转化反应的时间以反应完全为准，一般为 5~36小时。不对称还原反应结束后，可按本领域常规方法从反应液中提取手性醇。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
本发明所用的原料或试剂除特别说明之外，均市售可得。
与现有技术相比，本发明的有益效果主要体现在：（1）本发明所涉及的重组耐热醛酮还原酶具有高活性、热稳定性好，60℃处理 15小时后仍较为稳定，残余相对酶活高达99%；（2）本发明的重组耐热醛酮还原酶高效高选择性地制备手性醇类化合物，可以在葡萄糖脱氢酶GDH或甲酸脱氢酶条件下构建辅酶NADPH或NADH循环再生系统，能大大降低反应过程中辅酶的消耗；（3）由于本发明的重组耐热醛酮还原酶具有较高的热稳定性，可以回收利用，并且反应体系中只需要额外添加少量的辅酶（辅酶的质量用量为底物质量的1/1000，辅酶在反应体系中的浓度不超过1Mm），极大地降低了生产的成本，且反应条件温和，对环境友好，操作简便，在合成药物手性中间体方面具有很好的工业应用前景。
（四）附图说明
图 1、为pET28a-- tadh2质粒经限制性内切酶BamHⅠ和NotⅠ酶切后产物电泳结果图，泳道1和3分别为核酸Markerλ-Hind Ⅲ和DL 2000， 泳道2为重组质粒pET28a- tadh2双酶产物，可以看到两条带，其中小片段在800bp上下，与目的基因大小一致；大片段为线性的pET28a。
图 2、目的基因表达产物的SDS-PAGE电泳图，泳道2为低分子蛋白Marker ，泳道1 为BL21/ pET28a-tadh2诱导表达后细胞破碎上清，在29.0kDa附近有一条明显诱导的蛋白表达条带，与推测的重组蛋白理论相对分子质量（31.49kDa ）一致。
图3、重组质粒pET28a--tadh2的构建示意图。
图4、重组耐热醛酮还原酶催化苯甲酰甲酸乙酯制备s-扁桃酸乙酯的液相色谱图，a为扁桃酸乙酯标准品，b为产物s-扁桃酸乙酯。
图5、EOPB反应后液相色谱图：12.655分钟的峰为R-EHPB，峰面积为295743，13.910分钟的峰为S-EHPB，峰面积为208899。
图6、丙酮酸乙酯反应后液相色谱图：9.63分钟的峰为R-乳酸乙酯，峰面积为93256；10.786分钟的峰为S-乳酸乙酯，峰面积为28313。
图7、实施例7中反应液的液相色谱图，8.158分钟的峰为S型3羟基-4-氯乙酰乙酸乙酯R-乳酸乙酯，峰面积为89473；8.442分钟的峰为R型3羟基-4-氯乙酰乙酸乙酯，峰面积为27709。
（五）具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
下列实施例中材料的来源为：
表达质粒 pET28a购自Novagen公司。
E.coli DH5α和 E.coli BL21(DE3)感受态细胞，2×Taq PCR MasterMix，琼脂糖凝胶 DNA回收试剂盒购自北京天根生化科技有限公司。
Clone EZ重组克隆试剂盒购自 GenScript公司。
LB培养基终浓度组成为：100ml蒸馏水中，加入1g氯化钠、1g蛋白胨和0.5g酵母提取物，自然pH值。
实施例 1 重组耐热醛酮还原酶基因的高效表达基因和表达载体的 人工构建
通过对genebank的检索与分析确定本发明的重组耐热醛酮还原酶基因（tadh2）DNA序列。在保证重组耐热醛酮还原酶的氨基酸序列不变的情况下，将编码重组耐热醛酮还原酶基因的密码子，全部换成在大肠杆菌中使用频率最高的密码子，改建的由重组耐热醛酮还原酶基因序列推断出的DNA序列如序列表SEQ ID NO ：1所示，在金斯瑞生物科技基因合成序列为SEQ ID NO: 1所示的tadh2 DNA。然后将合成的tadh2 DNA克隆到大肠杆菌高效表达载体pET28a中，并经IPTG诱导在E.coli BL21(DE3)基因工程菌中高效表达。
将上述人工合成的重组耐热醛酮还原酶DNA序列（tadh2）用限制性内切酶BamHⅠ和NotⅠ进行双酶切，用割胶回收的方法，回收约800bp大小的 DNA片段；用同样的限制性内切酶酶切pET28a质粒载体，酶切产物用AxyPrep PCR纯化试剂盒回收；将回收的800bp目的DNA片段与pET28a载体片段进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。从E.coli DH5α受体菌中提取BamHⅠ和NotⅠ质粒，进行双酶切检测鉴定，阳性克隆转化E.coli BL21(DE3)表达菌株中。重组载体的构建过程见图3所示，具体实验方法如下：
