JPH0767390B2

JPH0767390B2 - ピルビン酸オキシダ−ゼの遺伝情報を有するｄｎａおよびその用途

Info

Publication number: JPH0767390B2
Application number: JP62000903A
Authority: JP
Inventors: 均嵯峨井; 恵子野方; 英二松村
Original assignee: 旭化成工業株式会社
Priority date: 1987-01-06
Filing date: 1987-01-06
Publication date: 1995-07-26
Anticipated expiration: 2010-07-26
Also published as: JPS63169989A

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は、新規ピルビン酸オキシダーゼの遺伝情報を有
するポリデオキシリボ核酸に関する。

本発明はまた、該ポリデオキシリボ核酸を保持してなる
形質転換体に関する。

〔従来の技術〕

ピルビン酸オキシダーゼは、ピルビン酸、燐酸および酸
素からアセチルリン酸，二酸化炭素および過酸化水素を
生ずる反応を触媒するものであって、ラクトバチルス・
デルブリゥキィ（Lactobacillus delbrucki）〔William
s,F.R. ＆ Hager,L.P.（1966）Arch.Biochem.Biophy
s.116 168−176〕ペディオコッカス（Pediococcus），
ストレプトコッカス（Streptococcus），アエロッコカ
ス・ピリダンス（Aerococcus viridans）〔特公昭58−4
0465号公報〕に属する細菌に存在することが報告されて
いる。

また、ピルビン酸オキシダーゼは、ピルビン酸を基質と
する酸化酵素であるため、血清などの体液中に存在する
ピルビン酸の定量に使用されるだけでなく、グルタミン
酸−オキザロ酢酸トランスアミナーゼ，グルタミン酸−
ピルビン酸トランスアミナーゼ，ラクテートデヒドロゲ
ナーゼ，ノイラミニダーゼ−Ｎアセチルノイラミン酸ア
ルドラーゼなどのピルビン酸生成系において生じたピル
ビン酸量を測定することによりピルビン酸生成系に関与
した酵素の基質である種々の物質の定量またはピルビン
酸生成系に関与した角酵素活性の測定など、研究用試
薬、臨床診断用試薬として極めて有用である。

〔発明が解決しようとする問題点〕

従来より報告されているピルビン酸オキシダーゼ生産菌
は、ピルビン酸オキシダーゼの生産性が低く製造コスト
的に高価になるという難点があるだけでなく、共存する
他種酵素等の除去が非常に困難で、純度の高い良質なピ
ルビン酸オキシダーゼを得るために精製コストが非常に
高いものとなり、研究用試薬、臨床診断用試薬として安
易に広く用いるには必ずしも満足のいくものではなかっ
た。

また、従来より報告されているピルビン酸、燐酸および
酸素かわアセチルリン酸、二酸化炭素および過酸化水素
を生ずる反応を触媒するピルビン酸オキシダーゼの詳細
な化学構造は報告されていない。

〔問題点を解決するための手段〕

本発明者らは、該ピルビン酸オキシダーゼの生産性向上
を計るべく鋭意検討を試みたところ、該ピルビン酸オキ
シダーゼ遺伝子の採取ならびに一時構造解析に成功する
と共に遺伝子工学的手法を応用することによって、以下
に述べる如く、高生産性である製造法を確立した。

すなわち、本発明は、宿主にとって外来性であって、ピ
ルビン酸、燐酸および酸素からアセチルリン酸、二酸化
炭素および過酸化水素を生ずる反応を触媒するピルビン
酸オキシダーゼの構成成分としてなるポリペプチドの下
記Ｎ末端側からのアミノ酸配列をコードする塩基配列で
あることを特徴とするポリデオキシリボ核酸であり、ま
た該ポリデオキシリボ核酸を保持することを特徴とする
形質転換体である。またこのＮ末端側からのアミノ酸配
列としては下記式〔式中、Ａはアミノ酸残基，水素原子またはアセチル基
を示し、Ｂはアミノ酸残基，−OHまたは−NH₂を示す〕
である。またピルビン酸、燐酸および酸素からアセチル
リン酸、二酸化炭素および過酸化水素を生ずる反応を触
媒するピルビン酸オキシダーゼからなるポリペプチドの
構成成分としてなるポリペプチドであり、またピルビン
酸、燐酸および酸素からアセチルリン酸、二酸化炭素お
よび過酸化水素を生ずる反応を触媒するピルビン酸オキ
シダーゼの構成成分としてなるポリペプチドの上記Ｎ末
端側よりのアミノ酸配列をコードする塩基配列であるポ
リデオキシリボ核酸を発現ベクターに組み入れた組換え
DNAを宿主微生物に移入した形質転換体に関するもので
ある。

