CN112877305B - 对辅酶亲和力提高的葡萄糖脱氢酶突变体 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种对辅酶亲和力提高的葡萄糖脱氢酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4或者SEQ ID NO:5，与初始型葡萄糖脱氢酶SEQ ID NO:1相比，提高了对于NAD+和NADP+的亲和力，同时保持了热稳定性，可用于生物催化的不对称还原反应。

Description

对辅酶亲和力提高的葡萄糖脱氢酶突变体
技术领域
本发明属于酶催化技术领域，具体地说，涉及一种对辅酶亲和力提高的葡萄糖脱氢酶突变体。
背景技术
生物不对称还原反应是生物催化法生产手性化合物中常见的生物催化反应，与酶拆分最高50％的收率相比，不对称还原反应最高可以达到100％，所以在催化合成手性醇、羟基酸、氨基酸等手性化合物方面具有广泛应用。
有葡萄糖脱氢酶(Glucose dehydrogenase，GDH)参与的生物不对称还原反应比如羰基还原反应大多都需要辅酶NAD(P)H/NAD(P)+，NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸，辅酶I)和NADP+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸，辅酶II)的作用是，作为氧化剂掠夺电子，葡萄糖脱氢酶催化葡萄糖氧化，同时将NADP+还原为NADPH，产生充足的NADPH作为生物合成的还原剂，从而促进还原反应。
然而商品化的辅酶价格昂贵，因此在生物催化产业中氧化还原体系普遍存在辅酶再生的问题。辅酶的再生可以采用化学、光化学、酶学和电化学等再生系统，其中酶法再生系统由于具有反应速率快、再生体系与合成体系兼容性好、国外大企业已经将该技术广泛应用于工业生产，如巴斯夫、德固赛和钟渊化工等。
在目前工业生产采用的辅酶再生体系中，葡萄糖脱氢酶/葡萄糖体系对NADH/NADPH再生有很好的效果。Vázquez-Figueroa等(Vázquez-Figueroa,E.；Chaparro-Riggers,J.；Bommarius,A.S.(2007).Development of a thermostable glucosedehydrogenase by a structure-guided consensus concept.ChemBioChem,8(18),2295-2301.)对Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168来源的葡萄糖脱氢酶进行了热稳定性改造，得到的Q252L/E170R突变体大大提高了在65℃的半衰期，同时提高了50％的比酶活。我们在专利申请CN201810343484.8中也描述了该葡萄糖脱氢酶突变体GDH/Q252L/E170R的构建方法。但GDH/Q252L/E170R对NAD+的依赖性高于NADP+，而NADP+比NAD+更加昂贵，在一些依赖NADP+的酶促反应中，GDH/Q252L/E170R的催化效率仍不能满足工业化大生产的需求。
发明内容
为克服这一瓶颈，我们继续以葡萄糖脱氢酶GDH/Q252L/E170R作为初始酶(本文中的序列SEQ ID NO:1)进行了研究，通过分子定向进化技术发现了2个新关键位点N46和L19，这两个位点的改造可提高GDH对NAD+/NADP+的亲和力，同时具有较高的热稳定性。这意味着可以在催化反应中添加更少量的辅酶NAD+或NADP+即可实现氧化还原反应的高效运行，进一步降低了生产成本，因此具有极高的工业应用价值。
基于该研究发现，本发明提供如下技术方案：
一种葡萄糖脱氢酶突变体，其氨基酸序列为：
SEQ ID NO:3，其为SEQ ID NO:1第46位的天冬酰胺N替换为色氨酸W的突变体，氨基酸序列为：
MYPDLKGKVVAITGAASGLGKAMAIRFGKEQAKVVINYYSNKQDPWEVKEEVIKAGGEAVVVQGDVTKEEDVKNIVQTAIKEFGTLDIMINNAGLENPVPSHEMPLKDWDKVIGTNLTGAFLGSREAIKYFVENDIKGNVINMSSVHEVIPWPLFVHYAASKGGIKLMTRTLALEYAPKGIRVNNIGPGAINTPINAEKFADPKQKADVESMIPMGYIGEPEEIAAVAAWLASKEASYVTGITLFADGGMTLYPSFQAGRG(SEQ ID NO:3)；
SEQ ID NO:4，其为SEQ ID NO:1第46位的天冬酰胺N替换为亮氨酸L的突变体，氨基酸序列为：
MYPDLKGKVVAITGAASGLGKAMAIRFGKEQAKVVINYYSNKQDPLEVKEEVIKAGGEAVVVQGDVTKEEDVKNIVQTAIKEFGTLDIMINNAGLENPVPSHEMPLKDWDKVIGTNLTGAFLGSREAIKYFVENDIKGNVINMSSVHEVIPWPLFVHYAASKGGIKLMTRTLALEYAPKGIRVNNIGPGAINTPINAEKFADPKQKADVESMIPMGYIGEPEEIAAVAAWLASKEASYVTGITLFADGGMTLYPSFQAGRG(SEQ ID NO:4)；或者
SEQ ID NO:5，其为SEQ ID NO:1第19位的亮氨酸L替换为异亮氨酸I的突变体，氨基酸序列为：
