DE3886225T2

DE3886225T2 - Pyruvat-Oxidase, ihre Herstellung und Verwendung.

Info

Publication number: DE3886225T2
Application number: DE19883886225
Authority: DE
Inventors: Shigeyuki Imamura; Eiji Matsumura; Hideo Misaki; Keiko Nogata; Hitoshi Sagai
Original assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Current assignee: Asahi Chemical Industry Co Ltd
Priority date: 1987-01-06
Filing date: 1988-01-06
Publication date: 1994-03-31
Anticipated expiration: 2008-01-07
Also published as: EP0274425A3; EP0274425A2; DE3886225D1; EP0274425B1

Description

Die Erfindung betrifft eine Pyruvatoxidase, die im wesentlichen frei von ATPase und Lactatoxidase ist.
Pyruvatoxidase ist ein Enzym, das die Reaktion von Brenztraubensäure, Phosphat und Sauerstoff unter Bildung von Acetylphosphat, Kohlendioxid und Wasserstoffperoxid katalysiert und wurde bisher von einem Stamm von Lactobacillus delbruckii (Williams, F.R. & Hager, L.P. (1966) Arch. Biochem. Biophys., 116: 168-176), Pediococcus, Streptococcus oder Aerococcus vilidans (JP-A-58-40465) abgeleitet.
Pyruvatoxidase ist eine Oxidase für das Substrat Brenztraubensäure, und daher kann sie zur quantitativen Bestimmung von Pyruvat in Serum verwendet werden. Ferner kann dieses Enzym zur quantitativen Analyse eines Substrats, das in Beziehung zu verschiedenen Enzymen des Pyruvat-erzeugenden Systems steht, wie Glutamat-Oxalacetat-Transaminase, Glutamat-Pyruvat-Transaminase, Lactatdehydrogenase oder Neuraminidase, N-Acetylneuraminsäure-Aldolase und zur Messung der Enzymaktivität der Enzym-Reaktionssysteme, die Pyruvat bilden, verwendet werden. So ist Pyruvatoxidase als Reagens in der Forschung und in der klinischen Diagnostik nützlich.
Die quantitative ADP-Bestimmung unter Verwendung von Pyruvatoxidase ist bekannt, d.h. Pyruvat wird durch Wirken von Pyruvatkinase unter Bildung von ATP und Pyruvat aus ADP und Phosphoenolpyruvat erzeugt, und das so erzeugte Pyruvat wird durch Pyruvatoxidase aus Pediococcus sp. B-0667, Streptococcus sp. B-0668 oder Aerococcus vilidans IFO 12219 und IFO 12317 unter Bildung von Wasserstoffperoxid, das dann gemessen wird, oxidiert (ungepr. japanische Patentveröffentlichung Nr. 59-15637). Pyruvatoxidase mit einem anderen Ursprung ist ebenfalls bekannt (ibid. Nr. 59- 162877 und Nr. 59-159777).
Bisher bekannte Pyruvatoxidase-produzierende Mikroorganismen besitzen Nachteile dahingehend, daß die Produktivität niedrig ist und die Kontamination mit anderen Enzymen nicht entfernt werden kann, und daher kann eine Pyruvatoxidase hoher Qualität nicht erhalten werden.
Eine weitere ausführliche chemische Struktur der Pyruvatoxidase, die die Reaktion von Pyruvat, Phosphat und Sauerstoff unter Bildung und Acetylphosphat, Kohlendioxid und Wasserstoffperoxid katalysiert, wurde nicht beschrieben.
Eine früher in einem ADP-Assay verwendete Pyruvatoxidase enthält eine beträchtliche Menge an verunreinigender ATPase, was zu einer höheren Beobachtung des Leerwerts führte. In einem ADP-Assay werden Phosphoenolpyruvat und Pyruvatkinase einer ADP-haltigen Probe zugesetzt, wodurch ATP und Pyruvat erzeugt werden, und dann wird das Reaktionsgemisch mit Pyruvatoxidase umgesetzt, und das erzeugte H&sub2;O&sub2; wird gemessen. In diesem Assaysystem katalysiert die verunreinigende ATPase die Reaktion:
ATP + H&sub2;O T ADP + Pi.
Das so erhaltene ADP überlappt mit dem ursprünglichen ADP in der Probe. Daher sollte die verunreinigende ATPase möglichst weitgehend entfernt werden. Ferner ist die Pyruvatoxidase aus dein Stand der Technik mit Lactatoxidase kontaminiert, was zu einem Meßfehler von erzeugtem oder verbrauchtem H&sub2;O&sub2; in einem Assay unter Verwendung von Pyruvatoxidase führt. Daher sollte die verunreinigende Lactatoxidase entfernt werden.
Die Erfinder haben erfolgreich das Pyruvatoxidasegen isoliert und die Primärstruktur bestimmt und eine hohe Produktivität unter Anwendung einer gentechnischen Manipulation entwickelt.
Die so erhaltene erfindungsgemäße Pyruvatoxidase besitzt im wesentlichen keine verunreinigende ATPase mit einem Gehalt unter 0,0005%. Die Pyruvatoxidase kann für einen ADP-Assay ohne erhöhten Farbleerwert in dem Assay verwendet werden. Ferner enthält sie keine Lactatoxidase.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung einer Polydesoxyribonucleinsäure mit den folgenden Eigenschaften:
- sie ist für den Wirt exogen, und
- sie besitzt eine Basensequenz, die eine Aminosäuresequenz des Polypeptids, bestehend aus Pyruvatoxidase, die die Reaktion von Pyruvat, Phosphat und Sauerstoff unter Erzeugung von Acetylphosphat, Kohlendioxid und Wasserstoffperoxid katalysiert, oder eine Aminosäuresequenz einschließlich eines Polypeptids, bestehend aus der Pyruvatoxidase, codiert.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Polypeptids, bestehend aus Pyruvatoxidase, die die Reaktion von Pyruvat, Phosphat und Sauerstoff unter Erzeugung von Acetylphosphat, Kohlendioxid und Wasserstoffperoxid katalysiert, oder eines Polypeptids, umfassend die Pyruvatoxidase mit einer Aminosäuresequenz vom N-Terminus der folgenden Formel
worin A für einen Aminosäurerest, Wasserstoff oder Acetyl steht und B für einen Aminosäurerest, -OH oder -NH&sub2; steht.
Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Verfahrens zur Produktion von Pyruvatoxidase, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man
- eine rekombinante DNA in einen Wirtsmikroorganismus transformiert, wobei die rekombinante DNA durch Insertion einer Polydesoxyribonucleinsäure, bestehend aus einem Gen für Pyruvatoxidase, die die Reaktion von Pyruvat, Phosphat und Sauerstoff unter Bildung von Acetylphosphat, Kohlendioxid und Wasserstoffperoxid katalysiert, oder einer Polydesoxyribonucleinsäure, umfassend dieses Gen, konstruiert wird, wodurch ein Transformant erhalten wird,
- eine genetische Information der Polydesoxyribonucleinsäure durch Züchten des Transformanten exprimiert, und
