JP2706223B2 - ピルビン酸オキシダーゼの遺伝情報を有するｄｎａの用途 - Google Patents
ピルビン酸オキシダーゼの遺伝情報を有するｄｎａの用途Info
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- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Description
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、新規ピルビン酸オキシ
ダーゼの遺伝情報を有するポリデオキシリボ核酸を保持
してなる形質転換体により該ポリデオキシリボ核酸の遺
伝情報を発現せしめて得られるピルビン酸オキシダーゼ
およびその製造方法に関する。 【０００２】 【従来の技術】ピルビン酸オキシダーゼは、ピルビン
酸，燐酸および酸素からアセチルリン酸，二酸化炭素お
よび過酸化水素を生ずる反応を触媒するものであって、
ラクトバチルス・デルブリゥキィ（Lactobacillus delb
rucki ) 〔Williams,F.R. ＆ Hager,L.P.(1966) Arch.
Biochem.Biophys. 116 168-176 〕ペディオコッカス
（Pediococcus ）、ストレプトコッカス（Streptococcu
s ）、アエロッコカス・ビリダンス（Aerococcus virid
ans ）〔特公昭５８−４０４６５号公報〕に属する細菌
に存在することが報告されている。 【０００３】また、ピルビン酸オキシダーゼは、ピルビ
ン酸を基質とする酸化酵素であるため、血清などの体液
中に存在するピルビン酸の定量に使用されるだけでな
く、グルタミン酸−オキザロ酢酸トランスアミナーゼ、
グルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼ，ラクテ
ートデヒドロゲナーゼ、ノイラミニダーゼ−Ｎアセチル
ノイラミン酸アルドラーゼなどのピルビン酸生成系にお
いて生じたピルビン酸量を測定することによりピルビン
酸生成系に関与した酵素の基質である種々の物質の定量
またはピルビン酸生成系に関与した各酵素活性の測定な
ど、研究用試薬、臨床診断用試薬として極めて有用であ
る。 【０００４】 【発明が解決しようとする課題】従来より報告されてい
るピルビン酸オキシダーゼ生産菌は、ピルビン酸オキシ
ダーゼの生産性が低く製造コスト的に高価になるという
難点があるだけでなく、共存する他種酵素等の除去が非
常に困難で、純度の高い良質なピルビン酸オキシダーゼ
を得るために精製コストが非常に高いものとなり、研究
用試薬、臨床診断用試薬として安易に広く用いるには必
ずしも満足のいくものではなかった。 【０００５】また、従来より報告されているピルビン
酸、燐酸および酸素からアセチルリン酸、二酸化炭素お
よび過酸化水素を生ずる反応を触媒するピルビン酸オキ
シダーゼの詳細な化学構造は報告されていない。 【課題を解決するための手段】本発明者らは、該ピルビ
ン酸オキシダーゼの生産性向上を計るべく鋭意検討を試
みたところ、該ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子の採取な
らびに一次構造解析に成功すると共に遺伝子工学的手法
を応用することによって、以下に述べる如く、高生産性
である製造法を確立した。 【０００６】すなわち、本発明は、下記のＮ末端側より
のアミノ酸配列をコードするピルビン酸オキシダーゼ遺
伝子であるポリデオキシリボ核酸または該遺伝子が構成
成分であるポリデオキシリボ核酸を発現ベクターに組み
入れた組換えＤＮＡを宿主微生物に移入して形質転換体
を得、該形質転換体を培養して該ポリデオキシリボ核酸
の遺伝情報を発現させ、次いでピルビン酸オキシダーゼ
であるポリペプチドまたは該ピルビン酸オキシダーゼが
構成成分であるポリペプチドを採取してなるピルビン酸
オキシダーゼの製造法である。 Ａ−Ser Asp Asn Lys Ile Asn Ile Gly Leu Ala Val Met Lys Ile Leu Glu Ser Trp Gly Ala Asp Thr Ile Tyr Gly Ile Pro Ser Gly Thr Leu Ser Ser Leu Met Asp Ala Met Gly Glu Glu Glu Asn Asn Val Lys Phe Leu Gln Val Lys His Glu Glu Val Gly Ala Met Ala Ala Val Met Gln Ser Lys Phe Gly Gly Asn Leu Gly Val Thr Val Gly Ser Gly Gly Pro Gly Ala Ser His Leu Ile Asn Gly Leu Tyr Asp Ala Ala Met Asp Asn Ile Pro Val Val Ala Ile Leu Gly Ser Arg Pro Gln Arg Glu Leu Asn Met Asp Ala Phe Gln Glu Leu Asn Gln Asn Pro Met Tyr Asp His Ile Ala Val Tyr Asn Arg Arg Val Ala Tyr Ala Glu Gln Leu Pro Lys Leu Val Asp Glu Ala Ala Arg Met Ala Ile Ala Lys Arg Gly Val Ala Val Leu Glu Val Pro Gly Asp Phe Ala Lys Val Glu Ile Asp Asn Asp Gln Trp Tyr Ser Ser Ala Asn Ser Leu Arg Lys Tyr Ala Pro Ile Ala Pro Ala Ala Gln Asp Ile Asp Ala Ala Val Glu Leu Leu Asn Asn Ser Lys Arg Pro Val Ile Tyr Ala Gly Ile Gly Thr Met Gly His Gly Pro Ala Val Gln Glu Leu Ala Arg Lys Ile Lys Ala Pro Val Ile Thr Thr Gly Lys Asn Phe Glu Thr Phe Glu Trp Asp Phe Glu Ala Leu Thr Gly Ser Thr Tyr Arg Val Gly Trp Lys Pro Ala Asn Glu Thr Ile Leu Glu Ala Asp Thr Val Leu Phe Ala Gly Ser Asn Phe Pro Phe Ser Glu Val Glu Gly Thr Phe Arg Asn Val Asp Asn Phe Ile Gln Ile Asp Ile Asp Pro Ala Met Leu Gly Lys Arg His His Ala Asp Val Ala Ile Leu Gly Asp Ala Gly Leu Ala Ile Asp Glu Ile Leu Asn Lys Val Asp Ala Val Glu Glu Ser Ala Trp Trp Thr Ala Asn Leu Lys Asn Ile Ala Asn Trp Arg Glu Tyr Ile Asn Met Leu Glu Thr Lys Glu Glu Gly Asp Leu Gln Phe Tyr Gln Val Tyr Asn Ala Ile Asn Asn His Ala Asp Glu Asp Ala Ile Tyr Ser Ile Asp Val Gly Asn Ser Thr Gln Thr Ser Ile Arg His Leu His Met Thr Pro Lys Asn Met Trp Arg Thr Ser Pro Leu Phe Ala Thr Met Gly Ile Ala Ile Pro Gly Gly Leu Gly Ala Lys Asn Thr Tyr Pro Asp Arg Gln Val Trp Asn Ile Ile Gly Asp Gly Ala Phe Ser Met Thr Tyr Pro Asp Val Val Thr Asn Val Arg Tyr Asn Met Pro Val Ile Asn Val Val Phe Ser Asn Thr Glu Tyr Ala Phe Ile Lys Asn Lys Tyr Glu Asp Thr Asn Lys Asn Leu Phe Gly Val Asp Phe Thr Asp Val Asp Tyr Ala Lys Ile Ala Glu Ala Gln Gly Ala Lys Gly Phe Thr Val Ser Arg Ile Glu Asp Met Asp Arg Val Met Ala Glu Ala Val Ala Ala Asn Lys Ala Gly His Thr Val Val Ile Asp Cys Lys Ile Thr Gln Asp Arg Pro Ile Pro Val Glu Thr Leu Lys Leu Asp Ser Lys Leu Tyr Ser Glu Asp Glu Ile Lys Ala Tyr Lys Glu Arg Tyr Glu Ala Ala Asn Leu Val Pro Phe Arg Glu Tyr Leu Glu Ala Glu Gly Leu Glu Ser Lys Tyr Ile Lys −Ｂ （Ｉ） 〔式中、Ａはアミノ酸残基、水素原子またはアセチル基
を示し、Ｂはアミノ酸残基、−ＯＨまたは−ＮＨ2 を示
す〕に関するものである。 【０００７】上記ポリペプチド（Ｉ）に関し、Ａで示さ
れるアミノ酸残基としては、一個または複数個のアミノ
酸残基よりなり、Ａとしては、好ましくは、水素原子若
しくはMet またはシグナルペプチドが挙げられる。Ｂで
示されるものとしては、酸アミドであってもよく、また
一個以上のアミノ酸残基であってもよい。ピルビン酸、
燐酸および酸素からアセチルリン酸、二酸化炭素および
過酸化水素を生ずる反応を触媒するピルビン酸オキシダ
ーゼ遺伝子であるポリデオキシリボ核酸または該遺伝子
が構成成分であるポリデオキシリボ核酸としては、少な
くともピルビン酸、燐酸および酸素からアセチルリン
酸、二酸化炭素および過酸化水素を生ずる反応を触媒す
るピルビン酸オキシダーゼ遺伝子それ自体を含むポリデ
オキシリボ核酸であればよく、例えば該ピルビン酸オキ
シダーゼ遺伝子それ自体としてはＮ末端側より式 で表されるピルビン酸、燐酸および酸素からアセチルリ
ン酸、二酸化炭素および過酸化水素を生ずる反応を触媒
するピルビン酸オキシダーゼからなるポリペプチドのア
ミノ酸配列をコードする塩基配列であるポリデオキシリ
ボ核酸を挙げることが出来る。 【０００８】また式（ＩＩ）で表されるピルビン酸オキ
シダーゼであるポリペプチドのアミノ酸配列において、
各アミノ酸に対応する一連のコドンのうちのいずれか１
個のコドンからなるポリデオキシリボ核酸であればよ
く、さらに該ポリデオキシリボ核酸の５’末端に１個以
上のナンセンスコドン以外のコドンおよび／または３’
末端に１個以上のコドンを有するポリデオキシリボ核酸
であってもよい。例えば、その代表例として５’末端側
より式 〔式中、ＸはTAA,TAG およびTGA 以外のコドンまたは水
素原子を示し、Ｙはコドンまたは水素原子を示す〕で表
される塩基配列を有するポリデオキシリボ核酸を挙げる
ことができる。 【０００９】式（ＩＩＩ）で表される塩基配列に関し、
Ｘで示されるコドンは、アミノ酸をコードするコドンで
あればいずれでもよく、更に、その５’末端側にアミノ
酸をコードするコドンを１個以上有してもよいが、好ま
しくはATG またはシグナルペプチドに対応するポリデオ
キシリボ核酸を挙げることができる。Ｙで示されるコド
ンは、翻訳終止コドンまたはアミノ酸をコードするコド
ンであればいずれでもよく、更に、その３’末端側にア
ミノ酸をコードするコドンを１個以上有していてもよい
が、その場合には、この複数個のコドンの３’末端に翻
訳終止コドンを有することが好ましい。 【００１０】ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子を構成成分
としてなるポリデオキシリボ核酸または、式（ＩＩ）で
表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる遺
伝子であるポリデオキシリボ核酸または、式（ＩＩＩ）
で表されるポリデオキシリボ核酸は、例えばピルビン酸
オキシダーゼを生産するピルビン酸オキシダーゼ遺伝子
の供与体である微生物より該微生物のＤＮＡを分離精製
した後、超音波、制限酵素などを用いてＤＮＡと切断し
たリニヤーな発現ベクターとを両ＤＮＡの平滑または接
着末端部においてＤＮＡリガーゼなどにより結合閉環さ
せ、かくして得られた組換えＤＮＡベクターを複製可能
な宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカーとピル
ビン酸オキシダーゼの活性とを指標としてスクリーニン
グして取得した該組換えＤＮＡベクターを保持する微生
物を培養し、該培養菌体から該組換えＤＮＡベクターを
分離精製し、次いで該組換えＤＮＡベクターからピルビ
ン酸オキシダーゼ遺伝子であるポリデオキシリボ核酸を
採取すればよい。 【００１１】ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子の供与体で
ある微生物としては、ピルビン酸オキシダーゼ産生能を
有する微生物であればよく、例えば、好適に特開昭５４
−１２６７９１号公報に示されているアエロコッカス・
ビリダンス（Aerococcus viridans ）の微生物が適宜選
ばれる。 【００１２】また、遺伝子組換え技術を駆使して、ピル
ビン酸オキシダーゼ産生能を付与せしめた形質転換微生
物をピルビン酸オキシダーゼ遺伝子の供与体として利用
してもよい。遺伝子の供与体である微生物から由来する