按照超纯水，人工合成重组耐热醛酮还原酶DNA序列和pET28a质粒、酶切缓冲液、限制性内切酶BamHⅠ和NotⅠ的顺序加到PCR管中，用枪头吸打几次，充分混匀后，用小型离心机离心（3000rpm，1 min）将管壁上的液体集中于管底，37℃水浴4h后，95℃水浴10分钟终止酶切。切取含目的条带的胶块后以AxyPrep DNA胶回收试剂盒纯化回收800bp目的DNA片段。由于经BamHⅠ和NotⅠ酶切的pET28a载体，切掉的片段只有34bp，AxyPrep PCR纯化试剂盒只能回收长度大于75bp的DNA片段，所以同样可以使用该试剂盒选择性地回收酶切后的线性载体。
酶切体系（50μL）：
将上述酶切体系用质量浓度0.7%琼脂糖凝胶电泳检测，分析双酶切结果，结果见图1所示，泳道1和3分别为核酸Markerλ-Hind Ⅲ和DL 2000，泳道2为重组质粒pET28a- tadh2双酶产物，可以看到两条带，其中小片段在800bp上下，与目的基因大小一致；大片段为线性的pET28a。其中800bp左右的片段是需回收的tadh2基因目的片段，较大的片段是线性pET28a。
将双酶切回收的tadh2基因目的片段与线性pET28a(+)按如下比例配成连接体系，置于PCR仪16℃恒温16h，得到重组质粒pET28a-tadh 2。
连接体系（10μL）：
在含50μL感受态细胞（E.coli DH5α）的EP管中加入10μL连接产物，轻轻混匀，冰浴30min，转入42℃水浴中热击90s，快速转至冰浴中2min，取出后加入500μL 无抗性LB培养基，37℃，180r/min摇床培养1h后涂布于含30μg/mL卡那霉素的LB平板，37℃倒置培养16h后挑取单菌落，活化培养后使用AxyPrep质粒DNA小量提取试剂盒提取质粒进 行双酶切检测鉴定阳性克隆。将含有阳性克隆的E.coli DH5α菌株于8%（体积浓度）甘油中，-20℃冰箱保存。
同样方式构建含有pET28a-tadh2的表达菌株E.coli BL21- pET28a-tadh2（DE3），置于终浓度为8%（体积）甘油中，-20℃冰箱保存。
实施例 2 重组基因工程菌的培养及重组耐热醛酮还原酶酶粉制备
取实施案例1中得到的表达菌株E.coli BL21- pET28a-tadh2（DE3），分别接种于两个5mL含有30μg/mL卡那霉素的LB培养基的试管中，37℃，180r/min培养12h后，将培养液以体积比1：100的比例接种于新鲜的100mL含30μg/mL卡那霉素的LB培养基中，37℃培养1.5~2h，至菌液OD600约为0.6，再加入24mg/mL的IPTG溶液至IPTG终浓度为0.5mmol/L，25℃、100r/min诱导培养12h，然后4℃，4000r/m离心20min后弃上清，用蒸馏水悬浮菌体（即沉淀）洗涤，同样条件下离心，即得到重组耐热醛酮还原酶的菌体细胞。
将菌体细胞重新悬浮于20mL 预冷的Tris-HCl(20mM，pH 8.0)缓冲液后进行细胞超声破碎，工作条件为功率80W，工作5秒，间歇5秒，共进行20min，此过程中细胞始终保持在冰浴中，防止蛋白热变性，破碎混合液10000r/mim离心10分钟，得到上清液，即酶液，沉淀用20mlTris-HCl(20mM，pH 8.0)缓冲液溶解，用于后续电泳检测。
本实验中表达的目标蛋白大小在31kDa左右，根据目的蛋白大小，分离胶选用10% SDS-PAGE，浓缩胶采用5%SDS-PAGE。
电泳参数：样品上样10μL，Marker上样10μL，浓缩胶电压50V，分离胶电压200V。
电泳完毕后，取出胶加入适量考马斯亮蓝染色液在脱色摇床染色2h后更换脱色液，每2h更换一次，最后脱色过夜，观察电泳结果。
结果如图2所示，重组质粒pET28a-SDR3转化大肠杆菌BL21(DE3)， 经IPTG诱导后，细胞裂解液上清有一条明显的分子量在30kD左右的蛋白条带，大约为29kDa（泳道1所示），目的基因tadh2在大肠杆菌成功的异源表达。结果表明：在29.0kDa附近有一条明显诱导的蛋白表达条带，与推测的重组蛋白理论相对分子质量（31.49kDa ）一致。
将上述酶液经过70℃热处理5分钟后，10000r/mim离心10分钟，取上清液在-80℃冷冻干燥48h，得到重组耐热醛酮还原酶干酶粉0.1g。
实施例3 重组耐热醛酮还原酶活力测定和酶的热稳定性
酶活测定依据Vallee&Hoch法：在340nm还原型辅酶NAD(P)H有明显吸收而氧化型辅酶NAD(P)+无吸收，因此在氧化还原反应中，辅酶被氧化或还原会引起340nm吸光度的变化。故可通过测定反应过程中340nm出辅酶吸光度的变化来衡量氧化还原酶的活力。
酶活单位的定义为：每分钟消耗1mmol底物所需要的酶量为一个酶活单位（1U）。
