JPH0880192A

JPH0880192A - ホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼをコードするｄｎａおよび該ｄｎａを保有する実質的に純粋な微生物

Info

Publication number: JPH0880192A
Application number: JP6217201A
Authority: JP
Inventors: Katsura Izui; 桂泉井; Kazuo Houriyou; 一生芳陵
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1994-09-12
Filing date: 1994-09-12
Publication date: 1996-03-26

Abstract

(57)【要約】【構成】耐熱性で安定なホスホエノールピルビン酸カ
ルボキシラーゼ（ＰＥＰＣ）のアミノ酸配列をコードす
るＤＮＡおよび該ＤＮＡを保有する実質的に純粋な微生
物。【効果】ＰＥＰＣの部分アミノ酸配列に基づいて合成
したオリゴヌクレオチドを使用して、ＰＥＰＣ生産菌株
に由来する染色体ＤＮＡライブラリーからＰＥＰＣ遺伝
子の全ＤＮＡ配列を明確とした新規なＰＥＰＣ遺伝子を
分離し、該ＰＥＰＣ遺伝子を利用し、高効率な耐熱性で
安定なＰＥＰＣの生産を可能とした。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は、ホスホエノールピルビ
ン酸カルボキシラーゼ（Ｐｈｏｓｐｈｏｅｎｏｌｐｙｒ
ｕｖａｔｅｃａｒｂｏｘｙｌａｓｅ、以下ＰＥＰＣと
略す）蛋白質のアミノ酸配列をコードする遺伝子と、そ
の形質転換微生物、およびこれを用いてなる遺伝子組換
え酵素ＰＥＰＣの製造法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ＰＥＰＣは生体におけるホスホエノール
ピルビン酸と二酸化炭素からオキサロ酢酸を不可逆的に
生成する反応を触媒する酵素である（Ｅ．Ｃ．４．１．
１．３１．）。ＰＥＰＣは、血清中などの二酸化炭素濃
度の高感度測定に利用される（Ｇｏｕｌｄ，Ｂ．Ｊ．，
Ｒｏｃｋｓ，Ｂ．Ｆ．（１９８５）Ｈａｎｄｂｏｏｋ
ｏｆＥｎｚｙｍｅＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｓｅ
ｃｏｎｄｅｄｉｔｉｏｎ，４２１−４３７）。

【０００３】従来、公知のＰＥＰＣとしては、大腸菌
（Ｃａｎｏｖａｓ，Ｊ．Ｌ．，ａｎｄＫｏｒｎｂｅｒ
ｇ，Ｈ．Ｌ．（１９６６）Ｐｒｏｃ．Ｒｏｙ．Ｓｏｃ．
１６５Ｂ，１８９、特開昭５８−１２６７８９）、落花
生（Ｍａｒｕｙａｍａ，Ｈ．，ｅｔ．ａｌ．（１９６
６）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４１，２４０５）、ト
ウモロコシ（Ｕｅｄａｎ，Ｋ．，ａｎｄＳｕｇｉｙａ
ｍａ，Ｔ．（１９７６）ＰｌａｎｔＰｈｙｓｉｏｌ．
５７，９０６−９１０、特開昭６２−４８３８４）、コ
リネバクテリウム（特開昭６２−５５０８９、特開昭０
２−２９１２７６）などにより生産されているものが知
られている。

【０００４】また、高度好熱菌であるサーマス属もＰＥ
ＰＣを生産していることが報告されている（Ｓｕｎｄａ
ｒａｎ，Ｔ．Ｋ．（１９７９）Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏ
ｐｈｙｓ．Ａｃｔａ，４３，５３７−５４５）（Ｙｏｓ
ｈｉｚａｋｉ，Ｆ．，ａｎｄＩｍａｈｏｒｉ，Ｋ．（１
９７９）Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．４３，３９
７−３９９）。このサーマス属由来のＰＥＰＣは高い耐
熱性と安定性を有する酵素であり、診断用酵素として高
い有用性を有する。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】上記の如くサーマス属
はＰＥＰＣを生産することが確認されているが、従来法
における培養活性はたかだか０．０２〜０．０５ｕ／ｍ
ｌであり、１回の培養で得られる培養酵素が少なく不経
済であり、効率のよい高純度かつ高品質、高耐熱性で安
定なＰＥＰＣ生産法が望まれていた。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記問題
点に関し鋭意研究の結果、アイスランドで分離され、Ｔ
ｅｃｈｎｏｌｏｇｉｃａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆ
Ｉｃｅｌａｎｄより有償で譲渡された、上記サーマス
属に属する微生物サーマス・エスピー（Ｔｈｅｒｍｕｓ
ｓｐ．）Ｎｏ．２３株（ＦＥＲＭＰ−１４４７６）
より、試行錯誤の末ＰＥＰＣの遺伝子を分離し、該微生
物が生産するＰＥＰＣ蛋白質のアミノ酸配列、および該
アミノ酸配列をコードするＤＮＡの塩基配列を決定し
た。なお本サーマス・エスピー・Ｎｏ．２３株は、その
菌学的性質よりサーマス・アクアティカス（Ｔｈｅｒｍ
ｕｓａｑｕａｔｉｃｕｓ）に属する可能性もあるが、
未だ確定しておらず、本発明においてはサーマス・エス
ピーとして述べる。

【０００７】また、該ＰＥＰＣ遺伝子を任意のベクター
に導入し、好ましい宿主−ベクター系にて宿主微生物を
形質転換体とし、該形質転換体を培養して、ＰＥＰＣ遺
伝子情報を発現させ、該培養物からＰＥＰＣを確認し、
優れた工業的生産方法を確立し、本発明を完成するに至
った。本発明は、上記の知見に基づいてなされたもの
で、Ｎ末端側より図１で表される下記のアミノ酸配列を
コードするヌクレオチド配列から実質的になるＮ末端側
よりＳｅｒＡｓｐＰｒｏＰｈｅＧｌｕＡｌａＬｅｕＬｙｓＡｌａＧｌｕＡｓｐＬｅｕＬｅｕＧｌｙＡｒｇＬｅｕＬｅｕＧｌｙＧｌｕＡｌａＩｌｅＡｒｇＬｙｓＶａｌＳｅｒＧｌｙＧｌｕＰｈｅＰｈｅＡｌａＬｅｕＶａｌＧｌｕＧｌｕＶａｌＡｒｇＬｅｕＬｅｕＳｅｒＬｙｓＡｌａＡｒｇＡｒｇＧｌｎＡｓｐＧｌｙＡｌａＡｌａＡｌａＧｌｕＶａｌＬｅｕＳｅｒＧｌｎＡｒｇＶａｌＧｌｕＡｒｇＭｅｔＰｒｏＶａｌＧｌｕＭｅｔＧｌｕＡｌａＬｅｕＶａｌＡｒｇＡｌａＰｈｅＴｈｒＨｉｓＴｙｒＰｈｅＨｉｓＬｅｕＶａｌＡｓｎＡｌａＧｌｕＧｌｕＡｒｇＨｉｓＡｒｇＶａｌＡｒｇＶａｌＡｓｎＡｒｇＬｅｕＡｒｇＴｈｒＧｌｕＧｌｙＧｌｕＬｅｕＧｌｕＡｓｎＰｒｏＡｒｇＰｒｏＧｌｕＧｌｙＰｈｅＬｅｕＡｌａＬｅｕＡｌａＬｙｓＡｌａＬｅｕＬｙｓＡｒｇＧｌｙＬｅｕＳｅｒＬｅｕＧｌｕＧｌｕＡｌａＧｌｕＡｌａＨｉｓＬｅｕＡｓｎＡｒｇＬｅｕＡｌａＬｅｕＬｅｕＴｈｒＰｈｅＴｈｒＡｌａＨｉｓＰｒｏＴｈｒＧｌｕＴｈｒＡｒｇＡｒｇＡｒｇＴｈｒＬｅｕＡｒｇＨｉｓＬｅｕＧｌｕＡｒｇＬｅｕＧｌｎＧｌｕＧｌｕＬｅｕＧｌｕＧｌｙＧｌｙＡｓｐＡｒｇＧｌｕＡｒｇＬｅｕＬｅｕＡｒｇＶａｌＶａｌＬｅｕＬｅｕＴｙｒＡｌａＴｈｒＧｌｕＧｌｕＶａｌＡｒｇＬｙｓＡｌａＡｒｇＰｒｏＳｅｒＧｌｕＡｓｐＧｌｕＩｌｅＬｙｓＧｌｙＧｌｙＬｅｕＴｙｒＴｙｒＬｅｕＰｒｏＴｈｒＴｈｒＬｅｕＴｒｐＡｒｇＩｌｅＰｒｏＬｙｓＶａｌＶａｌＧｌｕＧｌｙＬｅｕＧｌｕＡｌａＡｌａＬｅｕＧｌｕＡｒｇＶａｌＴｙｒＧｌｙＡｒｇＰｒｏＨｉｓＬｅｕＡｒｇＳｅｒＰｒｏＶａｌＡｒｇＰｈｅＡｒｇＳｅｒＴｒｐＭｅｔＧｌｙＧｌｙＡｓｐＡｓｐＧｌｙＡｓｎＰｒｏＴｙｒＶａｌＴｈｒＰｒｏＧｌｕＶａｌＴｈｒＡｌａＰｈｅＡｌａＧｌｙＡｒｇＴｙｒＡｒｇＧｌｕＶａｌＡｌａＬｙｓＧｌｙＡｒｇＴｙｒＬｅｕＧｌｕＧｌｕＬｅｕＧｌｕＡｌａＬｅｕＶａｌＡｒｇＬｅｕＳｅｒＬｅｕＳｅｒＧｌｕＡｌａＡｒｇＩｌｅＰｒｏＶａｌＰｒｏＬｙｓＧｌｕＶａｌＡｒｇＧｌｕＧｌｙＧｌｕＧｌｙＶａｌＧｌｕＡｒｇＰｈｅＰｒｏＧｌｙＧｌｕＰｒｏＴｙｒＡｒｇＡｒｇＴｙｒＰｈｅＡｌａＡｌａＴｙｒＡｒｇＡｌａＬｅｕＧｌｕＧｌｙＧｌｕＡｌａＬｅｕＳｅｒＴｈｒＧｌｕＧｌｙＬｅｕＡｌａＡｒｇＡｌａＬｙｓＶａｌＡｌａＧｌｕＬｙｓＧｌｙＬｅｕＧｌｕＧｌｙＶａｌＧｌｙＬｅｕＡｌａＧｌｎＶａｌＡｌａＧｌｎＰｈｅＬｅｕＡｒｇＰｒｏＬｅｕＧｌｕＡｌａＡｒｇＬｅｕＳｅｒＡｌａＰｈｅＧｌｙＬｅｕＧｌｕＬｅｕＡｌａＬｅｕＡｓｐＬｅｕＡｒｇＧｌｕＧｌｕＳｅｒＧｌｙＬｙｓＬｅｕＬｅｕＧｌｕＡｌａＡｌａＡｌａＧｌｕＬｅｕＡｒｇＬｅｕＧｌｙＧｌｙＶａｌＨｉｓＰｒｏＡｓｐＰｈｅＬｅｕＡｌａＬｅｕＳｅｒＰｒｏＧｌｕＧｌｕＬｙｓＡｌａＬｅｕＬｅｕＴｈｒＧｌｕＧｌｕＬｅｕＬｙｓＴｈｒＡｌａＡｒｇＰｒｏＬｅｕＬｅｕＰｒｏＶａｌＧｌｙＶａｌＰｒｏＧｌｎＧｌｙＧｌｕＡｌａＬｅｕＡｒｇＶａｌＡｌａＬｅｕＧｌｙＡｌａＬｅｕＡｒｇＡｌａＴｒｐＡｓｐＬｙｓＧｌｙＡｌａＨｉｓＶａｌＶａｌＳｅｒＭｅｔＴｈｒＨｉｓＨｉｓＰｒｏＡｌａＡｓｐＬｅｕＬｅｕＶａｌＰｈｅＬｅｕＬｅｕＡｌａＡｒｇＧｌｕＶａｌＧｌｙＬｅｕＴｙｒＡｒｇＰｒｏＧｌｙＬｙｓＰｒｏＬｅｕＰｈｅＡｓｐＶａｌＶａｌＰｒｏＬｅｕＰｈｅＧｌｕＴｈｒＬｅｕＧｌｕＡｓｐＬｅｕＧｌｕＡｒｇＡｌａＰｒｏＶａｌＬｅｕＡｒｇＡｒｇＬｅｕＬｅｕＡｌａＡｓｎＰｒｏＶａｌＰｈｅＡｒｇＡｌａＨｉｓＡｌａＧｌｎＧｌｙＧｌｙＧｌｙＶａｌＧｌｕＶａｌＭｅｔＩｌｅＧｌｙＴｙｒＳｅｒＡｓｐＳｅｒＡｓｎＬｙｓＡｓｐＡｌａＧｌｙＬｅｕＭｅｔＡｌａＡｓｎＬｅｕＡｌａＬｅｕＴｙｒＧｌｎＡｌａＧｌｎＧｌｕＡｌａＬｅｕＨｉｓＡｌａＶａｌＧｌｕＡｌａＧｌｎＧｌｙＩｌｅＰｒｏＶａｌＰｈｅＰｈｅＰｈｅＨｉｓＧｌｙＡｒｇＧｌｙＴｈｒＳｅｒＴｈｒＡｒｇＧｌｙＧｌｙＧｌｙＰｒｏＡｌａＧｌｙＡｒｇＡｌａＩｌｅＡｌａＧｌｙＬｅｕＰｒｏＰｒｏＬｙｓＳｅｒＧｌｙＨｉｓＡｒｇＬｅｕＡｒｇＬｅｕＴｈｒＧｌｕＧｌｎＧｌｙＧｌｕＡｌａＬｅｕＡｌａＡｓｐＡｒｇＴｙｒＨｉｓＰｒｏＡｓｐＬｅｕＡｌａＶａｌＡｒｇＨｉｓＬｅｕＧｌｕＧｌｎＬｅｕＬｅｕＴｙｒＨｉｓＰｈｅＡｌａＡｌａＡｌａＬｅｕＧｌｙＡｓｐＧｌｙＶａｌＧｌｕＰｒｏＬｙｓＡｌａＨｉｓＴｒｐＡｒｇＧｌｕＡｌａＬｅｕＧｌｕＡｌａＧｌｙＧｌｕＡｒｇＳｅｒＭｅｔＡｌａＡｒｇＴｙｒＡｒｇＡｌａＬｅｕＬｅｕＳｅｒＧｌｎＧｌｕＰｈｅＰｈｅＰｒｏＰｈｅＰｈｅＧｌｕＡｌａＰｈｅＴｈｒＰｒｏＩｌｅＡｒｇＧｌｕＩｌｅＧｌｙＧｌｕＬｅｕＩｌｅＡｌａＳｅｒＡｒｇＰｒｏＶａｌＴｙｒＡｒｇＨｉｓＧｌｙＡｒｇＶａｌＡｒｇＡｓｐＩｌｅＡｒｇＡｓｐＡｒｇＡｌａＩｌｅＰｒｏＴｒｐＶａｌＭｅｔＡｌａＴｒｐＴｈｒＧｌｎＶａｌＡｒｇＬｅｕＬｅｕＬｅｕＰｒｏＴｒｐＴｙｒＧｌｙＬｅｕＳｅｒＡｌａＬｅｕＧｌｕＧｌｙＬｅｕＰｒｏＭｅｔＰｒｏＬｅｕＬｅｕＡｒｇＧｌｕＴｙｒＡｒｇＧｌｕＴｒｐＰｒｏＰｈｅＰｈｅＡｌａＴｈｒＴｈｒＬｅｕＧｌｕＳｅｒＡｌａＡｌａＭｅｔＡｌａＡｌａＬｙｓＡｌａＡｓｐＬｅｕＧｌｙＩｌｅＡｌａＧｌｕＡｒｇＴｙｒＬｅｕＬｙｓＬｅｕＶａｌＰｒｏＧｌｕＬｅｕＧｌｎＧｌｙＰｈｅＴｙｒＨｉｓＨｉｓＬｅｕＡｌａＧｌｕＧｌｕＴｙｒＡｒｇＡｒｇＴｈｒＶａｌＡｌａＬｅｕＧｌｕＡｌａＩｌｅＰｈｅＧｌｕＡｌａＰｒｏＬｅｕＬｅｕＨｉｓＡｓｎＧｌｎＬｙｓＴｈｒＬｅｕＧｌｕＧｌｎＩｌｅＡｌａＬｅｕＡｒｇＡｓｎＰｒｏＴｙｒＶａｌＡｓｐＰｒｏＩｌｅＡｓｎＰｈｅＶａｌＧｌｎＶａｌＬｅｕＬｅｕＡｌａＡｒｇＴｙｒＡｒｇＡｌａＰｒｏＧｌｙＧｌｙＡｒｇＧｌｕＡｓｐＧｌｕＧｌｙＶａｌＡｒｇＡｌａＬｅｕＬｅｕＬｅｕＳｅｒＬｅｕＬｅｕＧｌｙＶａｌＡｌａＡｌａＧｌｙＬｅｕＡｒｇＡｓｎＡｌａＧｌｙで表されるアミノ酸配列で表されるＰＥＰＣポリペプチ
ドをコードすることを特徴とするＤＮＡ、エシェリヒア
・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）に属する
微生物であって、Ｎ末端側より図１で表されるアミノ酸
配列をコードするヌクレオチド配列から実質的になるＰ
ＥＰＣ蛋白をコードするＤＮＡを保持し、かつＰＥＰＣ
生産能を有することを特徴とする実質的に純粋な微生
物、Ｎ末端側より図１で表されるアミノ酸配列をコード
するヌクレオチド配列から実質的になるＰＥＰＣ蛋白を
コードするＤＮＡを保持し、かつ当該ＤＮＡの発現によ
るＰＥＰＣ生産能を有する実質的に純粋な微生物を培養
して該ＤＮＡの遺伝情報を発現せしめ、該培養物からＰ
ＥＰＣを採取することを特徴とするＰＥＰＣの製造法で
ある。