- ein Polypeptid, bestehend aus Pyruvatoxidase, die die Reaktion von Pyruvat, Phosphat und Sauerstoff unter Bildung von Acetylphosphat, Kohlendioxid und Wasserstoffperoxid katalysiert, oder ein Polypeptid, umfassend die Pyruvatoxidase, isoliert.
Eine noch weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung einer Zusammensetzung für den Assay, umfassend eine wasserlösliche Pyruvatoxidase, die die Reaktion von Pyruvat, Phosphat und Sauerstoff unter Bildung von Acetylphosphat, Kohlendioxid und Wasserstoffperoxid katalysiert, wobei der ATPase-Gehalt mindestens unter 0,0005% liegt und im wesentlichen keine Lactatoxidase-Aktivität enthalten ist.
Eine noch weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Assayverfahrens, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man in einem Assay auf Pyruvat in einer Probe, die Pyruvat enthält oder Pyruvat erzeugt und mindestens Lactat enthält, die Proben mit Wasserlöslicher Pyruvatoxidase, die die Lösung von Pyruvat, Phosphat und Sauerstoff unter Bildung von Acetylphosphat, Kohlendioxid und Wasserstoffperoxid katalysiert, mit einem ATPase-Gehalt von mindestens unter 0,0005% und im Wesentlichen ohne Lactatoxidase-Aktivität, behandelt und eine verbrauchte oder erzeugte Zusammensetzung mißt.
Eine noch weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Assayverfahrens auf ADP, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man mindestens die folgenden Verfahrens Schritte durchführt:
(a) einen Verfahrensschritt, bei dem ATP und Pyruvat aus ADP und Phosphoenolpyruvat durch Wirkung einer Transphosphorylierung einer Pyruvatkinase erzeugt werden,
(b) einen Verfahrensschritt, bei dem nachweisbare Veränderungen durch Erzeugung von Acetylphosphat, Kohlendioxid und Wasserstoffperoxid durch Wirkung von Pyruvatoxidase auf ein Pyruvatsubstrat unter Verwendung einer Zusammensetzung eines wirksamen Inhaltsstoffes, bestehend aus wasserlöslicher Pyruvatoxidase, die die Reaktion von Pyruvat, Phosphat und Sauerstoff unter Bildung von Acetylphosphat, Kohlendioxid und Wasserstoffperoxid katalysiert, mit einem ATPase-Gehalt von mindestens unter 0,0005% gebildet werden, und
(c) einen Verfahrensschritt, bei dem die nachweisbaren Veränderungen durch Wirkung des Enzyms und des Reagens es nachgewiesen werden.
Eine noch weitere Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung eines Assay-Verfahrens auf ATP, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man mindestens die folgenden Verfahrensschritte durchführt:
(a) einen Verfahrensschritt, bei dem ADP und eine Phosphatverbindung aus ATP und einer Nicht-Phosphatverbindung durch Wirkung der Transphosphorylierung einer Kinase erzeugt werden,
(b) einen Verfahrensschritt, bei dem ATP und Pyruvat aus dem erzeugten ADP und Phosphoenolpyruvat durch Wirkung einer Transphosphorylierung der Pyruvatkinase erzeugt werden,
(c) einen Verfahrensschritt, bei dem nachweisbare Veränderungen durch Bildung von Acetylphosphat, Kohlendioxid und Wasserstoffperoxid durch die Wirkung von Pyruvatoxidase auf das Pyruvatsubstrat unter Verwendung einer Zusammensetzung eines wirksamen Inhaltsstoffes, bestehend aus wasserlöslicher Pyruvatoxidase, die die Reaktion von Pyruvat, Phosphat und Sauerstoff unter Bildung von Acetylphosphat, Kohlendioxid und Wasserstoffperoxid katalysiert, mit einem ATPase- Gehalt von mindestens unter 0,0005% gebildet werden, und
(d) einen Verfahrensschritt, bei dem die nachweisbaren Veränderungen durch Wirkung des Enzyms und des Reagens es nachgewiesen werden.
Eine noch weitere Aufgabe der Erfindung ist die Bereitstellung eines Assay-Verfahrens auf Nicht-Phosphatverbindungen, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man mindestens die folgenden Verfahrensschritte durchführt:
(a) einen Verfahrensschritt, bei dem ADP und eine Phosphatverbindung aus ATP und der Nicht-Phosphatverbindung durch Wirkung der Transphosphorylierung einer Kinase erzeugt werden,
(b) einen Verfahrensschritt, bei dem ATP und Pyruvat aus dem erzeugten ADP und Phosphoenolpyruvat durch Wirkung der Transphosphorylierung der Pyruvatkinase erzeugt werden,
(c) einen Verfahrensschritt, bei dem nachweisbare Veränderungen durch Bildung von Acetylphosphat, Kohlendioxid und Wasserstoffperoxid durch Wirkung einer Pyruvatoxidase auf ein Pyruvatsubstrat unter Verwendung einer Zusammensetzung eines wirksamen Inhaltsstoffes, bestehend aus wasserlöslicher Pyruvatoxidase, die die Reaktion von Pyruvat, Phosphat und Sauerstoff unter Bildung von Acetylphosphat, Kohlendioxid und Wasserstoffperoxid katalysiert, mit einem ATPase- Gehalt von mindestens unter 0,0005% gebildet werden, und
(d) einen Verfahrensschritt, bei dem die nachweisbaren Veränderungen durch Wirkung des Enzyms und des Reagenses nachgewiesen werden.
In einem Polypeptid (I) steht der Aminosäurerest A für einen oder mehrere Aminosäurereste, bevorzugt Wasserstoff, Met oder ein Signalpeptid. Ein Beispiel für B ist ein Säureamid oder ein Aminosäurerest mit mehr als einer Aminosäure.
Ein Beispiel für eine Polydesoxyribonucleinsäure eines Gens, bestehend aus Pyruvatoxidase, die die Reaktion von Pyruvat, Phosphat und Sauerstoff unter Bildung von Acetylphosphat, Kohlendioxid und Wasserstoffperoxid katalysiert, oder eine Polydesoxyribonucleinsäure, umfassend das Gen, ist mindestens eine Polydesoxyribonucleinsäure, die das Gen von Pyruvatoxidase, das die die Reaktion von Pyruvat, Phosphat und Sauerstoff unter Bildung von Acetylphosphat, Kohlendioxid und Wasserstoffperoxid katalysiert, enthält, und ist eine Polydesoxyribonucleinsäure, bestehend aus einer Basensequenz, die eine Aminosäuresequenz eines Polypeptids der Pyruvatoxidase mit der folgenden Struktur vom N-Terminus codiert