测定方法如下：在1.5ml EP管中加10μl 二甲基亚砜（DMSO），用于底物助溶；分别加底物2-5μL（保持摩尔浓度为20mM）（底物见表1所示），混匀；加20μL 10mg/ml的NADH溶液（终浓度0.25mM），混匀；加20mM pH8.0的Tris-Hcl缓冲液至1ml，混匀，制成待测液；将上述1ml待测液加入到比色皿，放入分光光度计中；加10μL酶液（将实施例2制备的酶粉用超纯水配制成1mg/ml的酶液），迅速在340 nm 读取吸光值。3分钟后再记录一次吸光值，相对酶活力按公式（1）计算，结果见表1所示。
相对酶活力(U)=（ΔOD340×V×1000） /（6220×L×Δt） 公式（1）；
ΔOD340: 吸光度变化；V: 反应体系总体积(1mL)；Δt:反应时间(3min)； e: 摩尔吸光系数， 6.22 mL/(mol·cm)；L: 石英比色杯光程(1cm)。
重组耐热醛酮还原酶（tadh2）对各种测定的酮类均有一定的作用，其中丙醛、2,2,2-三氟苯乙酮、乙酰乙酸乙酯、4-氯乙酰乙酸乙酯和2-氧代-4-苯基丁酸乙酯是其较好的底物。重组耐热醛酮还原酶（tadh2）对2,2,2-三氟苯乙酮酶活为0.57U/mL，以该化合物为100%活性参照底物，标注对各底物的相对活性如表1。由表可见重组耐热醛酮还原酶（tadh2）对含苯环的酮催化作用较强，对酮酯（酸）类底物的活性很高，而对脂肪族酮、环酮活性相对较低。
表1重组耐热醛酮还原酶相对活性
酶的热稳定性：在20 mM Tris–HCl pH8.0缓冲液中，将重组耐热醛酮 还原酶酶液0.5ml（将实施例2制备的酶粉用超纯水配制成1 mg/ml的酶液）分别在不同温度（60℃-90℃，5℃为间隔）温浴15小时后，70℃测残留的相对酶活。TADH2经60℃、15小时温浴后残留相对酶活99%，85℃、15小时温浴后残留相对酶活63%，经90℃温浴酶活才明显下降。
37℃温浴7天，TADH2酶活残留59%；55℃温浴24小时，TADH2酶活残留87%。
热稳定性研究表明，该重组耐热醛酮还原酶在70℃下保温15min处理，较为稳定，残余相对酶活达99%，当温度高于90℃后，酶活急剧下降。结合酶热处理的结果选取70℃、15min处理的酶液作为不对称还原的催化剂。
实施例 4重组耐热短链脱氢酶催化苯甲酸甲酰乙酯的不对称还原
取0.1mg(反应体系中初始酶活29U/L)实施例 2所得的重组耐热短链脱氢酶的酶粉悬浮于 2ml磷酸-磷酸钠缓冲液 (100mmol/L，pH 7.5)中，加入0.02mg(反应体系中初始酶活20U/L)葡萄糖脱氢酶GDH，10mg底物苯甲酸甲酰乙酯，20mg葡萄糖和 2μmol辅酶NADP+构成反应体系，在 30℃，磁力搅拌下反应 22h。反应结束后反应液用2ml正己烷进行萃取，取小部分上层正己烷溶液用液相色谱 (手性色谱柱(Chiralcel OD-H,Japan, Daicel chemical,0.46φ×25，流动相：正己烷/异丙醇=93/7，v/v，1mL/min，柱温：40℃，检测波长：UV254nm紫外检测器)分析测定底物转化率和还原产物（s-扁桃酸乙酯）的 ee值。液相色谱图见图4所示，12.187分钟的峰为R-扁桃酸乙酯，峰面积为36588;13.843分钟的峰为S-扁桃酸乙酯，峰面积为35443321。结果如下：转化率 99％,；ee值97.9％。将剩余部分上层正己烷溶液用氮气吹扫除去正己烷，获得s-扁桃酸乙酯。
实施例 5重组耐热醛酮还原酶催化2,2,2-三氟苯乙酮的不对称还原
取0.1mg(反应体系中初始酶活29U/L)实施例 2所得的重组耐热醛酮还原酶的酶粉悬浮于 2ml磷酸-磷酸钠缓冲液 (100mmol/L，pH 7.5)中，加入0.02mg(反应体系中初始酶活20U/L)葡萄糖脱氢酶GDH，9mg底物2,2,2-三氟苯乙酮，20mg葡萄糖和 2μmol辅酶NADP+构成反应体系，在 37℃，磁力搅拌下反应 24h。反应结束后反应液用2ml正己烷进行萃取，取小部分上层正己烷溶液用液相色谱 (手性色谱柱(Chiralcel IC,Japan, Daicel chemical,0.46φ×25，流动相：正己烷/异丙醇=97/3，v/v，1mL/min，柱温：40℃，检测波长：UV254nm紫外检测器)分析测定底物转化率和还原产物（2,2,2-三氟苯乙醇）的 ee值。液相色谱图见图5所示，结果如下：转化率 68％；ee值99.8％。将剩余部分上层正己烷溶液用氮气吹扫除去正己烷，获得单一手性的2,2,2-三氟苯乙醇，产率为56%。
实施例 6重组耐热醛酮还原酶催化2-氧代-4-苯基丁酸乙酯的不对称还原