【０００８】本発明の図１で表されるＰＥＰＣ蛋白のア
ミノ酸配列をコードするＤＮＡにおいて、その図１にて
表記されるアミノ酸配列のＮ末端側及びＣ末端側はアミ
ノ酸残基またはポリペプチド残基を含む場合であっても
よく、Ｎ末端側であるＳｅｒの上流にはさらに一個また
は複数のアミノ酸残基を有してもよく、そのアミノ酸残
基としては開始コドンまたはシグナルペプチドが挙げら
れ、またＣ末端側のＧｌｙの下流には、さらに一個以上
のアミノ酸残基を有してもよい。

【０００９】さらに、本発明のＰＥＰＣを構成するアミ
ノ酸配列は図１で表されるアミノ酸配列からなるポリペ
プチドによる酵素活性発現と同様の効果を発現する図１
中のアミノ酸配列の一部からなる実質的になるアミノ酸
配列や酵素活性発現に関与しない一部のアミノ酸の配列
を変異、欠損または付加したものの均等物も含まれる。

【００１０】本発明の図１で表されるアミノ酸配列をコ
ードする新規なＤＮＡは、そのＮ末端側及びＣ末端側の
アミノ酸残基またはポリペプチド残基を含めたアミノ酸
配列の各アミノ酸に対応する一連のコドンのうちいずれ
か１個のコドンからなるＤＮＡであればよい。さらに、
本発明のＰＥＰＣを構成するアミノ酸配列をコードする
ＤＮＡは図１で表されるアミノ酸配列からなるポリペプ
チドによる酵素活性発現と同様の効果を発現する図１中
の一部分からなる実質的になるアミノ酸配列をコードす
るＤＮＡであってもよく、また酵素活性発現に関与しな
い一部のアミノ酸の配列を変異、欠損または付加したも
のの均等物のアミノ酸配列をコードするＤＮＡであって
もよい。

【００１１】上記ＤＮＡの好適な例として、５’末端側
より図２で表される塩基配列を有するＤＮＡを挙げるこ
とができる。該ＤＮＡは、５’末端の上流側にアミノ酸
をコードするコドンを１個以上有したものでもよく、Ｔ
ＡＡ、ＴＡＧ、及びＴＧＡ以外のコドンであればよい。
さらに、好ましくはＡＴＧ、ＧＴＧ、それら以外の開始
コドン又はシグナルペプチドに対応するコドンを有した
ものを挙げることができる。３’末端たるＧＧＣの下流
側には、アミノ酸をコードするコドンを１個以上有する
か、又は翻訳終止コドンを有するかのいずれでもよく、
更に、その３’末端側にアミノ酸をコードするコドンを
１個以上有する場合には、このアミノ酸をコードするコ
ドンの３’末端側に翻訳終止コドンを有することが好ま
しい。

【００１２】図１に示されたアミノ酸配列をコードする
ヌクレオチド配列から実質的になるＤＮＡは、例えば、
ＰＥＰＣを生産するＰＥＰＣ遺伝子の供与体である微生
物サーマス・エスピー・Ｎｏ．２３株菌体よりＤＮＡを
分離精製した後、制限酵素などを用いて切断した該ＤＮ
Ａと、同じく切断してリニヤーにした発現ベクターと
を、両ＤＮＡの末端部をＤＮＡリガーゼなどにより結合
閉環させ、かくして得られた組み換えＤＮＡプラスミド
を宿主微生物に導入し、発現ベクターのマーカーと、Ｐ
ＥＰＣの活性発現もしくはＤＮＡプローブを指標として
スクリーニングを行い、ＰＥＰＣ遺伝子を含有する組み
換えＤＮＡプラスミドを保持する微生物を分離し、該遺
伝子組換え微生物を培養し、該培養菌体から該組み換え
ＤＮＡプラスミドを分離精製し、次いで該組み換えＤＮ
ＡプラスミドからＰＥＰＣ遺伝子であるＤＮＡを取得す
ることにより得られる。

【００１３】図１に示されたアミノ酸配列をコードする
ＤＮＡを得るためには、具体的には以下のように行えば
よいが、その操作法のうち常法とされるものは、例えば
マニアティスらの方法（Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ．，ｅｔ
ａｌ．ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ．Ｃｏｌｄ
ＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙ
１９８２，１９８９）や、市販の各種酵素、キット類
に添付された手順に従えば実施できるものである。

【００１４】サーマス・エスピー・Ｎｏ．２３に由来す
るＤＮＡ（以下サーマスＤＮＡと略称する）を採取する
には、例えばサーマス・エスピー・Ｎｏ．２３を、液体
培地で約３〜７日間通気撹拌培養し、得られる培養物を
遠心分離して集菌し、次いでこれを溶菌させることによ
ってＰＥＰＣ遺伝子を含有する溶菌物を調製する。溶菌
方法としては、例えばリゾチームなどの細胞壁溶解酵素
による処理が施され、必要によりプロテアーゼなどの他
の酵素やラウリル硫酸ナトリウムなどの界面活性剤が併
用され、さらに細胞壁の物理的破壊法である凍結融解
（特開昭６３−１８５３７１号公報参照）やフレンチプ
レス処理を上述の溶菌法と組み合わせで行ってもよい。

【００１５】この様にして得られた溶菌物からサーマス
ＤＮＡを分離精製するには、常法に従って、例えばフェ
ノール抽出による除蛋白処理、プロテアーゼ処理、リボ
ヌクレアーゼ処理、アルコール沈澱、遠心分離などの方
法を適宜組み合わせることにより行うことができる。分
離精製されたサーマスＤＮＡを切断する方法は、常法に
従って制限酵素処理により行えばよく、特に得られるサ
ーマスＤＮＡ断片とベクターとの結合を容易ならしめる
ため、制限酵素、とりわけ特定ヌクレオチド配列に作用
する、例えば、ＳａｌＩ、ＢｇｌＩＩ、ＢａｍＨＩ、Ｘ
ｈｏＩ、ＭｌｕＩなどのＩＩ形制限酵素が適している。

【００１６】サーマスＤＮＡ断片を組み込むベクターと
しては、宿主微生物体内で自律的に増殖しうるファージ
又はプラスミドから遺伝子組み換え用として構築された
ものが適しており、ファージベクターとしては、例え
ば、エシェリヒア・コリに属する微生物を宿主微生物と
する場合にはλｇｔ・λＣ、λｇｔ・λＢなどが使用で
きる。また、プラスミドベクターとしては、例えば、エ
シェリヒア・コリを宿主微生物とする場合には、プラス
ミドｐＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１８４、
ｐＵＣ１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９、ｐ
ＵＣ１１８、ｐＩＮ１などが使用できる。

【００１７】この様なベクターを、サーマスＤＮＡの切
断に使用した制限酵素で生成するＤＮＡ末端と、同じ末
端を生成する制限酵素で切断してベクター断片を作成
し、サーマスＤＮＡ断片とベクター断片とを、ＤＮＡリ
ガーゼ酵素により常法に従って結合させればよい。サー
マスＤＮＡの断片を結合したプラスミドを移入する宿主
微生物としては、組み換えＤＮＡが安定かつ自律的に増
殖可能であればよく、例えば宿主微生物がエシェリヒア
・コリに属する微生物の場合、エシェリヒア・コリＤ
Ｈ１、エシェリヒア・コリＪＭ１０９、エシェリヒア
・コリＷ３１１０、エシェリヒア・コリＣ６００、
等が利用できる。

【００１８】宿主微生物に組み換えＤＮＡを移入する方
法としては、例えば、宿主微生物がエシェリヒア・コリ
に属する微生物の場合には、常法に従ってコンピテント
セル化した宿主菌株に組み換えＤＮＡの移入を行えばよ
い。宿主微生物への目的組み換えＤＮＡ移入の有無につ
いての選択は、上記方法により組換えＤＮＡを移入した
宿主微生物により作成した遺伝子ライブラリーから、３
２Ｐや蛍光体などでラベルした、図３に例示した予め合
成したＰＥＰＣのＤＮＡプローブで、コロニーハイブリ
ダイゼーションやプラークハイブリダイゼーションなど
を行うことによりポジティブ株を選択し、この株を目的
の形質転換体とすればよい。

【００１９】形質転換体からのＰＥＰＣ遺伝子を含むＤ
ＮＡの分離は、常法に従って行えばよい。上述の方法に
よって得られたＰＥＰＣ遺伝子のＤＮＡの塩基配列は、
ジデオキシ法（Ｓａｎｇａｒ，Ｆ．（１９８１）Ｓｃｉ
ｅｎｃｅ，２１４，１２０５−１２１０）で解読すれば
よく、またＰＥＰＣを構成するポリペプチドの全アミノ
酸配列は、塩基配列より予測決定できる。

【００２０】この様にして一度選択された組み換えＤＮ
Ａは、該組み換えＤＮＡを保持する形質転換微生物から
取り出され、他の宿主微生物に移入することも容易に実
施できる。また、さらに、該組み換えＤＮＡから制限酵
素などにより切断してＰＥＰＣを構成するポリペプチド
のアミノ酸配列をコードするＤＮＡを切り出し、前記と
同様な方法により切断して得られる他の開環ベクターの
末端に結合させて新規な特徴を有する組み換えＤＮＡを
作製して、他の宿主微生物に移入することも容易に実施
できる。

【００２１】かくして得られた形質転換体である微生物
は、栄養培地に培養されることによりＰＥＰＣを産生し
得るが、宿主微生物によってはＰＥＰＣ遺伝子を移入す
るだけではＰＥＰＣ生産性を有しない場合がありうる。
このような場合、得られたＰＥＰＣ遺伝子を含むＤＮＡ
断片を、ゾラーの方法による部位特異的変異法（Ｚｏｌ
ｌｅｒ，Ｍ．Ｊ．ａｎｄＳｍｉｔｈ，Ｍ．（１９８
３）ＭｅｔｈｏｄｓｉｎＥｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１
５４，３６７）による制限酵素認識部位の作製や、制限
酵素による切り出しなどにより適切な形態で分離し、該
宿主微生物に適合する遺伝子プロモーター下流にＰＥＰ
Ｃ遺伝子を結合したＤＮＡを組み込んだプラスミドによ
り、新たな形質転換体を作成し、ＰＥＰＣを産生させれ
ばよい。

【００２２】例えば、上記宿主微生物がエシェリヒア・
コリに属する微生物の場合、ＰＥＰＣ遺伝子を接続する
遺伝子プロモーターとしては、ｌａｃＺプロモーター、
ｔａｃプロモーター、Ｔ７プロモーターなどが例示さ
れ、これらのプロモーターの下流にリボソーム結合部位
を介在して、開始コドンＡＴＧやＧＴＧを有するＰＥＰ
Ｃ構造遺伝子を接続し、大腸菌を宿主とするベクターに
組み込み、かくのごとくして作成されたプラスミドで大
腸菌を形質転換すればよい。

【００２３】上記の遺伝子操作に一般的に使用される量
的関係は、供与微生物からのＤＮＡ及びプラスミドＤＮ
Ａを０．１〜１０μｇに対し、制限酵素を約１〜１０
ｕ、リガーゼ約３００ｕ、その他の酵素約１〜１０ｕ程
度が例示される。また、本発明のＰＥＰＣは公知の遺伝
子操作手段によりペプチドのアミノ酸の配列の一部の変
異をなしてもよく、このような部位特異的変異によるム
テインのＤＮＡは、本発明のＰＥＰＣ遺伝子から遺伝子
工学的手法により作製される人工変異遺伝子を意味し、
この人工変異遺伝子は前出の部位特異的変異法や、目的
遺伝子の特定ＤＮＡ断片を人工変異ＤＮＡで置換するな
どの種々なる遺伝子工学的方法を使用して得られ、かく
して取得された人工変異遺伝子のうち特に優れた性質を
有するＰＥＰＣムテインＤＮＡについては最終的にはこ
のムテインＤＮＡをベクターに挿入せしめて組み換えＤ
ＮＡを作成し、これを宿主微生物に移入させることによ
って、ＰＥＰＣムテインの製造が可能である。

【００２４】ＰＥＰＣ遺伝子を含み、宿主微生物にＰＥ
ＰＣを産生させ得るプラスミドの具体的な例示として
は、エシェリヒア・コリに属する微生物を宿主微生物と
するプラスミドｐｌＰＥＰＣ１（またはｐＴＨＰＰＣと
称することもある）が挙げられる（その制限酵素地図を
図４に示した）。このプラスミドｐｌＰＥＰＣ１（また
はｐＴＨＰＰＣと称することもある）を保持するエシェ
リヒア・コリＪＭ１０９をエシェリヒア・コリＪＭ
１０９・ｐｌＰＥＰＣ１（またはエシェリヒア・コリ
ＪＭ１０９ｐＴＨＰＰＣと称することもある）と命名
し、このような形質転換体により該ＰＥＰＣを製造する
に当たっては、該形質転換体を栄養培地で培養して菌体
内又は培養液中に該ＰＥＰＣを産生せしめ、培養終了
後、得られた培養物を濾過又は遠心分離などの手段によ
り菌体を採集し、次いでこの菌体を機械的方法又はリゾ
チームなどの酵素的方法で破壊し、又、必要に応じてＥ
ＤＴＡ及び／又は適当な界面活性剤などを添加して該Ｐ
ＥＰＣの水溶液を濃縮するか、又は濃縮する事なく硫安
分画、ゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー等
の吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフ
ィーにより処理して、純度のよい該ＰＥＰＣを得ること
ができる。

