CN117511831A - 产麦角硫因的大肠杆菌的构建方法 - Google Patents
产麦角硫因的大肠杆菌的构建方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN117511831A CN117511831A CN202310214002.XA CN202310214002A CN117511831A CN 117511831 A CN117511831 A CN 117511831A CN 202310214002 A CN202310214002 A CN 202310214002A CN 117511831 A CN117511831 A CN 117511831A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- ergothioneine
- synthase
- gene
- mutant
- seq
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 229940093497 ergothioneine Drugs 0.000 title claims abstract description 153
- SSISHJJTAXXQAX-ZETCQYMHSA-N L-ergothioneine Chemical compound C[N+](C)(C)[C@H](C([O-])=O)CC1=CNC(=S)N1 SSISHJJTAXXQAX-ZETCQYMHSA-N 0.000 title claims abstract description 145
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 title claims abstract description 42
- 238000010276 construction Methods 0.000 title description 17
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 30
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 29
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 claims abstract description 20
- 241000221961 Neurospora crassa Species 0.000 claims abstract description 15
- 102000003960 Ligases Human genes 0.000 claims abstract description 12
- 108090000364 Ligases Proteins 0.000 claims abstract description 12
- 241001013691 Escherichia coli BW25113 Species 0.000 claims abstract description 9
- 235000013878 L-cysteine Nutrition 0.000 claims abstract description 9
- 239000004201 L-cysteine Substances 0.000 claims abstract description 9
- 230000006652 catabolic pathway Effects 0.000 claims abstract description 4
- 230000003313 weakening effect Effects 0.000 claims abstract description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 53
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 45
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 claims description 34
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 20
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 20
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 claims description 10
- 101150018674 sseA gene Proteins 0.000 claims description 10
- 230000009466 transformation Effects 0.000 claims description 10
- 101150024934 ygeA gene Proteins 0.000 claims description 10
- 241000088436 Neurospora sp. Species 0.000 claims description 8
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 claims description 8
- 244000005700 microbiome Species 0.000 claims description 8
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 claims description 3
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 claims description 3
- 241000660147 Escherichia coli str. K-12 substr. MG1655 Species 0.000 claims description 2
- 241001302584 Escherichia coli str. K-12 substr. W3110 Species 0.000 claims description 2
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 claims 1
- 241000221960 Neurospora Species 0.000 abstract description 3
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 36
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 35
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 31
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 28
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 28
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 24
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 description 22
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 21
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 20
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 20
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 18
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 18
- 239000000047 product Substances 0.000 description 18
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 16
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 15
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 13
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 12
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 12
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 11
- 229960002885 histidine Drugs 0.000 description 10
- 229960002433 cysteine Drugs 0.000 description 9
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- 101100065106 Schizosaccharomyces pombe (strain 972 / ATCC 24843) egt1 gene Proteins 0.000 description 7
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 7
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 7
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 description 6
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 101100172079 Neurospora crassa (strain ATCC 24698 / 74-OR23-1A / CBS 708.71 / DSM 1257 / FGSC 987) egt-2 gene Proteins 0.000 description 6
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 6
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 6
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 6
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 6
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 5
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 5
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 5
- 238000012217 deletion Methods 0.000 description 5
- 230000037430 deletion Effects 0.000 description 5
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 5
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 5
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 5
- 229960004452 methionine Drugs 0.000 description 5
- 230000008569 process Effects 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 5
- 102000016928 DNA-directed DNA polymerase Human genes 0.000 description 4
- 108010014303 DNA-directed DNA polymerase Proteins 0.000 description 4
- 102000001390 Fructose-Bisphosphate Aldolase Human genes 0.000 description 4
- 108010068561 Fructose-Bisphosphate Aldolase Proteins 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N L-Methionine Natural products CSCCC(N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 4
- CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L Magnesium sulfate Chemical compound [Mg+2].[O-][S+2]([O-])([O-])[O-] CSNNHWWHGAXBCP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 102000016397 Methyltransferase Human genes 0.000 description 4
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 230000003078 antioxidant effect Effects 0.000 description 4
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 4
- 230000037353 metabolic pathway Effects 0.000 description 4
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 4
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 4
- 238000004064 recycling Methods 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 4
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 3
- 241000589513 Burkholderia cepacia Species 0.000 description 3
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N Triethylamine Chemical compound CCN(CC)CC ZMANZCXQSJIPKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 3
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 3
- 125000001931 aliphatic group Chemical group 0.000 description 3
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 3
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 3
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 3
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 3
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 3
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 3
- -1 2-thioimidazole amino acid Chemical class 0.000 description 2
- 235000001674 Agaricus brunnescens Nutrition 0.000 description 2
- QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N Ammonia Chemical compound N QGZKDVFQNNGYKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010356 CRISPR-Cas9 genome editing Methods 0.000 description 2
- VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L Calcium carbonate Chemical compound [Ca+2].[O-]C([O-])=O VTYYLEPIZMXCLO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 2
- 101100160768 Escherichia coli (strain K12) yubO gene Proteins 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N Melanin Chemical compound O=C1C(=O)C(C2=CNC3=C(C(C(=O)C4=C32)=O)C)=C2C4=CNC2=C1C XUMBMVFBXHLACL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000186359 Mycobacterium Species 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 2
- 240000001462 Pleurotus ostreatus Species 0.000 description 2
- 101000702488 Rattus norvegicus High affinity cationic amino acid transporter 1 Proteins 0.000 description 2
- 108091027544 Subgenomic mRNA Proteins 0.000 description 2
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 2
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 description 2
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 description 2
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 description 2
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 2
- BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N ammonium sulfate Chemical compound N.N.OS(O)(=O)=O BFNBIHQBYMNNAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052921 ammonium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011130 ammonium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 description 2
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 2
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 description 2
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 2
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 2
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 2
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 108091008053 gene clusters Proteins 0.000 description 2
- 238000010362 genome editing Methods 0.000 description 2
- PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N gold Chemical compound [Au] PCHJSUWPFVWCPO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052737 gold Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000010931 gold Substances 0.000 description 2
- 230000036541 health Effects 0.000 description 2
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 description 2
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 2
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 2
- 229960000318 kanamycin Drugs 0.000 description 2
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 2
- 229930182823 kanamycin A Natural products 0.000 description 2
- OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N kanamycin A sulfate Chemical compound OS(O)(=O)=O.O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N OOYGSFOGFJDDHP-KMCOLRRFSA-N 0.000 description 2
- 229960002064 kanamycin sulfate Drugs 0.000 description 2
- 238000009630 liquid culture Methods 0.000 description 2
- 229910052943 magnesium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019341 magnesium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 229940099596 manganese sulfate Drugs 0.000 description 2
- 239000011702 manganese sulphate Substances 0.000 description 2
- 235000007079 manganese sulphate Nutrition 0.000 description 2
- SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L manganese(II) sulfate Chemical compound [Mn+2].[O-]S([O-])(=O)=O SQQMAOCOWKFBNP-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 2
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 2
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 2
- 102220129381 rs200333798 Human genes 0.000 description 2
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 2
- 210000003491 skin Anatomy 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 2
- 125000005323 thioketone group Chemical group 0.000 description 2
- 238000011426 transformation method Methods 0.000 description 2
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 description 2
- PWKSKIMOESPYIA-UHFFFAOYSA-N 2-acetamido-3-sulfanylpropanoic acid Chemical compound CC(=O)NC(CS)C(O)=O PWKSKIMOESPYIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FVNKWWBXNSNIAR-UHFFFAOYSA-N 2-amino-3-(2-sulfanylidene-1,3-dihydroimidazol-4-yl)propanoic acid Chemical compound OC(=O)C(N)CC1=CNC(S)=N1 FVNKWWBXNSNIAR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 241000228212 Aspergillus Species 0.000 description 1
- 241000276408 Bacillus subtilis subsp. subtilis str. 168 Species 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 1
- ACTIUHUUMQJHFO-UHFFFAOYSA-N Coenzym Q10 Natural products COC1=C(OC)C(=O)C(CC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)CCC=C(C)C)=C(C)C1=O ACTIUHUUMQJHFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 108010044467 Isoenzymes Proteins 0.000 description 1
- 241000255777 Lepidoptera Species 0.000 description 1
- 241000547652 Lepista sordida Species 0.000 description 1
- GPPYTCRVKHULJH-QMMMGPOBSA-N N(alpha),N(alpha),N(alpha)-trimethyl-L-histidine Chemical compound C[N+](C)(C)[C@H](C([O-])=O)CC1=CNC=N1 GPPYTCRVKHULJH-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 1
- 206010033661 Pancytopenia Diseases 0.000 description 1
- 206010051246 Photodermatosis Diseases 0.000 description 1
- 235000007685 Pleurotus columbinus Nutrition 0.000 description 1
- 235000001603 Pleurotus ostreatus Nutrition 0.000 description 1
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000055027 Protein Methyltransferases Human genes 0.000 description 1
- 108700040121 Protein Methyltransferases Proteins 0.000 description 1
- 241000223252 Rhodotorula Species 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000187747 Streptomyces Species 0.000 description 1
- 241000187398 Streptomyces lividans Species 0.000 description 1
- 102000003929 Transaminases Human genes 0.000 description 1
- 108090000340 Transaminases Proteins 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 230000032683 aging Effects 0.000 description 1
- 229910021529 ammonia Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000002518 antifoaming agent Substances 0.000 description 1
- 238000006701 autoxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000003796 beauty Effects 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 235000013361 beverage Nutrition 0.000 description 1
- 230000002210 biocatalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 238000005282 brightening Methods 0.000 description 1
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 1
- 229910000019 calcium carbonate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 description 1
- 230000010307 cell transformation Effects 0.000 description 1
- 238000007385 chemical modification Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 235000017471 coenzyme Q10 Nutrition 0.000 description 1
- 229940110767 coenzyme Q10 Drugs 0.000 description 1
- ACTIUHUUMQJHFO-UPTCCGCDSA-N coenzyme Q10 Chemical compound COC1=C(OC)C(=O)C(C\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CC\C=C(/C)CCC=C(C)C)=C(C)C1=O ACTIUHUUMQJHFO-UPTCCGCDSA-N 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002537 cosmetic Substances 0.000 description 1
- 208000024389 cytopenia Diseases 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N dATP Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-RRKCRQDMSA-N 0.000 description 1
- SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N dATP Natural products C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1C1CC(O)C(COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 SUYVUBYJARFZHO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J dCTP(4-) Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@@H]1O[C@H](COP([O-])(=O)OP([O-])(=O)OP([O-])([O-])=O)[C@@H](O)C1 RGWHQCVHVJXOKC-SHYZEUOFSA-J 0.000 description 1
- HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N dGTP Chemical compound C1=NC=2C(=O)NC(N)=NC=2N1[C@H]1C[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)O1 HAAZLUGHYHWQIW-KVQBGUIXSA-N 0.000 description 1
- NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N dTTP Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OP(O)(O)=O)[C@@H](O)C1 NHVNXKFIZYSCEB-XLPZGREQSA-N 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 101150044740 egt1 gene Proteins 0.000 description 1
- 230000009088 enzymatic function Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 238000003209 gene knockout Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 235000013882 gravy Nutrition 0.000 description 1
- 210000005260 human cell Anatomy 0.000 description 1
- 125000002349 hydroxyamino group Chemical group [H]ON([H])[*] 0.000 description 1
- JGPMMRGNQUBGND-UHFFFAOYSA-N idebenone Chemical compound COC1=C(OC)C(=O)C(CCCCCCCCCCO)=C(C)C1=O JGPMMRGNQUBGND-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960004135 idebenone Drugs 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 230000031700 light absorption Effects 0.000 description 1
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 238000005192 partition Methods 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 238000003068 pathway analysis Methods 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000008845 photoaging Effects 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M potassium dihydrogen phosphate Chemical compound [K+].OP(O)([O-])=O GNSKLFRGEWLPPA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K potassium phosphate Substances [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000035755 proliferation Effects 0.000 description 1
- 239000003223 protective agent Substances 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000006340 racemization Effects 0.000 description 1
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012827 research and development Methods 0.000 description 1
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000004927 skin cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 1
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 239000008223 sterile water Substances 0.000 description 1
- 230000008685 targeting Effects 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/10—Transferases (2.)