ポリペプチド（Ｉ）に関し、Ａで示されるアミノ酸残基
としては、一個または複数個のアミノ酸残基よりなり、
Ａとしては、好ましくは、水素原子若しくはMetまたは
シグナルペプチドが挙げられる。Ｂで示されるものとし
ては、酸アミドであってもよく、また一個以上のアミノ
酸残基であってもよい。

ピルビン酸、燐酸および酸素からアセチルリン酸、二酸
化炭素および過酸化水素を生ずる反応を触媒するピルビ
ン酸オキシダーゼの構成成分としてなるポリペプチドの
上記Ｎ末端側よりのアミノ酸配列をコードする塩基配列
であるピルビン酸オキシダーゼ遺伝子を構成成分として
なるポリデオキシリボ核酸であるポリデオキシリボ核酸
または該遺伝子が構成成分であるポリデオキシリボ核酸
としては、少なくともピルビン酸、燐酸および酸素から
アセチルリン酸、二酸化炭素および過酸化水素を生ずる
反応を触媒するピルビン酸オキシダーゼ遺伝子それ自体
を含むポリデオキシリボ核酸であればよく、例えば該ピ
ルビン酸オキシダーゼ遺伝子それ自体としてはＮ末端側
より式で表されるピルビン酸、燐酸および酸素からアセチルリ
ン酸、二酸化炭素および過酸化水素を生ずる反応を触媒
するピルビン酸オキシダーゼからなるポリペプチドのア
ミノ酸配列をコードする塩基配列であるポリデオキシリ
ボ核酸を挙げることが出来る。また式（II）で表される
ピルビン酸オキシダーゼであるポリペプチドのアミノ酸
配列において、各アミノ酸に対応する一連のコドンのう
ちのいずれか１個のコドンからなるポリデオキシリボ核
酸であればよく、さらに該ポリデオキシリボ核酸の５′
末端に１個以上のナンセンスコドン以外のコドンおよび
／または３′末端に１個以上のコドンを有するポリデオ
キシリボ核酸であってもよい。例えば、その代表例とし
て５′末端側より式〔式中、ＸはTAA,TAGおよびTGA以外のコドンまたは水素
原子を示し、Ｙはコドンまたは水素原子を示す〕で表さ
れる塩基配列を有するポリデオキシリボ核酸を挙げるこ
とができる。

式（III）で表される塩基配列に関し、Ｘで示されるコ
ドンは、アミノ酸をコードするコドンであればいずれで
もよく、更に、その５′末端側にアミノ酸をコードする
コドンを１個以上有してもよいが、好ましくはATGまた
はシグナルペプチドに対応するポリデオキシリボ核酸を
挙げることができる。

Ｙで示されるコドンは、翻訳終止コドンまたはアミノ酸
をコードするコドンであればいずれでもよく、更に、そ
の３′末端側にアミノ酸をコードするコドンを１個以上
含有していてもよいが、その場合には、この複数個のコ
ドンの３′末端に翻訳終止コドンを有することが好まし
い。

ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子を構成成分としてなるポ
リデオキシリボ核酸または、式（II）で表されるアミノ
酸配列をコードする塩基配列からなる遺伝子であるポリ
デオキシリボ核酸または、式（III）で表されるポリデ
オキシリボ核酸は、例えばピルビン酸オキシダーゼを生
産するピルビン酸オキシダーゼ遺伝子の供与体である微
生物より該微生物のDNAを分離精製した後、超音波、制
限酵素などを用いてDNAと切断したリニヤーな発現ベク
ターとを両DNAの平滑または接着末端部においてDNAリガ
ーゼなどにより結合閉環させ、かくして得られた組換え
DNAベクターを複製可能な宿主微生物に移入した後、ベ
クターのマーカーとピルビン酸オキシダーゼの活性とを
指標としてスクリーニングして取得した該組換えDNAベ
クターを保持する微生物を培養し、該培養菌体から該組
換えDNAベクターを分離精製し、次いで該組換えDNAベク
ターからピルビン酸オキシダーゼ遺伝子であるポリデオ
キシリボ核酸を採取すればよい。

ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子の供与体である微生物と
しては、ピルビン酸オキシダーゼ産生能を有する微生物
であればよく、例えば、特開昭54−126791号公報、特開
昭59−159777号公報、特開昭59−162877号公報、Arch.B
iochem.Biophys.116 168−176（1966）などに示されて
いるラクトバチルス・デルブリゥキィ（Lactobacillus
delbrucki），ペディオコッカス．エスピー（Pediococc
us sp），ストレプトコッカス．エスピー（Streptococc
us sp），アエロッコカス・ピリダンス（Aerococcus vi
ridans），ラクトバチルス・プランタルム（Lactobacil
lus Plantarum），ラクトバチルス・サリバリウス（Lac
tobacillus Salivarius），ロイコノストック・メセン
テロイデス（Leuconostoc Mesenteroides）等のラクト
バシラセア科またはストレプトコッカセア科などの微生
物が適宜選ばれる。

また、遺伝子組換え技術を駆使して、ピルビン酸オキシ
ダーゼ産生能を付与せしめた形質転換微生物をピルビン
酸オキシダーゼ遺伝子の供与体として利用してもよい。

遺伝子の供与体である微生物から由来するDNAは次の如
くにして採取される。即ち、供与微生物である上述した
細菌のいずれかを、例えば、液体培地で約１〜３日間基
撹拌培養し、得られる培養物を遠心分離して集菌し、次
いでこれを溶菌させることによってピルビン酸オキシダ
ーゼ遺伝子の含有溶菌物を調製することができる。溶菌
方法としては、例えばリゾチームやβ−グルカナーゼな
どの細胞壁溶解酵素による処理が施され、必要によりプ
ロテアーゼなどの他の酵素やラウリル硫酸ナトリウムな
どの界面活性剤が併用され、さらに細胞壁の物理的破壊
法である凍結融解やフレンチプレス処理を上述の溶菌法
との組み併せで行ってもよい。

このようにして得られた溶菌物からDNAを分離、精製す
るには、常法に従って、例えばフェノール抽出による除
蛋白処理、プロテアーゼ処理、リボヌクレアーゼ処理、
アルコール沈澱、遠心分離などの方法を適宜組み合わせ
ることにより行うことができる。

分離精製された微生物DNAを切断する方法は、例えば、
超音波処理、制限酵素処理などにより行うことができる
が、得られるDNA断片とベクターとの結合を容易ならし
めるため、制限酵素、とりわけ特定ヌクレオチド配列に
作用する、例えば、EcoR I,Hind III,BamH IなどII型制
限酵素が適している。

ベクターとしては、宿主微生物で自律的に増殖しうるフ
ァージまたはプラスミドから遺伝子組換え用として構築
されたものが適している。

ファージとしては、例えば、エシェリヒア・コリ（Esch
erichia coli）を宿主微生物とする場合には、λgt・λ
C,λgt・λＢなどが使用できる。

また、プラスミドとしては、例えば、エシェリヒア・コ
リを宿主微生物とする場合にはpBR322,pBR325,pACY184,
pUC12,pUC13,pUC18,pUC19などが、バチルス・ズブチル
ス（Bacillus subtillis）を宿主微生物とする場合には
pUB110、pC194などが使用でき、さらに、エシェリヒア
・コリおよびサッカロマイセス・セレビシアなどのグラ
ム陰・陽両性にまたがる二種以上の宿主微生物で自律的
に増殖可能なシャトルベクターを利用することもでき
る。このようなベクターを、先に述べたピルビン酸オキ
シダーゼ遺伝子供与体である微生物DNAの切断に使用し
た制限酵素と同じ制限酵素で切断して、ベクター断片を
得ることが好ましい。

