KR20190074917A

KR20190074917A - 에탄올에서 아세토인의 생산방법

Info

Publication number: KR20190074917A
Application number: KR1020180020623A
Authority: KR
Inventors: 이정걸; 장례완; 쿠마 씽 러우션; 이정임
Original assignee: 건국대학교 산학협력단
Priority date: 2017-12-20
Filing date: 2018-02-21
Publication date: 2019-06-28
Also published as: KR102093546B1

Abstract

본 발명은 에탄올에서 아세토인의 생산방법 및 이의 다양한 적용에 관한 것이다. 본 발명의 에탄올에서 아세토인 생산 방법은, 효소로서 NOX, EtDH, FLS, 의 단백질과 이의 변이체 단백질을 다단계 촉매활성이 나타나도록 인공 합성 경로를 디자인하여 무-세포(cell-free) 촉매 방법을 이용하였다. 본 발명의 아세토인 생산 방법은 종래 미생물 이용 발효법과 비교하여 세포 생장이 필요하지 않고, 짧은 합성 경로, 빠른 반응 속도, 높은 수율 및 생산성, 목적으로 하는 반응 조건의 조절이 용이하여, 효과적으로 아세토인을 생산할 수 있다. 또한, 상기 단백질을 나노입자에 고정하여 다 수의 재사용이 가능하고 아세토인 생성에도 효과적이므로 경제적이다. 따라서, 유효 성분으로서 아세토인이 요구되는 관련 산업에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

에탄올에서 아세토인의 생산방법{A method for producing acetoin from ethanol}

본 발명은 에탄올에서 아세토인의 생산방법 및 이의 다양한 적용에 관한 것이다.

화석연료들의 사용은 지구온난화 가스 및 폐기물을 대량생산하여 인류에게 심각한 환경적인 위기를 초래하고 있다. 화석연료로부터 생산되어지는 화학공업을 대체할 수 있는, 즉 인류에게 유해한 폐기물의 생산 및 에너지 소비를 최소화할 수 있는 바이오매스를 원료로 사용하는 환경 친화적인 새로운 생물 공정의 개발이 필요하다. 바이오에너지로 대표되는 바이오에탄올, 바이오디젤, 바이오가스, 아세토인에 대한 관심이 증가하고 있지만, 언급된 종류의 바이오에너지 모두 전력생산이나 수송용 연료로 사용될 수 있으나, 실적용 및 생산 방법의 몇몇 단점으로 인해 새로운 신재생에너지 자원인 탄화수소(hydrocarbon) 형태의 화합물에 대한 관심이 증가되고 있다.

아세토인은 버터향이 나는 향료로 식품, 화장품, 담배, 또는 세제 등에 널리 사용될 뿐 아니라 해충의 유인제로 작용하여 방충제로서의 활용도 가능하다. 이러한 아세토인의 다양한 활용 용도와 대량 생산 가능성으로 인해, 아세토인은 미국 에너지국이 정한 바이오 매스로부터 생산 가능한 30개 플랫폼 화학물질에 포함되어 있다. 현재 대부분의 아세토인은 화학적 합성법으로 생산되고 있으나, 화장품이나 식품에 사용될 경우 천연 향료로서의 활용에 대한 선호도가 증가하고 있어 새로운 생산 방법이 요구되고 있다.

먼저, 지금까지 연구된 재조합 균주들은 복합배지에서 배양되어 아세토인을 생산하여 왔다. 그러나 상기 복합배지에는 Yeast extract. Corn steep liquor 등의 성분들이 함유되어 있으며, 이러한 성분은 배양액의 총 비용에서 50% 이상 차지하는바, 생산비용을 증가시키는 결과를 초래하였다. 이뿐 아니라, 다양한 복합배지의 성분은 미생물 배양 후, 아세토인을 정제하는 과정에서 추가적인 문제를 일으키기도 하는바, 실제 상용화에 있어서 걸림돌이 되고 있는 실정이다.

그러나 미생물을 이용하여 산업적으로 유용한 수준으로 아세토인을 생산하기 위하여는 발효 과정을 수행하여야 하며, 아세토인의 선택성, 수율 및 생산성, 즉 단위시간 당 아세토인의 생산량 모두가 우수하여야 하고, 이와 같은 조건을 만족하는 미생물을 발굴하기 위해서는 과도한 반복 실험이 요구되어 왔다.

본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위하여, 에탄올에서 아세토인으로의 효과적인 생산 방법에 대해 연구하던 중, 종래 미생물 발효법을 이용하지 않으면서 무-세포(Cell-free) 상에서 이용 가능한 방법을 이용하고, NOX, EtDH 및 FLS의 단백질 및 이의 변이체 단백질을 발굴하고 이를 효소로서 다단계 반응에 적용한 결과, 에탄올을 기질로 하는 아세토인을 효과적을 생산할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 목적은 FLS 변이 아미노산을 제공할 수 있다.

또한 본 발명의 목적은 상기 FLS 변이 아미노산을 코딩하는 유전자를 제공할 수 있다.

또한 본 발명의 목적은 재조합 벡터를 제공할 수 있다.

또한 본 발명의 목적은 상기 재조합 벡터가 도입된 형질전환 미생물을 제공할 수 있다.

또한 본 발명의 목적은 상기 형질전환 미생물에서 생산된 단백질을 정제하고 반응시키는 단계;를 포함하는 아세토인 생산 방법을 제공할 수 있다.

또한 본 발명의 목적은 상기 형질전환 미생물에서 생산된 단백질을 나노입자에 고정하고 반응시키는 단계;를 포함하는 아세토인 생산 방법을 제공할 수 있다.

상기 목적의 달성을 위해, 본 발명은 서열번호 8로 표시되는 FLS(formolase) 아미노산에서 482번째 루신이 세린, 아르기닌 및 글루탐산으로 치환된 변이로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 변이를 포함하는 FLS 변이 아미노산을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 FLS 변이 아미노산을 코딩하는 유전자를 제공한다.

또한 본 발명은 NOX(NADH oxidase) 유전자, EtDH(ethanol dehydrogenase) 유전자, EtDH의 변이체 유전자, FLS(formolase) 유전자 및 상기 FLS 변이 아미노산을 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 유전자를 포함하는 재조합 벡터를 제공한다.

또한 본 발명은 상기 재조합 벡터가 도입된 형질전환 미생물을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 형질전환 미생물에서 생산된 단백질을 정제하고 반응시키는 단계;를 포함하는 아세토인 생산 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 상기 형질전환 미생물에서 생산된 단백질을 나노입자에 고정하고 반응시키는 단계;를 포함하는 아세토인 생산 방법을 제공한다.

본 발명의 에탄올에서 아세토인 생산 방법은, 효소로서 NOX, EtDH 및 FLS 단백질과 이의 변이체 단백질을 다단계 촉매활성이 나타나도록 인공 합성 경로를 디자인하여 무-세포(cell-free) 촉매 방법을 이용하였다. 본 발명의 아세토인 생산 방법은 종래 미생물 이용 발효법과 비교하여 세포 생장이 필요하지 않고, 짧은 합성 경로, 빠른 반응 속도, 높은 수율 및 생산성, 목적으로 하는 반응 조건의 조절이 용이하여, 효과적으로 아세토인을 생산할 수 있다. 또한, 상기 단백질을 나노입자에 고정하여 다수의 재사용이 가능하고 아세토인 생성에도 효과적이므로 경제적이다. 따라서, 유효 성분으로서 아세토인이 요구되는 관련 산업에 유용하게 이용될 수 있다.

도 1는 본 발명의 최적 효소를 포함하는 무-세포 다중 촉매 시스템을 이용한 에탄올에서 아세토인의 생성 방법을 모식화한 도이다.
도 2a는 NOX 효소 단백질을 발현하는 벡터맵을 나타낸 도이다.
도 2b는 EtDH 효소 단백질을 발현하는 벡터맵을 나타낸 도이다.
도 2c는 EtDH:D46G 효소 단백질을 발현하는 벡터맵을 나타낸 도이다.
도 2d는 FLS:L482S 효소 단백질을 발현하는 벡터맵을 나타낸 도이다.
도 3은 EtDH, EtDH:D46G, NOX, FLS 단백질 발현을 확인한 도이다.
도 4는 FLS 효소에 따른 아세토인 생성을 VP 반응으로 확인한 도이다(A는 50 mM 아세트 알데히드, 0 시간; B는 100 mM 아세트알데히드, 0시간; C는 50 mM 아세트알데히드, 6 시간; D는 100 mM 아세트알데히드, 6시간).
도 5는 본 발명의 다단계 효소 및 이의 변이체를 이용한 아세토인 생성을 키랄-칼럼 GC(Chiral-column GC) 분석한 결과이다(A는 표준 물질의 혼합물; B는 중간 생성물 아세트알데히드를 통한 에탄올에서 아세토인의 반응).
도 6은 본 발명의 각 효소의 열안정성(Thermostability)을 30, 37, 45도에서 확인한 도이다(1은 EtDH:D46G(에탄올, NAD⁺포함); 2는 EtDH:D46G (ethanol, NAD⁺ 포함); 3은 EtDH:D46G(에탄올, NADP⁺); 4는 FLS(아세트알데히드, TPP 포함); 5는 FLS:L482S(아세트알데히드, TPP); 6은 NOX (O₂, NADH 포함)).
도 7a는 pH 조건(6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5 및 8.5)에 따른 에탄올에서 아세토인 생성 농도를 확인한 도이다.
도 7b는 온도(20, 25, 30, 37 및 42도)에 따른 에탄올에서 아세토인 생성 농도를 확인한 도이다.
도 7c는 NAD+(1, 2, 4, 6, 8 mM)에 따른 에탄올에서 아세토인 생성 농도를 확인한 도이다.
도 7d는 TPP(1, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 및 0.5 mM)에 따른 에탄올에서 아세토인 생성 농도를 확인한 도이다.
도 7e는 금속 이온(Mg²⁺, Mn²⁺, Ca²⁺, Fe²⁺, Ni²⁺, Cu²⁺ 및 Zn²⁺)에 따른 에탄올에서 아세토인 생성 농도를 확인한 도이다.
도 8은 최적 반응 조건하에 시간 조건에 따른 에탄올에서 아세토인의 생성을 확인한 도이다.
도 9은 에탄올에서 아세토인으로의 속도 조절 단계(Rate limiting step)를 확인한 도이다.
도 10은 FLS 아미노산 서열의 돌연변이 핫스팟을 분석한 도이다(A는 핫 스폿 예측의 결과; B는 FLS 효소의 구조 모델(파란색 : 기질 터널 포켓, 골든 활성 사이트 포켓, 적색 : FLS 효소의 높은 변이 가능한 잔기, 황색 : FLS 효소의 중간 변이 가능한 잔기).
도 11a는 FLS 및 이의 변이체의 아세토인 생성을 확인한 도이다.
도 11b는 FLS의 고유 활성(specific activity)과 비교하여 FLS 및 이의 변이체의 활성을 확인한 도이다.
도 12a는 기질인 아세트알데히드와 FLS의 활성 부위 잔기 W480간의 분자 상관관계를 확인한 도이다.
도 12b는 기질인 아세트알데히드와 FLS:L482S의 활성 부위 잔기 W480간의 분자 상관관계를 확인한 도이다.
도 12c는 기질인 아세트알데히드와 FLS의 100-ns 분자 역동 시뮬레이션을 확인한 도이다.
도 12d는 기질인 아세트알데히드와 FLS:L482S의 100-ns 분자 역동 시뮬레이션을 확인한 도이다.
도 13a는 시간 조건에 따른 기질인 에탄올에서 아세트알데히드 및 아세토인의 생성을 확인한 도이다.
도 13b는 기질인 에탄올의 농도에 따른 에탄올에서 아세트알데히드 및 아세토인의 생성을 확인한 도이다.
도 14a는 에탄올에서 아세토인 생산을 위한 효소의 재순환성(Recyclability)을 확인한 도이다(에탄올(■), 아세트알데히드(▲), 아세토인(●)).
도 14b는 에탄올에서 아세토인 생산을 위하여 고정된 효소의 재사용성(Reusability)을 확인한 도이다.