取0.1mg(反应体系中初始酶活29U/L)实施例 2所得的重组耐热醛酮还原酶的酶粉悬浮于 2ml磷酸-磷酸钠缓冲液 (100mmol/L，pH 7.5)中，加入0.02mg(反应体系中初始酶活20U/L)葡萄糖脱氢酶GDH，9.8微升底物2-氧代-4-苯基丁酸乙酯，20mg葡萄糖和 2μmol辅酶NADP+构成反应体系，在 37℃，磁力搅拌下反应 12h。反应结束后反应液用2ml乙酸乙酯进行萃取，取小部分上层乙酸乙酯溶液用液相色谱 (手性色谱柱(Chiralcel IC,Japan, Daicel chemical,0.46φ×25，流动相：正己烷/异丙醇=95/5，v/v，1mL/min，柱温：40℃，检测波长：UV254nm紫外检测器)分析测定底物转化率和还原产物（R-EHPB）的 ee值。液相色谱图见图6所示，12.790分钟的峰为R-EHPB，峰面积为583978：14.187分钟的峰为S-EHPB峰面积为77648。结果：转化率 95％；ee值76.5％。
实施例 7重组耐热醛酮还原酶催化4-氯乙酰乙酸乙酯的不对称还原
取0.1mg(反应体系中初始酶活29U/L)实施例 2所得的重组耐热醛酮还原酶的酶粉悬浮于 2ml磷酸-磷酸钠缓冲液 (100mmol/L，pH 7.5)中，加入0.02mg(反应体系中初始酶活20U/L)葡萄糖脱氢酶GDH，10微升底物丙酮酸乙酯，20mg葡萄糖和 0.5μmol辅酶NADP+构成反应体系，在 30℃，磁力搅拌下反应 24h。反应结束后，取0.2ml反应液用1ml乙酸乙酯进行萃取，取0.ml上层乙酸乙酯溶液用氮气吹扫除去乙酸乙酯，再加入1ml正己烷混合均匀后用液相色谱 (手性色谱柱(Chiralcel AS-H,Japan, Daicel chemical,0.46φ×25，流动相：正己烷/异丙醇=98/2，v/v，1mL/min，柱温：40℃，检测波长：UV215nm紫外检测器)分析测定底物转化率和还原产物（3羟基-4-氯乙酰乙酸乙酯）的 ee值。液相色谱图见图7所示，8.158分钟的峰为S型3羟基-4-氯乙酰乙酸乙酯R-乳酸乙酯，峰面积为89473；8.442分钟的峰为R型3羟基-4-氯乙酰乙酸乙酯，峰面积为27709。转化率 90％；ee值52.7％。
实施例 8重组耐热醛酮还原酶全细胞催化苯甲酸甲酰乙酯的不对称还原
取 20mg(反应体系中初始酶活30U/L)实施例 2所得的重组耐热醛酮还原酶的菌体细胞悬浮于 2ml磷酸-磷酸钠缓冲液 (100mmol/L，pH 7.5)中，加入0.04mg(反应体系中初始酶活40U/L)葡萄糖脱氢酶GDH，20mg底物苯甲酸甲酰乙酯，40mg葡萄糖和 2μmol辅酶NADP+构成反应体系，在 35℃，磁力搅拌下反应 20h。反应结束后反应液用4ml正己烷进行萃取，取小部分上层正己烷溶液用液相色谱 (手性色谱柱(Chiralcel OD-H,Japan, Daicel chemical,0.46φ×25，流动相：正己烷/异丙醇=93/7，v/v，1mL/min，柱温：40℃，检测波长：UV254nm紫外检测器)分析测定底物转化率和还原产物（s-扁桃酸乙酯）的 ee值。结果：转化率 98％； ee值＞98.5％。
应理解，在阅读了本发明的上述内容后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动和修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州师范大学
<120> 重组耐热醛酮还原酶基因、编码酶、载体、工程菌及应用
<130>
<160> 2
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 927
<212> DNA
<213> Unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 1
atgggcagca gccatcatca tcatcatcac agcagcggcc tggtgccgcg cggcagccat 60
atggctagca tgactggtgg acagcaaatg ggtcgcggat ccatgctgta taaagaactg 120
ggtcgtaccg gcgaagaaat tccggcactg ggtctgggta cctggggtat cggcggtttt 180
gaaacgccgg attatagccg cgatgaagaa atggtggaac tgctgaaaac cgcaattaaa 240
atgggttaca cccatatcga tacggcggaa tattacggcg gtggccacac ggaagaactg 300
attggcaaag ccatcaaaga ttttcgtcgc gaagatctgt tcattgtgag caaagtttgg 360
ccgacccatc tgcgtcgcga tgatctgctg cgttctctgg aaaacaccct gaaacgcctg 420
gatacggatt atgttgatct gtacctgatt cactggccga atccggaaat cccgctggaa 480
