CN106929490B

CN106929490B - 一种羰基还原酶、突变体及其在制备他汀合成中间体中的应用

Info

Publication number: CN106929490B
Application number: CN201710060704.1A
Authority: CN
Inventors: 郑高伟; 宫绪敏; 许建和; 潘江; 钱小龙
Original assignee: Fuan Suzhou Hundred Zymotechnic Co Ltd; East China University of Science and Technology
Current assignee: Suzhou Baifu Enzyme Technology Co ltd
Priority date: 2017-01-25
Filing date: 2017-01-25
Publication date: 2019-10-01
Anticipated expiration: 2037-01-25
Also published as: CN106929490A

Abstract

本发明涉及一种来源于短乳杆菌(Lactobacillus brevis)CGMCC 1.3258的羰基还原酶及其活性提高的突变体，其基因、含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及利用该重组羰基还原酶或重组表达转化体作为催化剂催化不对称还原制备手性羟基化合物的应用，特别是阿托伐他汀手性中间体6‑氰基‑(3R,5R)‑二羟基己酸叔丁酯的生物催化合成方面的应用。与不对称还原制备6‑氰基‑(3R,5R)‑二羟基己酸叔丁酯的其他方法相比，本发明具有底物浓度高、反应条件温和、环境友好、产率高、产品光学纯度高等优势，因此在阿托伐他汀手性侧链的工业化生产中具有很好的应用前景。

Description

一种羰基还原酶、突变体及其在制备他汀合成中间体中的应用

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种来源于短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)CGMCC 1.3258的羰基还原酶及其活性提高的突变体，其基因、含有该基因的重组表达载体和重组表达转化体，以及利用该重组羰基还原酶或重组表达转化体作为催化剂催化不对称还原制备手性羟基化合物的应用，特别是阿托伐他汀手性中间体6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的生物催化合成方面的应用。

背景技术

阿托伐他汀是他汀类药物的一种，主要用于治疗高胆固醇血症和冠心病，反应机理是通过竞争性抑制羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶，降低低密度脂蛋白(LDL)和甘油三酯的水平。辉瑞公司开发的药物“立普妥”(其活性成分为阿托伐他汀)年销售额曾超过100亿美元，是历史上最畅销的药物。6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯是合成阿托伐他汀原料药的重要手性中间体，其包含两个手性中心，但是只有一种构型是有活性的，即两个手性羟基都处在顺式位，构型为syn-(3R,5R)。阿托伐他汀原料药合成中对该手性侧链立体构型的要求为：ee>99.5％，de>99％，因此该手性侧链的合成具有一定的挑战性。目前可通过化学法和生物催化法合成该手性侧链。

传统化学法生产6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的反应条件苛刻，反应过程需要在低温(-85℃～-100℃)下进行，而且需要添加甲氧基二乙基硼烷(或三乙基硼烷)作为手性诱导剂，采用硼氢化钠作为还原剂，溶剂为甲醇和四氢呋喃(US 5155251)。该工艺可以制得较高光学纯度(de 98％)的中间体，通过重结晶可将非对映异构体纯度提高到>99％(de)，但是该工艺能耗高，需要使用大量有毒的有机溶剂，并且产生大量废弃物，不符合绿色化学的要求。

生物催化方法可以在室温下进行反应，反应介质一般为水溶液，可减少有机溶剂的使用，低毒，耗能低，环境友好，而且具有高立体选择性等优势，因此生物催化的羰基不对称还原反应在手性醇不对称合成中的应用越来越受到重视。例如，Zeneca公司报道的Pichia angusta NCYC R320整细胞可催化还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，通过发酵生产制备Pichia angusta NCYC R320活性细胞，并直接将底物通过连续补料的方式添加到发酵液中，维持底物浓度约2g/L，48h后转化率可达79％，产物浓度为16.96g/L(0.074M)，产物提取、分离得率为91％，de>99％(WO9700968)。Codexis公司经过定向进化获得高活性的突变体羰基还原酶KRED，能催化还原浓度高达300g L^–1的6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯，反应转化率98％，产物de>99.9％(US7879585)。Cambrex IEP GMBH公司分别从Rubrobacter xylanophilus DSM 9941和Geobacillus thermodenitrificans DSM465中克隆，并异源表达了两个还原酶，催化6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的不对称还原，在底物浓度不低于50g/L时，转化率大于90％，产物的de值大于99％(US20150152451)。郑裕国课题组从Kluyveromyces lactis XP1461中克隆、异源表达了醛酮还原酶KlAKR，催化6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的不对称还原，底物浓度为4.54g/L时，KlAKR催化转化率达90.3％，产物的de值高于99.5％，对该酶进行分子改造后得到的突变体可催化的底物浓度提高至50g/L，转化率高于99％，产物的de值高于99.5％(Journal of Biotechnology,2016,224:20–26)。上述报道中，Codexis公司的KRED虽具有较高的催化效率和立体选择性等优点，但只有98％的转化率，剩余的未反应完全的底物增加了产品后续分离精制的成本，使得该生物催化合成工艺不够经济高效，其他的野生菌整细胞或羰基还原酶催化的反应存在着催化活性低、底物耐受性差，反应时间长等问题，与产业化应用要求相距甚远，因此需要挖掘性能更优的新型羰基还原酶，开发经济、高效、环保的生物催化合成工艺。

