CN117230031B - 羰基还原酶突变体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物工程领域，具体涉及羰基还原酶突变体及其应用。具体地，本发明提供了一种催化8‑氯‑6‑氧代辛酸乙酯制备(R)‑8‑氯‑6‑羟基辛酸乙酯的羰基还原酶突变体，所述的突变体蛋白为非天然蛋白，并且所述突变体蛋白在初始羰基还原酶的3个与酶催化活性相关的核心氨基酸发生突变。本发明的有益效果在于，本发明所提供的羰基还原酶突变体具有高效催化8‑氯‑6‑氧代辛酸乙酯制备硫辛酸前体物质(R)‑8‑氯‑6‑羟基辛酸乙酯的特点，其可高效催化8‑氯‑6‑氧代辛酸的氧化还原反应，产物时空收率达到99.9 g·L‑1·h‑1以上。
Description
技术领域
本发明属于生物工程领域，具体涉及一种羰基还原酶突变体及其在制备硫辛酸前体中的应用。
背景技术
硫辛酸作为一种万能抗氧化剂，对治疗糖尿病等疾病有明显效果，在药物、化妆品等行业有极高的应用价值，但是只有R构型有生理活性。当前世界各国对药品和保健品的使用标准提高，企业对（R）-硫辛酸合成技术的需求也逐渐增加，以改变当前市场上主要以硫辛酸外消旋体形式流通的模式。2015年许建和等人（Y. J. Zhang, W. X. Zhang, G. W.Zheng, J. H. Xu, Advanced Synthesis&Catalysis. 2015, 357, 1697-1702.）提出以8-氯-6-氧代辛酸乙酯为原料、经生物酶的催化合成（R）-8-氯-6-羟基辛酸乙酯、再结合后续的化学反应合成（R）-α-硫辛酸，是一条有竞争力的合成路线（工艺路线如附图1）。
然而，目前只有两个羰基还原酶可以制备高纯度（R）-8-氯-6-羟基辛酸乙酯，如果能开发出催化能力更强的（R）-α-硫辛酸前体的生物酶用于生产将极大的提高硫辛酸工业化制备的效率，对（R）-α-硫辛酸市场的发展具有重要意义。
发明内容
为了实现以8-氯-6氧代辛酸乙酯为原料制备硫辛酸前体物质（R）-8-氯-6-羟基辛酸乙酯，本发明开发了能够高效催化8-氯-6氧代辛酸乙酯反应制备（R）-8-氯-6-羟基辛酸乙酯的羰基还原酶突变体。
本发明所提供的羰基还原酶突变体，其蛋白质的氨基酸序列选择如下序列之一：
（1）将如SEQ ID No:3所示氨基酸序列的第129位精氨酸替换为亮氨酸，同时第210位天冬氨酸替换为苏氨酸；
（2）将如SEQ ID No:5所示氨基酸序列的第129位精氨酸替换为亮氨酸，第210位天冬氨酸替换为苏氨酸，同时第126位丝氨酸替换为丙氨酸。
所述羰基还原酶突变体的编码基因的核苷酸序列，如SEQ ID NO:4、SEQ ID:6所示。
此外，本发明还提供了上述的羰基还原酶突变体的制备方法，包括如下步骤：合成初始羰基还原酶的编码基因，初始羰基还原酶编码基因定点突变，构建表达载体，转化蛋白表达宿主菌，诱导蛋白表达。
本发明从Genbank中ID为XP_003867714.1的假丝酵母菌，Candida orthopsilosisCo 90-125（氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示）的羰基还原酶蛋白结构的底物通道入手，分析了底物通道入口段及通道内部结构特点，通过半理性设计对其进行迭代饱和突变，确定了影响初始羰基还原酶酶学性质的关键是第R129、D210、S126三个位点的氨基酸，然后通过密码子替换将129位点的精氨酸（Arg）变为亮氨酸（Leu），210位点的天冬氨酸（Asp）变为苏氨酸（Thr），获得了具有高活性的羰基还原酶突变体目的基因R129L/D210T（氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示），以及在此基础上，126位点的丝氨酸（Ser）变为丙氨酸（Ala），得到的三突变体R129L/D210T/S126A（氨基酸序列如SEQID NO:5所示）。
