JP5949757B2 - 改変型グルコースデヒドロゲナーゼ - Google Patents

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Description

本発明は、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼ［ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨ］の特定のアミノ酸を他のアミノ酸に変更することにより、熱安定性および／または有機溶媒耐性を向上させた改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨ、該酵素のアミノ酸配列をコードする遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該ベクターにより得られる形質転換体、該形質転換体を用いる改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨの製造方法に関する。
特定の基質に対して特異的に反応する酵素を用いた臨床検査薬は様々な体内分子の測定に利用されており、その代表的なものの一つとして、グルコース測定検査薬が挙げられる。
グルコース測定検査薬は、グルコース定量用酵素、例えばグルコースデヒドロゲナーゼ（ＧＤＨ）がグルコースの脱水素反応を触媒する性質を利用しており、これにより分析試料中のグルコース濃度を定量することができる。
ＧＤＨとしては、例えばバチルス・メガテリウム（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｍｅｇａｔｅｒｉｕｍ）由来ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨも利用することができるが、過剰の無機塩が存在しない場合は極めて熱安定性が低いといった課題がある。
そのため、バチルス・メガテリウム由来ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨにおける特定のアミノ酸を他のアミノ酸に置換した変異体を作製することにより、無機塩非存在下における熱安定性、ｐＨ安定性または比活性を向上させる試みがなされている（例えば、特許文献１〜３および非特許文献１〜２）。
特許文献３には、バチルス・メガテリウム由来ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨの１７０番目のグルタミン酸をリジンに、２５２番目のグルタミンをロイシンに置換した変異体は、無機塩の非存在下において６６℃、８時間の処理でも約６０％の相対活性を保持していることが記載されている。
上記のバチルス・メガテリウムと同じバチルス属に分類される、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨは酵素が単離されて遺伝子も既に特定されており（例えば、非特許文献３〜４）、該酵素もグルコース測定検査薬用途に利用することができる。
前記バチルス・サブチリス由来ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨは、バチルス・メガテリウム由来ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨと８５％程度の相同性を示し（例えば非特許文献５）、高濃度の塩化ナトリウム存在下で９００Ｕ／ｍｇ以上の高い比活性を示す酵素である。
しかしながら、バチルス・メガテリウム由来ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨと同様に無機塩非存在下における熱安定性などは十分でなかった。そのため、バチルス・サブチリス由来ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨについても、特定のアミノ酸を他のアミノ酸に置換した変異体を作製することにより、無機塩非存在下における熱安定性、ｐＨ安定性または比活性を向上させる試みがなされている。
一方、最近のＧＤＨの新しい用途として、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生産が挙げられる。ＮＡＤ（Ｐ）Ｈを消費してＮＡＤ（Ｐ）が複生するような反応系にグルコースを触媒するＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨの反応を共役させると、高価なＮＡＤ（Ｐ）Ｈを再生産できる場合があるが、この際にもＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨの熱安定性などが課題になっていた。
特許文献４には、ＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生産の用途において、バチルス・サブチリス由来ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨの１６５番目のイソロイシン、１９４番目のプロリンおよび２０４番目のリジンのうち、少なくとも１アミノ酸を別のアミノ酸に置換し、更に他のアミノ酸にも置換を施した変異体は、野生型酵素に比べて比活性が数倍向上し、５０℃で２０分間の熱処理で残存活性が８０％以上となることが記載されている。
非特許文献６には、同じくＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生産の用途において、バチルス・サブチリス由来ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨの４５番目のプロリンをアラニンに、１５５番目のフェニルアラニンをチロシンに、１７０番目のグルタミン酸をアルギニンに、２２７番目のバリンをアラニンに、２５２番目のグルタミンをロイシンに置換した変異体およびその他の変異体は、０．３Ｍの塩化ナトリウムの共存下、６５℃においてほとんど失活が観察されない熱安定性を有することと、１００〜１５０Ｕ／ｍｇの比活性を有することが記載されている。
非特許文献７には、同じくＮＡＤ（Ｐ）Ｈの再生産の用途において、バチルス・サブチリス由来ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨの４５番目のプロリンをアラニンに、４６番目のアスパラギンをグルタミン酸に、１５５番目のフェニルアラニンをチロシンに、１７０番目のグルタミン酸をリジンに、２２７番目のバリンをアラニンに、２３０番目のトリプトファンをフェニルアラニンに、２５２番目のグルタミンをロイシンに置換した変異体は、６５℃においてほとんど失活が観察されない熱安定性を有することと、野生型酵素に比べてアセトンなどの有機溶媒に対する耐性が向上することが記載されている。
さらに、ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨの別の新しい用途として、バイオ燃料電池が挙げられる。負極又は正極の少なくとも一方の電極上に触媒として酸化還元酵素を固定したバイオ燃料電池は、例えばグルコースのように通常の工業触媒では利用できない燃料から効率よく電子を取り出すことができるため、次世代の燃料電池として注目されている。例えば特許文献５または特許文献６に記載されるように、陰極において、グルコースからはじめに電子を引き抜く重要な酵素としてＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨが利用されている。
日本国特開平２−８６７７９号公報 日本国特開平４−２５８２９３号公報 日本国特開２００３−３１０２７４号公報 米国特許第７，８１６，１１１号明細書 日本国特開２００４−０７１５５９号公報 日本国特開２０１０−２１９０２１号公報
Y.Makino et al. Stability-increasing Mutants of Glucose Dehydrogenase from Bacillus megaterium IWG3. J Biol Chem.1989.264(11).p6381-6385. S.H.Baik et al. Significantly enhanced stability of Glucose Dehydrogenase by directed evolution. Appl Microbiol Biotechnol.2003.61.p329-335. Ramaley et al. Glycerol protection and purification of Bacillus subtilis glucose dehydrogenase.J Biol Chem.1983.258(20).p12558-12565. Lampel et al. Characterization of the developmentally regulated Bacillus subtilis glucose dehydrogenase gene. J Bacteriol. 1986.166(1).p238-243. Fortnagel et al. Sequence homologies of glucose-dehydrogenases of Bacillus megaterium and Bacillus subtilis. J Theor Biol.1986.120(4).p489-497. Eduardo et al. Development of a Thermostable Glucose Dehydrogenase by a Structure-Guided Consensus Concept. ChemBioChem.2007.8.p2295-2301. Eduardo et al. Thermostable variants constructed via the structure-guided consensus method also show increased stability in salts solutions and homogeneous aqueous-organic media. Protein Engineering,Design&Selection.2008.21(11)p673-680.
上記したように、従来はグルコース測定検査薬用途のような比較的温和な条件で利用されてきたＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨであるが、近年では熱および溶媒などの条件がより厳しい工業用途での利用が図られてきており、塩化ナトリウムのような無機塩の存在に制限されず、幅広い温度域で安定して利用できる改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨが望まれている。
しかしながら、上記のように様々なＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨの変異体が作出されてきているものの、これらの変異体酵素が無機塩非存在下で、７０℃を超える過酷な環境においても安定に機能し、熱および溶媒などの条件がより厳しい工業用途に用いることができるかは不明であった。したがって、ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨを無機塩非存在下で幅広い熱環境下で機能させるには、更なる熱安定化などの機能改変が必要であった。
さらに、本発明者らは、実施例においても後述するように、特許文献３、非特許文献６、非特許文献７に記載されている通り、バチルス・メガテリウム由来ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨまたはバチルス・サブチリス由来ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨの無機塩存在下、非存在下における熱安定性を向上させることが示されている公知の変異である１７０番目のグルタミン酸をリジンに置換するアミノ酸置換および２５２番目のグルタミンをロイシンに置換するアミノ酸置換を導入した変異体は、無機塩非存在下で、７０℃の熱処理後における残存活性が非常に低く、８０℃の熱処理後においては完全に失活することから、熱および溶媒などの条件がより厳しい工業用途には適していないことを見出した。
したがって、本発明は、無機塩非存在下においても、幅広い温度域で安定して機能し、熱および／または溶媒などの条件がより厳しい工業用途に用いることのできるＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨを提供することを目的とする。
より具体的には、工業用途での広範な利用にも耐えうるよう、無機塩非存在下において、ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨの高い比活性を維持したまま、７０℃以上の熱処理後も安定して機能し、アセトンのような有機溶媒に対する耐性も持ち合わせる改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨを遺伝子工学的手法等により提供することを目的とする。
また、該改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨの大量生産に必要な遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該ベクターにより得られる形質転換体、該形質転換体を用いる改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨの製造方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、上記課題を解決すべく鋭意研究を重ねた結果、バチルス・サブチリス由来ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨの特定のアミノ酸を他のアミノ酸に変更することにより、塩化ナトリウム非存在下において、熱安定性および／または有機溶媒耐性を従来の変異体酵素に比べて向上させた改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨを生産できることを見出し、本発明に達した。
すなわち、本発明の要旨は以下である。
１．以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を含む、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼ[ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨ]活性を有するタンパク質。
（ａ）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列において、以下の（１）〜（１０）からなる群より選択される少なくとも１のアミノ酸置換がなされたアミノ酸配列
（１）Ａ１５９Ｃ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｑ２５２Ｌ
（２）Ａ１５９Ｃ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ａ２４６Ｖ＋Ｑ２５２Ｌ
（３）Ａ１５９Ｃ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｙ２１７Ｒ＋Ｉ２１８Ｌ＋Ｑ２５２Ｌ
（４）Ｑ３１Ｇ＋Ａ１５９Ｃ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｙ２１７Ｒ＋Ｉ２１８Ｌ＋Ｑ２５２Ｌ
（５）Ｇ６４Ａ＋Ａ１５９Ｃ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｙ２１７Ｒ＋Ｉ２１８Ｌ＋Ｑ２５２Ｌ