发明内容

本发明的目的是提供一种来源于短乳杆菌(Lactobacillus brevis)CGMCC1.3258的羰基还原酶及其突变体，包含该羰基还原酶或其突变体基因的重组表达载体和重组表达转化体，并开发该重组羰基还原酶在6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯等羰基化合物的生物不对称还原方面的应用。

本发明的目的可以通过以下技术方案来实现：

本发明提供了一种羰基还原酶，本发明通过分析生物信息学的方法，分析预测可能对6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯具有明显还原活性的羰基还原酶基因，并将其分选出来进行克隆表达，构建重组大肠杆菌细胞。通过测定重组表达的羰基还原酶的活力及其催化6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯还原的立体选择性等，对所克隆的酶进行筛选，最终获得催化性能最佳的羰基还原酶，其来源于短乳杆菌(Lactobacillus brevis)CGMCC 1.3258，命名为羰基还原酶LbCR。所述短乳杆菌(Lactobacillus brevis)CGMCC1.3258购自中国普通微生物菌种保藏管理中心，所述羰基还原酶的氨基酸序列较佳地为如序列表中SEQ ID No.2所示。

所述羰基还原酶的来源较佳地包括：提取自然界中天然存在的羰基还原酶，通过人工合成氨基酸全序列所得的羰基还原酶，通过基因工程方法克隆表达所得的羰基还原酶。

本发明所述羰基还原酶较佳地来源于短乳杆菌(Lactobacillus brevis)CGMCC1.3258。其具体制备方法包括：以短乳杆菌(Lactobacillus brevis)CGMCC 1.3258的基因组DNA为模板，采用本领域常规技术方法(如聚合酶链式反应，PCR)，获得编码所述羰基还原酶LbCR的完整核酸分子。其中涉及的合成引物，优选的上游引物和下游引物序列如SEQ IDNo.3和SEQ ID No.4所示。

上游引物：5’-CGC GGATCC ATGACAGATCGTTTGAAAGATAAAGTGGCA-3’；

下游引物：5’-CCC AAGCTT TTAAGCGCGTTGACCACCGTCAACCGTA-3’；

其中，上游引物下划线部分为BamHI酶切位点，下游引物下划线部分为HindIII酶切位点。所述羰基还原酶全长基因的核苷酸序列如序列表中SEQ ID No.1所示，全长为750个核苷酸碱基。其编码序列(CDS)从第1个碱基起至第750个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA，无内含子，该基因编码的蛋白质的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.2所示。

本发明还提供了多种羰基还原酶突变体，其是在如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列中经过取代一个或几个氨基酸形成的羰基还原酶活性提高的衍生蛋白质。

优选的是由SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第39位的天冬酰胺、第40位的组氨酸、第96位的缬氨酸、第97位的天冬酰胺、第154位的甲硫氨酸、第155位的丙氨酸、第198位的缬氨酸、第201位的甘氨酸、第202位的丙氨酸、第204位的天冬氨酸、第243位的缬氨酸经过一个或几个氨基酸取代后形成的新氨基酸序列构成的衍生蛋白质。

进一步优选的突变体的氨基酸序列如下：

(1)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第201位的甘氨酸替换为丙氨酸，第204位的天冬氨酸替换为赖氨酸；

(2)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第201位的甘氨酸替换为丙氨酸，第204位的天冬氨酸替换为丙氨酸；

(3)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第198位的缬氨酸替换为异亮氨酸，第201位的甘氨酸替换为丙氨酸，第204位的天冬氨酸替换为赖氨酸；

(4)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第201位的甘氨酸替换为丙氨酸，第204位的天冬氨酸替换为赖氨酸，第243位的缬氨酸替换为异亮氨酸；

(5)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第154位的甲硫氨酸替换为异亮氨酸，第201位的甘氨酸替换为丙氨酸，第204位的天冬氨酸替换为赖氨酸；

(6)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第96位的缬氨酸替换为天冬氨酸，第97位的天冬酰胺替换为天冬氨酸，第201位的甘氨酸替换为丙氨酸，第204位的天冬氨酸替换为赖氨酸；

