CN111349644A

CN111349644A - 生物合成异戊二醇的菌株及方法

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Publication number: CN111349644A
Application number: CN202010186932.5A
Authority: CN
Inventors: 张炽坚; 何廷刚; 艾勇; 陈林; 马成伟; 曾安平
Original assignee: Hua An Tang Biotech Group Co ltd
Current assignee: Hua An Tang Biotech Group Co ltd
Priority date: 2020-03-17
Filing date: 2020-03-17
Publication date: 2020-06-30

Abstract

本发明涉及生物合成领域，特别涉及生物合成异戊二醇的菌株及方法。本发明以3‑羟基异戊酸(3HIV)作为前体制备异戊二醇的生物合成途径，该途径依次通过CAR和醛酮还原酶对3HIV进行酶生物催化从而制备IPDO。

Description

生物合成异戊二醇的菌株及方法

技术领域

本发明涉及生物合成领域，特别涉及生物合成异戊二醇的菌株及方法。

背景技术

异戊二醇(3-甲基-1，3-丁二醇，IPDO)是一种无色无味的液体，与水完全混合。异戊二醇除了具有安全性和与其他成分的高度相容性外，在护肤应用中还可以起到保湿和润肤的作用。它也被用于修复受损头发的护发产品中。

到目前为止，化学合成仍被用于生产异戊二醇，然而该方法依赖于化石资源，且对环境不友好。因此，开发利用可再生碳水化合物原料生产IPDO的绿色生物合成工艺具有越来越大的工业价值。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种新的IPDO生物合成途径,利用单一微生物将可发酵碳源生物转化为异戊二醇(IPDO)。

为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

本发明提供了羧酸还原酶(CAR)和醛还原酶(特别是酿酒酵母中的NADPH依赖的甲基乙二醛还原酶GRE2或大肠杆菌中的乙醇脱氢酶YqhD)的过表达在生物合成异戊二醇中的应用。

羧酸还原酶(CARs)能够将多种羧酸催化还原为醛类，这些醛类很容易通过醛酮还原酶还原转化为目标醇。研究结果表明，从乙酰辅酶A出发通过部分的甲羟戊酸途径生物合成3HIV的可能性以及用丙酮和乙酰辅酶A通过生物催化生产3HIV的方法。此外，研究发现α-酮异已酸(KIC)可以在4-羟基苯丙酮酸双加氧酶(HPD)的催化下一步酶解生成3HIV(图1)。KIC是亮氨酸途径的中间产物，因此，KIC的生产可以通过使用工程微生物发酵方法或使用表达特定氨基酸脱氨酶(aad)的全细胞催化亮氨酸脱氨来实现。这使得可再生的碳水化合物原料(如葡萄糖)生产IPDO成为可能。

本发明还提供了α-酮异己酸双加氧酶(也称为4-羟基苯丙酮酸双加氧酶，HPD)、羧酸还原酶(CAR)和醛还原酶(特别是酿酒酵母中的NADPH依赖的甲基乙二醛还原酶GRE2或大肠杆菌中的乙醇脱氢酶YqhD)的过表达在生物合成异戊二醇中的应用。

本发明还提供了氨基酸脱氨酶(aad)、α-酮异己酸双加氧酶(也称为4-羟基苯丙酮酸双加氧酶，HPD)、羧酸还原酶(CAR)和醛还原酶(特别是酿酒酵母中的NADPH依赖的甲基乙二醛还原酶GRE2或大肠杆菌中的乙醇脱氢酶YqhD)的过表达在生物合成异戊二醇中的应用。

本发明还提供了α-酮异己酸双加氧酶(也称为4-羟基苯丙酮酸双加氧酶，HPD)、羧酸还原酶(CAR)和醛还原酶(特别是酿酒酵母中的NADPH依赖的甲基乙二醛还原酶GRE2或大肠杆菌中的乙醇脱氢酶YqhD)的过表达以及alsS(编码丙酮酸合成酶)、ilvC、ilvD、leuA、leuB、leuC、leuD的过表达在生物合成异戊二醇中的应用。

本发明还提供了生物合成异戊二醇的菌株，其羧酸还原酶和醛还原酶过表达。

本发明还提供了生物合成异戊二醇的菌株，其α-酮异己酸双加氧酶、羧酸还原酶和醛还原酶过表达。

本发明还提供了生物合成异戊二醇的菌株，其氨基酸脱氨酶、α-酮异己酸双加氧酶、羧酸还原酶和醛还原酶过表达。

本发明还提供了生物合成异戊二醇的菌株，其α-酮异己酸双加氧酶、羧酸还原酶和醛还原酶的过表达以及alsS(编码丙酮酸合成酶)、ilvC、ilvD、leuA、leuB、leuC、leuD的过表达在生物合成异戊二醇中的应用。

在本发明的一些具体实施方案中所述醛还原酶包括甲基乙二醛还原酶GRE2或乙醇脱氢酶YqhD；所述α-酮异己酸双加氧酶包括SaHPD、SnHPD、AaHPD或RaHPD；生物合成异戊二醇的底物为可发酵碳源，所述可发酵碳源包括3HIV、KIC、亮氨酸或葡萄糖。

本发明还提供了生物合成异戊二醇的方法，以所述的菌株为出发菌株；所述底物为可发酵碳源，所述可发酵碳源包括3-HIV、KIC、亮氨酸或葡萄糖。

在本发明的一些具体实施方案中，当底物为3HIV时，同时过表达羧酸还原酶(CAR)和醛还原酶(特别是酿酒酵母中的NADPH依赖的甲基乙二醛还原酶GRE2或大肠杆菌中的乙醇脱氢酶YqhD)。为此，构建了sLCKP03/pIBBLC45、sLCKP03/pIBBLC48。

在本发明的一些具体实施方案中，当底物为KIC时，同时过表达α-酮异己酸双加氧酶(也称为4-羟基苯丙酮酸双加氧酶，HPD)、羧酸还原酶(CAR)和醛还原酶(特别是酿酒酵母中的NADPH依赖的甲基乙二醛还原酶GRE2或大肠杆菌中的乙醇脱氢酶YqhD)。通过质粒pIBBLC30和pET-Car转入到菌株sLCKP01中过表达，获得菌株sLCKP01/(pIBBLC30+pET-Car)。