MYPDLKGKVVAITGAASGIGKAMAIRFGKEQAKVVINYYSNKQDPNEVKEEVIKAGGEAVVVQGDVTKEEDVKNIVQTAIKEFGTLDIMINNAGLENPVPSHEMPLKDWDKVIGTNLTGAFLGSREAIKYFVENDIKGNVINMSSVHEVIPWPLFVHYAASKGGIKLMTRTLALEYAPKGIRVNNIGPGAINTPINAEKFADPKQKADVESMIPMGYIGEPEEIAAVAAWLASKEASYVTGITLFADGGMTLYPSFQAGRG(SEQ ID NO:5)。
一种编码上述葡萄糖脱氢酶突变体的基因。
一种包含上述基因的质粒。该质粒是用于表达上述基因的载体，优选载体是pET系列比如pET24a、pET28b，但并不受限于此。
一种转化了上述质粒的微生物，该微生物可作为宿主用于表达上述葡萄糖脱氢酶突变体。
优选地，上述微生物选自枯草芽孢杆菌、短乳杆菌、木兰假丝酵母、毕赤酵母、酿酒酵母、大肠杆菌，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌BL21(DE3)。
上述葡萄糖脱氢酶突变体或者微生物可以应用于生物催化(酶催化或者细胞催化)的不对称还原反应。
作为一种可选的实施方式，上述不对称还原反应可以是葡萄糖脱氢酶参与的羰基还原反应。
在上述不对称还原反应比如羰基还原反应的反应体系中，一般添加有葡萄糖，例如0.1-1M葡萄糖。
相较初始型葡萄糖脱氢酶SEQ ID NO:1，本发明构建的葡萄糖脱氢酶突变体SEQID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5对于NAD+和NADP+的亲和力得到了提高，同时保持了热稳定性，因此可以降低辅酶NAD+或NADP+的添加量，进一步降低了生产成本，具有工业化开发和应用前景。
具体实施方式
本发明构建的葡萄糖脱氢酶突变体SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4和SEQ ID NO:5是之前已报到的葡萄糖脱氢酶GDH/Q252L/E170R的进一步突变体。
为了描述方便起见，本文中将GDH/Q252L/E170R作为初始酶，也已经在专利CN201810343484.8中报道过，氨基酸序列为SEQ ID NO:1：
MYPDLKGKVVAITGAASGLGKAMAIRFGKEQAKVVINYYSNKQDPNEVKEEVIKAGGEAVVVQGDVTKEEDVKNIVQTAIKEFGTLDIMINNAGLENPVPSHEMPLKDWDKVIGTNLTGAFLGSREAIKYFVENDIKGNVINMSSVHEVIPWPLFVHYAASKGGIKLMTRTLALEYAPKGIRVNNIGPGAINTPINAEKFADPKQKADVESMIPMGYIGEPEEIAAVAAWLASKEASYVTGITLFADGGMTLYPSFQAGRG(SEQ ID NO:1)，
其编码基因是SEQ ID NO:2：
atgtatccggatttaaaaggaaaagtcgtcgctattacaggagctgcttcagggctcggaaaggcgatggccattcgcttcggcaaggagcaggcaaaagtggttatcaactattatagtaataaacaagatccgaacgaggtaaaagaagaggtcatcaaggcgggcggtgaagctgttgtcgtccaaggagatgtcacgaaagaggaagatgtaaaaaatatcgtgcaaacggcaattaaggagttcggcacactcgatattatgattaataatgccggtcttgaaaatcctgtgccatctcacgaaatgccgctcaaggattgggataaagtcatcggcacgaacttaacgggtgcctttttaggaagccgtgaagcgattaaatatttcgtagaaaacgatatcaagggaaatgtcattaacatgtccagtgtgcacgaagtgattccttggccgttatttgtccactatgcggcaagtaaaggcgggataaagctgatgacacgaacattagcgttggaatacgcgccgaagggcattcgcgtcaataatattgggccaggtgcgatcaacacgccaatcaatgctgaaaaattcgctgaccctaaacagaaagctgatgtagaaagcatgattccaatgggatatatcggcgaaccggaggagatcgccgcagtagcagcctggcttgcttcgaaggaagccagctacgtcacaggcatcacgttattcgcggacggcggtatgacactatatccttcattccaggcaggccgcggttaa(SEQ ID NO:2)。
为了表明初始酶与突变体的关系，将葡萄糖脱氢酶突变体SEQ ID NO:3表示为GDH/Q252L/E170R/N46W或者/N46W；将葡萄糖脱氢酶突变体SEQ ID NO:4表示为GDH/Q252L/E170R/N46L或者N46L；将葡萄糖脱氢酶突变体SEQ ID NO:5表示为GDH/Q252L/E170R/L19I或者/L19I。
在本发明中，术语“初始(型)酶”、“初始葡萄糖脱氢酶”表示相同的意义，都是指序列为SEQ ID NO:1的GDH/Q252L/E170R。
为表述方便起见，蛋白质的氨基酸缩写既可以使用英文三字母、也可以采用英文单字母，这是本领域技术人员熟知的，这些缩写列于下表中：
表1、氨基酸中英文对照及缩写
Figure BDA0002294809040000041
Figure BDA0002294809040000051