(7)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第39位的天冬酰胺替换为缬氨酸，第40位的组氨酸替换为天冬氨酸，第201位的甘氨酸替换为丙氨酸，第204位的天冬氨酸替换为赖氨酸；

(8)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第96位的缬氨酸替换为天冬氨酸，第97位的天冬酰胺替换为天冬氨酸，第201位的甘氨酸替换为丙氨酸，第204位的天冬氨酸替换为丙氨酸，第243位的缬氨酸替换为异亮氨酸；

(9)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第201位的甘氨酸替换为天冬氨酸，第202位的丙氨酸替换为亮氨酸，第204位的天冬氨酸替换为赖氨酸；

(10)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第201位的甘氨酸替换为组氨酸，第202位的丙氨酸替换为异亮氨酸，第204位的天冬氨酸替换为赖氨酸；

(11)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第201位的甘氨酸替换为天冬氨酸，第202位的丙氨酸替换为缬氨酸，第204位的天冬氨酸替换为赖氨酸；

(12)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第201位的甘氨酸替换为组氨酸，第202位的丙氨酸替换为亮氨酸，第204位的天冬氨酸替换为赖氨酸；

(13)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第154位的甲硫氨酸替换为异亮氨酸，第155位的丙氨酸替换为天冬氨酸，第201位的甘氨酸替换为丙氨酸，第204位的天冬氨酸替换为赖氨酸；

(14)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第154位的甲硫氨酸替换为丝氨酸，第155位的丙氨酸替换为天冬氨酸，第201位的甘氨酸替换为丙氨酸，第204位的天冬氨酸替换为赖氨酸；

(15)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第154位的甲硫氨酸替换为缬氨酸，第155位的丙氨酸替换为天冬氨酸，第201位的甘氨酸替换为丙氨酸，第204位的天冬氨酸替换为赖氨酸；

(16)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第198位的缬氨酸替换为异亮氨酸，第201位的甘氨酸替换为天冬氨酸，第202位的丙氨酸替换为亮氨酸，第204位的天冬氨酸替换为赖氨酸；

(17)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第154位的甲硫氨酸替换为异亮氨酸，第155位的丙氨酸替换为天冬氨酸，第201位的甘氨酸替换为天冬氨酸，第202位的丙氨酸替换为亮氨酸，第204位的天冬氨酸替换为赖氨酸。

SEQ ID No.1的同系物也指启动子突变体。所述羰基还原酶基因的启动子可通过一个或多个核苷酸的替换、插入或缺失而改变，但这些改变对启动子的功能没有负面影响。而且通过改变启动子的序列或使用不同来源的更有效的启动子进行完全替换，可提高所述羰基还原酶的表达水平。

本发明还提供了一种包含上述羰基还原酶基因核酸序列的重组表达载体。所述重组表达载体可通过本领域常规方法将上述羰基还原酶基因克隆到各种载体上构建而成。所述的表达载体较佳地包括本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，所述载体优选地为pET28a质粒。

较佳的，可通过下述方法制得本发明所述重组表达载体：将通过PCR扩增所得的羰基还原酶基因序列DNA片段用限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切，同时将表达载体pET28a用限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切，形成互补的粘性末端，回收上述酶切后的羰基还原酶基因DNA片段以及pET28a质粒，利用T4DNA连接酶连接，构建包含所述羰基还原酶及其突变体基因的重组表达载体，例如pET28a-LbCR。

本发明还提供一种包含前述羰基还原酶基因或其重组表达载体的重组表达转化体。所述重组表达转化体可通过将上述重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述宿主细胞为本领域常规的宿主细胞，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，并且其所携带的羰基还原酶基因可被有效表达即可。所述宿主细胞优选为大肠杆菌，更优选地为：大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)或大肠杆菌DH5α。将前述重组表达载体转化至大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中，即可得本发明优选的基因工程菌株。例如，将重组表达载体pET28a-LbCR转化至大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)中，获得重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbCR。

本发明所述重组羰基还原酶的制备方法较佳地为：培养如上所述的重组表达转化体，获得重组表达的羰基还原酶。其中所述的培养重组表达转化体所用的培养基为本领域任何可使转化体生长并产生本发明的重组羰基还原酶的培养基。所述培养基优选LB培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，pH 7.0。培养方法和培养条件没有特殊的限制，可以根据宿主细胞类型和培养方法等因素的不同，按本领域常规知识进行适当的选择，只要使转化体能够生长并生产羰基还原酶即可。培养转化体的具体操作均可按本领域常规操作进行。菌株培养方法优选地包括：将本发明所述的重组大肠杆菌，例如E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbCR，接种至含卡那霉素的LB培养基中，37℃培养，当培养液的光密度OD₆₀₀达到0.5～1.0(优选0.6)时，加入终浓度为0.1～1.0mmol/L(优选0.5mmol/L)的异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)进行产酶诱导，在16℃继续培养24h，即可高效表达本发明所述的羰基还原酶。培养结束后，离心收获沉淀的菌体细胞，即为重组表达转化体的静息细胞；将所得菌体细胞沉淀冷冻干燥，可以获得冻干细胞，有利于长期存放，方便以后使用。