ＤＮＡは次の如くにして採取される。即ち、供与微生物
である上述した細菌のいずれかを、例えば、液体培地で
約１〜３日間通気撹拌培養し、得られる培養物を遠心分
離して集菌し、次いでこれを溶菌させることによってピ
ルビン酸オキシダーゼ遺伝子の含有溶菌物を調製するこ
とができる。溶菌方法としては、例えばリゾチームやβ
ーグルカナーゼなどの細胞壁溶解酵素による処理が施さ
れ、必要によりプロテアーゼなどの他の酵素やラウリル
硫酸ナトリウムなどの界面活性剤が併用され、さらに細
胞壁の物理的破壊法である凍結融解やフレンチプレス処
理を上述の溶菌法との組み合せで行ってもよい。 【００１３】このようにして得られた溶菌物からＤＮＡ
を分離、精製するには、常法に従って、例えばフェノー
ル抽出による除蛋白処理、プロテアーゼ処理、リボヌク
レアーゼ処理、アルコール沈澱、遠心分離などの方法を
適宜組み合わせることにより行うことができる。分離精
製された微生物ＤＮＡを切断する方法は、例えば、超音
波処理、制限酵素処理などにより行うことができるが、
得られるＤＮＡ断片とベクターとの結合を容易ならしめ
るため、制限酵素、とりわけ特定ヌクレオチド配列に作
用する、例えば、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｂａｍ
ＨＩなどのＩＩ型制限酵素が適している。 【００１４】ベクターとしては、宿主微生物で自律的に
増殖しうるファージまたはプラスミドから遺伝子組換え
用として構築されたものが適している。ファージとして
は、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）
を宿主微生物とする場合には、λgt・λＣ、λgt・λＢ
などが使用できる。また、プラスミドとしては、例え
ば、エシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合にはｐ
ＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ
１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９などが、バ
チルス・ズブチルス（Bacillus subtillis）を宿主微生
物とする場合には pUB110 、pC194 などが使用でき、さ
らに、エシェリヒア・コリおよびサッカロマイセス・セ
レビシアなどのグラム陰・陽両性にまたがる二種以上の
宿主微生物で自律的に増殖可能なシャトルベクターを利
用することもできる。このようなベクターを、先に述べ
たピルビン酸オキシダーゼ遺伝子供与体である微生物Ｄ
ＮＡの切断に使用した制限酵素と同じ制限酵素で切断し
て、ベクター断片を得ることが好ましい。 【００１５】微生物ＤＮＡ断片とベクター断片とを結合
させる方法は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であ
ればよく、例えば、微生物ＤＮＡ断片の接着末端とベク
ター断片の接着末端とのアニーリングの後、適当なＤＮ
Ａリガーゼの作用により微生物ＤＮＡ断片とベクター断
片との組換えＤＮＡを作成する。必要ならば、アニーリ
ングの後、宿主微生物に移入して、生体内のＤＮＡリガ
ーゼを利用し組換えＤＮＡを作成することもできる。 【００１６】宿主微生物としては、組換えＤＮＡが安定
かつ自律的に増殖可能で、且つ外来性ＤＮＡの形質が発
現のできるものであればよく、例えば、宿主微生物がエ
シェリヒア・コリの場合、エシェリヒア・コリＤＨ１、
エシェリヒア・コリＨＢ１０１、エシェリヒア・コリＷ
３１１０、エシェリヒア・コリＣ６００等が利用出来
る。 【００１７】宿主微生物に組換えＤＮＡを移入する方法
としては、例えば、宿主微生物がエシェリヒア属に属す
る微生物の場合には、カルシュウムイオンの存在下で組
換えＤＮＡの移入を行い、またバチルス属に属する微生
物の場合には、コンピテントセル法またはプロトプラス
ト法などを採用することができ、さらにマイクロインジ
ェクション法を用いてもよい。かくして得られた形質転
換体である微生物は、栄養培地に培養されることにより
多量のピルビン酸オキシダーゼを安定して産生し得るこ
とを見出した。 【００１８】宿主微生物への目的組換えＤＮＡ移入の有
無についての選択は、目的組換えＤＮＡを保持するベク
ターの薬剤耐性マーカーとピルビン酸オキシダーゼとを
同時に発現し得る微生物を検索すればよく、例えば、薬
剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、かつピルビ
ン酸オキシダーゼを生成する微生物を選択すればよいこ
のようにして一度選択されたピルビン酸オキシダーゼ遺
伝子を保有する組換えＤＮＡは、形質転換微生物から取
り出され、他の宿主微生物に移入することも容易に実施
できる。また、ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子を保持す
る組換えＤＮＡから制限酵素などにより切断してピルビ
ン酸オキシダーゼ遺伝子であるＤＮＡを切り出し、これ
と同様な方法により切断して得られるベクター断片とを
結合させて、宿主微生物に移入することも容易に実施で
きる。 【００１９】また本質的にピルビン酸オキシダーゼ活性
であるピルビン酸オキシダーゼムテインのＤＮＡは、本
発明のピルビン酸オキシダーゼ遺伝子から遺伝子工学的
手法により作製される人工変異遺伝子であり、この人工
変異遺伝子は上述の種々なる方法を使用して増幅され、
最終的には、この変異遺伝子をベクターに挿入せしめて
組換えＤＮＡを作成し、これを宿主微生物に移入させる
ことによって、ピルビン酸オキシダーゼムテインの製造
が可能である。 【００２０】さらに上述の方法により得られたピルビン
酸オキシダーゼ遺伝子の塩基配列は、Science 214 12
05〜1210 (1981年) に示されているジデオキシ法で解読
し、またピルビン酸オキシダーゼのアミノ酸配列は、塩
基配列より決定した。一方、ピルビン酸オキシダーゼで
あるペプチドのＮ末端部を構成する部分アミノ酸配列
は、以下の如くにして決定した。即ち、ピルビン酸オキ
シダーゼ産生能を有するピルビン酸オキシダーゼ遺伝子
供与微生物を栄養培地で培養して菌体内にピルビン酸オ
キシダーゼを産生蓄積せしめ、培養終了後、得られた培
養物を濾過または遠心分離などの手段により菌体を採取
し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなど
の酵素的方法で破壊し、また必要に応じてＥＤＴＡおよ
び／または適当な界面活性剤等を添加してピルビン酸オ
キシダーゼが可溶化され、水溶液として分離採取され
る。この様にして得られたピルビン酸オキシダーゼの水
溶液を濃縮するか、または濃縮することなく硫安分画、
ゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマ
トグラフィーにより処理して、高純度ピルビン酸オキシ
ダーゼが得られ、高純度ピルビン酸オキシダーゼを用い
て液相プロテイン シーケンサー（ベックマン社製：Ｂ
ＥＣＫＭＡＮ Ｓｙｓｔｅｍ ８９０ＭＥ）によりピル
ビン酸オキシダーゼであるペプチドのＮ末端部を構成す
る部分アミノ酸配列が決定され、少なくとも、該部分ア
ミノ酸配列は、遺伝子操作によって得られたピルビン酸
オキシダーゼのＮ末端部分アミノ酸配列と一致するもの
であることを確認した。 【００２１】形質転換体である宿主微生物の培養形態は
宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すれば
良く、通常多くの場合は、液体培養で行うか、工業的に
は深部通気撹拌培養を行うのが有利である。 培地の栄
養源としては、微生物の培養に通常用いられるものが広
く使用され得る。炭素源としては、資化可能な炭素化合
物であればよく、例えばグルコース、シュクロース、ラ
クトース、マルトース、フラクトース、糖蜜、ピルビン
酸などが使用される。窒素源としては利用可能な窒素化
合物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エ
キス、カゼイン加水分解物などが使用される。その他、
リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウ
ム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定の
アミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用され
る。 【００２２】培養温度は菌が発育し、ピルビン酸オキシ
ダーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒ
ア・コリの場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。
培養時間は、条件によって多少異なるが、ピルビン酸オ
キシダーゼが最高収量に達する時期を見計らって適当な
時期に培養を終了すればよく、通常は１２〜４８時間程
度である。培地ｐＨは菌が発育し、ピルビン酸オキシダ
ーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、特に好ましく
はｐＨ６．０〜８．０程度である。 【００２３】培養物中のピルビン酸オキシダーゼは、菌
体を含む培養液そのままを採取し、利用することもでき
るが、一般には常法に従って、ピルビン酸オキシダーゼ
が培養液中に存在する場合には、濾過、遠心分離などに
よりピルビン酸オキシダーゼ含有溶液と微生物菌体とを
分離した後に利用される。ピルビン酸オキシダーゼが菌
体内に存在する場合には、得られた培養物を濾過または
遠心分離などの手段により、菌体を採取し、次いでこの
菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で
破壊し、また必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート剤およ
び／または界面活性剤を添加してピルビン酸オキシダー
ゼを可溶化し水溶液として分離採取する。 【００２４】この様にして得られたピルビン酸オキシダ
ーゼ含有溶液を、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、更に、硫
安、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有
機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなど
による分別沈澱法により沈澱せしめればよい。次いでこ
の沈澱物を、水に溶解し、半透膜にて透析せしめて、よ
り低分子量の不純物を除去することができる。また吸着
剤あるいはゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマ
トグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーにより精
製し、これらの手段を用いて得られるピルビン酸オキシ
ダーゼ含有溶液は、減圧濃縮凍結乾燥等の処理にてより
精製されたピルビン酸オキシダーゼを得る。 【００２５】本明細書に記載のアミノ酸、ペプチド、核
酸、核酸関連物質、その他に関する略号は、それらの当
該分野における慣用略号に基づくもので、それらの例を
以下に列記する。またすべてのアミノ酸はＬ体を示すも
のとする。 ＤＮＡ ： デオキシリボ核酸 ＲＮＡ ： リボ核酸 Ａ ： アデニン Ｔ ： チミン Ｇ ： グアニン Ｃ ： シトシン Ａｌａ ： アラニン Ａｒｇ ： アルギニン Ａｓｎ ： アスパラギン Ａｓｐ ： アスパラギン酸 Ｃｙｓ ： システイン Ｇｌｎ ： グルタミン Ｇｌｕ ： グルタミン酸 Ｇｌｙ ： グリシン Ｈｉｓ ： ヒスチジン Ｉｌｅ ： イソロイシン Ｌｅｕ ： ロイシン Ｌｙｓ ： リジン Ｍｅｔ ： メチオニン Ｐｈｅ ： フェニルアラニン Ｐｒｏ ： プロリン Ｓｅｒ ： セリン Ｔｈｒ ： スレオニン Ｔｒｐ ： トリプトファン Ｔｙｒ ： チロシン Ｖａｌ ： バリン 【００２６】 【実施例】以下、実施例で本発明を詳細に説明する。 【００２７】 【実施例１】 〔染色体ＤＮＡの分離〕Aerococcus viridans （ＩＦＯ
０１２２１９）の染色体ＤＮＡを次の方法で分離した同
菌株を１５０ｍｌの普通ブイヨン培地（０．５％チオ硫
酸ソーダ含有）で３７℃一晩震盪培養後遠心（３，００
０回転１０分）により集菌した。１０％サッカロース、
５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）５０ｍＭのＥＤＴＡ
を含んだ溶液５ｍｌに懸濁させ、１ｍｌのリゾチーム溶
液（１０ｍｇ／ｍｌ）を加えて３７°Ｃ、１５分間保温
し、次いで１ｍｌの１０％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリ
ウム）溶液を加えた、この懸濁液に等量のクロロホルム
−フェノール混液（１：１）を加え、攪拌混合し、１
０，０００ｒｐｍ３分の遠心で水層と溶媒層に分け、水
層を合取した。 【００２８】この水層に２倍量のエタノールを静かに重
層し、ガラス棒でゆっくり攪拌しながらＤＮＡをガラス
棒にまきつかせて分離した。これを１０ｍｌの１０ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡを含んだ
溶液（以下ＴＥと略す）で溶解した。これを等量のクロ
ロホルム−フェノール混液で処理後、遠心により水層を
分取し、２倍量のエタノールを加えて上記の方法でもう
一度ＤＮＡを分離し、２ｍｌのＴＥで溶解した。 【００２９】 【実施例２】 〔ｐＡＣＹＣ／８４プラスミドＤＮＡの分離〕ｐＡＣＹ
Ｃ／８４を保有するエシェリヒア・コリｐＭ１９１（J.