微生物DNA断片とベクター断片とを結合させる方法は、
公知のDNAリガーゼを用いる方法であればよく、例え
ば、微生物DNA断片の接着末端とベクター断片の接着末
端とのアニーリングの後、適当なDNAリガーゼの作用に
より微生物DNA断片とベクター断片との組換えDNAを作成
する。必要ならば、アニーリングの後、宿主微生物に移
入して、生体内のDNAリガーゼを利用し組換えDNAを作成
することもできる。

宿主微生物としては、組換えDNAが安定かつ自律的に増
殖可能で、且つ外来性DNAの形質が発現のできるもので
あればよく、例えば、宿主微生物がエシェリヒア・コリ
の場合、エシェリヒア・コリDH1,エシェリヒア・コリHB
101,エシェリヒア・コリW3110,エシェリヒア・コリC600
等が利用出来る。

宿主微生物に組換えDNAを移入する方法としては、例え
ば、宿主微生物がエシェリヒア属に属する微生物の場合
には、カルシュウムイオンの存在下で組換えDNAの移入
を行い、またバチルス属に属する微生物の場合には、コ
ンピテントセル法またはプロトプラスト法などを採用す
ることができ、さらにマイクロインジェクション法を用
いてもよい。かくして得られた形質転換体である微生物
は、栄養培地に培養されることにより多量のピルビン酸
オキシダーゼを安定して産生し得ることを見出した。

宿主微生物への目的組換えDNA移入の有無についての選
択は、目的組換えDNAを保持するベクターの薬剤耐性マ
ーカーとピルビン酸オキシダーゼとを同時に発現し得る
微生物を検索すればよく、例えば、薬剤耐性マーカーに
基づく選択培地で生育し、かつピルビン酸オキシダーゼ
を生成する微生物を選択すればよい。

このようにして一度選択されたピルビン酸オキシダーゼ
遺伝子を保有する組換えDNAは、形質転換微生物から取
り出され、他の宿主微生物に移入することも容易に実施
できる。また、ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子を保持す
る組換えDNAから制限酵素などにより切断してピルビン
酸オキシダーゼ遺伝子であるDNAを切り出し、これと同
様な方法により切断して得られるベクター断片とを結合
させて、宿主微生物に移入することも容易に実施でき
る。

また本質的にピルビン酸オキシダーゼ活性であるピルビ
ン酸オキシダーゼムテインのDNAは、本発明のピルビン
酸オキシダーゼ遺伝子から遺伝子工学的手法により作製
される人工変異遺伝子であり、この人工変異遺伝子は上
述の種々なる方法を使用して増幅され、最終的には、こ
の変異遺伝子をベクターに挿入せしめて組換えDNAを作
成し、これを宿主微生物に移入させることによって、ピ
ルビン酸オキシダーゼムテインの製造が可能である。

さらに上述の方法により得られたピルビン酸オキシダー
ゼ遺伝子の塩基配列は、Science 214 1205〜1210（1981
年）に示されているジデオキシ法で解読し、またピルビ
ン酸オキシダーゼのアミノ酸配列は、塩基配列より決定
した。一方、ピルビン酸オキシダーゼであるペプチドの
Ｎ末端部を構成する部分アミノ酸配列は、以下の如くに
して決定した。即ち、ピルビン酸オキシダーゼ産生能を
有するピルビン酸オキシダーゼ遺伝子供与微生物を栄養
培地で培養して菌体内にピルビン酸オキシダーゼを産生
蓄積せしめ、培養終了後、得られた培養物を濾過または
遠心分離などの手段により菌体を採取し、次いでこの菌
体を機械的方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破
壊し、また必要に応じてEDTAおよび／または適当な界面
活性剤等を添加してピルビン酸オキシダーゼが可溶化さ
れ、水溶液として分離採取される。この様にして得られ
たピルビン酸オキシダーゼの水溶液を濃縮するか、また
は濃縮することなく硫安分画、ゲル濾過、吸着クロマト
グラフィー、イオン交換クロマトグラフィーにより処理
して、高純度ピルビン酸オキシダーゼが得られ、高純度
ピルビン酸オキシダーゼを用いて液相プロテインシー
ケンサー（ベックマン社製:BECKMAN System 890ME）
によりピルビン酸オキシダーゼであるペプチドのＮ末端
部を構成する部分アミノ酸配列が決定され、少なくと
も、該部分アミノ酸配列は、遺伝子操作によって得られ
たピルビン酸オキシダーゼのＮ末端部分がアミノ酸配列
と一致するものであることを確認した。