在本发明的一些具体实施方案中，当底物为亮氨酸时，同时过表达氨基酸脱氨酶(aad)、α-酮异己酸双加氧酶(也称为4-羟基苯丙酮酸双加氧酶，HPD)、羧酸还原酶(CAR)和醛还原酶(特别是酿酒酵母中的NADPH依赖的甲基乙二醛还原酶GRE2或大肠杆菌中的乙醇脱氢酶YqhD)。所需的四种酶aad、AaHPD、NiCAR和GRE2通过pIBBLC34质粒和psfp-NiCAR导入并在sLCKP01中过表达。

在本发明的一些具体实施方案中，当底物为葡萄糖时，同时过表达α-酮异己酸双加氧酶、羧酸还原酶和醛还原酶以及alsS(编码丙酮酸合成酶)、ilvC、ilvD、leuA、leuB、leuC、leuD。在菌株sLCKP03中使用了两个质粒来过表达从丙酮酸到IPDO生物转化过程中的相关基因，该菌株为sLCKP03/(p15Leu+pIBBLC45)。质粒pIBBLC45过度表达AaHPD、NiCAR、GRE2基因(如图4所示)，质粒p15Leu过度表达alsS(编码丙酮酸合成酶)、ilvC、ilvD、leuA、leuB、leuC、leuD等基因(如图9所示)。

本发明以3-羟基异戊酸(3HIV)作为前体制备异戊二醇的生物合成途径，该途径依次通过CAR和醛酮还原酶对3HIV进行酶生物催化从而制备IPDO(图1)。3HIV是必需氨基酸亮氨酸降解途径的天然代谢物，可以在人体内合成。如图1所示，IPDO可以通过α-酮异已酸(KIC，亮氨酸生物合成途径的最后一个中间产物)在大肠杆菌中通过三步反应生物制备。第一步反应将KIC转化为3HIV，所使用的酶为α-酮异己酸双加氧酶(也称为4-羟基苯丙酮酸双加氧酶，HPD)。第一步反应所生成的3HIV被CAR(羧酸还原酶)转化为3-羟基-3-甲基丁烷(3HMB)。随后，3HMB通过相应的醛还原酶(特别是酿酒酵母中的NADPH依赖的甲基乙二醛还原酶GRE2或大肠杆菌中的乙醇脱氢酶YqhD)还原为IPDO。这些反应的标准吉布斯自由能(ΔrG’°，显示在图1的灰色框中)均小于零，表明这些反应的方向在热力学上是可行的和有利的。当底物为3HIV时，工程菌sLCKP03/pIBBLC48和sLCKP03/pIBBLC45的试验结果证明了该途径在胞内的可行性。试验结果显示sLCKP03/pIBBLC48菌株的IPDO产量是sLCKP03/pIBBLC45菌株的7.5倍，这可能主要是因为MiCAR对3HIV的活性明显高于NiCAR(见表3)。

当底物为KIC时，本发明提供的菌株产生了5.2mg/L的IPDO。

当底物为亮氨酸时，本发明提供的菌株发酵36小时后取样检测，菌株sLCKP01/(pIBBLC34+psfp-NiCAR)产生36.6±3.2mg/L的IPDO。

当底物为葡萄糖时，本发明提供的菌株sLCKP03/(p15Leu+pIBBLC45)中可检测到IPDO的产生，而对照菌株sLCKP03/p15Leu和sLCKP03/pIBBLC45在相同条件下均未检测到IPDO。用菌sLCKP03/(p15Leu+pIBBLC45)进行上述重复发酵实验，样品10倍浓缩后用GC/MS测定样品IPDO的含量，两个平行样品中IPDO原浓度分别被测定为1.5mg/L和2.9mg/L(如图10所示)。这些结果表明，通过图1所示的新途径由葡萄糖发酵生产IPDO是可行的。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示以葡萄糖为原料，经KIC合成IPDO的新生物合成途径及IPDO生产代谢工程；相应的基因以斜体显示在箭头旁边；

图2示标品KIC、3HIV、IPDO的液相色谱图(浓度水平:1.0,2.5,5.0,10mM)；

图3示质粒pDPT的图谱；

图4示质粒pIBBLC45的图谱；

图5示质粒pIBBLC48图谱；

图6示sLCKP03/pIBBLC45和sLCKP03/pIBBLC48的IPDO生产；标品包含KIC、3HIV和IPDO，浓度为10mm；

图7示sLCKP01/(pIBBLC30+pET-Car)菌株以KIC为底物发酵生产IPDO的GC检测结果；

图8示以亮氨酸为底物的sLCKP01/(pIBBLC34+psfp-NiCAR)菌株发酵生产IPDO的GC检测结果；

图9示质粒p15Leu的图谱；alsS基因是从枯草芽孢杆菌中克隆得到；该质粒表达的LeuA(G462D)是LeuA的亮氨酸反馈抗性突变体；

图10示用GC/MS法分析并鉴定菌株sLCKP03/(p15Leu+pIBBLC45)以葡萄糖发酵样品中IPDO的产量。

具体实施方式

本发明公开了生物合成异戊二醇的菌株及方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

培养基：

LB培养基(LB)含有5g/L酵母提取物、10g/L胰蛋白酶和10g/L NaCl。LB琼脂平板为LB培养基加1.5％琼脂。发酵培养基II(FII培养基)含(每升)葡萄糖(30g)、MgSO₄·7H₂O(0.5g),KH₂PO₄(3g),K₂HPO₄(12g),(NH₄)₂SO₄(4g)、酵母提取物(1g)、柠檬酸钠(2g)、FeSO₄·7H₂O(0.1g)。

引物：

如果没有另外说明，本研究使用的所有引物的序列如表1所示。

表1.本发明使用的引物列表.