Bacteriol１３４，１１４１（１９８１）；ＡＴＣＣ３
７０３３）を１ｌのＢＨＩ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で震
盪培養した。濁度がＯＤ660 ＝１．０に増殖したとき、
スペクチノマイシン（最終濃度３００μｇ／ｍｌ、プラ
スミドの耐性マーカーとしてクロラムフェニコールが含
まれているとき）を加え、さらに３７℃で１６時間以上
震盪を続けた。３０００ｒｐｍ１０分間の遠心により集
菌し、リゾチーム−ＳＤＳ法とセシウムクロライド−エ
チジウムプロマイド法（Maniortis ら：Molecular Clon
ing pp８６〜９４Cold Spring Harbor（１９８２））に
従いプラスミドＤＮＡを調製した。 【００３０】 【実施例３】 〔ピルビン酸オキシダーゼ（ＰＯＰ）遺伝子を有するプ
ラスミドｐＯＸＩ３の作成〕 (i) 実施例１で調製したA. viridans の染色体ＤＮＡ２
μｌ（約０．５μｇ）と１０倍濃度のＥｃｏＲＩ切断用
バッファー（５００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、７
０ｍＭＭｇＣｌ2 、１ＭＮａＣｌ、７０ｍＭメルカプト
エタノール）１μｌ，ＥcoＲＩ（宝酒造製 １．０unit
/ μl)１μｌ、水６μｌを混合し、３７℃１時間切断し
た。別に調製したプラスミドｐＡＣＹＣ１８４ＤＮＡ約
０．３μｇを同様の方法を用いてＥｃｏＲＩで切断し、
さらにアルカリ性フォスファターゼ（以下ＢＡＰと略す
ことがある。宝酒造製）０．６unitを加え、６５℃１時
間処理した。これらのＥｃｏＲＩで切断した２種のＤＮ
Ａ溶液を混合し、その１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム
を加え、さらに全体量と等量のクロロホルム−フェノー
ル混液で処理し、遠心分離により水層を分取した。 【００３１】この水層に２倍容のエタノールを加え、遠
心でＤＮＡを沈殿させたのち減圧乾燥した。水８９μｌ
で溶解後、１０倍濃度のライゲーションバッファ（０．
５Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．６）、０．１ＭＭｇＣｌ2 、
０．１Ｍジチオスレイトール、１０ｍＭスペルミジン、
１０ｍＭＡＴＰ）１０μｌとＴ4 ＤＮＡリガーゼ１μｌ
（宝酒造製１７５unit）を加え混合し４℃で一晩放置し
た。このＤＮＡ溶液をクロロホルム−フェノール処理
し、エタノール沈殿を集め減圧乾燥した後、１０μｌの
ＴＥで溶解した。 【００３２】(ii)１００ｍｌのＢＨＩ培地（Brain Hear
t Infusion, Ｄｉｆｃｏ社製）で培養した対数増殖期の
エシェリヒア・コリＷ３１１０株〔国立遺伝学研究所よ
り分与を受けた、ストック番号ＭＥ７７７８；ＡＴＣＣ
２７３２５〕を遠心分離により集菌し（１０，０００ｒ
ｐｍ．２分間）４０ｍｌの氷冷した３０ｍＭ酢酸カリウ
ム、１００ｍＭＲｂＣｌ、１０ｍＭＣａＣｌ2 、５０ｍ
ＭＭｎＣｌ2 および１５％グリセリンを含んだ溶液（ｐ
Ｈ５．８）で懸濁した。０℃で５分間放置後、遠心し上
清をすて、さらに４ｍｌの１０ｍＭＭＯＰＳ緩衝液（ド
ータイト社製）、７５ｍＭＣａＣｌ2 、１０ｍＭＲｂＣ
ｌおよび１５％グリセリンを含んだ溶液（ｐＨ６．５）
で懸濁し、０℃で１５分間放置してコンピテント細胞と
した。 【００３３】(iii) この大腸菌懸濁液２００μｌに(i)
で調製したＤＮＡ溶液１０μｌを加え、３０分間０°Ｃ
で放置した。ＢＨＩ培地１ｍｌを加え、３７℃で９０分
間保温後、この１００μｌをテトラサイクリン（１５μ
ｇ／ｍｌ）を含んだＢＨＩ寒天プレートにまき、３７℃
で一晩培養し形質転換体を得た。この形質転換体をＰＯ
Ｐ培地（組成はペプトン５ｇ、肉エキス２ｇ、イースト
エキス５ｇ、ＮａＣｌ１ｇ、Ｋ2 ＨＰＯ4 １ｇ、ＭｇＳ
Ｏ4 ０．５ｇ、パーオキシダーゼ５００ＩＵ、ＦＡＤ
７．８５ｍｇ、ジアニシジン０．１ｇ、チアミンピロフ
ォスフェート４２４ｍｇ、ピルビン酸１ｍｌ、寒天１５
ｇ、蒸留水１ｌ、ｐＨ７．０）のプレートにレプリカ
し、３７℃でさらに一晩培養した。 【００３４】約４５００コロニーの形質転換を調べたと
ころ、コロニーの周辺が茶褐色に変色したもの１株を
得、この株をエシェリヒア・コリＷ３１１０・ｐＯＸＩ
３株「微生物受託番号 微工研菌寄第９０７１号、ＦＥ
ＲＭＰ−No. ９０７１、微工研条寄第１５６５、ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−１５６５」と命名した。この菌を純粋分離後
ＢＨＩ培地で３７℃一晩培養し、ピルビン酸オキシダー
ゼの生産性を後述するピルビン酸オキシダーゼ活性測定
法により調べたところ、約３ｕ／ｍｌのピルビン酸オキ
シダーゼ活性を有していた。この菌株の保有していたプ
ラスミドを実施例２と同様にしてプラスミドを分離し、
ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子を含み、ｐＡＣＹＣ１８
４遺伝子を含むプラスミドをｐＯＸＩ３と命名した。 【００３５】ピルビン酸オキシダーゼ活性測定法 本発明のピルビン酸オキシダーゼの活性測定法は次の通
りである。 ０．５Ｍピルビン酸カリウム ０．１ｍｌ ０．５Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０） ０．２ｍｌ ０．２％４−アミノアンチピリン ０．１ｍｌ ０．２％Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン ０．２ｍｌ １０ｍＭＭｇＣｌ2 ５０μｌ １０ｍＭチアミノピロフォスフェート ２０μｌ ペルオキシダーゼ（４５Ｕ／ｍｌ） ０．１ｍｌ １ｍＭＦＡＤ １０μｌ 蒸留水 ０．２２ｍｌ 上記の組成の反応液１．０ｍｌを試験管に分取し、３７
℃、３分間予備加熱した後、酵素液２０μｌを加えて３
７℃、１０分間反応を行い、反応後、０．３ｍｌの０．
１ＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）を加えて反応を停止し、次
いでこれに蒸留水１．７ｍｌを加えた後生じた紫色を５
６５ｎｍの波長にて比色定量する。１分間に１μmoleの
過酸化水素を生じる活性を１単位（Ｕ）とした。 【００３６】 【実施例４】 〔ｐＯＸＩ３のマッピングおよびＰＯＰ遺伝子の塩基配
列の決定〕エシェリヒア・コリＷ３１１０ｐＯＸＩ３株
からｐＡＣＹＣ１８４と同様の方法でｐＯＸＩ３プラス
ミドＤＮＡを調製した。ｐＯＸＩ３ＤＮＡについて制限
酵素ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｓｃａ
Ｉ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩＩ、ＸｂａＩ（いずれも宝酒造
製）Ｈｐａｌ（東洋紡製）による切断地図を作成した。
その結果を図１に示した。ピルビン酸オキシダーゼ遺伝
子を含んだＤＮＡの塩基配列をＭ１３ファージを用いた
ジデオキシ法（Science ２１４ １２０５−１２１０
（１９８１））を用いて決定した。ＰＯＰの構造遺伝子
の塩基配列並びにアミノ酸配列を図２および図３（図３
は図２の続きである）に示した。 【００３７】 【実施例５】 〔ピルビン酸オキシダーゼの製造〕エシェリヒア・コリ
Ｗ３１１０ｐＯＸＩ３株を２０ｌのＢＨＩ培地（Ｄｉｆ
ｃｏ社製）で３７℃１８時間ジャーファーメーターによ
り培養し、５，０００ｒｐｍ１０分間の遠心で集菌し
た。生理食塩水２ｌで洗浄後、２ｌの１０ｍＭリン酸バ
ッファ（ｐＨ７．０）で懸濁した。リゾチームを１ｍｇ
／ｍｌ、ＥＤＴＡ−１Ｎａを２ｍＭ、トリトンＸ−１０
０を０．１％となるように加えて３７℃３０分間保温
し、５，０００ｒｐｍ１０分の遠心より上清液を分離し
た。この上清液１．９ｌについて硫安塩析（４０％〜６
６％）を行い、沈殿物を遠心（５，０００ｒｐｍ３０
分）により集めた。この沈殿物を２００ｍｌの１０ｍＭ
リン酸バッファ（ｐＨ７．０，１０μＭのＦＡＤを含
む）で溶解し、セファデックスＧ−２５で脱塩処理をし
た。この後、ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂを用い
てイオン交換クロマトを行い活性画分を分取後脱塩し、
凍結乾燥により粉末標品を得た。この酵素標品前述のピ
ルビン酸オキシダーゼ活性測定法により測定した５１ｕ
／ｍｇの比活性を有していた。 【００３８】 【実施例６】 〔組換え体より分離精製したピルビン酸オキシダーゼの
アミノ末端部分のアミノ酸配列の決定〕実施例５で分離
精製したピルビン酸オキシダーゼについてベックマン社
のアミノ酸シークエンサー（Beckman System ９８０Ｍ
Ｅ）を用いてアミノ末端から１０個のアミノ酸の配列を
調べた。 【００３９】その結果、約８０％のものにＮ末にMet が
存在しアミノ酸配列の１位からSerAsn Lys Ile Asn Ile
Gly Leu (Ala) の配列であることを確認した。 【００４０】 【発明の効果】本発明によって、ピルビン酸オキシダー
ゼ遺伝子および、ピルビン酸オキシダーゼのアミノ酸配
列が明らかになり、また、遺伝子工学手法による効率的
なピルビン酸オキシダーゼの製造方法を提供した。ま
た、本発明のピルビン酸オキシダーゼ遺伝子と種々の遺
伝子工学的手法とを用いることによって、より効率的な
ピルビン酸オキシダーゼの製造方法をもたらしめるもの
である。 【００４１】 【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：５９１アミノ酸残基 配列の種類：ペプチド 配列の名称：ピルビン酸オキシダーゼのアミノ酸配列 配列 Ser Asp Asn Lys Ile Asn Ile Gly Leu Ala Val Met Lys Ile Leu 15 Glu Ser Trp Gly Ala Asp Thr Ile Tyr Gly Ile Pro Ser Gly Thr 30 Leu Ser Ser Leu Met Asp Ala Met Gly Glu Glu Glu Asn Asn Val 45 Lys Phe Leu Gln Val Lys His Glu Glu Val Gly Ala Met Ala Ala 60 Val Met Gln Ser Lys Phe Gly Gly Asn Leu Gly Val Thr Val Gly 75 Ser Gly Gly Pro Gly Ala Ser His Leu Ile Asn Gly Leu Tyr Asp 90 Ala Ala Met Asp Asn Ile Pro Val Val Ala Ile Leu Gly Ser Arg 105 Pro Gln Arg Glu Leu Asn Met Asp Ala Phe Gln Glu Leu Asn Gln 120 Asn Pro Met Tyr Asp His Ile Ala Val Tyr Asn Arg Arg Val Ala 135 Tyr Ala Glu Gln Leu Pro Lys Leu Val Asp Glu Ala Ala Arg Met 150 Ala Ile Ala Lys Arg Gly Val Ala Val Leu Glu Val Pro Gly Asp 165 Phe Ala Lys Val Glu Ile Asp Asn Asp Gln Trp Tyr Ser Ser Ala 180 Asn Ser Leu Arg Lys Tyr Ala Pro Ile Ala Pro Ala Ala Gln Asp 195 Ile Asp Ala Ala Val Glu Leu Leu Asn Asn Ser Lys Arg Pro Val 210 Ile Tyr Ala Gly Ile Gly Thr Met Gly His Gly Pro Ala Val Gln 225 Glu Leu Ala Arg Lys Ile Lys Ala Pro Val Ile Thr Thr Gly Lys 240 Asn Phe Glu Thr Phe Glu Trp Asp Phe Glu Ala Leu Thr Gly Ser 255 Thr Tyr Arg Val Gly Trp Lys Pro Ala Asn Glu Thr Ile Leu Glu 270 Ala Asp Thr Val Leu Phe Ala Gly Ser Asn Phe Pro Phe Ser Glu 285 Val Glu Gly Thr Phe Arg Asn Val Asp Asn Phe Ile Gln Ile Asp 300 Ile Asp Pro Ala Met Leu Gly Lys Arg His His Ala Asp Val Ala 315 Ile Leu Gly Asp Ala Gly Leu Ala Ile Asp Glu Ile Leu Asn Lys 330 Val Asp Ala Val Glu Glu Ser Ala Trp Trp Thr Ala Asn Leu Lys 345 Asn Ile Ala Asn Trp Arg Glu Tyr Ile Asn Met Leu Glu Thr Lys 360 Glu Glu Gly Asp Leu Gln Phe Tyr Gln Val Tyr Asn Ala Ile Asn 375 Asn His Ala Asp Glu Asp Ala Ile Tyr Ser Ile Asp Val Gly Asn 390 Ser Thr Gln Thr Ser Ile Arg His Leu His Met Thr Pro Lys Asn 405 Met Trp Arg Thr Ser Pro Leu Phe Ala Thr Met Gly Ile Ala Ile 420 Pro Gly Gly Leu Gly Ala Lys Asn Thr Tyr