【００２５】形質転換体である微生物の培養条件はその
栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すれば良く、
通常多くの場合は、液体培養で行うが、工業的には深部
通気撹拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源とし
ては、微生物の培養に通常用いられるものが広く使用さ
れうる。炭素源としては、資化可能な炭素化合物であれ
ばよく、例えばグルコース、サッカロース、ラクトー
ス、マルトース、フラクトース、糖蜜などが使用され
る。窒素源としては利用可能な窒素化合物であれば良
く、例えばペプトン、肉エキス、酵母エキス、カゼイン
加水分解物などが使用される。

【００２６】その他、リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグ
ネシウム、カルシウム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛
などの塩類、特定のアミノ酸、特定のビタミンなどが必
要に応じて使用される。培養温度は微生物が発育し、Ｐ
ＥＰＣを生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒ
ア・コリの場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。
培養条件は、条件によって多少異なるが、ＰＥＰＣが最
高終了に達する時期を見計らって適当な時期に培養を終
了すればよく、エシェリヒア・コリの場合、通常は１２
〜４８時間程度である。培地ｐＨは菌が発育し、ＰＥＰ
Ｃを生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・
コリの場合、好ましくはｐＨ６〜８程度である。

【００２７】培養物中のＰＥＰＣは、菌体を含む培養液
そのままを採取し、利用することもできるが、一般には
常法に従って、ＰＥＰＣが培養液中に存在する場合に
は、濾過、遠心分離などによりＰＥＰＣ含有溶液と微生
物菌体とを分離した後に利用される。ＰＥＰＣが菌体内
に存在する場合には、得られた培養物を濾過又は遠心分
離などの手段により、菌体を採取し、次いでこの菌体を
機械的方法又はリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、
又、必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート剤及び／又は界
面活性剤を添加してＰＥＰＣを可溶化し水溶液として分
離採取する。

【００２８】この様にして得られたＰＥＰＣ含有溶液
を、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、更に、硫安、硫酸ナト
リウムなどの塩析処理などによる分別沈澱法により沈澱
せしめればよい。次いでこの沈澱物を、水に溶解し、半
透膜にて透析せしめて、より低分子量の不純物を除去す
ることができる。また、吸着剤あるいはゲル濾過剤など
によるゲル濾過、アフィニティークロマトグラフィー等
の吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフ
ィー等により精製し、これらの手段を用いて得られるＰ
ＥＰＣ含有溶液から、減圧濃縮凍結乾燥等の処理により
精製されたＰＥＰＣが得られる。

【００２９】

【実施例】以下、本発明の実施例を挙げて詳細に説明す
るが、本発明はこれによってなんら限定されるものでは
ない。なお、実施例中、常法に従い、と記述した操作
は、例えば前出のマニアティスらの方法や、市販の各種
酵素、キット類に添付された手順に従えば実施できるも
のである。また、実験に使用した組換えＤＮＡ実験酵素
試薬（制限酵素など）、ベクターＤＮＡ、キット類は特
に指摘しない限り宝酒造株式会社より購入したものであ
る。

【００３０】

【実施例１】＜サーマス・エスピーからのＤＮＡの抽出＞下記高温菌
培地２００ｍｌに、ＰＥＰＣ生産菌であるサーマス・エ
スピー（Ｔｈｅｒｍｕｓｓｐ．）・Ｎｏ．２３株（Ｆ
ＥＲＭＰ−１４４７６）を植菌し６５℃で７日間振盪
培養した。

【００３１】高温菌培地組成１０％Ｍｅｄｉｕｍ１６２２．５％Ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ（ＤＩＦ
ＣＯ社製）２．５％Ｂａｃｔｏｔｒｉｐｔｏｎｅ（ＤＩ
ＦＣＯ社製）１０％リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）ただし、上記の組成について下記に詳細に述べる。Ｍｅｄｉｕｍ１６２組成１．３２ｇ／ｌ酢酸ナトリウム０．４ｇ／ｌ塩化カルシウム２水和物２．０ｇ／ｌ塩化マグネシウム６水和物０．０５ｍＭクエン酸０．５％Ｔｒａｃｅｅｌｅｍｅｎｔｓｏｌ
ｕｔｉｏｎｐＨ７．２（ＮａＯＨ調整）リン酸緩衝液（ｐＨ７．２）組成５．４４ｇ／ｌリン酸２水素カリウム２１．４ｇ／ｌリン酸水素２ナトリウム２水和物Ｔｒａｃｅｅｌｅｍｅｎｔｓｏｌｕｔｉｏｎ組成１２．８ｇ／ｌ酢酸ナトリウム１．０ｇ／ｌ硫酸第１鉄７水和物０．５ｇ／ｌ塩化マンガン４水和物０．３ｇ／ｌ塩化コバルト６水和物０．２ｇ／ｌ塩化亜鉛５０ｍｇ／ｌ塩化銅２水和物５０ｍｇ／ｌモリブデン酸ナトリウム２水和物２０ｍｇ／ｌホウ酸２０ｍｇ／ｌ塩化ニッケル６水和物ｐＨ６．０〜６．５（ＨＣｌ調整）である。

【００３２】培養液を遠心分離（３，０００Ｇ、４℃、
１０分）し、集菌した菌体を２０ｍｌのＴＥＳ（５０ｍ
Ｍトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、５０ｍＭのＥＤ
ＴＡ（ｐＨ８．０）、１５％Ｓｕｃｒｏｓｅ）に懸濁
し、最終濃度が１ｍｇ／ｍｌになるようにリゾチーム
（ＳＩＧＭＡ社製）を加え、３７℃で１０分間処理し、
細胞壁を破壊した。これに１０％ドデシル硫酸ナトリウ
ム（以下ＳＤＳと略す）を０．５ｍｌ加え、さらに２１
ｍｌのフェノールとクロロホルムの１対１混合液を加え
撹拌した後、遠心分離（２５，０００Ｇ、１５分）し、
分離した水層を他の容器に移し、４２ｍｌのエタノール
を加え析出してくる染色体をガラス棒にからめて取得し
た。

【００３３】この染色体を２０ｍｌのＴＥ（１０ｍＭの
トリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡ
（ｐＨ８．０））に溶解し、ＴＥ飽和のフェノールとク
ロロホルムの１対１混和液２０ｍｌを加え、全体を懸濁
した後、同様の遠心分離を繰り返し、上層を再び別の容
器に移した。この分離した上層２０ｍｌに３Ｍ酢酸ナト
リウム緩衝液（ｐＨ５．５）２ｍｌとエタノール５０ｍ
ｌを加え、撹拌後−７０℃で５分間冷却した後、遠心分
離（２，０００Ｇ、４℃、１５分）し、沈澱した染色体
を７５％エタノールで洗い、減圧乾燥した。

【００３４】以上の操作によりサーマス・エスピー・Ｎ
ｏ．２３株の染色体標品１ｍｇを得た。

【００３５】

【実施例２】＜放射性ＤＮＡプローブの作製＞サーマス・エスピー・
Ｎｏ．２３株より生産された酵素ＰＥＰＣを精製し、そ
の部分アミノ酸配列をエドマン分解法により決定した。
判明した部分アミノ酸配列をコードするＰＥＰＣ遺伝子
の塩基配列を予想した。この配列を基に設計されるオリ
ゴヌクレオチドプローブには無数の形状があるが、本発
明ではそのうちＫ２８−２Ｓと命名したオリゴヌクレオ
チドを使用した。Ｋ２８−２Ｓの塩基配列構造を図３の
（１）に示した。

【００３６】このオリゴヌクレオチドを外部機関（ベッ
クス社）に合成依託して作成し、完成したオリゴヌクレ
オチド２００ｎｇをＴ４ポリヌクレオチドキナーゼバッ
ファー（５０ｍＭのＴｒｉｓ塩酸緩衝液（ｐＨ８．
０）、１０ｍＭの塩化マグネシウム、１０ｍＭの２−メ
ルカプトエタノール）および、７４０ｋＢｑ（キロベク
レル）の［γ−３２Ｐ］ＡＴＰ（第一化学薬品社販売）
存在下、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ８．５ｕで３
７℃、３０分間反応せしめ、ラジオアイソトープ３２Ｐ
を取り込ませ放射性オリゴヌクレオチドプローブとし
た。

【００３７】

【実施例３】＜ＰＥＰＣ遺伝子含有ＤＮＡフラグメントの検定＞実施
例１の操作で得られたサーマス・エスピーＮｏ．２３
株の染色体ＤＮＡから遺伝子ライブラリーを作成するた
め、本染色体を各種制限酵素で切断し、目的遺伝子が含
有されるＤＮＡフラグメントの鎖長を検定する操作を行
った。即ち、サーマス・エスピーＮｏ．２３株の染色
体ＤＮＡ（５μｇ）を各種制限酵素で切断し、１％アガ
ロースゲル（同人化学研究所社：ｔｙｐｅ２）で１５０
Ｖ、１．５時間電気泳動し、ナイロンメンブレン（バイ
オラッド社：Ｚｅｔａ−ＰｒｏｂｅＢｌｏｔｔｉｎｇ
Ｍｅｍｂｒａｎｅｓ）に、添付のマニュアルに従って
ＤＮＡをアガロースゲルから移行させた。

【００３８】このメンブレンを風乾後、添付のマニュア
ルに従ってプレハイブリダイゼーションを行い、さらに
実施例２で作成したＫ２８−２Ｓ放射性プローブを使用
したハイブリダイゼーションを５０℃で１晩行った。ハ
イブリダイゼーション後、メンブレンを５０℃の洗浄液
１（３×ＳＳＣ、１０％、１０×デンハルト溶液、５％
ＳＤＳ、５ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）
（ただし、〔１×ＳＳＣ：０．１５Ｍ塩化ナトリウム，
１５ｍＭクエン酸ナトリウム〕、〔１００×デンハルト
溶液：２％ウシ血清アルブミン，２％ポリビニルピロリ
ドン、２％フィコール〕）で３０分洗い（メンブレン１
００平方ｃｍ当り約５０ｍｌ）、続いて５０℃の洗浄液
２（１×ＳＳＣ、１％ＳＤＳ）で（メンブレン１００平
方ｃｍ当り約５０ｍｌ）３０分間洗った後メンブレンを
自然乾燥した。この乾燥したメンブレンをＸ線フィルム
（コダック社製、ＴＭＳ／ＲＡ１）に重ね、遮光下、−
７０℃で２４時間オートラジオグラフィーを行った。

【００３９】オートラジオグラフィー終了後、フィルム
を現像し、各制限酵素による切断染色体が示すポジティ
ブバンドのサイズを観察した。その結果、ＳｐｈＩ切断
により約５〜１０ｋｂ（キロベース：ＤＮＡ鎖長の単
位、１，０００塩基対）のＤＮＡフラグメント上にＰＥ
ＰＣ遺伝子が含有されることが明らかとなり、ＳｐｈＩ
で切断した染色体ＤＮＡの５〜１０ｋｂフラグメントか
ら遺伝子ライブラリーを作成することとした。

【００４０】

【実施例４】＜遺伝子ライブラリーの作成＞実施例１の操作で得られ
たサーマス・エスピーＮｏ．２３株の染色体ＤＮＡ１
２μｇを制限酵素ＳｐｈＩで切断し、常法に従い約５〜
１０ｋｂのＤＮＡフラグメントを分離した。このＤＮＡ
フラグメントを、制限酵素ＳｐｈＩで切断しアルカリフ
ォスファターゼ（以下ＣＩＡＰと略称）１ｕで切断末端
を脱リン酸化したｐＵＣ１９０．６μｇと、ＤＮＡ・
Ｌｉｇａｔｉｏｎ・Ｋｉｔ（宝酒造社製）で連結させ
た。これを用いて、常法に従ってコンピテント細胞とし
たエシェリヒア・コリＪＭ１０９（宝酒造社販売）
（ｒｅｌＡ１，ｓｕｐＥ４４，ｅｎｄＡ１，ｈｓｄＲ１
７，ｇｙｒＡ９６，ｒｅｃＡ１，ｔｈｉ，△（ｌａｃ−
ｐｒｏＡＢ）／Ｆ’［ｔｒａＤ３６，ｐｒｏＡＢ＋，ｌ
ａｃＩｑ，ｌａｃＺ△Ｍ１５］，ｍｃｒＡ−，ｍｃｒＢ
＋（Ｍｅｓｓｉｎｇ，Ｊ．（１９８５）Ｇｅｎｅ，３
３，１１９．））をトランスフォーメーションし、５０
μｇ／ｍｌアンピシリン含有ＬＢ（バクトトリプトン
（ＤＩＦＣＯ社製）１０ｇ／ｌ、酵母エキス（ＤＩＦＣ
Ｏ社製）５ｇ／ｌ、ＮａＣｌ１０ｇ／ｌ）１．５％寒
天平板培地にて一夜培養し、約５，４００個のアンピシ
リン耐性コロニーを得、遺伝子ライブラリーとした。

【００４１】

【実施例５】＜ＰＥＰＣ遺伝子含有クローンのスクリーニング＞実施
例４により得た遺伝子ライブラリーを、ニトロセルロー
スフィルター（ミリポア社製：ＨＡＴＦ０８２５０）に
レプリカし、このフィルターに添付のマニュアルに従っ
て菌体のＤＮＡを固定した。

【００４２】このフィルターを添付のマニュアルに従っ
てプレハイブリダイゼーションおよび、実施例２で調製
したＫ２８−２Ｓプローブを使用したハイブリダイゼー
ションを行った。ハイブリダイゼーション後、メンブレ
ンを実施例３に示した５０℃の洗浄液１で３０分洗い、
続いて同じく５０℃の洗浄液２で３０分間洗った後メン
ブレンを自然乾燥した。この乾燥メンブレンをＸ線フィ
ルムに重ね、遮光下、−７０℃で２４時間オートラジオ
グラフィーを行った。

【００４３】オートラジオグラフィー終了後、フィルム
を現像し、ポジティブシグナルをしめすコロニーを９個
確認した。

【００４４】

【実施例６】＜組み換えプラスミドの抽出＞実施例５で選ばれたポジ
ティブシグナルを示すコロニーを５０μｇ／ｍｌのアン
ピシリン含有ＬＢ液体培地１．５ｍｌに植菌し３７℃で
１６時間振盪培養した後、常法に従ってプラスミドを抽
出した。その結果、９つのコロニーより抽出されたプラ
スミドは同じ染色体ＤＮＡ断片を含むものであり、この
プラスミドのうちの１つをｐＴＰＣＣ２と命名した。

【００４５】

【実施例７】＜ＰＥＰＣ遺伝子塩基配列の決定＞実施例６で得られた
プラスミドｐＴＰＣＣ２より、ＰＥＰＣをコードする部
分についてジデオキシ法により塩基配列を決定した。そ
の結果、このプラスミドにはＰＥＰＣ遺伝子の５’末端
部が含まれていないことが判明し、この部分のクローニ
ングを新たに行うこととした。