본 발명은 서열번호 8로 표시되는 FLS(formolase) 아미노산에서 482번째 루신이 세린, 아르기닌 및 글루탐산으로 치환된 변이로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 변이를 포함하는 FLS 변이 아미노산을 제공한다.

본 발명에서 용어, "FLS(formolase)"는 3개의 1-카본 포름알데히드(carbon formaldehyde) 분자를 하나의 3-카본 디하이드록시아세톤(dihydroxyacetone) 분자로 carboligation을 촉매한다. 본 발명의 목적 상, FLS 및 이의 변이체는 알코올 대사 과정에서 생성된 아세트알데히드를 기질로 하여 아세토인을 생성할 수 있다.

본 발명에서 용어, "FLS 변이 아미노산"은 야생형 FLS 아미노산 중 하나 이상의 아미노산을 치환, 삽입, 제거 또는 변형한 것을 의미한다.

상기 FLS는 서열번호 7로 표시되는 염기서열로 코딩될 수 있고, 상기 FLS에서 482번째 루신이 세린으로 치환된 변이는 서열번호 9의 염기서열 및 서열번호 10의 아미노산 서열로 표시되고, 482번째 루신이 아르기닌으로 치환된 변이는 서열번호 11의 아미노산 서열로 표시되며, 482번째 루신이 글루탐산으로 치환된 변이는 서열번호 12의 아미노산 서열로 표시된다.

상기 FLS 변이 아미노산은 396번째 트레오닌의 변이, 446번째 트레오닌의 변이, 473번째 메티오닌의 변이, 477번째 세린의 변이 및 499번째 루신의 변이로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 더 포함할 수 있으나, 에탄올 대사 과정에서 생산된 아세트알데히드를 아세토인으로 전환시키기 위한 목적을 달성하기 위해서라면, 이에 제한되지 않는다.

상기 FLS는 슈도모나스 플루오레스센스(Pseudomonas fluorescens)로부터 유래되나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 본 발명의 FLS 변이는 FLS의 구조를 분석한 결과, 6개의 잔여(Six residuals) 핫스팟(T396, T446, M473, S477, L482 및 L499)를 발굴하였다. 그 중, 기질인 아세트알데히드와 분자 상호 작용은 활성 부위 잔기는 W480임을 확인하고, FLS 보다 변이체 FLS:L482S가 더 강하게 기질과 결합하고, 수소 결합함을 확인하였다(도 12a 내지 12d).

본 발명에 따른 FLS 및 이의 변이 아미노산의 범위는 본 발명의 아미노산으로 합성된 단백질 및 상기 단백질의 기능적 동등물을 포함한다. "기능적 동등물"이란 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 상기 아미노산과 적어도 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더욱 바람직하게는 90% 이상, 더 더욱 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로, 본 발명의 FLS 및 이의 변이 아미노산과 실질적으로 동질의 생리활성을 나타내는 단백질 또는 아미노산을 말한다.

본 발명의 FLS 및 이의 변이 아미노산은 이의 천연형 아미노산 서열을 갖는 단백질뿐만 아니라 이의 아미노산 서열 변이체가 또한 본 발명의 범위에 포함된다.

상기 FLS 및 이의 변이 아미노산은 천연에서 추출하거나 합성 (Merrifleld, J. Amer. chem. Soc. 85:2149-2156, 1963) 또는 DNA 서열을 기본으로 하는 유전자 재조합 방법에 의해 제조될 수 있다 (Sambrook et al, Molecular Cloning, Cold Spring Harbour Laboratory Press, New York, USA, 2판, 1989).

상기 유전자의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 본 발명의 FLS 변이 아미노산을 코딩하는 유전자로서 사용될 수 있는 FLS 변이 핵산분자는 이를 구성하는 핵산 분자의 작용성 등가물, 예를 들어, FLS 변이 핵산 분자의 일부 염기서열이 결실(deletion), 치환(substitution) 또는 삽입(insertion)에 의해 변형되었지만, FLS 변이 핵산 분자와 기능적으로 동일한 작용을 할 수 있는 변이체(variants)를 포함하는 개념이다. 구체적으로, 상기 유전자는 각각 70% 이상, 더욱 바람직하게는 80% 이상, 더 더욱 바람직하게는 90% 이상, 가장 바람직하게는 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 이에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다

본 발명에서 용어, "NOX(NADH oxidase)"는 본 발명의 목적 상, 기질로서 산소를 이용하며, NADH를 산화시켜 NAD⁺를 재생산한다. 상기 재생산된 NAD⁺는 EtDH가 조효소로 이용할 수 있다.

본 발명에서 용어, "EtDH(ethanol dehydrogenase)"는 본 발명의 목적 상, 에탄올을 기질로 이용하고, 조효소로서 NAD⁺ 및/또는 NADP⁺를 이용하여 에탄올을 탈수소시킬 수 있다. 이 후, 아세트알데히드 생산을 유도하여, 이를 기질로 이용하는 FLS가 아세토인을 생성하도록 할 수 있다.

상기 NOX 유전자는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)로부터 유래되고, 상기 EtDH 유전자 또는 EtDH 변이체 유전자는 쿠프리아비두스 네카터(Cupriavidus necator)로부터 유래될 수 있으나, 본 발명의 아세토인 생성을 위한 효소 생산을 위해서라면, 이에 제한되지 않는다.

상기 NOX 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로, EtDH 유전자는 서열번호 3의 염기서열 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시된다. 또한, 상기 EtDH는 서열번호 4로 표시되는 EtDH 아미노산의 46번째 아스파르트산이 글리신으로 치환되고 서열번호 5의 염기서열 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 EtDH 변이를 포함할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 실시예 1-2의 방법을 이용하여, 각 단백질 및 이의 변이체를 발현하도록 플라미스미드를 제작하였고, NOX 단백질 발현 플라스미드 및 벡터맵은 도 2a에 나타내었다. 또한, EtDH 또는 EtDH:D46G 변이체 발현 플라스미드 및 벡터맵은 도 2b 및 도 2c에 나타내었다. 또한, FLS:L482S 변이체 발현 플라스미드 및 벡터맵은 도 2d에 나타내었다(표 1).

본 발명에서 용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 목적 유전자를 발현시킬 수 있도록 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 유전자의 폴리뉴클레오티드를 함유하는 DNA 제조물을 의미하는 것으로, 상기 조절 서열은 전사를 개시할 수 있는 프로모터, 그러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 포함한다.

본 발명에서 "작동가능하게 연결된 (operably linked)"는 일반적 기능을 수행하도록 핵산 발현조절 서열과 목적하는 단백질을 코딩하는 핵산 서열이 기능적으로 연결되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 프로모터와 단백질 또는 RNA를 코딩하는 핵산 서열이 작동가능하게 연결되어 코딩서열의 발현에 영향을 미칠 수 있다. 재조합 벡터와의 작동적 연결은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술 분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.

본 발명의 벡터는 프로모터, 개시코돈, 종결코돈, 폴리아데닐화 시그널 및 인핸서 같은 발현 조절 엘리먼트, 분비시그널 등을 포함할 수 있으며, 목적에 따라 다양하게 제조될 수 있다. 개시 코돈 및 종결 코돈은 유전자 작제물이 투여되었을 때 개체에서 반드시 작용을 나타내야 하며 코딩 서열과 인프레임(in frame)에 있어야 한다.

본 발명에서 사용되는 벡터는 숙주 중에서 복제 가능한 것이면 특별히 한정되지 않으며 당 업계에 알려진 임의의 벡터를 이용할 수 있다. 예컨대 비바이러스성 벡터 또는 바이러스성벡터를 사용할 수 있다.

상기 비바이러스성 벡터로는 플라스미드가 대표적이다. 플라스미드 발현 벡터는 사람에게 사용할 수 있는 FDA의 승인된 유전자 전달방법으로 사람 세포에 직접적으로 플라스미드 DNA를 전달하는 방법으로, 플라스미드 DNA는 바이러스 벡터와는 달리 균질하게 정제될 수 있는 장점이 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 플라스미드 발현 벡터로는 당업계에 공지된 포유동물 발현 플라스미드를 사용할 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 pRK5(유럽특허 제307,247호), pSV16B(국제특허공개 제91/08291호) 및 pVL1392(PharMingen) 등이 대표적이다.

또한 본 발명의 발현 벡터로 바이러스 벡터를 사용할 수 있다. 바이러스 벡터는 예를 들어, 레트로바이러스(retrovirus), 아데노바이러스(adenovirus), 아데노바이러스-연관 바이러스, 허피스바이러스(herpes virus) 및 아비폭스바이러스(avipoxvirus) 등이 포함된다. 바이러스 벡터는 다음의 기준을 충족해야 한다: (1) 목적하는 세포에 감염할 수 있어야 하며 이에 따라 적합한 숙주 범위를 갖는 바이러스 벡터가 선택되어야 하고, (2) 전달된 유전자가 적절한 기간 동안 세포에서 보존되고 발현될 수 있어야 하며, (3) 벡터가 숙주에 안전해야 한다.