Als Aminosäuresequenz des Polypeptids (II) der Pyruvatoxidase kann jede beliebige Polydesoxyribonucleinsäure, umfassend irgendein Codon entsprechend jeder Aminosäure erwähnt werden, und bevorzugt kann sie eine Polydesoxyribonucleinsäure mit mehr als einem Codon, ausgenommen dem Nonsens-Codon am 5'-terminalen Ende und/oder mehr als einem Codon am 3'-terminalen Ende sein. Ein Beispiel einer Polydesoxyribonucleinsäure mit einer Basensequenz vom 5'-terminalen Ende besitzt die folgende Formel
worin X ein Codon, ausgenommen TAA, TAG und TGA, oder Wasserstoff ist, und Y ein Codon oder Wasserstoff ist.
In einer Basensequenz (III) kann das Codon X ein Codon sein, das eine Aminosäure codiert, und es kann ein Codon mehr als eines sein, das eine Aminosäure am 5'-terminalen Ende codiert, und es ist bevorzugt ATG oder eine Polydesoxyribonucleinsäure entsprechend einem Signalpeptid.
Ein Codon Y kann ein Terminationscodon oder ein Codon, das ein Aminosäure codiert, sein und kann ferner mehr als ein Codon besitzen, das eine Aminosäure am 3'-terminalen Ende codiert, und es besitzt bevorzugt ein Terminationscodon am 3'-terminalen Ende aus mehreren Codons.
Eine Polydesoxyribonucleinsäure, umfassend das Pyruvatoxidasegen, eine Polydesoxyribonucleinsäure, bestehend aus einem Gen mit einer Basensequenz, die die Aminosäuresequenz (II) codiert, oder eine Polydesoxyribonucleinsäure (III) können beispielsweise durch Isolieren der DNA aus Pyruvatoxidase-produzierenden Mikroorganismen, die ein Donor für das Pyruvatoxidasegen sind, Spalten der DNA durch Beschallung oder Spalten mit Restriktionsenzymen, Legieren der DNA mit einem linearen Expressionsvektor an dem stumpfen oder dem cohäsiven Ende durch die DNA-Ligase, Transferieren des so erhaltenen rekombinanten DNA-Vektors in einen Wirtsmikroorganismus, Gewinnen der Mikroorganismen, die das rekombinante Plasmid tragen, durch Selektion von Vektormarkern und Pyruvatoxidaseaktivität, Züchten der Mikroorganismen, Isolieren und Reinigen des rekombinanten DNA-Vektors aus den gezüchteten Zellen und Isolieren der Polydesoxyribonucleinsäure des Pyruvatoxidasegens aus dem rekombinanten DNA-Vektor erhalten werden.
Ein Mikroorganismus, der ein Donor des Pyruvatoxidasegens ist, kann ein Pyruvatoxidase-produzierender Mikroorganismus sein, beispielsweise Lactobacillaceae und Streptococcaceae, wie Lactobacillus delbrucki [nicht-geprüfte japanische Patentpublikationen Nr. 54-126791, Nr. 59-159777, Nr. 59- 162877 und Arch. Biochem. Biophys., 116: 168-176 (1966)], Pediococcus sp., Streptococcus sp., Aerococcus viridans, Lactobacillus salivarius, Leuconostoc mesenteroides.
Transformierte Mikroorganismen, denen die Fähigkeit zur Produktion von Pyruvatoxidase mittels der rekombinanten DNA-Technologie verliehen worden ist, können ebenfalls als Donoren für das Pyruvatoxidasegen verwendet werden.
Die DNA kann aus den Donor-Mikroorganismen für das Gen wie folgt erhalten werden. Die vorstehend beispielhaft aufgeführten Mikroorganismen werden 1 bis 3 Tage aerob in einem Flüssigmedium gezüchtet. Die gezüchteten Zellen werden durch Zentrifugation gewonnen, und die gewonnenen Zellen werden lysiert, wodurch Zellysate, die das Pyruvatoxidasegen enthalten, erhalten werden. Die Bakteriolyse kann durch Behandeln mit zellwandlytischen Enzymen, wie Slysozym oder β-Glucanase, die gegebenenfalls mit anderen Enzymen, wie Protease behandelt wurden, oder mit grenzflächenaktiven Mitteln, wie Natriumlaurylsulfat, oder anderen physikalischen Zerstörungsmitteln, wie Gefrier-Tauen oder eine French-Presse, durchgeführt werden.
Die Isolierung und Reinigung der DNA aus den lysierten Zellen kann durch Kombination herkömmlicher Mittel, wie Deproteinisierung durch Phenolbehandlung, Behandlung mit Protease und/oder Ribonuclease, Alkoholfällung oder Zentrifugation durchgeführt werden.
Das Spalten der isolierten oder gereinigten mikrobiellen DNA kann durch Schallbehandlung oder Behandlung mit Restriktionsenzyinen, bevorzugt mit Restriktionsenzymen zur leichten Legierung, insbesondere unter Verwendung von Enzymen, die auf eine spezifische Nucleotidsequenz einwirken, beispielsweise Typ II-Restriktionsenzyme, wie EcoRI, HindIII oder BamHI, durchgeführt werden.
Bevorzugte Vektoren sind Plasmide, die für die rekombinante DNA-Technologie aus autonom gezüchteten Phagen oder Plasmiden in Wirtszellen konstruiert wurden. Beispiele für die Phagen sind λgt λC und λgt λB für die Wirtszelle Escherichia coli.
Beispiele für Plasmide sind pBR322, pBR325, pACYC184, pUC12, pUC13, pUC18 oder pUC19 für E. coli, pUB110 oder pc194 für Bacillus subtilis und ein Schaukelvektor für E. coli und Saccharomyces cerevisiae. Es ist bevorzugt, das Vektorfragment durch Spalten des vorstehenden Vektors mit dem gleichen Restriktionsenzym, das zur Spaltung der mikrobiellen DNA, die das Pyruvatoxidasegen enthält, vorher verwendet wurde, zu erhalten.
Das Ligierungsverfahren des mikrobiellen DNA-Fragments und des Vektor-Fragments kann ein herkömmliches Verfahren sein, bei dem eine bekannte DNA-Ligase verwendet wird. Beispielsweise kann nach dem Assoziieren eines cohäsiven Endes eines mikrobiellen DNA-Fragments und eines cohäsiven Endes eines Vektor-Fragments eine rekombinante DNA aus dem mikrobiellen DNA-Fragment und dem Vektor-Fragment durch Wirkung einer bevorzugten DNA-Ligase konstruiert werden. Gegebenenfalls wird die DNA nach dem Assoziieren in Wirtsmikroorganismen überführt, und eine rekombinante DNA kann mittels in vivo- DNA-Ligase hergestellt werden.
Beispiele für Wirtsmikroorganismen sind bevorzugt ein Wirtsmikroorganismus, in dem sich die rekombinante DNA stabil und autonom replizieren kann und transferierte exogene DNA exprimiert werden kann, beispielsweise Escherichia coli DH1, E. coli HB101, E. coli W3110 und E. coli C600.