- C12N9/13—Transferases (2.) transferring sulfur containing groups (2.8)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/88—Lyases (4.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/90—Isomerases (5.)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
- C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y208/00—Transferases transferring sulfur-containing groups (2.8)
- C12Y208/01—Sulfurtransferases (2.8.1)
- C12Y208/01002—3-Mercaptopyruvate sulfurtransferase (2.8.1.2)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y501/00—Racemaces and epimerases (5.1)
- C12Y501/01—Racemaces and epimerases (5.1) acting on amino acids and derivatives (5.1.1)
- C12Y501/0101—Amino-acid racemase (5.1.1.10)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2800/00—Nucleic acids vectors
- C12N2800/10—Plasmid DNA
- C12N2800/101—Plasmid DNA for bacteria
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
- C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
- C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
- C12R2001/185—Escherichia
- C12R2001/19—Escherichia coli
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种构建产麦角硫因的大肠杆菌的方法,包括下述步骤:A.以大肠杆菌BW25113为底盘菌,敲除或者弱化L‑半胱氨酸降解途径,得到菌株A;B.使菌株A过表达链孢霉Neurospora sp.来源的麦角硫因合成酶1以及粗糙链孢霉Neurospora crassa来源的麦角硫因合成酶2,得到产麦角硫因的大肠杆菌工程菌。本发明还公开了可提高大肠杆菌表达麦角硫因水平的麦角硫因合成酶1突变体。
Description
技术领域
本发明属于基因工程领域,涉及一种麦角硫因生产菌的构建方法,具体涉及一种构建产麦角硫因的大肠杆菌工程菌的方法。
背景技术
麦角硫因(L-ergothionine,EGT),化学名为2-巯基组氨酸三甲基内盐,是至今发现的唯一天然的2-硫代咪唑氨基酸。由于麦角硫因具有特殊的硫酮结构和较高的氧化还原电势,因此是一种天然的抗氧化剂。自然状态下,麦角硫因主要以硫酮的形式存在,相较其他抗氧化剂更不易发生自氧化反应,具有更高的稳定性,是一种比辅酶Q10或艾地苯醌更强大的抗氧化剂。作为一种强力抗氧化剂,其抗氧化功能主要体现在延缓人体细胞的衰老速度上,提高皮肤细胞的活性,防止皮肤的光老化,减少黑色素生成和亮肤的效果,因此麦角硫因作为一种多功能的细胞生理保护剂被广泛用于化妆品、美容产品、食品、饮料和保健品等健康保健领域。
麦角硫因的制备包括化学合成法和生物合成法。化学合成方法工艺复杂,合成过程容易导致局部或全部手性消旋化,产品收率低,且合成的试剂昂贵,导致产品成本高,难以大范围推广使用。生物合成法分两种,一种是蕈菌菌丝深层发酵法,另一种是基因工程菌生物催化合成法。蕈菌菌丝深层发酵指的是以蕈菌菌丝体发酵制备L-麦角硫因,发酵成本低,易于规模化,但是麦角硫因的产量低,且发酵过程副产物较多、难提纯,因此也无法规模化制备出高纯度麦角硫因。例如,CN102978121A公开了食用菌白香蘑菌催化组氨酸底物生成麦角硫因,底物转化率可达70%,未报道产物产率;CN103184246A公开了大型丝状真菌花脸香蘑摇瓶发酵10天,麦角硫因产量51mg/L;WO2015180492A1公开了糙皮侧耳在75L发酵罐中经14天发酵,麦角硫因产量352mg/L;CN103734022A公开了食用菌糙皮侧耳经7~15天发酵,麦角硫因产量最高产量143.7mg/L。
基因工程菌生物催化合成法是当下麦角硫因的重点研发方向,以基因工程菌催化L-组氨酸、L-半胱氨酸催化合成L-麦角硫因合成,发酵成本低,提取工艺相对简单,易于规模化,具有工业化应用潜力。例如,WO2017150304A1公开了青紫链霉菌Streptomyceslividans经7天发酵,麦角硫因产量900mg/L;CN107250347A公开了基因工程曲霉经基因工程改造后,发酵产量可达438mg/L;大肠杆菌经基因工程改造,异源表达分枝杆菌的麦角硫因基因合成簇,麦角硫因产量640mg/L;CN106661585A公开了大肠杆菌经基因工程改造,发酵麦角硫因产量12mg/L;CN201910664772.8A公开了以枯草芽孢杆菌168为宿主表达外源基因,构建的基因工程菌麦角硫因产量达到568.4mg/L;CN111534535A公开了以圆红酵母为宿主表达外源基因,工程菌发酵麦角硫因产量达到1.5g/L。
发明内容
由于大肠杆菌是增殖速度最快的微生物之一,也是基因工程领域应用最广的模式菌,因此开发产麦角硫因的大肠杆菌工程菌将会促进工程菌发酵生产麦角硫因方法的工业化应用。发明人探索了大肠杆菌工程菌的构建,改变大肠杆菌BW25113的代谢途径,并对于麦角硫因合成的相关蛋白(包括酶和转运蛋白)/基因簇进行了广泛筛选和实验对比,通过结合链孢霉Neurospora sp.来源的麦角硫因合成酶1(NsEgt1,GenBank登录号:KAJ4380386.1)与粗糙链孢霉Neurospora crassa来源的麦角硫因合成酶2(NcEgt2,NCBI登录号:XP_001728131.1)的两酶组合,终于实现了麦角硫因的表达。另一方面,为了提高大肠杆菌工程菌的麦角硫因表达水平,还通过针对甲基转移酶功能区的定向突变技术对麦角硫因合成酶1(NsEgt1)和/或麦角硫因合成酶2(NcEgt2)进行改造,获得了促进麦角硫因合成的酶突变体和大肠杆菌工程菌。具体地,本发明包括如下技术方案:
一种构建产麦角硫因的大肠杆菌的方法,包括下述步骤:
A.以大肠杆菌BW25113、MG1655或W3110为底盘菌,优选大肠杆菌BW25113为底盘菌,敲除或者弱化L-半胱氨酸降解途径,得到菌株A;
B.使菌株A过表达链孢霉(Neurospora sp.)来源的麦角硫因合成酶1(NsEgt1,GenBank登录号:KAJ4380386.1,氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)或者其突变体(氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示)以及粗糙链孢霉(Neurospora crassa)来源的麦角硫因合成酶2(NcEgt2,NCBI登录号:XP_001728131.1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示),筛选阳性克隆,得到产麦角硫因的大肠杆菌工程菌。