分析方法

如图2所示，相对高浓度的组分KIC、3HIV和IPDO可以用高效液相色谱法分析：分析柱为Aminex HPX-87H column(300×7.8mm柱)(Bio-Rad,Hercules,USA)，柱温箱温度设定为60℃，流动相为5mM H₂SO₄，流速为0.6ml/min，所使用的检测器为示差折光(RI)检测器。

简称：

糖磷酸转移酶系统(PTS)、磷酸烯醇丙酮酸(pep)、丙酮酸(pyr)、乙酰内酯(alac)、(2R)-2,3-二羟基-3-甲基丁酸酯(DHIV)、乙酰辅酶a(AcCoA)、乙酰磷酸(Acetyl-p)。酶编码基因:D乳酸脱氢酶(ldhA)乙酰乳酸合成酶(als),酮醇酸还原异构酶:辅酶ii+(ilvC)、二羟酸脱水酶(ilvD)2-苹果酸异丙酯合成酶(leuA)3-苹果酸异丙酯脱氢酶(leuB)3-苹果酸异丙酯脱水酶亚基LeuC(LeuC)3-苹果酸异丙酯脱水酶亚基(诸侯)支链氨基酸转氨酶(ilvE),酪氨酸转氨酶(tyrB),氨基酸脱氨酶(aad)4-羟基苯丙酮酸加双氧酶(HPD),羧酸还原酶(CAR)、来自酿酒酵母(GRE2)的nadph依赖性的甲基乙二醛还原酶(GRE2)、来自大肠杆菌的醇脱氢酶(YqhD)、丙酮酸氧化酶(poxB)、丙酮酸甲酸裂解酶(pflB)、丙酮酸脱氢酶(aceEF)、醇脱氢酶/醛脱氢酶(adhE)、磷酸乙酰转移酶(pta)和醋酸激酶(ackA)。

蛋白质序列

序列1(SaHPD):如SEQ ID No.1所示

MTQTTHHTPDTARQADPFPVKGMDAVVFAVGNAKQAAHYSTAFGMQLVAYSGPENGSRETASYVLTNGSARFVLTSVIKPATPWGHFLADHVAEHGDGVVDLAIEVPDARAAHAYAIEHGARSVAEPYELKDEHGTVVLAAIATYGKTRHTLVDRTGYDGPYLPGYVAAAPIVEPPAHRTFQAIDHCVGNVELGRMNEWVGFYNKVMGFTNMKEFVGDDIATEYSALMSKVVADGTLKVKFPINEPALAKKKSQIDEYLEFYGGAGVQHIALNTGDIVETVRTMRAAGVQFLDTPDSYYDTLGEWVGDTRVPVDTLRELKILADRDEDGYLLQIFTKPVQDRPTVFFEIIERHGSMGFGKGNFKALFEAIEREQEKRGNL

序列2(SnHPD):如SEQ ID No.2所示

MADTTMHTQPTTPATARQADPFPVKGMDAVVFAVGNAKQAAHYYSTAFGMKRVAYQGPETGSRETASYVLTSGGARFVFTSVVKPTTEWGRFLADHVAAHGDGVVDLAIEVPDARAAYAYAVEHGATGLEEPYETKDEHGTVVRAAIATYGQTRHTLVERTGYDGPYLPGFVAAEPLVAAPTKRFFQAVDHCVGNVELGKMDEWVAFYNNVMGFTNMKEFVGDDIATEYSALMSKVVADGTKKVKFPLNEPAVAKKKSQIDEYLEFYGGPGVQHIALATNDIVASVRQMRAAGVEFLDVPGSYYDTLGEWVGETRVPIDELRELKILADRDEDGYLLQIFTKPVQDRPTVFFEMIERHGSLGFGKGNFKALFEAIEREQDRRGNL

序列3(AaHPD):如SEQ ID No.3所示

MTETLDQGKPMDDVSFDQLRQLVGLVDYDSSSDPFPVKAMDAVVFVVGNATQTALFYQFAFGMEQVAYSGPETGNRDHKSYVLKSGSARFVINGGVSPESPLLDHHRAHGDGVVDLALEVGDVDRCVEHARSQGATVLDEPHDVSDEHGTVRIAAIAAYGETRHTLIDRSRYTGPYLPGYVAKAGAYRKPEGAPKRLFQAVDHCVGNVELGKMDYWVEFYNRVMGFVNMAEFIGDDIATDYSALMSKVVANGNHRVKFPLNEPAVAQRKSQIDEYLEFYGGPGCQHIALATNDILSTVDAMRAAGVEFLDTPDSYYDDPELRARIGEVRVPIEELKSRKILVDRDEDGYLLQIFTKPTGDRPTVFYEMIERHGSLGFGKGNFKALFEAIEREQERRGNL

序列4(RaHPD)：如SEQ ID No.4所示

MTTYSNKGPKPERGRFLHFHSVTFWVGNAKQAASFYCNKMGFEPLAYKGLETGSREVVSHVIKQGKIVFVLCSALNPWNKEMGDHLVKHGDGVKDIAFEVEDCEHIVQKARERGAKIVREPWVEEDKFGKVKFAVLQTYGDTTHTLVEKINYTGRFLPGFEAPTYKDTLLPKLPSCNLEIIDHIVGNQPDQEMESASEWYLKNLQFHRFWSVDDTQVHTEYSSLRSIVVANYEESIKMPINEPAPGRKKSQIQEYVDYNGGAGVQHIALRTEDIITTIRHLRERGMEFLAVPSSYYRLLRENLKTSKIQVKENMDVLEELKILVDYDEKGYLLQIFTKPMQDRPTLFLEVIQRHNHQGFGAGNFNSLFKAFEEEQALRGNLTDLETNGVRSGM

序列5(NiCAR)：如SEQ ID No.5所示

MAVDSPDERLQRRIAQLFAEDEQVKAARPLEAVSAAVSAPGMRLAQIAATVMAGYADRPAAGQRAFELNTDDATGRTSLRLLPRFETITYRELWQRVGEVAAAWHHDPENPLRAGDFVALLGFTSIDYATLDLADIHLGAVTVPLQASAAVSQLIAILTETSPRLLASTPEHLDAAVECLLAGTTPERLVVFDYHPEDDDQRAAFESARRRLADAGSLVIVETLDAVRARGRDLPAAPLFVPDTDDDPLALLIYTSGSTGTPKGAMYTNRLAATMWQGNSMLQGNSQRVGINLNYMPMSHIAGRISLFGVLARGGTAYFAAKSDMSTLFEDIGLVRPTEIFFVPRVCDMVFQRYQSELDRRSVAGADLDTLDREVKADLRQNYLGGRFLVAVVGSAPLAAEMKTFMESVLDLPLHDGYGSTEAGASVLLDNQIQRPPVLDYKLVDVPELGYFRTDRPHPRGELLLKAETTIPGYYKRPEVTAEIFDEDGFYKTGDIVAELEHDRLVYVDRRNNVLKLSQGEFVTVAHLEAVFASSPLIRQIFIYGSSERSYLLAVIVPTDDALRGRDTATLKSALAESIQRIAKDANLQPYEIPRDFLIETEPFTIANGLLSGIAKLLRPNLKERYGAQLEQMYTDLATGQADELLALRREAADLPVLETVSRAAKAMLGVASADMRPDAHFTDLGGDSLSALSFSNLLHEIFGVEVPVGVVVSPANELRDLANYIEAERNSGAKRPTFTSVHGGGSEIRAADLTLDKFIDARTLAAADSIPHAPVPAQTVLLTGANGYLGRFLCLEWLERLDKTGGTLICVVRGSDAAAARKRLDSAFDSGDPGLLEHYQQLAARTLEVLAGDIGDPNLGLDDATWQRLAETVDLIVHPAALVNHVLPYTQLFGPNVVGTAEIVRLAITARRKPVTYLSTVGVADQVDPAEYQEDSDVREMSAVRVVRESYANGYGNSKWAGEVLLREAHDLCGLPVAVFRSDMILAHSRYAGQLNVQDVFTRLILSLVATGIAPYSFYRTDADGNRQRAHYDGLPADFTAAAITALGIQATEGFRTYDVLNPYDDGISLDEFVDWLVESGHPIQRITDYSDWFHRFETAIRALPEKQRQASVLPLLDAYRNPCPAVRGAILPAKEFQAAVQTAKIGPEQDIPHLSAPLIDKYVSDLELLQLL