【００４６】

【実施例８】＜遺伝子ウォーキングによる全ＰＥＰＣ遺伝子の分離＞
プラスミドｐＴＰＣＣ２を制限酵素ＡｃｃＩで切断し、
ＰＥＰＣ遺伝子の一部を含む５００ｂｐのフラグメント
を、常法に従って分離した。このフラグメントをＤＮＡ
・Ｌａｂｅｌｉｎｇ・Ｋｉｔ（宝酒造社製）を使用し
て、添付のマニュアルにしたがい［α−３２Ｐ］ｄＣＴ
Ｐ（第一化学薬品販売）で放射能ラベルし、ＤＮＡプロ
ーブとした。

【００４７】次に実施例３と同様にして、サーマス・エ
スピー・Ｎｏ．２３株の染色体ＤＮＡを各種制限酵素で
切断し、アガロースゲル電気泳動した染色体ＤＮＡをナ
イロンメンブレンに固定した。このメンブレンを風乾
後、添付のマニュアルに従ってプレハイブリダイゼーシ
ョンを行い、さらに上述のＤＮＡプローブを使用したハ
イブリダイゼーションを６５℃で１晩行った。ハイブリ
ダイゼーション後、メンブレンを６０℃の洗浄液３（１
ｍＭのＥＤＴＡ、４０ｍＭのリン酸ナトリウム緩衝液
（ｐＨ７．２）、５％ＳＤＳ）で２０分２回洗い（メン
ブレン１００平方ｃｍ当り約５０ｍｌ）、続いて洗浄液
４（１ｍＭのＥＤＴＡ、４０ｍＭのリン酸ナトリウム緩
衝液（ｐＨ７．２）、１％ＳＤＳ）で（１００平方ｃｍ
当り約５０ｍｌ）で６５℃２０分間２回と７５℃３０分
２回洗った後メンブレンを自然乾燥した。この乾燥した
メンブレンをＸ線フィルム（コダック社製、ＴＭＳ／Ｒ
Ａ１）に重ね、遮光下、−７０℃で２４時間オートラジ
オグラフィーを行った。

【００４８】オートラジオグラフィー終了後、フィルム
を現像し、各制限酵素による切断染色体が示すポジティ
ブバンドのサイズを観察した。その結果、ＡｃｃＩ切断
により約１．２〜１．５ｋｂのＤＮＡフラグメント上に
ＰＥＰＣ遺伝子の５’末端が含有されることが明らかと
なり、ＡｃｃＩで切断した染色体ＤＮＡの１．２〜１．
５ｋｂフラグメントから新たに遺伝子ライブラリーを作
成することとした。

【００４９】実施例１の操作で得られたサーマス・エス
ピー・Ｎｏ．２３株の染色体ＤＮＡ１２μｇを制限酵素
ＡｃｃＩで切断し、ＤＮＡ・Ｂｌｕｎｔｉｎｇ・Ｋｉｔ
（宝酒造社製）で末端を平滑化した後、常法に従い約１
〜１．５ｋｂのＤＮＡフラグメントを分離した。このＤ
ＮＡフラグメント０．５μｇを、制限酵素ＳｍａＩで切
断しＣＩＡＰの１ｕで切断末端を脱リン酸化したｐＵＣ
１９の０．６μｇと、ＤＮＡ・Ｌｉｇａｔｉｏｎ・Ｋｉ
ｔで連結させた。これを用いて、常法に従ってコンピテ
ント細胞としたエシェリヒア・コリＪＭ１０９をトラ
ンスフォーメーションし、５０μｇ／ｍｌアンピシリン
含有ＬＢ１．５％寒天平板培地にて一夜培養し、約１，
２００個のアンピシリン耐性コロニーを得、遺伝子ライ
ブラリーとした。

【００５０】この遺伝子ライブラリーを、ニトロセルロ
ースフィルター（ミリポア社製：ＨＡＴＦ０８２５０）
にレプリカし、このフィルターに添付のマニュアルに従
って菌体のＤＮＡを固定した。このフィルターを添付の
マニュアルに従ってプレハイブリダイゼーションおよ
び、ＡｃｃＩフラグメントＤＮＡプローブを使用したハ
イブリダイゼーションを行った。

【００５１】ハイブリダイゼーション後、メンブレンを
上記の６０℃の洗浄液３で２０分２回洗い、続いて洗浄
液４でで６５℃、２０分間２回と７５℃、３０分の２回
洗った後メンブレンを自然乾燥した。この乾燥メンブレ
ンをＸ線フィルムに重ね、遮光下、−７０℃で２４時間
オートラジオグラフィーを行った。オートラジオグラフ
ィー終了後、フィルムを現像し、ポジティブシグナルを
しめすコロニーを８個確認した。

【００５２】この８個のコロニーを５０μｇ／ｍｌのア
ンピシリン含有ＬＢ液体培地１．５ｍｌに植菌し３７℃
で１６時間振盪培養した後、常法に従ってプラスミドを
抽出した。その結果、８つのコロニーより抽出されたプ
ラスミドは同じ染色体ＤＮＡ断片を含むものであり、こ
のプラスミドのうちの１つをｐＴＰＣＮ１と命名した。

【００５３】このプラスミドよりＰＥＰＣをコードする
部分について、再びジデオキシ法により塩基配列を決定
し、ＰＥＰＣ遺伝子の全塩基配列を決定するに至った。

【００５４】

【実施例９】＜部位特異的変異用オリゴヌクレオチドプライマーの作
製＞高効率なＰＥＰＣ発現プラスミドを作製するため
に、ＰＥＰＣ遺伝子の開始コドン上にＢｓｐＨＩ制限酵
素サイトを作製するためのオリゴヌクレオチドプライマ
ーＰＣ−Ｂ１を、外部機関（ベックス社）へ合成依託し
て作成した。ＰＣ−Ｂ１の塩基配列構造を図３の（２）
に示した。

【００５５】

【実施例１０】＜ＰＥＰＣ発現用プラスミドｐｌＰＥＰＣ１の作製＞オ
リゴヌクレオチドプライマーＰＣ−Ｂ１を使用し、ゾラ
ーの方法によりプラスミドｐＴＰＣＮ１に部位特異的変
異を施し、ＰＥＰＣ遺伝子の開始コドンＡＴＧ上にＢｓ
ｐＨＩ制限酵素サイトを付加したプラスミドをｐＴＰＣ
Ｎ１Ｓとして回収した。

【００５６】次に、２μｇのプラスミドｐＴＰＣＮ１Ｓ
をＢｓｐＨＩとＳｐｈＩで切断し、ＰＥＰＣ遺伝子を含
む約３００ｂｐのＤＮＡフラグメントを分離し、Ｎｃｏ
ＩとＳｐｈＩで切断し、ＣＩＡＰで末端の脱リン酸化を
行ったｐＴＶ１１９Ｎ（宝酒造社製）１００ｎｇとＤＮ
Ａ・Ｌｉｇａｔｉｏｎ・Ｋｉｔで連結し、これを用い
て、コンピテント細胞としたエシェリヒア・コリＪＭ
１０９を形質転換した。この形質転換体より実施例６で
示したのと同様の方法でプラスミドを抽出、精製し、こ
のプラスミドをｐｃＰＥＰＣ３と命名した。

【００５７】次に、２μｇのプラスミドｐＴＰＣＣ２を
制限酵素ＳｐｈＩとＰｓｔＩで切断し、ＰＥＰＣ遺伝子
を含む約３．５ｋｂのＤＮＡフラグメントを分離し、Ｓ
ｐｈＩとＰｓｔＩで切断し、ＣＩＡＰで末端を脱リン酸
化したｐｃＰＥＰＣ３の１００ｎｇと、ＤＮＡ・Ｌｉｇ
ａｔｉｏｎ・Ｋｉｔで連結させた。これを用いて、コン
ピテント細胞としたエシェリヒア・コリＪＭ１０９を
形質転換した。この形質転換体より常法に従ってプラス
ミドを抽出、精製し、このプラスミドをｐｌＰＥＰＣ１
と命名した。また、プラスミドｐｌＰＥＰＣ１を保持す
るエシェリヒア・コリＪＭ１０９をエシェリヒア・コ
リ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＪＭ１０９・
ｐｌＰＥＰＣ１（ＦＥＲＭＰ−１４４７７）と命名し
た。ｐｌＰＥＰＣ１の保持するサーマス・エスピー・Ｎ
ｏ．２３由来約４．１ｋｂＤＮＡフラグメント中のＰＥ
ＰＣ遺伝子の塩基配列を図２に、そのコードするＰＥＰ
Ｃ蛋白質のアミノ酸配列を図１に示した。

【００５８】

【実施例１１】＜ｐｌＰＥＰＣ１保持大腸菌の培養とその細胞抽出液の
調製＞エシェリヒア・コリＪＭ１０９・ｐｌＰＥＰＣ
１（ＦＥＲＭＰ−１４４７７）を５０μｇ／ｍｌのア
ンピシリン及び１ｍＭのＩＰＴＧ（和光純薬社製）を含
有した３．７％ＢＨＩ（ＤＩＦＣＯ社製）液体培地
１．５ｍｌで３７℃、１６時間培養し、そのうち１ｍｌ
を遠心分離（１５，０００Ｇ、１分、４℃）により集菌
し、２００μｌの１０ｍＭのトリス塩酸緩衝液（ｐＨ
８．０）を加え、超音波破砕機を用いて菌体を破砕した
後、遠心分離（１４，０００Ｇ、５分、４℃）し、上清
を取得して細胞抽出液とした。同様に、ＰＥＰＣ遺伝子
を含まないクローニングベクターｐＴＶ１１９Ｎにより
形質転換されたエシェリヒア・コリＪＭ１０９・ｐＴＶ
１１９Ｎの抽出液も調製した。さらに両抽出液につい
て、耐熱性ＰＥＰＣの活性のみを検定するために６５℃
で１０分熱処理した。

【００５９】

【実施例１２】＜細胞抽出液中のＰＥＰＣ酵素活性の確認＞実施例１０
で調製したエシェリヒア・コリＪＭ１０９・ｐｌＰＥ
ＰＣ１、およびエシェリヒア・コリＪＭ１０９・ｐＴ
Ｖ１１９Ｎの細胞抽出液中のＰＥＰＣ酵素活性を、以下
のＰＥＰＣ酵素活性測定法によって測定した。

【００６０】反応液組成反応液：１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．５）、
５ｍＭの塩化マグネシウム、１０ｍＭの炭酸水素カリウ
ム、２ｍＭのアセチル−ＣｏＡ、０．２５ｍＭのＮＡＤ
Ｈ、５ｍＭのホスホエノールピルビン酸、２ｕ／ｍｌの
リンゴ酸脱水素酵素酵素活性測定酵素反応液１ｍｌを３７℃で５分間インキュベートした
後に、適当に希釈した酵素液０．０５ｍｌを添加して撹
拌し、３７℃で反応を開始し、反応中の３４０ｎｍの吸
光度の減少を測定し、減少度が直線になる領域において
１分当りの吸光度の減少率を求め、これを△Ａとした。
また、上記反応液よりホスホエノールピルビン酸を除い
た反応液で同様の測定を行い、１分当りの吸光度の減少
率を△Ａｂとした。以上により求めた△Ａおよび△Ａｂ
から下式により酵素液の活性が求められる。

【００６１】

【数１】

【００６２】上記の方法により測定した活性の結果を表
１に示した。これによりエシェリヒア・コリＪＭ１０
９・ｐｌＰＥＰＣ１でのＰＥＰＣの活性発現が確認され
た。

【００６３】

【表１】

【００６４】さらに単離、精製して以下の物理化学的性
質を確認した。（１）酵素作用下記式に示した通り、ホスホエノールピルビン酸と二酸
化炭素と水からオキサロ酢酸と遊離リン酸を不可逆的に
生成する反応を触媒する。

【００６５】

【化１】

【００６６】（２）分子量単量体：９５，５００（アミノ酸配列からの計算値）。
ただし、成熟酵素蛋白は４量体である。（３）等電点ｐＨ５．２±０．５（等電点電気泳動用カラム（ＬＫＢ
社製）、キャリアーアンフォラインｐＨ３．５〜１０．
０（ＬＫＢ社製）を用い、７００Ｖ、４８時間通電した
後、カラム（２４×３０ｃｍ）から２ｍｌずつ分画し、
それぞれの画分のｐＨと活性を測定することによる。）（４）熱安定性１００ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ８．０）に本酵素を
溶解し、各温度で３０分間加熱処理した後、その残存活
性を測定した結果、本酵素は少なくとも８０℃以下では
安定であり、耐熱性酵素であった。（５）至適温度３０℃、３５℃、４０℃、５０℃、６０℃の各温度にお
いて酵素活性を測定した結果、本酵素は４０℃±５℃に
至適温度を有した。（６）ｐＨ安定性本酵素を５０ｍＭのジメチルグルタル酸−水酸化ナトリ
ウム緩衝液（ｐＨ５．０〜７．０）、トリス塩酸緩衝液
（ｐＨ６．５〜９．０）、グリシン−水酸化ナトリウム
緩衝液（ｐＨ８．５〜１０．０）に溶解し、８０℃で３
０分間処理した後、その残存活性を後記の酵素活性測定
法に従って測定した。その結果、本酵素はｐＨ７．０〜
９．０の範囲で安定であった。（７）至適ｐＨ後記の酵素活性測定法の反応液にジメチルグルタル酸−
水酸化ナトリウム緩衝液（ｐＨ５．０〜７．０）、トリ
ス塩酸緩衝液（ｐＨ６．５〜９．０）、グリシン−水酸
化ナトリウム緩衝液（ｐＨ８．５〜１０．０）を加えて
酵素活性を測定した結果、本酵素はｐＨ８．０〜９．０
に至適ｐＨを有した。

【００６７】

【発明の効果】ＰＥＰＣの部分アミノ酸配列に基づいて
合成したオリゴヌクレオチドを使用して、ＰＥＰＣ生産
菌株に由来する染色体ＤＮＡライブラリーからＰＥＰＣ
遺伝子の全ＤＮＡ配列を明確とした新規なＰＥＰＣ遺伝
子を分離したもので、該ＰＥＰＣ遺伝子を利用して、高
効率な耐熱性ＰＥＰＣの生産が可能になった。