本发明的葡萄糖脱氢酶突变体的氨基酸数量只有261个，且结构明确，因此本领域技术人员很容易获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。
这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。
上述转化体宿主可以使任何适合表达葡萄糖脱氢酶突变体的微生物，包括细菌和真菌。优选微生物是枯草芽孢杆菌、短乳杆菌、木兰假丝酵母、毕赤酵母、酿酒酵母或者大肠杆菌，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌BL21(DE3)。
当作为生物催化剂用于生产时，本发明的葡萄糖脱氢酶突变体可以呈现酶的形式或者菌体的形式。所述酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶、细胞破碎物等；所述菌体的形式包括存活菌体细胞和死亡菌体细胞。
作为另一种可选的实施方式，可以采用表达上述葡萄糖脱氢酶突变体的微生物菌体细胞作为酶催化反应的生物催化剂。菌体的形式包括存活菌体和死亡菌体，当微生物比如大肠杆菌不再进行发酵增殖、而是用于酶催化反应时，本身就是一种天然的固定化酶，而且不需要进行破碎处理、甚至提取纯化处理，就可以作为一种酶制剂用于催化反应。由于反应底物和反应产物都是小分子化合物，可以很方便地穿过菌体的生物屏障--细胞膜，因此不需要对菌体进行破碎处理，这在经济方面是有利的。
以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。
实施例
材料和方法
实施例中的全基因合成、引物合成及测序皆由南京金斯瑞生物科技有限公司完成。
实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。
PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。
LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，pH7.2。(LB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)
TB培养基：24g/L酵母提取物、12g/L胰蛋白胨、16.43g/L K2HPO4.3H2O、2.31g/LKH2PO4、5g/L甘油，pH7.0-7.5。(TB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)
培养基使用前在121℃高温高压灭菌20分钟。
实施例1葡萄糖脱氢酶随机突变体库的构建
1.1参考专利文献CN201810343484.8中公开的方法，以GDH/Q252L/E170R编码基因SEQ ID NO:2为模板，应用易错PCR和大引物PCR技术构建随机突变体库。设计引物(5’-3’)如下：
GDHerr-F：AGCGGCCTGGTGCCGCGCGGCAGCC；
GDHerr-R：GTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCAAGC。
100μL易错PCR反应体系包括：50ng质粒模板，各30pmol一对引物GDHerr-F和GDHerr-R，1X Taq buffer，0.2mM dGTP，0.2mM dATP，1mM dCTP，1mM dTTP，7mM MgCl2，(0.1mM、0.2mM、0.3mM)MnCl2，5个单位的Taq酶(fermentas)。
PCR反应条件为：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃1min；40个循环；72℃10min。胶回收800bp随机突变片段作为大引物，用KOD DNA聚合酶做MegaPrimer PCR：94℃2min，68℃10min；98℃10s，55℃30s，68℃3min；25个循环；68℃10min。DpnI消化质粒模板，电转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，得到超过4000个克隆的随机突变库。
实施例2随机突变体库的高通量筛选
用牙签挑取突变体库中的转化子，接种到每孔含300μL LB培养基(加入100μg/ml卡那霉素和0.1mM IPTG)的96孔深孔培养板中，37℃、220rpm培养6h后降温至30℃，220rpm培养16h。
将96孔板上的菌液振荡混匀，每孔吸取50μl菌液至96孔PCR板上，-70℃冻存30min。取出放入PCR仪中，设置56℃处理2h进行冻融破胞和热处理，完毕后每孔吸取15μl破胞液转移至另一块96孔板中，加入1ml去离子水稀释，吸取15μl稀释后的破胞液转移到96孔酶标板上，每孔加入185μl反应液，37℃反应5min，在酶标仪上读取OD340数据。
为筛选到对NADP+亲和力提高的突变体，在96孔板反应体系中将NADP+降低到0.05g/l。反应液中包含：0.1M Tris-HCl(pH 7.5，37℃)160μl，1M葡萄糖20μl，2g/l NADP+5μl。
经过初筛和复筛确定得到OD340比出发菌(即专利文献CN201810343484.8中公开的菌种BL21(DE3)/pET24a-GDH/Q252L/E170R)更高的突变菌种，表明该突变菌种表达的葡萄糖脱氢酶突变体对于NADP+的亲和力更高，反应酶活性更强。对这些葡萄糖脱氢酶突变体进行测序验证，发现突变体N46W、L19I对NADP+的酶活比初始葡萄糖脱氢酶更高。
为描述方便起见，实施例中将葡萄糖脱氢酶突变体N46W、L19I等的表达菌株也简称为N46W、L19I等。
实施例3 N46定点饱和突变库的构建和筛选
以GDH/Q252L/E170R的编码基因为模板，设计如下引物对N46-F和GDHerr-R：
N46-F：AAACAAGATCCGNNKGAGGTAAAAGAAG，
GDHerr-R：GTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCAAGC。
采用KOD DNA聚合酶进行PCR扩增(94℃2min；98℃10s，55℃30s，68℃30s；30个循环；68℃10min)，得到带有N46突变位点的DNA片段。
胶回收该DNA片段作为大引物做MegaPrimer PCR(94℃2min；98℃10s，55℃30s，68℃3min；25个循环；68℃10min)，DpnI消化质粒模板，电转化到大肠杆菌BL21(DE3)，涂布到含有卡那霉素的LB平板，构建得到GDH/Q252L/E170R/N46的饱和突变体库。
高通量筛选方法同实施例2所述方法。
实施例4 L19定点饱和突变体库的构建和筛选
以GDH/Q252L/E170R的编码基因为模板，设计引物对L19-F和GDHerr-R：
L19-F：GCTGCTTCAGGGNNKGGAAAGGCGATG，
GDHERR-R：GTGGTGCTCGAGTGCGGCCGCAAGC。
采用KOD DNA聚合酶进行PCR扩增(94℃2min；98℃10s，55℃30s，68℃30s；30个循环；68℃10min)，得到带有L19突变位点的DNA片段。
胶回收该DNA片段作为大引物做MegaPrimer PCR(94℃2min；98℃10s，55℃30s，68℃3min；25个循环；68℃10min)，DpnI消化质粒模板，电转化到大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，涂布到含有卡那霉素的LB平板，构建得到GDH/Q252L/E170R/L19的饱和突变体库。
高通量筛选方法同实施例2所述方法。
实施例5突变体菌株摇瓶发酵和酶液制备
5.1摇瓶培养条件：将筛选出的突变体菌株分别接种到含100μg/ml卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、220rpm培养过夜后，按1％v/v接种量接种到新鲜TB培养基中(含100μg/ml卡那霉素)，37℃、220rpm培养至OD600约为5-6，加入终浓度为0.3mM IPTG，28℃、220rpm诱导培养16h。
5.2菌体收集：收集发酵液，置于离心机4000rpm离心30min，弃上清后收集菌泥，放置于-20℃冷冻收藏。
酶液的制备：称取1g菌泥，加入9倍体积去离子水重悬浮后，通过超声波进行细胞破碎，破胞液经过12000rpm离心10min后取上清，即为酶液，放置于冰浴中待用。
热处理：在离心管中加入1mL 100g/L酶液和1mL去离子水混匀，60℃水浴中放置2h后备用。
GDH酶活测定方法可参考文献Fujita Y,Ramaley R,Freese E.Location andproperties of glucose dehydrogenase in sporulating cells and spores ofBacillus subtilis.J.Bacteriol,1977,132:282-293.。
GDH是辅酶NAD(P)H依赖型酶，酶活的测定通过测定340nm处吸光值改变确定辅酶NAD(P)H的改变来反映酶活。GDH酶活测定条件为：总反应体系4ml，分别加入3350μl 0.1MTris-HCl(pH 7.5,37℃)，0.1M葡萄糖，0.75g/l NAD(P)+，37℃保温2min，加入100μl 100g/l酶液后开始监测340nm处吸光值的变化。酶活力定义为：在上述条件下，每分钟催化生成1μmol产物为1个酶活单位U。酶活计算公式为：酶活/菌体量(U/g)＝[ΔA/min]×[1/ε]×[1/d]×[Vt/Vs]×10。ΔA/min表示每分钟吸光度的变化值，Vt表示反应液总体积，Vs表示样品体积，d表示比色杯光径(1cm)，ε表示摩尔消光系数。
实施例6高亲和力突变体筛选
含NADP+反应液：0.1M Tris-HCl(pH 7.5，37℃)3350μl，1M葡萄糖400μl，20g/lNADP+150μl。
含NAD+反应液：0.1M Tris-HCl(pH 7.5，37℃)3350μl，1M葡萄糖400μl，20g/l NAD+150μl。
按实施例5中所述方法，分别以NAD+和NADP+为辅酶检测各个GDH突变体酶活，结果参见表2。
表2、各个GDH突变体结合NAD+和NADP+的酶活比较
突变体 酶活(U/g),NAD+ 酶活(U/g),NADP+
N46W 123360 112000
N46V 96680 98920
N46L 138040 130600
L19I 141000 171000
GDH/Q252L/E170R(对照) 98600 86760
从表2中可以看出，与初始酶GDH/Q252L/E170R相比，突变体N46W、N46L、L19I对NAD+和NADP+的酶活都有一定程度提高，说明这三个突变体对辅酶的亲和力提高；L19I对NADP+的酶活高于对NAD+，对辅酶的倾向性有所改变，提示可以优先选择NADP+作为辅酶。
实施例7酶的热稳定性测试
将50g/l破胞液在60℃水浴中放置2h后，测定初始型GDH及突变体的酶活，考察它们的热稳定性。结果参见表3。
表3、各个突变体的热稳定性考察
Figure BDA0002294809040000091