상기 레트로바이러스 벡터는 바이러스 유전자가 모두 제거되었거나 또는 변경되어 비-바이러스 단백질이 바이러스 벡터에 의해 감염된 세포 내에서 만들어지도록 제작된 것이다. 유전자 요법을 위한 레트로바이러스 벡터의 주요 장점은 다량의 유전자를 복제세포 내에 전달하고, 세포 DNA 내로 전달된 유전자를 정확하게 통합하며, 유전자 형질 감염 후 연속적인 감염이 유발되지 않는 것이다. FDA에서 인증 받은 레트로바이러스 벡터는 PA317 암포트로픽 레트로바이러스 패키지 세포를 이용하여 제조한 것이다(Miller, A.D. and Buttimore, C., Molec.Cell Biol., 6:2895-2902, 1986).

비-레트로바이러스 벡터로는 상기에서 언급한 바와 같은 아데노바이러스가 있다. 아데노바이러스의 주요 장점은 다량의 DNA 단편(36kb 게놈)을 운반하고, 매우 높은 역가로 비-복제세포를 감염시킬 수 있는 능력이 있다는 것이다. 또한, 허피스 바이러스도 사람 유전자 요법을 위해 유용하게 사용될 수 있다(Wolfe, J.H., et al.,Nature Genetics,1:379-384, 1992). 이외에도, 공지된 적절한 바이러스 벡터를 사용할 수 있다.

세포 내로 유전자 전달을 위해 사용할 수 있는 다른 바이러스 벡터로는 뮤린 백혈병 바이러스(MLV), JC, SV40, 폴리오마, 엡스타인-바르 바이러스 파필로마 바이러스, 백시니아, 폴리오바이러스, 헤르페스 바이러스, 신드비스 바이러스, 렌티 바이러스, 기타 사람 및 동물 바이러스가 포함될 수 있다.

본 발명에 따른 상기 발현 벡터는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 세포에 도입할 수 있다. 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질감염(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질감염(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질감염(DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질감염(polybrene-mediated transfection), 전기침공법(electropora tion), 유전자 총(gene gun) 및 세포 내로 핵산을 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 세포 내로 도입할 수 있다(Wu et al., J. Bio. Chem., 267:963-967, 1992; Wu and Wu, J. Bio. Chem.,263:14621-14624, 1988).

또한, 본 발명의 벡터는 선별 마커(selection market)를 추가로 포함할 수 있다. 선별 마커는 벡터로 형질전환 된 세포를 선별, 즉, 목적 유전자의 삽입 여부를 확인하기 위한 것으로, 약물 내성, 영양 요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면 단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 마커들이 사용될 수 있다. 선택제(selective agent)가 처리된 환경에서는 선별 마커를 발현하는 세포만 생존하거나, 다른 표현 형질을 나타내므로, 형질전환된 세포를 선별할 수 있다.

본 발명의 형질전환체는 벡터를 프로모터가 작용할 수 있는 양태로 숙주세포 내에 도입시키는 것에 의해 구축될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 "형질전환"은 DNA를 숙주로 도입하여 DNA가 염색체외 인자로서 또는 염색체 통합완성에 의해 복제 가능하게 되는 것을 의미한다. 형질전환은 핵산 분자를 유기체, 세포, 조직 또는 기관에 도입하는 어떤 방법도 포함되며, 당 분야에서 공지된 바와 같이 숙주 세포에 따라 적합한 표준 기술을 선택하여 수행할 수 있다. 이런 방법에는 전기천공법(electroporation), 인산칼슘(CaPO₄) 침전, 염화칼슘(CaCl₂) 침전, 미세주입법(microinjection), 폴리에틸렌글리콜(PEG)법, DEAE-덱스트란법, 양이온 리포좀법, 및 초산 리튬-DMSO법 등이 포함될 수 있으나 이들로 제한되는 것은 아니다.

발현벡터로 형질전환되는 숙주세포에 따라서 단백질의 발현량과 수식 등이 다르게 나타나므로, 목적에 가장 적합한 숙주세포를 선택하여 사용하면 된다. 본 발명에서 이용될 수 있는 숙주세포로는 곤충세포주, 효모, 진균, 세균 또는 조류가 가능하다.

본 발명에서 상기 형질전환 미생물은 배양할 수 있으며, "배양"은 미생물을 적당히 인공적으로 조절한 환경조건에서 생육시키는 것을 의미한다.

상기 형질전환 미생물은 통상의 배지에서 생육 가능하며, 상기 배지는 특정 미생물을 배양하기 위하여 배양대상 즉 배양체가 되는 미생물이 필요로 하는 영양물질을 포함하는 것으로 특수한 목적을 위한 물질이 추가로 첨가되어 혼합된 것일 수 있다. 상기 배지는 배양기 또는 배양액이라고도 하며, 천연배지, 합성배지 또는 선택배지를 모두 포함하는 개념이다.

배양에 사용되는 배지는 적당한 탄소원, 질소원, 아미노산, 비타민 등을 함유한 통상의 배지 내에서 온도, pH 등을 조절하면서 적절한 방식으로 특정 균주의 요건을 충족해야 한다. 사용될 수 있는 탄소원으로는 글루코즈 및 자일로즈의 혼합당을 주 탄소원으로 사용하며 이외에 수크로즈, 락토즈, 프락토즈, 말토즈, 전분, 셀룰로즈와 같은 당 및 탄수화물, 대두유, 해바라기유, 피마자유, 코코넛유 등과 같은 오일 및 지방, 팔미트산, 스테아린산, 리놀레산과 같은 지방산, 글리세롤, 에탄올과 같은 알코올, 아세트산과 같은 유기산이 포함된다. 이들 물질은 개별적으로 또는 혼합물로서 사용될 수 있다. 사용될 수 있는 질소원으로는 암모니아, 황산암모늄, 염화암모늄, 초산암모늄, 인산암모늄, 탄산안모늄, 및 질산암모늄과 같은 무기질소원; 글루탐산, 메티오닌, 글루타민과 같은 아미노산 및 펩톤, NZ-아민, 육류 추출물, 효모 추출물, 맥아 추출물, 옥수수 침지액, 카세인 가수분해물, 어류 또는 그의 분해생성물, 탈지 대두 케이크 또는 그의 분해생성물 등 유기질소원이 사용될 수 있다. 이들 질소원은 단독 또는 조합되어 사용될 수 있다. 상기 배지에는 인원으로서 인산 제1칼륨, 인산 제2칼륨 및 대응되는 소듐-함유 염이 포함될 수 있다. 사용될 수 있는 인원으로는 인산이수소칼륨 또는 인산수소이칼륨 또는 상응하는 나트륨-함유 염이 포함된다. 또한, 무기화합물로는 염화나트륨, 염화칼슘, 염화철, 황산마그네슘, 황산철, 황산망간 및 탄산칼슘 등이 사용될 수 있다. 마지막으로, 상기 물질에 더하여 아미노산 및 비타민과 같은 필수 성장 물질이 사용될 수 있다.

또한, 배양 배지에 적절한 전구체들이 사용될 수 있다. 상기된 원료들은 배양과정에서 배양물에 적절한 방식에 의해 회분식, 유가식 또는 연속식으로 첨가될 수 있으나, 특별히 이에 제한되지는 않는다. 수산화나트륨, 수산화칼륨, 암모니아와 같은 기초 화합물 또는 인산 또는 황산과 같은 산 화합물을 적절한 방식으로 사용하여 배양물의 pH를 조절할 수 있다.

상기 생산 방법은 무-세포(cell-free) 상태에서 상기 형질전환 미생물에서 생산된 단백질을 다단계 촉매 작용을 수행하여 아세토인을 생산하고, 에탄올을 기질로 이용하나, 이에 제한되지 않는다.

상기 생산 방법은 조효소인 NAD⁺, NADP⁺, 비타민 B₁₂ 및 TPP(thiamine pyrophosphate)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 조효소를 더 포함하나, 이의 처리 농도 또는 처리량 또한 제한되지 않는다.

상기 생산 방법은 금속 이온 Mg²⁺, Mn²⁺, Ca²⁺, Fe²⁺, Ni²⁺, Cu²⁺ 및 Zn²⁺으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 금속 이온을 더 포함하며, 바람직하게는 Mg²⁺, Mn²⁺, Ca²⁺, Fe²⁺ 및 Ni²⁺이 더 효율적으로 촉매 반응을 유도할 수 있으나, 아세토인을 생산하기 위해서라면 이에 제한되지 않는다.

상기 생산 방법은 pH 5.0 내지 9.0의 조건으로 아세토인을 생산하고, 바람직하게는 6.5 내지 8.5의 조건이나, 아세토인 생성 목적 달성을 위해서라면 이에 제한되지 않는다.

상기 생산 방법은 16 내지 45도에서 아세토인을 생산하나, 바람직하게는 25 내지 42도의 조건이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명은 에탄올에서 C₄ 화합물인 아세토인을 생성하기 위하여, 다단계 효소(cascade enzymes)를 이용한 인공 합성 경로를 디자인하였으며, 상기 다단계 효소로서, NOX, EtDH, FLS와 이의 각 변이체를 선발하였다. 구체적으로, NOX는 기질로서 산소를 이용하며, NADH를 산화시켜 NAD⁺를 재생산한다. 상기 재생산된 NAD⁺는 EtDH가 조효소로 이용한다. EtDH 및 이의 변이체는 에탄올을 기질로 이용하고, 조효소로서 NAD⁺ 및/또는 NADP⁺를 이용하여 에탄올을 탈수소화하여, 아세트알데히드 생산을 유도한다. 이 후, FLS 및 이의 변이체는 아세트알데히드를 기질로 하여 최종적으로 아세토인을 생성한다.

본 발명은 무세포 다중 효소 촉매(Cell-free multi-enzyme catalysis, CFME) 방법을 이용한 in vitro 상에서 간소화된 경로를 이용하여 에탄올에서 아세토인의 인공 합성 목적을 달성하였다. 상기 무-세포 다중 효소 촉매 방법을 이용 시, 종래의 세포를 이용한 대사 공학, 예컨대 박테리아, 재조합 미생물 등을 배양한 발효법의 낮은 목표 생성물 수율, 원치 않는 부산물 생성, 세포내 수송 제약 등의 문제점을 해결하여, 세포 생장이 필요하지 않고, 짧은 합성 경로, 빠른 반응 속도, 높은 수율 및 생산성, 목적으로 하는 반응 조건의 조절 등과 같은 장점이 존재한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 실시예 6의 방법에 따라, 최적의 아세토인 생산 방법은, 본 발명에서 디자인한 인공 합성 경로에 따라 무세포 다중 효소 촉매를 이용하고, 기질로서 에탄올을 이용한다. 효소로서 NOX, EtDH, FLS:L482S를 이용하고, 조효소로서, NAD⁺, NADP⁺, TPP, 비타민 B_12,Mg²⁺을 첨가한 반응 혼합물로 아세토인 생성을 효과적으로 유도할 수 있다(도 1).