gaaaccctga gtgcgatggc cgaaggtgtg cgtcagggcc tgattcgcta tatcggcgtt 540
agcaactttg atcgtcgcct gctggaagaa gccattagca aatctcagga accgatcgtg 600
tgcgatcagg ttaaatataa cattgaagat cgtgatccgg aacgcgatgg tctgctggaa 660
ttctgtcaga aaaatggcgt gaccctggtt gcatacagtc cgctgcgtcg cacgctgctg 720
agcgaaaaaa ccaaacgtac gctggaagaa atcgcgaaaa atcatggtgc caccatttac 780
cagatcatgc tggcatggct gctggcgaaa ccgaacgtgg ttgccattcc gaaagcaggc 840
cgtgtggaac acctgcgcga aaatctgaaa gcgacggaaa tcaaactgtc tgaagaagaa 900
atgaaactgc tggatagtct gggctaa 927
<210> 2
<211> 275
<212> PRT
<213> Unknown
<220>
<223> 人工序列
<400> 2
Met Leu Tyr Lys Glu Leu Gly Arg Thr Gly Glu Glu Ile Pro Ala Leu
1 5 10 15
Gly Leu Gly Thr Trp Gly Ile Gly Gly Phe Glu Thr Pro Asp Tyr Ser
20 25 30
Arg Asp Glu Glu Met Val Glu Leu Leu Lys Thr Ala Ile Lys Met Gly
35 40 45
Tyr Thr His Ile Asp Thr Ala Glu Tyr Tyr Gly Gly Gly His Thr Glu
50 55 60
Glu Leu Ile Gly Lys Ala Ile Lys Asp Phe Arg Arg Glu Asp Leu Phe
65 70 75 80
Ile Val Ser Lys Val Trp Pro Thr His Leu Arg Arg Asp Asp Leu Leu
85 90 95
Arg Ser Leu Glu Asn Thr Leu Lys Arg Leu Asp Thr Asp Tyr Val Asp
100 105 110
Leu Tyr Leu Ile His Trp Pro Asn Pro Glu Ile Pro Leu Glu Glu Thr
115 120 125
Leu Ser Ala Met Ala Glu Gly Val Arg Gln Gly Leu Ile Arg Tyr Ile
130 135 140
Gly Val Ser Asn Phe Asp Arg Arg Leu Leu Glu Glu Ala Ile Ser Lys
145 150 155 160
Ser Gln Glu Pro Ile Val Cys Asp Gln Val Lys Tyr Asn Ile Glu Asp
165 170 175
Arg Asp Pro Glu Arg Asp Gly Leu Leu Glu Phe Cys Gln Lys Asn Gly
180 185 190
Val Thr Leu Val Ala Tyr Ser Pro Leu Arg Arg Thr Leu Leu Ser Glu
195 200 205
Lys Thr Lys Arg Thr Leu Glu Glu Ile Ala Lys Asn His Gly Ala Thr
210 215 220
Ile Tyr Gln Ile Met Leu Ala Trp Leu Leu Ala Lys Pro Asn Val Val
225 230 235 240
Ala Ile Pro Lys Ala Gly Arg Val Glu His Leu Arg Glu Asn Leu Lys
245 250 255
Ala Thr Glu Ile Lys Leu Ser Glu Glu Glu Met Lys Leu Leu Asp Ser
260 265 270
Leu Gly Gln
275
Claims (7)
1.一种重组耐热醛酮还原酶基因，其特征在于所述基因的核苷酸序列为SEQ ID No.1所示。
2.一种由权利要求1所述重组耐热醛酮还原酶基因编码的重组耐热醛酮还原酶，其特征在于所述重组耐热醛酮还原酶的氨基酸序列为SEQ ID No.2所示。
3.一种含有权利要求1所述重组耐热醛酮还原酶基因的重组载体。