【００６８】

【配列表】

配列番号：１配列の長さ：２５６８配列の型：核酸鎖の数：二本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ起源生物名：サーマス・エスピー（Ｔｈｅｒｍｕｓｓ
ｐ．）株名：Ｎｏ．２３配列の特徴ＰＣＤＳ配列 AGC GAC CCC TTT GAG GCC CTA AAG GCC GAG GTG GAC CTC TTG GGC CGC 48 Ser Asp Pro Phe Glu Ala Leu Lys Ala Glu Val Asp Leu Leu Gly Arg 1 5 10 15 CTC CTT GGG GAG GCG ATA AGG AAG GTC TCC GGG GAG CGC TTC TTC GCC 96 Leu Leu Gly Glu Ala Ile Arg Lys Val Ser Gly Glu Arg Phe Phe Ala 20 25 30 TTG GTG GAG GAG GTG CGC CTC CTT TCC AAG GCG AGG CGC CAA GGG GAC 144 Leu Val Glu Glu Val Arg Leu Leu Ser Lys Ala Arg Arg Gln Gly Asp 35 40 45 GGG GCG GCG GCC GAG GTC CTT TCC CAA CGG GTG GAG CGC ATG CCC GTG 192 Gly Ala Ala Ala Glu Val Leu Ser Gln Arg Val Glu Arg Met Pro Val 50 55 60 GAG GAG ATG GAA GCG CTG GTG CGG GCC TTC ACC CAC TAC TTC CAC CTG 240 Glu Glu Met Glu Ala Leu Val Arg Ala Phe Thr His Tyr Phe His Leu 65 70 75 80 GTG AAC CTG GCG GAG GAG CGC CAC CGG GTG CGG GTG AAC CGT CTC AGG 288 Val Asn Leu Ala Glu Glu Arg His Arg Val Arg Val Asn Arg Leu Arg 85 90 95 ACG GAG GGG GAA ACC CTG GAA AAC CCC AGG CCC GAG GGC TTT TTG GCC 336 Thr Glu Gly Glu Thr Leu Glu Asn Pro Arg Pro Glu Gly Phe Leu Ala 100 105 110 CTG GCC AAG GCC CTG AAG GAG CGG GGC CTC TCC CTG GAG GAG GCC GAG 384 Leu Ala Lys Ala Leu Lys Glu Arg Gly Leu Ser Leu Glu Glu Ala Glu 115 120 125 GCC CAT CTG AAC CGG TTA GCG CTC CTC CTC ACC TTC ACC GCC CAT CCC 432 Ala His Leu Asn Arg Leu Ala Leu Leu Leu Thr Phe Thr Ala His Pro 130 135 140 ACG GAG ACC CGG CGC CGC ACC CTC CGG CAC CAC TTG GAA AGG CTT CAG 480 Thr Glu Thr Arg Arg Arg Thr Leu Arg His His Leu Glu Arg Leu Gln 145 150 155 160 GAG GAA TTG GAA GGG GGG GAC CGG GAG CGC CTT TTG GCC CGG GTT GTC 528 Glu Glu Leu Glu Gly Gly Asp Arg Glu Arg Leu Leu Ala Arg Val Val 165 170 175 CTC CTC TAC GCC ACG GAG GAG GTG CGC AAG GCG CGG CCC AGC GTG GAG 576 Leu Leu Tyr Ala Thr Glu Glu Val Arg Lys Ala Arg Pro Ser Val Glu 180 185 190 GAC GAG ATC AAG GGA GGG CTT TAC TAC CTC CCC ACC ACC CTG TGG CGG 624 Asp Glu Ile Lys Gly Gly Leu Tyr Tyr Leu Pro Thr Thr Leu Trp Arg 195 200 205 GCC ATC CCC AAG GTG GTG GAG GGC CTC GAG GCC GCC CTG GAA CGG GTC 672 Ala Ile Pro Lys Val Val Glu Gly Leu Glu Ala Ala Leu Glu Arg Val 210 215 220 TAC GGC AAG CGC CCC CAC CTC AGA AGC CCC GTG CGC TTC CGC AGC TGG 720 Tyr Gly Lys Arg Pro His Leu Arg Ser Pro Val Arg Phe Arg Ser Trp 225 230 235 240 ATG GGC GGG GAC CGG GAC GGG AAC CCC TAC GTC ACC CCC GAG GTC ACC 768 Met Gly Gly Asp Arg Asp Gly Asn Pro Tyr Val Thr Pro Glu Val Thr 245 250 255 GCC TTT GCC GGC CGC TAC GCC CGG GAG GTG GCC AAG GGG CGG TAC CTA 816 Ala Phe Ala Gly Arg Tyr Ala Arg Glu Val Ala Lys Gly Arg Tyr Leu 260 265 270 GAG GAG TTG GAA GCC TTG GTG CGG GAC CTC TCC CTT TCC GAG GCC CGT 864 Glu Glu Leu Glu Ala Leu Val Arg Asp Leu Ser Leu Ser Glu Ala Arg 275 280 285 ATC CCC GTG CCC AAG GAG GTG CGG GAG GGG GGG GAA GGG GTG GAG CGC 912 Ile Pro Val Pro Lys Glu Val Arg Glu Gly Gly Glu Gly Val Glu Arg 290 295 300 TTT CCC GGG GAG CCT TAC CGC CGC TAC TTC GCC GCC CTT TAC CGG GCC 960 Phe Pro Gly Glu Pro Tyr Arg Arg Tyr Phe Ala Ala Leu Tyr Arg Ala 305 310 315 320 TTG GAA GGG GAG GCC CTT TCC ACC GAA GGG CTG GCC CGG GCT TTG AAG 1008 Leu Glu Gly Glu Ala Leu Ser Thr Glu Gly Leu Ala Arg Ala Leu Lys 325 330 335 GTG GCG GAA AAG GGC CTC GAG GGG GTG GGG CTT GCC CAG GTG GCG CAG 1056 Val Ala Glu Lys Gly Leu Glu Gly Val Gly Leu Ala Gln Val Ala Gln 340 345 350 GCC TTT CTG CGG CCT CTG GAG GCG CGG CTT TCC GCT TTC GGC CTG GAG 1104 Ala Phe Leu Arg Pro Leu Glu Ala Arg Leu Ser Ala Phe Gly Leu Glu 355 360 365 CTT GCC CCC TTG GAC CTG AGG GAG GAA TCC GGA AAG CTC CTG GAG GCT 1152 Leu Ala Pro Leu Asp Leu Arg Glu Glu Ser Gly Lys Leu Leu Glu Ala 370 375 380 GCC GCA GAG CTT CTC CGC TTG GGC GGG GTT CAC CCG GAC TTC CTG GCC 1200 Ala Ala Glu Leu Leu Arg Leu Gly Gly Val His Pro Asp Phe Leu Ala 385 390 395 400 CTC TCC CCG GAG GAA AAG GAA GCC CTC CTC ACG GAA GAG CTC AAG ACC 1248 Leu Ser Pro Glu Glu Lys Glu Ala Leu Leu Thr Glu Glu Leu Lys Thr 405 410 415 GCC CGC CCC CTT CTG CCC GTT GGG GAG GTG CCG CAG GGG GAG GCG CTC 1296 Ala Arg Pro Leu Leu Pro Val Gly Glu Val Pro Gln Gly Glu Ala Leu 420 425 430 CGG GTG GCC CTG GGG GCC CTT CGG GCC TGG GGG GAC AAG GGG GCC CAC 1344 Arg Val Ala Leu Gly Ala Leu Arg Ala Trp Gly Asp Lys Gly Ala His 435 440 445 GTG GTC TCC ATG ACC CAC CAC CCC GCC GAC CTC CTC GCC GTC TTC CTC 1392 Val Val Ser Met Thr His His Pro Ala Asp Leu Leu Ala Val Phe Leu 450 455 460 CTG GCC CGG GAG GTG GGG CTC TAC CGT CCG GGG AAG CCC CTC CCC TTT 1440 Leu Ala Arg Glu Val Gly Leu Tyr Arg Pro Gly Lys Pro Leu Pro Phe 465 470 475 480 GAC GTG GTC CCC CTC TTT GAG ACC CTG GAG GAC CTG GAG CGG GCG CCC 1488 Asp Val Val Pro Leu Phe Glu Thr Leu Glu Asp Leu Glu Arg Ala Pro 485 490 495 GAG GTC CTA AGG CGC CTC TTG GCC AAC CCC GTC TTC CGG GCC CAC GCC 1536 Glu Val Leu Arg Arg Leu Leu Ala Asn Pro Val Phe Arg Ala His Ala 500 505 510 CAG GGA AGG GGC GGG GTG GAG GTG ATG ATC GGC TAC TCC GAT TCC AAC 1584 Gln Gly Arg Gly Gly Val Glu Val Met Ile Gly Tyr Ser Asp Ser Asn 515 520 525 AAG GAT GCG GGA TTC CTC ATG GCC AAC CTG GCC CTT TAC CAG GCC CAG 1632 Lys Asp Ala Gly Phe Leu Met Ala Asn Leu Ala Leu Tyr Gln Ala Gln 530 535 540 GAG GCC CTC CAC GCC GTG GGG GAA GCC CAG GGT ATC CCC GTC TTC TTC 1680 Glu Ala Leu His Ala Val Gly Glu Ala Gln Gly Ile Pro Val Phe Phe 545 550 555 560 TTC CAC GGG CGG GGT ACC TCC ACC GCC CGG GGT GGG GGG CCG GCG GGG 1728 Phe His Gly Arg Gly Thr Ser Thr Ala Arg Gly Gly Gly Pro Ala Gly 565 570 575 CGG GCC ATC GCC GGC CTC CCC CCC AAG AGC GTG GGC CAC CGC CTG CGC 1776 Arg Ala Ile Ala Gly Leu Pro Pro Lys Ser Val Gly His Arg Leu Arg 580 585 590 CTC ACG GAG CAG GGG GAG GCC TTG GCG GAC CGG TAC GCC CAC CCC GAC 1824 Leu Thr Glu Gln Gly Glu Ala Leu Ala Asp Arg Tyr Ala His Pro Asp 595 600 605 CTG GCC GTG CGC CAC CTG GAG CAA CTC CTG TAC CAC TTC GCC CAG GCC 1872 Leu Ala Val Arg His Leu Glu Gln Leu Leu Tyr His Phe Ala Gln Ala 610 615 620 GCC CTG GGG GAT GGG GTG GAG CCC AAG GCC CAT TGG CGC GAG GCG CTA 1920 Ala Leu Gly Asp Gly Val Glu Pro Lys Ala His Trp Arg Glu Ala Leu 625 630 635 640 GGG GAG GCC GGG GAG AGG AGC ATG GCC CGC TAC CGG GCC CTC CTT TCC 1968 Gly Glu Ala Gly Glu Arg Ser Met Ala Arg Tyr Arg Ala Leu Leu Ser 645 650 655 CAA GAG GGA TTT TTC CCC TTC TTT GAG GCT TTT ACC CCC ATT CGC GAG 2016 Gln Glu Gly Phe Phe Pro Phe Phe Glu Ala Phe Thr Pro Ile Arg Glu 660 665 670 ATC GGC GAA CTC CCC ATC GCC AGC CGC CCC GTC TAC CGC CAC GGC CGG 2064 Ile Gly Glu Leu Pro Ile Ala Ser Arg Pro Val Tyr Arg His Gly Arg 675 680 685 GTG CGG GAT ATC CGG GAC CTA AGG GCC ATC CCC TGG GTC ATG GCC TGG 2112 Val Arg Asp Ile Arg Asp Leu Arg Ala Ile Pro Trp Val Met Ala Trp 690 695 700 ACC CAG GTG CGC CTC CTC CTG CCG GGG TGG TAC GGG CTT TCC GCC CTG 2160 Thr Gln Val Arg Leu Leu Leu Pro Gly Trp Tyr Gly Leu Ser Ala Leu 705 710 715 720 GAA GGC CTG CCC ATG CCC CTC CTC AGG GAG ATG TAC CGG GAG TGG CCC 2208 Glu Gly Leu Pro Met Pro Leu Leu Arg Glu Met Tyr Arg Glu Trp Pro 725 730 735 TTT TTC GCC ACC ACC TTG GAA AGC GCC GCC ATG GCC TTG GCC AAA GCG 2256 Phe Phe Ala Thr Thr Leu Glu Ser Ala Ala Met Ala Leu Ala Lys Ala 740 745 750 GAT CTG GGC ATC GCC GAG CGT TAC CTC AAG CTG GTC CCC GAA GGG CTC 2304 Asp Leu Gly Ile Ala Glu Arg Tyr Leu Lys Leu Val Pro Glu Gly Leu 755 760 765 CAG GGC TTC TAC CAC CAC CTG GCG GAG GAG TAC CGC AGG ACG GTG GCC 2352 Gln Gly Phe Tyr His His Leu Ala Glu Glu Tyr Arg Arg Thr Val Ala 770 775 780 CTT TTG GAG GCT ATC TTT GAA GCC CCC CTC CTC CAC AAC CAA AAG ACC 2400 Leu Leu Glu Ala Ile Phe Glu Ala Pro Leu Leu His Asn Gln Lys Thr 785 790 795 800 CTG GAG CGC CAG ATC GCC CTC AGG AAC CCC TAC GTG GAC CCC ATC AAC 2448 Leu Glu Arg Gln Ile Ala Leu Arg Asn Pro Tyr Val Asp Pro Ile Asn 805 810 815 TTC GTG CAG GTG GAG CTC CTT GCC CGC TAC CGG GCC CCA GGG GGG CGG 2496 Phe Val Gln Val Glu Leu Leu Ala Arg Tyr Arg Ala Pro Gly Gly Arg 820 825 830 GAG GAC GAG GGG GTG CGG CGG GCG TTG CTC CTT TCC CTC CTG GGG GTG 2544 Glu Asp Glu Gly Val Arg Arg Ala Leu Leu Leu Ser Leu Leu Gly Val 835 840 845 GCG GCG GGG CTT AGG AAC GCC GGC 2568 Ala Ala Gly Leu Arg Asn Ala Gly 850 855

【００６９】

【配列表】

配列番号：２配列の長さ：２３配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Ｏｔｈｅｒｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ
（合成ＤＮＡ）配列の特徴ＳＣＤＳ配列 ATY AAC TTY GTS CAG GTS GAG YT 23 Ile Asn Phe Val Gln Val Glu Leu 1 5

【００７０】

【配列表】

配列番号：３配列の長さ：１９配列の型：核酸鎖の数：一本鎖トポロジー：直鎖状配列の種類：Ｏｔｈｅｒｎｕｃｌｅｉｃａｃｉｄ
（合成ＤＮＡ）配列 GGAGTCATGA GCGACCCCT 19

【図面の簡単な説明】

【図１】図１はホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
ーゼを構成するポリペプチドのアミノ酸配列を示す。