Pro Asp Arg Gln Val 435 Trp Asn Ile Ile Gly Asp Gly Ala Phe Ser Met Thr Tyr Pro Asp 450 Val Val Thr Asn Val Arg Tyr Asn Met Pro Val Ile Asn Val Val 465 Phe Ser Asn Thr Glu Tyr Ala Phe Ile Lys Asn Lys Tyr Glu Asp 480 Thr Asn Lys Asn Leu Phe Gly Val Asp Phe Thr Asp Val Asp Tyr 495 Ala Lys Ile Ala Glu Ala Gln Gly Ala Lys Gly Phe Thr Val Ser 510 Arg Ile Glu Asp Met Asp Arg Val Met Ala Glu Ala Val Ala Ala 525 Asn Lys Ala Gly His Thr Val Val Ile Asp Cys Lys Ile Thr Gln 540 Asp Arg Pro Ile Pro Val Glu Thr Leu Lys Leu Asp Ser Lys Leu 555 Tyr Ser Glu Asp Glu Ile Lys Ala Tyr Lys Glu Arg Tyr Glu Ala 570 Ala Asn Leu Val Pro Phe Arg Glu Tyr Leu Glu Ala Glu Gly Leu 585 Glu Ser Lys Tyr Ile Lys 591 【００４２】 【配列表】 配列番号：２ 配列の長さ：１７７３塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：アエロコッカス・ビリダンス 株名：ＩＦＯ０１２２１９ 配列の特徴：ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子 配列 TCA GAT AAC AAA ATT AAC ATC GGT TTA GCA GTT ATG AAG ATT TTA 45 GAA TCT TGG GGA GCA GAT ACT ATT TAT GGT ATT CCT TCA GGT ACT 90 TTA AGC TCA TTA ATG GAT GCT ATG GGT GAA GAA GAA AAC AAC GTC 135 AAA TTC CTA CAA GTG AAA CAC GAA GAA GTA GGT GCA ATG GCT GCT 180 GTA ATG CAA AGC AAA TTC GGC GGT AAC TTA GGT GTT ACT GTA GGT 225 TCT GGT GGA CCA GGT GCA TCT CAC TTG ATC AAC GGT TTA TAC GAT 270 GCA GCA ATG GAT AAC ATT CCA GTA GTT GCG ATC TTA GGT TCT CGT 315 CCA CAA CGC GAA TTA AAC ATG GAC GCT TTC CAA GAA TTA AAC CAG 360 AAC CCA ATG TAC GAC CAT ATT GCA GTT TAC AAC CGT CGT GTA GCT 405 TAT GCT GAG CAA TTA CCA AAA TTA GTT GAC GAA GCA GCT CGT ATG 450 GCT ATC GCT AAA CGC GGT GTA GCA GTT CTA GAA GTA CCT GGT GAT 495 TTT GCT AAA GTT GAA ATC GAC AAC GAC CAA TGG TAT TCA TCT GCA 540 AAC AGC TTA CGT AAA TAT GCA CCA ATC GCT CCA GCA GCA CAA GAT 585 ATC GAC GCA GCA GTT GAA TTA TTA AAC AAC TCT AAA CGT CCA GTT 630 ATC TAC GCT GGT ATT GGT ACT ATG GGC CAC GGT CCT GCA GTT CAA 675 GAA TTA GCT CGT AAA ATC AAA GCG CCA GTT ATC ACT ACT GGT AAA 720 AAC TTT GAA ACT TTC GAG TGG GAT TTC GAA GCG TTA ACA GGT TCT 765 ACT TAT CGT GTA GGT TGG AAA CCA GCT AAC GAA ACA ATT TTA GAA 810 GCT GAC ACA GTA TTA TTT GCT GGT TCA AAC TTC CCA TTC TCA GAG 855 GTT GAA GGT ACT TTC CGT AAC GTG GAT AAC TTC ATC CAA ATC GAT 900 ATC GAC CCA GCT ATG TTA GGT AAA CGT CAC CAC GCT GAT GTT GCT 945 ATC TTA GGT GAT GCT GGT CTA GCA ATC GAC GAA ATC TTA AAC AAA 990 GTA GAT GCT GTT GAA GAG TCA GCA TGG TGG ACA GCT AAC TTG AAA 1035 AAC ATC GCT AAC TGG CGT GAA TAC ATC AAC ATG TTA GAA ACT AAA 1080 GAA GAA GGC GAC TTG CAA TTC TAC CAA GTG TAC AAT GCA ATC AAC 1125 AAC CAC GCC GAC GAA GAT GCA ATC TAC TCT ATT GAT GTT GGT AAC 1170 TCA ACT CAA ACT TCT ATC CGT CAT TTA CAT ATG ACA CCT AAA AAC 1215 ATG TGG AGA ACT TCT CCA TTA TTC GCG ACA ATG GGT ATC GCT ATC 1260 CCT GGT GGT TTA GGT GCT AAA AAC ACT TAC CCA GAT CGT CAA GTT 1305 TGG AAC ATC ATC GGT GAT GGT GCT TTC TCT ATG ACT TAC CCA GAT 1350 GTA GTA ACT AAC GTA CGT TAC AAC ATG CCT GTA ATC AAC GTT GTA 1395 TTC TCT AAC ACT GAA TAT GCC TTC ATC AAA AAC AAA TAT GAA GAC 1440 ACT AAC AAA AAC TTA TTC GGT GTA GAC TTT ACA GAT GTT GAT TAC 1485 GCT AAA ATC GCT GAA GCA CAA GGT GCT AAA GGA TTT ACT GTA AGC 1530 CGT ATC GAA GAT ATG GAC CGT GTA ATG GCT GAA GCT GTT GCA GCT 1575 AAT AAA GCA GGT CAC ACT GTC GTT ATC GAC TGT AAG ATT ACT CAA 1620 GAT CGT CCA ATC CCT GTA GAA ACA TTG AAA TTA GAT TCA AAA CTT 1665 TAC AGC GAA GAC GAA ATC AAA GCT TAC AAA GAA CGC TAC GAA GCT 1710 GCT AAC TTA GTA CCA TTC AGA GAG TAC TTA GAA GCT GAA GGC TTA 1755 GAA TCT AAA TAC ATC AAA 1773
ダーゼの遺伝情報を有するポリデオキシリボ核酸を保持
してなる形質転換体により該ポリデオキシリボ核酸の遺
伝情報を発現せしめて得られるピルビン酸オキシダーゼ
およびその製造方法に関する。 【０００２】 【従来の技術】ピルビン酸オキシダーゼは、ピルビン
酸，燐酸および酸素からアセチルリン酸，二酸化炭素お
よび過酸化水素を生ずる反応を触媒するものであって、
ラクトバチルス・デルブリゥキィ（Lactobacillus delb
rucki ) 〔Williams,F.R. ＆ Hager,L.P.(1966) Arch.
Biochem.Biophys. 116 168-176 〕ペディオコッカス
（Pediococcus ）、ストレプトコッカス（Streptococcu
s ）、アエロッコカス・ビリダンス（Aerococcus virid
ans ）〔特公昭５８−４０４６５号公報〕に属する細菌
に存在することが報告されている。 【０００３】また、ピルビン酸オキシダーゼは、ピルビ
ン酸を基質とする酸化酵素であるため、血清などの体液
中に存在するピルビン酸の定量に使用されるだけでな
く、グルタミン酸−オキザロ酢酸トランスアミナーゼ、
グルタミン酸−ピルビン酸トランスアミナーゼ，ラクテ
ートデヒドロゲナーゼ、ノイラミニダーゼ−Ｎアセチル
ノイラミン酸アルドラーゼなどのピルビン酸生成系にお
いて生じたピルビン酸量を測定することによりピルビン
酸生成系に関与した酵素の基質である種々の物質の定量
またはピルビン酸生成系に関与した各酵素活性の測定な
ど、研究用試薬、臨床診断用試薬として極めて有用であ
る。 【０００４】 【発明が解決しようとする課題】従来より報告されてい
るピルビン酸オキシダーゼ生産菌は、ピルビン酸オキシ
ダーゼの生産性が低く製造コスト的に高価になるという
難点があるだけでなく、共存する他種酵素等の除去が非
常に困難で、純度の高い良質なピルビン酸オキシダーゼ
を得るために精製コストが非常に高いものとなり、研究
用試薬、臨床診断用試薬として安易に広く用いるには必
ずしも満足のいくものではなかった。 【０００５】また、従来より報告されているピルビン
酸、燐酸および酸素からアセチルリン酸、二酸化炭素お
よび過酸化水素を生ずる反応を触媒するピルビン酸オキ
シダーゼの詳細な化学構造は報告されていない。 【課題を解決するための手段】本発明者らは、該ピルビ
ン酸オキシダーゼの生産性向上を計るべく鋭意検討を試
みたところ、該ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子の採取な
らびに一次構造解析に成功すると共に遺伝子工学的手法
を応用することによって、以下に述べる如く、高生産性
である製造法を確立した。 【０００６】すなわち、本発明は、下記のＮ末端側より
のアミノ酸配列をコードするピルビン酸オキシダーゼ遺
伝子であるポリデオキシリボ核酸または該遺伝子が構成
成分であるポリデオキシリボ核酸を発現ベクターに組み
入れた組換えＤＮＡを宿主微生物に移入して形質転換体
を得、該形質転換体を培養して該ポリデオキシリボ核酸
の遺伝情報を発現させ、次いでピルビン酸オキシダーゼ
であるポリペプチドまたは該ピルビン酸オキシダーゼが
構成成分であるポリペプチドを採取してなるピルビン酸
オキシダーゼの製造法である。 Ａ−Ser Asp Asn Lys Ile Asn Ile Gly Leu Ala Val Met Lys Ile Leu Glu Ser Trp Gly Ala Asp Thr Ile Tyr Gly Ile Pro Ser Gly Thr Leu Ser Ser Leu Met Asp Ala Met Gly Glu Glu Glu Asn Asn Val Lys Phe Leu Gln Val Lys His Glu Glu Val Gly Ala Met Ala Ala Val Met Gln Ser Lys Phe Gly Gly Asn Leu Gly Val Thr Val Gly Ser Gly Gly Pro Gly Ala Ser His Leu Ile Asn Gly Leu Tyr Asp Ala Ala Met Asp Asn Ile Pro Val Val Ala Ile Leu Gly Ser Arg Pro Gln Arg Glu Leu Asn Met Asp Ala Phe Gln Glu Leu Asn Gln Asn Pro Met Tyr Asp His Ile Ala Val Tyr Asn Arg Arg Val Ala Tyr Ala Glu Gln Leu Pro Lys Leu Val Asp Glu Ala Ala Arg Met Ala Ile Ala Lys Arg Gly Val Ala Val Leu Glu Val Pro Gly Asp Phe Ala Lys Val Glu Ile Asp Asn Asp Gln Trp Tyr Ser Ser Ala Asn Ser Leu Arg Lys Tyr Ala Pro Ile Ala Pro Ala Ala Gln Asp Ile Asp Ala Ala Val Glu Leu Leu Asn Asn Ser Lys Arg Pro Val Ile Tyr Ala Gly Ile Gly Thr Met Gly His Gly Pro Ala Val Gln Glu Leu Ala Arg Lys Ile Lys Ala Pro Val Ile Thr Thr Gly Lys Asn Phe Glu Thr Phe Glu Trp Asp Phe Glu Ala Leu Thr Gly Ser Thr Tyr Arg Val Gly Trp Lys Pro Ala Asn Glu Thr Ile Leu Glu Ala Asp Thr Val Leu Phe Ala Gly Ser Asn Phe Pro Phe Ser Glu Val Glu Gly Thr Phe Arg Asn Val Asp Asn Phe Ile Gln Ile Asp Ile Asp Pro Ala Met Leu Gly Lys Arg His His Ala Asp Val Ala Ile Leu Gly Asp Ala