（６）Ｋ１１１Ｒ＋Ａ１５９Ｃ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｙ２１７Ｒ＋Ｉ２１８Ｌ＋Ｑ２５２Ｌ
（７）Ａ１５９Ｃ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｋ１７９Ｙ＋Ｙ２１７Ｒ＋Ｉ２１８Ｌ＋Ｑ２５２Ｌ
（８）Ａ１５９Ｃ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｙ２１７Ｒ＋Ｉ２１８Ｌ＋Ａ２４６Ｖ＋Ｑ２５２Ｌ
（９）Ｇ６４Ａ＋Ｋ１１１Ｒ＋Ａ１５９Ｃ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｙ２１７Ｒ＋Ｉ２１８Ｌ＋Ｑ２５２Ｌ
（１０）Ｑ３１Ｇ＋Ｇ６４Ａ＋Ａ１５９Ｃ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｙ２１７Ｒ＋Ｉ２１８Ｌ＋Ｑ２５２Ｌ
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列において、前記１７０番目、２５２番目、３１番目、６４番目、１１１番目、１５９番目、１７９番目、２１７番目、２１８番目および２４６番目のアミノ酸以外の位置で、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列
２．前記（ａ）のアミノ酸配列が、配列表の配列番号３、１３、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９および４１のいずれか１で示されるアミノ酸配列である前項１に記載のタンパク質。
３．前項１または２に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
４．ＤＮＡの塩基配列におけるコドン利用頻度を大腸菌のコドン利用頻度に最適化した前項３に記載のＤＮＡ。
５．前項３または前項４に記載のＤＮＡを含む、組換えベクター。
６．前項５に記載の組換えベクターにより得られる形質転換体。
７．宿主が大腸菌である前項６に記載の形質転換体。
８．前項６または前項７に記載の形質転換体を培養することによりＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨを生成させ、該ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨを採取することを含む、改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨの製造方法。
９．前項１または２に記載のタンパク質を含むグルコース測定検査薬。
１０．前項１または２に記載のタンパク質を含むグルコースセンサ。
１１．前項１または２に記載のタンパク質を用いるグルコース濃度の測定方法。
本発明の改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨは、バチルス・サブチリス由来ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨの１７０番目のグルタミン酸および２５２番目のグルタミンを他のアミノ酸に置換するアミノ酸置換に加えて、さらに特定のアミノ酸置換がなされたアミノ酸配列を含むことにより、無機塩の非存在下において、ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨの高い比活性を維持したまま、幅広い温度域で安定して機能し、従来のＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨに比べて、顕著に高い熱安定性および／または有機溶媒耐性を示す。
図１は、ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨを含むマルチプルアライメント図を二分割した図のうち、Ｎ末端側の図である。 図２は、ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨを含むマルチプルアライメント図を二分割した図のうち、Ｃ末端側の図である。 図３は、作成した４種類の分子系統樹のうちの１つの図である。 図４は、作成した４種類の分子系統樹のうちの１つの図である。 図５は、作成した４種類の分子系統樹のうちの１つの図である。 図６は、作成した４種類の分子系統樹のうちの１つの図である。 図７は、推定祖先型アミノ酸配列とＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨを含むマルチプルアライメント図を三分割した図のうち、Ｎ末端側の図である。 図８は、推定祖先型アミノ酸配列とＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨを含むマルチプルアライメント図を三分割した図のうち、Ｎ末端およびＣ末端の間の中央部分の図である。 図９は、推定祖先型アミノ酸配列とＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨを含むマルチプルアライメント図を三分割した図のうち、Ｃ末端側の図である。
以下、本発明を詳細に説明する。
配列表を除いた本明細書におけるアミノ配列中の２０種類のアミノ酸残基は、一文字略記で表現している。すなわち、グリシン（Ｇｌｙ）はＧ、アラニン（Ａｌａ）はＡ、バリン（Ｖａｌ）はＶ、ロイシン（Ｌｅｕ）はＬ、イソロイシン（Ｉｌｅ）はＩ、フェニルアラニン（Ｐｈｅ）はＦ、チロシン（Ｔｙｒ）はＹ、トリプトファン（Ｔｒｐ）はＷ、セリン（Ｓｅｒ）はＳ、スレオニン（Ｔｈｒ）はＴ、システイン（Ｃｙｓ）はＣ、メチオニン（Ｍｅｔ）はＭ、アスパラギン酸（Ａｓｐ）はＤ、グルタミン酸（Ｇｌｕ）はＥ、アスパラギン（Ａｓｎ）はＮ、グルタミン（Ｇｌｎ）はＱ、リジン（Ｌｙｓ）はＫ、アルギニン（Ａｒｇ）はＲ、ヒスチジン（Ｈｉｓ）はＨ、プロリン（Ｐｒｏ）はＰである。
本明細書における「Ａ１５９Ｃ」等の表現は、アミノ酸置換の表記法である。例えば「Ａ１５９Ｃ」とは、ある特定のアミノ酸配列におけるＮ末端側から１５９番目のアミノ酸Ａを、アミノ酸Ｃに置換することを意味する。
また、本明細書における「Ｙ２１７Ｒ＋Ｉ２１８Ｌ」等の表現は、Ｙ２１７ＲおよびＩ２１８Ｌのアミノ酸置換をアミノ酸配列に同時に導入していることを意味する。
本発明の改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨは、以下の（ａ）のアミノ酸配列を含む、ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨ活性を有するタンパク質である。該タンパク質は、無機塩の非存在下において７０℃以上で熱安定性である。
（ａ）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１７０番目のグルタミン酸および２５２番目のグルタミンが他のアミノ酸に置換され、さらに３１番目のグルタミン、６４番目のグリシン、１１１番目のリジン、１５９番目のアラニン、１７９番目のリジン、２１７番目のチロシン、２１８番目のイソロイシンおよび２４６番目のアラニンからなる群より選択される少なくとも１以上のアミノ酸が他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列。
前記他のアミノ酸としては、例えば、各アミノ酸を下記のアミノ酸に置換することが好ましい。
（ｉ）１７０番目のグルタミン酸：リジン、アルギニンまたはイソロイシンへの置換が好ましく、リジンへの置換がより好ましい。
（ｉｉ）２５２番目のグルタミン：ロイシンへの置換が好ましい。
（ｉｉｉ）３１番目のグルタミン：グリシンまたはアラニンへの置換が好ましく、グリシンへの置換がより好ましい。グリシンは、３１番目のグルタミンの後述する祖先型アミノ酸である。
（ｉｖ）６４番目のグリシン：アラニン、メチオニン、ロイシンまたはシステインへの置換が好ましく、アラニンへの置換がより好ましい。アラニンは、６４番目のグリシンの後述する祖先型アミノ酸である。
（ｖ）１１１番目のリジン：アルギニン、ロイシン、グリシンまたはグルタミン酸への置換が好ましく、アルギニンへの置換がより好ましい。アルギニンは、１１１番目のリジンの後述する祖先型アミノ酸である。
（ｖｉ）１５９番目のアラニン：システイン、グリシン、スレオニンまたはセリンへの置換が好ましく、システインへの置換がより好ましい。システインは、１５９番目のアラニンの後述する祖先型アミノ酸である。
（ｖｉｉ）１７９番目のリジン：チロシン、アルギニン、ヒスチジン、ロイシン、グルタミン、アスパラギン酸またはアラニンへの置換が好ましく、チロシンへの置換がより好ましい。チロシンは、１７９番目のリジンの後述する祖先型アミノ酸である。
（ｖｉｉｉ）２１７番目のチロシン：アルギニン、リシンまたはヒスチジンへの置換が好ましく、アルギニンへの置換がより好ましい。アルギニンは２１７番目のチロシンの後述する祖先型アミノ酸である。
（ｉｘ）２１８番目のイソロイシン：ロイシン、トリプトファン、チロシン、メチオニン、プロリンまたはメチオニンへの置換が好ましく、ロイシンへの置換がより好ましい。ロイシンは、２１８番目のイソロイシンの後述する祖先型アミノ酸である。
（ｘ）２４６番目のアラニン：バリンまたはイソロイシンへの置換が好ましく、バリンへの置換がより好ましい。バリンは、２４６番目のアラニンの後述する祖先型アミノ酸である。
下記（１）１７０番目のグルタミン酸および２５２番目のグルタミンを他のアミノ酸に置換するアミノ酸置換に加えて、さらに下記（２）〜（９）からなる群より選択される少なくとも１以上のアミノ酸置換がなされたアミノ酸配列を含む改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨは、無機塩の非存在下において、ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨの高い比活性を維持したまま、幅広い温度域で安定して機能し、従来のＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨに比べて、顕著に高い熱安定性および／または有機溶媒耐性を示す。
前記（ａ）のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列において、以下の（１）のアミノ酸置換がなされ、且つ、（２）〜（９）からなる群より選択される少なくとも１のアミノ酸置換がなされたアミノ酸配列であることが好ましい。
（１）Ｅ１７０Ｋ＋Ｑ２５２Ｌ
（２）Ｑ３１Ｇ
（３）Ｇ６４Ａ
（４）Ｋ１１１Ｒ
（５）Ａ１５９Ｃ
（６）Ｋ１７９Ｙ
（７）Ｙ２１７Ｒ
（８）Ｉ２１８Ｌ
（９）Ａ２４６Ｖ
配列番号１に示されるアミノ酸配列において（１）Ｅ１７０Ｋ＋Ｑ２５２Ｌのアミノ酸置換をするだけでは、得られる変異体は無機塩非存在下において７０℃以上における熱処理後の残存活性が非常に低く、８０℃以上の熱処理では失活するため、幅広い温度域で安定して機能することができない。
しかしながら、配列番号１に示されるアミノ酸配列において（１）Ｅ１７０Ｋ＋Ｑ２５２Ｌのアミノ酸置換に加えて、さらに前記（２）〜（９）からなる群より選択される少なくとも１のアミノ酸置換がなされることにより、得られる改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨは、無機塩非存在下において、ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨの高い比活性を維持したまま、７０℃以上の熱処理後も安定して機能し、および／またはアセトンのような有機溶媒に対する耐性も持ち合わせることができる。
なお、無機塩非存在下における有機溶媒に対する耐性を向上させるためには、配列番号１に示されるアミノ酸配列において（１）Ｅ１７０Ｋ＋Ｑ２５２Ｌのアミノ酸置換に加えて、さらに前記（５）、（７）および（８）からなる群より選択される少なくとも１以上のアミノ酸置換がなされることが特に好ましい。
前記（ａ）のアミノ酸配列は、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列において、（１）Ｅ１７０Ｋ＋Ｑ２５２Ｌ＋（５）Ａ１５９Ｃのアミノ酸置換、（１）Ｅ１７０Ｋ＋Ｑ２５２Ｌ＋（５）Ａ１５９Ｃ＋（２）Ｑ３１Ｇのアミノ酸置換、（１）Ｅ１７０Ｋ＋Ｑ２５２Ｌ＋（５）Ａ１５９Ｃ＋（３）Ｇ６４Ａのアミノ酸置換、（１）Ｅ１７０Ｋ＋Ｑ２５２Ｌ＋（５）Ａ１５９Ｃ＋（４）Ｋ１１１Ｒのアミノ酸置換、（１）Ｅ１７０Ｋ＋Ｑ２５２Ｌ＋（５）Ａ１５９Ｃ＋（６）Ｋ１７９Ｙのアミノ酸置換、（１）Ｅ１７０Ｋ＋Ｑ２５２Ｌ＋（５）Ａ１５９Ｃ＋（９）Ａ２４６Ｖのアミノ酸置換または（１）Ｅ１７０Ｋ＋Ｑ２５２Ｌ＋（７）Ｙ２１７Ｒ＋（８）Ｉ２１８Ｌのアミノ酸置換、（１）Ｅ１７０Ｋ＋Ｑ２５２Ｌ＋（７）Ｙ２１７Ｒ＋（８）Ｉ２１８Ｌ＋（２）Ｑ３１Ｇのアミノ酸置換、（１）Ｅ１７０Ｋ＋Ｑ２５２Ｌ＋（７）Ｙ２１７Ｒ＋（８）Ｉ２１８Ｌ＋（３）Ｇ６４Ａのアミノ酸置換、（１）Ｅ１７０Ｋ＋Ｑ２５２Ｌ＋（７）Ｙ２１７Ｒ＋（８）Ｉ２１８Ｌ＋（４）Ｋ１１１Ｒのアミノ酸置換、（１）Ｅ１７０Ｋ＋Ｑ２５２Ｌ＋（７）Ｙ２１７Ｒ＋（８）Ｉ２１８Ｌ＋（６）Ｋ１７９Ｙのアミノ酸置換または（１）Ｅ１７０Ｋ＋Ｑ２５２Ｌ＋（７）Ｙ２１７Ｒ＋（８）Ｉ２１８Ｌ＋（９）Ａ２４６Ｖのアミノ酸置換が導入されたアミノ酸配列であることがより好ましく、（１）Ｅ１７０Ｋ＋Ｑ２５２Ｌ＋（５）Ａ１５９Ｃ＋（７）Ｙ２１７Ｒ＋（８）Ｉ２１８Ｌのアミノ酸置換、（１）Ｅ１７０Ｋ＋Ｑ２５２Ｌ＋（５）Ａ１５９Ｃ＋（７）Ｙ２１７Ｒ＋（８）Ｉ２１８Ｌ＋（２）Ｑ３１Ｇのアミノ酸置換、（１）Ｅ１７０Ｋ＋Ｑ２５２Ｌ＋（５）Ａ１５９Ｃ＋（７）Ｙ２１７Ｒ＋（８）Ｉ２１８Ｌ＋（３）Ｇ６４Ａのアミノ酸置換、（１）Ｅ１７０Ｋ＋Ｑ２５２Ｌ＋（５）Ａ１５９Ｃ＋（７）Ｙ２１７Ｒ＋（８）Ｉ２１８Ｌ＋（４）Ｋ１１１Ｒのアミノ酸置換、（１）Ｅ１７０Ｋ＋Ｑ２５２Ｌ＋（５）Ａ１５９Ｃ＋（７）Ｙ２１７Ｒ＋（８）Ｉ２１８Ｌ＋（６）Ｋ１７９Ｙのアミノ酸置換、（１）Ｅ１７０Ｋ＋Ｑ２５２Ｌ＋（５）Ａ１５９Ｃ＋（７）Ｙ２１７Ｒ＋（８）Ｉ２１８Ｌ＋（９）Ａ２４６Ｖのアミノ酸置換または（１）Ｅ１７０Ｋ＋Ｑ２５２Ｌ＋（５）Ａ１５９Ｃ＋（７）Ｙ２１７Ｒ＋（８）Ｉ２１８Ｌ＋（３）Ｇ６４Ａ＋（４）Ｋ１１１Ｒのアミノ酸置換または（１）Ｅ１７０Ｋ＋Ｑ２５２Ｌ＋（５）Ａ１５９Ｃ＋（７）Ｙ２１７Ｒ＋（８）Ｉ２１８Ｌ＋（２）Ｑ３１Ｇ＋（３）Ｇ６４Ａが導入されたアミノ酸配列であることがより好ましい。
前記（ａ）のアミノ酸配列としては、具体的には、例えば、配列表の配列番号３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９および４１のいずれか１で示されるアミノ酸配列が挙げられる。
本発明の改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨには、下記（ｂ）のアミノ酸配列を含む、ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨ活性を有するタンパク質が含まれる。該タンパク質は、無機塩の非存在下において７０℃以上で熱安定性である。
（ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列において、前記１７０番目、２５２番目、３１番目、６４番目、１１１番目、１５９番目、１７９番目、２１７番目、２１８番目および２４６番目のアミノ酸以外の位置で、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列。
前記（ｂ）のアミノ酸配列において、アミノ酸改変がなされるアミノ酸残基の個数は、１個乃至２０個であることが好ましく、１個乃至１０個であることがより好ましく、１個乃至６個であることがさらに好ましく、数個（１から２または３個）であることが特に好ましく、１個であることが最も好ましい。