Bezüglich des Verfahrens des Transfers der rekombinanten DNA in einen Wirtsmikroorganismus, beispielsweise im Falle, daß die Wirtszelle E. coli ist, kann eine rekombinante DNA in Gegenwart von Calciumionen transferiert werden und im Falle, daß die Wirtszelle ein Bacillus ist, kann ein kompetentes Zellverfahren oder das Protoplastenverfahren angewandt werden, ferner kann auch das Mikroinjektionsverfahren angewandt werden. Der so erhaltene und gezüchtete Transformant kann große Mengen an Pyruvatoxidase stabil in einer Kultur aus Nährmedium produzieren. Die Insertion der rekombinanten DNA kann durch Isolieren der Mikroorganismen, die Arzneimittelresistenzmarker in dem Vektor, und die Pyruvatoxidaseproduktion exprimieren, ausgewählt werden. Beispielsweise werden bevorzugt Mikroorganismen, die in einem Selektivmedium für Arzneimittelresistenz wachsen und die die Aktivität der Pyruvatoxidaseproduktion besitzen, bevorzugt ausgewählt.
Die ausgewählte rekombinante DNA, bestehend aus dem Pyruvatoxidasegen, wird aus den transformierten Zellen isoliert und kann leicht in andere Wirtszellen transformiert werden. Das aus DNA bestehende Pyruvatoxidasegen wird auch durch das Restriktionsenzym gespalten, wodurch ein DNA-Fragment des Pyruvatoxidasegens erhalten wird, das mit dem auf gleiche Weise erhaltenen Vektor-Fragment ligiert wird, und die ligierte DNA kann leicht in die Wirtszellen überführt werden.
DNA, die das Pyruvatoxidase-Mutein codiert, das im wesentlichen Pyruvatoxidase-Aktivität zeigt, ist ein künstlich mutiertes Gen, das von dem erfindungsgemäßen Pyruvatoxidasegen mittels der Gentechnik abgeleitet ist, und dieses mutierte Gen, das durch die vorstehenden Verfahren hergestellt wurde, wird in einen Vektor insertiert, um die rekombinante DNA zu konstruieren, und dann kann das Pyruvatoxidaseprotein produziert werden.
Die Basensequenz des so erhaltenen Pyruvatoxidasegens wird nach dem Didesoxy-Verfahren (Science, 214: 1205-1210, (1981)) bestimmt, und die Aminosäuresequenz der Pyruvatoxidase wird anhand der Basensequenz vorhergesagt.
Eine Aminosäureteilsequenz des N-Terminus des Pyruvatoxidasepeptids wird nach dem folgenden Verfahren bestimmt. Der Pyruvatoxidase-produzierende Mikroorganismus, der ein Donor des Pyruvatoxidasegens ist, wird in einem Nährmedium gezüchtet, um Pyruvatoxidase endogen zu akkumulieren. Die gezüchteten Zellen werden durch Filtration oder mittels Zentrifugation gewonnen, mechanisch oder enzymatisch mit Lysozym aufgebrochen, durch Zugabe von EDTA und/oder eines grenzflächenaktiven Mittels solubilisiert, und die Enzymlösung wird isoliert. Die wäßrige Pyruvatoxidaselösung wird durch Ammoniumsulfat fraktioniert, gelfiltriert, mittels Adsorption oder Ionenaustausch mit oder ohne Konzentrieren chromatographiert, um hochgereinigte Pyruvatoxidase zu erhalten. Eine Teilsequenz der Aminosäure des N-Terminus der Pyruvatoxidase wird durch einen Flüssigphasenproteinsequenator (Beckman System 890 ME) bestimmt und bestätigte die Identität im Vergleich zu der Pyruvatoxidase, die gentechnisch erhalten worden ist.
Die Züchtungsbedingungen des Transformanten werden durch Berücksichtigung der ernährungsphysiologischen Eigenschaften der Wirtszellen bestimmt, und sie sind üblicherweise eine herkömmliche Flüssigkultur, und eine belüftete Submerskultur ist für die industrielle Produktion bevorzugt.
Ein herkömmliches Medium zur Züchtung von Mikroorganismen kann bevorzugt verwendet werden. Hinsichtlich der Kohlenstoffquellen können bevorzugt assimilierbare Kohlenstoffquellen, wie Glucose, Saccharose, Lactose, Maltose, Fructose, Melassen, Brenztraubensäure oder dergleichen, verwendet werden. Assimilierbare Stickstoffquellen, wie Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Caseinhydrolysat oder dergleichen, können verwendet werden. Verschiedene anorganische Salze, wie Phosphate, Carbonate, Sulfate, Magnesium-, Calcium-, Kalium-, zweiwertiges Eisen-, Mangan- oder Zinksalze, oder spezifische Aminosäuren und Vitamine können verwendet werden.
Die Züchtungstemperatur kann im Bereich für das Wachsen mikrobieller Zellen und der Produktion der Pyruvatoxidase ausgewählt werden und beträgt bevorzugt 20 bis 42ºC für E. coli. Die Züchtungszeit kann je nach den Bedingungen verändert werden und ist beendet, wenn die Pyruvatoxidaseproduktion im wesentlichen vollständig ist, und beträgt üblicherweise 12 bis 48 Stunden.
Der pH-Wert des Mediums kann je nach den Bedingungen zum Züchten der Zellen und der Produktion der Pyruvatoxidase verändert werden und beträgt üblicherweise pH 6,0 bis 8,0.
Um die Pyruvatoxidase von der Kultur abzutrennen, wird die gezüchtete Masse fitriert oder zentrifugiert, um die Zellen zu gewinnen. Sie werden durch mechanische oder enzymatische Behandlung, wie mit Lysozym, oder im Falle, daß das Enzym exogen in dem Medium vorhanden ist, aufgebrochen, die Kulturmasse wird fitriert oder zentrifugiert, um das Kulturfiltrat abzutrennen. Ferner wird gegebenenfalls die Pyruvatoxidase durch Zugabe von EDTA und eines grenzflächenaktiven Mittels zur Extraktion des Enzyms solubilisiert. Die so erhaltene Pyruvatoxidaselösung wird mit oder ohne Konzentrieren behandelt, und danach wird das Enzym durch Aussalzen durch Zugabe eines löslichen Salzes, wie Ammoniumsulfat oder Natriumchlorid, präzipitiert. Die niedermolekularen Verunreinigungen werden durch Dialyse entfernt. Ferner werden die Verunreinigungen der Pyruvatoxidaselösung bevorzugt durch Adsorptionschromatographie, Ionenaustauschchromatographie oder Gelfiltration entfernt. Die so erhaltene Enzymlösung wird durch Vakuumkonzentration behandelt und lyophilisiert, um pulverförmige Pyruvatoxidase zu ergeben. Die Aminosäuren, Peptide, Nukleinsäuren, Nukleinsäureverwandte Substanzen und andere werden wie folgt abgekürzt.
Alle Aminosäuren liegen in der L-Form vor.
DNA Desoxyribonucleinsäure
RNA: Ribonucleinsäure
A: Adenin
T: Thymin
G: Guanin
C: Cytosin
Ala: Alanin
Arg: Arginin
Asn: Asparagin
Asp: Aspartat
Cys: Cystein
Gln: Glutamin
Glu: Glutamat
Gly: Glycin
His: Histidin
Ile: Isoleucin
Leu: Leucin
Lys: Lysin
Met: Methionin
Phe: Phenylalanin
Pro: Prolin
Ser: Serin
Thr: Threonin
Trp: Tryptophan
Tyr: Tyrosin
Val: Valin
Die erfindungsgemäß produzierte Pyruvatoxidase besitzt die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften

(1) Enzymwirkung:

Das Enzym katalysiert die Oxidationsreaktion von Brenztraubensäure, anorganischem Phosphat und Sauerstoff unter Bildung von Acetylphosphat, Kohlendioxid und Wasserstoffperoxid:
CH&sub3;COCOOH + HOPO &supmin; + O&sub2; T CH&sub3;COOP &supmin;+ CO&sub2; + H&sub2;O&sub2;

(2) Substratspezifität:

Spezifisch für Pyruvat keine Wirkung auf α-Ketoglutarat, Oxalacetat, Lactat, Acetat und Alanin.

(3) Isoelektrischer Punkt:

pH 4

(4) Molekargewicht:

150.000 bis 155.000 (Gelfiltrationsverfahren)

(5) pH-Optimum:

6,5 bis 7,5

(6) pH-Stabilität:

5,5 bis 7

(7) Lactatoxidaseaktivität

Es wird im wesentlichen keine Lactatoxidaseaktivität beobachet. Die Lactatoxidaseaktivität wurde gemäß der ungeprüften japanischen Patentpublikation Nr. 55-76 gemessen.

(8) ATPase-Aktivität:

Verunreinigende ATPase-Aktivität wird zu weniger als 0,0005% beobachtet.

(9) Natur:

wasserlöslich

(10) Aminosäuresequenz:

siehe Formel (I)
Bei dem erfindungsgemäßen Pyruvatoxidase-Assayverfahren wird ein Reaktionsgemisch wie folgt verwendet:
0,5 M Kaliumpyruvat 0,1 ml
0,5 M Phosphatpuffer (pH 7,0) 0,2 ml
0,2% 4-Aminoantipyrin 0,1 ml
0,2% N,N-Dimethylanilin 0,2 ml
10 mM MgCl&sub2; 50 ul
10 mM Thiaminpyrophosphat 20 ul
Peroxidase (45 E/ml) 0,1 ml
1 mM FAD 10 ul
destilliertes Wasser 0,22 ml
Das vorstehende Reaktionsgemisch (1,0 ml) wird 3 Minuten lang bei 37ºC vorinkubiert. Diese Lösung wird mit der Enzymlösung (20 ul) versetzt und 10 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. 0,1 M Citratpuffer (PH 6,0, 2 ml), enthaltend 0,1 M EDTA wird zugesetzt, um die Reaktion zu beenden. Die gebildete violette Farbe wird colorimetrisch bei 565 nm gemessen.
Eine Einheit (1 Einheit, 1 E) Enzymaktivität ist als die Aktivität definiert, die 1 umol Wasserstoffperoxid pro Minute erzeugt.
Die Grundreaktionen des Assayverfahrens unter Verwendung von Pyruvatoxidase werden nachstehend dargelegt.

I. Pyruvat-erzeugendes System

In den Assay kann mindestens die folgende Reaktion aufgenommen werden, und verschiedene Kombinationen bekannter Reaktionen aus dem Stand der Technik können verwendet werden.
(1) Reaktion von Glutamat-Pyruvat-Transaminase:
Alanin + α-Ketoglutarat T Pyruvat + Glutamat
(2) Reaktion von Glutamat-Oxalacetat-Transaminase und Oxalacetat-Decarboxylase:
Aspartat + α-Ketoglutarat T Oxalacetat + Glutamatoxalacetat T Pyruvat + CO&sub2;
(3) Reaktion der Pyruvatkinase:
ADP + Phosphoenolpyruvat T ATP + Pyruvat
(4) Reaktion der N-Acetylneuraminataldolase:
N-Acetylneuraminat + H&sub2;O T N-Acetylmanosamin + Pyruvat
(5) Reaktion der Lactatdehydrogenase:
Lactat + NAD T Pyruvat + reduziertes NAD
Eine bevorzugte Kombination für die vor stehende Reaktion ist beispielsweise Ammonium, gebildet aus Harnstoff durch die Wirkung von Urease, Ammonium, gebildet aus Kreatinin durch die Wirkung der Kreatinindiaminase, oder Ammonium, freigesetzt aus dem anderen Reaktionssystem, das dann mit Glutamat und ATP in Gegenwart von Glutamatsynthetase unter Bildung von ADP, Glutamin und anorganischem Phosphat umgesetzt wird, und das so erzeugte ADP wird mit dem ADP-Assaysystem unter Verwendung der erfindungsgemäßen Pyruvatkinase und Phosphoenolpyruvat kombiniert. II. ADP-Assay: Pyruvatkinase Phosphoenolpyruvat Pyruvat
(c) Messung des verbrauchten O&sub2; oder des erzeugten H&sub2;O&sub2; oder CO&sub2;
Verschiedene Assays können durch Kombinieren von Reaktionssystemen aus dem Stand der Technik mit den vorstehenden Verfahren hergestellt werden. III. Assay auf ATP Kinase Nicht-Phosphatverbindung Phosphatverbindung
(b) ADP + Phosphoenolpyruvat T ATP + Pyruvat Pyruvatoxidase Pyruvat Acetylphosphat
(d) Messung des verbrauchten O&sub2; oder erzeugten H&sub2;O&sub2; oder CO&sub2;

IV. Assay auf Nicht-Phosphatverbindungen:

Siehe den vorstehenden Punkt III
Beispiele für ADP-erzeugende oder -verbrauchende Enzymreaktionssysteme sind nachstehend wie folgt aufgeführt.

ADP-erzeugende Reaktionen:

(1) Reaktion der Hexokinase;
ATP + D-Hexose T ADP + D-Hexose-6-phosphat
(2) Reaktion der Glucokinase; ATP + D-Glucose T ADP + D-Glucose-6-phosphat
(3) Reaktion der Amylase (mit Maltase);
Glucosepolymeres (lösliche Stärke, Amylose oder andere Oligosaccharide oder Derivate davon) + nH&sub2;O T D-Glucose + Maltose, und
Maltose + 2H&sub2;O T 2 D-Glucose
ATP + D-Glucose TADP + D-Glucose-6-phosphat
(4) Reaktion der Adenosinkinase;
ATP + Adenosin T ADP + AMP
(5) Reaktion der Thymidinkinase;
ATP + Thymidin TADP + Thymidin-5'-phosphat
(6) Reaktion der NAD-Kinase;
ATP + NAD&spplus; T ADP + NADP&spplus;
(7) Reaktion der Enzymwirkung von NADH + H&spplus; zur Erzeugung von NAD&spplus;
NADH + H&spplus; + Substrat A (oxidierte Form) T NAD&spplus; + H&sub2;A und ATP + NAD&spplus; T ADP + NADP&spplus;
(8) Reaktion der Riboflavinkinase;
ATP + Riboflavin T ADP + Flavin-5'-phosphat
(9) Reaktion der Glycerinkinase;
ATP + Glycerin T ADP + Glycerin-3-phosphat
(10) Reaktion des Triglycerid-Assays (mit Lipase);
Triglycerid + 3H&sub2;O T Glycerin + 3 Fettsäuren, und
ATP + Glycerin TADP + Glycerin-3-phosphat
(11) Reaktion des Lipase-Assays;
Di- oder Triglycerid + nH&sub2;O T Glycerin + n Fettsäuren, und
ATP + Glycerin T ADP + Glycerin-3-phosphat
(12) Reaktion der Cholinkinase;
ATP + Cholin T ADP + Cholinphosphat
(13) Reaktion des Cholin-Esterase-Assays;
Cholinester (Fettsäureester oder Arylester; RCOO) + H&sub2;O T Cholin + RCOO&supmin; und
ATP + Cholin T ADP + Cholinphosphat
(14) Reaktion des Phospholipid(Lecithin)-Assays (mit Phospholipase D);
Lecithin + H&sub2;O T Phosphatidat + Cholin-ATP + Cholin T ADP + Cholinphosphat
(15) Reaktion des Protein-Kinase-Assays;
ATP + Proteine T ADP + Phosphoprotein
(16) Assay der Kreatinkinase oder Kreatin;
ATP + Kreatin T ADP + Kreatinphosphat
ATP-erzeugende Reaktionen (ADP-verbrauchende Reaktionen):
(1) Reaktion des Carbamatkinase-Assays, ADP- oder Carbamoylphosphat-Assays;
ADP + Carbamoylphosphat T NH&sub3; + ATP + CO&sub2;
(2) Assay der Phosphoglyceratkinase-Aktivität oder ADP;
ADP + D-1,3-Bisphosphoglycerat T ATP + 3-Glycerin-D-glycerat
(3) Reaktion des Formiat-Kinase-Assays, ADP oder Formylphosphat;
ADP + Formylphosphat TATP + Formiat
(4) Reaktion des Kreatin-Kinase-Assays, ADP- oder Creatinphosphat-Assays;
ADP + Kreatinphosphat T ATP + Kreatin
(5) Assay der Ammoniak-Kinase-Aktivität oder ADP;
ADP + Phosphoamid T ATP + NH&sub4;&spplus;
(6) Assay der Myokinase-Aktivität oder ADP;
2ADP T ATP + AMP.
Ein Assayverfahren von erzeugtem ADP oder verbrauchtem ADP ist in der japanischen Patentanmeldung Nr. 53-86350 "Assay kit and method using pyruvate oxidase" beschrieben.
Um das Pyruvatoxidase-Reaktionssystem zu aktivieren, werden FAD, Thiaminpyrophosphat und Phosphat zugesetzt. Ferner werden zur Aktivierung des Enzyms ein ionenfreisetzendes Salz, das Calciumionen, Cobaltionen, Magnesiumionen oder Manganionen freisetzt, bevorzugt als Chlorid zugesetzt. Ein Indikator, wie ein Farbindikator oder ein Fluoreszensindikator für Wasserstoffperoxid, kann bevorzugt verwendet werden.
Die Menge und das Verhältnis der Komponenten in dem Enzymreaktionssystem kann für die wesentliche Enzymreaktion ausgewählt werden und variiert je nach der Menge an Pyruvat, der Temperatur und der Zeit der Enzymreaktion. Beispielsweise können bevorzugt 1 bis 200 E Pyruvatoxidase verwendet werden.
Pyruvatoxidase kann in einer mikroverkapselten Form oder in einer immobilisierten Form in covalenter Bindung an einen organischen oder anorganischen Träger oder in Adsorption auf einen Träger vorliegen.
Ferner können 0,1 bis 20 nmol FAD, 0,05 bis 0,5 umol Thiaminpyrophosphat, 1 bis 10 umol anorganisches Phosphat und 0,05 bis 0,1 umol des ionenfreisetzenden Salzes pro Test bevorzugt verwendet werden.
Das Molverhältnis des Indikators für Wasserstoffperoxid ist mindestens äquimolar oder überschüssig zu dem erzeugten Wasserstoffperoxid. Im Falle der Peroxidase werden 0,5 bis 20 E pro Test bevorzugt verwendet. Diese Komponenten des enzymatischen Reaktionsgemisches werden bevorzugt durch Auflösen in einem Puffer mit einem geeignet eingestellten pH-Wert verwendet.
Das so hergestellte enzymatische Reaktionssystem wird zur Analyse von Brenztraubensäure, ADP, ATP oder verwandter Nicht-Phosphatverbindungen verwendet.
Der Assay wird durch Inkubation der Probe und des Reagensgemisches durchgeführt. Das Reagensgemisch ist bevorzugt ein Kit der notwendigen Reagentien. Zum Assay wird die verbrauchte Komponente oder die erzeugte Komponente gemessen. Die Messung der Menge an Sauerstoffverbrauch durch Auflösung in einem Sauerstoff-Meßgerät ist als Assayverfahren bevorzugt. In diesem Falle ist kein Indikator für Wasserstoffperoxid notwendig. Für den Assay einer erzeugten Komponente ist die Messung der Menge an Wasserstoffperoxid bevorzugt, beispielsweise mittels eines Wasserstoffperoxid- Elektrodengeräts, wie eines YSI-Oxidasemeters, oder colorimetrisch oder fluorimetrisch mit einem Indikator für Wasserstoffperoxid. Der Assay kann bevorzugt 10 bis 60 Minuten und bei 20 bis 40ºC, bevorzugt bei 35 bis 37ºC, durchgeführt werden.
Der Indikator für Wasserstoffperoxid ist eine Kombination aus einem oder mehreren chromogenen oder fluoreszierenden Stoffen, die durch Kopplung mit Wasserstoffperoxid bewirkt wird. Beispiele für solche Indikatoren sind Kombinationen von tetravalenten Titanverbindungen und Xylenol-Orange, das mit Wasserstoffperoxid unter Bildung einer stabilen roten Farbe kuppelt, oder eine Kombination aus Phenol oder N,N- Dimethylanilin oder Homovanillinsäure, 4-Aminoantipyrin und Peroxidase zur Messung der Farbe oder der Fluoreszenz. 4- Aminoantipyrin kann durch 4-Aminophenazon ersetzt werden. Eine Kombination aus 2,6-Dichlorphenolindophenol und Peroxidase und aus Guajacol und Peroxidase kann ebenfalls verwendet werden. Der Indikator kann zuvor als Lösung hergestellt werden.
Die Menge an Brenztraubensäure kann durch Berechnung des verbrauchten Sauerstoffs oder des erzeugten Wasserstoffperoxids aus den entsprechenden Standardkurven bestimmt werden. Colorimetrische oder fluorimetrische Assays werden durch Messung der Absorption bei einer geeigneten Wellenlänge, wie 565 nm, durchgeführt.
Phosphat als verbrauchte Komponente oder Acetylphosphat als erzeugte Komponente können nach jedem herkömmlichen Verfahren ebenfalls bestimmt werden.
Die erfindungsgemäße Pyruvatoxidase ist nicht mit Lactatoxidase kontaminiert, und der Gehalt an ATPase beträgt weniger als 0,0005%, und daher ist sie im Vergleich mit den aus dem Stand der Technik bekannten Pyruvatoxidasen, die Lactatoxidase und 0,0005% ATPase enthalten, vorteilhaft.
Das ATPase-Assayverfahren und das Farbreagens für den ADP- Assay sind nachstehend erläutert.