在一种实施方式中,上述步骤A是敲除ygeA基因(NCBI登录号:GI:446771403)和sseA基因(NCBI登录号:GI:446030771),获得BW25113-ΔYS宿主菌A。
可选地,所述ygeA基因和sseA基因的敲除可以采用CRISPR-Cas9基因编辑技术进行。
上述步骤B可以是将Neurospora sp.来源的麦角硫因合成酶1(NsEgt1,GenBank登录号:KAJ4380386.1,氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)或者其突变体(氨基酸序列如SEQ IDNO:6所示)的表达质粒、Neurospora crassa来源的麦角硫因合成酶2(NcEgt2,NCBI登录号:XP_001728131.1,氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示)的表达质粒转化入菌株A感受态细胞中。
在一种可选的实施方式中,上述步骤B可以是将链孢霉(Neurospora sp.)来源的麦角硫因合成酶1(NsEgt1,GenBank登录号:KAJ4380386.1)基因或者其突变体基因与粗糙链孢霉(Neurospora crassa)来源的麦角硫因合成酶2(NcEgt2,NCBI登录号:XP_001728131.1)基因一起克隆入大肠杆菌基因组中。
优选地,所述麦角硫因合成酶1(NsEgt1,GenBank登录号:KAJ4380386.1,氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示;所述麦角硫因合成酶1突变体(氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示)的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示;所述麦角硫因合成酶2(NcEgt2,NCBI登录号:XP_001728131.1,氨基酸序列如SEQ IDNO:4所示)的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
当使用质粒表达上述NsEgt1和NcEgt2时,上述麦角硫因合成酶1即NsEgt1或其突变体的编码基因和所述麦角硫因合成酶2即NcEgt2的编码基因被克隆在同一个质粒上进行共表达。
可选地,上述质粒中,麦角硫因合成酶1即NsEgt1或其突变体的编码基因和所述麦角硫因合成酶2即NcEgt2的编码基因分别置于trc启动子调控下。
上述质粒载体可以是任何适合于在大肠杆菌中表达的质粒,例如可以是pET载体pET22b、pET24a、pET28a等,pSH,pTrc99a,pETDuet 1,pRSFDuet 1质粒等等。
在一种实施方式中,上述的共表达质粒是用pTrc99a质粒做骨架载体,trc启动子作为基因表达的启动子,通过基因片段重组的方式构建含有NsEgt1/突变体和NcEgt2的共表达质粒pTrc99a-trc-NsEgt1/突变体-trc-NcEgt2。
本发明的第二个方面提供了一种麦角硫因合成酶突变体,其可以具有如SEQ IDNO:6所示的氨基酸序列,本文中可命名为NsEgt1mut,其为NsEgt1的(E88G、K239S、V316A)突变体。应理解,上述麦角硫因合成酶1突变体并不限于氨基酸序列为SEQ ID NO:6的突变体NsEgt1mut,还包括氨基酸序列与SEQ ID NO:6有85%以上、优选90%以上、优选95%以上、优选98%以上、更优选99%以上同源性、且酶活力相比SEQ ID NO:6提高的多肽。
本发明的第三个方面提供了编码上述麦角硫因合成酶突变体NsEgt1mut的基因。
例如,上述NsEgt1mut编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。
本发明的第四个方面提供了上述的麦角硫因合成酶突变体NsEgt1mut或者上述的基因例如SEQ ID NO:6在促进微生物生产麦角硫因中的应用;或者提供了上述的麦角硫因合成酶突变体NsEgt1mut在酶促合成麦角硫因中的应用。
本发明的第五个方面提供了一种麦角硫因生产菌,其通过上述的方法构建得到。
本发明的另一个方面提供了上述麦角硫因生产菌在发酵法生产麦角硫因中的用途。
在一种实施方式中,由于在麦角硫因的好氧生物合成途径和厌氧生物合成途径中,组氨酸、甲硫氨酸和半胱氨酸是合成麦角硫因的前体,因此发酵培养基中可添加有L-组氨酸,并且还可以添加有L-甲硫氨酸和/或L-半胱氨酸。
在上述麦角硫因生产菌发酵后,从发酵液中提取产物麦角硫因,无需对发酵菌体进行破胞处理,有助于降低生产成本。
本发明通过基因工程手段构建出生产麦角硫因的大肠杆菌工程菌株;并且通过针对NsEgt1甲基转移酶功能区的定向突变技术获得了可提高大肠杆菌表达麦角硫因水平的麦角硫因合成酶1突变体NsEgt1mut,使得L-组氨酸转化率和麦角硫因生成率有效地提高,麦角硫因的产量提升了3.1倍,高达5g/L,为大肠杆菌发酵法生产麦角硫因开辟了一种新途径。
附图说明
图1是本发明构建的质粒pTrc99a-trc-NsEgt1-trc-NcEgt2的图谱结构示意图。
图2是本发明构建的质粒pTargetF-ygeA-sseA的图谱结构示意图。
图3是分光光度计法检测麦角硫因的标准曲线图。
图4是本发明实施例中检测麦角硫因产品的HPLC图谱。
具体实施方式
生物学领域公知,大肠杆菌传代速度快,是已知代时最短的自由生活细菌之一,因此是一种优良的用于构建表达系统的底盘细胞。
虽然有多种微生物包括分枝杆菌、链霉菌、霉菌和酵母等具有麦角硫因的合成能力,但大肠杆菌一般不能合成麦角硫因。因此,要想使用大肠杆菌表达麦角硫因,必须对大肠杆菌的代谢系统进行基因工程改造。
大肠杆菌作为麦角硫因生产菌的一个优势还在于菌株发酵产生的麦角硫因大部分会分泌到发酵液中,使得麦角硫因作为胞外产物由于无需对发酵菌体进行破壁处理,这对于产物麦角硫因的提取和纯化极为有利,省去了复杂的分离提取等后处理步骤,因而能降低生产成本。
并非所有大肠杆菌都能通过代谢系统改造就能实现麦角硫因的生物合成,因为不同的亚种具有不同的遗传特点、生理性状和代谢路线。经过代谢路径分析和筛选实验比较,发现大肠杆菌BW25113很适合于作为表达麦角硫因的底盘细胞。
本发明除了通过敲除ygeA基因(GenBank登录号:446771403)和sseA基因(GenBank登录号:446030771)等手段来敲除/弱化大肠杆菌BW25113中的L-半胱氨酸降解途径(步骤A)外,还需要导入编码麦角硫因合成酶(系)的麦角硫因合成基因簇(步骤B)。
应理解,在构建本发明的基因工程菌的具体操作中,步骤A和步骤B的排序并非完全根据英文字母顺序由前到后地固定不变,它们可以交叉、颠倒地操作,只要每个步骤能实现各自的功能、完成宿主细胞基因型的定向改变即可。
在粗糙链孢霉中,麦角硫因合成酶系包括egt1和egt2两个关键酶。在Fe2+和O2存在的条件下,egt1催化HER和半胱氨酸合成Cys-HER,再由egt2催化Cys-HER转化为麦角硫因(Irani S,Naowarojna N,Tang Y,et al.Snapshots of C–S cleavage in Egt2 revealssubstrate specificity and reaction mechanism.Cell Chem Biol,2018,25(5):519-529.e4.DOI:10.1016/j.chembiol.2018.02.002)。