なお、既に報告されているＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨのアミノ酸配列の１４５番目のセリン、１５８番目のチロシン、１６２番目のリジンがＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨ活性に必要であることが知られている［Ｋｅｉｚｏ Ｙａｍａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．１２９（２）３０３−３１２（２００２）］。したがって、（ｂ）のアミノ酸配列において、これらのアミノ酸は保持されていることが好ましい。
さらに、本発明の改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨには、前記（ａ）のアミノ酸配列に相同性を有するアミノ酸配列を含む、ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨ活性を有し、かつ無機塩の非存在下において７０℃以上で熱安定性であるタンパク質を含む。該相同性は、例えば、８０％以上であることが好ましく、９０％以上であることがより好ましく、９５％以上であることがさらに好ましく、９９％以上であることが特に好ましい。
ここで、「相同性」とは、ＢＬＡＳＴ ＰＡＣＫＡＧＥ〔ｓｇｉ３２ ｂｉｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２；ａｖａｉｌａｂｌｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ ［ＮＣＢＩ］〕のｂｌ２ｓｅｑ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｔａｔｉａｎａ Ａ．Ｔａｔｓｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．１７４，２４７−２５０，１９９９）により得られる同一性の値を示す。パラメーターとしては、Ｇａｐ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ Ｃｏｓｔ ｖａｌｕｅ：１１、Ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｃｏｓｔ ｖａｌｕｅ：１が例示される。
ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨは、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼである。ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨは、補酵素に水素を添加する反応と共役してβ−Ｄ−グルコース（ブドウ糖）の脱水素反応を触媒する酵素であり、ＥＣ１．１．１４７に分類される酵素である。
〔ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨの活性の測定〕
本発明において、ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨの活性は下記試薬を用いて、下記測定条件で測定する。
（試薬）
１００ｍＭ トリス−塩酸緩衝液 ｐＨ８．０
１００ｍＭ ＮＡＤ（Ｐ）＋水溶液
１Ｍ Ｄ−グルコース水溶液
酵素活性測定試薬：上記トリス−塩酸緩衝液を１７．５ｍＬ、ＮＡＤ（Ｐ）＋水溶液を０．５ｍＬ、グルコース水溶液を２ｍＬ、を混合して酵素活性測定試薬とする。
酵素活性測定溶液：酵素［ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨ］を所望の濃度に希釈するための溶液（以下、「酵素希釈液」ともいう）として、２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）を使用し、以下の活性値が５〜１５Ｕ／ｍＬとなるように酵素の原液（以下、「酵素原液」ともいう）を希釈して酵素活性測定溶液とする。
（測定条件）
酵素活性測定試薬０．９ｍＬを分光光度計用セルに入れ、３７℃で５分間以上プレインキュベートする。酵素活性測定溶液０．００５ｍＬを添加してよく混合し、３７℃で予めインキュベートされた分光光度計で、３４０ｎｍの吸光度変化を４０秒間記録し、１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤ／分）を計算する。ブランクは、酵素活性測定溶液の代わりに水を酵素活性測定試薬に混合して上記のように１分間あたりの吸光度変化（ΔＯＤｂｌａｎｋ／分）を計算する。これらの値から、下記の計算式にしたがって活性値を求める。
（式）活性（Ｕ／ｍＬ）＝（ΔＯＤ／分−ΔＯＤｂｌａｎｋ／分）×９０５×希釈倍率／（６．２２×５×１．０）
なお、上記計算式の９０５は酵素活性測定試薬と酵素活性測定溶液の液量、６．２２は本測定条件におけるＮＡＤ＋の分子吸光係数（ｃｍ２／マイクロモル）、５は酵素活性測定溶液の液量、１．０は酵素活性測定に使用するセルの光路長（ｃｍ）を示す。
〔ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨの比活性の測定〕
比活性値とは、酵素の活性をタンパク質重量当たりの活性値で表現した値である。本発明において、ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨの比活性値は下記試薬を用いて、下記測定条件で測定する。
（試薬）
酵素希釈液：２０ｍＭ リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ８．０）
酵素活性測定試薬：上記の酵素活性測定試薬
（測定条件）
必要であれば酵素原液を酵素希釈液で希釈し、上記活性測定法により活性を求める。酵素原液のタンパク質濃度を、２８０ｎｍの吸光度において、１ＯＤ＝１ｍｇ／ｍｌとして計算する。
上記計算式により、酵素原液の活性（Ｕ／ｍＬ）を求め、酵素原液のタンパク質濃度（ｍｇ／ｍｌ）を求める。これらの値から、以下の計算式にしたがって、比活性を求める。
（式）比活性（Ｕ／ｍｇ）＝（活性）／（タンパク質濃度）
本発明の改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨの比活性（Ｕ／ｍｇ）は、５００Ｕ／ｍｇ−タンパク質以上であることが好ましく、６００Ｕ／ｍｇ−タンパク質以上であることがより好ましく、８００Ｕ／ｍｇ−タンパク質以上であることがさらに好ましい。
〔無機塩の非存在下における熱安定性〕
本発明の改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨは、無機塩の非存在下において７０℃以上で熱安定性を示す。ここで、無機塩としては、塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、過炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、臭化ナトリウム、ヨウ化ナトリウムおよびホウ酸ナトリウム等が挙げられ、中でも塩化ナトリウムが好ましい。
無機塩の非存在下における改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨの熱安定性は、例えば、下記（１）および（２）の手順で測定する残存活性率に基づいて評価する。
（１）酵素希釈液により、酵素原液を特定の濃度に希釈して酵素活性測定溶液を得る。酵素活性測定溶液における酵素のタンパク質濃度は、１〜１０００μｇ／ｍＬとすることが好ましい。ここで、酵素希釈液、酵素原液および酵素活性測定溶液のいずれも無機塩を含まない条件とする。
（２）無機塩を含まない条件において、酵素活性測定溶液を、任意の温度で特定の時間熱処理し、熱処理前後の酵素活性を求める。熱処理時間は３０分〜１時間が好ましい。熱処理前の活性値を１００としたときの熱処理後の残存活性率（％）を求める。
無機塩の非存在下における熱安定性は、具体的には、例えば、実施例において後述する方法により測定する。実施例において後述するように、酵素活性を測定するための酵素活性測定試薬も塩化ナトリウムを含まないことが好ましい。
「無機塩の非存在下において７０℃以上で熱安定である」とは、７０℃以上で加熱処理後の残存活性率（％）が、２０％以上であることをいう。本発明の改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨの７０℃、３０分の加熱処理後の残存活性は、２０％以上であり、７５％以上であることが好ましく、８０％以上であることがより好ましい。
また、本発明の改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨの８０℃、３０分の加熱処理後の残存活性は、１％以上であることが好ましく、２０％以上であることが好ましく、６０％以上であることがより好ましい。
さらに、本発明の改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨの８４℃、３０分の加熱処理後の残存活性は、１％以上であることが好ましく、１０％以上であることが好ましく、３０％以上であることがさらに好ましい。
また、本発明の改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨの７０℃、３０分の加熱処理後の残存活性は、配列表の配列番号７９に示されるアミノ酸配列において、Ｉ１６５Ｍ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｐ１９４Ｔ＋Ａ１９７Ｋ＋Ｋ２０４Ｅ＋Ｋ２０６Ｒ＋Ｅ２２２Ｄ＋Ｓ２３７Ｃのアミノ酸置換がなされたタンパク質に比べて高いことが好ましい。
配列表の配列番号７９に示されるアミノ酸配列と配列番号１に記載のアミノ酸配列とは、３アミノ酸異なるが、両者は共に同じＢａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ菌由来であり実質的に同一のアミノ酸配列である。
ここで、配列表の配列番号７９に示されるアミノ酸配列において、Ｉ１６５Ｍ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｐ１９４Ｔ＋Ａ１９７Ｋ＋Ｋ２０４Ｅ＋Ｋ２０６Ｒ＋Ｅ２２２Ｄ＋Ｓ２３７Ｃのアミノ酸置換がなされたタンパク質とは、米国特許第７８１６１１１号明細書の配列番号１６４に記載の変異体である。
本発明の改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨは、アミノ酸置換前（以下、「改変前」ともいう）の配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨ（以下、「野生型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨ」ともいう）と比較して、無機塩の非存在下かつ７０℃以上における熱安定性が向上していることが好ましい。
また、本発明の改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨは、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１７０番目のグルタミン酸および２５２番目のグルタミンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含むＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨの変異体と比較して、無機塩の非存在下かつ７０℃以上における熱安定性が向上していることがより好ましい。
さらに、本発明の改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨは、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列において、Ｅ１７０Ｋ＋Ｑ２５２Ｌのアミノ酸置換がなされたアミノ酸配列を含むＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨの変異体と比較して、無機塩の非存在下かつ７０℃以上における熱安定性が向上していることが更に好ましい。
〔無機塩の非存在下における有機溶媒耐性〕
本発明の改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨは、アミノ酸置換前（以下、「改変前」ともいう）の配列番号１に示されるアミノ酸配列からなるＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨ（以下、「野生型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨ」ともいう）と比較して、無機塩の非存在下における有機溶媒耐性が向上したポリペプチドであることが好ましい。
また、本発明の改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨは、無機塩の非存在下における有機溶媒処理後の残存活性が、配列表の配列番号７９に示されるアミノ酸配列において、Ｉ１６５Ｍ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｐ１９４Ｔ＋Ａ１９７Ｋ＋Ｋ２０４Ｅ＋Ｋ２０６Ｒ＋Ｅ２２２Ｄ＋Ｓ２３７Ｃのアミノ酸置換がなされたタンパク質に比べて高いことが好ましい。
前記無機塩としては、塩化ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、炭酸ナトリウム、過炭酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、硫酸ナトリウム、チオ硫酸ナトリウム、亜硫酸水素ナトリウム、亜硝酸ナトリウム、硝酸ナトリウム、臭化ナトリウム、ヨウ化ナトリウムおよびホウ酸ナトリウム等が挙げられ、中でも塩化ナトリウムが好ましい。
また、有機溶媒としては、例えば、エチレングリコール、１、２-プロパンジオール、エタノール、メタノール、アセトニトリル、アセトンおよび１、４-ジオキサン等が挙げられ、中でもアセトンが好ましい。
本発明における無機塩の非存在下における有機溶媒耐性は、例えば、下記（１）〜（３）の手順で測定する残存活性率に基づいて評価する。
（１）酵素希釈液により、酵素原液を特定の濃度に希釈して酵素活性測定溶液を得る。ここで、酵素希釈液、酵素原液、酵素活性測定溶液のいずれも無機塩を含まない条件とする。酵素活性測定溶液における酵素のタンパク質濃度は、１〜１０００μｇ／ｍＬとすることが好ましい。
（２）無機塩を含まない条件において、酵素活性測定溶液を有機溶媒中に投入して攪拌した後、熱乾燥によりすべての溶媒を除去する。熱乾燥の条件は有機溶媒の種類により異なるが、通常、温度は、２０〜８０℃とすることが好ましく、時間は５分〜１時間とすることが好ましい。
（３）乾燥終了後の酵素を酵素希釈液で再懸濁し、有機溶媒／熱乾燥前後の酵素活性を求める。有機溶媒／熱乾燥前の活性値を１００としたときの、有機溶媒／熱乾燥後の残存活性率（％）を求める。
無機塩の非存在下における有機溶媒耐性は、具体的には、例えば、実施例において後述する方法により測定する。実施例において後述するように、酵素活性を測定するための酵素活性測定試薬も無機塩を含まないことが好ましい。
本発明の改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨは、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列において、１７０番目のグルタミン酸および２５２番目のグルタミンが他のアミノ酸に置換されたアミノ酸配列を含むＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨの変異体と比較して、無機塩の非存在下における有機溶媒耐性が向上していることがより好ましい。