表3显示，经60℃处理2h后，突变体N46W、N46L、L19I的酶活均比对照有所下降，但酶活力仍然较高，说明突变体体N46W、N46L、L19I在提高了对辅酶的亲和力后仍具有较好的热稳定性。
综上所述，相比初始型葡萄糖脱氢酶SEQ ID NO:1，本发明的葡萄糖脱氢酶突变体SEQ ID NO:3-5对于NAD+和NADP+的亲和力得到了提高，同时保持了热稳定性，有利于降低生物催化不对称还原反应的生产成本。
序列表
<110> 湖州颐辉生物科技有限公司
<120> 对辅酶亲和力提高的葡萄糖脱氢酶突变体
<130> SHPI1910736
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 1
Met Tyr Pro Asp Leu Lys Gly Lys Val Val Ala Ile Thr Gly Ala Ala
1 5 10 15
Ser Gly Leu Gly Lys Ala Met Ala Ile Arg Phe Gly Lys Glu Gln Ala
20 25 30
Lys Val Val Ile Asn Tyr Tyr Ser Asn Lys Gln Asp Pro Asn Glu Val
35 40 45
Lys Glu Glu Val Ile Lys Ala Gly Gly Glu Ala Val Val Val Gln Gly
50 55 60
Asp Val Thr Lys Glu Glu Asp Val Lys Asn Ile Val Gln Thr Ala Ile
65 70 75 80
Lys Glu Phe Gly Thr Leu Asp Ile Met Ile Asn Asn Ala Gly Leu Glu
85 90 95
Asn Pro Val Pro Ser His Glu Met Pro Leu Lys Asp Trp Asp Lys Val
100 105 110
Ile Gly Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg Glu Ala Ile
115 120 125
Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp Ile Lys Gly Asn Val Ile Asn Met Ser
130 135 140
Ser Val His Glu Val Ile Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr Ala Ala
145 150 155 160
Ser Lys Gly Gly Ile Lys Leu Met Thr Arg Thr Leu Ala Leu Glu Tyr
165 170 175
Ala Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly Ala Ile Asn
180 185 190
Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Lys Gln Lys Ala Asp
195 200 205
Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Glu Pro Glu Glu Ile
210 215 220
Ala Ala Val Ala Ala Trp Leu Ala Ser Lys Glu Ala Ser Tyr Val Thr
225 230 235 240
Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Leu Tyr Pro Ser Phe
245 250 255
Gln Ala Gly Arg Gly
260
<210> 2
<211> 786
<212> DNA
<213> 人工序列()
<400> 2
atgtatccgg atttaaaagg aaaagtcgtc gctattacag gagctgcttc agggctcgga 60
aaggcgatgg ccattcgctt cggcaaggag caggcaaaag tggttatcaa ctattatagt 120
aataaacaag atccgaacga ggtaaaagaa gaggtcatca aggcgggcgg tgaagctgtt 180
gtcgtccaag gagatgtcac gaaagaggaa gatgtaaaaa atatcgtgca aacggcaatt 240
aaggagttcg gcacactcga tattatgatt aataatgccg gtcttgaaaa tcctgtgcca 300
tctcacgaaa tgccgctcaa ggattgggat aaagtcatcg gcacgaactt aacgggtgcc 360
tttttaggaa gccgtgaagc gattaaatat ttcgtagaaa acgatatcaa gggaaatgtc 420
attaacatgt ccagtgtgca cgaagtgatt ccttggccgt tatttgtcca ctatgcggca 480
agtaaaggcg ggataaagct gatgacacga acattagcgt tggaatacgc gccgaagggc 540
attcgcgtca ataatattgg gccaggtgcg atcaacacgc caatcaatgc tgaaaaattc 600