但我们的研究发现,粗糙链孢霉(Neurospora crassa)来源的egt1和egt2组合在大肠杆菌BW25113中并不能实现促进麦角硫因合成的效果,原因可能在于链孢霉与大肠杆菌存在许多生理性状和代谢路径等多方面显著差异。于是不得不对众多微生物来源的egt1和egt2及同工酶进行筛选比较,最终发现粗糙链孢霉(Neurospora crassa)来源的egt2即NcEgt2(氨基酸序列为SEQ ID NO:4)与另一种链孢霉(Neurospora sp.)来源的egt1即NsEgt1(氨基酸序列为SEQ ID NO:2)的组合能够实现麦角硫因在大肠杆菌BW25113中的表达。
在本文中,为了描述简便,有时会将某种蛋白比如egt1与其编码基因(DNA)名称混用,本领域技术人员应能理解它们在不同描述场合表示不同的物质。本领域技术人员根据语境和上下文容易理解它们的含义。例如,对于egt1,用于描述酶功能或类别时,指的是蛋白质;在作为一种基因描述时,指的是编码该酶的基因。
构建出的重组工程菌pTrc99a-trc-NsEgt1-trc-NcEgt2/Ecoli BW25113-ΔYS发酵产生的麦角硫因产量偏低,经分析,推断提高NsEgt1的酶活力应该能够提升麦角硫因表达水平。
本文中的术语“重组菌”和“(基因)工程菌(株)”表示相同的意义,都是指已经对野生型大肠杆菌BW25113进行了基因改造、实现麦角硫因表达或者提高了麦角硫因表达量的菌株。
我们尝试采用定向突变技术对NsEgt1进行突变,重点突变NsEgt1的甲基转移酶功能区,以期获得酶活力相对野生酶NsEgt1显著提高的突变酶。
在本文中,术语“野生(型)”、“野生酶”、“野生型酶”表示相同的意义,都是指野生型的麦角硫因合成酶1(NsEgt1,GenBank登录号:KAJ4380386.1,氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示)。类似地,术语“麦角硫因合成酶1突变体”、“突变体麦角硫因合成酶1”、“突变麦角硫因合成酶1”和“突变酶”表示相同的意义,都是指麦角硫因合成酶1氨基酸序列中个别氨基酸残基发生突变后形成的突变体比如SEQ ID NO:6(NsEgt1mut)。有时为了表述方便起见,在本文中比如实施例中可以将野生酶NsEgt1与其突变体比如NsEgt1mut等统称为“麦角硫因合成酶1(NsEgt1)”。
术语“酶活力”、“酶活性”或“酶合成活力”在本文中尤其是指酶催化底物组氨酸生成麦角硫因前体S-(组氨酸甜菜碱)-2-)基-L-半胱氨酸S-氧化物(S-(hercyn-2-yl)-L-cysteine S-oxide)的催化性能。
本文中,上述所用术语“(酶活力)提高”或“增加”表示相较于参考水平提高至少100%,例如相较于参考水平的至少约1倍、至少约2倍、或至少约3倍、或至少约5倍、或至少约10倍、或至少约20倍的提高。
本领域技术人员应当理解,上述麦角硫因合成酶1突变体并不限于氨基酸序列为SEQ ID NO:6的突变体NsEgt1mut,还包括氨基酸序列与SEQ ID NO:6有85%以上、优选90%以上、优选95%以上、优选98%以上、更优选99%以上同源性、且酶活力相比SEQ ID NO:6提高的多肽。
所述的“突变”包括但不限于氨基酸残基的替换、删除、插入、化学修饰,优选是正向突变即酶活力提高的突变。所述取代可以是非保守取代、保守取代或非保守取代和保守取代的组合。“保守的”氨基酸取代或突变是指具有相似侧链的残基的可互换性,并且因此通常包括用相同或相似的氨基酸定义类别中的氨基酸取代多肽中的氨基酸。然而,如本文所用,如果保守的突变可以代替地为脂肪族至脂肪族、非极性至非极性、极性至极性、酸性至酸性、碱性至碱性、芳族至芳族、或限制残基至限制残基的取代,则保守的突变不包括亲水至亲水、疏水至疏水、含羟基至含羟基或小残基至小残基的取代。本技术领域公知,保守性置换的常见情况包括:芳香族氨基酸F、W、Y之间的相互置换;疏水性氨基酸L、I、V之间的相互置换,极性氨基酸Q、N之间的相互置换,碱性氨基酸K、R、H之间的相互置换,酸性氨基酸D、E之间的相互置换,羟基的氨基酸S、T之间的相互置换。此外,A、V、L或I可以保守地突变为另一脂肪族残基或另一非极性残基。示例性的保守取代例如可以根据下表来进行,其中在第二列中属于同一个分区的氨基酸可以相互取代,在优选的情况下第三列中同一行的氨基酸可互相取代:
“非保守取代”是指用具有显著不同的侧链特性的氨基酸进行的多肽中氨基酸的取代或突变。非保守取代可以使用上面所列的定义组之间而不是之内的氨基酸。在一个实施方案中,非保守突变影响(a)取代区域中肽主链的结构(例如,脯氨酸取代甘氨酸)、(b)电荷或疏水性、或(c)侧链体积。
“缺失”是指通过从参考多肽移除一个或多个氨基酸而对多肽进行的修饰。缺失可以包括移除1个或多个氨基酸、2个或更多个氨基酸、5个或更多个氨基酸、10个或更多个氨基酸、15个或更多个氨基酸、或20个或更多个氨基酸、多达构成参考酶的氨基酸总数的10%,同时保留酶活性和/或保留工程化醛缩酶的改良特性。缺失可以针对多肽的内部和/或端部。在多个实施方案中,缺失可以包含连续的区段或者可以是不连续的。
“插入”是指通过从参考多肽添加一个或多个氨基酸而对多肽进行的修饰。在一些实施方案中,改良的工程化醛缩酶包括将一个或多个氨基酸插入天然存在的醛缩酶中以及将一个或多个氨基酸插入其他改良的醛缩酶多肽中。插入可以是在多肽的内部,或羧基端或氨基端。如本文所用的插入包括如本领域中已知的融合蛋白。插入可以是连续氨基酸区段或者被天然存在的多肽中的一个或多个氨基酸分隔开。
本发明的麦角硫因合成酶1(NsEgt1和NsEgt1mut)的氨基酸数量有881个,麦角硫因合成酶2(NcEgt2)的氨基酸数量有473个,结构明确,因此本领域技术人员很容易获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。
为了在基因工程中最常用的大肠杆菌中最佳地表达麦角硫因合成酶1(NsEgt1和NsEgt1mut)和麦角硫因合成酶2(NcEgt2),可以对这些酶的表达基因进行了密码子优化。密码子优化是可用于通过增加感兴趣基因的翻译效率使生物体中蛋白质表达最大化的一种技术。不同的生物体由于突变倾向和天然选择而通常示出对于编码相同氨基酸的一些密码子之一的特殊偏好性。例如,在生长快速的微生物如大肠杆菌中,优化密码子反映出其各自的基因组tRNA库的组成。因此,在生长快速的微生物中,氨基酸的低频率密码子可以被用于相同氨基酸的但高频率的密码子置换。因此,优化的DNA序列的表达在快速生长的微生物中得以改良。
例如,为了在大肠杆菌中表达转氨酶,经密码子优化的NsEgt1(SEQ ID NO:2)的编码基因可以是SEQ ID NO:1;突变体NsEgt1mut(SEQ ID NO:6)的编码基因可以是SEQ IDNO:5;NcEgt2(SEQ ID NO:4)的编码基因可以是SEQ ID NO:3。
上述可以使用trc启动子调控NsEgt1编码基因SEQ ID NO:1、NsEgt1mut编码基因SEQ ID NO:5和NcEgt2编码基因SEQ ID NO:3的表达。本领域技术人员容易理解,调控麦角硫因合成酶1和麦角硫因合成酶2表达的启动子可以相同、也可以不同,且包括但不仅仅限于trc。
该启动子与下游的NsEgt1/NcEgt2编码基因和终止子构成NsEgt1/NcEgt2基因表达盒。在本发明构建的工程菌中,egt1基因以基因表达盒的形式存在。在本文中,术语“麦角硫因合成酶基因表达盒”、“基因表达盒”和“表达盒”表示相同的意义,可以互换使用。
这些基因可以分别构建在合适的质粒上,再将两种质粒一起转化入大肠杆菌BW25113中进行共表达;也可以将NsEgt1和NcEgt2的编码基因克隆在同一个质粒上形成共表达质粒,再将该质粒转化入大肠杆菌BW25113中进行共表达。
例如,可以使用pTrc99a质粒做骨架载体,将两个基因置于trc启动子调控下,构建出共表达质粒pTrc99a-trc-NsEgt1/NsEgt1mut-trc-NcEgt2。