序列6(GRE2)：如SEQ ID No.6所示

MSVFVSGANGFIAQHIVDLLLKEDYKVIGSARSQEKAENLTEAFGNNPKFSMEVVPDISKLDAFDHVFQKHGKDIKIVLHTASPFCFDITDSERDLLIPAVNGVKGILHSIKKYAADSVERVVLTSSYAAVFDMAKENDKSLTFNEESWNPATWESCQSDPVNAYCGSKKFAEKAAWEFLEENRDSVKFELTAVNPVYVFGPQMFDKDVKKHLNTSCELVNSLMHLSPEDKIPELFGGYIDVRDVAKAHLVAFQKRETIGQRLIVSEARFTMQDVLDILNEDFPVLKGNIPVGKPGSGATHNTLGATLDNKKSKKLLGFKFRNLKETIDDTASQILKFEGRI

序列7(MiCAR)：如SEQ ID No.7所示

MSTAIHDEHLDRRIEELIANDPQFAAARPDPAITAATEAPGLRLPQIIRTVLDGYADRPALAQRVVEFVTDAKTGRTTAELLPRFETITYGELGERVSALGRAWAGDAVRPGDRVCVLGFNSVDYATIDIALGTIGAVSVPLQTSAAISSLQPIVAETEPSLIASSVNQLPDAVELILAGDHVPGKLVVFDYQPQVDDQREAVEAAAARLADSGVAVEALADVLRRGKDLPAVEPPASDEDSLALLIYTSGSTGAPKGAMYPQSNVGKMWRRGSKNWFGESAASITLNFMPMSHVMGRGILYGTLGNGGTAYFAARSDLSTLLEDLELVRPTEMNFVPRIWETLYGEFQRQVERRLADGDAGPEARETVAAAVLEEQRQYLLGGRFIFAMTGSAPTSPELKAWAESLLQMHLMDGYGSTEAGMVLFDGEIQRPPVIDYKLVDVPDLGYFSTDRPHPRGELLLRTENMFPGYYKRAETTANVFDEDGYYRTGDVFAEIAPDRLVYVDRRNNVLKLAQGEFVTLAKLEAVFGNSPRIRQIYVYGNSSQPYLLAVVVPTEEALADNDLESLKPKIADSLQKVAKETGLQSYEVPRDFIIETTPFTLENGLLTGIRKLAWPKLKAHYGDRLEQMYAELAAGQANELAELRRSGAAAPVAQTVSRAAAALLGATAGDLSADAHFTDLGGDSLSALTFGNLLREIFDVDVPVGVIVSPANDLAGIAAYIEAERQGSKRPTFAAVHGRGATMVHASDLTLDKFLDEATLAAAPSLPKPATEVRTVLLTGATGFLGRYLALDWLERMDMVDGKVIALVRARTDEEARARLDKTFDSGDPKLLAHYQRLAADHLEVIAGDKGEANLGLDPQTWQRLAEEVDVIVDPAALVNHVLPYSELFGPNALGTAELIRIALTSRQKPYTYVSTIGVGDQIQPGEFVENADIRQISATREINDGYANGYGNSKWAGEVLLREAHDLCGLPVTVFRCDMILADTTYAGQLNLPDMFTRLMLSLVATGIAPGSFYELDADGNRQRAHYDGLPVEFIAAAISTLGTQITDSDTGFQTYHVMNPYDDGIGLDEYIDWLIEAGYSIERIADYSEWLRRFETSLRALPDRQRQYSLLPLLHNYQKPEKPINGSMAPTDVFRAAVQEAKIGPDKDIPHVSAPVIVKYITDLELLGLL

序列8(aad)：如SEQ ID No.8所示

MKISRRKLLLGVGAAGVLAGGAALVPMVRRDGKFVEAKSRASFVEGTEGALPKESDAVIIGGGIQGIMTAINLAERGMSVTILEKGEIAGEQSGRAYSQIISYQTSPEIFPLHHYGKILWRGMNEKIGADTSYRTQGRVEALADEKAFDKAQAWIKTAKESAGFDTPLNTRIIKGDELSNRLVGAQTPWTVAAFEEDSGSVDPETGTPALARYAKQIGVKIYTNCAVRGIETAGGKISDVVTEKGAIKTSHVVLAGGIWSRLFMGNMGIDIPTLNVYLSQQRVSGVPGAPRGNVHLPNGIHFREQADGTYAVAPRIFTSSIVKDSFLLGPKFMHLLGGGELPLEFSIGEDLFNSFKMATSWKLDEKTPFEQYRIATATQNTEHLDAVFQRMKAEFPVFEKSQVVERWGAVVSPTFDELPIISEVKEYPGLVINTATVWGMTEGPAAGELTADIVTGKKPVIDPTPFSMDRFKK

本文使用的全部术语“过表达”通常是指相对于未进行基因改造的对照菌株而言增高了统计学上显著的量；为了避免疑义，术语过表达”通常是相对于未进行基因改造的对照菌株而言增高至少10％，例如：与未进行基因改造的对照菌株相比而言，增高至少约20％、或至少约30％、或至少约40％、或至少约50％、或至少约60％、或至少约70％、或至少约80％、或至少约90％、或上至并包括100％增高，或与对照相比而言的10％～100％之间的任意增高；或与对照相比，增高至少约2倍、或至少约3倍、或至少约4倍、或至少约5倍、或至少约10倍，或2倍至10倍以上的任意增高。特别地，增强表达包括在宿主细菌内表达外源的相应蛋白。