进一步的，本发明还利用分子克隆技术获得了双突变体的编码基因（SEQ ID NO:4）以及三突变R129L/D210T/S126A的基因编码（SEQ ID NO:6），并通过构建突变体基因的6×His融合表达载体并导入基因工程菌E.coliOver Express C43（DE3）中诱导表达，获得了两个突变体酶蛋白，以突变体为催化剂、以8-氯-6-氧代辛酸乙酯为底物在适当的条件下进行酶催化反应。结果表明，该双突变体和三突变体合成的(R)-8-氯-6-羟基辛酸乙酯ee值较初始酶的86.44± 5.41%提高到>99.5%，催化效率较初始羰基还原酶分别提高了31.65倍、93.42倍，在放大反应中（50 mL），时空收率高达99.9 g·L-1·h-1，在（R）-硫辛酸的工业生产中都有巨大的应用潜力和价值。
本发明以上所提及的编码羰基还原酶突变体的基因、基因的核苷酸序列SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:6，均为本发明所要重点保护的内容。此外，包含所述基因的表达盒、载体或者重组菌同样落入本发明所保护的技术范围中。
同理，包含了上述羰基还原酶突变体的催化剂，同样是本发明所保护的技术内容。
更进一步地，本发明还提供了上述羰基还原酶突变体或包含了上述羰基还原酶突变体的催化剂在8-氯-6-氧代辛酸乙酯反应中的应用。
所述的应用具体是：使用上述的羰基还原酶突变体或包含了上述羰基还原酶突变体的催化剂，以8-氯-6-氧代辛酸乙酯为底物进行催化反应，合成硫辛酸前体（R）-8-氯-6-羟基辛酸乙酯。
进一步的，上述催化反应在25~30℃、pH=7.0~7.5、8-氯-6-氧代辛酸乙酯浓度为33.3 g/L的条件下进行。
本发明的有益效果在于：
通过对羰基还原酶的改造，实现了以8-氯-6-氧代辛酸乙酯为原料生产（R）-α-硫辛酸前体物质（R）-8-氯-6-羟基辛酸乙酯的高效催化，将显著提高（R）-α-硫辛酸前体的生产效率。
附图说明
图1为酶催化合成（R）-8-氯-6-羟基辛酸乙酯的示意图；
图2为羰基还原酶突变体R129L/D210T 2 mL反应催化产物的气相色谱图；
图3为羰基还原酶突变体R129L/D210T/S126A 2mL反应催化产物的气相色谱图；
图4为羰基还原酶突变体R129L/D210T/S126A 50 mL反应催化产物的气相色谱图；
图5为羰基还原酶突变体R129L/D210T 2 mL反应催化合成不同构型产物高效液相图谱；
图6为羰基还原酶突变体R129L/D210T/S126A 2 mL反应催化合成不同构型产物高效液相图谱；
图7为羰基还原酶突变体R129L/D210T/S126A 50 mL反应催化合成不同构型产物高效液相图谱。
具体实施方式
为了能使本领域技术人员更好的理解本发明，现结合具体实施方式对本发明进行更进一步的阐述。
下面结合具体实施例进一步描述本发明，需要声明的是，下述实施例仅作为解释和说明，不以任何方式限制本发明的范围。
主要试剂与耗材：Phanta®Max Super-Fidelity DNA polymerase P505购买自南京诺唯赞生物科技有限公司；FastDigest DpnI DNA内切酶（货号：FD1703）购买自ThermoFisher Scientific公司；pET28（a）质粒为已知的大肠杆菌表达载体，载体大小为5369 bp，T7启动子，载体标签N-6×His和C-6×His，载体抗性Kanamycin（卡那霉素），购自Novogen公司；E.coliDH5α感受态细胞（货号：G6016），E.coliRosetta（DE3）感受态细胞（货号：G6031），E.coliOverexpress C43（DE3）感受态细胞（货号：X17016）均购买自昂羽生物公司；琼脂粉（货号：A8190），购买自Solarbio公司；TRYPTONE（货号：LP0042）和YEAST EXTRACT（货号：LP0021）均购买自OXOID公司，NaCl（货号：10019318）、K2HPO4·3H2O（货号：10017518）、KH2PO4（货号：10017618）和丙三醇（货号：10010618）等试剂均购买自国药集团化学试剂有限公司。
LB培养基
每100 mL LB培养基含有：1 g胰蛋白胨、0.5 g酵母提取物和1 g NaCl，pH=7.0~7.2。
配制方法：在1 L蒸馏水中溶解10 g胰蛋白胨、5 g酵母提取物，10 g NaCl，不调节pH值，121℃高压蒸汽灭菌20 min。若配制固体培养基，则100 mL培养基中加入1.8 g琼脂粉。