また、本発明の改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨは、配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列において、Ｅ１７０Ｋ＋Ｑ２５２Ｌのアミノ酸置換がなされたアミノ酸配列を含むＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨの変異体と比較して、無機塩の非存在下における有機溶媒耐性が向上していることが更に好ましい。
本発明の改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨは、外来タンパク質又はペプチドと連結された融合タンパク質とすることができる。ここで、外来タンパク質又はペプチドとは、本発明の改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨに対して外因的なタンパク質又はペプチドを意味する。
前記外来タンパク質又はペプチドとしては、例えば、タンパク質精製に使用されるタンパク質又はペプチド（例えば、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ、マルトース結合タンパク質、チオレドキシン、セルロース結合ドメイン、ストレプトアビジン結合ペプチドおよびヒスチジンタグ等）が挙げられる。
本発明の改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨに対して外来タンパク質又はペプチドを連結する位置は、本発明の改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨと外来タンパク質又はペプチドとがそれぞれの機能又は活性を有するように適宜選択することができる。
〔野生型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨへの変異導入部位の決定方法〕
本発明の改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨは、一般的に用いられる進化工学的な手法を利用したランダム変異導入法ではなく、以下の（１）マルチプルアライメント図に基づくコンセンサス法に加えて、さらに（２）系統学的手法に基づいた祖先型アミノ酸導入法を併用することにより決定されるアミノ酸置換を、配列表の配列番号１で示される野生型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨのアミノ酸配列に導入することにより得られる。
（１）マルチプルアライメント図に基づくコンセンサス法
マルチプルアライメント図に基づくコンセンサス法とは、本来は抗体の機能改変を目的として利用され始め、酵素の熱安定性の向上を目的として利用された実績もあるＤＮＡ配列あるいはアミノ酸配列における部位特異的変異導入法（配列上のどの位置にどの変異を導入するか部位特異的に決定する方法）である。詳細についてはＢ．Ｓｔｅｉｐｅ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２４０，１８８−１９２，１９９４に記述されている。
マルチプルアライメント図に基づくコンセンサス法の材料としては、既知のアミノ酸配列を公知のデータベースに対して相同性検索することで得られる複数のアミノ酸配列を、公知のアライメントプログラムなどを利用してマルチプルアライメントさせた図を使用する。マルチプルアライメント図のすべての座位は、コンピュータープログラムにより挿入、欠失または置換等が最小となるように並べられる。
例えば、アミノ酸配列の欠失等により候補タンパク質に活性がない場合には、候補タンパク質のアミノ酸配列の特定の座位が欠失し、候補遺伝子以外のアミノ酸配列には何らかのアミノ酸が配置されている状況が観察される。その座位において候補タンパク質以外のアミノ酸残基に例えばメチオニン（Ｍ）が多く配列していれば、該欠失部位にＭを挿入する。同様にセリン（Ｓ）が多く配置していれば、該欠失部位にＳを挿入する。このような多数決的な決定による変異導入法をコンセンサス法と呼ぶ。
コンセンサス法は、酵素の様々な性能の改変または向上に利用できる。しかしながら、その反面、コンセンサス法は、単独で用いた場合、必ずしも無機塩の非存在下におけるＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨの熱安定性の向上を図る手法とは言えない。本発明者らは、コンセンサス法に加えて、以下に示す系統学的手法に基づいた祖先型アミノ酸導入法を併用することによって、無機塩の非存在下における熱安定性の向上した改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨを得られることを見出した。
（２）系統学的手法に基づいた祖先型アミノ酸導入法
系統学的手法に基づいた祖先型アミノ酸導入法は、ある特定の酵素についての複数の生物種における共通祖先のアミノ酸配列を推定し、該共通祖先のアミノ酸配列の一部あるいは全部をもとの酵素に変異として導入することにより共通祖先の酵素の機能を推察する目的で開発された手法である。
一般的に共通祖先型の酵素はもとの酵素に対して熱安定化することが示されており、全生物の共通祖先が超好熱菌であるとの仮説を支持するものであるが、本発明における利用のように、産業用酵素の機能改変にも利用されている方法である。詳細については、Ｈｉｓａｋｏ，Ｉ．，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，２４３，３９３−３９８，２００５；Ｋｅｉｋｏ，Ｗ．，ｅｔ ａｌ．，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，５８０，３８６７−３８７１，２００６；日本国特開２００２−２４７９９１号公報；日本国特開２０１１−１３９６７７号公報に記載されている。
祖先型アミノ酸導入法において共通祖先のアミノ酸配列を推定する際には、前述のコンセンサス法でも用いた特定の候補遺伝子のアミノ酸配列をデータベースに対して相同性検索することにより得られた複数の相同アミノ酸配列とそのマルチプルアライメント図に加えて、それらの相同アミノ酸配列群を基に作成した分子系統樹（以下、系統樹とも表記する）、および系統樹作成のためのアルゴリズム、並びにマルチプルアライメント図を材料として利用する。
系統樹を作成するためのいくつかのアルゴリズムには、例えば、最大節約原理に基づくアルゴリズム等が知られており、それを実現するコンピュータープログラムも利用または入手することができる。例えば、ＴＲＥＥ ＰＵＺＺＬＥ、ＭＯＬＰＨＹおよびＰＨＹＬＩＰ等の種々の系統樹推定プログラムが利用できる。
また、例えば、最尤原理に基づくアルゴリズム等が知られており、それを実現するコンピュータープログラムも利用または入手することができる。例えば、ＭｏｄｅｌＴｅｓｔ、ＰＨＹＭＬ、ＰＨＹＬＩＰおよびＴｒｅｅＦｉｎｄｅｒ等の種々の系統樹推定プログラムが利用できる。それらを用いて系統樹を作成することができるが、より簡便には、既に公表されている系統樹を利用することもできる。
このような系統樹においては、分子進化的に近い位置の生物種は、系統樹中で近い位置に現れる。また、系統樹中で根元に近い位置にある生物種はより祖先に近いと考えられる。
特定の酵素のアミノ酸配列をデータベースに対して相同性検索することで得られた複数の相同アミノ酸配列のデータをもとに適当なプログラムを使用してマルチプルアラインメントの結果が得られたならば、特定の系統樹における祖先型酵素のアミノ酸配列を推定することができる。
本発明においては、特に祖先型酵素のアミノ酸配列の推定に最尤法（「根井正利『分子進化遺伝学』培風館、「根井正利、Ｓ．クマー『分子進化と分子系統学』培風館」）を用いた。
本発明に使用し得る最尤法とは、予め決定した系統樹の樹形とアミノ酸置換モデルに基づいて、樹形の特定の位置に（主に系統樹の根にあたる部分）おけるあらゆる祖先型アミノ酸配列を推定し、最も尤度の高い配列を最も有望な祖先型アミノ配列として選択する方法である。また、最尤法に基づいて、系統樹およびアミノ酸配列のマルチプルアライメントから祖先型推定を行うためのプログラムＰＡＭＬ等も利用可能である。
得られた系統樹を利用してマルチプルアラインメントしたアミノ酸残基のそれぞれの部位に関して祖先型アミノ酸を決定することができる。このようにして、マルチプルアラインメントした配列の各々の残基に関して祖先型アミノ酸残基を推定し、その結果、対応する領域の祖先型アミノ酸配列を推定することができる。
この場合、祖先型アミノ酸配列を推定するために用いる生物種を変えると、系統樹の樹形が変化し、それと関連して異なる祖先型アミノ残基が得られる場合もあり、その位置と種類は比較に用いるアミノ酸配列にも依存する。
従って、そのような変動が比較的少ない位置のアミノ酸残基を改変の対象とすることが考えられる。そのようなアミノ酸残基は、系統樹の作成に用いる生物種を変える、または、生物種は変えずに系統樹作成に使用するアミノ酸配列情報の一部のみを用いるなど、系統樹の作成に使用するアミノ酸配列情報を変化させた場合の樹形変化の程度を見積り、樹形への影響の少ない残基を選択することによって決定できる。
上記のようにして祖先型アミノ酸残基が決定されたならば、解析対象とした酵素について非祖先型であるアミノ酸残基の少なくとも１つを祖先型アミノ酸残基に置換してその酵素を改変することができる。
上記のように（１）マルチプルアライメント図に基づくコンセンサス法に、さらに（２）系統学的手法に基づいた祖先型アミノ酸導入法を併用して決定されるアミノ酸置換を野生型のアミノ酸配列に導入することにより、従来のＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨに比べて大幅に無機塩の非存在下における熱安定性および／または有機溶媒耐性を向上させた改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨを得ることができる。
前記（１）の手法に前記（２）の手法を併用することにより、従来知られているものとは異なる特定の変異、すなわち超高熱菌であったと言われている全生物の共通祖先型アミノ酸変異を効果的に野生型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨのアミノ酸配列に対して導入することができ、得られる改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨの無機塩の非存在下における熱安定性および／または有機溶媒耐性が向上するものと考えられる。
以下、本発明の改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを含む組換えベクター、該ベクターを導入した形質転換体、また、該形質転換体を用いた改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨの製造方法について説明する。
〔改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨをコードするＤＮＡ〕
本発明の改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨをコードするＤＮＡは、改変前の野生型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨのＤＮＡに前記アミノ酸置換が導入されるように変異を導入することにより得ることができる。
前記野生型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨのＤＮＡまたは改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨのＤＮＡは、遺伝子の全合成法により人工合成することもできる。その際、該ＤＮＡの塩基配列におけるコドン利用頻度を、後述する大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のコドン利用頻度に最適化したＤＮＡを人工合成することもできる。
ここで、野生型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨのＤＮＡは、例えば、配列表の配列番号２に示される塩基配列である公知のＤＮＡであれば、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＮＢＲＣ３１３４株からＰＣＲを用いた定法により単離することができる。
特定の部位に特定の変異を導入する方法として、キットなどが広く販売され当業者が容易に利用可能なＤＮＡの部位特異的変異導入法などが利用できる。ＤＮＡ中の塩基を変換する具体的な方法としては、例えば市販のキット（ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｓｉｔｅ−Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ：Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製、ＫＯＤ−Ｐｌｕｓ−Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ：東洋紡製など）の利用などが挙げられる。
このようにして得られたＤＮＡは、ＤＮＡシーケンサーを用いて塩基配列を確認することができる。得られた塩基配列については、ＤＮＡＳＩＳ（日立ソフトエンジニアリング社製）およびＧＥＮＥＴＹＸ（株式会社ゼネティックス製）等の塩基配列解析ソフトによる解析を行うことにより、ＤＮＡ中のＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨ遺伝子のコード領域を特定することができる。
一旦、塩基配列が確定されると、その後は化学合成、クローニングされたプローブを鋳型としたＰＣＲ、または該塩基配列を有するＤＮＡ断片をプローブとするハイブリダイゼーションによって、本発明の改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨをコードする遺伝子を得ることができる。
さらに、部位特異的突然変異誘発法等によって本発明の改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨをコードする遺伝子の変異型であって変異前と同等の機能を有するものを合成することができる。なお、本発明の改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨをコードする遺伝子に変異を導入するには、Ｋｕｎｋｅｌ法、Ｇａｐｐｅｄ ｄｕｐｌｅｘ法またはメガプライマーＰＣＲ法等の公知の手法又はこれに準ずる方法を採用することができる。
本発明のＤＮＡは、本発明の改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨ又は上述の融合タンパク質をコードするＤＮＡである。本発明の改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨをコードするＤＮＡの塩基配列としては、例えば、配列表の配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０および４２で示される配列が挙げられる。
本発明の改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨをコードするＤＮＡと外来タンパク質又はペプチドをコードするＤＮＡとを連結した融合タンパク質をコードするＤＮＡを作製する場合には、本発明の改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨをコードするＤＮＡに外来タンパク質又はペプチドをコードするＤＮＡを連結したＤＮＡを準備する。