本发明提供的生物合成异戊二醇的菌株及方法中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1质粒构建

编码SaHPD(SEQ.1)的相应基因从阿维链霉菌(Streptomyces avermitilis,DSM41443)基因组DNA用引物NdeI-SaHPD和SaHPD-XhoI扩增得到。扩增所得片段在相应的限制性内切酶消解后插入到载体pET22b的NdeI和XhoI位点上，所得质粒命名为pIBBLC02。

编码SnHPD(SEQ.2)的相应基因从稻瘟病菌(Streptomyces noursei,DSM40635)基因组DNA用引物NdeI-SnHPD和SnHPD-XhoI扩增得到。扩增所得片段在相应的限制性内切酶消解后插入到载体pET22b的NdeI和XhoI位点上，所得质粒命名为pIBBLC03。

编码AaHPD(SEQ.3)的相应基因从albata Allokutzneria(DSM 44149)基因组DNA用引物NdeI-AaHPD和AaHPD-XhoI扩增得到。扩增所得片段在相应的限制性内切酶消解后插入到载体pET22b的NdeI和XhoI位点上，所得质粒命名为pIBBLC05。

RaHPD(SEQ.4)的相应基因由GenScript USA公司进行代码优化后重新合成。将合成的基因插入载体pET22b中，得到质粒命名为pIBBLC17。

编码NiCAR(SEQ.5)的相应基因利用引物NcoI-His-NiCAR和NiCAR-HindIII从Nocardia iowensis(DSM 45197)基因组DNA中扩增得到。扩增所得片段在相应的限制性内切酶消解后插入到载体pET28a的NcoI和HindIII位点上，所得质粒命名为pIBBLC06。

质粒pIBBLC10用于过表达乙醛还原酶GRE2(SEQ 6)。利用引物NdeI-GRE2和GRE2-HindIII从酿酒酵母(S288c株)基因组DNA中扩增出相应的GRE2基因，经NdeI和HindIII酶消解后插入质粒pIBBLC06相应的位点，得到pIBBLC10质粒。

利用引物NdeI-MiCAR和MiCAR-HindIII从分枝杆菌ATCC 13950基因组DNA扩增得到含有MiCAR(SEQ 6)编码基因的DNA片段。该片段经NdeI和HindIII插入到质粒pIBBLC06相应的位点，得到pIBBLC12质粒。

利用引物SacI-GRE2和GRE2-KpnI从质粒pIBBLC10中扩增出GRE2基因，转入质粒pDPT(图3)，得到质粒pTrc-GRE2。从质粒pIBBLC05和pIBBLC17上分别用引物对BamHI-pET/AaHPD-HindIII和BamHI-pET/RaHPD-HindIII扩增得到AaHPD和RaHPD基因。经BamHI和HindIII酶切后分别插入质粒pTrc-GRE2的相应酶切位点，获得质粒pIBBLC30和pIBBLC31。

含有FAD结合氧化还原酶(氨基酸脱氨酶aad,SEQ 8)编码序列的DNA片段由GenScript USA公司合成。以该片段为模板，用引物aad-FF和aad-FR进行PCR扩增，使用融合HD克隆试剂盒(TaKaRa)将所得PCR产物插入到质粒pIBBLC30的KpnI位点获得质粒pIBBLC34。

质粒pET28-Car由GenScript USA公司构建，该质粒含有针对大肠杆菌优化编码的NiCAR编码基因。利用限制性内切酶NcoI和HindIII将car基因亚克隆到载体pTrc99A中，得到质粒pIBBLC40。利用引物GRE2-FF和AaHPD-FR从质粒pIBBLC30中扩增出含有AaHPD和GRE2的DNA片段。然后使用融合HD克隆试剂盒(TaKaRa)将其插入到质粒pIBBLC40的HindIII位点，获得质粒pIBBLC45。

为了构建一个表达GRE2和MiCAR基因的质粒，分别用引物NdeI-MiCAR/MiCAR-HindIII and MiCAR-rbs-GRE2/T7ter对质粒pIBBLC12和pIBBLC10进行PCR扩增。同时用引物pZAF和pZA31R3将质粒pza311luc(从pZ Vectors--EXPRESSYS购买)线性化。所获得的PCR产物用融合HD克隆试剂盒(TaKaRa)进行连接获得质粒pIBBLC48。

实施例2菌株sLCKP01,sLCKP02,and sLCKP03的构建

编码枯草芽孢杆菌磷酸戊二烯基转移酶的相应编码基因sfp通常与CAR基因共同表达以最大程度发挥CAR酶的活力(Finnigan et al.，2017)。为了使sfp基因在遗传上能够稳定表达，将sfp基因整合到宿主的染色体中进行表达是非常重要且必要的。为此，我们将sfp基因表达分别整合到大肠杆菌BL21和W3110的染色体中。

为了将sfp基因整合到BL21中，首先用引物pTagR和ilvE-N20对模板质粒pTagAmpR(Chen等人，2019)进行PCR扩增，构建了一个名为pIBBLC14的质粒。然后，分别用引物ilvE-C1/ilvE-C2和ilvE-C3/ilvE-C4从大肠杆菌BL21中扩增出两个DNA片段。用sfp-C1(tggttcgctgggaagacctcgacgctctcccttatgcg，如SEQ ID No.46所示)和sfp-C2引物(ttacagcagttcttcgtagctaaccatcg，如SEQ ID No.47所示)从质粒pCDFDeut-1_sfp(GenScript USA Inc.的定制产品)中扩增出含有sfp基因的DNA片段。然后用融合HD克隆试剂盒将这三个DNA片段同时插入到质粒pIBBLC4的HindIII位点中，得到一个名为pIBBLC15的质粒。然后，采用Jiang等人报道的方法(2015年)将其导入预制备的BL21/pCas感受态细胞中，以在基因组中插入sfp基因。消除质粒pCas和pIBBLC15后，获得一株重组菌株，该菌株被命名为sLCKP01。