Gly Leu Ala Ile Asp Glu Ile Leu Asn Lys Val Asp Ala Val Glu Glu Ser Ala Trp Trp Thr Ala Asn Leu Lys Asn Ile Ala Asn Trp Arg Glu Tyr Ile Asn Met Leu Glu Thr Lys Glu Glu Gly Asp Leu Gln Phe Tyr Gln Val Tyr Asn Ala Ile Asn Asn His Ala Asp Glu Asp Ala Ile Tyr Ser Ile Asp Val Gly Asn Ser Thr Gln Thr Ser Ile Arg His Leu His Met Thr Pro Lys Asn Met Trp Arg Thr Ser Pro Leu Phe Ala Thr Met Gly Ile Ala Ile Pro Gly Gly Leu Gly Ala Lys Asn Thr Tyr Pro Asp Arg Gln Val Trp Asn Ile Ile Gly Asp Gly Ala Phe Ser Met Thr Tyr Pro Asp Val Val Thr Asn Val Arg Tyr Asn Met Pro Val Ile Asn Val Val Phe Ser Asn Thr Glu Tyr Ala Phe Ile Lys Asn Lys Tyr Glu Asp Thr Asn Lys Asn Leu Phe Gly Val Asp Phe Thr Asp Val Asp Tyr Ala Lys Ile Ala Glu Ala Gln Gly Ala Lys Gly Phe Thr Val Ser Arg Ile Glu Asp Met Asp Arg Val Met Ala Glu Ala Val Ala Ala Asn Lys Ala Gly His Thr Val Val Ile Asp Cys Lys Ile Thr Gln Asp Arg Pro Ile Pro Val Glu Thr Leu Lys Leu Asp Ser Lys Leu Tyr Ser Glu Asp Glu Ile Lys Ala Tyr Lys Glu Arg Tyr Glu Ala Ala Asn Leu Val Pro Phe Arg Glu Tyr Leu Glu Ala Glu Gly Leu Glu Ser Lys Tyr Ile Lys −Ｂ （Ｉ） 〔式中、Ａはアミノ酸残基、水素原子またはアセチル基
を示し、Ｂはアミノ酸残基、−ＯＨまたは−ＮＨ2 を示
す〕に関するものである。 【０００７】上記ポリペプチド（Ｉ）に関し、Ａで示さ
れるアミノ酸残基としては、一個または複数個のアミノ
酸残基よりなり、Ａとしては、好ましくは、水素原子若
しくはMet またはシグナルペプチドが挙げられる。Ｂで
示されるものとしては、酸アミドであってもよく、また
一個以上のアミノ酸残基であってもよい。ピルビン酸、
燐酸および酸素からアセチルリン酸、二酸化炭素および
過酸化水素を生ずる反応を触媒するピルビン酸オキシダ
ーゼ遺伝子であるポリデオキシリボ核酸または該遺伝子
が構成成分であるポリデオキシリボ核酸としては、少な
くともピルビン酸、燐酸および酸素からアセチルリン
酸、二酸化炭素および過酸化水素を生ずる反応を触媒す
るピルビン酸オキシダーゼ遺伝子それ自体を含むポリデ
オキシリボ核酸であればよく、例えば該ピルビン酸オキ
シダーゼ遺伝子それ自体としてはＮ末端側より式 で表されるピルビン酸、燐酸および酸素からアセチルリ
ン酸、二酸化炭素および過酸化水素を生ずる反応を触媒
するピルビン酸オキシダーゼからなるポリペプチドのア
ミノ酸配列をコードする塩基配列であるポリデオキシリ
ボ核酸を挙げることが出来る。 【０００８】また式（ＩＩ）で表されるピルビン酸オキ
シダーゼであるポリペプチドのアミノ酸配列において、
各アミノ酸に対応する一連のコドンのうちのいずれか１
個のコドンからなるポリデオキシリボ核酸であればよ
く、さらに該ポリデオキシリボ核酸の５’末端に１個以
上のナンセンスコドン以外のコドンおよび／または３’
末端に１個以上のコドンを有するポリデオキシリボ核酸
であってもよい。例えば、その代表例として５’末端側
より式 〔式中、ＸはTAA,TAG およびTGA 以外のコドンまたは水
素原子を示し、Ｙはコドンまたは水素原子を示す〕で表
される塩基配列を有するポリデオキシリボ核酸を挙げる
ことができる。 【０００９】式（ＩＩＩ）で表される塩基配列に関し、
Ｘで示されるコドンは、アミノ酸をコードするコドンで
あればいずれでもよく、更に、その５’末端側にアミノ
酸をコードするコドンを１個以上有してもよいが、好ま
しくはATG またはシグナルペプチドに対応するポリデオ
キシリボ核酸を挙げることができる。Ｙで示されるコド
ンは、翻訳終止コドンまたはアミノ酸をコードするコド
ンであればいずれでもよく、更に、その３’末端側にア
ミノ酸をコードするコドンを１個以上有していてもよい
が、その場合には、この複数個のコドンの３’末端に翻
訳終止コドンを有することが好ましい。 【００１０】ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子を構成成分
としてなるポリデオキシリボ核酸または、式（ＩＩ）で
表されるアミノ酸配列をコードする塩基配列からなる遺
伝子であるポリデオキシリボ核酸または、式（ＩＩＩ）
で表されるポリデオキシリボ核酸は、例えばピルビン酸
オキシダーゼを生産するピルビン酸オキシダーゼ遺伝子
の供与体である微生物より該微生物のＤＮＡを分離精製
した後、超音波、制限酵素などを用いてＤＮＡと切断し
たリニヤーな発現ベクターとを両ＤＮＡの平滑または接
着末端部においてＤＮＡリガーゼなどにより結合閉環さ
せ、かくして得られた組換えＤＮＡベクターを複製可能
な宿主微生物に移入した後、ベクターのマーカーとピル
ビン酸オキシダーゼの活性とを指標としてスクリーニン
グして取得した該組換えＤＮＡベクターを保持する微生
物を培養し、該培養菌体から該組換えＤＮＡベクターを
分離精製し、次いで該組換えＤＮＡベクターからピルビ
ン酸オキシダーゼ遺伝子であるポリデオキシリボ核酸を
採取すればよい。 【００１１】ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子の供与体で
ある微生物としては、ピルビン酸オキシダーゼ産生能を
有する微生物であればよく、例えば、好適に特開昭５４
−１２６７９１号公報に示されているアエロコッカス・
ビリダンス（Aerococcus viridans ）の微生物が適宜選
ばれる。 【００１２】また、遺伝子組換え技術を駆使して、ピル
ビン酸オキシダーゼ産生能を付与せしめた形質転換微生
物をピルビン酸オキシダーゼ遺伝子の供与体として利用
してもよい。遺伝子の供与体である微生物から由来する
ＤＮＡは次の如くにして採取される。即ち、供与微生物
である上述した細菌のいずれかを、例えば、液体培地で
約１〜３日間通気撹拌培養し、得られる培養物を遠心分
離して集菌し、次いでこれを溶菌させることによってピ
ルビン酸オキシダーゼ遺伝子の含有溶菌物を調製するこ
とができる。溶菌方法としては、例えばリゾチームやβ
ーグルカナーゼなどの細胞壁溶解酵素による処理が施さ
れ、必要によりプロテアーゼなどの他の酵素やラウリル
硫酸ナトリウムなどの界面活性剤が併用され、さらに細
胞壁の物理的破壊法である凍結融解やフレンチプレス処
理を上述の溶菌法との組み合せで行ってもよい。 【００１３】このようにして得られた溶菌物からＤＮＡ
を分離、精製するには、常法に従って、例えばフェノー
ル抽出による除蛋白処理、プロテアーゼ処理、リボヌク
レアーゼ処理、アルコール沈澱、遠心分離などの方法を
適宜組み合わせることにより行うことができる。分離精
製された微生物ＤＮＡを切断する方法は、例えば、超音
波処理、制限酵素処理などにより行うことができるが、
得られるＤＮＡ断片とベクターとの結合を容易ならしめ
るため、制限酵素、とりわけ特定ヌクレオチド配列に作
用する、例えば、ＥｃｏＲＩ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｂａｍ
ＨＩなどのＩＩ型制限酵素が適している。 【００１４】ベクターとしては、宿主微生物で自律的に
増殖しうるファージまたはプラスミドから遺伝子組換え
用として構築されたものが適している。ファージとして
は、例えば、エシェリヒア・コリ（Escherichia coli）
を宿主微生物とする場合には、λgt・λＣ、λgt・λＢ
などが使用できる。また、プラスミドとしては、例え
ば、エシェリヒア・コリを宿主微生物とする場合にはｐ
ＢＲ３２２、ｐＢＲ３２５、ｐＡＣＹＣ１８４、ｐＵＣ
１２、ｐＵＣ１３、ｐＵＣ１８、ｐＵＣ１９などが、バ
チルス・ズブチルス（Bacillus subtillis）を宿主微生
物とする場合には pUB110 、pC194 などが使用でき、さ
らに、エシェリヒア・コリおよびサッカロマイセス・セ
レビシアなどのグラム陰・陽両性にまたがる二種以上の
宿主微生物で自律的に増殖可能なシャトルベクターを利
用することもできる。このようなベクターを、先に述べ
たピルビン酸オキシダーゼ遺伝子供与体である微生物Ｄ
ＮＡの切断に使用した制限酵素と同じ制限酵素で切断し
て、ベクター断片を得ることが好ましい。 【００１５】微生物ＤＮＡ断片とベクター断片とを結合
させる方法は、公知のＤＮＡリガーゼを用いる方法であ
ればよく、例えば、微生物ＤＮＡ断片の接着末端とベク
ター断片の接着末端とのアニーリングの後、適当なＤＮ
Ａリガーゼの作用により微生物ＤＮＡ断片とベクター断
片との組換えＤＮＡを作成する。必要ならば、アニーリ
ングの後、宿主微生物に移入して、生体内のＤＮＡリガ
ーゼを利用し組換えＤＮＡを作成することもできる。 【００１６】宿主微生物としては、組換えＤＮＡが安定
かつ自律的に増殖可能で、且つ外来性ＤＮＡの形質が発
現のできるものであればよく、例えば、宿主微生物がエ
シェリヒア・コリの場合、エシェリヒア・コリＤＨ１、
エシェリヒア・コリＨＢ１０１、エシェリヒア・コリＷ
３１１０、エシェリヒア・コリＣ６００等が利用出来
る。 【００１７】宿主微生物に組換えＤＮＡを移入する方法
としては、例えば、宿主微生物がエシェリヒア属に属す
る微生物の場合には、カルシュウムイオンの存在下で組
換えＤＮＡの移入を行い、またバチルス属に属する微生
物の場合には、コンピテントセル法またはプロトプラス
ト法などを採用することができ、さらにマイクロインジ
ェクション法を用いてもよい。かくして得られた形質転
換体である微生物は、栄養培地に培養されることにより
多量のピルビン酸オキシダーゼを安定して産生し得るこ
とを見出した。 【００１８】宿主微生物への目的組換えＤＮＡ移入の有
無についての選択は、目的組換えＤＮＡを保持するベク
ターの薬剤耐性マーカーとピルビン酸オキシダーゼとを
同時に発現し得る微生物を検索すればよく、例えば、薬
剤耐性マーカーに基づく選択培地で生育し、かつピルビ
ン酸オキシダーゼを生成する微生物を選択すればよいこ
のようにして一度選択されたピルビン酸オキシダーゼ遺
伝子を保有する組換えＤＮＡは、形質転換微生物から取
り出され、他の宿主微生物に移入することも容易に実施
できる。また、ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子を保持す
る組換えＤＮＡから制限酵素などにより切断してピルビ
ン酸オキシダーゼ遺伝子であるＤＮＡを切り出し、これ
と同様な方法により切断して得られるベクター断片とを
結合させて、宿主微生物に移入することも容易に実施で
きる。 【００１９】また本質的にピルビン酸オキシダーゼ活性
であるピルビン酸オキシダーゼムテインのＤＮＡは、本
発明のピルビン酸オキシダーゼ遺伝子から遺伝子工学的
手法により作製される人工変異遺伝子であり、この人工
変異遺伝子は上述の種々なる方法を使用して増幅され、
最終的には、この変異遺伝子をベクターに挿入せしめて
組換えＤＮＡを作成し、これを宿主微生物に移入させる
ことによって、ピルビン酸オキシダーゼムテインの製造
が可能である。 【００２０】さらに上述の方法により得られたピルビン
酸オキシダーゼ遺伝子の塩基配列は、Science 214 12
05〜1210 (1981年) に示されているジデオキシ法で解読
し、またピルビン酸オキシダーゼのアミノ酸配列は、塩
基配列より決定した。一方、ピルビン酸オキシダーゼで
あるペプチドのＮ末端部を構成する部分アミノ酸配列
は、以下の如くにして決定した。即ち、ピルビン酸オキ
シダーゼ産生能を有するピルビン酸オキシダーゼ遺伝子
供与微生物を栄養培地で培養して菌体内にピルビン酸オ
キシダーゼを産生蓄積せしめ、培養終了後、得られた培
養物を濾過または遠心分離などの手段により菌体を採取
し、次いでこの菌体を機械的方法またはリゾチームなど
の酵素的方法で破壊し、また必要に応じてＥＤＴＡおよ
び／または適当な界面活性剤等を添加してピルビン酸オ
キシダーゼが可溶化され、水溶液として分離採取され
る。この様にして得られたピルビン酸オキシダーゼの水
溶液を濃縮するか、または濃縮することなく硫安分画、
ゲル濾過、吸着クロマトグラフィー、イオン交換クロマ
トグラフィーにより処理して、高純度ピルビン酸オキシ
ダーゼが得られ、高純度ピルビン酸オキシダーゼを用い
て液相プロテイン シーケンサー（ベックマン社製：Ｂ
ＥＣＫＭＡＮ Ｓｙｓｔｅｍ ８９０ＭＥ）によりピル
ビン酸オキシダーゼであるペプチドのＮ末端部を構成す
る部分アミノ酸配列が決定され、少なくとも、該部分ア
ミノ酸配列は、遺伝子操作によって得られたピルビン酸
オキシダーゼのＮ末端部分アミノ酸配列と一致するもの
であることを確認した。 【００２１】形質転換体である宿主微生物の培養形態は
宿主の栄養生理的性質を考慮して培養条件を選択すれば
良く、通常多くの場合は、液体培養で行うか、工業的に