若未特别说明，以下实施例中使用的试剂均为本领域常规试剂，可商购获得或按照本领域常规方法配制而得，规格为实验室纯级即可。若未特别说明，以下实施例中使用的方法均为本领域常规方法，使用的实验条件均为本领域常规实验条件，可参考相关实验手册或厂商说明书。
实施例1羰基还原酶突变体的制备
一、羰基还原酶突变体设计
通过基因挖掘，从NCBI数据库中筛选获得了Genbank ID为XP_003867714.1的羰基还原酶基因，该基因的开放阅读框全长1005 bp，其编码的羰基还原酶由334个氨基酸组成，其氨基酸序列(334aa)为：
MPVFISGATGFIAQHVIKELLNDGFQVIGSVRSKAKGEYLSSLIKSKKFSYAVVPDIVATGAFDQVLQENQDIDSFIHTASPVDFQVSDVQTGLLDPAIEGTKNVLIAIEKYGKNVKNVVVTSSTSAVRDSSGSRPSNSLLTEASWNEITLEQGLKSARLGYSAAKTFAEKEVWKFAAEHNGTFNITTVNPTYVFGPQAFEVQNKSQLNDSAEYVNNIFKLKPNDDIPMFVGLFIDVRDVAKAHVAAIKKPKEFNGQRLVLINSAWTNELLAVIINKHFPNVDIPKGNIEKSDEELKKADLKWDNSKTKKLLGYSFIPIEKSVVDAVQQLLDTE(SEQ ID NO:1)。
编码该羰基还原酶的核苷酸序列为：
atgccggttttcatcagcggcgcgaccggtttcatcgcgcagcacgttatcaaagaactgctgaacgatggtttccaggttatcggtagcgttcgttctaaagcgaaaggcgaatacctgagcagcctgatcaaatctaaaaaattctcttacgcggttgttccggatatcgttgcgaccggcgcgttcgatcaggttctgcaggaaaaccaggatatcgatagcttcatccacaccgcttctccggttgatttccaggttagcgatgttcagaccggtctgctggatccggcgatcgaaggtaccaaaaacgttctgatcgcgatcgaaaaatacggtaaaaacgttaaaaacgttgttgttacctcttccaccagcgcggttcgtgacagcagcggtagccgtccgtctaacagcctgctgaccgaagcgagctggaacgaaatcaccctggaacagggtctgaaatctgcgcgtctgggctacagcgcggcgaaaaccttcgcagaaaaagaagtgtggaaattcgcggcggaacacaacggcaccttcaacatcaccaccgttaacccgacctacgttttcggtccgcaggcgttcgaagttcagaacaaaagccagctgaacgattctgctgaatacgttaacaacatcttcaaactgaaaccgaacgatgatatcccgatgttcgttggcctgttcatcgatgtgcgtgatgttgcgaaagcgcacgttgcggcgatcaaaaaaccgaaagaatttaacggccagcgtctggtgctgatcaacagcgcatggaccaacgaactgctggcggttatcatcaacaaacacttcccgaacgttgatatcccgaaaggcaacatcgaaaaaagcgatgaagaactgaaaaaagcggatctgaaatgggataactctaaaaccaaaaaactgctgggctacagcttcatcccgatcgaaaaaagcgtggttgatgcggttcagcagctgctggataccgaataa (SEQ ID NO:2)。
本发明通过分析该羰基还原酶的蛋白三维结构，确定了影响初始羰基还原酶酶学性质的关键是底物通道空间位阻，通过对底物通道入口及通道内部选取突变位点，采取带迭代饱和突变的方法确定了R129、D210以及S126位点的关键作用，其中R129L/D210T、R129L/D210T/S126A这两个突变体展现出较好的催化性能酶活性能。
R129其对应的核苷酸序列为第385-387位密码子，D210对应的核苷酸序列为第628-630位密码子，S126对应的核苷酸序列为第376-378位密码子。