상기 나노입자는 산화 규소(silicon oxide)를 부착하고 글루타알데히드(glutaraldehyde)와 반응시키나, 본 발명의 단백질을 나노입자에 부착하여 아세토인을 생산하기 위한 목적을 달성하기 위해서라면, 이에 제한되지 않는다.

상기 고정된 단백질 나노입자는 재사용이 가능하고, 바람직하게는 1 내지 30회 재사용이 가능하며, 더욱 바람직하게는 1 내지 20회이나, 이에 제한되지 않는다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 실시예 7의 방법에 따라, 최적의 아세토인 생산 방법은, 본 발명에서 디자인한 인공 합성 경로에 따라 무세포 다중 효소 촉매를 이용하고, 기질로서 에탄올을 이용한다. 효소로서 NOX, EtDH, FLS:L482S를 이용하고, 조효소로서, NAD⁺, NADP⁺, TPP, 비타민 B_12,Mg²⁺을 첨가한 반응 혼합물로 아세토인 생성을 효과적으로 유도할 수 있다(도 1). 상기 효소를 나노입자에 부착시켜 고정시키고 아세토인 생성을 유도한 결과, 재사용 후에도 효과적으로 아세토인이 생성됨을 확인하였다(도 14a 내지 도 14d).

하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명의 내용을 구체화하기 위한 것일 뿐 이에 의해 본 발명이 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1> 실험 준비 및 실험 방법

<1-1> 효소 및 시약 구입

제한 효소인 DNA Polymerase High Fidelity and T4 DNA ligase는 TaKaRa Biotech(Shiga, Japan) 및 New England Biolabs(Ipswich, MA, USA)에서 각각 구입하였다. DNA 및 단백질 마커는 Tiangen Biotech(Shanghai, China)에서 구입하였다. IPTG(Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside), DTT(dithiothreitol) 및 DMSO(dimethyl sulfoxide)는 Sigma-Aldrich(St. Louis, MO, USA) 및 Sinopharm(Shanghai, China)에서 각각 구입하였다. 대조군으로서, (3S/3R)-아세토인(acetoin)은 Sigma-Aldrich에서 구입하였다. 모든 다른 시약은 달리 명시되지 않는 한, 분석 등급이었으며 상업적으로 이용 가능한 것을 이용하였다.

<1-2> 박테리아 균주, 플라스미드 및 박테리아 성장 조건

본 발명에 이용된 균주 및 플라스미드는 하기 표 1에 나타내었으며, 클로닝 및 발현 발현 숙주로서 Escherichia coli DH5α 및 BL21(DE3)을 이용하였으며 37도에서 배양하였다. 플라스미드 pET28a를 이용하여 발현 벡터를 제작하였다. Luria-Bertani(LB) 배지는 균주 배양 및 재조합 단백질 발현에 사용되었으며, 최종 농도 50 μg mL^-1의 재조합 균주를 배양하기 위해 카나마이신을 상기 배지에 추가하였다.

Strain or plasmid	Relevant genotype and description	Vector Map
Strains
E. coli DH5α	Host of plasmid for cloning
E. coli BL21(DE3)	Host of plasmid for expression, F-, ompT, hsdSB(rB-mB-), gal(λ c I 857, ind1, Sam7, nin5, lacUV-T7 gene1), dcm(DE3)
Plasmids
pET28a	Expression vector, Km^R
pET-EtDH	pET28a carries EtDH gene	fig. 2b
pET-EtDH:D46G	pET28a carries EtDH mutant gene	fig. 2c
pET-FLS	pET28a carries FLS gene
pET-FLS:L482S	pET28a carries FLS mutant gene	fig. 2d
pET-FLS:L482R	pET28a carries FLS mutant gene
pET-FLS:L482E	pET28a carries FLS mutant gene
pET-NOX	pET28a carries NOX gene	fig. 2a

<1-3> 다단계 효소(cascade enzymes)의 재조합 단백질 발현 및 정제

에탄올에서 C₄ 화합물인 아세토인을 최종적으로 생성하기 위하여, 다단계 효소(cascade enzymes)를 이용하였으며, EtDH(ethanol dehydrogenase), FLS(formolase) 및 NOX(NADH oxidase)의 유전자는 각 쿠프리아비두스 네카터(Cupriavidus necator)[T. Y. Wu, et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 2016, 100, 1], 슈도모나스 플루오레스센스(Pseudomonas fluorescens)[ J. Siegel, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2015, 112, 3704] 및 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)[ Y. W. Zhang, et al., Enzyme Microb. Tech., 2012, 50, 255]에서 유래한 유전자를 이용하였으며, General Biosystems, Inc. (Anhui, China)에서 합성하였다. 또한, 상기 각 유전자를 발현 플라스미드 pET28a에 클로닝되었다. 단백질 발현 플라스미드를 E. coli BL21(DE3)에 도입하였으며, 각 pET-EtDH, pET-FLS 및 pET-NOX가 포함된 각 재조합 E. coli BL21(DE3)를 600 nm 에서 광학 밀도가 0.6 일 때, 0.5 mM IPTG가 포함된 LB 배지에 37도로 배양하였다.

18도에서 24시간 유도한 후, 세포를 원심분리하여 수득하고 ice bath에서 초음파 처리하여 파쇄하였다. 세포 파편을 제거하기 위하여 세포 용해물을 8000×g, 10분간 원심 분리하였다. EtDH, FLS 및 NOX 효소를 수득하기 위하여, 용해성 분획을 정제 프로토콜(GE Healthcare, Little Chalfont, UK)에 따라 HisTrap HP 칼럼을 이용하여 정제하였다. 상기 각 정제된 효소는 초미세여과(ultrafiltration)하여 농축 및 탈염화시킨 후, SDS-PAGE로 검출하였다.

<1-4> 효소 변이체(enzyme variants)의 제작

상기 각 EtDH, FLS 효소에 대한 변이체를 제작하고 이를 발현 및 정제하였다.

또한, EtDH 변이체를 제작하기 위하여, EtDH:D46G 변이체는 하기 표 2에 나타낸 EtDH1/EtDH2 프라이머를 이용하여 부위 특이적 돌연변이 유도(site-directed mutagenesis)를 수행하여 제작하였다. 야생형 EtDH 포함하는 재조합 플라스미드 pET-EtDH는 PCR 증폭을 위한 DNA 주형으로서 각각 사용되었다. 정정된(correct) 돌연변이 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 E. coli BL21(DE3)에 형질전환 시킨 후, 콜로니는 카나마이신 저항성인 것으로 선택하여 단백질 발현에 이용하였다. 각 단백질의 정제 후, EtDH 변이체의 활성 및 운동 파라미터(kinetic parameter)를 측정하였다.

또한, FLS 효소의 촉매 효율을 높이기 위하여, 신규한 돌연변이 영역을 찾아내고자, HotSpot Wizard 2.0 server를 이용하여 FLS 구조(PDB No.: 4QPZ)를 입력하여 핫 스팟을 분석하였다[(J. Siegel, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., 2015, 112, 3704), (J. Bendl, et al., Acids Res., 2016, 44, 479)]. 6개의 잔여(Six residuals) 핫스팟(T396, T446, M473, S477, L482 및 L499)를 하기 표 2의 FLS1-FLS12 프라이머를 이용하여 부위 특이적 돌연변이를 유도하였다. 야생형 FLS를 포함하는 재조합 플라스미드 pET-FLS를 DNA 주형으로 이용하였으며, 돌연변이 유전자를 포함하는 재조합 플라스미드를 E. coli BL21(DE3)로 형질전환하였다. FLS 변이체를 아세트알데이히드(acetaldehyde)를 기질로 하는 전체-세포 생촉매법(whole-cell biocatalytic method)을 이용하여 스크리닝 하였다. 구체적으로, 콜로니를 LB 배지에 접종한 후 600 nm에서 광학 밀도가 0.6에 도달하였을 때, 18도로 24시간 동안 0.5 mM IPTG를 추가하여 단백질 발현을 유도하였다. 상기 세포는 원심 분리하여 수득하고, 50 mM 인산 완충액(pH 8.0), 100 mM 아세트알데히드 및 40 gL^-1 wet cell weight(WCW)를 포함하는 반응 혼합물로 6시간, 30도 조건으로 전체-세포 생촉매 작용을 수행하였다.

각 효소 및 이의 일부 변이체에 대한 유래 및 염기서열은 표 2에 나타내었다.

Primers	Sequence (5'-3′')	Mutation site	seq No.
EtDH1	GATTGTTACCGGTGCTGGCCTGCATAAAATG	D46G	13
EtDH2	CATTTTATGCAGGCCAGCACCGGTAACAATC	D46G	14
FLS1	GGTAGCGGATGGTGGCCTGNNNTATCTCTGGCTGTCC	T396	15
FLS2	GGACAGCCAGAGATANNNCAGGCCACCATCCGCTACC	T396	16
FLS3	CCGCCGCACGATCCTTGTGNNNGGCGATGGCTCGGTG	T446	17
FLS4	CACCGAGCCATCGCCNNNCACAAGGATCGTGCGGCGG	T446	18
FLS5	GCCGCTGATCGTCATCATCNNNAACAACCAAAGCTGG	M473	19
FLS6	CCAGCTTTGGTTGTTNNNGATGATGACGATCAGCGGC	M473	20
FLS7	CATCATCATGAACAACCAANNNTGGGGGTGGACATTG	S477	21
FLS8	CAATGTCCACCCCCANNNTTGGTTGTTCATGATGATG	S477	22
FLS9	CCAAAGCTGGGGGTGGACANNNCATTTCCAGCAATTG	L482	23
FLS10	CAATTGCTGGAAATGNNNTGTCCACCCCCAGCTTTGG	L482	24
FLS11	TCGCGTGACGGGCACCCGTNNNGAAAATGGCTCCTAT	L499	25
FLS12	ATAGGAGCCATTTTCNNNACGGGTGCCCGTCACGCGA	L499	26

유전자의 염기서열 또는 이의 변이체	유래	염기서열 번호	아미노산 서열번호
NOX(NADH oxidase)	락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)	1	2
EtDH(ethanol dehydrogenase)	쿠프리아비두스 네카터(Cupriavidus necator)	3	4
EtDH:D46G	쿠프리아비두스 네카터(Cupriavidus necator)	5	6
FLS(formolase)	슈도모나스 플루오레스센스(Pseudomonas fluorescens)	7	8
FLS:L482S		9	10
FLS:L482R			11
FLS:L482E			12

<1-5> 효소 활성 분석

1-5-1. EtDH 효소 활성 분석

EtDH 효소 활성 및 이의 변이체는 100 mM glycine-NaOH 완충액(pH 9.5), 5 mM Mg²⁺, 3 mM NAD⁺/NADP⁺ 및 10 mM 에탄올을 포함하는 반응 혼합물로 25도에서 측정하였다. 활성은 분광광도계(UV-1800, MAPADA, Shanghai, China)를 이용하여 340 nm에서 NAD⁺/NADP⁺ 감소율로 확인하였다. 1 단위의 EtDH 활성은 분 당 1 μmol의 NAD⁺/NADP⁺ 를 감소시키는데 필요한 효소의 양으로 확인하였다.