gctgacccta aacagaaagc tgatgtagaa agcatgattc caatgggata tatcggcgaa 660
ccggaggaga tcgccgcagt agcagcctgg cttgcttcga aggaagccag ctacgtcaca 720
ggcatcacgt tattcgcgga cggcggtatg acactatatc cttcattcca ggcaggccgc 780
ggttaa 786
<210> 3
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 3
Met Tyr Pro Asp Leu Lys Gly Lys Val Val Ala Ile Thr Gly Ala Ala
1 5 10 15
Ser Gly Leu Gly Lys Ala Met Ala Ile Arg Phe Gly Lys Glu Gln Ala
20 25 30
Lys Val Val Ile Asn Tyr Tyr Ser Asn Lys Gln Asp Pro Trp Glu Val
35 40 45
Lys Glu Glu Val Ile Lys Ala Gly Gly Glu Ala Val Val Val Gln Gly
50 55 60
Asp Val Thr Lys Glu Glu Asp Val Lys Asn Ile Val Gln Thr Ala Ile
65 70 75 80
Lys Glu Phe Gly Thr Leu Asp Ile Met Ile Asn Asn Ala Gly Leu Glu
85 90 95
Asn Pro Val Pro Ser His Glu Met Pro Leu Lys Asp Trp Asp Lys Val
100 105 110
Ile Gly Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg Glu Ala Ile
115 120 125
Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp Ile Lys Gly Asn Val Ile Asn Met Ser
130 135 140
Ser Val His Glu Val Ile Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr Ala Ala
145 150 155 160
Ser Lys Gly Gly Ile Lys Leu Met Thr Arg Thr Leu Ala Leu Glu Tyr
165 170 175
Ala Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly Ala Ile Asn
180 185 190
Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Lys Gln Lys Ala Asp
195 200 205
Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Glu Pro Glu Glu Ile
210 215 220
Ala Ala Val Ala Ala Trp Leu Ala Ser Lys Glu Ala Ser Tyr Val Thr
225 230 235 240
Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Leu Tyr Pro Ser Phe
245 250 255
Gln Ala Gly Arg Gly
260
<210> 4
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 4
Met Tyr Pro Asp Leu Lys Gly Lys Val Val Ala Ile Thr Gly Ala Ala
1 5 10 15
Ser Gly Leu Gly Lys Ala Met Ala Ile Arg Phe Gly Lys Glu Gln Ala
20 25 30
Lys Val Val Ile Asn Tyr Tyr Ser Asn Lys Gln Asp Pro Leu Glu Val
35 40 45
Lys Glu Glu Val Ile Lys Ala Gly Gly Glu Ala Val Val Val Gln Gly
50 55 60
Asp Val Thr Lys Glu Glu Asp Val Lys Asn Ile Val Gln Thr Ala Ile
65 70 75 80
Lys Glu Phe Gly Thr Leu Asp Ile Met Ile Asn Asn Ala Gly Leu Glu
85 90 95
Asn Pro Val Pro Ser His Glu Met Pro Leu Lys Asp Trp Asp Lys Val
100 105 110
Ile Gly Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg Glu Ala Ile
115 120 125
Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp Ile Lys Gly Asn Val Ile Asn Met Ser
130 135 140
Ser Val His Glu Val Ile Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr Ala Ala