通过检测340nm处吸光值变化的方式，利用分光光度计测定羰基还原酶的活力。所述羰基还原酶的活力可用如下方法测定：将含2mmol/L 6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯和0.1mmol/L NADPH的1mL反应体系(100mmol/L磷酸钾缓冲液，pH 6.0)预热至30℃，然后加入适量的羰基还原酶，30℃保温反应，在分光光度计上检测340nm处NADPH的吸光度变化，记录1分钟内吸光度的变化值。

根据下式计算得到酶活力：

酶活力(U)＝EW×V×10³/(6220×l)

式中，EW为1分钟内340nm处吸光度的变化；V为反应液的体积，单位为ml；6220为NADPH的摩尔消光系数，单位为L/(mol·cm)；l为光程距离，单位为cm。1个酶活力单位对应于上述条件下每分钟氧化1μmol NADPH所需的酶量。

此外，本发明还提供了所述羰基还原酶在不对称还原羰基化合物中的应用。其中所述羰基化合物可选自如下通式：

其中R₁选自-CH₃或-C₆H₅；

R₂为-CH₃、-CH₂Cl、-C₆H₅；

R₃为-CH₂CH₃或-C(CH₃)₃；

R₄为-CH₃。

优选化合物为：化合物1：R₁为-CH₃；

化合物2：R₁为-C₆H₅；

化合物3：R₂为-CH₃，R₃为-C(CH₃)₃；

化合物4：R₂为-CH₂Cl，R₃为-CH₂CH₃；

化合物5：R₂为-C₆H₅，R₃为-CH₂CH₃；

化合物6：R₄为-CH₃。

优选的，式4为6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯。

针对化合物6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的不对称还原，可按下述示例性方法进行：在pH 5.5-7.5的磷酸盐缓冲液中，在葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和NAD(P)⁺的存在下，在所述羰基还原酶或重组羰基还原酶的作用下，对6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯进行不对称还原反应，制得光学活性6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯。所述应用中，底物6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯在反应液中的浓度可以为0.1～1.5mol/L。所述羰基还原酶的酶活单位(U)定义为每分钟催化1μmol底物转化生成产物所需的酶量。根据所采用的反应体系，所述羰基还原酶的用量可以为5～20kU/L。在6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的不对称还原时，为了进行辅酶循环，向反应体系中额外添加葡萄糖和来自巨大芽孢杆菌的葡萄糖脱氢酶(制备方法参见：Journal of Industrial Microbiology andBiotechnology,2011,38,633–641)。取决于不同反应体系，葡萄糖脱氢酶的活力单位可以与所述羰基还原酶的活力单位相当，例如葡萄糖脱氢酶的用量可以为5～20kU/L。葡萄糖与底物的摩尔比可以为1.0～1.5，额外添加的NAD(P)⁺的用量可以为0～1mmol/L。所述磷酸盐缓冲液可以是本领域常规的任何磷酸盐缓冲液，如磷酸-磷酸钠(钾)缓冲液。磷酸盐缓冲液的浓度可以为0.05～0.2mol/L。所述的不对称还原反应的温度可以为25～35℃，优选30℃。反应中，间歇取样测定反应转化率，反应时间以底物完全反应完或反应自行终止的时间为准，一般为1～16小时。转化率和非对映异构体纯度可采用高效液相色谱法来分析，优选的，使用ODS-2 C18柱(4.6×250mm,5μm)，流动相为乙腈/水＝1:3(v/v)，柱温40℃，流速1mL/min，紫外检测波长210nm。

待不对称还原反应结束后，反应液用等量本领域常规的水不溶性有机溶剂，如乙酸乙酯、乙酸丁酯、甲苯、二氯甲烷、三氯甲烷、异丙醚、甲基叔丁基醚等进行萃取，重复萃取两次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥过夜。旋转蒸发除去溶剂，即得光学纯手性产物6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的粗提物，进一步通过常规方法，比如减压蒸馏等方法进行纯化即可得高度化学纯和光学纯的产物。

本发明提供的所述羰基还原酶LbCR，可用于高效催化6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯的不对称还原，生成光学纯6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯。利用该酶法催化技术，底物浓度达1.3mol/L，转化率可超过99％，产物de值高于99％。相对于其他6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的不对称还原制备方法，本发明具有产物浓度高和光学纯度高的优势，有利于实现6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的高效、低成本生产，具有工业化应用前景。