1-5-2. FLS 효소 활성 분석

FLS 효소 활성 및 이의 변이체는 100 mM 인산 완충액(pH 8.0), 1 mM Mg⁺, 0.1 mM TPP 및 20 mM 아세트알데히드를 포함하는 반응 혼합물로 검정하였으며, 반응 후 실온에서 1시간 두었으며, 아세트알데히드에서 아세토인의 농도는 VP 반응으로 측정하였으며, 표준 아세토인 검정곡선으로 계산하였다.

1-5-3. NOX 효소 활성 분석

NOX 효소 활성은 50 mM HEPES-NaOH buffer (pH 8.0) 및 0.2 mM NADH를 포함하는 반응 혼합물로 실온에서 측정하였다. 활성은 분광광도계(UV-1800, MAPADA)를 이용하여 340 nm에서 NADH의 산화율로 확인하였다. 1단위의 NOX 활성은 분 당 1 μmol NADH를 산화시키는데 필요한 효소의 양으로 측정하였다.

<1-6> VP(Voges-proskauer) 반응

각 조건의 처리군을 10,000×g에서 5분 간 4도에서 원심분리 하였다. 각 처리군의 아세토인 농도를 분석하고 VP 반응에서 정량화하기 위하여, 10mL 튜브에 희석된 시료 0.3 mL, 0.5 % 크레아틴 0.3 mL, 5 % 알파 나프톨 0.3 mL 및 5 % NaOH 0.3 mL를 넣고 30 에서 30 분간 부드럽게 진탕시켰다. 분광 광도계 (UV-1800, MAPADA)를 사용하여 520 nm에서 반응 용액의 광학 밀도를 측정하고 검량선으로부터 아세토인 농도를 계산하였다. 보정 그래프는 표준 아세토인 농도와 0.04-0.4 mM 범위의 VP 반응 후 520 nm에서 해당 광학 밀도 사이에 측정하였다.

<1-7> 운동 파라미터(kinetic parameters)의 측정

EtDH 및 EtDH:D46G의 운동 파라미터는 100 mM glycine-NaOH 완충액(pH 9.5), 5 mM Mg²⁺, 3 mM NAD⁺/NADP⁺ 및 0.5-100 mM 에탄올을 포함하는 반응 혼합물로 실온에 두어 확인하였다. FLS 및 이의 변이체의 운동 파라미터는 100 mM 인산 완충액(pH 8.0), 1 mM Mg⁺, 0.1 mM TPP 및 0.5-20 mM 아세트알데히드를 포함하는 반응 혼합물로 실온에 두어 확인하였다. 상기 K _m 및 k _cat 값은 미카엘리스-멘텐 방정식(Michaelis-Menten equation)의 비선형 회귀 피팅으로 확인하였으며 3회 반복하였다.

<1-8> 무-세포 다중 효소 촉매 시스템(Cell-free multi-enzyme catalysis system)

도 1에 나타낸 바와 같이, 무-세포 다중 효소 촉매를 이용하여 에탄올로부터 아세토인의 합성은 기질, 조효소, 금속 이온 및 해당되는 효소를 포함하는 0.5-mL 반응 혼합물로 수행하였다. 온도, pH, 조효소 및 메탈 이온을 포함하는 반응 조건은 인공적인 반응 경로의 플럭스(flux)를 증대시키기 위한 최적 조건으로 수행하였다. 아세토인의 최적 반응 조건은 하기와 같다.

아세토인 생성은 50 mM HEPES buffer (pH 8.0), 1 mM NAD⁺, 0.1 mg mL^-1 EtDH, 0.2 mg mL^-1 FLS:L482S, 0.1 mg mL^-1 NOX, 0.1 mM TPP, 1 mM Mg²⁺, 1 mM DTT, 20 % DMSO 및 100 mM 에탄올을 포함하는 0.5-mL 반응 혼합물을 30도 두어 수행하였다.

모든 반응은 6시간 동안 수행하였으며, 각 생성물은 가스 크로마토그래피로 확인하였다. 또한, 생성물에 대한 백분율 수율은 하기와 같은 수식으로 계산하였다: 백분율 수율(%) = 생성물 수율(mM)/이론 수율(theoretical yield)(mM). 이론적으로, 2몰의 에탄올은 1몰의 아세토인을 생성할 수 있다.

<1-9> 단계적 연쇄 반응의 재순환성 확인(Recyclability of cascade reactions)

정제된 효소를 활성 규소 산화물 입자와 혼합하고 이를 12시간, 4도 조건으로 배양하였다. 고정화하기 전에, 규소 산화물 입자(4830HT; Nanostructured & Amorphous Materials, Houston, TX, USA)를 글루타르알데히드(glutaraldehyde) (Sigma)를 포함하는 나노입자를 처리하여 활성화시켰다. 고정화 수율(%) 및 고정화 효율(%)은 다음과 같은 고정화된 효소로 다음과 같은 수학식으로 계산하였다 : 고정화 효율 = (α_i/α_f)×100, 고정화 수율 = [{P_i-(P_w + P_s)}/P_i]×100. α_i는 고정화된 효소의 총 활성도이고, α_f는 자유 효소의 총 활성도이며, Pi는 조효소 제제의 총 단백질 함량이고, Pw 및 Ps는 고정 후 세척용액 또는 상등액의 단백질 농도를 의미한다.

아세토인 생산을 위하여, 50 mM HEPES 완충액(pH 8.0), 1 mM NAD⁺, 1.06 U mL^-1 EtDH, 0.05 U mL^-1 FLS:L482S, 0.98 U mL^-1 NOX, 0.1 mM TPP, 1 mM Mg²⁺, 1 mM DTT, 20% DMSO 및 100 mM 에탄올을 포함하는 0.5mL 반응 혼합물로 반응을 수행하였다.

또한, 고정화된 효소의 재사용성을 확인하기 위하여, 상기와 같은 동일한 반응 조건하에 수행하였다. 각 1차 반응 순환 후, 고정화된 효소는 4000×g로 30분 동안 원심분리하여 제거하였다. 고정화된 효소를 수집하고 탈이온수 및 완충액으로 세척하였다. 2차 반응 순환을 위하여, 상기 고정화된 효소를 새로운 완충액에 용해시키고, 기질을 첨가한 후, 상기 1차 반응 순환과 동일하게 처리하였다.

<1-10> 분석 방법

세포 성장 분석

세포 성장은 분광 광도계(UV-1800, MAPADA)를 사용하여 600 nm에서 광학 밀도를 측정하여 확인하였다. 단백질 농도는 브레트포드 법(Bradford method)을 이용하여 측정하였고, 소 혈청 알부민(bovine serum albumin)을 표준 단백질로 사용하였다.

GC-MS 분석

키랄 칼럼(chiral column)(Supelco β-DEX™ 120, 30-m 길이, 0.25-mm 내경)이 장착된 가스 크로마토그래프 시스템(Agilent GC9860, Santa Clara, CA, USA)을 사용하여 정량하였다. 수행 조건은 다음과 같다: N2를 1.2 mL min^-1의 유속으로 캐리어 카스로서 이용하였다; 인젝터 온도 및 검출기 온도는 각각 215 및 245도로 설정하였다; 칼럼 온도는 50도에서 1.5분간 유지시킨 후, 15°C min^-1의 속도로 180도까지 증가시켰다.

<실시예 2> 본 발명의 다단계 효소 및 이의 변이체의 단백질 발현 확인

본 발명의 다단계 효소 및 이의 변이체 단백질 발현을 확인하기 위하여, 18도에서 24시간 유도한 후, 세포를 원심 분리하여 수득하고 ice bath에서 초음파 처리하여 파쇄하였다. 세포 파편을 제거하기 위하여 세포 용해물을 8000×g, 10분간 원심 분리하였다. NOX, EtDH, FLS, BDH 및 dhaR 효소를 수득하기 위하여, 용해성 분획을 정제 프로토콜(GE Healthcare, Little Chalfont, UK)에 따라 HisTrap HP 칼럼을 이용하여 정제하였다. DDH 정제는 종래의 방법으로 수행하였다[M. Seyfried, et al., J. Bacteriol., 1996, 178, 5793]. 상기 각 정제된 효소는 초미세여과(ultrafiltration)하여 농축 및 탈염화시킨 후, SDS-PAGE로 검출하였다. 그 결과를 도 3에 나타내었다.

도 3에 나타낸 바와 같이, EtDH 및 EtDH:D46G 단백질이 제대로 발현됨을 확인하였다. 또한, 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus) 유래 또는 락토바실러스 브레비스(Lactobacillus brevis) 유래된 NOX 단백질은 각각 분자량이 상이하여, 동일한 유전자라 할지라도 유래에 따라 발현되는 단백질이 상이함을 확인하였다. 또한, FLS 유전자가 제대로 발현됨을 확인하였다.

<실시예 3> 본 발명의 다단계 효소 및 이의 변이체를 이용한 에탄올에서 C ₄ 화합물 생성 확인

본 발명의 다단계 효소 및 이의 변이체를 이용하여, 에탄올에서 C₄화합물인 아세토인 생성을 유도하기 위하여, 상기 무-세포 다중 효소 촉매 시스템을 이용한 인공 합성 경로를 도 1과 같이 설계하였다. 에탄올은 먼저 NAD(P)H-의존성 EtDH에 의해 탈수소되어 아세트알데히드를 생성하며, 응축 반응을 거쳐 본 발명의 FLS 및 이의 변이체에 의하여 아세토인을 생성한다. NOX는 NAD⁺를 재생하는 데 사용한다.