4.一种含有权利要求1所述重组耐热醛酮还原酶基因或重组载体的重组基因工程菌。
5.一种由权利要求1所述重组耐热醛酮还原酶基因编码的重组耐热醛酮还原酶在制备光学活性手性醇中的应用，其特征在于所述的应用为：以前手性羰基化合物为底物，以重组耐热醛酮还原酶为酶源，加入葡萄糖、葡萄糖脱氢酶和辅酶NADP+或辅酶NAD+构成反应体系进行生物转化反应，反应完全后，将反应液后处理获得所述光学活性手性醇；所述前手性羰基化合物为酮酯、芳香酮酯、酮酸或脂肪醛酮；所述重组耐热醛酮还原酶是以含重组耐热醛酮还原酶的重组基因工程菌发酵培养获得的菌体细胞或菌体细胞破碎后的上清液冻干后的酶粉作为酶源。
6.如权利要求5所述重组耐热醛酮还原酶基因编码的重组耐热醛酮还原酶在制备光学活性手性醇中的应用，其特征在于所述的应用为：将含重组耐热醛酮还原酶的重组基因工程菌发酵培养获得的菌体细胞或将菌体细胞经细胞破碎后的上清液冻干获得的酶粉作为酶源，悬浮于pH值6.0～9.0的缓冲溶液中，分别加入底物、葡萄糖、葡萄糖脱氢酶和辅酶NADP+或辅酶NAD+构成反应体系，在20～50℃下磁力搅拌5～36h，反应结束后，反应液用有机溶剂萃取，取上层有机相，氮气吹扫除去溶剂，获得所述光学活性手性醇；所述底物为4-甲基-2-戊酮、环戊酮、2,2,2-三氟苯乙酮、五氟苯乙酮、丙醛、异丁醛、异戊醛、苯甲醛、3-甲氧基苯甲醛、4-氯乙酰乙酸乙酯、乙酰乙酸乙酯、2-甲基乙酰乙酸乙酯、丙酮酸乙酯、2-氧代-4-苯基丁酸乙酯、丙酮酸乙酯、丁酰乙酸乙酯或苯甲酰甲酸乙酯；所述萃取用有机溶剂为乙酸乙酯、正己烷或氯仿；所述底物的初始浓度为1～100g/L反应体系，所述酶源的用量为1～50U/L反应体系，所述葡萄糖与底物的质量比为1～2:1，所述葡萄糖脱氢酶的用量为1～50U/L反应体系，所述辅酶NADP+或辅酶NAD+的终浓度为0.1～1.0mmol/L反应体系。
7.如权利要求5～6之一所述重组耐热醛酮还原酶基因编码的重组耐热醛酮还原酶在制备光学活性手性醇中的应用，其特征在于所述的所述含重组耐热醛酮还原酶的重组基因工程菌发酵培养获得的菌体细胞按如下方法制备：将含重组耐热醛酮还原酶的重组基因工程菌接种至含30μg/ml卡那霉素的LB培养基中培养，37℃、180r/min震荡培养12h，将培养液以体积比1:100接种至新鲜的含30μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃、180r/min震荡培养至培养液的OD600达到0.5～0.7时，向培养液中加入终浓度为0.1～1mmol/L的IPTG，25℃、100r/min继续诱导培养8～24小时，将诱导培养液离心，取菌体细胞，即为酶源。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210535657.9A CN103122355B (zh) | 2012-12-12 | 2012-12-12 | 重组耐热醛酮还原酶基因、编码酶、载体、工程菌及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201210535657.9A CN103122355B (zh) | 2012-12-12 | 2012-12-12 | 重组耐热醛酮还原酶基因、编码酶、载体、工程菌及应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN103122355A CN103122355A (zh) | 2013-05-29 |
| CN103122355B true CN103122355B (zh) | 2014-11-05 |
Family
ID=48453500
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201210535657.9A Expired - Fee Related CN103122355B (zh) | 2012-12-12 | 2012-12-12 | 重组耐热醛酮还原酶基因、编码酶、载体、工程菌及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN103122355B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106520849A (zh) * | 2015-09-11 | 2017-03-22 | 杭州酶易生物技术有限公司 | 一种制备手性2-氯-3,4-二氟苯乙醇的方法 |
Families Citing this family (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103614347B (zh) * | 2013-09-27 | 2016-04-20 | 杭州师范大学 | 一种嗜热酮还原酶突变体、编码基因及其应用 |