与不对称还原制备6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的其他方法相比，本发明具有底物浓度高、反应条件温和、环境友好、产率高、产品光学纯度高等优势，因此在阿托伐他汀手性侧链的工业化生产中具有很好的应用前景。

前述各反应或检测条件，可根据本领域常识进行组合或更改，并可通过实验得到验证。

附图说明

图1为重组表达质粒pET-LbCR的构建示意图。

图2为羰基还原酶LbCR催化合成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的示意图。

具体实施方式

以下实施例举例说明了本发明示例性的实施方式，来帮助本领域技术人员理解本申请的其它目标、特征、优点和各方面。应当理解，虽然表明了本申请的优选实施方式，但以下描述和具体实施例仅是为了说明而给出，而不对本发明的范围构成限制。本发明的范围根据所附权利要求书确定。除非另有说明，下列实施例中的具体实验按照本领域常规方法和条件进行，或遵照商品说明书。

下列实施例中的材料来源为：

短乳杆菌(Lactobacillus brevis)CGMCC 1.3258，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心。

表达质粒pET28a购自Novagen公司。

E.coli DH5α和E.coli BL21(DE3)感受态细胞、2×Taq PCR MasterMix、琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒均购自北京天根生化科技有限公司。

限制性内切酶BamHI和Hind III均为New England Biolabs(NEB)公司的市售产品。

实施例1羰基还原酶LbCR的基因克隆

根据羰基还原酶LbCR的开放阅读框，设计上、下游引物如下：

上游引物，其序列见SEQ ID No.3，具体为：

5’-CGC GGATCC ATGACAGATCGTTTGAAAGATAAAGTGGCA-3’；

下游引物，其序列见SEQ ID No.4，具体为：

5’-CCC AAGCTT TTAAGCGCGTTGACCACCGTCAACCGTA-3’；

其中，上游引物下划线部分为BamHI酶切位点，下游引物下划线部分为HindIII酶切位点。

以短乳杆菌(Lactobacillus brevis)CGMCC 1.3258的基因组DNA为模板，进行PCR扩增。PCR体系为：2×Taq PCR MasterMix 25μl,上游引物和下游引物(10ng/μl)各2.5μl，基因组DNA(100ng/μl)1μl和ddH₂O 19μl。PCR扩增程序为：95℃预变性5分钟后进行32次如下循环：94℃变性30秒，50℃退火30秒，72℃延伸1分钟；最后72℃再延伸10分钟。PCR扩增产物进行凝胶电泳纯化后，用DNA回收试剂盒回收目的片段。经过DNA测序，该序列编码的开放阅读框全长750bp，其碱基序列如SEQ ID No.1所示。

实施例2羰基还原酶LbCR重组表达质粒和重组表达转化体的制备

将实施例1中PCR扩增所得的羰基还原酶目的DNA片段以及pET 28a空质粒同时用限制性内切酶BamHI和HindIII双酶切过夜，然后经琼脂糖凝胶电泳纯化、DNA试剂盒回收。将回收的酶切目的片段和空载体在T4DNA连接酶的作用下，于4℃连接12小时，得到重组质粒pET28a-LbCR，所述基因的重组表达载体构建策略如图1所示。

将所得重组质粒转化至E.coli DH5α，涂布到含有50μg/ml卡那霉素的LB培养基平板上，37℃培养8小时，对长出来的菌落进行菌落PCR验证，挑取成功扩增出长度约750bp的目的条带的阳性克隆。经测序验证后，提取相应的质粒，进一步转化至E.coli BL21(DE3)，挑取阳性克隆，即获得重组表达转化体E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbCR。

实施例3羰基还原酶LbCR突变体构建

采用CASTing技术构建羰基还原酶LbCR的突变库：选取LbCR底物结合口袋内非保守残基分组进行组合饱和突变，采用简并密码子NDT设计突变引物，以pET28a-LbCR作为模板，用高保真聚合酶PrimeSTAR进行PCR。PCR反应条件如下：总体积为20μL的PCR反应体系中，加入模板0.5～20ng，10μL 2×PrimeSTAR(Premix)，一对突变引物各0.4μL(10μM)，加灭菌蒸馏水至20μL。PCR反应程序：(1)98℃变性10sec，(2)55℃退火5sec，(3)72℃延伸60sec，步骤(1)～(3)共进行30个循环，4℃保存产物。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳分析验证后加入限内酶DpnI在37℃消化1h。将消化产物转入E.coli BL21(DE3)感受态细胞并涂布于含有卡那抗生素的平板中，置于37℃培养箱中静置培养约12h。将所得到的单克隆菌落挑取到96孔深孔板中进行培养，对表达的蛋白进行高通量活力筛选，对活性较高的突变体进行纯化表征，对相应的基因进行测序。