は深部通気撹拌培養を行うのが有利である。 培地の栄
養源としては、微生物の培養に通常用いられるものが広
く使用され得る。炭素源としては、資化可能な炭素化合
物であればよく、例えばグルコース、シュクロース、ラ
クトース、マルトース、フラクトース、糖蜜、ピルビン
酸などが使用される。窒素源としては利用可能な窒素化
合物であればよく、例えばペプトン、肉エキス、酵母エ
キス、カゼイン加水分解物などが使用される。その他、
リン酸塩、炭酸塩、硫酸塩、マグネシウム、カルシウ
ム、カリウム、鉄、マンガン、亜鉛などの塩類、特定の
アミノ酸、特定のビタミンなどが必要に応じて使用され
る。 【００２２】培養温度は菌が発育し、ピルビン酸オキシ
ダーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒ
ア・コリの場合、好ましくは２０〜４２℃程度である。
培養時間は、条件によって多少異なるが、ピルビン酸オ
キシダーゼが最高収量に達する時期を見計らって適当な
時期に培養を終了すればよく、通常は１２〜４８時間程
度である。培地ｐＨは菌が発育し、ピルビン酸オキシダ
ーゼを生産する範囲で適宜変更し得るが、特に好ましく
はｐＨ６．０〜８．０程度である。 【００２３】培養物中のピルビン酸オキシダーゼは、菌
体を含む培養液そのままを採取し、利用することもでき
るが、一般には常法に従って、ピルビン酸オキシダーゼ
が培養液中に存在する場合には、濾過、遠心分離などに
よりピルビン酸オキシダーゼ含有溶液と微生物菌体とを
分離した後に利用される。ピルビン酸オキシダーゼが菌
体内に存在する場合には、得られた培養物を濾過または
遠心分離などの手段により、菌体を採取し、次いでこの
菌体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で
破壊し、また必要に応じてＥＤＴＡ等のキレート剤およ
び／または界面活性剤を添加してピルビン酸オキシダー
ゼを可溶化し水溶液として分離採取する。 【００２４】この様にして得られたピルビン酸オキシダ
ーゼ含有溶液を、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、更に、硫
安、硫酸ナトリウムなどの塩析処理、あるいは親水性有
機溶媒、例えばメタノール、エタノール、アセトンなど
による分別沈澱法により沈澱せしめればよい。次いでこ
の沈澱物を、水に溶解し、半透膜にて透析せしめて、よ
り低分子量の不純物を除去することができる。また吸着
剤あるいはゲル濾過剤などによるゲル濾過、吸着クロマ
トグラフィー、イオン交換クロマトグラフィーにより精
製し、これらの手段を用いて得られるピルビン酸オキシ
ダーゼ含有溶液は、減圧濃縮凍結乾燥等の処理にてより
精製されたピルビン酸オキシダーゼを得る。 【００２５】本明細書に記載のアミノ酸、ペプチド、核
酸、核酸関連物質、その他に関する略号は、それらの当
該分野における慣用略号に基づくもので、それらの例を
以下に列記する。またすべてのアミノ酸はＬ体を示すも
のとする。 ＤＮＡ ： デオキシリボ核酸 ＲＮＡ ： リボ核酸 Ａ ： アデニン Ｔ ： チミン Ｇ ： グアニン Ｃ ： シトシン Ａｌａ ： アラニン Ａｒｇ ： アルギニン Ａｓｎ ： アスパラギン Ａｓｐ ： アスパラギン酸 Ｃｙｓ ： システイン Ｇｌｎ ： グルタミン Ｇｌｕ ： グルタミン酸 Ｇｌｙ ： グリシン Ｈｉｓ ： ヒスチジン Ｉｌｅ ： イソロイシン Ｌｅｕ ： ロイシン Ｌｙｓ ： リジン Ｍｅｔ ： メチオニン Ｐｈｅ ： フェニルアラニン Ｐｒｏ ： プロリン Ｓｅｒ ： セリン Ｔｈｒ ： スレオニン Ｔｒｐ ： トリプトファン Ｔｙｒ ： チロシン Ｖａｌ ： バリン 【００２６】 【実施例】以下、実施例で本発明を詳細に説明する。 【００２７】 【実施例１】 〔染色体ＤＮＡの分離〕Aerococcus viridans （ＩＦＯ
０１２２１９）の染色体ＤＮＡを次の方法で分離した同
菌株を１５０ｍｌの普通ブイヨン培地（０．５％チオ硫
酸ソーダ含有）で３７℃一晩震盪培養後遠心（３，００
０回転１０分）により集菌した。１０％サッカロース、
５０ｍＭトリス塩酸（ｐＨ８．０）５０ｍＭのＥＤＴＡ
を含んだ溶液５ｍｌに懸濁させ、１ｍｌのリゾチーム溶
液（１０ｍｇ／ｍｌ）を加えて３７°Ｃ、１５分間保温
し、次いで１ｍｌの１０％ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリ
ウム）溶液を加えた、この懸濁液に等量のクロロホルム
−フェノール混液（１：１）を加え、攪拌混合し、１
０，０００ｒｐｍ３分の遠心で水層と溶媒層に分け、水
層を合取した。 【００２８】この水層に２倍量のエタノールを静かに重
層し、ガラス棒でゆっくり攪拌しながらＤＮＡをガラス
棒にまきつかせて分離した。これを１０ｍｌの１０ｍＭ
トリス塩酸（ｐＨ８．０）、１ｍＭのＥＤＴＡを含んだ
溶液（以下ＴＥと略す）で溶解した。これを等量のクロ
ロホルム−フェノール混液で処理後、遠心により水層を
分取し、２倍量のエタノールを加えて上記の方法でもう
一度ＤＮＡを分離し、２ｍｌのＴＥで溶解した。 【００２９】 【実施例２】 〔ｐＡＣＹＣ／８４プラスミドＤＮＡの分離〕ｐＡＣＹ
Ｃ／８４を保有するエシェリヒア・コリｐＭ１９１（J.
Bacteriol１３４，１１４１（１９８１）；ＡＴＣＣ３
７０３３）を１ｌのＢＨＩ培地（Ｄｉｆｃｏ社製）で震
盪培養した。濁度がＯＤ660 ＝１．０に増殖したとき、
スペクチノマイシン（最終濃度３００μｇ／ｍｌ、プラ
スミドの耐性マーカーとしてクロラムフェニコールが含
まれているとき）を加え、さらに３７℃で１６時間以上
震盪を続けた。３０００ｒｐｍ１０分間の遠心により集
菌し、リゾチーム−ＳＤＳ法とセシウムクロライド−エ
チジウムプロマイド法（Maniortis ら：Molecular Clon
ing pp８６〜９４Cold Spring Harbor（１９８２））に
従いプラスミドＤＮＡを調製した。 【００３０】 【実施例３】 〔ピルビン酸オキシダーゼ（ＰＯＰ）遺伝子を有するプ
ラスミドｐＯＸＩ３の作成〕 (i) 実施例１で調製したA. viridans の染色体ＤＮＡ２
μｌ（約０．５μｇ）と１０倍濃度のＥｃｏＲＩ切断用
バッファー（５００ｍＭトリス塩酸（ｐＨ７．５）、７
０ｍＭＭｇＣｌ2 、１ＭＮａＣｌ、７０ｍＭメルカプト
エタノール）１μｌ，ＥcoＲＩ（宝酒造製 １．０unit
/ μl)１μｌ、水６μｌを混合し、３７℃１時間切断し
た。別に調製したプラスミドｐＡＣＹＣ１８４ＤＮＡ約
０．３μｇを同様の方法を用いてＥｃｏＲＩで切断し、
さらにアルカリ性フォスファターゼ（以下ＢＡＰと略す
ことがある。宝酒造製）０．６unitを加え、６５℃１時
間処理した。これらのＥｃｏＲＩで切断した２種のＤＮ
Ａ溶液を混合し、その１／１０量の３Ｍ酢酸ナトリウム
を加え、さらに全体量と等量のクロロホルム−フェノー
ル混液で処理し、遠心分離により水層を分取した。 【００３１】この水層に２倍容のエタノールを加え、遠
心でＤＮＡを沈殿させたのち減圧乾燥した。水８９μｌ
で溶解後、１０倍濃度のライゲーションバッファ（０．
５Ｍトリス塩酸（ｐＨ７．６）、０．１ＭＭｇＣｌ2 、
０．１Ｍジチオスレイトール、１０ｍＭスペルミジン、
１０ｍＭＡＴＰ）１０μｌとＴ4 ＤＮＡリガーゼ１μｌ
（宝酒造製１７５unit）を加え混合し４℃で一晩放置し
た。このＤＮＡ溶液をクロロホルム−フェノール処理
し、エタノール沈殿を集め減圧乾燥した後、１０μｌの
ＴＥで溶解した。 【００３２】(ii)１００ｍｌのＢＨＩ培地（Brain Hear
t Infusion, Ｄｉｆｃｏ社製）で培養した対数増殖期の
エシェリヒア・コリＷ３１１０株〔国立遺伝学研究所よ
り分与を受けた、ストック番号ＭＥ７７７８；ＡＴＣＣ
２７３２５〕を遠心分離により集菌し（１０，０００ｒ
ｐｍ．２分間）４０ｍｌの氷冷した３０ｍＭ酢酸カリウ
ム、１００ｍＭＲｂＣｌ、１０ｍＭＣａＣｌ2 、５０ｍ
ＭＭｎＣｌ2 および１５％グリセリンを含んだ溶液（ｐ
Ｈ５．８）で懸濁した。０℃で５分間放置後、遠心し上
清をすて、さらに４ｍｌの１０ｍＭＭＯＰＳ緩衝液（ド
ータイト社製）、７５ｍＭＣａＣｌ2 、１０ｍＭＲｂＣ
ｌおよび１５％グリセリンを含んだ溶液（ｐＨ６．５）
で懸濁し、０℃で１５分間放置してコンピテント細胞と
した。 【００３３】(iii) この大腸菌懸濁液２００μｌに(i)
で調製したＤＮＡ溶液１０μｌを加え、３０分間０°Ｃ
で放置した。ＢＨＩ培地１ｍｌを加え、３７℃で９０分
間保温後、この１００μｌをテトラサイクリン（１５μ
ｇ／ｍｌ）を含んだＢＨＩ寒天プレートにまき、３７℃
で一晩培養し形質転換体を得た。この形質転換体をＰＯ
Ｐ培地（組成はペプトン５ｇ、肉エキス２ｇ、イースト
エキス５ｇ、ＮａＣｌ１ｇ、Ｋ2 ＨＰＯ4 １ｇ、ＭｇＳ
Ｏ4 ０．５ｇ、パーオキシダーゼ５００ＩＵ、ＦＡＤ
７．８５ｍｇ、ジアニシジン０．１ｇ、チアミンピロフ
ォスフェート４２４ｍｇ、ピルビン酸１ｍｌ、寒天１５
ｇ、蒸留水１ｌ、ｐＨ７．０）のプレートにレプリカ
し、３７℃でさらに一晩培養した。 【００３４】約４５００コロニーの形質転換を調べたと
ころ、コロニーの周辺が茶褐色に変色したもの１株を
得、この株をエシェリヒア・コリＷ３１１０・ｐＯＸＩ
３株「微生物受託番号 微工研菌寄第９０７１号、ＦＥ
ＲＭＰ−No. ９０７１、微工研条寄第１５６５、ＦＥＲ
Ｍ ＢＰ−１５６５」と命名した。この菌を純粋分離後
ＢＨＩ培地で３７℃一晩培養し、ピルビン酸オキシダー
ゼの生産性を後述するピルビン酸オキシダーゼ活性測定
法により調べたところ、約３ｕ／ｍｌのピルビン酸オキ
シダーゼ活性を有していた。この菌株の保有していたプ
ラスミドを実施例２と同様にしてプラスミドを分離し、
ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子を含み、ｐＡＣＹＣ１８
４遺伝子を含むプラスミドをｐＯＸＩ３と命名した。 【００３５】ピルビン酸オキシダーゼ活性測定法 本発明のピルビン酸オキシダーゼの活性測定法は次の通
りである。 ０．５Ｍピルビン酸カリウム ０．１ｍｌ ０．５Ｍリン酸塩緩衝液（ｐＨ７．０） ０．２ｍｌ ０．２％４−アミノアンチピリン ０．１ｍｌ ０．２％Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン ０．２ｍｌ １０ｍＭＭｇＣｌ2 ５０μｌ １０ｍＭチアミノピロフォスフェート ２０μｌ ペルオキシダーゼ（４５Ｕ／ｍｌ） ０．１ｍｌ １ｍＭＦＡＤ １０μｌ 蒸留水 ０．２２ｍｌ 上記の組成の反応液１．０ｍｌを試験管に分取し、３７
℃、３分間予備加熱した後、酵素液２０μｌを加えて３
７℃、１０分間反応を行い、反応後、０．３ｍｌの０．
１ＭＥＤＴＡ（ｐＨ７．５）を加えて反応を停止し、次
いでこれに蒸留水１．７ｍｌを加えた後生じた紫色を５
６５ｎｍの波長にて比色定量する。１分間に１μmoleの
過酸化水素を生じる活性を１単位（Ｕ）とした。 【００３６】 【実施例４】 〔ｐＯＸＩ３のマッピングおよびＰＯＰ遺伝子の塩基配
列の決定〕エシェリヒア・コリＷ３１１０ｐＯＸＩ３株
からｐＡＣＹＣ１８４と同様の方法でｐＯＸＩ３プラス
ミドＤＮＡを調製した。ｐＯＸＩ３ＤＮＡについて制限
酵素ＣｌａＩ、ＥｃｏＲＶ、ＨｉｎｄＩＩＩ、Ｓｃａ
Ｉ、ＰｓｔＩ、ＰｖｕＩＩ、ＸｂａＩ（いずれも宝酒造
製）Ｈｐａｌ（東洋紡製）による切断地図を作成した。
その結果を図１に示した。ピルビン酸オキシダーゼ遺伝
子を含んだＤＮＡの塩基配列をＭ１３ファージを用いた
ジデオキシ法（Science ２１４ １２０５−１２１０
（１９８１））を用いて決定した。ＰＯＰの構造遺伝子
の塩基配列並びにアミノ酸配列を図２および図３（図３
は図２の続きである）に示した。 【００３７】 【実施例５】 〔ピルビン酸オキシダーゼの製造〕エシェリヒア・コリ
Ｗ３１１０ｐＯＸＩ３株を２０ｌのＢＨＩ培地（Ｄｉｆ
ｃｏ社製）で３７℃１８時間ジャーファーメーターによ
り培養し、５，０００ｒｐｍ１０分間の遠心で集菌し
た。生理食塩水２ｌで洗浄後、２ｌの１０ｍＭリン酸バ
ッファ（ｐＨ７．０）で懸濁した。リゾチームを１ｍｇ
／ｍｌ、ＥＤＴＡ−１Ｎａを２ｍＭ、トリトンＸ−１０
０を０．１％となるように加えて３７℃３０分間保温
し、５，０００ｒｐｍ１０分の遠心より上清液を分離し
た。この上清液１．９ｌについて硫安塩析（４０％〜６
６％）を行い、沈殿物を遠心（５，０００ｒｐｍ３０
分）により集めた。この沈殿物を２００ｍｌの１０ｍＭ
リン酸バッファ（ｐＨ７．０，１０μＭのＦＡＤを含
む）で溶解し、セファデックスＧ−２５で脱塩処理をし
た。この後、ＤＥＡＥ−セファロースＣＬ−６Ｂを用い
てイオン交換クロマトを行い活性画分を分取後脱塩し、
凍結乾燥により粉末標品を得た。この酵素標品前述のピ
ルビン酸オキシダーゼ活性測定法により測定した５１ｕ
／ｍｇの比活性を有していた。 【００３８】 【実施例６】 〔組換え体より分離精製したピルビン酸オキシダーゼの
アミノ末端部分のアミノ酸配列の決定〕実施例５で分離
精製したピルビン酸オキシダーゼについてベックマン社
のアミノ酸シークエンサー（Beckman System ９８０Ｍ
Ｅ）を用いてアミノ末端から１０個のアミノ酸の配列を
調べた。 【００３９】その結果、約８０％のものにＮ末にMet が
存在しアミノ酸配列の１位からSerAsn Lys Ile Asn Ile
Gly Leu (Ala) の配列であることを確認した。 【００４０】 【発明の効果】本発明によって、ピルビン酸オキシダー
ゼ遺伝子および、ピルビン酸オキシダーゼのアミノ酸配
列が明らかになり、また、遺伝子工学手法による効率的
なピルビン酸オキシダーゼの製造方法を提供した。ま
た、本発明のピルビン酸オキシダーゼ遺伝子と種々の遺
伝子工学的手法とを用いることによって、より効率的な
ピルビン酸オキシダーゼの製造方法をもたらしめるもの