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解,以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度,其中所述的百分含量,除特别说明外,皆指质量百分含量。
实施例
材料和方法
本文中的全基因合成、引物合成及测序皆由苏州金唯智生物技术公司完成。
本文中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、感受态细胞制备、转化等主要参照《分子克隆实验指南》(第三版),J.萨姆布鲁克,D.W.拉塞尔(美)编著,黄培堂等译,科学出版社,北京,2002)进行。比如感受态细胞转化方法及感受态制备方法均参照《分子克隆实验指南》(第三版)第1章96页进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。
主要培养基及溶液:
LB培养基:5g/L酵母提取物,10g/L胰蛋白胨,10g/L氯化钠。(LB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)
TB培养基:24g/L酵母提取物、12g/L胰蛋白胨、16.43g/L K2HPO4.3H2O、2.31g/LKH2PO4、5g/L甘油,pH7.0-7.5。(TB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)
营养肉汁培养基:10g/L胰蛋白胨,3g/L牛肉浸膏,5g/L氯化钠,pH7.0。(固体培养基另加15g/L琼脂粉。)
麦角硫因标准品,购自阿拉丁化学试剂公司。
麦角硫因HPLC检测条件:安捷伦高效液相色谱仪1260infinity II,SB-AQ250mm×4.6mm,5μm;检测波长258nm;流动相A:B(95:5);操作温度40℃;流速0.5ml/min;流动相A:0.1%乙酸铵;流动相B:乙腈。
氨基酸HPLC检测条件:waters Symmetry(250*4.6mm,5um)色谱柱,流速1ml/min,波长:338nm,柱温:35℃,进样量20ul,流动相A:B(40:60)
流动相A相:2.72g/L乙酸钠,0.018%三乙胺,0.3%四氢呋喃(pH 7.20)。
流动相B相:50%乙腈,50%甲醇。
实施例1:产L-麦角硫因基因工程大肠杆菌的构建
1.表达质粒构建
用pTrc99a质粒做骨架载体,trc启动子作为基因表达的启动子,通过基因片段重组的方式构建含有Neurospora sp.来源的麦角硫因合成酶1(NsEgt1)和Neurosporacrassa来源的麦角硫因合成酶2(NcEgt2)的共表达质粒pTrc99a-trc-NsEgt1-trc-NcEgt2。步骤如下:
基于Neurospora sp.来源的麦角硫因合成酶1(NsEgt1,GenBank序列号:KAJ4380386.1)的氨基酸序列SEQ ID NO:2,进行大肠杆菌偏好性的密码子优化,全基因合成其编码基因序列SEQ ID NO:1。以SEQ ID NO:1为模板,用NsEgt1-F和NsEgt1-R为引物扩增。扩增片段大小2646bp,切胶回收制备NsEgt1片段。
基于Neurospora crassa来源的麦角硫因合成酶2(NcEgt2,NCBI序列号:XP_001728131.1)的氨基酸序列SEQ ID NO:4,进行大肠杆菌偏好性的密码子优化,全基因合成其编码基因序列SEQ ID NO:3,用trc-NcEgt2-F1和ter-NcEgt2-R为引物扩增。扩增片段大小1480bp,切胶回收制备NcEgt2片段。
以pTrc99a质粒为模板,用NsEgt1-trc-F和trc-R为引物扩增,片段大小95bp,切胶回收制备trc片段。以NcEgt2片段和trc片段为模板,用NsEgt1-trc-F和ter-NcEgt2-R为引物扩增。扩增片段大小1540bp,切胶回收制备trc-NcEgt2片段。
以pTrc99a质粒为模板,用ter-F和trc-R为引物扩增。扩增片段大小4122bp,切胶回收制备pTrc99a载体片段。
将pTrc99a载体片段、NsEgt1片段和trc-NcEgt2片段三个片段通过全式金公司Seamless Cloning and Assembly Kit重组试剂盒重组成麦角硫因合成酶1和麦角硫因合成酶2共表达质粒pTrc99a-trc-NsEgt1-trc-NcEgt2,质粒图谱见附图1。
上述构建过程中的PCR具体操作如下:
50μL PCR反应体系包括:10ng质粒模板,10pmol的引物对,1xKOD plus buffer,0.2mM dNTP,1.5mM MgSO4,5个单位的KOD-plus DNA聚合酶。
PCR反应条件为:95℃3min;98℃10s,57℃30s,68℃1min/kbp,30个循环;68℃10min。
质粒构建引物序列如下:
注:引物名称中的“-F”代表正向;“-R”代表反向。
2.宿主菌株Ecoli BW25113-ΔYS构建
对大肠杆菌BW25113中L-半胱氨酸降解的途径进行敲除弱化,即对ygeA基因(GI:446771403)和sseA基因(GI:446030771)采用CRISPR-Cas9基因编辑技术进行敲除。包括下述步骤:
(1)构建pTargetF-ygeA-sseA质粒
根据ygeA基因(GI:446771403)、sseA基因(GI:446030771)的基因序列设计sgRNA靶向N20序列,设计结果如下:
ygeA基因N20序列:cctcagccagaatgtccccg
sseA基因N20序列:tctcagccccacgagcatgg
以pTargetF质粒为模板,用ygeAspc和spc-R引物进行环状PCR扩增。扩增获得大小2117bp片段,PCR产物经Dpn I消化后,直接转化DH5a化学感受态,长出的阳性克隆进行质粒抽提,获得pTargetF-ygeA质粒。
按照相同的方法,用sseAspc和spc-R引物,最终获得了pTargetF-sseA质粒。
以pTargetF-ygeA质粒为模板,用ygeA-N20-EcoR-F和ygeA-N20-EcoR-R引物扩增大小164bp片段,PCR产物用EcoR I进行酶切,然后切胶回收制备ygeA-N20片段。
pTargetF-sseA质粒用EcoR I进行酶切,然后再用1μl去磷酸化酶FastAP处理,最后切胶回收大片段制备pTargetF-sseA载体片段。
采用T4 DNA连接酶将pTargetF-sseA载体片段和ygeA-N20片段连接,连接产物转化DH5a,最终获得ygeA和sseA双靶向sgRNA辅助质粒pTargetF-ygeA-sseA,质粒图谱见附图2。
上述构建过程中的PCR具体操作如下:
50μL PCR反应体系包括:10 ng质粒模板,10 pmol的引物对,1xKOD plus buffer,0.2mMdNTP,1.5mM MgSO4,5个单位的KOD-plus DNA聚合酶。
PCR反应条件为:95℃3min;98℃10s,57℃30s,68℃1min/kbp,30个循环;68℃10min。
质粒构建引物序列如下:
(2)重组片段构建
ΔsseA重组片段制备:通过引物互为模板的方式,用引物对sseA-OF和sseA-OR直接进行扩增。PCR产物大小129bp,PCR产物直接试剂盒进行回收,然后真空浓缩至浓度超过500ng/μl,然后备用。
ΔygeA重组片段制备:通过引物互为模板的方式,用引物对ygeA-OF和ygeA-OR直接进行扩增。PCR产物大小132bp,PCR产物直接试剂盒进行回收,然后真空浓缩至浓度超过500ng/μl,然后备用。
上述构建过程中的PCR具体操作如下:
50μL PCR反应体系包括:50pmol的引物对,1xKOD plus buffer,0.2mM dNTP,1.5mM MgSO4,5个单位的KOD-plus DNA聚合酶。
PCR反应条件为:95℃1min;98℃10s,57℃30s,68℃20s,25个循环;68℃10min。
(3)ygeA和sseA基因敲除
制备大肠杆菌BW25113化转感受态,然后通过氯化钙转化方法将pEcCas质粒转入大肠杆菌BW25113中,通过硫酸卡那霉素抗性平板筛选,获得pEcCas/Ecoli BW25113菌。
制备pEcCas/Ecoli BW25113菌株电转化感受态细胞,100μl电转化感受态中加入3μl pTargetF-ygeA-sseA质粒、3.5μlΔsseA重组片段和3.5μlΔygeA重组片段,电转条件为0.2cm电转杯,2.5KV,200欧姆,25μF。电转后产物经37℃孵育1小时后,菌体涂终浓度50μg/ml硫酸卡那霉素和50μg/ml壮观抗性双抗平板。
分别用引物对ygeA-up480/ygeA-dn267和sseA-up243/sseA-dn292进行菌落PCR鉴定,PCR产物大小为767bp和541bp的为ygeA和sseA两个基因均敲除的菌种,经过辅助质粒消除最终获得基因工程宿主菌Ecoli BW25113-ΔYS。
所用引物序列见下表
3.产L-麦角硫因菌种的构建
将质粒pTrc99a-trc-NsEgt1-trc-NcEgt2用化学转化法转入菌株Ecoli BW25113-ΔYS中,最终获得了菌种pTrc99a-trc-NsEgt1-trc-NcEgt2/Ecoli BW25113-ΔYS。该菌株发酵罐发酵生产麦角硫因的水平参见表1。
菌株5L发酵罐发酵72h后麦角硫因产量为0.66g/L,发酵96h后麦角硫因产量为1.59g/L。为了进一步提高其麦角硫因表达水平,尝试通过对NsEgt1和/或NcEgt2进行突变来提高菌株的麦角硫因合成能力。
实施例2:NsEgt1易错突变库建立及筛选
针对麦角硫因合成酶1(NsEgt1)的甲基转移酶功能区进行突变,获得麦角硫因表达水平提高的菌株。
1.易错突变库建立
以pTrc99a-trc-NsEgt1-trc-NcEgt2质粒为模板,对NsEgt1的甲基转移酶区域进行突变,建立麦角硫因合成酶1(NsEgt1)的易错随机突变库。设计如下引物对:
正向引物NsEgt1-F:5’-ATGCCGTCCGCTGAAACCATG-3’,
反向引物NsEgt1-R1200:5’-CGGTTTTTCCAGCAGTTCTTCCTG-3’。
易错PCR反应体系:100ng质粒模板,20μM一对引物NsEgt1-F和NsEgt1-R1200,1×Taq buffer,0.2mM dGTP,1mM dATP,1mM dCTP,0.2mM dTTP,7mM MgCl2,5个单位的Taq酶(Thermo公司)。PCR反应条件为:95℃5min;94℃30s,58℃30s,72℃2min/kbp;25-30个循环;72℃10min。胶回收1.2kbp随机突变片段作为大引物(Axygen DNA凝胶回收试剂盒AP-GX-50),用KOD-plus DNA聚合酶做MegaPrimer PCR:94℃5min,;98℃20s,60℃40s,68℃2min/kbp,30个循环;68℃10min。Dpn I限制性内切酶(Thermo公司)消化质粒模板,电转化大肠杆菌Ecoli BW25113-ΔYS,得到超过300个克隆的NsEgt1随机突变库。
2.洋葱伯克霍尔德氏菌菌悬液制备
洋葱伯克霍尔德氏菌(CGMCC 1.2787)冻存菌种进行营养肉汤固体培养基平板划线,30℃培养,然后挑选单菌落接种至含有5ml营养肉汤液体培养基的试管中,30℃,250rpm培养过夜,然后按照1%v/v接种至含有50ml营养肉汤液体培养基的摇瓶中,30℃,250rpm培养40-48h,然后10000rpm,离心收集菌体,菌体用无菌水重悬至菌浓20g/L,备用。
3.分光光度计法测定麦角硫因的标准曲线
配制浓度分别为0mg/L、25mg/L、50mg/L、75mg/L、100mg/L、150mg/L、200mg/L的麦角硫因水溶液标准品,然后100μl标准品加入100μl步骤2中获得的菌悬液,30℃孵育30min,然后离心取上清用酶标仪检测315nm吸光值。标准曲线见附图3。
4.突变体库的高通量筛选
选取突变体库中的转化子,接种到500μL含有50μg/mL卡那霉素LB液体培养基的96孔深孔培养板中,培养过夜,然后取80μl过夜培养物,转接至800μl含有50μg/mL卡那霉素的TB液体培养基中,37℃培养3h后,加入终浓度0.5mM IPTG,降温至30℃,培养4-8h,培养菌液4500rpm离心15min,弃上清,加入500μl转化培养基重悬,继续在30℃培养40-48h。转化培养基配方:0.1g/L玉米浆,硫酸铵10g/L,5%葡萄糖,硫酸镁5g/L,磷酸二氢钾2.5g/L,硫酸亚铁0.2g/L,硫酸锰0.05g/L,L-组氨酸2g/L,L-甲硫氨酸2g/L,L-半胱氨酸2g/L,0.5%碳酸钙,pH7.0。培养液5000rpm离心20min,取100μl离心上清,加入100μl步骤2制备的洋葱伯克霍尔德氏菌菌悬液,30℃孵育30min,然后离心取上清用酶标仪检测315nm吸光值,与标准曲线比对后确定麦角硫因浓度,用于评估转化子的麦角硫因表达水平。
高通量筛选结果显示,获得一株麦角硫因产量明显提升幅度最大的突变菌株,编号BL9-M1278。对其抽取质粒,委托苏州金唯智公司进行核酸测序,将基因组中NsEgt1相关片段与SEQ ID NO:1进行比对,确定NsEgt1的氨基酸序列改变情况。比较发现NsEgt1相关基因片段的核酸序列为SEQ ID NO:5,对应的氨基酸序列为SEQ ID NO:6,确定所获得的质粒在麦角硫因合成酶1(NsEgt1)的氨基酸序列发生了三个氨基酸突变,分别为E88G、K239S、V316A,将该麦角硫因合成酶1突变体命名为NsEgt1mut。
实施例3:菌株发酵罐发酵对比
为了验证NsEgt1mut的功能,按照实施例1的方法,全基因合成NsEgt1mut的编码基因核苷酸序列SEQ ID NO:5,以SEQ ID NO:5为模板进行PCR扩增,构建麦角硫因合成酶1突变体和麦角硫因合成酶2共表达质粒pTrc99a-trc-NsEgt1mut-trc-NcEgt2,并构建出工程菌pTrc99a-trc-NsEgt1mut-trc-NcEgt2/Ecoli BW25113-ΔYS,仍命名为BL9-M1278。
分别挑取工程菌pTrc99a-trc-NsEgt1-trc-NcEgt2/Ecoli BW25113-ΔYS和BL9-M1278单克隆,接种至5ml含有100μg/ml Amp抗性的LB培养基中,37℃培养20-24h,然后按照1%v/v的比例转接至含有100μg/ml Amp抗性的LB培养基中,37℃培养至OD600大约1.5左右,然后按照5%v/v的比例转接至转接至2L含有100μg/ml Amp抗性的TB培养基中,37℃,350-400rpm培养至OD600大约3左右,加入终浓度0.2mM IPTG,然后30℃继续培养6-8个小时。培养液5000rpm离心10min,收集菌体,菌体用等体积的转化培养基重悬(转化培养基配方:0.8g/L玉米浆,硫酸铵10g/L,10%葡萄糖,硫酸镁5g/L,磷酸二氢钾2.5g/L,硫酸亚铁0.2g/L、硫酸锰0.05g/L,L-组氨酸5g/L,L-甲硫氨酸5g/L,L-半胱氨酸5g/L,消泡剂0.5g/L,pH7.0;补料:50%葡萄糖、3%L-组氨,3%L-甲硫氨酸,3%L-半胱氨酸),30℃,转速400-600rpm,通气200L/h,氨水控制PH7.0-7.5,葡萄糖维持5-10g/L,氨基酸1-10g/L。发酵72-96h后,取样进行检测麦角硫因和L-组氨酸的含量,结果列于表1中。
表1、两种工程菌发酵生产麦角硫因的对比实验