双突变R129L/D210T将该羰基还原酶基因序列的第385-387处密码子由CGT更改为CTG，从而将氨基酸序列的第129位由原来的精氨酸（R）替换成亮氨酸（L），第628-630位密码子由GAT更改为ACC，从而将氨基酸序列的第210位由原来天冬氨酸（D）替换成苏氨酸（T），得到酶突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
而三突变在该羰基还原酶双突变体基因序列的第376-378位密码子由AGC更改为GCG，从而将氨基酸序列的第126位由原来的丝氨酸（S）替换成丙氨酸（A），得到三突变体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示。
SEQ ID NO:3
MPVFISGATGFIAQHVIKELLNDGFQVIGSVRSKAKGEYLSSLIKSKKFSYAVVPDIVATGAFDQVLQENQDIDSFIHTASPVDFQVSDVQTGLLDPAIEGTKNVLIAIEKYGKNVKNVVVTSSTSAVLDSSGSRPSNSLLTEASWNEITLEQGLKSARLGYSAAKTFAEKEVWKFAAEHNGTFNITTVNPTYVFGPQAFEVQNKSQLNTSAEYVNNIFKLKPNDDIPMFVGLFIDVRDVAKAHVAAIKKPKEFNGQRLVLINSAWTNELLAVIINKHFPNVDIPKGNIEKSDEELKKADLKWDNSKTKKLLGYSFIPIEKSVVDAVQQLLDTE (SEQ ID NO:3)。
SEQ ID NO:4
atgccggttttcatcagcggcgcgaccggtttcatcgcgcagcacgttatcaaagaactgctgaacgatggtttccaggttatcggtagcgttcgttctaaagcgaaaggcgaatacctgagcagcctgatcaaatctaaaaaattctcttacgcggttgttccggatatcgttgcgaccggcgcgttcgatcaggttctgcaggaaaaccaggatatcgatagcttcatccacaccgcttctccggttgatttccaggttagcgatgttcagaccggtctgctggatccggcgatcgaaggtaccaaaaacgttctgatcgcgatcgaaaaatacggtaaaaacgttaaaaacgttgttgttacctcttccaccagcgcggttctggacagcagcggtagccgtccgtctaacagcctgctgaccgaagcgagctggaacgaaatcaccctggaacagggtctgaaatctgcgcgtctgggctacagcgcggcgaaaaccttcgcagaaaaagaagtgtggaaattcgcggcggaacacaacggcaccttcaacatcaccaccgttaacccgacctacgttttcggtccgcaggcgttcgaagttcagaacaaaagccagctgaacacctctgctgaatacgttaacaacatcttcaaactgaaaccgaacgatgatatcccgatgttcgttggcctgttcatcgatgtgcgtgatgttgcgaaagcgcacgttgcggcgatcaaaaaaccgaaagaatttaacggccagcgtctggtgctgatcaacagcgcatggaccaacgaactgctggcggttatcatcaacaaacacttcccgaacgttgatatcccgaaaggcaacatcgaaaaaagcgatgaagaactgaaaaaagcggatctgaaatgggataactctaaaaccaaaaaactgctgggctacagcttcatcccgatcgaaaaaagcgtggttgatgcggttcagcagctgctggataccgaataa(SEQ ID NO:4)。
SEQ ID NO:5