である。 【００４１】 【配列表】 配列番号：１ 配列の長さ：５９１アミノ酸残基 配列の種類：ペプチド 配列の名称：ピルビン酸オキシダーゼのアミノ酸配列 配列 Ser Asp Asn Lys Ile Asn Ile Gly Leu Ala Val Met Lys Ile Leu 15 Glu Ser Trp Gly Ala Asp Thr Ile Tyr Gly Ile Pro Ser Gly Thr 30 Leu Ser Ser Leu Met Asp Ala Met Gly Glu Glu Glu Asn Asn Val 45 Lys Phe Leu Gln Val Lys His Glu Glu Val Gly Ala Met Ala Ala 60 Val Met Gln Ser Lys Phe Gly Gly Asn Leu Gly Val Thr Val Gly 75 Ser Gly Gly Pro Gly Ala Ser His Leu Ile Asn Gly Leu Tyr Asp 90 Ala Ala Met Asp Asn Ile Pro Val Val Ala Ile Leu Gly Ser Arg 105 Pro Gln Arg Glu Leu Asn Met Asp Ala Phe Gln Glu Leu Asn Gln 120 Asn Pro Met Tyr Asp His Ile Ala Val Tyr Asn Arg Arg Val Ala 135 Tyr Ala Glu Gln Leu Pro Lys Leu Val Asp Glu Ala Ala Arg Met 150 Ala Ile Ala Lys Arg Gly Val Ala Val Leu Glu Val Pro Gly Asp 165 Phe Ala Lys Val Glu Ile Asp Asn Asp Gln Trp Tyr Ser Ser Ala 180 Asn Ser Leu Arg Lys Tyr Ala Pro Ile Ala Pro Ala Ala Gln Asp 195 Ile Asp Ala Ala Val Glu Leu Leu Asn Asn Ser Lys Arg Pro Val 210 Ile Tyr Ala Gly Ile Gly Thr Met Gly His Gly Pro Ala Val Gln 225 Glu Leu Ala Arg Lys Ile Lys Ala Pro Val Ile Thr Thr Gly Lys 240 Asn Phe Glu Thr Phe Glu Trp Asp Phe Glu Ala Leu Thr Gly Ser 255 Thr Tyr Arg Val Gly Trp Lys Pro Ala Asn Glu Thr Ile Leu Glu 270 Ala Asp Thr Val Leu Phe Ala Gly Ser Asn Phe Pro Phe Ser Glu 285 Val Glu Gly Thr Phe Arg Asn Val Asp Asn Phe Ile Gln Ile Asp 300 Ile Asp Pro Ala Met Leu Gly Lys Arg His His Ala Asp Val Ala 315 Ile Leu Gly Asp Ala Gly Leu Ala Ile Asp Glu Ile Leu Asn Lys 330 Val Asp Ala Val Glu Glu Ser Ala Trp Trp Thr Ala Asn Leu Lys 345 Asn Ile Ala Asn Trp Arg Glu Tyr Ile Asn Met Leu Glu Thr Lys 360 Glu Glu Gly Asp Leu Gln Phe Tyr Gln Val Tyr Asn Ala Ile Asn 375 Asn His Ala Asp Glu Asp Ala Ile Tyr Ser Ile Asp Val Gly Asn 390 Ser Thr Gln Thr Ser Ile Arg His Leu His Met Thr Pro Lys Asn 405 Met Trp Arg Thr Ser Pro Leu Phe Ala Thr Met Gly Ile Ala Ile 420 Pro Gly Gly Leu Gly Ala Lys Asn Thr Tyr Pro Asp Arg Gln Val 435 Trp Asn Ile Ile Gly Asp Gly Ala Phe Ser Met Thr Tyr Pro Asp 450 Val Val Thr Asn Val Arg Tyr Asn Met Pro Val Ile Asn Val Val 465 Phe Ser Asn Thr Glu Tyr Ala Phe Ile Lys Asn Lys Tyr Glu Asp 480 Thr Asn Lys Asn Leu Phe Gly Val Asp Phe Thr Asp Val Asp Tyr 495 Ala Lys Ile Ala Glu Ala Gln Gly Ala Lys Gly Phe Thr Val Ser 510 Arg Ile Glu Asp Met Asp Arg Val Met Ala Glu Ala Val Ala Ala 525 Asn Lys Ala Gly His Thr Val Val Ile Asp Cys Lys Ile Thr Gln 540 Asp Arg Pro Ile Pro Val Glu Thr Leu Lys Leu Asp Ser Lys Leu 555 Tyr Ser Glu Asp Glu Ile Lys Ala Tyr Lys Glu Arg Tyr Glu Ala 570 Ala Asn Leu Val Pro Phe Arg Glu Tyr Leu Glu Ala Glu Gly Leu 585 Glu Ser Lys Tyr Ile Lys 591 【００４２】 【配列表】 配列番号：２ 配列の長さ：１７７３塩基対 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：ｇｅｎｏｍｉｃ ＤＮＡ 起源 生物名：アエロコッカス・ビリダンス 株名：ＩＦＯ０１２２１９ 配列の特徴：ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子 配列 TCA GAT AAC AAA ATT AAC ATC GGT TTA GCA GTT ATG AAG ATT TTA 45 GAA TCT TGG GGA GCA GAT ACT ATT TAT GGT ATT CCT TCA GGT ACT 90 TTA AGC TCA TTA ATG GAT GCT ATG GGT GAA GAA GAA AAC AAC GTC 135 AAA TTC CTA CAA GTG AAA CAC GAA GAA GTA GGT GCA ATG GCT GCT 180 GTA ATG CAA AGC AAA TTC GGC GGT AAC TTA GGT GTT ACT GTA GGT 225 TCT GGT GGA CCA GGT GCA TCT CAC TTG ATC AAC GGT TTA TAC GAT 270 GCA GCA ATG GAT AAC ATT CCA GTA GTT GCG ATC TTA GGT TCT CGT 315 CCA CAA CGC GAA TTA AAC ATG GAC GCT TTC CAA GAA TTA AAC CAG 360 AAC CCA ATG TAC GAC CAT ATT GCA GTT TAC AAC CGT CGT GTA GCT 405 TAT GCT GAG CAA TTA CCA AAA TTA GTT GAC GAA GCA GCT CGT ATG 450 GCT ATC GCT AAA CGC GGT GTA GCA GTT CTA GAA GTA CCT GGT GAT 495 TTT GCT AAA GTT GAA ATC GAC AAC GAC CAA TGG TAT TCA TCT GCA 540 AAC AGC TTA CGT AAA TAT GCA CCA ATC GCT CCA GCA GCA CAA GAT 585 ATC GAC GCA GCA GTT GAA TTA TTA AAC AAC TCT AAA CGT CCA GTT 630 ATC TAC GCT GGT ATT GGT ACT ATG GGC CAC GGT CCT GCA GTT CAA 675 GAA TTA GCT CGT AAA ATC AAA GCG CCA GTT ATC ACT ACT GGT AAA 720 AAC TTT GAA ACT TTC GAG TGG GAT TTC GAA GCG TTA ACA GGT TCT 765 ACT TAT CGT GTA GGT TGG AAA CCA GCT AAC GAA ACA ATT TTA GAA 810 GCT GAC ACA GTA TTA TTT GCT GGT TCA AAC TTC CCA TTC TCA GAG 855 GTT GAA GGT ACT TTC CGT AAC GTG GAT AAC TTC ATC CAA ATC GAT 900 ATC GAC CCA GCT ATG TTA GGT AAA CGT CAC CAC GCT GAT GTT GCT 945 ATC TTA GGT GAT GCT GGT CTA GCA ATC GAC GAA ATC TTA AAC AAA 990 GTA GAT GCT GTT GAA GAG TCA GCA TGG TGG ACA GCT AAC TTG AAA 1035 AAC ATC GCT AAC TGG CGT GAA TAC ATC AAC ATG TTA GAA ACT AAA 1080 GAA GAA GGC GAC TTG CAA TTC TAC CAA GTG TAC AAT GCA ATC AAC 1125 AAC CAC GCC GAC GAA GAT GCA ATC TAC TCT ATT GAT GTT GGT AAC 1170 TCA ACT CAA ACT TCT ATC CGT CAT TTA CAT ATG ACA CCT AAA AAC 1215 ATG TGG AGA ACT TCT CCA TTA TTC GCG ACA ATG GGT ATC GCT ATC 1260 CCT GGT GGT TTA GGT GCT AAA AAC ACT TAC CCA GAT CGT CAA GTT 1305 TGG AAC ATC ATC GGT GAT GGT GCT TTC TCT ATG ACT TAC CCA GAT 1350 GTA GTA ACT AAC GTA CGT TAC AAC ATG CCT GTA ATC AAC GTT GTA 1395 TTC TCT AAC ACT GAA TAT GCC TTC ATC AAA AAC AAA TAT GAA GAC 1440 ACT AAC AAA AAC TTA TTC GGT GTA GAC TTT ACA GAT GTT GAT TAC 1485 GCT AAA ATC GCT GAA GCA CAA GGT GCT AAA GGA TTT ACT GTA AGC 1530 CGT ATC GAA GAT ATG GAC CGT GTA ATG GCT GAA GCT GTT GCA GCT 1575 AAT AAA GCA GGT CAC ACT GTC GTT ATC GAC TGT AAG ATT ACT CAA 1620 GAT CGT CCA ATC CCT GTA GAA ACA TTG AAA TTA GAT TCA AAA CTT 1665 TAC AGC GAA GAC GAA ATC AAA GCT TAC AAA GAA CGC TAC GAA GCT 1710 GCT AAC TTA GTA CCA TTC AGA GAG TAC TTA GAA GCT GAA GGC TTA 1755 GAA TCT AAA TAC ATC AAA 1773
【図面の簡単な説明】
【図１】図１は、ｐＯＸＩ３ベクターの構成を示す模式
図を示す。 【図２】図２は、ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子ＤＮＡ
のコード鎖（５’→３’）および得られる翻訳生成物の
それぞれの配列を示す。 【図３】図３は、図２に続くピルビン酸オキシダーゼ遺
伝子ＤＮＡのコード鎖（５’→３’）および得られる翻
訳生成物のそれぞれの配列を示す。
図を示す。 【図２】図２は、ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子ＤＮＡ
のコード鎖（５’→３’）および得られる翻訳生成物の
それぞれの配列を示す。 【図３】図３は、図２に続くピルビン酸オキシダーゼ遺
伝子ＤＮＡのコード鎖（５’→３’）および得られる翻
訳生成物のそれぞれの配列を示す。
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所
Ｃ１２Ｒ 1:01）
Claims (1)
- (57)【特許請求の範囲】 １．下記のＮ末端側よりのアミノ酸配列をコードするピ
ルビン酸オキシダーゼ遺伝子であるポリデオキシリボ核
酸または該遺伝子が構成成分であるポリデオキシリボ核
酸を発現ベクターに組み入れた組換えＤＮＡを宿主微生
物に移入して形質転換体を得、該形質転換体を培養して
該ポリデオキシリボ核酸の遺伝情報を発現させ、次いで
ピルビン酸オキシダーゼであるポリペプチドまたは該ピ
ルビン酸オキシダーゼが構成成分であるポリペプチドを
採取することを特徴とするピルビン酸オキシダーゼの製