形質転換体である宿主微生物の培養形態は宿主の栄養生
理的性質を考慮して培養条件を選択すれば良く、通常多
くの場合は、液体培養で行うか、工業的には深部通気撹
拌培養を行うのが有利である。培地の栄養源としては、
微生物の培養に通常用いられるものが広く使用され得
る。炭素源としては、資化可能な炭素化合物であればよ
く、例えばグルコース，シュクロース，ラクトース，マ
ルトース，フラクトース，糖密，ピルビン酸などが使用
される。窒素源としては利用可能な窒素化合物であれば
よく、例えばペプトン，肉エキス，酵母エキス，カゼイ
ン加水分解物などが使用される。その他、リン酸塩，炭
酸塩，硫酸塩，マグネシウム，カルシウム，カリウム，
鉄，マンガン，亜鉛などの塩類、特定のアミノ酸，特定
のビタミンなどが必要に応じて使用される。

培養温度は菌が発育し、ピルビン酸オキシダーゼを生産
する範囲で適宜変更し得るが、エシェリヒア・コリの場
合、好ましくは20〜42℃程度である。培養時間は、条件
によって多少異なるが、ピルビン酸オキシダーゼが最高
収量に達する時期を見計らって適当な時期に培養を終了
すればよく、通常は12〜48時間程度である。培地pHは菌
が発育し、ピルビン酸オキシダーゼを生産する範囲で適
宜変更し得るが、特に好ましくはpH6.0〜8.0程度であ
る。

培養物中のピルビン酸オキシダーゼは、菌体を含む培養
液そのままを採取し、利用することもできるが、一般に
は常法に従って、ピルビン酸オキシダーゼが培養液中に
存在する場合には、濾過、遠心分離などによりピルビン
酸オキシダーゼ含有溶液と微生物菌体とを分離した後に
利用される。ピルビン酸オキシダーゼが菌体内に存在す
る場合には、得られた培養物を濾過または遠心分離など
の手段により、菌体を採取し、次いでこの菌体を機械的
方法またはリゾチームなどの酵素的方法で破壊し、また
必要に応じてEDTA等のキレート剤および／または界面活
性剤を添加してピルビン酸オキシダーゼを可溶化し水溶
液として分離採取する。

この様にして得られたピルビン酸オキシダーゼ含有溶液
を、例えば、減圧濃縮、膜濃縮、更に、硫安、硫酸ナト
リウムなどの塩析処理、あるいは親水性有機溶媒、例え
ばメタノール，エタノール，アセトンなどによる分別沈
澱法により沈澱せしめればよい。次いでこの沈澱物を、
水に溶解し、半透膜にて透析せしめて、より低分子量の
不純物を除去することができる。また吸着剤あるいはゲ
ル濾過剤などによるゲル濾過，吸着クロマトグラフィ
ー，イオン交換クロマトグラフィーにより精製し、これ
らの手段を用いて得られるピルビン酸オキシダーゼ含有
溶液は、減圧濃縮凍結乾燥等の処理にてより精製された
ピルビン酸オキシダーゼを得る。

本明細書に記載のアミノ酸、ペプチド、核酸、核酸関連
物質、その他に関する略号は、それらの当該分野におけ
る慣用略号に基づくもので、それらの例を以下に列記す
る。またすべてのアミノ酸はＬ体を示すものとする。

DNA:デオキシリボ核酸 RNA:リボ核酸 A:アデニン T:チミン G:グアニン C:シトシン Ala:アラニン Arg:アルギニン Asn:アスパラギン Asp:アスパラギン酸 Cys:システイン Gln:グルタミン Glu:グルタミン酸 Gly:グリシン His:ヒスチジン Ile:イソロイシン Leu:ロイシン Lys:リジン Met:メチオニン Phe:フェニルアラニン Pro:プロリン Ser:セリン Thr:スレオニン Trp:トリプトファン Tyr:チロシン Val:バリン以下、実施例で本発明を詳細に説明する。