| CN103709058B (zh) * | 2013-12-10 | 2015-09-02 | 苏州汉酶生物技术有限公司 | 一种左旋肉碱的合成方法 |
| CN103898072B (zh) * | 2014-02-26 | 2016-03-16 | 杭州师范大学 | 一种酮还原酶突变体及其应用 |
| CN105567652B (zh) * | 2014-10-14 | 2019-06-11 | 上海弈柯莱生物医药科技有限公司 | 一种酮还原酶及其在不对称合成手性羟基化合物中的应用 |
| CN106520716A (zh) * | 2016-10-28 | 2017-03-22 | 杭州酶易生物技术有限公司 | 一种嗜热酮还原酶突变体及其应用 |
| CN106929521B (zh) * | 2017-01-21 | 2020-08-21 | 浙江工业大学 | 一种醛酮还原酶基因重组共表达载体、工程菌及其应用 |
| CN109112166B (zh) * | 2017-06-26 | 2023-08-15 | 弈柯莱生物科技(上海)股份有限公司 | 酶法制备替卡格雷中间体 |
| CN109652463B (zh) * | 2018-12-12 | 2020-05-08 | 浙江大学 | 一种应用Perakine还原酶合成手性醇的方法 |
| CN110387361A (zh) * | 2019-08-12 | 2019-10-29 | 天津迪沙医药技术开发有限公司 | 一种醛酮还原酶及其应用 |
| CN110938608A (zh) * | 2019-12-20 | 2020-03-31 | 台州酶易生物技术有限公司 | 醛酮还原酶突变体、编码基因及其在合成(s)-tcpe中的应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1315513A (zh) * | 2000-03-24 | 2001-10-03 | 上海博德基因开发有限公司 | 一种新的多肽——人醛/酮还原酶36和编码这种多肽的多核苷酸 |
| WO2010066851A1 (en) * | 2008-12-10 | 2010-06-17 | Ghent University | Neuroblastoma prognostic multigene expression signature |
| CN101845450A (zh) * | 2009-10-31 | 2010-09-29 | 福建农林大学 | 一种耐热耐碱木聚糖酶重组工程菌bl21-xa及其应用 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| ATE205257T1 (de) * | 1995-12-12 | 2001-09-15 | Takara Shuzo Co | Gene kodierend für ultrathermostabile proteasen |
| CN1178835A (zh) * | 1997-11-13 | 1998-04-15 | 复旦大学 | 一种耐热碱性磷酸酯酶及其表达 |
-
2012
- 2012-12-12 CN CN201210535657.9A patent/CN103122355B/zh not_active Expired - Fee Related
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1315513A (zh) * | 2000-03-24 | 2001-10-03 | 上海博德基因开发有限公司 | 一种新的多肽——人醛/酮还原酶36和编码这种多肽的多核苷酸 |
| WO2010066851A1 (en) * | 2008-12-10 | 2010-06-17 | Ghent University | Neuroblastoma prognostic multigene expression signature |
| CN101845450A (zh) * | 2009-10-31 | 2010-09-29 | 福建农林大学 | 一种耐热耐碱木聚糖酶重组工程菌bl21-xa及其应用 |
Non-Patent Citations (8)
| Title |
|---|
| 嗜热酶耐热机制的研究进展;石宣明等;《科学技术与工程》;20040930(第09期);全文 * |
| 小鼠醛糖还原酶相似基因同源蛋白表达研究;金俊飞等;《中华肝脏病杂志》;20040825(第08期);全文 * |