MPVFISGATGFIAQHVIKELLNDGFQVIGSVRSKAKGEYLSSLIKSKKFSYAVVPDIVATGAFDQVLQENQDIDSFIHTASPVDFQVSDVQTGLLDPAIEGTKNVLIAIEKYGKNVKNVVVTSSTAAVLDSSGSRPSNSLLTEASWNEITLEQGLKSARLGYSAAKTFAEKEVWKFAAEHNGTFNITTVNPTYVFGPQAFEVQNKSQLNTSAEYVNNIFKLKPNDDIPMFVGLFIDVRDVAKAHVAAIKKPKEFNGQRLVLINSAWTNELLAVIINKHFPNVDIPKGNIEKSDEELKKADLKWDNSKTKKLLGYSFIPIEKSVVDAVQQLLDTE(SEQ ID NO:5)。
SEQ ID NO:6
atgccggttttcatcagcggcgcgaccggtttcatcgcgcagcacgttatcaaagaactgctgaacgatggtttccaggttatcggtagcgttcgttctaaagcgaaaggcgaatacctgagcagcctgatcaaatctaaaaaattctcttacgcggttgttccggatatcgttgcgaccggcgcgttcgatcaggttctgcaggaaaaccaggatatcgatagcttcatccacaccgcttctccggttgatttccaggttagcgatgttcagaccggtctgctggatccggcgatcgaaggtaccaaaaacgttctgatcgcgatcgaaaaatacggtaaaaacgttaaaaacgttgttgttacctcttccaccgcggcggttctggacagcagcggtagccgtccgtctaacagcctgctgaccgaagcgagctggaacgaaatcaccctggaacagggtctgaaatctgcgcgtctgggctacagcgcggcgaaaaccttcgcagaaaaagaagtgtggaaattcgcggcggaacacaacggcaccttcaacatcaccaccgttaacccgacctacgttttcggtccgcaggcgttcgaagttcagaacaaaagccagctgaacacctctgctgaatacgttaacaacatcttcaaactgaaaccgaacgatgatatcccgatgttcgttggcctgttcatcgatgtgcgtgatgttgcgaaagcgcacgttgcggcgatcaaaaaaccgaaagaatttaacggccagcgtctggtgctgatcaacagcgcatggaccaacgaactgctggcggttatcatcaacaaacacttcccgaacgttgatatcccgaaaggcaacatcgaaaaaagcgatgaagaactgaaaaaagcggatctgaaatgggataactctaaaaccaaaaaactgctgggctacagcttcatcccgatcgaaaaaagcgtggttgatgcggttcagcagctgctggataccgaataa(SEQ ID NO:6)。
二、羰基还原酶突变体基因的获得
羰基还原酶突变体基因可以通过全基因合成方法或分子克隆方法获得。本实验采用全基因合成方法获得Genbank ID为XP_003867714.1的羰基还原酶基因，采用PCR法获得羰基还原酶突变体基因。
1、初始羰基还原酶全基因合成
对Genbank ID为XP_003867714.1的羰基还原酶进行全基因合成，合成后的基因片段连入pET28a(+)质粒中。委托生工生物工程（上海）股份有限公司合成上述基因。
2、羰基还原酶定点突变
（1）定点突变引物设计
表1 突变体引物设计
（2）羰基还原酶定点突变
以含有初始羰基还原酶基因的pET28a(+)质粒为模板，采用步骤（1）获得的上游引物和下游引物，按照下列PCR体系和程序扩增羰基还原酶突变体基因。
PCR体系：Phanta®Max Super-Fidelity DNA polymerase P505 0.5 μL，模板质粒0.6 μL，上游引物-F（10 μM）1 μL，下游引物-R（10 μM）1 μL，2×PCR Buffer 12.5 μL，dNTPmix 0.5 μL,ddH2O 8.9 μL。
PCR程序如下：a. 95℃预变性5 min；b. 95℃变性30 sec，55℃退火30 sec, 72℃延伸3.75 min，20个循环；c.72℃延伸10 min，降温至4℃，使用DpnI酶消化含有初始羰基还原酶基因的模板质粒，37℃，消化30 min。