<3-1> 본 발명의 FLS 효소에 따른 아세토인 생성 확인

본 발명의 FLS 효소에 의한 아세트알데히드에서 아세토인으로의 전환능을 확인하기 위하여, VP 반응을 수행하였으며, 기질인 아세트알데히드를 50 또는 100nM 처리하거나, 처리시간을 0 또는 6시간 두고 FLS 효소를 처리하여 각 조건을 설정하였다. 그 결과를 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타낸 바와 같이, 아세토인이 생성됨을 확인하여, FLS 효소를 처리하고, 기질인 아세트알데히드를 농도로 달리할 경우 얻어지는 아세토인 농도도 다르다는 것을 색의 변화가 짙음을 통해 효과적으로 확인하였다.

<3-2> 본 발명의 다단계 효소 및 이의 변이체를 이용한 아세토인 생성 분석

본 발명의 다단계 효소 및 이의 변이체를 이용하여, 이를 무-세포 다중 효소 촉매 시스템을 이용한 인공 합성 경로로 아세토인을 생성하였다. 그 후, 시판되는 표준 물질인 에탄올, 아세트알데히드, 3S/3R)-아세토인(acetoin)을 혼합하여 이를 대조군으로서 이용하였다. 또한, 본 발명의 무-세포 다중 효소 촉매에 따른 각 다단계 효소를 이용한 분석 결과를 GC/GC-MS 분석을 이용하여 수행하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 각 다단계 효소를 이용한 무-세포 다중 효소 촉매 시스템을 이용 시, 시판되는 표준 물질과 비교하여 동일한 피크의 아세토인을 생성함을 확인하였다.

<실시예 4> 본 발명의 인공 합성 경로에서 다단계 효소 및 이의 변이체의 촉매 효과 확인

<4-1> 본 발명의 다단계 효소 및 이의 변이체의 운동 파라미터(kinetic parameter) 측정을 통한 촉매 효율 비교

본 발명의 다단계 효소 및 이의 변이체의 운동 파라미터(kinetic parameter) 측정을 통한 촉매 효율을 비교하기 위하여, 다음과 같은 실험을 수행하였다.

구체적으로, EtDH 및 EtDH:D46G의 운동 파라미터는 100 mM glycine-NaOH 완충액(pH 9.5), 5 mM Mg²⁺, 3 mM NAD⁺/NADP⁺ 및 0.5-100 mM 에탄올을 포함하는 반응 혼합물로 실온에 두어 확인하였다. FLS 및 이의 변이체의 운동 파라미터는 100 mM 인산 완충액(pH 8.0), 1 mM Mg⁺, 0.1 mM TPP 및 0.5-20 mM 아세트알데히드를 포함하는 반응 혼합물로 실온에 두어 확인하였다. 기질 친화도인 Km 및 kcat 값은 미카엘리스-멘텐 방정식(Michaelis-Menten equation)의 비선형 회귀 피팅으로 확인하였으며 3회 반복하였다. DDH 및 NOX는 종래 결과[(S. Kwak, et al., Bioresource Technol., 2013, 135, 432), (M. Kopke, et al., Appl. Environ. Microbiol., 2014, 80, 3394)]를 참고하여 비교하였다. 그 결과를 표 4에 나타내었다.

표 4에 나타낸 바와 같이, EtDH 및 EtDH:D46G 효소는 기질로서 에탄올, 조효소로서 NAD⁺를 이용 시, 각 kcat/Km 값이 17.09, 9.97s^-1mM^-1임을 확인하여, 조효소로서 NADP⁺를 이용하는 것 보다 NAD⁺를 이용하는 것이 촉매 효율을 높일 수 있음을 확인하였다.

또한, FLS 효소는 기질로서 아세트알데히드를, 조효소로서 TPP(thiamine pyrophosphate)를 이용 시, kcat/Km 값이 7.69×10^-3 s^-1mM^-1임을 확인하였다. 또한, 이의 변이체인 FLS:L482S, FLS:L482R 및 FLS:L482E는 각 kcat/Km 값이 1.33×10^-2, 1.06×10^-2 및 9.66×10^-3s^-1mM^-1임을 확인하여, 상기 야생형 FLS 효소 보다 각 72.95%, 37.84% 및 25.62%으로 촉매 효율이 증가됨을 확인하였다.

Enzyme	Substrate/coenzyme	K _m	k _cat	k _cat/K _m
Enzyme	Substrate/coenzyme	(mM)	(s^-1)	(s^-1 mM^-1)
EtDH	Ethanol/NAD⁺	0.37 ± 0.05	6.28 ± 0.11	17.09
EtDH	Ethanol/NADP⁺	0	0	0
EtDH:D46G	Ethanol/NAD⁺	0.57 ± 0.03	5.65 ± 0.09	9.97
EtDH:D46G	Ethanol/NADP⁺	0.60 ± 0.02	0.99 ± 0.03	1.65
FLS	Acetaldehyde/TPP	58.46 ± 2.32	0.45 ± 0.03	7.69 × 10^-3
FLS:L482S	Acetaldehyde/TPP	47.45 ± 1.20	0.63 ± 0.01	1.33 × 10^-2
FLS:L482R	Acetaldehyde/TPP	50.27 ± 1.44	0.53 ± 0.02	1.06 × 10^-2
FLS:L482E	Acetaldehyde/TPP	50.95 ± 1.51	0.49 ± 0.03	9.66 × 10^-3
NOX	O2/NADH	5.8 ×10-3	218.7	3.77 ×104

<4-2> 본 발명의 다단계 효소 및 이의 변이체의 열 안정성(Thermostability) 확인

본 발명의 다단계 효소 및 이의 변이체의 열 안정성을 확인하기 위하여, EtDH(에탄올, NAD+ 포함), EtDH:D46G(에탄올, NAD⁺ 포함), EtDH:D46G(에탄올, NADP⁺), EtDH:D46G (ethanol, NAD+ 포함), FLS(아세트알데히드, TPP 포함), FLS:L482S(아세트알데히드, TPP), NOX (O₂, NADH 포함) 세포를 30, 37, 45 에서 6시간 동안 배양한 후 활성을 측정하였다. 그 결과를 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타낸 바와 같이, 열 안정성을 확인한 결과, 30도 조건에서 EtDH, FLS 및 NOX 효소는 각 87.91%, 70.43%, 및 91.30%의 열 안정성이 나타남을 확인하였다. 또한, 37도 및 45도에서 NOX 효소는 지속적인 열 안정성이 나타남을 확인하였다.

<실시예 5> 본 발명의 인공 합성 경로를 통한 아세토인 생성

<5-1> 에탄올에서 아세토인으로의 최적 반응 조건 확인

에탄올에서 아세토인의 생성을 위하여, EtDH, FLS 및 NOX 효소를 사용하였다. 구체적으로, 초기 반응은 50 mM HEPES 버퍼(pH 7.0), 0.1 mg mL^-1 EtDH, 0.2 mg mL^-1 FLS, 0.1 mg mL^-1 NOX, 4 mM NAD⁺, 0.1 mM TPP, 1 mM Mg²⁺, 1 mM DTT, 20% DMSO, 초기 기질로서 100 mM 에탄올을 포함하는 0.5-mL 반응 혼합액을 이용하였다. 반응은 30도 조건에서 6시간 동안 진행하였고, 반응 용액에서 이론적 수득율(theoretical yield)의 35.96%인 17.98 mM의 아세토인이 생성됨을 확인하여, 본 발명의 인공 합성 경로를 이용시, 에탄올에서 아세토인으로 반응 유도가 가능함을 확인하였다.

또한, 온도, pH, 조효소(NAD⁺ 및 TPP) 및 금속 이온의 조건에 따라, 반응 최적 조건을 찾기 위하여, 온도는 20, 25, 30, 37 및 42도의 조건을 두었다. 또한, pH는 6.0, 6.5, 7.0, 7.5, 8.0, 8.5 및 8.5의 조건에서, NAD⁺는 1, 2, 4, 6, 8 mM 농도 조건에서, TPP는 1, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4 및 0.5 mM 농도 조건에서, 금속 이온은 Mg²⁺, Mn²⁺, Ca²⁺, Fe²⁺, Ni²⁺, Cu²⁺ 및 Zn²⁺을 처리하여 최적 반응 조건을 확인하였다. 그 결과를 도 7a 내지 도 7e에 나타내었다.

도 7a의 결과 pH 조건은 8.0이, 도 17b의 결과 온도는 30도에서, 도 7c의 결과 NAD+의 농도는 1mM에서, 도 7d의 결과 TPP는 0.1mM 농도에서, 도 7e의 결과 금속 이온 Mg²⁺에서 가장 최적 반응 조건임을 확인하였으며, 에탄올에서 아세토인으로의 반응 플럭스를 향상시킴을 확인하였다.

또한, 상기 최적 반응 조건에 시간에 따른 아세토인의 생성을 확인하기 위하여, EtDH, FLS 및 NOX 효소를 이용하고 100 mM 에탄올을 기질로 하여 0, 2, 4, 6, 및 8 시간을 처리하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다.

도 8에 나타낸 바와 같이, 6시간 처리 시, 이론적 수득율(theoretical yield)의 45.50%인 22.75 mM의 아세토인이 생성됨을 확인하였다.

<5-2> 에탄올에서 아세토인으로의 속도 조절 단계(Rate limiting step) 확인

에탄올에서 아세토인으로의 속도 조절 단계를 확인하기 위하여, 각 EtDH, FLS 또는 NOX 효소를 1/10의 농도로 줄이고 이를 제외한 나머지 효소는 일정한 농도를 유지하여 3회 반복하여 아세토인 양을 확인하였다. 그 결과를 도 9에 나타내었다.

도 9에 나타낸 바와 같이, EtDH 또는 NOX 효소보다 FLS 효소의 농도가 줄어들었을 때, 아세토인의 생성에 영향을 끼침을 확인하였다. 따라서, 상기 FLS 효소는 아세토인 생성에 중요한 효소임을 확인하였다.

<5-3> FLS 효소 변이체의 촉매 효율 확인 및 선발

FLS 효소의 촉매 효율을 향상시키기 위해, HotSpot Wizard 2.0 서버를 사용하여 FLS 아미노산 서열의 돌연변이 핫스팟을 분석 하였다. 핫 스팟 마법사 2.0 서버를 사용하여 핫 스팟 잔기(T396, T446, M473, S477, L482 및 L499) 6개 부위 포화 돌연변이 유발을 확인하고, 이의 각 구조 모델을 도 10에 나타내었다.

도 10에 나타낸 바와 같이, FLS에서 482 부위가 효소 활성에 중요한 역할을 함을 확인하였다.