造法。 Ａ−Ser Asp Asn Lys Ile Asn Ile Gly Leu Ala Val Met Lys Ile Leu Glu Ser Trp Gly Ala Asp Thr Ile Tyr Gly Ile Pro Ser Gly Thr Leu Ser Ser Leu Met Asp Ala Met Gly Glu Glu Glu Asn Asn Val Lys Phe Leu Gln Val Lys His Glu Glu Val Gly Ala Met Ala Ala Val Met Gln Ser Lys Phe Gly Gly Asn Leu Gly Val Thr Val Gly Ser Gly Gly Pro Gly Ala Ser His Leu Ile Asn Gly Leu Tyr Asp Ala Ala Met Asp Asn Ile Pro Val Val Ala Ile Leu Gly Ser Arg Pro Gln Arg Glu Leu Asn Met Asp Ala Phe Gln Glu Leu Asn Gln Asn Pro Met Tyr Asp His Ile Ala Val Tyr Asn Arg Arg Val Ala Tyr Ala Glu Gln Leu Pro Lys Leu Val Asp Glu Ala Ala Arg Met Ala Ile Ala Lys Arg Gly Val Ala Val Leu Glu Val Pro Gly Asp Phe Ala Lys Val Glu Ile Asp Asn Asp Gln Trp Tyr Ser Ser Ala Asn Ser Leu Arg Lys Tyr Ala Pro Ile Ala Pro Ala Ala Gln Asp Ile Asp Ala Ala Val Glu Leu Leu Asn Asn Ser Lys Arg Pro Val Ile Tyr Ala Gly Ile Gly Thr Met Gly His Gly Pro Ala Val Gln Glu Leu Ala Arg Lys Ile Lys Ala Pro Val Ile Thr Thr Gly Lys Asn Phe Glu Thr Phe Glu Trp Asp Phe Glu Ala Leu Thr Gly Ser Thr Tyr Arg Val Gly Trp Lys Pro Ala Asn Glu Thr Ile Leu Glu Ala Asp Thr Val Leu Phe Ala Gly Ser Asn Phe Pro Phe Ser Glu Val Glu Gly Thr Phe Arg Asn Val Asp Asn Phe Ile Gln Ile Asp Ile Asp Pro Ala Met Leu Gly Lys Arg His His Ala Asp Val Ala Ile Leu Gly Asp Ala Gly Leu Ala Ile Asp Glu Ile Leu Asn Lys Val Asp Ala Val Glu Glu Ser Ala Trp Trp Thr Ala Asn Leu Lys Asn Ile Ala Asn Trp Arg Glu Tyr Ile Asn Met Leu Glu Thr Lys Glu Glu Gly Asp Leu Gln Phe Tyr Gln Val Tyr Asn Ala Ile Asn Asn His Ala Asp Glu Asp Ala Ile Tyr Ser Ile Asp Val Gly Asn Ser Thr Gln Thr Ser Ile Arg His Leu His Met Thr Pro Lys Asn Met Trp Arg Thr Ser Pro Leu Phe Ala Thr Met Gly Ile Ala Ile Pro Gly Gly Leu Gly Ala Lys Asn Thr Tyr Pro Asp Arg Gln Val Trp Asn Ile Ile Gly Asp Gly Ala Phe Ser Met Thr Tyr Pro Asp Val Val Thr Asn Val Arg Tyr Asn Met Pro Val Ile Asn Val Val Phe Ser Asn Thr Glu Tyr Ala Phe Ile Lys Asn Lys Tyr Glu Asp Thr Asn Lys Asn Leu Phe Gly Val Asp Phe Thr Asp Val Asp Tyr Ala Lys Ile Ala Glu Ala Gln Gly Ala Lys Gly Phe Thr Val Ser Arg Ile Glu Asp Met Asp Arg Val Met Ala Glu Ala Val Ala Ala Asn Lys Ala Gly His Thr Val Val Ile Asp Cys Lys Ile Thr Gln Asp Arg Pro Ile Pro Val Glu Thr Leu Lys Leu Asp Ser Lys Leu Tyr Ser Glu Asp Glu Ile Lys Ala Tyr Lys Glu Arg Tyr Glu Ala Ala Asn Leu Val Pro Phe Arg Glu Tyr Leu Glu Ala Glu Gly Leu Glu Ser Lys Tyr Ile Lys −Ｂ 〔式中、Ａはアミノ酸残基、水素原子またはアセチル基
を示し、Ｂはアミノ酸残基、−ＯＨまたは−ＮＨ2 を示
す〕。 ２．該ポリデオキシリボ核酸が、アエロコッカス属の該
ピルビン酸オキシダーゼ生産菌より得られたポリデオキ
シリボ核酸である請求項１記載の製造法。 ３．ポリデオキシリボ核酸が、５’末端側より式 Ｘ−TCA GAT AAC AAA ATT AAC ATC GGT TTA GCA GTT ATG AAG ATT TTA GAA TCT TGG GGA GCA GAT ACT ATT TAT GGT ATT CCT TCA GGT ACT TTA AGC TCA TTA ATG GAT GCT ATG GGT GAA GAA GAA AAC AAC GTC AAA TTC CTA CAA GTG AAA CAC GAA GAA GTA GGT GCA ATG GCT GCT GTA ATG CAA AGC AAA TTC GGC GGT AAC TTA GGT GTT ACT GTA GGT TCT GGT GGA CCA GGT GCA TCT CAC TTG ATC AAC GGT TTA TAC GAT GCA GCA ATG GAT AAC ATT CCA GTA GTT GCG ATC TTA GGT TCT CGT CCA CAA CGC GAA TTA AAC ATG GAC GCT TTC CAA GAA TTA AAC CAG AAC CCA ATG TAC GAC CAT ATT GCA GTT TAC AAC CGT CGT GTA GCT TAT GCT GAG CAA TTA CCA AAA TTA GTT GAC GAA GCA GCT CGT ATG GCT ATC GCT AAA CGC GGT GTA GCA GTT CTA GAA GTA CCT GGT GAT TTT GCT AAA GTT GAA ATC GAC AAC GAC CAA TGG TAT TCA TCT GCA AAC AGC TTA CGT AAA TAT GCA CCA ATC GCT CCA GCA GCA CAA GAT ATC GAC GCA GCA GTT GAA TTA TTA AAC AAC TCT AAA CGT CCA GTT ATC TAC GCT GGT ATT GGT ACT ATG GGC CAC GGT CCT GCA GTT CAA GAA TTA GCT CGT AAA ATC AAA GCG CCA GTT ATC ACT ACT GGT AAA AAC TTT GAA ACT TTC GAG TGG GAT TTC GAA GCG TTA ACA GGT TCT ACT TAT CGT GTA GGT TGG AAA CCA GCT AAC GAA ACA ATT TTA GAA GCT GAC ACA GTA TTA TTT GCT GGT TCA AAC TTC CCA TTC TCA GAG GTT GAA GGT ACT TTC CGT AAC GTG GAT AAC TTC ATC CAA ATC GAT ATC GAC CCA GCT ATG TTA GGT AAA CGT CAC CAC GCT GAT GTT GCT ATC TTA GGT GAT GCT GGT CTA GCA ATC GAC GAA ATC TTA AAC AAA GTA GAT GCT GTT GAA GAG TCA GCA TGG TGG ACA GCT AAC TTG AAA AAC ATC GCT AAC TGG CGT GAA TAC ATC AAC ATG TTA GAA ACT AAA GAA GAA GGC GAC TTG CAA TTC TAC CAA GTG TAC AAT GCA ATC AAC AAC CAC GCC GAC GAA GAT GCA ATC TAC TCT ATT GAT GTT GGT AAC TCA ACT CAA ACT TCT ATC CGT CAT TTA CAT ATG ACA CCT AAA AAC ATG TGG AGA ACT TCT CCA TTA TTC GCG ACA ATG GGT ATC GCT ATC CCT GGT GGT TTA GGT GCT AAA AAC ACT TAC CCA GAT CGT CAA GTT TGG AAC ATC ATC GGT GAT GGT GCT TTC TCT ATG ACT TAC CCA GAT GTA GTA ACT AAC GTA CGT TAC AAC ATG CCT GTA ATC AAC GTT GTA TTC TCT AAC ACT GAA TAT GCC TTC ATC AAA AAC AAA TAT GAA GAC ACT AAC AAA AAC TTA TTC GGT GTA GAC TTT ACA GAT GTT GAT TAC GCT AAA ATC GCT GAA GCA CAA GGT GCT AAA GGA TTT ACT GTA AGC CGT ATC GAA GAT ATG GAC CGT GTA ATG GCT GAA GCT GTT GCA GCT AAT AAA GCA GGT CAC ACT GTC GTT ATC GAC TGT AAG ATT ACT CAA GAT CGT CCA ATC CCT GTA GAA ACA TTG AAA TTA GAT TCA AAA CTT TAC AGC GAA GAC GAA ATC AAA GCT TAC AAA GAA CGC TAC GAA GCT GCT AAC TTA GTA CCA TTC AGA GAG TAC TTA GAA GCT GAA GGC TTA GAA TCT AAA TAC ATC AAA −Ｙ 〔式中、ＸはTAA,TAG およびTGA 以外のコドンまたは水
素原子を示し、Ｙはコドンまたは水素原子を示す〕であ
る請求項２記載の製造法。
Priority Applications (1)
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|---|---|---|---|
| JP7004738A JP2706223B2 (ja) | 1995-01-17 | 1995-01-17 | ピルビン酸オキシダーゼの遺伝情報を有するｄｎａの用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP7004738A JP2706223B2 (ja) | 1995-01-17 | 1995-01-17 | ピルビン酸オキシダーゼの遺伝情報を有するｄｎａの用途 |
Related Parent Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP62000903A Division JPH0767390B2 (ja) | 1987-01-06 | 1987-01-06 | ピルビン酸オキシダ−ゼの遺伝情報を有するｄｎａおよびその用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09187280A JPH09187280A (ja) | 1997-07-22 |
| JP2706223B2 true JP2706223B2 (ja) | 1998-01-28 |
Family
ID=11592261
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP7004738A Expired - Lifetime JP2706223B2 (ja) | 1995-01-17 | 1995-01-17 | ピルビン酸オキシダーゼの遺伝情報を有するｄｎａの用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2706223B2 (ja) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| AU2076799A (en) * | 1998-02-03 | 1999-08-23 | Hakuju Institute For Health Science Co. Ltd. | Inspection method for microorganisms and the like, and unit therefor |
-
1995
- 1995-01-17 JP JP7004738A patent/JP2706223B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH09187280A (ja) | 1997-07-22 |
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