前記ＤＮＡは、連結したＤＮＡ自体であってもよく、当該ＤＮＡを含むベクター等であってよい。本発明の改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨをコードするＤＮＡに外来タンパク質又はペプチドをコードするＤＮＡを連結する方法は、それぞれ精製された本発明の改変型ＤＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨをコードする遺伝子及び外来タンパク質又はペプチドをコードするＤＮＡを適当な制限酵素で切断し、連結する方法が採用される。
また、本発明の改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨをコードするＤＮＡと外来タンパク質又はペプチドをコードするＤＮＡのそれぞれ一部に相同な領域を持たせることにより、ＰＣＲ等を用いたｉｎ ｖｉｔｒｏ法又は酵母等を用いたｉｎ ｖｉｖｏ法によって両者を連結する方法であってもよい。
本発明の改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨをコードするＤＮＡは、該ＤＮＡまたは該ＤＮＡを有する細胞に変異処理を行い、これらのＤＮＡ若しくは細胞から、例えば、配列表の配列番号４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０および４２の少なくとも１つで示される塩基配列からなるＤＮＡとストリンジェントな条件下でハイブリダイズするＤＮＡを選択することによって得られるＤＮＡであって、ＧＤＨ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡも含有する。
ここでいう「ストリンジェントな条件」とは、いわゆる特異的なハイブリッドが形成されるが、非特異的なハイブリッドは形成されない条件をいう。この条件を明確に数値化することは困難であるが、相同性が高い核酸同士、例えば７０〜９０％以上の相同性を有するＤＮＡ同士がハイブリダイズし、それより相同性が低い核酸同士がハイブリダイズしない条件等が挙げられる。
また、「ストリンジェントな条件下」とは、例えば以下の条件をいう。すなわち０．５％ＳＤＳ、５×デンハルツ〔Ｄｅｎｈａｒｔｚ’ｓ、０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、０．１％ポリビニルピロリドン、０．１％フィコール４００〕および１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含む６×ＳＳＣ（１×ＳＳＣは、０．１５Ｍ ＮａＣｌ、０．０１５Ｍ クエン酸ナトリウム、ｐＨ７．０）中で、５０℃〜６５℃で４時間〜一晩保温する条件をいう。
ハイブリダイゼーションは、前記のストリンジェントな条件下で行うことができる。例えば、本発明の改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨをコードするＤＮＡライブラリーまたはｃＤＮＡライブラリーを固定化したナイロン膜を作成し、６×ＳＳＣ、０．５％ ＳＤＳ、５×デンハルツ、１００μｇ／ｍｌサケ精子ＤＮＡを含むプレハイブリダイゼーション溶液中、６５℃でナイロン膜をブロッキングする。その後、３２Ｐでラベルした各プローブを加えて、６５℃で一晩保温する。このナイロン膜を６×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ＳＤＳを含む２×ＳＳＣ中、室温で１０分間、０．１％ＳＤＳを含む０．２×ＳＳＣ中、４５℃で３０分間洗浄した後、オートラジオグラフィーをとり、プローブと特異的にハイブリダイズするＤＮＡを検出することができる。また、洗いなどの条件を変えることによって様々な相同性を示す遺伝子を得ることができる。
また、本発明の改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨをコードするＤＮＡには、該ＤＮＡに相同性を有するＤＮＡであって、ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨ活性を有するポリペプチドをコードするＤＮＡも含まれる。相同性としては、少なくとも８０％以上、好ましくは９０％以上の相同性を有する遺伝子、さらに好ましくは９５％以上、さらに好ましくは９８％以上であることが好ましい。
ここで、ＤＮＡの「相同性」とは、ＢＬＡＳＴ ＰＡＣＫＡＧＥ［ｓｇｉ３２ ｂｉｔ ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｖｅｒｓｉｏｎ ２．０．１２；ａｖａｉｌａｂｌｅ ｆｒｏｍ ｔｈｅ Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）］のｂｌ２ｓｅｑ ｐｒｏｇｒａｍ（Ｔａｔｉａｎａ Ａ． Ｔａｔｓｕｓｏｖａ，Ｔｈｏｍａｓ Ｌ．Ｍａｄｄｅｎ，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｌｅｔｔ．，Ｖｏｌ．１７４，２４７−２５０，１９９９）により得られる同一性の値を示す。パラメーターとしては、Ｇａｐ ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ Ｃｏｓｔ ｖａｌｕｅ：１１、Ｇａｐ ｅｘｔｅｎｓｉｏｎ Ｃｏｓｔ ｖａｌｕｅ：１が例示される。
本発明の改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨをコードするＤＮＡは、コドン出現頻度を宿主に最適化したものが好ましく、コドンユーゼージを大腸菌に最適化させたＤＮＡがより好ましい。
コドン出現頻度を表す指標として、各コドンの宿主最適コドン使用頻度の総計を採択する。最適コドンとは、同じアミノ酸に対応するコドンのうち出現頻度が最も高いコドンと定義する。コドンユーゼージは、宿主に最適化したものであれば特に限定されないが、例えば、大腸菌のコドンユーゼージの一例として以下のものが挙げられる。
Ｆ：フェニルアラニン（ｔｔｔ）、Ｌ：ロイシン（ｃｔｇ）、Ｉ：イソロイシン（ａｔｔ）、Ｍ：メチオニン（ａｔｇ）、Ｖ：バリン（ｇｔｇ）、Ｙ：チロシン（ｔａｔ）、終止コドン（ｔａａ）、Ｈ：ヒスチジン（ｃａｔ）、Ｑ：グルタミン（ｃａｇ）、Ｎ：アスパラギン（ａａｔ）、Ｋ：リジン（ａａａ）、Ｄ：アスパラギン酸（ｇａｔ）、Ｅ：グルタミン酸（ｇａａ）、Ｓ：セリン（ａｇｃ）、Ｐ：プロリン（ｃｃｇ）、Ｔ：スレオニン（ａｃｃ）、Ａ：アラニン（ｇｃｇ）、Ｃ：システイン（ｔｇｃ）、Ｗ：トリプトファン（ｔｇｇ）、Ｒ：アルギニン（ｃｇｃ）、Ｇ：グリシン（ｇｇｃ）。
〔組換えベクター〕
本発明の改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨをコードするＤＮＡを含む組換えベクター（以下、本発明の組換えベクターという）は、発現ベクターに本発明の改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨをコードするＤＮＡを挿入することにより得ることができる。
ここで発現ベクターとしては、宿主内で自律的に増殖し得るファージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として構築されたものが適している。
ファージとしては、例えば、後述する大腸菌を宿主とする場合には、Ｌａｍｂｄａ ｇｔ１０およびＬａｍｂｄａ ｇｔ１１などが挙げられる。
一方、プラスミドとしては、例えば、大腸菌を宿主とする場合には、ｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１１８、ｐＵＣ１９、ｐＵＣ１１９、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔおよびコスミドであるＳｕｐｅｒ Ｃｏｓ Ｉなどが挙げられる。
シュードモナスを用いる場合には、例えば、グラム陰性菌用広宿主域ベクターであるＲＳＦ１０１０、ｐＢＢＲ１２２およびｐＣＮ５１などが挙げられる。さらに、例えば、レトロウイルスおよびワクシニアウイルス等の動物ウイルス並びにバキュロウイルス等の昆虫ウイルスベクターなどが挙げられる。
宿主としては、組換えベクターが安定であり、かつ自律増殖可能で外来性遺伝子の形質を発現できるのであれば特に制限されないが、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）等のエッシェリヒア属、バチルス・ズブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）等のバチルス属およびシュードモナス・プチダ（Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｐｕｔｉｄａ）等のシュードモナス属等に属する細菌、酵母、ＣＯＳ細胞等の動物細胞、Ｓｆ９等の昆虫細胞、並びにアブラナ科等に属する植物体全体、植物器官（例えば、葉、花弁、茎、根および種子等）、植物組織（例えば、表皮、師部、柔組織、木部および維管束等）および植物培養細胞等が挙げられる。これらの中でも大腸菌が好ましく、大腸菌ＤＨ５αおよび大腸菌ＸＬ−１ Ｂｌｕｅ ＭＲがより好ましい。
ベクターに本発明のＤＮＡを挿入する方法は、上述した本発明の改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨをコードする遺伝子に外来タンパク質又はペプチドをコードする遺伝子を連結する方法に準じて行うことができる。
細菌への本発明の組換えベクター等の導入方法は、細菌にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えば、カルシウムイオン処理によるコンピテントセル用いる方法およびエレクトロポレーション法等が挙げられる。
酵母への本発明の組換えベクター等の導入方法は、酵母にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えば、電気穿孔法（エレクトロポレーション法）、スフェロプラスト法および酢酸リチウム法等が挙げられる。
動物細胞への本発明の組換えベクター等の導入方法としては、動物細胞にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えば、エレクトロポレーション法、リン酸カルシウム法およびリポフェクション法等が挙げられる。
昆虫細胞への本発明の組換えベクター等の導入方法としては、昆虫細胞にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えば、リン酸カルシウム法、リポフェクション法およびエレクトロポレーション法等が挙げられる。
植物への本発明の組換えベクター等の導入方法としては、植物にＤＮＡを導入する方法であれば特に限定されるものではない。例えば、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法およびＰＥＧ法等が挙げられる。
本発明の組換えベクター等が宿主に組み込まれたか否かを確認する方法としては、例えば、ＰＣＲ法、サザンハイブリダイゼーション法およびノーザンハイブリダイゼーション法等が挙げられる。
ＰＣＲ法よる場合、例えば、形質転換体から組換えベクターを分離・精製する。
組換えベクターの分離・精製は、例えば、宿主が細菌の場合、細菌を溶菌して得られる溶菌物に基づいて行われる。溶菌の方法としては、例えばリゾチームなどの溶菌酵素により処理が施され、必要に応じてプロテアーゼおよび他の酵素並びにラウリル硫酸ナトリウム（ＳＬＳ）などの界面活性剤が併用される。
さらに、凍結融解およびフレンチプレス処理のような物理的破砕方法を組み合わせてもよい。溶菌物からのＤＮＡの分離・精製は、例えば、フェノール処理およびプロテアーゼ処理による除蛋白処理、リボヌクレアーゼ処理、アルコール沈殿処理並びに市販のキットを適宜組み合わせることにより行うことができる。
ＤＮＡの切断は、常法にしたがい、例えば、制限酵素処理を用いて行うことができる。制限酵素としては、例えば、特定のヌクレオチド配列に作用するＩＩ型制限酵素が挙げられる。ＤＮＡと発現ベクターとの結合は、例えば、ＤＮＡリガーゼを用いて行う。
その後、分離・精製したＤＮＡを鋳型として、本発明のＤＮＡに特異的なプライマーを設計してＰＣＲを行う。ＰＣＲにより得られた増幅産物についてアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動等を行い、臭化エチジウムまたはＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ液等により染色し、そして増幅産物をバンドとして検出することにより、形質転換されたことを確認する。
また、予め蛍光色素等により標識したプライマーを用いてＰＣＲを行い、増幅産物を検出することもできる。さらに、マイクロプレート等の固相に増幅産物を結合させ、蛍光および酵素反応等により増幅産物を確認する方法も採用してもよい。
〔形質転換体〕
本発明の形質転換体は、組換えベクターにマーカーを施して、該組換えベクターを宿主に導入することにより得られる。該形質転換体から、組換えベクターのマーカーと酵素活性の発現を指標としてスクリーニングして、改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨをコードする遺伝子を含有する組換えベクターを保持する遺伝子供与微生物を得る。
改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨをコードする遺伝子の塩基配列は、従来公知の方法、例えばジデオキシ法により解読できる。改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨのアミノ酸配列は、当該方法により決定された塩基配列より推定できる。
形質転換体の培養形態は、宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すればよく、好ましくは液体培養で行う。工業的には通気攪拌培養を行うのが有利である。
培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用いられるものが使用され得る。炭素源としては、資化可能な炭素化合物であればよく、例えば、グルコース、シュークロース、ラクトース、マルトース、糖蜜およびピルビン酸などが挙げられる。
窒素源としては、資化可能な窒素化合物であればよく、例えば、ペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン加水分解物および大豆粕アルカリ抽出物などが挙げられる。
その他に、例えば、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガンおよび亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸並びに特定のビタミンなどを必要に応じて使用する。
培養温度は、宿主が生育し、宿主が改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨを産生する範囲で適宜変更し得るが、好ましくは１５〜３７℃程度である。培養は、改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨが最高収量に達する時期を見計らって適当時期に完了すればよく、通常は培養時間が１２〜４８時間程度である。
培地のｐＨは、宿主が発育し、宿主が改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨを産生する範囲で適宜変更し得るが、好ましくはｐＨ５．０〜９．０程度の範囲である。