为了整合大肠杆菌W3110染色体上的sfp基因，用与pIBBLC14相同的方法构建了gRNA供体质粒pIBBLC21，但所使用的引物为pTagR和ilvB-N20。然后，分别用引物对uilvB-C2/XbaI-uilvB和dilvB-HindIII/dilvB-C1从大肠杆菌W3110基因组DNA中扩增出两个目标DNA片段，并将该两个片段插入到用XbaI和HindIII消化后的线性化载体pIBBLC21中，从而得到质粒pIBBLC22。从质粒pCDFDeut-1_-sfp中，分别用引物对j23101sfp/sfp-HF和j23105sfp/sfp-HF扩增出含有sfp基因的DNA片段。使用融合HD克隆试剂盒，它们被分别插入到质粒pIBBLC21的HindIII位点上，并相应地获得两个质粒，被分别命名为pIBBLC23和pIBBLC24。通过质粒pIBBLC23及CRISPR/Cas基因编辑技术，将由组成性启动子J23101(https://parts.igem.org/Part:BBa_J23101)控制sfp基因表达的表达盒整合到大肠杆菌DY330(Yu et al.,2000)的染色体中。随后去除DY330染色体上的lambda-Red重组系统，并消除掉质粒pCas和pIBBLC23，获得sLCKP02菌株。以同样的方法，但使用质粒pIBBLC24构建了sLCKP03菌株。不同的是在重组菌sLCKP03中，sfp基因的表达由启动子J23105控制(https://parts.igem.org/Part:BBa_J23105)。

实施例3 CARs、GRE2、YqhD的表达与提纯

将质粒pIBBLC10和pET-YqhD转化宿主大肠杆菌BL21进行蛋白表达。将质粒pET28-Car分别转化到宿主BL21、BL21/pCDFDeut-sfp和sLCKP01中。将质粒pIBBLC12转化到sLCKP01菌株中。质粒pIBBL40分别转化到宿主菌sLCKP01、sLCKP02和sLCKP03中。将LB琼脂板的单菌落或冷冻管接种到5ml LB培养基中，并在37℃、220rpm下培养过夜。然后将过夜培养物50倍稀释接种到50ml LB培养基中(在300ml摇瓶中)。在37℃、220转/分条件下培养到OD600约为0.4到0.6后，添加0.5mM IPTG开始诱导蛋白表达。然后将培养物转入30℃、220转/分的条件下培养12-16小时。在培养过程中，如有必要，添加相应的抗生素(氨苄西林，100微克/毫升；卡那霉素50微克/毫升，链霉素50微克/毫升)。培养物在冰上冷却30分钟后，在4℃、5000转/分的条件下离心收集细胞。移除上清液后，用30毫升的结合缓冲液(20mM磷酸钠、500mM氯化钠、20mM咪唑、pH值7.4)洗涤一次。将细胞重新悬浮在3ml的结合缓冲液中，并使用

24仪器物理破碎细胞。然后在4℃、13000rpm条件下离心20分钟获得含蛋白的上清液。随后按照SpinTrap columns(GE Healthcare)试剂盒提供的操作手册纯化目标蛋白，并将目标蛋白洗脱至洗脱缓冲液(20mM磷酸钠、500mM氯化钠、500mM咪唑、pH7.4)中。随后，在4℃下使用

Ultra-0.5离心超滤膜，将洗脱缓冲液替换成HEPES缓冲液(pH 7.5)用于后续的酶分析实验。根据布拉德福德方法，以牛血清白蛋白为标准，对所获得的蛋白样品进行定量。

实施例4 sLCKP01,sLCKP02,and sLCKP03菌株评估

为了评估染色体上整合的sfp基因的表达强度是否能够提供足够的磷戊二烯基转移酶活性，我们在不同的宿主中过表达和纯化了NiCAR，并进行了体外酶活测定(表2)。

表2.不同寄主NiCAR过表达活性的比较。

表2中，实验1～3的数据表明，与CAR共同表达的磷戊四烯基转移酶对CAR的活性至关重要，这一结果与之前的报导一致(Venkitasubramanian et al.，2007)。2号和3号的实验结果表明，sfp基因的整合表达，从该宿主中表达获得的CAR酶具有相对较高的活力。这可能是质粒的不稳定性导致的。将菌株sLKP01至sLCKP03中获得的NiCAR(No.4～6)的活性进行比较，发现这些菌株均能保证过表达CAR具有高活性。3号和4号实验活性的差异可能是由启动子的强度不同导致的转录水平的差异引起的(pET-Car和pIBBLC40使用的启动子分别为T7和trc)。

实施例5 NiCAR和MiCAR对3HIV的催化活力比较

CARs体外酶活检测按照文献(Moura et al.，2016)描述进行，并进行了少量修改。根据反应中NADPH在340nm吸光值的变化来测定并计算酶活力。完整的反应体系包含80mM的磷酸缓冲液(pH值7.5),MgCl2 10mM,0.25mM NADPH,1mM ATP,10mM 3-HIV或5mM苯甲酸作为底物和50-200μg/L纯化的CAR酶(NiCAR或MiCAR)，总反应体积为0.2mL。所有的反应都在比色皿进行，反应温度为30℃，反应时间5到15分钟，动态检测340nm吸光值变化。将底物(3-HIV或苯甲酸)外的其他成分混合，加热至反应温度后加入底物(3-HIV或苯甲酸)开始反应。测定NiCAR和MiCAR对3HIV和苯甲酸的酶催化活性结果见表3。

表3.sLCKP01中NiCAR和MiCAR过表达活性的比较。

结果表明，MiCAR比NiCAR对3HIV和苯甲酸有更高的活性。在10mm3HIV存在时，MiCAR的活性是NiCAR的4倍以上。

实施例6从3HIV体内外生物合成IPDO

3HIV到IPDO的合成途径，该途径由CAR和醛还原酶依次催化的反应组成(如图1所示)。为了实验证明该途径，我们以3HIV为底物在体外和体内测试了CAR和醛还原酶级联反应产物。

在体外试验中，反应在含有20mM 3HIV、10mM NADPH、2mM ATP、10mM Mg2+、400ug/LNiCAR和200ug/L YqhD(或GRE2)的HEPES缓冲液(pH 7.5)中进行。在30℃孵育6小时后，用气相色谱法测定样品的IPDO浓度。如表4所示，通过CAR和醛酮还原酶催化的多酶反应，实现了以3HIV为底物催化生成IPDO。