（3）DH5α感受态细胞转化
将步骤（2）获得的含有羰基还原酶突变体的pET28a(+)质粒的消化产物转化到DH5α感受态细胞中。
将DH5α感受态细胞放置于冰上，待细胞融化后加入15 μL质粒溶液，冰上放置30min，42℃热激45s，然后冰上静置2 min，加入700 μL无菌LB液体培养基，37℃，200 rpm摇床中培养1 h，4000 rpm离心1min，留200 μL上清，将沉淀的菌体与上清混匀后全部涂布于含有Kana抗性（50 μg/mL）的LB平板培养基上，37℃倒置培养过夜。
（4）阳性克隆筛选
挑取LB平板上的单菌落，接种于含有Kana抗性（50 μg/mL）LB液体培养基中，37℃，200 rpm摇床过夜培养，保菌（无菌甘油终浓度15%）后送金唯智（中国，苏州）公司测序，鉴定初始羰基还原酶是否突变成功。测序成功要求公司返还质粒。
3、羰基还原酶突变体6×His融合蛋白的异源表达
（1）蛋白表达感受态细胞转化
从-80℃超低温冰箱中分别取出Overexpress C43（DE3）感受态细胞，冰上放置，待细胞融化后，分别向每种感受态细胞中加入1 μL含有羰基还原酶突变体的pET28a(+)质粒，冰上放置30 min,42℃热激45 s，然后冰上放置2 min，加入700μL无菌LB液体培养基，37℃，200 rpm摇床培养1 h，吸取200 μL培养好的菌液，涂布于含有Kana抗性（50 μg/mL）的LB平板培养基上，37℃倒置培养过夜。
（2）羰基还原酶突变体表达菌株保存
挑取LB平板上的单菌落，接种于含有Kana抗性（50 μg/mL）LB液体培养基的试管中，37℃，200 rpm摇床过夜培养，用作羰基还原酶突变体的表达菌株，向菌液中加入终体积浓度为15%的无菌丙三醇，-80℃超低温冰箱中长期保存。
（3）蛋白表达
将过夜培养的试管菌液接入50 mL无菌LB液体培养基中（接种量1%），卡那霉素终浓度为50 μg/mL，37℃，200 rpm培养2.5 h左右，待OD600=0.6-0.8时，加入终浓度为0.1 mM的无菌IPTG，28℃，200 rpm诱导培养6 h. 8000 rpm离心10 min收集菌体。
实施例2羰基还原酶CoCR 13及其突变体酶活及动力学参数测定
(1) 酶活测定
羰基还原酶酶活力测定体系如下：150 μL PB缓冲液(100 mM，pH7.0)，10 μLNADPH (0.25 g/L)，20 μL 8-氯-6-氧代辛酸乙酯（2.5 mM，溶解于DMF），20 μL纯化的突变体酶液，混合体系加入96孔板。在30℃用酶标仪检测监测6 min内在340nm处吸光值的下降，根据标曲计算反应消耗NADPH的量。
一个酶活单位U定义为：1分钟内消耗1μmol NADPH所需要的酶量。
(2) 动力学参数
设定底物浓度为0.1-10 mM，其余与上述酶活测定体系、反应条件相同。
结论：氨基酸序列如SEQIDNO:3和SEQIDNO:5所示的羰基还原酶突变体，相比于野生型的羰基还原酶对8-氯-6-氧代辛酸乙酯具有较高的催化还原活性和催化效率。
表2 初始羰基还原酶及突变体酶活及动力学参数
实施例3羰基还原酶CoCR 13及其突变体R129L/D210T/S126A最适温度、pH测定
（1）最适温度
在实施例2中的酶活测定体系下，除纯酶液外，其余成分在以下温度（20℃-50℃）中孵育10 min且酶标仪设定相同温度下测定酶活，30℃时酶活为标准100%，测定不同温度下的酶活。
野生型最适温度为30℃，三突变R129L/D210T/S126A最适温度为30℃。
（2）最适pH
在实施例二中缓冲液更换为柠檬酸-柠檬酸盐缓冲体系（pH4.0-6.0）、磷酸盐缓冲体系（pH6.0-8.0）、Tris-HCl缓冲体系（pH8.0-9.0）条件下，测定酶活，以PB（pH7.0）酶活为标准100%。
结果：CoCR 13最适的pH为7.0，R129L/D210T/S126A最适pH为7.5。
实施例4利用羰基还原酶突变体合成8-氯-6-羟基辛酸乙酯及检测
1、8-氯-6-羟基辛酸乙酯的合成
（1）2 mL反应体系：取200 mM PB（pH7.0），羰基还原酶CoCR 13或实施例1中双突变体R129L/D210T或三突变体R129L/D210T/S126A 50 g/L，实验室保存的GDH 25 g/L，150mM8-氯-6-氧代辛酸乙酯，225 mM葡糖糖，0.25 g/L NADP+，1.5% DMF，于5 mLEP管中，温度30℃，转速250 rpm，过夜反应，反应液中加入2 mL乙酸乙酯充分萃取，6000 rpm离心5min取上清检测。
（2）50 mL反应体系：200 mM PBS（pH7.5），实施例1中羰基还原酶突变体R129L/D210T/S126A 20 g/L,实验室保存的GDH 10 g/L，150mM 8-氯-6-氧代辛酸乙酯，225 mM葡糖糖，0.1 g/L NADP+，1.5% DMF，于250 mL反应釜中，温度30℃，转速500 rpm反应20min，反应液中加入相同体积乙酸乙酯充分萃取，6000 rpm离心5min取上清检测。
2、8-氯-6-羟基辛酸乙酯的检测
利用GC检测样品中8-氯-6-羟基辛酸乙酯的含量。
GC仪器型号：安捷伦7890B。
参数设置：色谱柱：DB-624UI（30 ×0.32 mm×1.8μm）；柱温200℃保持5min，以20℃/min升温至250℃，保持10 min；进样口240℃；恒压100 Kpa，分流比25：1；FID：260℃。
根据峰面积确定样品中底物8-氯-6-氧代辛酸乙酯和产物8-氯-6-羟基辛酸乙酯的含量，气相色谱结果如图2、3、4所示。
附图2~4所对应的色谱图中，底物8-氯-6-氧代辛酸乙酯和产物8-氯-6-羟基辛酸乙酯的峰信息分别如下表3~5所示。
表3 附图2色谱图对应的底物与产物的峰信息
表4 附图3色谱图对应的底物与产物的峰信息
表5 附图4色谱图对应的底物与产物的峰信息
其中，图2为羰基还原酶突变体R129L/D210T 2 mL反应催化产物的气相色谱图，8-氯-6-羟基辛酸乙酯的保留时间为5.872 min；
图3为羰基还原酶突变体R129L/D210T/S126A 2mL反应催化产物的气相色谱图，8-氯-6-羟基辛酸乙酯的保留时间为8.351 min；
图4为羰基还原酶突变体R129L/D210T/S126A 50 mL反应催化产物的气相色谱图，8-氯-6-羟基辛酸乙酯的保留时间为8.277 min。
从图2~4中可以看出，经改造的不同种类的羰基还原酶突变体均能够成功合成8-氯-6-羟基辛酸乙酯。
另外，利用HPLC检测样品中8-氯-6-羟基辛酸乙酯的手性构型。
HPLC仪器型号：赛默飞u3000。
参数设置：色谱柱：大赛璐IA（250×4.6 mm，5 μm）；波长210 nm；流动相：正己烷：异丙醇=95：5；流速0.8 mL/min。
根据峰面积确定样品中不同构型8-氯-6-羟基辛酸乙酯的含量，高效液相色谱结果如图5、6、7所示。
附图5~7所对应的色谱图中，不同构型8-氯-6-羟基辛酸乙酯的峰信息分别如下表6~8所示。
表6 附图5色谱图对应的底物与产物的峰信息
表7 附图6色谱图对应的底物与产物的峰信息
表8 附图7色谱图对应的底物与产物的峰信息
其中，图5为羰基还原酶突变体R129L/D210T 2 mL反应催化合成不同构型产物高效液相图谱，（R）-8-氯-6-羟基辛酸乙酯的保留时间为14.177 min，（S）-8-氯-6-羟基辛酸乙酯的保留时间为15.985 min；
图6为羰基还原酶突变体R129L/D210T/S126A 2 mL反应催化合成不同构型产物高效液相图谱，（R）-8-氯-6-羟基辛酸乙酯的保留时间为14.427 min，（S）-8-氯-6-羟基辛酸乙酯的保留时间为16.202 min；
图7为羰基还原酶突变体R129L/D210T/S126A 50 mL反应催化合成不同构型产物高效液相图谱，（R）-8-氯-6-羟基辛酸乙酯的保留时间为14.995 min，（S）-8-氯-6-羟基辛酸乙酯的保留时间为16.202 min。
从附图5~7中可以看出，采用本发明所制备的羰基还原酶突变体制备出的8-氯-6-羟基辛酸乙酯的主要构型为R型，即（R）-8-氯-6-羟基辛酸乙酯，（S）-8-氯-6-羟基辛酸乙酯的含量极少，即本发明的羰基还原酶突变体能够成功催化原料8-氯-6-氧代辛酸乙酯生成（R）-8-氯-6-羟基辛酸乙酯。
Claims (10)