形質転換体を培養し、培養液を遠心分離などの方法により培養上清または菌体を回収し、菌体は超音波およびフレンチプレスといった機械的方法またはリゾチームなどの溶菌酵素により処理を施し、必要に応じてプロテアーゼおよび他の酵素並びにラウリル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）などの界面活性剤を併用することにより可溶化し、改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨを含む水溶性画分を得ることができる。
また、適当な発現ベクターと宿主を選択することにより、発現した改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨを培養液中に分泌させることもできる。
上記のようにして得られた改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨを含む水溶性画分から該酵素を精製する方法としては、該水溶性画分から直ちに行うこともできるが、該水溶性画分中の改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨを濃縮した後に行うこともできる。
濃縮は、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、塩析処理および親水性有機溶媒（例えば、メタノール、エタノールおよびアセトン）による分別沈殿法により行うことができる。改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨの濃縮には、加熱処理および等電点処理も有効な精製手段である。
濃縮液の精製は、例えば、ゲルろ過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーおよびアフィニティクロマトグラフィー等の方法を適宜組み合わせることによって行うことができる。
前記方法はすでに公知であり、適当な文献、雑誌および教科書等を参照することで進めることができる。このようにして得られた精製酵素は、例えば、凍結乾燥、真空乾燥およびスプレードライにより粉末化して市場に流通させることができる。
次に、本発明を具体的に説明するが、本発明は以下に限定されるものではない。
＜実施例１＞ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨへの変異導入部位の決定
（１−１）ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨ相同アミノ酸配列情報の取得
配列表の配列番号１で示されるバチルス・サブチリス由来ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨのアミノ酸配列を使用してＢｌａｓｔ（ｈｔｔｐ：／／ｂｌａｓｔ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／Ｂｌａｓｔ．ｃｇｉ）により相同性検索を行い、様々な生物種由来のアミノ酸配列情報を得た。
具体的には、ＮＡＤ（Ｐ）−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ｇｌｕｃｏｓｅ １−ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（Ｓｅｑ０１、ＹＰ＿１９２４０７、Ｇｌｕｃｏｎｏｂａｃｔｅｒ ｏｘｙｄａｎｓ ６２１Ｈ）、ｇｌｕｃｏｓｅ １−ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ ｐｕｔａｖｉｖｅ（Ｓｅｑ０２、ＹＰ＿００２４２６６２３、Ａｃｉｄｉｔｈｉｏｂａｃｉｌｌｕｓ ｆｅｒｒｏｏｘｉｄａｎｓ ＡＴＣＣ ２３２７０）、ｇｌｕｃｏｓｅ １−ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（Ｓｅｑ０３、ＮＰ＿３９３６６９、Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ ａｃｉｄｏｐｈｉｌｕｍ ＤＳＭ １７２８）、ｐｒｏｂａｂｌｅ ｇｌｕｃｏｓｅ １−ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（Ｓｅｑ０４、ＺＰ＿０１０９２７４４、Ｂｌａｓｔｏｐｉｒｅｌｌｕｌａ ｍａｒｉｎａ ＤＳＭ ３６４５）、ｇｌｕｃｏｓｅ １−ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（Ｓｅｑ０５、ＹＰ＿００１２２８１８４、Ｓｙｎｅｃｈｏｃｏｃｃｕｓ ｓｐ．ＲＣＣ３０７）、３−ｏｘｏａｃｙｌ−ｒｅｄｕｃｔａｓｅ（Ｓｅｑ０６、ＺＰ＿００９９５７３１、Ｊａｎｉｂａｃｔｅｒ ｓｐ． ＨＴＣＣ２６４９）、ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ／ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ＳＤＲ（Ｓｅｑ０７、ＹＰ＿９６９４５９、Ａｃｉｄｏｖｏｒａｘ ａｖｅｎａｅ ｓｕｂｓｐ． ｃｉｔｒｕｌｌｉ ＡＡＣ００−１）、ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ／ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ＳＤＲ（Ｓｅｑ０８、ＹＰ＿００１０４６８４１、Ｍｅｔｈａｎｏｃｕｌｌｅｕｓ ｍａｒｉｓｎｉｇｒｉ ＪＲ１）、ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ／ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ＳＤＲ（Ｓｅｑ０９、ＹＰ＿００２４６２９５６、Ｃｈｌｏｒｏｆｌｅｘｕｓ ａｇｇｒｅｇａｎｓ ＤＳＭ ９４８５）、２−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎａｔｅ ３−ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（Ｓｅｑ１０、ＮＰ＿０７００３５、Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ ｆｕｌｇｉｄｕｓ ＤＳＭ ４３０４）、ｐｒｅｄｉｃｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ（Ｓｅｑ１１、ＸＰ＿００１４１５４７２、Ｏｓｔｒｅｏｃｏｃｃｕｓ ｌｕｃｉｍａｒｉｎｕｓ ＣＣＥ９９０１）、ｓｈｏｒｔ−ｃｈａｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ／ｒｅｄｕｃｔａｓｅ ＳＤＲ（Ｓｅｑ１２、ＹＰ＿００１５４１２０１、Ｃａｌｄｉｖｉｒｇａ ｍａｇｕｉｌｉｎｇｅｎｓｉｓ ＩＣ−１６７）、ｓｈｏｒｔ ｃｈａｉｎ ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（Ｓｅｑ１３、ＹＰ＿００１０１２５０８、Ｈｙｐｅｒｔｈｅｒｍｕｓ ｂｕｔｙｌｉｃｕｓ ＤＳＭ ５４５６）、２−ｄｅｏｘｙ−Ｄ−ｇｌｕｃｏｎａｔｅ ３−ｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ（Ｓｅｑ１４、ＹＰ＿００１４７０６５３、Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｌｅｔｔｉｎｇａｅ ＴＭＯ）のアミノ酸配列情報を得た。
さらに、これらの配列情報に、配列番号１のバチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）由来ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨのアミノ酸配列（Ｓｅｑ１５）も付け加えた。
ここで、Ｓｅｑ〜とは後述の図１〜図２などに示したアミノ酸配列の配列番号を指し、間の文字列（例えばＹＰ＿１９２４０７など）はデータベースに登録されているそれぞれのアミノ酸配列のアクセッションナンバーを指す。さらにその後に、生物種の名称および株名を示した。
（１−２）ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨを含むマルチプルアライメント図の作成
上記のデータベースに登録されたアミノ酸配列データを、ＣｌｕｓｔａｌＷによりアライメントし、アライメント図（図１〜図２）とデータファイルを得た。得られたデータは、後述の分子系統樹の作成に使用した。
（１−３）分子系統樹の作成
ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨを含むマルチプルアライメント図のデータを使用して、公知のコンピュータープログラムを使用して最尤法により４種類の分子系統樹を作成した。ＷＡＧ＋Ｇモデルを分子置換モデルとして採用した。４種類の分子系統樹をそれぞれ図３〜図６に示す。
（１−４）祖先型アミノ酸配列の推定
公知のコンピュータープログラム、ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨを含むマルチプルアライメント図のデータ、上述した４種類の分子系統樹を用いて、最尤法により、それぞれの分子系統樹の根の位置における祖先型アミノ酸配列を計算した。ＷＡＧモデルを分子置換モデルとして採用した。
具体的には、配列番号４９で示されるアミノ酸配列は、図３の系統樹の根の位置における推定祖先型アミノ酸配列である。配列番号５０で示されるアミノ酸配列は、図４の系統樹の根の位置における推定祖先型アミノ酸配列である。配列番号５１で示されるアミノ酸配列は、図５の系統樹の根の位置における推定祖先型アミノ酸配列である。配列番号５２で示されるアミノ酸配列は、図６の系統樹の根の位置における推定祖先型アミノ酸配列である。
（１−５）推定祖先型アミノ酸配列とＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨを含むマルチプルアライメント図の作成、および推定祖先型アミノ酸導入部位の決定
４種類の分子系統樹から推定された祖先型アミノ酸配列を、図１〜図２に示したマルチプルアライメント図に追加した。得られた推定祖先型アミノ酸配列とＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨを含むマルチプルアライメント図を図７〜図９に分割して示す。
図７〜図９において、Ｔｒｅ１Ａｎｃと示されているアミノ酸配列は、図３の系統樹の根の位置における推定祖先型アミノ酸配列である。Ｔｒｅ２Ａｎｃと示されているアミノ酸配列は、図４の系統樹の根の位置における推定祖先型アミノ酸配列である。
Ｔｒｅ３Ａｎｃと示されているアミノ酸配列は、図５の系統樹の根の位置における推定祖先型アミノ酸配列である。Ｔｒｅ４Ａｎｃと示されているアミノ酸配列は、図６の系統樹の根の位置における推定祖先型アミノ酸配列である。
推定祖先型アミノ酸配列とＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨを含むマルチプルアライメント図を観察しながら、例えば図９に示すように、バチルス・サブチリス由来ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨ（Ｓｅｑ１５）の２１７番目のアミノ酸残基はチロシンであるが、その下に並んでいる祖先型アミノ酸残基はすべてアルギニンであるので、アルギニンを変異として導入すると決定した。同様にしてその他の推定祖先型アミノ酸導入部位も決定し、以下のアミノ酸置換がなされた変異体１〜変異体２３を作製、評価することを決定した。
なお、以下のＥ１７０ＫおよびＱ２５２Ｌは先行技術文献の特許文献３、非特許文献６、非特許文献７に記載されている通り、バチルス・メガテリウム由来ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨやバチルス・サブチリス由来ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨの塩化ナトリウム存在下、非存在下における熱安定性を向上させることが示されている公知の変異であり、本発明においても推定祖先型アミノ酸とともに利用した。
変異体２１は、特許文献１および特許文献３に記載されている変異を組み合わせた変異体であり、実施例における比較例として使用した。変異体２２の変異は、非特許文献７に記載されている熱安定性および有機溶媒耐性に効果が示された変異であるが、用いたバチルス属の株が異なるため、参考例として使用した。
変異体２３の変異は、非特許文献７に記載されている熱安定性および有機溶媒耐性に効果が示された変異であるが、用いたバチルス属の株が異なるため、実施例として使用した。
変異体１：Ａ１５９Ｃ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｑ２５２Ｌ
変異体２：Ｑ３１Ｇ＋Ａ１５９Ｃ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｑ２５２Ｌ
変異体３：Ｇ６４Ａ＋Ａ１５９Ｃ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｑ２５２Ｌ
変異体４：Ｋ１１１Ｒ＋Ａ１５９Ｃ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｑ２５２Ｌ
変異体５：Ａ１５９Ｃ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｋ１７９Ｙ＋Ｑ２５２Ｌ
変異体６：Ａ１５９Ｃ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ａ２４６Ｖ＋Ｑ２５２Ｌ
変異体７：Ｅ１７０Ｋ＋Ｙ２１７Ｒ＋Ｉ２１８Ｌ＋Ｑ２５２Ｌ
変異体８：Ｑ３１Ｇ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｙ２１７Ｒ＋Ｉ２１８Ｌ＋Ｑ２５２Ｌ
変異体９：Ｇ６４＋ＡＥ１７０Ｋ＋Ｙ２１７Ｒ＋Ｉ２１８Ｌ＋Ｑ２５２Ｌ
変異体１０：Ｋ１１１Ｒ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｙ２１７Ｒ＋Ｉ２１８Ｌ＋Ｑ２５２Ｌ
変異体１１：Ｅ１７０Ｋ＋Ｋ１７９Ｙ＋Ｙ２１７Ｒ＋Ｉ２１８Ｌ＋Ｑ２５２Ｌ
変異体１２：Ｅ１７０Ｋ＋Ｙ２１７Ｒ＋Ｉ２１８Ｌ＋Ａ２４６Ｖ＋Ｑ２５２Ｌ
変異体１３：Ａ１５９Ｃ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｙ２１７Ｒ＋Ｉ２１８Ｌ＋Ｑ２５２Ｌ
変異体１４：Ｑ３１Ｇ＋Ａ１５９Ｃ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｙ２１７Ｒ＋Ｉ２１８Ｌ＋Ｑ２５２Ｌ
変異体１５：Ｇ６４Ａ＋Ａ１５９Ｃ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｙ２１７Ｒ＋Ｉ２１８Ｌ＋Ｑ２５２Ｌ
変異体１６：Ｋ１１１Ｒ＋Ａ１５９Ｃ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｙ２１７Ｒ＋Ｉ２１８Ｌ＋Ｑ２５２Ｌ
変異体１７：Ａ１５９Ｃ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｋ１７９Ｙ＋Ｙ２１７Ｒ＋Ｉ２１８Ｌ＋Ｑ２５２Ｌ
変異体１８：Ａ１５９Ｃ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｙ２１７Ｒ＋Ｉ２１８Ｌ＋Ａ２４６Ｖ＋Ｑ２５２Ｌ
変異体１９：Ｇ６４Ａ＋Ｋ１１１Ｒ＋Ａ１５９Ｃ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｙ２１７Ｒ＋Ｉ２１８Ｌ＋Ｑ２５２Ｌ
変異体２０：Ｑ３１Ｇ＋Ｇ６４Ａ＋Ａ１５９Ｃ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｙ２１７Ｒ＋Ｉ２１８Ｌ＋Ｑ２５２Ｌ