【図２】図２はホスホエノールピルビン酸カルボキシラ
ーゼを構成するポリペプチドのアミノ酸配列をコードす
るＤＮＡを示す。

【図３】図３は実施例のホスホエノールピルビン酸カル
ボキシラーゼ遺伝子の選択に使用されたオリゴヌクレオ
チドプローブの塩基配列構造を示す。

【図４】図４はプラスミドｐｌＰＥＰＣ１の制限酵素地
図を示す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 //(Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/88 Ｃ１２Ｒ 1:19）Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】下記のアミノ酸配列をコードするヌクレ
オチド配列から実質的になるＮ末端側よりＳｅｒＡｓｐＰｒｏＰｈｅＧｌｕＡｌａＬｅｕＬｙｓＡｌａＧｌｕＡｓｐＬｅｕＬｅｕＧｌｙＡｒｇＬｅｕＬｅｕＧｌｙＧｌｕＡｌａＩｌｅＡｒｇＬｙｓＶａｌＳｅｒＧｌｙＧｌｕＰｈｅＰｈｅＡｌａＬｅｕＶａｌＧｌｕＧｌｕＶａｌＡｒｇＬｅｕＬｅｕＳｅｒＬｙｓＡｌａＡｒｇＡｒｇＧｌｎＡｓｐＧｌｙＡｌａＡｌａＡｌａＧｌｕＶａｌＬｅｕＳｅｒＧｌｎＡｒｇＶａｌＧｌｕＡｒｇＭｅｔＰｒｏＶａｌＧｌｕＭｅｔＧｌｕＡｌａＬｅｕＶａｌＡｒｇＡｌａＰｈｅＴｈｒＨｉｓＴｙｒＰｈｅＨｉｓＬｅｕＶａｌＡｓｎＡｌａＧｌｕＧｌｕＡｒｇＨｉｓＡｒｇＶａｌＡｒｇＶａｌＡｓｎＡｒｇＬｅｕＡｒｇＴｈｒＧｌｕＧｌｙＧｌｕＬｅｕＧｌｕＡｓｎＰｒｏＡｒｇＰｒｏＧｌｕＧｌｙＰｈｅＬｅｕＡｌａＬｅｕＡｌａＬｙｓＡｌａＬｅｕＬｙｓＡｒｇＧｌｙＬｅｕＳｅｒＬｅｕＧｌｕＧｌｕＡｌａＧｌｕＡｌａＨｉｓＬｅｕＡｓｎＡｒｇＬｅｕＡｌａＬｅｕＬｅｕＴｈｒＰｈｅＴｈｒＡｌａＨｉｓＰｒｏＴｈｒＧｌｕＴｈｒＡｒｇＡｒｇＡｒｇＴｈｒＬｅｕＡｒｇＨｉｓＬｅｕＧｌｕＡｒｇＬｅｕＧｌｎＧｌｕＧｌｕＬｅｕＧｌｕＧｌｙＧｌｙＡｓｐＡｒｇＧｌｕＡｒｇＬｅｕＬｅｕＡｒｇＶａｌＶａｌＬｅｕＬｅｕＴｙｒＡｌａＴｈｒＧｌｕＧｌｕＶａｌＡｒｇＬｙｓＡｌａＡｒｇＰｒｏＳｅｒＧｌｕＡｓｐＧｌｕＩｌｅＬｙｓＧｌｙＧｌｙＬｅｕＴｙｒＴｙｒＬｅｕＰｒｏＴｈｒＴｈｒＬｅｕＴｒｐＡｒｇＩｌｅＰｒｏＬｙｓＶａｌＶａｌＧｌｕＧｌｙＬｅｕＧｌｕＡｌａＡｌａＬｅｕＧｌｕＡｒｇＶａｌＴｙｒＧｌｙＡｒｇＰｒｏＨｉｓＬｅｕＡｒｇＳｅｒＰｒｏＶａｌＡｒｇＰｈｅＡｒｇＳｅｒＴｒｐＭｅｔＧｌｙＧｌｙＡｓｐＡｓｐＧｌｙＡｓｎＰｒｏＴｙｒＶａｌＴｈｒＰｒｏＧｌｕＶａｌＴｈｒＡｌａＰｈｅＡｌａＧｌｙＡｒｇＴｙｒＡｒｇＧｌｕＶａｌＡｌａＬｙｓＧｌｙＡｒｇＴｙｒＬｅｕＧｌｕＧｌｕＬｅｕＧｌｕＡｌａＬｅｕＶａｌＡｒｇＬｅｕＳｅｒＬｅｕＳｅｒＧｌｕＡｌａＡｒｇＩｌｅＰｒｏＶａｌＰｒｏＬｙｓＧｌｕＶａｌＡｒｇＧｌｕＧｌｙＧｌｕＧｌｙＶａｌＧｌｕＡｒｇＰｈｅＰｒｏＧｌｙＧｌｕＰｒｏＴｙｒＡｒｇＡｒｇＴｙｒＰｈｅＡｌａＡｌａＴｙｒＡｒｇＡｌａＬｅｕＧｌｕＧｌｙＧｌｕＡｌａＬｅｕＳｅｒＴｈｒＧｌｕＧｌｙＬｅｕＡｌａＡｒｇＡｌａＬｙｓＶａｌＡｌａＧｌｕＬｙｓＧｌｙＬｅｕＧｌｕＧｌｙＶａｌＧｌｙＬｅｕＡｌａＧｌｎＶａｌＡｌａＧｌｎＰｈｅＬｅｕＡｒｇＰｒｏＬｅｕＧｌｕＡｌａＡｒｇＬｅｕＳｅｒＡｌａＰｈｅＧｌｙＬｅｕＧｌｕＬｅｕＡｌａＬｅｕＡｓｐＬｅｕＡｒｇＧｌｕＧｌｕＳｅｒＧｌｙＬｙｓＬｅｕＬｅｕＧｌｕＡｌａＡｌａＡｌａＧｌｕＬｅｕＡｒｇＬｅｕＧｌｙＧｌｙＶａｌＨｉｓＰｒｏＡｓｐＰｈｅＬｅｕＡｌａＬｅｕＳｅｒＰｒｏＧｌｕＧｌｕＬｙｓＡｌａＬｅｕＬｅｕＴｈｒＧｌｕＧｌｕＬｅｕＬｙｓＴｈｒＡｌａＡｒｇＰｒｏＬｅｕＬｅｕＰｒｏＶａｌＧｌｙＶａｌＰｒｏＧｌｎＧｌｙＧｌｕＡｌａＬｅｕＡｒｇＶａｌＡｌａＬｅｕＧｌｙＡｌａＬｅｕＡｒｇＡｌａＴｒｐＡｓｐＬｙｓＧｌｙＡｌａＨｉｓＶａｌＶａｌＳｅｒＭｅｔＴｈｒＨｉｓＨｉｓＰｒｏＡｌａＡｓｐＬｅｕＬｅｕＶａｌＰｈｅＬｅｕＬｅｕＡｌａＡｒｇＧｌｕＶａｌＧｌｙＬｅｕＴｙｒＡｒｇＰｒｏＧｌｙＬｙｓＰｒｏＬｅｕＰｈｅＡｓｐＶａｌＶａｌＰｒｏＬｅｕＰｈｅＧｌｕＴｈｒＬｅｕＧｌｕＡｓｐＬｅｕＧｌｕＡｒｇＡｌａＰｒｏＶａｌＬｅｕＡｒｇＡｒｇＬｅｕＬｅｕＡｌａＡｓｎＰｒｏＶａｌＰｈｅＡｒｇＡｌａＨｉｓＡｌａＧｌｎＧｌｙＧｌｙＧｌｙＶａｌＧｌｕＶａｌＭｅｔＩｌｅＧｌｙＴｙｒＳｅｒＡｓｐＳｅｒＡｓｎＬｙｓＡｓｐＡｌａＧｌｙＬｅｕＭｅｔＡｌａＡｓｎＬｅｕＡｌａＬｅｕＴｙｒＧｌｎＡｌａＧｌｎＧｌｕＡｌａＬｅｕＨｉｓＡｌａＶａｌＧｌｕＡｌａＧｌｎＧｌｙＩｌｅＰｒｏＶａｌＰｈｅＰｈｅＰｈｅＨｉｓＧｌｙＡｒｇＧｌｙＴｈｒＳｅｒＴｈｒＡｒｇＧｌｙＧｌｙＧｌｙＰｒｏＡｌａＧｌｙＡｒｇＡｌａＩｌｅＡｌａＧｌｙＬｅｕＰｒｏＰｒｏＬｙｓＳｅｒＧｌｙＨｉｓＡｒｇＬｅｕＡｒｇＬｅｕＴｈｒＧｌｕＧｌｎＧｌｙＧｌｕＡｌａＬｅｕＡｌａＡｓｐＡｒｇＴｙｒＨｉｓＰｒｏＡｓｐＬｅｕＡｌａＶａｌＡｒｇＨｉｓＬｅｕＧｌｕＧｌｎＬｅｕＬｅｕＴｙｒＨｉｓＰｈｅＡｌａＡｌａＡｌａＬｅｕＧｌｙＡｓｐＧｌｙＶａｌＧｌｕＰｒｏＬｙｓＡｌａＨｉｓＴｒｐＡｒｇＧｌｕＡｌａＬｅｕＧｌｕＡｌａＧｌｙＧｌｕＡｒｇＳｅｒＭｅｔＡｌａＡｒｇＴｙｒＡｒｇＡｌａＬｅｕＬｅｕＳｅｒＧｌｎＧｌｕＰｈｅＰｈｅＰｒｏＰｈｅＰｈｅＧｌｕＡｌａＰｈｅＴｈｒＰｒｏＩｌｅＡｒｇＧｌｕＩｌｅＧｌｙＧｌｕＬｅｕＩｌｅＡｌａＳｅｒＡｒｇＰｒｏＶａｌＴｙｒＡｒｇＨｉｓＧｌｙＡｒｇＶａｌＡｒｇＡｓｐＩｌｅＡｒｇＡｓｐＡｒｇＡｌａＩｌｅＰｒｏＴｒｐＶａｌＭｅｔＡｌａＴｒｐＴｈｒＧｌｎＶａｌＡｒｇＬｅｕＬｅｕＬｅｕＰｒｏＴｒｐＴｙｒＧｌｙＬｅｕＳｅｒＡｌａＬｅｕＧｌｕＧｌｙＬｅｕＰｒｏＭｅｔＰｒｏＬｅｕＬｅｕＡｒｇＧｌｕＴｙｒＡｒｇＧｌｕＴｒｐＰｒｏＰｈｅＰｈｅＡｌａＴｈｒＴｈｒＬｅｕＧｌｕＳｅｒＡｌａＡｌａＭｅｔＡｌａＡｌａＬｙｓＡｌａＡｓｐＬｅｕＧｌｙＩｌｅＡｌａＧｌｕＡｒｇＴｙｒＬｅｕＬｙｓＬｅｕＶａｌＰｒｏＧｌｕＬｅｕＧｌｎＧｌｙＰｈｅＴｙｒＨｉｓＨｉｓＬｅｕＡｌａＧｌｕＧｌｕＴｙｒＡｒｇＡｒｇＴｈｒＶａｌＡｌａＬｅｕＧｌｕＡｌａＩｌｅＰｈｅＧｌｕＡｌａＰｒｏＬｅｕＬｅｕＨｉｓＡｓｎＧｌｎＬｙｓＴｈｒＬｅｕＧｌｕＧｌｎＩｌｅＡｌａＬｅｕＡｒｇＡｓｎＰｒｏＴｙｒＶａｌＡｓｐＰｒｏＩｌｅＡｓｎＰｈｅＶａｌＧｌｎＶａｌＬｅｕＬｅｕＡｌａＡｒｇＴｙｒＡｒｇＡｌａＰｒｏＧｌｙＧｌｙＡｒｇＧｌｕＡｓｐＧｌｕＧｌｙＶａｌＡｒｇＡｌａＬｅｕＬｅｕＬｅｕＳｅｒＬｅｕＬｅｕＧｌｙＶａｌＡｌａＡｌａＧｌｙＬｅｕＡｒｇＡｓｎＡｌａＧｌｙで表されるアミノ酸配列をコードすることを特徴とする
ＤＮＡ。
【請求項２】ＤＮＡが５’末端側よりＡＧＣＧＡＣＣＣＣＴＴＴＧＡＧＧＣＣＣＴＡＡＡＧＧＣＣＧＡＧＧＴＧＧＡＣＣＴＣＴＴＧＧＧＣＣＧＣＣＴＣＣＴＴＧＧＧＧＡＧＧＣＧＡＴＡＡＧＧＡＡＧＧＴＣＴＣＣＧＧＧＧＡＧＣＧＣＴＴＣＴＴＣＧＣＣＴＴＧＧＴＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＣＧＣＣＴＣＣＴＴＴＣＣＡＡＧＧＣＧＡＧＧＣＧＣＣＡＡＧＧＧＧＡＣＧＧＧＧＣＧＧＣＧＧＣＣＧＡＧＧＴＣＣＴＴＴＣＣＣＡＡＣＧＧＧＴＧＧＡＧＣＧＣＡＴＧＣＣＣＧＴＧＧＡＧＧＡＧＡＴＧＧＡＡＧＣＧＣＴＧＧＴＧＣＧＧＧＣＣＴＴＣＡＣＣＣＡＣＴＡＣＴＴＣＣＡＣＣＴＧＧＴＧＡＡＣＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＡＧＣＧＣＣＡＣＣＧＧＧＴＧＣＧＧＧＴＧＡＡＣＣＧＴＣＴＣＡＧＧＡＣＧＧＡＧＧＧＧＧＡＡＡＣＣＣＴＧＧＡＡＡＡＣＣＣＣＡＧＧＣＣＣＧＡＧＧＧＣＴＴＴＴＴＧＧＣＣＣＴＧＧＣＣＡＡＧＧＣＣＣＴＧＡＡＧＧＡＧＣＧＧＧＧＣＣＴＣＴＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＧＧＣＣＧＡＧＧＣＣＣＡＴＣＴＧＡＡＣＣＧＧＴＴＡＧＣＧＣＴＣＣＴＣＣＴＣＡＣＣＴＴＣＡＣＣＧＣＣＣＡＴＣＣＣＡＣＧＧＡＧＡＣＣＣＧＧＣＧＣＣＧＣＡＣＣＣＴＣＣＧＧＣＡＣＣＡＣＴＴＧＧＡＡＡＧＧＣＴＴＣＡＧＧＡＧＧＡＡＴＴＧＧＡＡＧＧＧＧＧＧＧＡＣＣＧＧＧＡＧＣＧＣＣＴＴＴＴＧＧＣＣＣＧＧＧＴＴＧＴＣＣＴＣＣＴＣＴＡＣＧＣＣＡＣＧＧＡＧＧＡＧＧＴＧＣＧＣＡＡＧＧＣＧＣＧＧＣＣＣＡＧＣＧＴＧＧＡＧＧＡＣＧＡＧＡＴＣＡＡＧＧＧＡＧＧＧＣＴＴＴＡＣＴＡＣＣＴＣＣＣＣＡＣＣＡＣＣＣＴＧＴＧＧＣＧＧＧＣＣＡＴＣＣＣＣＡＡＧＧＴＧＧＴＧＧＡＧＧＧＣＣＴＣＧＡＧＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＡＡＣＧＧＧＴＣＴＡＣＧＧＣＡＡＧＣＧＣＣＣＣＣＡＣＣＴＣＡＧＡＡＧＣＣＣＣＧＴＧＣＧＣＴＴＣＣＧＣＡＧＣＴＧＧＡＴＧＧＧＣＧＧＧＧＡＣＣＧＧＧＡＣＧＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＣＧＴＣＡＣＣＣＣＣＧＡＧＧＴＣＡＣＣＧＣＣＴＴＴＧＣＣＧＧＣＣＧＣＴＡＣＧＣＣＣＧＧＧＡＧＧＴＧＧＣＣＡＡＧＧＧＧＣＧＧＴＡＣＣＴＡＧＡＧＧＡＧＴＴＧＧＡＡＧＣＣＴＴＧＧＴＧＣＧＧＧＡＣＣＴＣＴＣＣＣＴＴＴＣＣＧＡＧＧＣＣＣＧＴＡＴＣＣＣＣＧＴＧＣＣＣＡＡＧＧＡＧＧＴＧＣＧＧＧＡＧＧＧＧＧＧＧＧＡＡＧＧＧＧＴＧＧＡＧＣＧＣＴＴＴＣＣＣＧＧＧＧＡＧＣＣＴＴＡＣＣＧＣＣＧＣＴＡＣＴＴＣＧＣＣＧＣＣＣＴＴＴＡＣＣＧＧＧＣＣＴＴＧＧＡＡＧＧＧＧＡＧＧＣＣＣＴＴＴＣＣＡＣＣＧＡＡＧＧＧＣＴＧＧＣＣＣＧＧＧＣＴＴＴＧＡＡＧＧＴＧＧＣＧＧＡＡＡＡＧＧＧＣＣＴＣＧＡＧＧＧＧＧＴＧＧＧＧＣＴＴＧＣＣＣＡＧＧＴＧＧＣＧＣＡＧＧＣＣＴＴＴＣＴＧＣＧＧＣＣＴＣＴＧＧＡＧＧＣＧＣＧＧＣＴＴＴＣＣＧＣＴＴＴＣＧＧＣＣＴＧＧＡＧＣＴＴＧＣＣＣＣＣＴＴＧＧＡＣＣＴＧＡＧＧＧＡＧＧＡＡＴＣＣＧＧＡＡＡＧＣＴＣＣＴＧＧＡＧＧＣＴＧＣＣＧＣＡＧＡＧＣＴＴＣＴＣＣＧＣＴＴＧＧＧＣＧＧＧＧＴＴＣＡＣＣＣＧＧＡＣＴＴＣＣＴＧＧＣＣＣＴＣＴＣＣＣＣＧＧＡＧＧＡＡＡＡＧＧＡＡＧＣＣＣＴＣＣＴＣＡＣＧＧＡＡＧＡＧＣＴＣＡＡＧＡＣＣＧＣＣＣＧＣＣＣＣＣＴＴＣＴＧＣＣＣＧＴＴＧＧＧＧＡＧＧＴＧＣＣＧＣＡＧＧＧＧＧＡＧＧＣＧＣＴＣＣＧＧＧＴＧＧＣＣＣＴＧＧＧＧＧＣＣＣＴＴＣＧＧＧＣＣＴＧＧＧＧＧＧＡＣＡＡＧＧＧＧＧＣＣＣＡＣＧＴＧＧＴＣＴＣＣＡＴＧＡＣＣＣＡＣＣＡＣＣＣＣＧＣＣＧＡＣＣＴＣＣＴＣＧＣＣＧＴＣＴＴＣＣＴＣＣＴＧＧＣＣＣＧＧＧＡＧＧＴＧＧＧＧＣＴＣＴＡＣＣＧＴＣＣＧＧＧＧＡＡＧＣＣＣＣＴＣＣＣＣＴＴＴＧＡＣＧＴＧＧＴＣＣＣＣＣＴＣＴＴＴＧＡＧＡＣＣＣＴＧＧＡＧＧＡＣＣＴＧＧＡＧＣＧＧＧＣＧＣＣＣＧＡＧＧＴＣＣＴＡＡＧＧＣＧＣＣＴＣＴＴＧＧＣＣＡＡＣＣＣＣＧＴＣＴＴＣＣＧＧＧＣＣＣＡＣＧＣＣＣＡＧＧＧＡＡＧＧＧＧＣＧＧＧＧＴＧＧＡＧＧＴＧＡＴＧＡＴＣＧＧＣＴＡＣＴＣＣＧＡＴＴＣＣＡＡＣＡＡＧＧＡＴＧＣＧＧＧＡＴＴＣＣＴＣＡＴＧＧＣＣＡＡＣＣＴＧＧＣＣＣＴＴＴＡＣＣＡＧＧＣＣＣＡＧＧＡＧＧＣＣＣＴＣＣＡＣＧＣＣＧＴＧＧＧＧＧＡＡＧＣＣＣＡＧＧＧＴＡＴＣＣＣＣＧＴＣＴＴＣＴＴＣＴＴＣＣＡＣＧＧＧＣＧＧＧＧＴＡＣＣＴＣＣＡＣＣＧＣＣＣＧＧＧＧＴＧＧＧＧＧＧＣＣＧＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＣＣＡＴＣＧＣＣＧＧＣＣＴＣＣＣＣＣＣＣＡＡＧＡＧＣＧＴＧＧＧＣＣＡＣＣＧＣＣＴＧＣＧＣＣＴＣＡＣＧＧＡＧＣＡＧＧＧＧＧＡＧＧＣＣＴＴＧＧＣＧＧＡＣＣＧＧＴＡＣＧＣＣＣＡＣＣＣＣＧＡＣＣＴＧＧＣＣＧＴＧＣＧＣＣＡＣＣＴＧＧＡＧＣＡＡＣＴＣＣＴＧＴＡＣＣＡＣＴＴＣＧＣＣＣＡＧＧＣＣＧＣＣＣＴＧＧＧＧＧＡＴＧＧＧＧＴＧＧＡＧＣＣＣＡＡＧＧＣＣＣＡＴＴＧＧＣＧＣＧＡＧＧＣＧＣＴＡＧＧＧＧＡＧＧＣＣＧＧＧＧＡＧＡＧＧＡＧＣＡＴＧＧＣＣＣＧＣＴＡＣＣＧＧＧＣＣＣＴＣＣＴＴＴＣＣＣＡＡＧＡＧＧＧＡＴＴＴＴＴＣＣＣＣＴＴＣＴＴＴＧＡＧＧＣＴＴＴＴＡＣＣＣＣＣＡＴＴＣＧＣＧＡＧＡＴＣＧＧＣＧＡＡＣＴＣＣＣＣＡＴＣＧＣＣＡＧＣＣＧＣＣＣＣＧＴＣＴＡＣＣＧＣＣＡＣＧＧＣＣＧＧＧＴＧＣＧＧＧＡＴＡＴＣＣＧＧＧＡＣＣＴＡＡＧＧＧＣＣＡＴＣＣＣＣＴＧＧＧＴＣＡＴＧＧＣＣＴＧＧＡＣＣＣＡＧＧＴＧＣＧＣＣＴＣＣＴＣＣＴＧＣＣＧＧＧＧＴＧＧＴＡＣＧＧＧＣＴＴＴＣＣＧＣＣＣＴＧＧＡＡＧＧＣＣＴＧＣＣＣＡＴＧＣＣＣＣＴＣＣＴＣＡＧＧＧＡＧＡＴＧＴＡＣＣＧＧＧＡＧＴＧＧＣＣＣＴＴＴＴＴＣＧＣＣＡＣＣＡＣＣＴＴＧＧＡＡＡＧＣＧＣＣＧＣＣＡＴＧＧＣＣＴＴＧＧＣＣＡＡＡＧＣＧＧＡＴＣＴＧＧＧＣＡＴＣＧＣＣＧＡＧＣＧＴＴＡＣＣＴＣＡＡＧＣＴＧＧＴＣＣＣＣＧＡＡＧＧＧＣＴＣＣＡＧＧＧＣＴＴＣＴＡＣＣＡＣＣＡＣＣＴＧＧＣＧＧＡＧＧＡＧＴＡＣＣＧＣＡＧＧＡＣＧＧＴＧＧＣＣＣＴＴＴＴＧＧＡＧＧＣＴＡＴＣＴＴＴＧＡＡＧＣＣＣＣＣＣＴＣＣＴＣＣＡＣＡＡＣＣＡＡＡＡＧＡＣＣＣＴＧＧＡＧＣＧＣＣＡＧＡＴＣＧＣＣＣＴＣＡＧＧＡＡＣＣＣＣＴＡＣＧＴＧＧＡＣＣＣＣＡＴＣＡＡＣＴＴＣＧＴＧＣＡＧＧＴＧＧＡＧＣＴＣＣＴＴＧＣＣＣＧＣＴＡＣＣＧＧＧＣＣＣＣＡＧＧＧＧＧＧＣＧＧＧＡＧＧＡＣＧＡＧＧＧＧＧＴＧＣＧＧＣＧＧＧＣＧＴＴＧＣＴＣＣＴＴＴＣＣＣＴＣＣＴＧＧＧＧＧＴＧＧＣＧＧＣＧＧＧＧＣＴＴＡＧＧＡＡＣＧＣＣＧＧＣで表される塩基配列を有する請求項第１項記載のＤＮ
Ａ。
【請求項３】エシェリヒア・コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃ
ｈｉａｃｏｌｉ）に属する微生物であって、下記のア
ミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列から実質的に
なるＮ末端側よりＳｅｒＡｓｐＰｒｏＰｈｅＧｌｕＡｌａＬｅｕＬｙｓＡｌａＧｌｕＡｓｐＬｅｕＬｅｕＧｌｙＡｒｇＬｅｕＬｅｕＧｌｙＧｌｕＡｌａＩｌｅＡｒｇＬｙｓＶａｌＳｅｒＧｌｙＧｌｕＰｈｅＰｈｅＡｌａＬｅｕＶａｌＧｌｕＧｌｕＶａｌＡｒｇＬｅｕＬｅｕＳｅｒＬｙｓＡｌａＡｒｇＡｒｇＧｌｎＡｓｐＧｌｙＡｌａＡｌａＡｌａＧｌｕＶａｌＬｅｕＳｅｒＧｌｎＡｒｇＶａｌＧｌｕＡｒｇＭｅｔＰｒｏＶａｌＧｌｕＭｅｔＧｌｕＡｌａＬｅｕＶａｌＡｒｇＡｌａＰｈｅＴｈｒＨｉｓＴｙｒＰｈｅＨｉｓＬｅｕＶａｌＡｓｎＡｌａＧｌｕＧｌｕＡｒｇＨｉｓＡｒｇＶａｌＡｒｇＶａｌＡｓｎＡｒｇＬｅｕＡｒｇＴｈｒＧｌｕＧｌｙＧｌｕＬｅｕＧｌｕＡｓｎＰｒｏＡｒｇＰｒｏＧｌｕＧｌｙＰｈｅＬｅｕＡｌａＬｅｕＡｌａＬｙｓＡｌａＬｅｕＬｙｓＡｒｇＧｌｙＬｅｕＳｅｒＬｅｕＧｌｕＧｌｕＡｌａＧｌｕＡｌａＨｉｓＬｅｕＡｓｎＡｒｇＬｅｕＡｌａＬｅｕＬｅｕＴｈｒＰｈｅＴｈｒＡｌａＨｉｓＰｒｏＴｈｒＧｌｕＴｈｒＡｒｇＡｒｇＡｒｇＴｈｒＬｅｕＡｒｇＨｉｓＬｅｕＧｌｕＡｒｇＬｅｕＧｌｎＧｌｕＧｌｕＬｅｕＧｌｕＧｌｙＧｌｙＡｓｐＡｒｇＧｌｕＡｒｇＬｅｕＬｅｕＡｒｇＶａｌＶａｌＬｅｕＬｅｕＴｙｒＡｌａＴｈｒＧｌｕＧｌｕＶａｌＡｒｇＬｙｓＡｌａＡｒｇＰｒｏＳｅｒＧｌｕＡｓｐＧｌｕＩｌｅＬｙｓＧｌｙＧｌｙＬｅｕＴｙｒＴｙｒＬｅｕＰｒｏＴｈｒＴｈｒＬｅｕＴｒｐＡｒｇＩｌｅＰｒｏＬｙｓＶａｌＶａｌＧｌｕＧｌｙＬｅｕＧｌｕＡｌａＡｌａＬｅｕＧｌｕＡｒｇＶａｌＴｙｒＧｌｙＡｒｇＰｒｏＨｉｓＬｅｕＡｒｇＳｅｒＰｒｏＶａｌＡｒｇＰｈｅＡｒｇＳｅｒＴｒｐＭｅｔＧｌｙＧｌｙＡｓｐＡｓｐＧｌｙＡｓｎＰｒｏＴｙｒＶａｌＴｈｒＰｒｏＧｌｕＶａｌＴｈｒＡｌａＰｈｅＡｌａＧｌｙＡｒｇＴｙｒＡｒｇＧｌｕＶａｌＡｌａＬｙｓＧｌｙＡｒｇＴｙｒＬｅｕＧｌｕＧｌｕＬｅｕＧｌｕＡｌａＬｅｕＶａｌＡｒｇＬｅｕＳｅｒＬｅｕＳｅｒＧｌｕＡｌａＡｒｇＩｌｅＰｒｏＶａｌＰｒｏＬｙｓＧｌｕＶａｌＡｒｇＧｌｕＧｌｙＧｌｕＧｌｙＶａｌＧｌｕＡｒｇＰｈｅＰｒｏＧｌｙＧｌｕＰｒｏＴｙｒＡｒｇＡｒｇＴｙｒＰｈｅＡｌａＡｌａＴｙｒＡｒｇＡｌａＬｅｕＧｌｕＧｌｙＧｌｕＡｌａＬｅｕＳｅｒＴｈｒＧｌｕＧｌｙＬｅｕＡｌａＡｒｇＡｌａＬｙｓＶａｌＡｌａＧｌｕＬｙｓＧｌｙＬｅｕＧｌｕＧｌｙＶａｌＧｌｙＬｅｕＡｌａＧｌｎＶａｌＡｌａＧｌｎＰｈｅＬｅｕＡｒｇＰｒｏＬｅｕＧｌｕＡｌａＡｒｇＬｅｕＳｅｒＡｌａＰｈｅＧｌｙＬｅｕＧｌｕＬｅｕＡｌａＬｅｕＡｓｐＬｅｕＡｒｇＧｌｕＧｌｕＳｅｒＧｌｙＬｙｓＬｅｕＬｅｕＧｌｕＡｌａＡｌａＡｌａＧｌｕＬｅｕＡｒｇＬｅｕＧｌｙＧｌｙＶａｌＨｉｓＰｒｏＡｓｐＰｈｅＬｅｕＡｌａＬｅｕＳｅｒＰｒｏＧｌｕＧｌｕＬｙｓＡｌａＬｅｕＬｅｕＴｈｒＧｌｕＧｌｕＬｅｕＬｙｓＴｈｒＡｌａＡｒｇＰｒｏＬｅｕＬｅｕＰｒｏＶａｌＧｌｙＶａｌＰｒｏＧｌｎＧｌｙＧｌｕＡｌａＬｅｕＡｒｇＶａｌＡｌａＬｅｕＧｌｙＡｌａＬｅｕＡｒｇＡｌａＴｒｐＡｓｐＬｙｓＧｌｙＡｌａＨｉｓＶａｌＶａｌＳｅｒＭｅｔＴｈｒＨｉｓＨｉｓＰｒｏＡｌａＡｓｐＬｅｕＬｅｕＶａｌＰｈｅＬｅｕＬｅｕＡｌａＡｒｇＧｌｕＶａｌＧｌｙＬｅｕＴｙｒＡｒｇＰｒｏＧｌｙＬｙｓＰｒｏＬｅｕＰｈｅＡｓｐＶａｌＶａｌＰｒｏＬｅｕＰｈｅＧｌｕＴｈｒＬｅｕＧｌｕＡｓｐＬｅｕＧｌｕＡｒｇＡｌａＰｒｏＶａｌＬｅｕＡｒｇＡｒｇＬｅｕＬｅｕＡｌａＡｓｎＰｒｏＶａｌＰｈｅＡｒｇＡｌａＨｉｓＡｌａＧｌｎＧｌｙＧｌｙＧｌｙＶａｌＧｌｕＶａｌＭｅｔＩｌｅＧｌｙＴｙｒＳｅｒＡｓｐＳｅｒＡｓｎＬｙｓＡｓｐＡｌａＧｌｙＬｅｕＭｅｔＡｌａＡｓｎＬｅｕＡｌａＬｅｕＴｙｒＧｌｎＡｌａＧｌｎＧｌｕＡｌａＬｅｕＨｉｓＡｌａＶａｌＧｌｕＡｌａＧｌｎＧｌｙＩｌｅＰｒｏＶａｌＰｈｅＰｈｅＰｈｅＨｉｓＧｌｙＡｒｇＧｌｙＴｈｒＳｅｒＴｈｒＡｒｇＧｌｙＧｌｙＧｌｙＰｒｏＡｌａＧｌｙＡｒｇＡｌａＩｌｅＡｌａＧｌｙＬｅｕＰｒｏＰｒｏＬｙｓＳｅｒＧｌｙＨｉｓＡｒｇＬｅｕＡｒｇＬｅｕＴｈｒＧｌｕＧｌｎＧｌｙＧｌｕＡｌａＬｅｕＡｌａＡｓｐＡｒｇＴｙｒＨｉｓＰｒｏＡｓｐＬｅｕＡｌａＶａｌＡｒｇＨｉｓＬｅｕＧｌｕＧｌｎＬｅｕＬｅｕＴｙｒＨｉｓＰｈｅＡｌａＡｌａＡｌａＬｅｕＧｌｙＡｓｐＧｌｙＶａｌＧｌｕＰｒｏＬｙｓＡｌａＨｉｓＴｒｐＡｒｇＧｌｕＡｌａＬｅｕＧｌｕＡｌａＧｌｙＧｌｕＡｒｇＳｅｒＭｅｔＡｌａＡｒｇＴｙｒＡｒｇＡｌａＬｅｕＬｅｕＳｅｒＧｌｎＧｌｕＰｈｅＰｈｅＰｒｏＰｈｅＰｈｅＧｌｕＡｌａＰｈｅＴｈｒＰｒｏＩｌｅＡｒｇＧｌｕＩｌｅＧｌｙＧｌｕＬｅｕＩｌｅＡｌａＳｅｒＡｒｇＰｒｏＶａｌＴｙｒＡｒｇＨｉｓＧｌｙＡｒｇＶａｌＡｒｇＡｓｐＩｌｅＡｒｇＡｓｐＡｒｇＡｌａＩｌｅＰｒｏＴｒｐＶａｌＭｅｔＡｌａＴｒｐＴｈｒＧｌｎＶａｌＡｒｇＬｅｕＬｅｕＬｅｕＰｒｏＴｒｐＴｙｒＧｌｙＬｅｕＳｅｒＡｌａＬｅｕＧｌｕＧｌｙＬｅｕＰｒｏＭｅｔＰｒｏＬｅｕＬｅｕＡｒｇＧｌｕＴｙｒＡｒｇＧｌｕＴｒｐＰｒｏＰｈｅＰｈｅＡｌａＴｈｒＴｈｒＬｅｕＧｌｕＳｅｒＡｌａＡｌａＭｅｔＡｌａＡｌａＬｙｓＡｌａＡｓｐＬｅｕＧｌｙＩｌｅＡｌａＧｌｕＡｒｇＴｙｒＬｅｕＬｙｓＬｅｕＶａｌＰｒｏＧｌｕＬｅｕＧｌｎＧｌｙＰｈｅＴｙｒＨｉｓＨｉｓＬｅｕＡｌａＧｌｕＧｌｕＴｙｒＡｒｇＡｒｇＴｈｒＶａｌＡｌａＬｅｕＧｌｕＡｌａＩｌｅＰｈｅＧｌｕＡｌａＰｒｏＬｅｕＬｅｕＨｉｓＡｓｎＧｌｎＬｙｓＴｈｒＬｅｕＧｌｕＧｌｎＩｌｅＡｌａＬｅｕＡｒｇＡｓｎＰｒｏＴｙｒＶａｌＡｓｐＰｒｏＩｌｅＡｓｎＰｈｅＶａｌＧｌｎＶａｌＬｅｕＬｅｕＡｌａＡｒｇＴｙｒＡｒｇＡｌａＰｒｏＧｌｙＧｌｙＡｒｇＧｌｕＡｓｐＧｌｕＧｌｙＶａｌＡｒｇＡｌａＬｅｕＬｅｕＬｅｕＳｅｒＬｅｕＬｅｕＧｌｙＶａｌＡｌａＡｌａＧｌｙＬｅｕＡｒｇＡｓｎＡｌａＧｌｙで表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを保持し、
かつホスホエノールピルビン酸カルボキシラーゼ生産能
を有することを特徴とする実質的に純粋な遺伝子組換え
微生物。
【請求項４】遺伝子組換え微生物が、エシェリヒア・
コリ（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ）ＪＭ１０９
・ｐｌＰＥＰＣ１「微工研寄託ＦＥＲＭＰ−１４４７
７」である請求項第３項記載の遺伝子組換え微生物。
【請求項５】下記のアミノ酸配列をコードするヌクレ
オチド配列から実質的になるＮ末端側よりＳｅｒＡｓｐＰｒｏＰｈｅＧｌｕＡｌａＬｅｕＬｙｓＡｌａＧｌｕＡｓｐＬｅｕＬｅｕＧｌｙＡｒｇＬｅｕＬｅｕＧｌｙＧｌｕＡｌａＩｌｅＡｒｇＬｙｓＶａｌＳｅｒＧｌｙＧｌｕＰｈｅＰｈｅＡｌａＬｅｕＶａｌＧｌｕＧｌｕＶａｌＡｒｇＬｅｕＬｅｕＳｅｒＬｙｓＡｌａＡｒｇＡｒｇＧｌｎＡｓｐＧｌｙＡｌａＡｌａＡｌａＧｌｕＶａｌＬｅｕＳｅｒＧｌｎＡｒｇＶａｌＧｌｕＡｒｇＭｅｔＰｒｏＶａｌＧｌｕＭｅｔＧｌｕＡｌａＬｅｕＶａｌＡｒｇＡｌａＰｈｅＴｈｒＨｉｓＴｙｒＰｈｅＨｉｓＬｅｕＶａｌＡｓｎＡｌａＧｌｕＧｌｕＡｒｇＨｉｓＡｒｇＶａｌＡｒｇＶａｌＡｓｎＡｒｇＬｅｕＡｒｇＴｈｒＧｌｕＧｌｙＧｌｕＬｅｕＧｌｕＡｓｎＰｒｏＡｒｇＰｒｏＧｌｕＧｌｙＰｈｅＬｅｕＡｌａＬｅｕＡｌａＬｙｓＡｌａＬｅｕＬｙｓＡｒｇＧｌｙＬｅｕＳｅｒＬｅｕＧｌｕＧｌｕＡｌａＧｌｕＡｌａＨｉｓＬｅｕＡｓｎＡｒｇＬｅｕＡｌａＬｅｕＬｅｕＴｈｒＰｈｅＴｈｒＡｌａＨｉｓＰｒｏＴｈｒＧｌｕＴｈｒＡｒｇＡｒｇＡｒｇＴｈｒＬｅｕＡｒｇＨｉｓＬｅｕＧｌｕＡｒｇＬｅｕＧｌｎＧｌｕＧｌｕＬｅｕＧｌｕＧｌｙＧｌｙＡｓｐＡｒｇＧｌｕＡｒｇＬｅｕＬｅｕＡｒｇＶａｌＶａｌＬｅｕＬｅｕＴｙｒＡｌａＴｈｒＧｌｕＧｌｕＶａｌＡｒｇＬｙｓＡｌａＡｒｇＰｒｏＳｅｒＧｌｕＡｓｐＧｌｕＩｌｅＬｙｓＧｌｙＧｌｙＬｅｕＴｙｒＴｙｒＬｅｕＰｒｏＴｈｒＴｈｒＬｅｕＴｒｐＡｒｇＩｌｅＰｒｏＬｙｓＶａｌＶａｌＧｌｕＧｌｙＬｅｕＧｌｕＡｌａＡｌａＬｅｕＧｌｕＡｒｇＶａｌＴｙｒＧｌｙＡｒｇＰｒｏＨｉｓＬｅｕＡｒｇＳｅｒＰｒｏＶａｌＡｒｇＰｈｅＡｒｇＳｅｒＴｒｐＭｅｔＧｌｙＧｌｙＡｓｐＡｓｐＧｌｙＡｓｎＰｒｏＴｙｒＶａｌＴｈｒＰｒｏＧｌｕＶａｌＴｈｒＡｌａＰｈｅＡｌａＧｌｙＡｒｇＴｙｒＡｒｇＧｌｕＶａｌＡｌａＬｙｓＧｌｙＡｒｇＴｙｒＬｅｕＧｌｕＧｌｕＬｅｕＧｌｕＡｌａＬｅｕＶａｌＡｒｇＬｅｕＳｅｒＬｅｕＳｅｒＧｌｕＡｌａＡｒｇＩｌｅＰｒｏＶａｌＰｒｏＬｙｓＧｌｕＶａｌＡｒｇＧｌｕＧｌｙＧｌｕＧｌｙＶａｌＧｌｕＡｒｇＰｈｅＰｒｏＧｌｙＧｌｕＰｒｏＴｙｒＡｒｇＡｒｇＴｙｒＰｈｅＡｌａＡｌａＴｙｒＡｒｇＡｌａＬｅｕＧｌｕＧｌｙＧｌｕＡｌａＬｅｕＳｅｒＴｈｒＧｌｕＧｌｙＬｅｕＡｌａＡｒｇＡｌａＬｙｓＶａｌＡｌａＧｌｕＬｙｓＧｌｙＬｅｕＧｌｕＧｌｙＶａｌＧｌｙＬｅｕＡｌａＧｌｎＶａｌＡｌａＧｌｎＰｈｅＬｅｕＡｒｇＰｒｏＬｅｕＧｌｕＡｌａＡｒｇＬｅｕＳｅｒＡｌａＰｈｅＧｌｙＬｅｕＧｌｕＬｅｕＡｌａＬｅｕＡｓｐＬｅｕＡｒｇＧｌｕＧｌｕＳｅｒＧｌｙＬｙｓＬｅｕＬｅｕＧｌｕＡｌａＡｌａＡｌａＧｌｕＬｅｕＡｒｇＬｅｕＧｌｙＧｌｙＶａｌＨｉｓＰｒｏＡｓｐＰｈｅＬｅｕＡｌａＬｅｕＳｅｒＰｒｏＧｌｕＧｌｕＬｙｓＡｌａＬｅｕＬｅｕＴｈｒＧｌｕＧｌｕＬｅｕＬｙｓＴｈｒＡｌａＡｒｇＰｒｏＬｅｕＬｅｕＰｒｏＶａｌＧｌｙＶａｌＰｒｏＧｌｎＧｌｙＧｌｕＡｌａＬｅｕＡｒｇＶａｌＡｌａＬｅｕＧｌｙＡｌａＬｅｕＡｒｇＡｌａＴｒｐＡｓｐＬｙｓＧｌｙＡｌａＨｉｓＶａｌＶａｌＳｅｒＭｅｔＴｈｒＨｉｓＨｉｓＰｒｏＡｌａＡｓｐＬｅｕＬｅｕＶａｌＰｈｅＬｅｕＬｅｕＡｌａＡｒｇＧｌｕＶａｌＧｌｙＬｅｕＴｙｒＡｒｇＰｒｏＧｌｙＬｙｓＰｒｏＬｅｕＰｈｅＡｓｐＶａｌＶａｌＰｒｏＬｅｕＰｈｅＧｌｕＴｈｒＬｅｕＧｌｕＡｓｐＬｅｕＧｌｕＡｒｇＡｌａＰｒｏＶａｌＬｅｕＡｒｇＡｒｇＬｅｕＬｅｕＡｌａＡｓｎＰｒｏＶａｌＰｈｅＡｒｇＡｌａＨｉｓＡｌａＧｌｎＧｌｙＧｌｙＧｌｙＶａｌＧｌｕＶａｌＭｅｔＩｌｅＧｌｙＴｙｒＳｅｒＡｓｐＳｅｒＡｓｎＬｙｓＡｓｐＡｌａＧｌｙＬｅｕＭｅｔＡｌａＡｓｎＬｅｕＡｌａＬｅｕＴｙｒＧｌｎＡｌａＧｌｎＧｌｕＡｌａＬｅｕＨｉｓＡｌａＶａｌＧｌｕＡｌａＧｌｎＧｌｙＩｌｅＰｒｏＶａｌＰｈｅＰｈｅＰｈｅＨｉｓＧｌｙＡｒｇＧｌｙＴｈｒＳｅｒＴｈｒＡｒｇＧｌｙＧｌｙＧｌｙＰｒｏＡｌａＧｌｙＡｒｇＡｌａＩｌｅＡｌａＧｌｙＬｅｕＰｒｏＰｒｏＬｙｓＳｅｒＧｌｙＨｉｓＡｒｇＬｅｕＡｒｇＬｅｕＴｈｒＧｌｕＧｌｎＧｌｙＧｌｕＡｌａＬｅｕＡｌａＡｓｐＡｒｇＴｙｒＨｉｓＰｒｏＡｓｐＬｅｕＡｌａＶａｌＡｒｇＨｉｓＬｅｕＧｌｕＧｌｎＬｅｕＬｅｕＴｙｒＨｉｓＰｈｅＡｌａＡｌａＡｌａＬｅｕＧｌｙＡｓｐＧｌｙＶａｌＧｌｕＰｒｏＬｙｓＡｌａＨｉｓＴｒｐＡｒｇＧｌｕＡｌａＬｅｕＧｌｕＡｌａＧｌｙＧｌｕＡｒｇＳｅｒＭｅｔＡｌａＡｒｇＴｙｒＡｒｇＡｌａＬｅｕＬｅｕＳｅｒＧｌｎＧｌｕＰｈｅＰｈｅＰｒｏＰｈｅＰｈｅＧｌｕＡｌａＰｈｅＴｈｒＰｒｏＩｌｅＡｒｇＧｌｕＩｌｅＧｌｙＧｌｕＬｅｕＩｌｅＡｌａＳｅｒＡｒｇＰｒｏＶａｌＴｙｒＡｒｇＨｉｓＧｌｙＡｒｇＶａｌＡｒｇＡｓｐＩｌｅＡｒｇＡｓｐＡｒｇＡｌａＩｌｅＰｒｏＴｒｐＶａｌＭｅｔＡｌａＴｒｐＴｈｒＧｌｎＶａｌＡｒｇＬｅｕＬｅｕＬｅｕＰｒｏＴｒｐＴｙｒＧｌｙＬｅｕＳｅｒＡｌａＬｅｕＧｌｕＧｌｙＬｅｕＰｒｏＭｅｔＰｒｏＬｅｕＬｅｕＡｒｇＧｌｕＴｙｒＡｒｇＧｌｕＴｒｐＰｒｏＰｈｅＰｈｅＡｌａＴｈｒＴｈｒＬｅｕＧｌｕＳｅｒＡｌａＡｌａＭｅｔＡｌａＡｌａＬｙｓＡｌａＡｓｐＬｅｕＧｌｙＩｌｅＡｌａＧｌｕＡｒｇＴｙｒＬｅｕＬｙｓＬｅｕＶａｌＰｒｏＧｌｕＬｅｕＧｌｎＧｌｙＰｈｅＴｙｒＨｉｓＨｉｓＬｅｕＡｌａＧｌｕＧｌｕＴｙｒＡｒｇＡｒｇＴｈｒＶａｌＡｌａＬｅｕＧｌｕＡｌａＩｌｅＰｈｅＧｌｕＡｌａＰｒｏＬｅｕＬｅｕＨｉｓＡｓｎＧｌｎＬｙｓＴｈｒＬｅｕＧｌｕＧｌｎＩｌｅＡｌａＬｅｕＡｒｇＡｓｎＰｒｏＴｙｒＶａｌＡｓｐＰｒｏＩｌｅＡｓｎＰｈｅＶａｌＧｌｎＶａｌＬｅｕＬｅｕＡｌａＡｒｇＴｙｒＡｒｇＡｌａＰｒｏＧｌｙＧｌｙＡｒｇＧｌｕＡｓｐＧｌｕＧｌｙＶａｌＡｒｇＡｌａＬｅｕＬｅｕＬｅｕＳｅｒＬｅｕＬｅｕＧｌｙＶａｌＡｌａＡｌａＧｌｙＬｅｕＡｒｇＡｓｎＡｌａＧｌｙで表されるアミノ酸配列をコードするＤＮＡを保持し、
かつ当該ＤＮＡの発現によるホスホエノールピルビン酸
カルボキシラーゼ生産能を有する実質的に純粋な遺伝子
組換え微生物を培養して該ＤＮＡの遺伝情報を発現せし
め、該培養物からホスホエノールピルビン酸カルボキシ
ラーゼを採取することを特徴とするホスホエノールピル
ビン酸カルボキシラーゼの製造法。