1.羰基还原酶突变体，其特征在于，所述的羰基还原酶突变体，其蛋白质的氨基酸序列选择如下序列之一：
（1）如SEQ ID NO:3所示；
（2）如SEQ ID NO:5所示。
2.编码权利要求1所述的羰基还原酶突变体的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6所示。
4.包含权利要求2所述基因的表达盒、载体或重组菌。
5.权利要求1所述的羰基还原酶突变体的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：合成初始羰基还原酶的编码基因，初始羰基还原酶编码基因定点突变，构建表达载体，转化蛋白表达宿主菌，诱导蛋白表达。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述羰基还原酶突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:4、SEQ ID:6所示。
7.权利要求1所述的羰基还原酶突变体在8-氯-6-氧代辛酸乙酯反应中的应用，其特征在于，使用羰基还原酶突变体，以8-氯-6-氧代辛酸乙酯为底物进行催化反应，合成硫辛酸前体（R）-8-氯-6-羟基辛酸乙酯。
8.一种催化剂，其特征在于，其有效成分包含权利要求1所述的羰基还原酶突变体。
9.权利要求8所述的催化剂在8-氯-6-氧代辛酸乙酯反应中的应用，使用催化剂，以8-氯-6-氧代辛酸乙酯为底物进行催化反应，合成硫辛酸前体（R）-8-氯-6-羟基辛酸乙酯。
10.根据权利要求7或9中任一项所述的应用，其特征在于，以8-氯-6-氧代辛酸乙酯为底物进行催化反应，合成硫辛酸前体（R）-8-氯-6-羟基辛酸乙酯，所述催化反应在25~30℃、pH=7.0~7.5、8-氯-6-氧代辛酸乙酯浓度为33.3 g/L的条件下进行。
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Citations (4)
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| WO2004028339A2 (en) * | 2002-09-27 | 2004-04-08 | Brigham And Women's Hospital, Inc. | Treatment of patients with multiple sclerosis based on gene expression changes in central nervous system tissues |
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-
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Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2004028339A2 (en) * | 2002-09-27 | 2004-04-08 | Brigham And Women's Hospital, Inc. | Treatment of patients with multiple sclerosis based on gene expression changes in central nervous system tissues |
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Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| "近平滑假丝酵母 ATCC 7330 羰基还原酶 CpCR 突变体酶的稳定性研究";龚大春等;《食品与发酵工业》;第48卷(第2期);第59-64页 * |
| Riccombeni,A. et al.."NADPH-dependent methylglyoxal reductase [Candida orthopsilosis Co 90-125] XP_003867714.1".《NCBI》.2017,第1-2页. * |
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