変異体２１：Ｅ１３３Ｋ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｑ２５２Ｌ
変異体２２：Ｅ１７０Ｋ＋Ｑ２５２Ｌ
変異体２３：Ｐ４５Ａ＋Ｎ４６Ｅ＋Ｆ１５５Ｙ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｖ２２７Ａ＋Ｗ２３０Ｆ＋Ｑ２５２Ｌ
本明細書における「Ａ１５９Ｃ」等の表現は、アミノ酸置換の表記法である。例えば「Ａ１５９Ｃ」とは、ある特定のアミノ酸配列におけるＮ末端側から１５９番目のアミノ酸Ａを、アミノ酸Ｃに置換することを意味する。
また、本明細書における「Ｙ２１７Ｒ＋Ｉ２１８Ｌ」等の表現は、Ｙ２１７ＲおよびＩ２１８Ｌのアミノ酸置換を同時に導入していることを意味する。
＜実施例２＞ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨへの変異導入と発現、精製
（２−１）ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨ遺伝子への部位特異的変異導入
上述した変異体１〜変異体２３の遺伝子をそれぞれ合成すべく、配列番号２の野生型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨのＤＮＡ配列に対してＰＣＲによる部位特異的変異導入を行った。それに先立ち、ＰＣＲによる部位特異的変異導入に使用するオリゴヌクレオチドを以下に記述するように設計して合成した。
変異１については、配列表の配列番号５３および配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６、配列番号５７および配列番号５８で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異２については、配列表の配列番号５３および配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６、配列番号５７および配列番号５８、配列番号５９および配列番号６０で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異３については、配列表の配列番号５３および配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６、配列番号５７および配列番号５８、配列番号６１および配列番号６２で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異４については、配列表の配列番号５３および配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６、配列番号５７および配列番号５８、配列番号６３および配列番号６４で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異５については、配列表の配列番号５３および配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６、配列番号５７および配列番号５８、配列番号６５および配列番号６６で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異６については、配列表の配列番号５３および配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６、配列番号５７および配列番号５８、配列番号６７および配列番号６８で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異７については、配列表の配列番号５５および配列番号５６、配列番号５７および配列番号５８、配列番号６９および配列番号７０で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異８については、配列表の配列番号５５および配列番号５６、配列番号５７および配列番号５８、配列番号５９および配列番号６０、配列番号６９および配列番号７０で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異９については、配列表の配列番号５５および配列番号５６、配列番号５７および配列番号５８、配列番号６１および配列番号６２、配列番号６９および配列番号７０で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異１０については、配列表の配列番号５５および配列番号５６、配列番号５７および配列番号５８、配列番号６３および配列番号６４、配列番号６９および配列番号７０で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異１１については、配列表の配列番号５５および配列番号５６、配列番号５７および配列番号５８、配列番号６５および配列番号６６、配列番号６９および配列番号７０で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異１２については、配列表の配列番号５５および配列番号５６、配列番号５７および配列番号５８、配列番号６７および配列番号６８、配列番号６９および配列番号７０で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異１３については、配列表の配列番号５３および配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６、配列番号５７および配列番号５８、配列番号６９および配列番号７０で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異１４については、配列表の配列番号５３および配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６、配列番号５７および配列番号５８、配列番号５９および配列番号６０、配列番号６９および配列番号７０で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異１５については、配列表の配列番号５３および配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６、配列番号５７および配列番号５８、配列番号６１および配列番号６２、配列番号６９および配列番号７０で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異１６については、配列表の配列番号５３および配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６、配列番号５７および配列番号５８、配列番号６３および配列番号６４、配列番号６９および配列番号７０で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異１７については、配列表の配列番号５３および配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６、配列番号５７および配列番号５８、配列番号６５および配列番号６６、配列番号６９および配列番号７０で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異１８については、配列表の配列番号５３および配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６、配列番号５７および配列番号５８、配列番号６７および配列番号６８、配列番号６９および配列番号７０で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異１９については、配列表の配列番号５３および配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６、配列番号５７および配列番号５８、配列番号６１および配列番号６２、配列番号６３および配列番号６４、配列番号６９および配列番号７０で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異２０については、配列表の配列番号５３および配列番号５４、配列番号５５および配列番号５６、配列番号５７および配列番号５８、配列番号５９および配列番号６０、配列番号６１および配列番号６２、配列番号６９および配列番号７０で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異２１については、配列表の配列番号５５および配列番号５６、配列番号５７および配列番号５８、配列番号７１および配列番号７２で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異２２については、配列表の配列番号５５および配列番号５６、配列番号５７および配列番号５８で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
変異２３については、配列表の配列番号５５および配列番号５６、配列番号５７および配列番号５８、配列番号７３および配列番号７４、配列番号７５および配列番号７６、配列番号７７および配列番号７８で示される塩基配列のオリゴヌクレオチドを利用した。
ＰＣＲによる部位特異的変異導入の鋳型には、バチルス・サブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）ＮＢＲＣ３１３４株からＰＣＲを用いた定法により単離した配列番号２の野生型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨのＤＮＡをｐＥＴ-２１ｃにクローニングしたベクターを使用した。以下、本ベクターをｐＥＴＧＤＨとも呼ぶ。
上記の相補的なオリゴヌクレオチドを利用して、ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ Ｌｉｇｈｔｎｉｎｇ Ｓｉｔｅ-Ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｋｉｔ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ製）を使用し、ｐＥＴＧＤＨを鋳型としてＰＣＲによる部位特異的変異導入を行った。方法はキットに添付のプロトコルに準拠した。
部位特異的変異導入実験を行ったあとのベクターにより大腸菌ＤＨ５αを形質転換してクローニングし、ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨのＤＮＡ上に所望の変異が導入できたかどうか、シーケンスにより確認した。
得られた変異体ベクターを、変異体１から変異体２３の順にそれぞれｐＥＴＧＤＨ１、ｐＥＴＧＤＨ２、ｐＥＴＧＤＨ３、ｐＥＴＧＤＨ４、ｐＥＴＧＤＨ５、ｐＥＴＧＤＨ６、ｐＥＴＧＤＨ７、ｐＥＴＧＤＨ８、ｐＥＴＧＤＨ９、ｐＥＴＧＤＨ１０、ｐＥＴＧＤＨ１１、ｐＥＴＧＤＨ１２、ｐＥＴＧＤＨ１３、ｐＥＴＧＤＨ１４、ｐＥＴＧＤＨ１５、ｐＥＴＧＤＨ１６、ｐＥＴＧＤＨ１７、ｐＥＴＧＤＨ１８、ｐＥＴＧＤＨ１９、ｐＥＴＧＤＨ２０、ｐＥＴＧＤＨ２１、ｐＥＴＧＤＨ２２およびｐＥＴＧＤＨ２３と命名した。
ｐＥＴＧＤＨ１〜ｐＥＴＧＤＨ２３にクローニングされたＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨのＤＮＡ配列は、順に配列表の配列番号４、配列番号６、配列番号８、配列番号１０、配列番号１２、配列番号１４、配列番号１６、配列番号１８、配列番号２０、配列番号２２、配列番号２４、配列番号２６、配列番号２８、配列番号３０、配列番号３２、配列番号３４、配列番号３６、配列番号３８、配列番号４０、配列番号４２、配列番号４４および配列番号４６、配列番号４８のとおりであった。ｐＥＴＧＤＨにクローニングされた野生型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨのＤＮＡ配列は配列表の配列番号２のとおりであった。
したがって、ｐＥＴＧＤＨ１〜ｐＥＴＧＤＨ２３にクローニングされたＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨのＤＮＡ配列にコードされたアミノ酸配列は、順に配列表の配列番号３、配列番号５、配列番号７、配列番号９、配列番号１１、配列番号１３、配列番号１５、配列番号１７、配列番号１９、配列番号２１、配列番号２３、配列番号２５、配列番号２７、配列番号２９、配列番号３１、配列番号３３、配列番号３５、配列番号３７、配列番号３９、配列番号４１、配列番号４３、配列番号４５および配列番号４７のとおりであった。ｐＥＴＧＤＨにクローニングされた野生型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨのＤＮＡ配列にコードされたアミノ酸配列は配列表の配列番号１のとおりであった。
なお、比較例１として、配列表の配列番号７９に示されるアミノ酸配列において、Ｉ１６５Ｍ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｐ１９４Ｔ＋Ａ１９７Ｋ＋Ｋ２０４Ｅ＋Ｋ２０６Ｒ＋Ｅ２２２Ｄ＋Ｓ２３７Ｃのアミノ酸置換がなされた変異体［米国特許第７８１６１１１号明細書（特許文献４）の配列番号１６４に記載の変異体］を作成した。
表１に変異体１〜２３と比較例１との塩基配列およびアミノ酸配列における相同性（％）、および野生型との塩基配列における相同性（％）を示す。
Figure 0005949757
ｐＥＴＧＤＨ１〜ｐＥＴＧＤＨ２３およびｐＥＴＧＤＨにより大腸菌ＤＨ５αをそれぞれ形質転換した形質転換体を用いて、以下の発現解析実験を行った。
（２−２）ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨ変異体遺伝子の発現
上述の６種類の形質転換体を１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ寒天プレート培地で培養してコロニーを形成させた。それぞれの形質転換体の単一コロニーを１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含むＬＢ培地１ｍＬに植菌し、３７℃で振とう培養した。
前培養した培養液１ｍＬを、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンおよび０．５ｍＭのＩＰＴＧ（イソプロピル−β−チオガラクトピラノシド）含むＴｅｒｒｉｆｉｃ培養液１００ｍＬに植菌し、３０℃で振とう培養した。培養が完了した後、培養液を遠心分離（８０００ｒｐｍ、１０分）してそれぞれの変異体酵素を発現させた大腸菌を回収した。回収した大腸菌は以下の精製工程で使用するまで−８０℃で保存した。
（２−３）精製
−８０℃で保存した大腸菌を２０ｍＬの２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ８）に懸濁して超音波により破砕した。破砕液を遠心分離（１００００×ｇ、１０分）して上清を回収した。得られた上清を、６０℃で６０分間、熱処理し、遠心分離（１００００×ｇ、２０分）して上清を回収した。
得られた遠心上清に氷冷下で３５％飽和硫安となるように硫酸アンモニウムを添加して硫安沈殿し、遠心分離（１００００×ｇ、２０分）により上清を回収した。硫安沈殿後の遠心上清を３５％飽和硫安を含む２０ｍＭ リン酸緩衝液で予め平衡化した６ｍＬのＲＥＳＯＵＲＣＥ ＰＨＥカラム（ＧＥヘルスケア製）に吸着させ、３５％から０％飽和硫安の濃度勾配で溶出した。