또한, 상기 FLS 변이체를 선발하기 위하여, FLS 및 이의 변이체인 L482S, L482R 및 L482E를 전체-세포 생촉매법을 이용하여 기질로서 아세트알데히드(100 mM)를 이용하여 아세토인을 생성 농도를 VP 법을 이용하여 확인하였다. 또한, 정제 후 FLS의 고유 활성(specific activity)인 0.16 U/mg과 비교하여, 각 변이체의 활성(%)을 비교하였으며 3회 반복하여 평균 ± 표준 편차값을 구하였다. 그 결과를 도 11a 및 11b에 나타내었다.

도 11a에 나타낸 바와 같이, 야생 FLS보다 FLS 변이체가 아세토인을 더 생성함을 확인하였다. 또한, 도 11b에 나타낸 바와 같이, FLS 변이체 L482S, L482R 및 L482E은 FLS 고유 활성보다 각 59.03%, 36.89% 및 34.12%로 증가됨을 확인하였다. 따라서, FLS 변이체 중L482S가 가장 아세토인 생성에 효과적임을 확인하였다.

<5-4> 야생형 FLS와 이의 변이체 FLS:L482S의 구조 및 활성 비교

야생형 FLS와 이의 변이체 FLS:L482S의 구조 및 활성을 비교하기 위하여, 100 ns에 대한 분자 역학 시뮬레이션 분석을 사용하여 야생형 FLS와 이의 변이체 FLS:L482S의 구조적 변화와 효소 활성간의 상관 관계를 확인하였다. 그 결과를 도 12a 내지 도 12d에 나타내었다.

도 12a 및 도 12b에 나타낸 바와 같이, 야생형 FLS와 이의 변이체 FLS:L482S는 기질인 아세트알데히드와 분자 상호 작용은 활성 부위 잔기 W480이며, 야생형 FLS보다(2.1Å) 변이체 FLS:L482S가 기질인 아세트알데히드에 더 강하게 결합(2.8Å)함을 확인하였다. 또한, 도 12c 및 도 12d에 나타낸 바와 같이, 변이체 FLS:L482S는 야생형 FLS보다 더 수소 결합함을 확인하였다.

<5-5> 기질 및 농도에 따른 FLS:L482S의 활성 비교

기질로서 에탄올을 이용하고 이의 농도에 따른 FLS:L482S의 활성을 비교하기 위하여, 50 mM HEPES 버퍼(pH 8.0), 1 mM NAD⁺, 1.06 Uml^-1 EtDH, 0.05 U mL^-1 FLS:L482S, 0.98 U mL^-1 NOX, 0.1 mM TPP, 1 mM Mg²⁺, 1 mM DTT, 20% DMSO, 및 100-500 mM 에탄올을 포함하는 0.5-mL 반응 혼합액으로 반응을 수행하였다. 그 후, 0-6시간, 30도의 조건을 두어 아세토인 생성을 확인하였다. 그 결과를 도 13a 및 도 13b에 나타내었다.

도 13a에 나타낸 바와 같이, 반응 4시간째에 100 mM 에탄올을 기질로 이용 시, 이론적 수율의 88.78%에 해당하는 44.39 mM의 아세토인을 수득하였다. 아세토인 이외에, 에탄올의 대사 작용에 생성되는 아세트알데히드가 측정되었고, 이는 반응 2시간 동안 9.58 mM까지 축적된 다음 6 시간에 5.65 mM로 감소함을 확인하였다. 또한, 다른 부산물은 축적되지 않아, FLS:L482S를 이용한 아세토인의 생산을 위한 본 발명의 인공 합성 경로는 기질에 특이적임을 확인하였다.

도 13b에 나타낸 바와 같이, 아세토인 생산에 대한 기질 농도(200, 300, 400 및 500 mM)의 영향을 확인한 결과, 농도 의존적으로 아세토인 및 아세트알데히드의 생성이 증가됨을 확인하였다.

<실시예 6> 본 발명의 인공 합성 경로에서의 최적 효소 및 이의 고유 활성도

본 발명의 인공 합성 경로에서의 최적 효소와 이의 활성에 영향을 미치는 각 기질 및 조효소를 확인하였다. 또한, 각 효소의 고유 활성도(Specific activity)를 확인하였다. 그 결과를 표 5에 나타내었다.

표 5에 나타낸 바와 같이, EtDH 또는 EtDH:D46G 변이체 효소는 기질로서 에탄올, 조효소로서 NAD⁺을 이용 시, 고유 활성도가 각 10.64±0.15, 8.81±0.13 U mg^-1임을 확인하였다. 또한, FLS:L482S 변이체 효소는 기질로 아세트알데히드, 조효소로 TPP를 이용 시, 0.26±0.01 U mg^-1임을 관찰하였다. NOX 조효소는 O₂ 기질, NADH 조효소일 때 9.83 ± 0.48 mg^-1의 고유 활성도가 나타남을 확인하였다.

Enzyme	Substrate/coenzyme	Specific activity (U mg^-1)
EtDH	Ethanol/NAD⁺	10.64 ± 0.15
EtDH:D46G	Ethanol/NAD⁺	8.81 ± 0.13
EtDH:D46G	Ethanol/NADP⁺	1.35 ± 0.01
FLS:L482S	Acetaldehyde/TPP	0.26 ± 0.01
NOX	O₂/NADH	9.83 ± 0.48

<실시예 7> 아세토인 생산을 위한 효소의 재순환성 확인(Recyclability of cascade reactions)

아세토인 생산을 위한 효소의 재순환성을 확인하기 위하여, 상기 실시예 1-8의 방법에 따라, 아세토인 생산을 위한 각 효소를 활성 규소 산화물 입자와 혼합하고 이를 12시간, 4도 조건으로 배양하였다. 고정화하기 전에, 규소 산화물 입자(4830HT; Nanostructured & Amorphous Materials, Houston, TX, USA)를 글루타르알데히드(glutaraldehyde) (Sigma)를 포함하는 나노입자를 처리하여 활성화 시키고, 1차-10차 반응 순환하여 고정화 수율(%) 및 고정화 효율(%)을 확인하였다. 그 결과를 도 14a 및 14b에 나타내었다.

도 14a에 나타낸 바와 같이, 고정화된 효소를 이용 시, 효과적으로 에탄올에서 아세토인을 생성함을 확인하였다.

또한, 14b에 나타낸 바와 같이, 아세토인 생성을 위한 고정화된 효소를 1차 내지 10차 반응 순환한 결과, 10차 재사용 후에도 초기 1차 아세토인 생성 농도와 비교하여 94 %의 효율이 나타남을 확인하였다.