145 150 155 160
Ser Lys Gly Gly Ile Lys Leu Met Thr Arg Thr Leu Ala Leu Glu Tyr
165 170 175
Ala Pro Lys Gly Ile Arg Val Asn Asn Ile Gly Pro Gly Ala Ile Asn
180 185 190
Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Lys Gln Lys Ala Asp
195 200 205
Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Glu Pro Glu Glu Ile
210 215 220
Ala Ala Val Ala Ala Trp Leu Ala Ser Lys Glu Ala Ser Tyr Val Thr
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Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Leu Tyr Pro Ser Phe
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260
<210> 5
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列()
<400> 5
Met Tyr Pro Asp Leu Lys Gly Lys Val Val Ala Ile Thr Gly Ala Ala
1 5 10 15
Ser Gly Ile Gly Lys Ala Met Ala Ile Arg Phe Gly Lys Glu Gln Ala
20 25 30
Lys Val Val Ile Asn Tyr Tyr Ser Asn Lys Gln Asp Pro Asn Glu Val
35 40 45
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50 55 60
Asp Val Thr Lys Glu Glu Asp Val Lys Asn Ile Val Gln Thr Ala Ile
65 70 75 80
Lys Glu Phe Gly Thr Leu Asp Ile Met Ile Asn Asn Ala Gly Leu Glu
85 90 95
Asn Pro Val Pro Ser His Glu Met Pro Leu Lys Asp Trp Asp Lys Val
100 105 110
Ile Gly Thr Asn Leu Thr Gly Ala Phe Leu Gly Ser Arg Glu Ala Ile
115 120 125
Lys Tyr Phe Val Glu Asn Asp Ile Lys Gly Asn Val Ile Asn Met Ser
130 135 140
Ser Val His Glu Val Ile Pro Trp Pro Leu Phe Val His Tyr Ala Ala
145 150 155 160
Ser Lys Gly Gly Ile Lys Leu Met Thr Arg Thr Leu Ala Leu Glu Tyr
165 170 175
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180 185 190
Thr Pro Ile Asn Ala Glu Lys Phe Ala Asp Pro Lys Gln Lys Ala Asp
195 200 205
Val Glu Ser Met Ile Pro Met Gly Tyr Ile Gly Glu Pro Glu Glu Ile
210 215 220
Ala Ala Val Ala Ala Trp Leu Ala Ser Lys Glu Ala Ser Tyr Val Thr
225 230 235 240
Gly Ile Thr Leu Phe Ala Asp Gly Gly Met Thr Leu Tyr Pro Ser Phe
245 250 255
Gln Ala Gly Arg Gly
260

Claims (10)

1.一种对辅酶亲和力提高的葡萄糖脱氢酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3、SEQID NO:4或者SEQ ID NO:5。
2.编码如权利要求1所述葡萄糖脱氢酶突变体的基因。
3.包含如权利要求2所述基因的质粒。
4.如权利要求3所述的质粒，其特征在于，是pET质粒。
5.转化了如权利要求3所述质粒的微生物。
6.如权利要求5所述的微生物，其特征在于，所述微生物选自枯草芽孢杆菌、短乳杆菌、木兰假丝酵母、毕赤酵母、酿酒酵母、大肠杆菌。
7.如权利要求6所述的微生物，其特征在于，所述微生物是大肠杆菌BL21(DE3)。
8.如权利要求1所述葡萄糖脱氢酶突变体在生物催化的不对称还原反应中的用途。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述不对称还原反应是葡萄糖脱氢酶参与的羰基还原反应。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，反应体系中添加有葡萄糖。
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