表4.多酶反应中3HIV产生IPDO。

为了证明从3HIV出发的IPDO通路在细胞体内也能工作，我们在细胞中同时过表达了CAR和醛酮还原酶。为此，构建并测试了三株细胞sLCKP03/pIBBLC45、sLCKP03/pIBBLC48和BL21/(pIBBLC10+psfp-NiCAR)。从LB琼脂板上挑取单个菌落接种到添加相应抗生素的5ml LB培养基中，并过夜培养。将一定量的过夜培养物接种于10ml FII培养基(pH 6.9，含抗生素和50mM 3HIV)置于100ml摇瓶中，初始OD600为0.1。在37℃,220rpm的条件下进行发酵培养。当OD600达到约0.3时，加入0.2mM IPTG诱导培养。用GC或HPLC测定48h时样品的浓度(结果见表5)。

表5.通过CAR和醛还原酶将3HIV转化为IPDO的胞内试验结果。

结果表明，在发酵培养基中如果不供应3HIV，就不会产生IPDO。而当提供底物为3HIV时，相同工程菌BL21/(pIBBLC10+psfp-NiCAR)在相同条件下产生了0.48g/L的IPDO。这表明，来自3HIV的IPDO通路在体内也起作用。工程菌sLCKP03/pIBBLC48和sLCKP03/pIBBLC45的试验结果也证明了该途径在胞内的可行性。试验结果显示sLCKP03/pIBBLC48菌株的IPDO产量是sLCKP03/pIBBLC45菌株的7.5倍，这可能主要是因为MiCAR对3HIV的活性明显高于NiCAR(见表3)。

实施例7由KIC合成IPDO

为了从实验上证明以KIC为底物的IPDO途径，我们首先利用全细胞催化将KIC转化为3HIV，然后将其作为底物在体外进行上述级联反应。此外，我们还在体内测试了来自KIC的整个IPDO合成路径。

首先，以KIC为原料采用全细胞催化法合成3HIV。为此，我们首先将质粒pIBBLC02、pIBBLC03、pIBBLC05和pIBBLC17转化进入大肠杆菌BL21，得到相应的菌株BL21/pIBBLC02、BL21/pIBBLC03、BL21/pIBBLC05和BL21/pIBBLC17。单个菌落接种于5ml LB培养基中，并在37℃、220rpm下培养过夜。过夜培养物稀释100倍，接种到50ml LB培养基中。当OD600增长至0.4到0.6时，加入0.5mM IPTG诱导，然后在30℃、220rpm条件下继续培养12小时。然后在5000rpm下离心10分钟收集细胞，用0.9％氯化钠溶液洗细胞一次后，将细胞重新悬浮在5ml的0.1M Tris缓冲液(pH 6.5)中，该缓冲液含有33mM KIC、3mM FeSO4、1mM DTT和5mM抗坏血酸。然后将细胞液转移至100ml摇瓶中在30℃、220转/分条件下孵育。采用第1.6节所述的高效液相色谱法对在6小时和24小时内采集的样品进行分析。表6所列结果表明，所有酶SaHPD、SnHPD、AaHPD和RaHPD均具有α-酮异己酸双加氧酶活性。其中，AaHPD在检测条件下似乎比其他酶活性更高。

表6.以KIC为原料，全细胞催化加体外酶促反应合成IPDO。

为了证明从KIC到IPDO整个途径的可行性，我们用KIC通过全细胞催化生产得到的3HIV作为底物，进行2.6节所描述的体外酶级联反应生产IPDO。具体如下：将上述全细胞催化反应液离心去除细胞后，3倍稀释加入到含有80mM HEPES(pH 7.5)，10mM NADPH,5mMATP,10mM Mg2+,400μg NiCAR和200μg GRE2的酶级联反应体系中。在30℃反应5小时后取样进行GC分析。结果显示KIC经全细胞催化所获得的3HIV可以被CAR及醛酮还原酶依次催化生产目标产物IPDO。这一结果进一步证明了从KIC生产IPDO的生物合成途径(如图1所示)的可行性。

为了进一步在体内检测这一途径，我们将该途径所需的三个酶通过质粒pIBBLC30和pET-Car转入到菌株sLCKP01中过表达，获得菌株sLCKP01/(pIBBLC30+pET-Car)并进行如下试验。将单个菌落接种于5ml LB培养基中过夜生长。5ml的发酵培养基置于100ml的摇瓶中，按2％的接种量接入过夜培养物。发酵培养基的组成为(每升):20g葡萄糖,0.5gMgSO4·7H2O,2.8g NaH2PO4·H2O,3.52g Na2HPO4·2H2O,10g(NH4)2SO4,20g酵母提取物,2g柠檬酸单钠,0.1g FeSO4·7H2O,0.1g维生素B1、6.5g KIC,0.4g酪氨酸,5g亮氨酸,1g异亮氨酸和1g缬氨酸。当OD600达到0.3左右时，加入0.2mM IPTG。所有的发酵都补充了100μg/mL氨苄青霉素和50μg/mL卡那霉素。发酵在37℃,220rpm摇床中进行。发酵36小时后，取样检测。分析结果显示菌株产生了5.2mg/L的IPDO。

实施例8由亮氨酸生物合成IPDO

如图1所示,亮氨酸能够被某些氨基酸脱氨酶(aad)转化为KIC,因此,也可以从亮氨酸出发，通过aad将其转化为KIC后再继续被催化生成IPDO。所需的四种酶aad、AaHPD、NiCAR和GRE2通过pIBBLC34质粒和psfp-NiCAR导入并在sLCKP01中过表达。所得菌株sLCKP01/(pIBBLC34+psfp-NiCAR)利用亮氨酸为底物进行发酵生产IPDO，所使用的发酵培养基为：FII培养基中加入5g/L亮氨酸、1g/L异亮氨酸、1g/L缬氨酸、0.2g/L酪氨酸及相应的抗生素。将上述菌株从LB-琼脂培养基中挑取单菌落并接种于5ml LB培养基中，在37℃、220rpm的摇床中培养过夜。然后将过夜培养物接种到10ml上述发酵培养基并置于100ml的摇瓶中，在与过夜培养物相同的培养条件下进行发酵。当OD600达到约0.3时，加入0.1mMIPTG进行诱导。发酵过程中每8至12小时手动调节pH至6.9。36小时后取样检测，菌株sLCKP01/(pIBBLC34+psfp-NiCAR)产生36.6±3.2mg/L的IPDO。