| 李凌凌等.醛酮还原酶及其在不对称合成手性醇中的应用.《化学与生物工程》.2009,(第11期), * |
| 石宣明等.嗜热酶耐热机制的研究进展.《科学技术与工程》.2004,(第09期), * |
| 蔡秋香等.醛酮还原酶超家族的研究进展.《医学综述》.2008,(第24期), * |
| 醛酮还原酶及其在不对称合成手性醇中的应用;李凌凌等;《化学与生物工程》;20091130(第11期);62-64 * |
| 醛酮还原酶超家族的研究进展;蔡秋香等;《医学综述》;20081220(第24期);全文 * |
| 金俊飞等.小鼠醛糖还原酶相似基因同源蛋白表达研究.《中华肝脏病杂志》.2004,(第08期), * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106520849A (zh) * | 2015-09-11 | 2017-03-22 | 杭州酶易生物技术有限公司 | 一种制备手性2-氯-3,4-二氟苯乙醇的方法 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN103122355A (zh) | 2013-05-29 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103122355B (zh) | 重组耐热醛酮还原酶基因、编码酶、载体、工程菌及应用 | |
| Kim et al. | L-Lactate dehydrogenase: substrate specificity and use as a catalyst in the synthesis of homochiral 2-hydroxy acids | |
| CN102952814A (zh) | 重组耐热短链脱氢酶基因、编码酶、载体、工程菌及应用 | |
| CN106164260B (zh) | 一种假丝酵母羰基还原酶及用于制备(r)-6-羟基-8-氯辛酸酯的方法 | |
| CN106929490B (zh) | 一种羰基还原酶、突变体及其在制备他汀合成中间体中的应用 | |
| CN106995808B (zh) | 一种重组转氨酶及其应用 | |
| CN105543186B (zh) | 一种醇脱氢酶lc3及其基因和应用 | |
| CN106995807B (zh) | 一种重组转氨酶及其制备方法与应用 | |
| CN101613672A (zh) | 一种不对称转化制备(s)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的重组大肠杆菌及其构建方法 | |
| CN103173503A (zh) | 重组大肠杆菌表达酮还原酶生物制备 (s)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的方法 | |
| CN103642765A (zh) | 醇脱氢酶突变体及其应用 | |
| CN106701698A (zh) | 羰基还原酶、突变体及其在制备抗真菌类药物中间体中的应用 | |
| CN104152506A (zh) | 醛酮还原酶的重组菌粗酶体系催化合成(s)-n,n-二甲基-3-羟基-3-(2-噻吩)-1-丙胺的方法 | |
| CN110387359A (zh) | 羰基还原酶突变体及其应用 | |
| CN102260657B (zh) | 一种脂肪酶基因及其重组酶和在制备光学活性扁桃酸中的应用 | |
| CN102827850A (zh) | 短链脱氢酶cpe基因、编码酶、载体、重组工程菌及应用 | |
| CN105112385A (zh) | 一种重组酯酶、编码基因、载体、工程菌及应用 | |
| CN104673814B (zh) | 一种来自于阴沟肠杆菌的l‑苏氨酸醛缩酶及其应用 | |
| CN104152425A (zh) | 一种嗜热酯酶及其在降解PAEs中的应用 | |
| CN103289970A (zh) | 酮还原酶lek、编码基因、突变体及应用 | |
| CN101979527B (zh) | 一种还原酶及其基因、重组酶及制备方法和应用 | |
| CN103320403A (zh) | 酮还原酶lek突变体及应用 | |
| CN112143688B (zh) | 一种重组大肠杆菌的构建及其应用 | |
| CN101962661B (zh) | 一种羰酰还原酶在生产(s)-4-氯-3羟基丁酸乙酯中的应用 | |
| CN105602913A (zh) | 重组羰基还原酶突变体ReCR-Mut、编码基因、工程菌及应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20141105 |