表1提供本发明公开的具有相关活性的特定序列的羰基还原酶LbCR突变体的列表。在下表中，序列标号分别指表1后面的一系列序列，在活性列中，一个加号“+”表示突变体蛋白比由序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列组成的蛋白质的比活力提高了0.1～1倍；两个加号“++”表示突变体蛋白比SEQ ID No.2所示氨基酸序列组成的蛋白质的比活力提高了1～2倍，三个加号“+++”表示突变体蛋白比SEQ ID No.2所示氨基酸序列组成的蛋白质的比活力提高了2～4倍。

表1：羰基还原酶SsCR突变体序列和相应的活性改进列表

实施例4羰基还原酶LbCR的诱导表达

将实施例2中所得的重组表达转化体E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbCR，接种至含50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃摇床振荡培养12小时，之后按1％(v/v)的接种量接种至装有100ml LB培养基的500ml三角瓶中，放入37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD₆₀₀达到0.6时，加入IPTG至终浓度0.2mmol/L进行诱导，16℃诱导24小时后，将培养液以8000rpm转速离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤，得到静息细胞，将其冷冻干燥，制得冻干细胞，其比活力为362U/g DCW。

将如上方法所得的静息细胞悬浮于pH 6.0的磷酸钾缓冲液中，冰水浴中进行超声破碎，离心收集上清液，即为重组羰基还原酶的粗酶液，酶活为2.2U/ml裂解液。所得粗酶液经聚丙烯酰胺凝胶电泳图分析，重组羰基还原酶以可溶的形式存在。

实施例5羰基还原酶LbCR_M1的诱导表达

将实施例3中所得的重组表达转化体E.coli BL21(DE3)/pET28a-LbCR _M1，接种至含50μg/ml卡那霉素的LB培养基中，37℃摇床振荡培养12小时，之后按1％(v/v)的接种量接种至装有100ml LB培养基的500ml三角瓶中，放入37℃、180rpm摇床振荡培养，当培养液的OD₆₀₀达到0.6时，加入IPTG至终浓度0.2mmol/L进行诱导，16℃诱导24小时后，将培养液以8000rpm转速离心，收集细胞，并用生理盐水洗涤，得到静息细胞，将其冷冻干燥，制得冻干细胞，其比活力为626U/g DCW。

实施例6 pH对LbCR催化活性和立体选择性的影响

在2mL离心管中进行反应，在1mL缓冲液(100mmol/L,柠檬酸钠-柠檬酸缓冲液pH5.5，磷酸钾缓冲液pH 6.0-7.5)中加入0.04ml如实施例4制备的LbCR粗酶液以及0.1U如文献(Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology,2011,38,633–641)报道的葡萄糖脱氢酶粗酶液，加入6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯、葡萄糖和NADP⁺至终浓度分别为20mmol/L、24mmol/L和1mmol/L。置于恒温混匀仪上，在30℃、1000rpm反应4小时，取样检测反应转化率和产物的de值，结果如表2所示。

表2 pH对LbCR不对称催化还原的影响

实施例7温度对LbCR催化活性和立体选择性的影响

在2mL离心管中进行反应，在1mL磷酸钾缓冲液(100mmol/L,pH 6.0)中加入0.04ml如实施例4制备的LbCR粗酶液以及0.1U如文献(Journal of Industrial Microbiologyand Biotechnology,2011,38,633–641)报道的葡萄糖脱氢酶粗酶液，加入6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯、葡萄糖和NADP⁺至终浓度分别为20mmol/L、24mmol/L和1mmol/L。置于恒温混匀仪上，分别在25℃、30℃或35℃，1000rpm反应4小时，取样检测反应转化率和产物的de值，反应结果如表3所示。

表3：温度对LbCR不对称催化还原的影响

实施例8重组还原酶LbCR_M1不对称还原6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯

羰基还原酶LbCR催化合成6-氰基-(3R,5R)-二羟基己酸叔丁酯的示意图如图2所示。

在2mL离心管中进行反应，在1mL磷酸钾缓冲液(100mmol/L,pH 6.0)中加入0.1U如实施例3所述的LbCR_M1粗酶液，以及0.1U的葡萄糖脱氢酶粗酶液，加入6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯、葡萄糖和NADP⁺至终浓度分别为20mmol/L、24mmol/L和1mmol/L。置于恒温混匀仪上，30℃、1000rpm反应。转化3.5小时，测得底物转化率为>99％，产物de值为>99％(R)。

实施例9～14 LbCR_M1催化的系列羰基化合物不对称还原反应

在10mL的磷酸钾缓冲液(100mmol/L,pH 6.0)中加入1U如实施例3所述的LbCR_M1(LbCR_M1指的是标号为M1的突变体)以及2U的葡萄糖脱氢酶，加入相应的羰基化合物底物至终浓度10mmol/L，并加入终浓度为12mmol/L的葡萄糖以及0.1mmol/L的NADP⁺。置于恒温混匀仪上，30℃、1000rpm反应12小时，终止反应，用等体积乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，加无水硫酸钠干燥过夜，测定底物转化率和还原产物的ee值。转化率与ee值的分析条件参考Adv Synth Catal 2014,356,1943-1948；Tetrahedron Asymmetry.2014,25,1501-1504。结果见表4：

表4 LbCR_M1催化系列羰基化合物不对称还原反应的结果

实施例15冻干细胞催化还原100mmol/L 6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯

在含100mmol/L底物6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯(23g/L)和120mmol/L葡萄糖(21.6g/L)的10mL的磷酸钾缓冲液(100mmol/L,pH 6.0)中，加入0.16g如实施例5所述重组表达转化体(E.coli BL21/pET28a-LbCR_M1)的冻干细胞，0.055g葡萄糖脱氢酶的冻干细胞。磁力搅拌下于30℃进行反应，通过自动电位滴定仪控制流加2mol/L的碳酸钾溶液使pH控制在6.0。反应1小时后，加入等量乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥过夜。用高效液相测得：底物转化率为>99％，产物de值为>99％。

实施例16冻干细胞催化还原300g/L 6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯

在含300g/L底物6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯(1.3M)和281g/L葡萄糖(1.56mol/L)的10mL的磷酸钾缓冲液(100mmol/L,pH 6.0)中，加入0.16g如实施例5所述重组表达转化体(E.coli BL21/pET28a-LbCR_M1)的冻干细胞，0.055g葡萄糖脱氢酶的冻干细胞。磁力搅拌下于30℃进行反应，通过自动电位滴定仪控制流加2mol/L的碳酸钾溶液使pH控制在6.0。反应16小时后，加入等量乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥过夜。用高效液相测得：底物转化率为>99％，产物de值为>99％。

实施例17冻干细胞催化还原300g/L 6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯

在含300g/L底物6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯(1.3M)和281g/L葡萄糖(1.56mol/L)的100mL的磷酸钾缓冲液(100mmol/L,pH 6.0)中，加入1.6g如实施例4所述重组表达转化体(E.coli BL21/pET28a-LbCR_M1)的冻干细胞，0.55g葡萄糖脱氢酶的冻干细胞。30℃下机械搅拌反应，通过自动电位滴定仪控制流加2mol/L的碳酸钾溶液使pH控制在6.0。反应16小时后，加入等量乙酸乙酯萃取两次，合并萃取液，加入无水硫酸钠干燥过夜。旋转蒸发除去溶剂，精制后获得产品27g，收率90％，产品的化学纯度为98.4％，de值>99％。

上述的对实施例的描述是为便于该技术领域的普通技术人员能理解和使用发明。熟悉本领域技术的人员显然可以容易地对这些实施例做出各种修改，并把在此说明的一般原理应用到其他实施例中而不必经过创造性的劳动。因此，本发明不限于上述实施例，本领域技术人员根据本发明的揭示，不脱离本发明范畴所做出的改进和修改都应该在本发明的保护范围之内。

<110> 华东理工大学、苏州百福安酶技术有限公司

<120>一种羰基还原酶、突变体及其在制备他汀合成中间体中的应用

<160>4

<170>PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 750

<212> DNA

<213> 短乳杆菌 (Lactobacillus brevis)

<400> 1

atgacagatc gtttgaaaga taaagtggca attattaccg gcggcgttgc tggtattggg 60

ttaggcatcg ctgaatgtta cgtgcgtgaa ggcgctaaag ttgtggtaac cgctaaccat 120

aatgtggatg gcgggcgtgc agccgttgcc aagtttggtg acgatgtcag tctgtttgtt 180

caacaggatg tgtccaaaga agctgactgg caaaaggtga ttgatgccac cattgccaaa 240

tttggccggg tggatattct cgtgaacaat gccggaatcg gtggcgttaa tacggctatc 300

gaggacttgg acttagctga ttggcagaag gtcattgacg tcaacttgac ggctaacttc 360

ttgggcgaaa aggccgccat taaggcaatg aagcagacgg cagatgctaa aggttccatc 420

atcaatgtgt cttctgtcgc gggcttagtt ggtttgccga tggccccagc gtactctgct 480

agtaaagggg ggagtcgctt gttaactcac gcgacggccc tgaacctggc gcaacggggc 540

attgacattc gggttaactc ggttcatccc gggtggattg atacttcgat tgtaccggaa 600

ggtgctcgtg atcagattat tgcgacgatt ccagttggtc acatggggca accacaagat 660

atcggtgagg tttgtgttta ccttggtagc gatgagtcac gatttgccaa cggtgccgaa 720

tttacggttg acggtggtca acgcgcttaa 750

<210> 2

<211> 249

<212> PRT

<213> 短乳杆菌 (Lactobacillus brevis)