实验结果显示,相较表达野生酶NsEgt1的工程菌pTrc99a-trc-NsEgt1-trc-NcEgt2/Ecoli BW25113-ΔYS,表达突变酶NsEgt1mut的工程菌BL9-M1278的麦角硫因产量提升了3.1倍,且底物L-组氨酸的转化效率也明显提升,工业化应用潜力巨大。
Claims (10)
1.一种构建产麦角硫因的大肠杆菌的方法,其特征在于,包括下述步骤:
A.以大肠杆菌BW25113、MG1655或W3110为底盘菌,敲除或者弱化L-半胱氨酸降解途径,得到菌株A;
B.使菌株A过表达链孢霉Neurospora sp.来源的麦角硫因合成酶1即NsEgt1或者其突变体以及粗糙链孢霉Neurospora crassa来源的麦角硫因合成酶2即NcEgt2,筛选阳性克隆,得到产麦角硫因的大肠杆菌工程菌。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤A是敲除ygeA基因(GI:446771403)和sseA基因(GI:446030771)。
3.如权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤B是将所述麦角硫因合成酶1即NsEgt1或者其突变体的表达质粒、所述麦角硫因合成酶2即NcEgt2的表达质粒转化入菌株A细胞中。
4.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述麦角硫因合成酶1即NsEgt1的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示;麦角硫因合成酶1突变体的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示;所述麦角硫因合成酶2即NcEgt2的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示。
5.如权利要求1所述的方法,其特征在于,所述麦角硫因合成酶1或其突变体的编码基因和所述麦角硫因合成酶2的编码基因被克隆在同一个质粒上进行共表达。
6.一种麦角硫因合成酶突变体,其特征在于,氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
7.编码如权利要求7所述麦角硫因合成酶突变体的基因。
8.如权利要求6所述的麦角硫因合成酶突变体或者如权利要求7所述的基因在促进微生物生产麦角硫因中的应用;或者如权利要求6所述的麦角硫因合成酶突变体在酶促合成麦角硫因中的应用。
9.一种麦角硫因生产菌,其通过如权利要求1-5中任一项所述的方法构建得到。
10.如权利要求9所述麦角硫因生产菌在发酵法生产麦角硫因中的用途。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310214002.XA CN117511831A (zh) | 2023-03-08 | 2023-03-08 | 产麦角硫因的大肠杆菌的构建方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
CN202310214002.XA CN117511831A (zh) | 2023-03-08 | 2023-03-08 | 产麦角硫因的大肠杆菌的构建方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
CN117511831A true CN117511831A (zh) | 2024-02-06 |
Family
ID=89746302
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
CN202310214002.XA Pending CN117511831A (zh) | 2023-03-08 | 2023-03-08 | 产麦角硫因的大肠杆菌的构建方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
CN (1) | CN117511831A (zh) |
-
2023
- 2023-03-08 CN CN202310214002.XA patent/CN117511831A/zh active Pending
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
CN111712570B (zh) | 一种生产阿洛酮糖及其衍生物的工程菌株及其构建方法和应用 | |
CN111254129B (zh) | 一种多聚磷酸激酶突变体及其应用 | |
CN109055324B (zh) | 一种改进的酮还原酶及其应用 | |
CN109468291B (zh) | 一种羰基还原酶EbSDR8突变体及其构建方法和应用 | |
CN114075524B (zh) | 阿魏酸生产工程菌、其建立方法及其应用 | |
CN111808829A (zh) | 一种γ-谷氨酰甲胺合成酶突变体及其应用 | |
CN109055417B (zh) | 一种重组微生物、其制备方法及其在生产辅酶q10中的应用 | |
CN1191369C (zh) | 一种用代谢工程菌生产腺苷甲硫氨酸的方法 | |
CN116355820A (zh) | 一种高产麦角硫因工程菌株及其生产麦角硫因的方法 | |
CN114908129B (zh) | 用于制备(r)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的脱氢酶 | |
CN117511831A (zh) | 产麦角硫因的大肠杆菌的构建方法 | |
CN109929853B (zh) | 嗜热菌来源的热激蛋白基因的应用 | |
KR102605543B1 (ko) | 메티오닌-생산 효모 | |
CN108913732B (zh) | 一种莫纳可林j异源生产的方法及应用 | |
CN113122563A (zh) | 构建r-3-氨基丁酸生产菌的方法 | |
CN108424859B (zh) | 生产胞磷胆碱的基因工程菌的构建与应用 | |
CN109897872B (zh) | 酶法制备(2s,3s)-n-叔丁氧羰基-3-氨基-1-氯-2-羟基-4-苯基丁烷 | |
US20140308715A1 (en) | Microbial conversion of sugar acids and means therein | |
CN112410353A (zh) | 一种fkbS基因、含其的基因工程菌及其制备方法和用途 | |
CN112877305B (zh) | 对辅酶亲和力提高的葡萄糖脱氢酶突变体 | |
CN114717250B (zh) | 一种基于辅因子代谢工程策略改造蛹虫草菌提高虫草素产量的方法及应用 | |
WO2024140379A1 (zh) | 酶、生产红景天苷的菌株及生产方法 | |
CN117143894A (zh) | 构建高效利用甲酸的大肠杆菌工程菌的方法 | |
CN117987479A (zh) | 醛缩酶催化合成3-羟基-3-甲基丁酸的方法 | |
CN114540397A (zh) | 增强调控蛋白表达以提高谷氨酰胺转氨酶发酵水平的方法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
PB01 | Publication | ||
PB01 | Publication | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
SE01 | Entry into force of request for substantive examination |