〔実施例〕

実施例1.〔染色体DNAの分離〕 Aerococcus viridans（IFO012219）の染色体DNAを次の
方法で分離した同菌株を150mlの普通ブイヨン培地（0.5
％チオ硫酸ソーダ含有）で37℃一晩振盪培養後遠心（3,
000回転10分）により集菌した。10％サツカロース、50m
Mトリス塩酸（pH8.0）50mM EDTAを含んだ溶液5mlに懸
濁させ、1mlのリゾチーム溶液（10mg/ml）を加えて37
℃、15分間保温し、次いで1mlの10％SDS（ドデシル硫酸
ナトリウム）溶液を加えた。この懸濁液に等量のクロロ
ホルム−フエノール混液（1:1）を加え、撹拌混合し、1
0,000rpm3分の遠心で水層と溶媒層に分け、水層を合取
した。この水層に２倍量のエタノールを静かに重層し、
ガラス棒でゆつくり撹拌しながらDNAをガラス棒にまき
つかせて分離した。これを10mlの10mMトリス塩酸（pH8.
0）、1mM EDTAを含んだ溶液（以下TEと略す）で溶解し
た。これを等量のクロロホルム−フエノール混液で処理
後、遠心により水層を分取し、２倍量のエタノールを加
えて上記の方法でもう一度DNAを分離し、2mlのTEで溶解
した。

実施例2.〔pACYC184プラスミドDNAの分離〕 pACYC184を保有するエシエリヒア・コリpM191（J.Bacte
riol 134,1141（1981）;ATCC37033）を１のBHI倍地
（Difco社製）で振盪培養した。濁度がOD₆₆₀＝1.0に増
殖したとき、スペクチノマイシン（最終濃度300μg/m
l、プラスミドの耐性マーカーとしてクロラムフエニル
コールが含まれているとき）を加え、さらに370℃で16
時間以上振盪を続けた。3000rpm10分間の遠心により集
菌し、リゾチーム−SDS法とセシウムクロライド−エチ
ジウムブロマイド法（Maniortisら:Molecular Cloning
pp86〜94Cold Spring Harbor（1982））に従いプラス
ミドDNAを調製した。

実施例3.〔ピルビン酸オキシダーゼ（POP）遺伝子を有
するプラスミドpOXI3の作成〕（ｉ）実施例1.で調製したA.viridansの染色体DNA2μ
（約0.5μｇ）と10倍濃度のEcoR I切断用バツフアー
（500mMトリス塩酸（pH7.5）,70mM MgCl₂/M NaCl,70mM
メルカプトエタノール）１μ,EcoR I（宝酒造製 10u
nit/μ）１μ，水６μを混合し、37℃１時間切断
した。別に調製したプラスミドpACYC184DNA約0.3μｇを
同様の方法を用いてEcoR Iで切断し、さらにアルカリ性
フオスフアターゼ（以下BAPと略することがある。宝酒
造製）0.6unitを加え、65℃１時間処理した。これらのE
coR Iで切断した２種のDNA溶液を混合し、その1/10量の
3M酢酸ナトリウムを加え、さらに全体量と等量のクロロ
ホルム−フエノール混液で処理し、遠心分離により水層
を分取した。この水層に２倍溶のエタノールを加え、遠
心でDNAを沈澱させたのち減圧乾燥した。水89μで溶
解後、10倍濃度のライゲーシヨンバツフア（0.5Mトリス
塩酸（pH7.6）,0.1M MgCl₂,0.1Mジチオスレイトール,10
mMスペルミジン,10mMATP）10μとT4DNAリガーゼ１μ
（宝酒造製 175unit）を加え混合し４℃で一晩放置
した。このDNA溶液をクロロホルム−フエノール処理
し、エタノール沈澱を集め減圧乾燥した後、10μのTE
で溶解した。