<400> 2

Met Thr Asp Arg Leu Lys Asp Lys Val Ala Ile Ile Thr Gly Gly

5 10 15

Val Ala Gly Ile Gly Leu Gly Ile Ala Glu Cys Tyr Val Arg Glu

20 25 30

Gly Ala Lys Val Val Val Thr Ala Asn His Asn Val Asp Gly Gly

35 40 45

Arg Ala Ala Val Ala Lys Phe Gly Asp Asp Val Ser Leu Phe Val

50 55 60

Gln Gln Asp Val Ser Lys Glu Ala Asp Trp Gln Lys Val Ile Asp

65 70 75

Ala Thr Ile Ala Lys Phe Gly Arg Val Asp Ile Leu Val Asn Asn

80 85 90

Ala Gly Ile Gly Gly Val Asn Thr Ala Ile Glu Asp Leu Asp Leu

95 100 105

Ala Asp Trp Gln Lys Val Ile Asp Val Asn Leu Thr Ala Asn Phe

110 115 120

Leu Gly Glu Lys Ala Ala Ile Lys Ala Met Lys Gln Thr Ala Asp

125 130 135

Ala Lys Gly Ser Ile Ile Asn Val Ser Ser Val Ala Gly Leu Val

140 145 150

Gly Leu Pro Met Ala Pro Ala Tyr Ser Ala Ser Lys Gly Gly Ser

155 160 165

Arg Leu Leu Thr His Ala Thr Ala Leu Asn Leu Ala Gln Arg Gly

170 175 180

Ile Asp Ile Arg Val Asn Ser Val His Pro Gly Trp Ile Asp Thr

185 190 195

Ser Ile Val Pro Glu Gly Ala Arg Asp Gln Ile Ile Ala Thr Ile

200 205 210

Pro Val Gly His Met Gly Gln Pro Gln Asp Ile Gly Glu Val Cys

215 220 225

Val Tyr Leu Gly Ser Asp Glu Ser Arg Phe Ala Asn Gly Ala Glu

230 235 240

Phe Thr Val Asp Gly Gly Gln Arg Ala

245 249

<210> 3

<211> 39

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

cgcggatcca tgacagatcg tttgaaagat aaagtggca

<210> 4

<211> 37

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

cccaagcttt taagcgcgtt gaccaccgtc aaccgta

Claims

1.一种羰基还原酶，其特征在于，所述羰基还原酶是具有如下序列的蛋白质：

(1)具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列；

2.一种分离的核酸，其特征在于，所述的核酸是编码如权利要求1所述羰基还原酶的核酸分子。

3.一种重组表达载体，其特征在于，其包含如权利要求2所述的核酸序列。

4.一种重组表达转化体，其特征在于，其包含如权利要求3所述的重组表达载体。

5.一种重组羰基还原酶催化剂的制备方法，其特征在于，所述方法包括：培养如权利要求4所述的重组表达转化体，分离表达的重组羰基还原酶。

6.一种羰基还原酶作为催化剂催化羰基化合物不对称还原制备手性羟基化合物的应用；

所述羰基还原酶是具有如下序列的蛋白质：

(1)具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列；

(17)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第154位的甲硫氨酸替换为异亮氨酸，第155位的丙氨酸替换为天冬氨酸，第201位的甘氨酸替换为天冬氨酸，第202位的丙氨酸替换为亮氨酸，第204位的天冬氨酸替换为赖氨酸；

(18)将如序列表中SEQ ID No.2所示氨基酸序列的第201位的甘氨酸替换为丙氨酸，第204位的天冬氨酸替换为赖氨酸；

所述的羰基化合物具有以下通式：

其中，其中R₁选自-CH₃或-C₆H₅，R₂为-CH₃、-CH₂Cl或-C₆H₅，R₃为-CH₂CH₃或-C(CH₃)₃，R₄为-CH₃。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述羰基还原酶催化羰基化合物不对称还原的反应在葡萄糖脱氢酶、葡萄糖和NADP⁺的存在下进行。

8.如权利要求6或7所述的应用，其特征在于，所述羰基化合物的浓度为1～1300mmol/L，所述羰基还原酶的用量为4～100U/mmol羰基化合物，反应温度25～35℃，pH 5.5～7.5。

9.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述式4的化合物为6-氰基-(5R)-羟基-3-羰基己酸叔丁酯。