实施例9从葡萄糖生物合成IPDO

为了证明IPDO可以由葡萄糖为底物进行生物合成，我们在菌株sLCKP03中使用了两个质粒来过表达从丙酮酸到IPDO生物转化过程中的相关基因，该菌株为sLCKP03/(p15Leu+pIBBLC45)。质粒pIBBLC45过度表达AaHPD、NiCAR、GRE2基因(如图4所示)，质粒p15Leu过度表达alsS(编码丙酮酸合成酶)、ilvC、ilvD、leuA、leuB、leuC、leuD等基因(如图9所示)。以只含有质粒p15Leu或pIBBLC45的菌株sLCKP03/p15Leu和sLCKP03/pIBBLC45作为对照。

上述菌株在摇瓶中用FII-培养基进行批式发酵。单菌落接种到5毫升的LB培养基中(34μg/mL氯霉素(Cm34)和100μg/mL氨苄青霉素(Amp100)),在37℃,220rpm的条件下过夜培养。以初始OD600＝0.1的接种量接种于10ml FII培养基(加入上述相同的抗生素)，置于100ml的摇瓶并在相同条件下培养。当OD600到达0.3～0.6左右时，加入0.2mM IPTG诱导。32小时后取样品，离心取上清并通过旋蒸浓缩10倍后，用GC进行分析检测。结果表明，在菌株sLCKP03/(p15Leu+pIBBLC45)中可检测到IPDO的产生，而对照菌株sLCKP03/p15Leu和sLCKP03/pIBBLC45在相同条件下均未检测到IPDO。用菌sLCKP03/(p15Leu+pIBBLC45)进行上述重复发酵实验，样品10倍浓缩后用GC/MS测定样品IPDO的含量，两个平行样品中IPDO原浓度分别被测定为1.5mg/L和2.9mg/L(如图10所示)。这些结果表明，通过图1所示的新途径由葡萄糖发酵生产IPDO是可行的。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 花安堂生物科技集团有限公司

<120> 生物合成异戊二醇的菌株及方法

<130> MP2002139

<160> 47

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 380

<212> PRT

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<211> 42

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 29

ttcgagctcc gtcgacaagc tggaattcga gctcagaagg ag 42

<210> 30

<211> 45

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 30

ataacccctt ggggcctcta aggcatcaaa taaaacgaaa ggctc 45

<210> 31

<211> 47

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 31

gtcgacatat ggtgatgctc ctctttaatg aattcggtca gtgcgtc 47

<210> 32

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 32

cgacctgcag aagctaccag gttgaagcgg cactc 35

<210> 33

<211> 20

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 33

gtcttcccag cgaaccatct 20

<210> 34

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 34

cgaagaactg ctgtaataga tcaggaaggt atcgcgctgg 40

<210> 35

<211> 35

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 35

taatagatct aagctccgcg ataatcggct taccg 35

<210> 36

<211> 80

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 36

gctcagtcct aggtataata ctagtatgtc gcacgcgctg cactagtttt agagctagaa 60

atagcaagtt aaaataaggc 80

<210> 37

<211> 80

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 37

gctcagtcct aggtataata ctagtgatta acgctgccaa acgccgtttt agagctagaa 60

atagcaagtt aaaataaggc 80

<210> 38

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 38

gttcgggcac aaagcttcat tctgatgaac aacgaagcgc 40

<210> 39

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 39

acagggtaat agatctaagc tgcgcgatgt tgttcaagcc 40

<210> 40

<211> 37

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 40

tcatcagaat gaagctttgt gcccgaactt gccatgc 37

<210> 41

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 41

gctttttttg aattctctag ttaaggcgct gacggcac 38

<210> 42

<211> 85

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 42

caagttcggg cacaaagctt ttacagctag ctcagtccta ggtattatgc tagcaacttt 60

aataaggaga tataccatgg gcaag 85

<210> 43

<211> 85

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 43

caagttcggg cacaaagctt ttacggctag ctcagtccta ggtactatgc tagcaacttt 60

aataaggaga tataccatgg gcaag 85

<210> 44

<211> 40

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 44

ttcatcagaa tgaagctcgg atccttacag cagttcttcg 40

<210> 45

<211> 36

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 45

actagtatta tacctaggac tgagctagct gtcaag 36

<210> 46

<211> 38

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 46

tggttcgctg ggaagacctc gacgctctcc cttatgcg 38

<210> 47

<211> 29

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<400> 47

ttacagcagt tcttcgtagc taaccatcg 29

Claims

1.羧酸还原酶和醛还原酶的过表达在生物合成异戊二醇中的应用。

2.α-酮异己酸双加氧酶和醛还原酶的过表达在生物合成异戊二醇中的应用。

3.氨基酸脱氨酶、α-酮异己酸双加氧酶、羧酸还原酶和醛还原酶的过表达在生物合成异戊二醇中的应用。

4.α-酮异己酸双加氧酶、羧酸还原酶和醛还原酶的过表达以及alsS、ilvC、ilvD、leuA、leuB、leuC、leuD的过表达在生物合成异戊二醇中的应用。

5.生物合成异戊二醇的菌株，其特征在于，羧酸还原酶和醛还原酶过表达。

6.生物合成异戊二醇的菌株，其特征在于，α-酮异己酸双加氧酶、羧酸还原酶和醛还原酶过表达。

7.生物合成异戊二醇的菌株，其特征在于，氨基酸脱氨酶、α-酮异己酸双加氧酶、羧酸还原酶和醛还原酶过表达。

8.生物合成异戊二醇的菌株，其特征在于，α-酮异己酸双加氧酶、羧酸还原酶和醛还原酶的过表达以及alsS、ilvC、ilvD、leuA、leuB、leuC、leuD的过表达在生物合成异戊二醇中的应用。

9.如权利要求1至4任一项所述的应用或如权利要求5至8任一项所述的菌株，其特征在于，所述醛还原酶包括甲基乙二醛还原酶GRE2或乙醇脱氢酶YqhD；所述α-酮异己酸双加氧酶包括SaHPD、SnHPD、AaHPD或RaHPD；

生物合成异戊二醇的底物为可发酵碳源，所述可发酵碳源包括3HIV、KIC、亮氨酸或葡萄糖。

10.生物合成异戊二醇的方法，其特征在于，以如权利要求5至8任一项所述的菌株为出发菌株；

所述底物为可发酵碳源，所述可发酵碳源包括3-HIV、KIC、亮氨酸或葡萄糖。