（ii） 100mlのBHI倍地（Brain Heart Inflsion,Difc
o社製）で培養した対数増殖期のノエシエリヒア・コリW
3110株〔国立遺伝学研究所より分与を受けた、ストツク
番号ME7778;ATCC27325〕を遠心分離により集菌し（10,0
00rpm.2分間）40mlの氷冷した30mM酢酸カリウム、100mM
RbCl、10mM CaCl₂、50mM MnCl₂および15％グリセリン
を含んだ溶液（pH5.8）で懸濁した。０℃で５分間放置
後、遠心し上清をすて、さらに4mlの10mM MOPS緩衝液
（ドータイト社製）、75mM CaCl₂、10mM PbClおよび15
％グリセリンを含んだ溶液（pH6.5）で懸濁し、０℃で1
5分間放置してコンピテント細胞とした。

（iii）この大腸菌懸濁液200μに（ｉ）で調製した
DNA溶液10μを加え、30分間０℃で放置した。BHI倍地
1mlを加え、37℃で90分間保温後、この100μをテトラ
サイクリン（15μg/ml）を含んだBHI寒天プレートにま
き、37℃で一晩培養し形質転換体を得た。この形質転換
体をPOP倍地（組成はペプトン5g、肉エキス2g、イース
トエイス5g、NaCl/g、K₂HPO₄/g、MgSO₄0.5g、パーオキ
シダーゼ500IU、FAD7.85mg、ジアニシジン0.1g、チアミ
ンプロフオスフエート42.4mg、ピルビン酸1ml、寒天15
g、蒸留水／、pH7.0）のプレートにレプリカし、37℃
でさらに一晩培養した。

約4500コロニーの形質転換体を調べたところ、コロニー
の周辺が茶褐色に変色したもの１株を得、この株をエシ
エリヒア・コリW3110・pOXI3株［微生物受託番号微工
研菌寄第9071、微工研条第1565号、FERM BP−1565」と
命名した。この菌を純粋分離跡BHI倍地で37℃一晩培養
し、ピルビン酸オキシダーゼの生産性を後述するピルビ
ン酸オキシダーゼ活性測定法により調べたところ、約3u
/muのピルビン酸オキシダーゼ活性を有していた。

この菌株の保有していたプラスミドを実施例２と同様に
してプラスミドを分離し、ピルビン酸オキシダーゼ遺伝
子を含み、pACYC184遺伝子を含むプラスミドpOXI3と命
名した。

ピルビン酸オキシダーゼ活性測定法本発明のピルビン酸オキシダーゼの活性測定法は次の通
りである。

0.5Mピルビン酸カリウム 0.1 ml 0.5Mリン酸塩緩衝液（pH7.0） 0.2 ml 0.2％４−アミノアンチピリン 0.1 ml 0.2％N,N−ジメチルアニリン 0.2 ml 10mM MgCl₂ 50 μ 10mMチアミノピロフオスフエート 20 μ ペルオキシダーゼ（45U/ml） 0.1 ml 1mM FAD 10 μ 蒸留水 0.22ml 上記の組成の反応液1.0mlを試験管に分取し、37℃、３
分間予備加温した後、酵素液20μを加えて37℃、10分
間反応を行い、反応後、0.3mlの0.1MEDTA（pH7.5）を加
えて反応を停止し、次いでこれに蒸留水1.7mlを加えた
後生じた紫色を565nmの波長にて比色定量する。１分間
に１μmoleの過酸化水素を生じる活性を１単位（Ｕ）と
した。

実施例4.〔pOXI3のマツピングおよびpop遺伝子の塩基配
列の決定〕エシエリヒア・コリW3110pOXI3株からpACYC184と同様の
方法でpOXI3プラスミドDNAを調製した。

pOXI3 DNAについて制限酵素Cla I,EcoR V,Hind III,Sca
I,Pst I,Pvu II,Xba I（いずれも宝酒造製）Hpa I（東
洋紡製）により切断地図を作成した。その結果を第１図
に示した。ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子を含んだDNA
の塩基配列をM13フアージを用いたジデオキシ法（Scien
ce 214 1205−1210（1981））を用いて決定した。POP
の構造遺伝子の塩基配列並びにアミノ酸配列を第２図
（第２−１図および第２−２図にわたって示す）に示し
た。