<110> Konkuk University Industrial Cooperation Corp <120> A method for producing acetoin from ethanol <130> PN1802-065 <150> KR 10-2017-0176269 <151> 2017-12-20 <160> 26 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1362 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Full-length NOX <400> 1 atgaagattc ttgtcattgg tgctacccat gccggtacat ttgcaaccca gcagatccta 60 accgaccatc cagatgcaga ggttactgtc tacgaacgca ataacaacct gtccttcctc 120 tcgtgcggca ttgccttgtg ggttggtgat catgtcagtg acccggataa aatgttctat 180 tccagtcccg aagcactcgc taaactcggt gctaatatgc aaatggaaca tgatgtgctc 240 aatattgatc cagcaactaa aacagttgaa gtcaaggatc taaaaaccgg aaccgttact 300 accgatactt atgacaaatt agtctacaca accggatcga cgccaatcat tccaaatatt 360 cccggtatcc acgattcaaa cgtctactta tgcaaaaatt ggtccgacgc caagacgcta 420 aaagatctgg ccccgtccat taaaagcgcc attgtcatcg gtgcaggcta catcggtgca 480 gaattagccg aacaatttgc gttaaccgac aaagaagtca cgttaatcga tggacttcca 540 cgggttttgg cgaaaaactt tgacgccact atcacggatc gcgttgaaaa gctttacacc 600 gatcacgggg ttcacttggc actcaatgag atggttaccg agttcgcaca agctgatcag 660 ggtatcaagg ttacaaccaa taaaggcgac tataccgcgg atattgcaat tttatgtacc 720 ggcttccgtc cgaacacgga tctgctaaag gaccatctgg acaccctgcc taatggcgct 780 gtcataacaa atgcatatat gcagaccagt gaccccgaca ttttcgctgc tggtgatacc 840 gctaccgtcc actataatcc gactggcaaa aatgactaca tcccgcttgc gaccaacgca 900 gtccgtcaag gcattcttgt tggtaaaaat atcatgaccc ccacggaaaa atacctggga 960 acacaatcta gctcggccgt tgaacttttt gatcacgcca ttgcggcaag cggcctaacg 1020 gtggaaggcg ctcacacacg tggacttgag cttgatagtg tcacgatcga acaggattat 1080 cgccccgatt tcatgttaac cacaacgccg gtgctctgca gcctgacatg ggatcccaag 1140 acgcatgaag ttaaaggagg tgcctttttc tccaagcacg atatcagcca aagcgctaat 1200 gtcatttcgc ttgcgatcca gacccacatg acgatcgaaa cacttgcgat ggttgacatg 1260 ctcttccaac ctaacttcga tcagccgatt aactgggtaa atgccgtggc tatggcggca 1320 gttgacaagg ctaaaaagaa gccgacaaca ccggtagcct aa 1362 <210> 2 <211> 453 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> AMINO ACID OF NOX <400> 2 Met Lys Ile Leu Val Ile Gly Ala Thr His Ala Gly Thr Phe Ala Thr 1 5 10 15 Gln Gln Ile Leu Thr Asp His Pro Asp Ala Glu Val Thr Val Tyr Glu 20 25 30 Arg Asn Asn Asn Leu Ser Phe Leu Ser Cys Gly Ile Ala Leu Trp Val 35 40 45 Gly Asp His Val Ser Asp Pro Asp Lys Met Phe Tyr Ser Ser Pro Glu 50 55 60 Ala Leu Ala Lys Leu Gly Ala Asn Met Gln Met Glu His Asp Val Leu 65 70 75 80 Asn Ile Asp Pro Ala Thr Lys Thr Val Glu Val Lys Asp Leu Lys Thr 85 90 95 Gly Thr Val Thr Thr Asp Thr Tyr Asp Lys Leu Val Tyr Thr Thr Gly 100 105 110 Ser Thr Pro Ile Ile Pro Asn Ile Pro Gly Ile His Asp Ser Asn Val 115 120 125 Tyr Leu Cys Lys Asn Trp Ser Asp Ala Lys Thr Leu Lys Asp Leu Ala 130 135 140 Pro Ser Ile Lys Ser Ala Ile Val Ile Gly Ala Gly Tyr Ile Gly Ala 145 150 155 160 Glu Leu Ala Glu Gln Phe Ala Leu Thr Asp Lys Glu Val Thr Leu Ile 165 170 175 Asp Gly Leu Pro Arg Val Leu Ala Lys Asn Phe Asp Ala Thr Ile Thr 180 185 190 Asp Arg Val Glu Lys Leu Tyr Thr Asp His Gly Val His Leu Ala Leu 195 200 205 Asn Glu Met Val Thr Glu Phe Ala Gln Ala Asp Gln Gly Ile Lys Val 210 215 220 Thr Thr Asn Lys Gly Asp Tyr Thr Ala Asp Ile Ala Ile Leu Cys Thr 225 230 235 240 Gly Phe Arg Pro Asn Thr Asp Leu Leu Lys Asp His Leu Asp Thr Leu 245 250 255 Pro Asn Gly Ala Val Ile Thr Asn Ala Tyr Met Gln Thr Ser Asp Pro 260 265 270 Asp Ile Phe Ala Ala Gly Asp Thr Ala Thr Val His Tyr Asn Pro Thr 275 280 285 Gly Lys Asn Asp Tyr Ile Pro Leu Ala Thr Asn Ala Val Arg Gln Gly 290 295 300 Ile Leu Val Gly Lys Asn Ile Met Thr Pro Thr Glu Lys Tyr Leu Gly 305 310 315 320 Thr Gln Ser Ser Ser Ala Val Glu Leu Phe Asp His Ala Ile Ala Ala 325 330 335 Ser Gly Leu Thr Val Glu Gly Ala His Thr Arg Gly Leu Glu Leu Asp 340 345 350 Ser Val Thr Ile Glu Gln Asp Tyr Arg Pro Asp Phe Met Leu Thr Thr 355 360 365 Thr Pro Val Leu Cys Ser Leu Thr Trp Asp Pro Lys Thr His Glu Val 370 375 380 Lys Gly Gly Ala Phe Phe Ser Lys His Asp Ile Ser Gln Ser Ala Asn 385 390 395 400 Val Ile Ser Leu Ala Ile Gln Thr His Met Thr Ile Glu Thr Leu Ala 405 410 415 Met Val Asp Met Leu Phe Gln Pro Asn Phe Asp Gln Pro Ile Asn Trp 420 425 430 Val Asn Ala Val Ala Met Ala Ala Val Asp Lys Ala Lys Lys Lys Pro 435 440 445 Thr Thr Pro Val Ala 450 <210> 3 <211> 1173 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Full-length EtDH <400> 3 atgacccatc tgaatattgc taatcgcgtg gatagttttt ttattccgtg tgttaccctg 60 tttggcccgg gttgcgcacg tgaaaccggc gcccgtgcac gtagtctggg cgcacgtaaa 120 gccctgattg ttaccgatgc tggcctgcat aaaatgggcc tgtcagaagt tgttgcaggt 180 catattcgtg aagctggtct gcaagcagtg atttttccgg gcgctgaacc gaatccgacc 240 gatgttaatg tgcatgatgg tgtgaaactg tttgaacgtg aagaatgtga ttttattgtg 300 tctctgggtg gcggtagcag ccatgattgc gctaaaggca ttggcctggt taccgcgggt 360 ggcggccata ttcgcgatta tgaaggtatt gataaaagta ccgtgccgat gaccccgctg 420 atttcaatta ataccaccgc tggtacagcc gccgaaatga cccgcttttg tattattacc 480 aattctagta atcatgttaa aatggcaatt gttgattggc gttgcacccc gctgattgcg 540 attgatgacc ctagtctgat ggtggcaatg ccgccggcgc tgaccgcggc aaccggcatg 600 gatgctctga cccatgcaat tgaagcgtat gtgtcaaccg cagccacccc gattaccgat 660 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Ala Gln Val Ile Gln Val Asp Pro Asp 290 295 300 Ala Cys Glu Leu Gly Arg Leu Gln Gly Ile Ala Leu Gly Ile Val Ala 305 310 315 320 Asp Val Gly Gly Thr Ile Glu Ala Leu Ala Gln Ala Thr Ala Gln Asp 325 330 335 Ala Ala Trp Pro Asp Arg Gly Asp Trp Cys Ala Lys Val Thr Asp Leu 340 345 350 Ala Gln Glu Arg Tyr Ala Ser Ile Ala Ala Lys Ser Ser Ser Glu His 355 360 365 Ala Leu His Pro Phe His Ala Ser Gln Val Ile Ala Lys His Val Asp 370 375 380 Ala Gly Val Thr Val Val Ala Asp Gly Gly Leu Thr Tyr Leu Trp Leu 385 390 395 400 Ser Glu Val Met Ser Arg Val Lys Pro Gly Gly Phe Leu Cys His Gly 405 410 415 Tyr Leu Asn Ser Met Gly Val Gly Phe Gly Thr Ala Leu Gly Ala Gln 420 425 430 Val Ala Asp Leu Glu Ala Gly Arg Arg Thr Ile Leu Val Thr Gly Asp 435 440 445 Gly Ser Val Gly Tyr Ser Ile Gly Glu Phe Asp Thr Leu Val Arg Lys 450 455 460 Gln Leu Pro Leu Ile Val Ile Ile Met Asn Asn Gln Ser Trp Gly Trp 465 470 475 480 Thr Glu His Phe Gln Gln Leu Ala Val Gly Pro Asn Arg Val Thr Gly 485 490 495 Thr Arg Leu Glu Asn Gly Ser Tyr His Gly Val Ala Ala Ala Phe Gly 500 505 510 Ala Asp Gly Tyr His Val Asp Ser Val Glu Ser Phe Ser Ala Ala Leu 515 520 525 Ala Gln Ala Leu Ala His Asn Arg Pro Ala Cys Ile Asn Val Ala Val 530 535 540 Ala Leu Asp Pro Ile Pro Pro Glu Glu Leu Ile Leu Ile Gly Met Asp 545 550 555 560 Pro Phe Ala <210> 13 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EtDH1 Primer <400> 13 gattgttacc ggtgctggcc tgcataaaat g 31 <210> 14 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> EtDH2 Primer <400> 14 cattttatgc aggccagcac cggtaacaat c 31 <210> 15 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FLS1 Primer <400> 15 ggtagcggat ggtggcctgn nntatctctg gctgtcc 37 <210> 16 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FLS2 Primer <400> 16 ggacagccag agatannnca ggccaccatc cgctacc 37 <210> 17 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FLS3 Primer <400> 17 ccgccgcacg atccttgtgn nnggcgatgg ctcggtg 37 <210> 18 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> 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Claims

서열번호 8로 표시되는 FLS(formolase) 아미노산에서 482번째 루신이 세린, 아르기닌 및 글루탐산으로 치환된 변이로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 변이를 포함하는 FLS 변이 아미노산.
제1항에 있어서, 상기 FLS는 서열번호 7로 표시되는 염기서열로 코딩되는 것을 특징으로 하는, FLS 변이 아미노산.
제1항에 있어서, 상기 FLS에서 482번째 루신이 세린으로 치환된 변이는(FLS:L482S) 서열번호 10의 아미노산으로 표시되고, 482번째 루신이 아르기닌으로 치환된 변이는(FLS:L482R) 서열번호 11의 아미노산으로 표시되며, 482번째 루신이 글루탐산으로 치환된 변이는(FLS:L482E) 서열번호 12의 아미노산으로 표시되는 것을 특징으로 하는, FLS 변이 아미노산.
제1항에 있어서, 상기 FLS 변이 아미노산은 396번째 트레오닌의 변이, 446번째 트레오닌의 변이, 473번째 메티오닌의 변이, 477번째 세린의 변이 및 499번째 루신의 변이로 구성된 군에서 선택된 1종 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는, FLS 변이 아미노산.
상기 FLS는 슈도모나스 플루오레스센스(Pseudomonas fluorescens)로부터 유래된 것을 특징으로 하는, FLS 변이 아미노산.
제1항의 FLS 변이 아미노산을 코딩하는 유전자.
NOX(NADH oxidase) 유전자, EtDH(ethanol dehydrogenase) 유전자, EtDH의 변이체 유전자, FLS(formolase) 유전자 및 제6항의 FLS 변이 아미노산을 코딩하는 유전자로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 유전자를 포함하는 재조합 벡터.
제7항에 있어서, 상기 NOX 유전자는 락토바실러스 람노서스(Lactobacillus rhamnosus)로부터 유래된 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
제7항에 있어서, 상기 EtDH 유전자 또는 EtDH 변이체 유전자는 쿠프리아비두스 네카터(Cupriavidus necator)로부터 유래된 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
제7항에 있어서, 상기 NOX 유전자는 서열번호 1로 표시되는 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
제7항에 있어서, 상기 EtDH 유전자는 서열번호 3의 염기서열 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
제7항에 있어서, 상기 EtDH의 변이체는 서열번호 4의 아미노산 서열로 표시되는 EtDH의 46번째 아스파르트산이 글리신으로 치환되고(EtDH:D46G), 서열번호 5의 염기서열 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 표시되는 것을 특징으로 하는, 재조합 벡터.
제7항의 재조합 벡터가 도입된 형질전환 미생물.
제13항의 형질전환 미생물에서 생산된 단백질을 정제하고 반응시키는 단계;를 포함하는 아세토인 생산 방법.
제14항에 있어서, 상기 생산 방법은 무-세포(cell-free) 상태에서 제13항의 형질전환 미생물에서 생산된 단백질을 다단계 촉매 작용을 수행하여 아세토인을 생산하는 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 생산 방법은 에탄올을 기질로 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 생산 방법은 조효소인 NAD⁺, NADP⁺, 비타민 B₁₂ 및 TPP(thiamine pyrophosphate)로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 조효소를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 생산 방법은 금속 이온 Mg²⁺, Mn²⁺, Ca²⁺, Fe²⁺, Ni²⁺, Cu²⁺ 및 Zn²⁺으로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 금속 이온을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 생산 방법은 pH 5.0 내지 8.5의 조건으로 아세토인을 생산하는 것을 특징으로 하는 방법.
제14항에 있어서, 상기 생산 방법은 16 내지 45도에서 아세토인을 생산하는 것을 특징으로 하는 방법.
제13항의 형질전환 미생물에서 생산된 단백질을 나노입자에 고정하고 반응시키는 단계;를 포함하는 아세토인 생산 방법.
제21항에 있어서, 상기 나노입자는 산화 규소(silicon oxide)를 부착하고 글루타알데히드(glutaraldehyde)와 반응시키는 것을 특징으로 하는 방법.
제21항에 있어서, 상기 고정된 단백질 나노입자는 재사용이 가능한 것을 특징으로 하는 방법.