回収されたＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨ活性を有する画分を２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ８）で透析し、限外濾過膜により濃縮した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより、濃縮されたＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨ活性画分が単一のタンパク質まで精製されていることを確認した。２０ｍＭ リン酸緩衝液（ｐＨ８）で透析して濃縮したＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨ変異体酵素溶液を以下、精製酵素ともいう。
＜実施例３＞ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨ変異体酵素の性能評価
該変異体酵素の性能評価は、以下に示す「比活性」、「熱安定性」、「アセトン／熱乾燥耐性」に関して実施した。すべての項目は、酵素原液、酵素希釈液、酵素活性測定溶液のいずれもＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨの安定化作用のある塩化ナトリウムを全く含まない条件で実施した。実験結果は表２にまとめて示す。
（３−１）比活性の測定
６種類のＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨ変異体酵素それぞれの比活性は、上記した通りの方法により求めた。結果を表２に示す。
（３−２）熱安定性の測定
精製酵素を酵素希釈液：２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）によりタンパク質濃度を３０μｇ／ｍＬとなるように希釈した。希釈した酵素溶液を１．５ｍＬのプラスチックチューブに０．５ｍＬずつ分注した。該プラスチックチューブを所定の温度に調節したウォーターバスに投入し、３０分間、熱処理した。熱処理が終了したら、該プラスチックチューブを氷水に投入して急冷した。熱処理前後の活性を上記した通りの方法により求めた。
熱処理前の活性値を１００としたときの、熱処理後の残存活性（％）を求め、熱安定性の指標とした。その結果を表２に示す。
（３−３）アセトン／熱乾燥耐性の測定
精製酵素を酵素希釈液：２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）によりタンパク質濃度を５００μｇ／ｍＬとなるように希釈した。希釈した酵素溶液１０μＬを１．５ｍＬのプラスチックチューブに分注し、そこに９０μＬのアセトンを加えて室温で１分間よく撹拌した。
前記プラスチックチューブを５０℃に設定した遠心エバポレーターＣＶＥ-３１００（ＥＹＥＬＡ製）にセットして３０分間の熱乾燥によりすべての溶媒を除去した。乾燥終了後の酵素粉末を２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ８）で再懸濁し、アセトン／熱乾燥処理前後の活性を上記した通りの方法により求めた。
熱処理前の活性値を１００としたときの、熱処理後の残存活性（％）を求めたうえで、変異体２２の残存活性を１．０としたときの相対値を求めてアセトン耐性の指標とした。その結果を表２に示す。
Figure 0005949757
表２に示すように、比活性に関しては、祖先型変異を導入した変異体１〜変異体２１及び変異体２３は、変異体２２（Ｅ１７０Ｋ＋Ｑ２５２Ｌ）に比べて若干の比活性の低下が観察されたが、実用上の問題が生じるレベルではなかった。
また、表２に示すように、熱安定性に関しては、変異体１（Ａ１５９Ｃ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｑ２５２Ｌ）、変異体２（Ｑ３１Ｇ＋Ａ１５９Ｃ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｑ２５２Ｌ）、変異体３（Ｇ６４Ａ＋Ａ１５９Ｃ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｑ２５２Ｌ）、変異体４（Ｋ１１１Ｒ＋Ａ１５９Ｃ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｑ２５２Ｌ）、変異体５（Ａ１５９Ｃ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｋ１７９Ｙ＋Ｑ２５２Ｌ）、変異体６（Ａ１５９Ｃ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ａ２４６Ｖ＋Ｑ２５２Ｌ）、変異体７（Ｅ１７０Ｋ＋Ｙ２１７Ｒ＋Ｉ２１８Ｌ＋Ｑ２５２Ｌ）、変異体８（Ｑ３１Ｇ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｙ２１７Ｒ＋Ｉ２１８Ｌ＋Ｑ２５２Ｌ）、変異体９（Ｇ６４＋ＡＥ１７０Ｋ＋Ｙ２１７Ｒ＋Ｉ２１８Ｌ＋Ｑ２５２Ｌ）、変異体１０（Ｋ１１１Ｒ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｙ２１７Ｒ＋Ｉ２１８Ｌ＋Ｑ２５２Ｌ）、変異体１１（Ｅ１７０Ｋ＋Ｋ１７９Ｙ＋Ｙ２１７Ｒ＋Ｉ２１８Ｌ＋Ｑ２５２Ｌ）、変異体１２（Ｅ１７０Ｋ＋Ｙ２１７Ｒ＋Ｉ２１８Ｌ＋Ａ２４６Ｖ＋Ｑ２５２Ｌ）、変異体１３（Ａ１５９Ｃ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｙ２１７Ｒ＋Ｉ２１８Ｌ＋Ｑ２５２Ｌ）、変異体１４（Ｑ３１Ｇ＋Ａ１５９Ｃ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｙ２１７Ｒ＋Ｉ２１８Ｌ＋Ｑ２５２Ｌ）、変異体１５（Ｇ６４Ａ＋Ａ１５９Ｃ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｙ２１７Ｒ＋Ｉ２１８Ｌ＋Ｑ２５２Ｌ）、変異体１６（Ｋ１１１Ｒ＋Ａ１５９Ｃ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｙ２１７Ｒ＋Ｉ２１８Ｌ＋Ｑ２５２Ｌ）、変異体１７（Ａ１５９Ｃ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｋ１７９Ｙ＋Ｙ２１７Ｒ＋Ｉ２１８Ｌ＋Ｑ２５２Ｌ）、変異体１８（Ａ１５９Ｃ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｙ２１７Ｒ＋Ｉ２１８Ｌ＋Ａ２４６Ｖ＋Ｑ２５２Ｌ）、変異体１９（Ｇ６４Ａ＋Ｋ１１１Ｒ＋Ａ１５９Ｃ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｙ２１７Ｒ＋Ｉ２１８Ｌ＋Ｑ２５２Ｌ）、変異体２０（Ｑ３１Ｇ＋Ｇ６４Ａ＋Ａ１５９Ｃ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｙ２１７Ｒ＋Ｉ２１８Ｌ＋Ｑ２５２Ｌが極めて高い熱安定性を有することが示された。
また、７０℃で３０分間処理した後の残存活性は、変異体２２（Ｅ１７０Ｋ＋Ｑ２５２Ｌ）が２０％を下回ったのに対し、比較例の変異体２１（Ｅ１３３Ｋ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｑ２５２Ｌ）は４５％、変異体２３（Ｐ４５Ａ＋Ｎ４６Ｅ＋Ｆ１５５Ｙ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｖ２２７Ａ＋Ｗ２３０Ｆ＋Ｑ２５２Ｌ）は７４％であった。一方、変異体１から変異体２０のすべての祖先型変異体は残存活性が８０％以上であり、その多くは失活が全く観察されなかった。
同様に、８０℃で３０分間処理した後の残存活性は、比較例の変異体２１、変異体２２、変異体２３は完全に失活した。一方で、変異体１、変異体２、変異体６、変異体７、変異体８、変異体９、変異体１０は数％の残存活性を示した。変異体１３、変異体１４、変異体１５、変異体１６、変異体１７、変異体１８、変異体１９、変異体２０に至っては６０％以上の残存活性を示した。
同様に、８４℃で３０分間処理した後の残存活性は、比較例の変異体２１、変異体２２、変異体２３は完全に失活した。一方で、変異体１３、変異体１４、変異体１５、変異体１６、変異体１７、変異体１８、変異体１９、変異体２０至っては３０％以上の残存活性を示した。
表２に示すように、アセトン耐性に関しては、変異体２２に対し、比較例の変異体２１および変異体２３は４倍未満の耐性であったのに対し、祖先型変異を導入した変異体１から変異体２０は、４倍以上の高い耐性を有していることが示された。変異体１３から変異体２０に至っては、７倍以上高い耐性を有していることが示された。
これらの結果から、Ｅ１７０Ｋ＋Ｑ２５２Ｌのアミノ酸置換をするだけでは、得られる変異体は無機塩非存在下において７０℃以上における熱処理後の残存活性が非常に低く、８０℃以上の熱処理では失活するため、幅広い温度域で安定して機能することができないことが分かった。
これに対し、配列番号１に示されるアミノ酸配列においてＥ１７０Ｋ＋Ｑ２５２Ｌのアミノ酸置換に加えて、さらにＱ３１Ｇ、Ｇ６４Ａ、Ｋ１１１Ｒ、Ａ１５９Ｃ、Ｋ１７９Ｙ、Ｙ２１７Ｒ、Ｉ２１８ＬおよびＡ２４６Ｖからなる群より選択される少なくとも１のアミノ酸置換がなされることにより、得られる改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨは、無機塩非存在下において、ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨの高い比活性を維持したまま、７０℃以上の熱処理後も安定して機能し、アセトンのような有機溶媒に対する耐性も持ち合わせることができることがわかった。
さらに、表２に示すように比較例１（Ｉ１６５Ｍ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｐ１９４Ｔ＋Ａ１９７Ｋ＋Ｋ２０４Ｅ＋Ｋ２０６Ｒ＋Ｅ２２２Ｄ＋Ｓ２３７Ｃ）と比較して、変異体１〜２０は、顕著に優れた熱安定性、アセトン耐性、および比活性を有するとともに、アセトン耐性にも優れていた。この結果から、本発明の変異体１〜２０は表１に示すように比較例１および野生型との塩基配列の相同性が９５％以上と非常に高いにも関わらず、耐熱性および有機溶媒に対する耐性において顕著に優れていることがわかった。
本発明を詳細にまた特定の実施態様を参照して説明したが、本発明の精神と範囲を逸脱することなく様々な変更および修正を加えることができることは当業者にとって明らかである。
本発明を特定の態様を用いて詳細に説明したが、本発明の意図と範囲を離れることなく様々な変更および変形が可能であることは、当業者にとって明らかである。なお本出願は、２０１１年３月３０日付で出願された日本特許出願（特願２０１１−７５４４９）に基づいており、その全体が引用により援用される。
本発明により、塩化ナトリウムのような無機塩の存在に制限されず、幅広い温度域で安定して利用できるＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨを提供することが可能になった。より具体的には、工業用途での広範な利用にも耐えうるよう、無機塩の非存在下において、バチルス・サブチリス由来ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨの高い比活性を維持したまま、７０℃以上の熱処理後も安定して機能し、アセトンのような有機溶媒に対する耐性も持ち合わせる変異体酵素を遺伝子工学的手法等により提供するとともに、その大量生産に必要な遺伝子、該遺伝子を含む組換えベクター、該ベクターにより得られる形質転換体、該形質転換体を用いる改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨの製造方法を提供する。

Claims (11)

  1. 以下の（ａ）または（ｂ）のアミノ酸配列を含む、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドまたはニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸を補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼ[ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨ]活性を有するタンパク質。
    （ａ）配列表の配列番号１に示されるアミノ酸配列において、以下の（１）〜（１０）からなる群より選択される少なくとも１のアミノ酸置換がなされたアミノ酸配列
    （１）Ａ１５９Ｃ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｑ２５２Ｌ
    （２）Ａ１５９Ｃ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ａ２４６Ｖ＋Ｑ２５２Ｌ
    （３）Ａ１５９Ｃ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｙ２１７Ｒ＋Ｉ２１８Ｌ＋Ｑ２５２Ｌ
    （４）Ｑ３１Ｇ＋Ａ１５９Ｃ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｙ２１７Ｒ＋Ｉ２１８Ｌ＋Ｑ２５２Ｌ
    （５）Ｇ６４Ａ＋Ａ１５９Ｃ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｙ２１７Ｒ＋Ｉ２１８Ｌ＋Ｑ２５２Ｌ
    （６）Ｋ１１１Ｒ＋Ａ１５９Ｃ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｙ２１７Ｒ＋Ｉ２１８Ｌ＋Ｑ２５２Ｌ
    （７）Ａ１５９Ｃ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｋ１７９Ｙ＋Ｙ２１７Ｒ＋Ｉ２１８Ｌ＋Ｑ２５２Ｌ
    （８）Ａ１５９Ｃ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｙ２１７Ｒ＋Ｉ２１８Ｌ＋Ａ２４６Ｖ＋Ｑ２５２Ｌ
    （９）Ｇ６４Ａ＋Ｋ１１１Ｒ＋Ａ１５９Ｃ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｙ２１７Ｒ＋Ｉ２１８Ｌ＋Ｑ２５２Ｌ
    （１０）Ｑ３１Ｇ＋Ｇ６４Ａ＋Ａ１５９Ｃ＋Ｅ１７０Ｋ＋Ｙ２１７Ｒ＋Ｉ２１８Ｌ＋Ｑ２５２Ｌ
    （ｂ）前記（ａ）のアミノ酸配列において、前記１７０番目、２５２番目、３１番目、６４番目、１１１番目、１５９番目、１７９番目、２１７番目、２１８番目および２４６番目のアミノ酸以外の位置で、１又は数個のアミノ酸が欠失、置換又は付加されたアミノ酸配列
  2. 前記（ａ）のアミノ酸配列が、配列表の配列番号３、１３、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９および４１のいずれか１で示されるアミノ酸配列である請求項１に記載のタンパク質。
  3. 請求項１または２に記載のタンパク質をコードするＤＮＡ。
  4. ＤＮＡの塩基配列におけるコドン利用頻度を大腸菌のコドン利用頻度に最適化した請求項３に記載のＤＮＡ。
  5. 請求項３または請求項４に記載のＤＮＡを含む、組換えベクター。
  6. 請求項５に記載の組換えベクターにより得られる形質転換体。
  7. 宿主が大腸菌である請求項６に記載の形質転換体。
  8. 請求項６または請求項７に記載の形質転換体を培養することによりＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨを生成させ、該ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨを採取することを含む、改変型ＮＡＤ（Ｐ）＋ＧＤＨの製造方法。
  9. 請求項１または２に記載のタンパク質を含むグルコース測定検査薬。
  10. 請求項１または２に記載のタンパク質を含むグルコースセンサ。
  11. 請求項１または２に記載のタンパク質を用いるグルコース濃度の測定方法。
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