実施例5.〔ピルビン酸オキシダーゼの製造〕エシエリヒア・コリW3110pOXI3株を20のBHI培地（Dif
co社製）で37℃18時間ジヤーフアーメーターにより培養
し、5,000rpm10分間の遠心で集菌した。生理食塩水２
で洗浄後、２の10mMリン酸バツフア（pH7.0）で懸濁
した。リゾチームを1mg1ml、EDT−2Naを2mM、トリトン
Ｘ−100を0.1％となるよに加えて37℃30分間保温し、5,
000rpm10分の遠心より上清液を分離した。

この上清液1.9について硫安塩析（40％〜66％）を行
い、沈澱物を遠心（5,000rpm30分）により集めた。この
沈澱物を200mlの10mMリン酸バツフア（pH7.0、10μＭの
FADを含む）で溶解し、セフアデツクスＧ−25で脱塩処
理をした。その後、DEAE−セフアロースCL−6Bを用いて
イオン交換クロマトを行い活性画分を分取後脱塩し、凍
結乾燥により粉末標品を得た。この酵素標品を前述のピ
ルビン酸オキシダーゼ活性測定法により測定した結果51
u/mgの比活性を有していた。

実施例6.〔組換え体より分離精製したピルビン酸オキシ
ダーゼのアミノ末端部分のアミノ酸配列の決定〕実施例５で分離精製したピルビン酸オキシダーゼについ
てベツクマン社のアミノ酸シークエンサー（Beckman Sy
stem 980ME）を用いてアミノ末端から10個のアミノ酸の
配列を調べた。その結果、約80％のものにＮ末にMetが
存在しアミノ酸配列の１位からSer Asp Asn Lys Ile As
n Ile Gly Leu（Ala）の配列であることを確認した。

〔発明の効果〕

本発明によって、ピルビン酸オキシダーゼ遺伝子およ
び、ピルビン酸オキシダーゼのアミノ酸配列が明らかに
なり、また、遺伝子工学手法による効率的なピルビン酸
オキシダーゼの製造方法を提供した。また、本発明のピ
ルビン酸オキシダーゼ遺伝子と種々の遺伝子工学的手法
とを用いることによって、より効率的なピルビン酸オキ
シダーゼの製造方法をもたらしめるものである。

【図面の簡単な説明】

第１図はpOXI3ベクターの構成を示す模式図、第２図
（第２−１図および第２−２図に渡って示す）は、ピル
ビン酸オキシダーゼ遺伝子DNAのコード鎖（５′→
３′）および得られる翻訳生成物のそれぞれの配列を示
す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号庁内整理番号ＦＩ技術表示箇所 (Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＣ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）Ｃ１２Ｒ 1:01）

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】ピルビン酸オキシダーゼの構成成分として
なるポリペプチドの下記Ｎ末端側よりのアミノ酸配列を
コードする塩基配列であることを特徴とするポリデオキ
シリボ核酸。〔式中、Ａはアミノ酸残基または水素原子を示し、Ｂは
アミノ酸残基または−OHを示す〕。
【請求項２】塩基配列が、５′末端側より式〔式中、ＸはTAA,TAGおよびTGA以外のコドンまたは水素
原子を示し、Ｙはコドンまたは水素原子を示す〕である
特許請求の範囲第１項記載のポリデオキシリボ核酸。
【請求項３】ピルビン酸オキシダーゼの構成成分として
なるポリペプチドの下記Ｎ末端側よりのアミノ酸配列を
コードする塩基配列であるポリデオキシリボ核酸を保持
することを特徴とする形質転換体。〔式中、Ａはアミノ酸残基または水素原子を示し、Ｂは
アミノ酸残基または−OHを示す〕。
【請求項４】塩基配列が、５′末端側より式〔式中、ＸはTAA,TAGおよびTGA以外のコドンまたは水素
原子を示し、Ｙはコドンまたは水素原子を示す〕である
特許請求の範囲第３項記載の形質転換体。
【請求項５】宿主微生物が、エシェリヒア属に属する特
許請求の範囲第３項記載の形質転換体。
【請求項６】エシェリヒア属に属する宿主微生物が、エ
シェリヒア・コリに属する微生物である特許請求の範囲
第５項記載の形質転換体。