1. ATPase-Assay:

Reagens 1 (1,0 ml) (enthält 40 E Pyruvatoxidase) wird 1 Stunde lang bei 37ºC vorinkubiert. Das ADP-Reagens 2 (1,0 ml) wird zugesetzt und 15 Minuten lang bei 37ºC inkubiert und weiter mit 10%igem SDS (Natriumdodecylsulfat) (1,0 ml) zur Auflösung der Trübung versetzt. Es wird bei 550 nm gemessen. Reagens 1: PIPES-Puffer (pH 7) ATP (Sigma) Pyruvatoxidase Reagens 2: Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) Phosphoenolpyruvat (Boehringer) Pyruvatoxidase (500 E/ml, Toyo Jozo) Thiaminpyrophosphat (Wako) FAD (Sigma) 4-Aminoantipyrin Peroxidase (50 E/ml, Sigma)
ATPase-Aktivität (E/ml)
ΔA550 nm: In dem Reagens 1 wird ATP zerstört. Die Inkubation wurde auf gleiche Weise durchgeführt, und die Absorption wurde abgezogen.
18: Molekularer Absorptionskoeffizient
0,1: Enzymlösung (1 ml)
3,0: Gesamtes Reaktionsvolumen (ml)
60: Reaktionszeit (min)
ATPase-Kontaminationsverhältnis:
400: Pyruvatoxidase-Aktivität (400 E/ml) 2. Vergleich des Farbreagenses für den ADP-Assay: Konzentration optimaler Bereich herkömmlicher Bereich Tris-HCl (pH 7,5)* Phosphoenolpyruvat (Boehringer) ATP (Sigma) Pyruvatoxidase Peroxidase (Sigma) Phosphatpuffer (pH 7,5) Thiaminpyrophosphat 4-Aminoantipyrin Phenol Triton X-100 * Eine andere Pufferlösung (pH 6,5-8) kann verwendet werden.
Der Leerwert für Reagens wird bei 10ºC bei einer Absorption bei 500 nm nach vorheriger Sterilfiltration des Inkubationsgemisches unter Verwendung eines Millipore-Filters gemessen.
Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung näher, ohne sie zu beschränken.

Beispiel 1

(Isolierung von chromosomaler DNA):

Die chromosomale DNA von Aerococcus viridans IFO 012219 wurde nach dem folgenden Verfahren isoliert.
Der Stamm wurde über Nacht unter Schütteln in einem Bouillonmedium (150 ml, enthaltend 0,5% Natriumthiosulfat) bei 37ºC gezüchtet. Die gezüchteten Zellen wurden durch 10minütige Zentrifugation bei 3000 UpM gewonnen. Die Lysozymlösung (10 mg/ml, 1 ml) wurde einer Suspension der Zellen in einer Lösung aus 10% Saccharose, 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 50 mM EDTA zugesetzt, und es wurde 15 Minuten lang bei 37ºC inkubiert. Dann wurde 10%iges SDS (Natriumdodecylsulfat) (1 ml) zugesetzt. Ein gleiches Volumen eines Gemisches aus Chloroform-Phenol (1:1) wurde der Suspension zugesetzt, es wurde unter Rühren gemischt und bei 10000 UpM drei Minuten lang zentrifugiert, um die wäßrige Schicht und die Lösungsschicht zu trennen. Die wäßrige Schicht wurde gewonnen. Das zweifache Volumen an Ethanol wurde sanft der wäßrigen Schicht zugesetzt, um eine doppelte Phase zu ergeben, und die DNA wurde durch Aufwinden auf einem Glasstab unter sanftem Rühren gewonnen. Die gewonnene DNA wurde in einer Lösung (10 ml) aus 10 mM Tris+HCl (pH 8,0) und 1 mM EDTA (nachstehend als TE-Lösung bezeichnet) aufgelöst. Die Lösung wurde mit einem gleichen Volumen eines Gemisches aus Chloroform - Phenol behandelt und zentrifugiert, um eine wäßrige Schicht abzutrennen. Das zweifache Volumen an Ethanol wurde der wäßrigen Schicht zugesetzt, und die DNA wurde auf gleiche Weise wie vorstehend isoliert und dann in TE-Lösung (2 ml) aufgelöst.

Beispiel 2

(Abtrennen der DNA des Plasmids pACYC 184):

Ein Stamm von Escherichia coli pM 191 [J. Bacteriol., 134:1141 (1981), ATCC 37033], der pACYC 184 trug, wurde unter Schütteln in BHI-Medium (Difco, 1 Liter) gezüchtet. Wenn das Wachstum der bakteriellen Zellen durch Trübungsmessung als OD&sub6;&sub6;&sub0; = 1,0 beobachtet wurde, wurde Spectinomycin (Endkonzentration 300 ug/ml, Plasmidresistenzmarke = Chloramphenicol) zugesetzt, und es wurde 16 Stunden lang bei 37ºC weiter geschüttelt. Die gezüchteten Zellen wurden bei 3000 UpM 10 Minuten lang gewonnen, und die Plasmid-DNA wurde nach dem Lysozym-SDS- und Caesiumchlorid-Ethidiumbromid-Verfahren [Maniortis et al., Molecular Cloning, S. 86- 94, Cold Spring Harbor (1982)] hergestellt.

Beispiel 3

[Herstellung des Plasmids pOX13, enthaltend das Pyruvatoxidase(POP)Gen]:

(i) Chromosomale DNA (2 ul, etwa 0,5 ug) von A. viridans, hergestellt gemäß Beispiel 1, wurde mit einem EcoRI-Spaltpuffer (1 ul) (500 mM Tris-HCl, pH 7,5, 70 ml MgCl&sub2;, 1 M NaCl und 70 mM Mercaptoethanol), EcoRI (1 ul: Takara Syuzo Co., Ltd.) und Wasser (6 ul) vermischt und 1 Stunde lang bei 37ºC gespalten. Getrennt hergestellte DNA des Plasmids pACYC 184 (ca. 0,3 ug) wurde auf gleiche Weise mit EcoRI gespalten. Die alkalische Phosphatase (nachstehend als BAP, Takara Shuzo Co.) (0,6 Einheiten) wurde zugesetzt und 1 Stunde lang bei 65ºC inkubiert. Die mit EcoRI behandelten zwei DNA-Arten wurden vermischt und mit 3 M Natriumacetat (1/10 Volumen) versetzt, und das Gemisch wurde weiter mit einem gleichen Volumen eines Gemisches aus Chloroform und Phenol behandelt. Die wäßrige Schicht wurde durch Zentrifugation gewonnen.
Das zweifache Volumen an Ethanol wurde der wäßrigen Schicht zugesetzt, die zur Fällung der DNA zentrifugiert wurde, welche in Vakuum getrocknet wurde. Die lyophilisierte DNA wurde in Wasser (89 ul) aufgelöst. Zehnfach konzentrierter Ligierungspuffer (0,5 M Tris-HCl, pH 7,6, 0,1 M MgCl&sub2;, 0,1 M Dithiothreit, 10 mM Spermidin und 10 mM ATP) (10 ul) und T4-DNA-Ligase (1 ul, Takara Shuzo Co., 175 E) wurden zugesetzt, vermischt und bei 4ºC über Nacht stehengelassen. Die DNA-Lösung wurde mit Chloroform-Phenol behandelt, die DNA wurde durch Präzipitation mit Ethanol gewonnen, im Vakuum getrocknet und in TE (10 ul) aufgelöst.
(ii) Logarithmisch wachsender Escherichia coli W3110 (erhalten vom National Institute of Heredity, Japan, Charge Nr. ME 7778, ATCC 27325) in BHI-Medium (100 ml, Hirn-Herz- Infusion, Difco) wurde durch 2minütige Zentrifugation bei 10000 UpM gewonnen und in einer eisgekühlten Lösung (40 ml, pH 5,8) aus 30 mM Kaliumacetat, 100 mM RbCl, 10 mM CaCl&sub2;, 50 mM MnCl&sub2; und 15% Glyerin suspendiert. Die Suspension wurde 5 Minuten lang bei 0ºC stehengelassen und zentrifugiert, und der Überstand wurde verworfen. Ferner wurde das Präzipitat in einer Lösung (4 ml, pH 6,5) aus 10 mM MOPS- Puffer (Dotite Co.), 75 mM CaCl&sub2;, 10 mM RbCl und 15% Glycerin suspendiert und 15 Minuten bei 0ºC stehengelassen, um kompetente Zellen herzustellen.
(iii) Die wie in (i) beschrieben hergestellte DNA-Lösung (10 ul) wurde der E. coli-Suspension aus (ii) (200 ul) zugesetzt und 30 Minuten lang bei 0ºC stehengelassen. Das BHI-Medium (1 ml) wurde zugesetzt, 90 Minuten lang bei 37ºC gehalten, und 100 ul davon wurden auf eine BHI-Agarplatte, die Tetracyclin (15 ug/ml) enthielt, ausplattiert. Dann wurde bei 37ºC über Nacht bebrütet, um einen Transformanten zu erhalten. Die transformierten Zellen wurden auf einer POP-Mediumplatte (Pepton 5 g, Fleischextrakt 2 g, Hefeextrakt 5 g, NaCl 1 g, K&sub2;HPO&sub4; 1 g, MgSO&sub4; 0,5 g, Peroxidase 500 IE, FAD 7,85 mg, Dianisidin 0,1 g, Thiaminpyrophosphat 42,4 mg, Pyruvat 1 ml, Agar 15 g, destilliertes Wasser 1 l, pH 7,0) repliziert und weiter bei 37ºC über Nacht bebrütet. Etwa 4500 Kolonien des Transformanten wurden überprüft, und eine Kolonie, deren Umgebung bräunlich-braun war, wurde erhalten. Dieser Stamm wurde als Escherichia coli W3110-pOXI3 bezeichnet und als FERM P-Nr. 9071 (FERM BP-1565) hinterlegt.
Es wurde gezeigt, daß der Stamm bei Züchtung bei 37ºC über Nacht in BHI-Medium 3 Einheiten/ml Pyruvatoxidase ergab. Ein Plasmid in diesem Stamm wurde nach dem in Beispiel 2 angegebenen Verfahren isoliert und als pOXI3 bezeichnet, das das Pyruvatoxidasegen und das pACYC 184-Gen enthielt.

Beispiel 4

[Kartierung von pOXI3 und Bestimmung der Basensequenz des POP-Gens]:

Eine pOXI3-Plasmid-DNA wurde aus Escherichia coli W3110- pOXI3 nach dem gleichen Verfahren, wie in Beispiel 2 zur Herstellung von pACYC 184 beschrieben, hergestellt.
Eine Restriktionskarte der pOXI3-DNA durch Spalten mit den Restriktionsenzymen ClaI, EcoRV, HindIII, ScaI, PstI, PvuII, XbaI (Takara Shuzo Co.) und HpaI (Toyobo Co.) wurde hergestellt. Das Ergebnis ist in Figur 1 gezeigt.
Die Basensequenz der DNA, die das Pyruvatoxidasegen codiert, wurde nach dem Didesoxyverfahren (Science, 214: 1205-1210, 1981) unter Verwendung des M13-Phagen bestimmt. In den Figuren 2-1, 2-2 und 2-3 sind die Basensequenz des POP-Strukturgens und die Aminosäuresequenz des Polypeptids, das dieses Gen codiert, dargestellt.

Beispiel 5

[Produktion von Pyruvatoxidase]

E. coli W3110-pOXI3 wurde in BHI-Medium (Difco) (20 Liter) bei 37ºC 18 Stunden lang in einem Großfermenter gezüchtet und 10 Minuten lang bei 5000 UpM zentrifugiert, um die Zellen zu gewinnen. Die bakteriellen Zellen wurden mit physiologischer Kochsalzlösung (2 Liter) gewaschen und in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) suspendiert. Lysozym (1 mg/ml), EDTA-2Na (2 mM) und Triton X-100 (0,1%) wurden zugesetzt und 30 Minuten lang bei 37ºC gehalten. Dann wurde bei 5000 UpM 10 Minuten lang zentrifugiert, um die überstehende Lösung abzutrennen.
Ammoniumsulfat wurde dem Überstand (1,9 l) bei einer Sättigung von 40-66% zugesetzt, und das Präzipitat wurde durch Zentrifugation (5000 UpM, 10 Minuten) gewonnen. Das Präzipitat wurde in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0, enthaltend 10 uM FAD) (200 ml) aufgelöst, anschließend über Sephadex G-25 entsalzt. Die entsalzte Enzymlösung wurde auf eine Säule aus DEAE-Sepharose CL-6B für die Ionenaustauschchromatogra-Phie gegeben, und die aktive Fraktion wurde gewonnen, entsalzt und lyophilisiert, um ein Enzympulver zu erhalten. Das Enzym zeigt eine Aktivität von 51 E/mg.

Beispiel 6

[Bestimmung der N-terminalen Aminosäuresequenz der Pyruvatoxidase]

Die Aminosäuresequenz von 10 Aminosäuren vom N-Terminus der Pyruvatoxidase, die in Beispiel 5 erhalten wurde, wurde mittels eines Aminosäuresequenators (Beckman System 980 ME) bestimmt.
Etwa 80% davon enthalten Met am N-terminalen Ende und die Sequenz von der Aminosäure in Position 1 lautet "Ser, Asp, Asn, Lys, Ile, Asn, Ile, Gly, Leu, (Ala)".

Beispiel 7

Der Leerwert des Pyruvatoxidasereagenses mit verunreinigender ATPase unter Verwendung des unter dem vorstehenden Punkt (2) hergestellten ADP-Farbreagenses wird ermittelt. Wie in Figur 3 gezeigt, wurde ein Ansteigen des Leerwertes, der durch Bildung von ADP aus ATP durch verunreinigende ATPase verursacht wurde, mit der bekannten Pyruvatoxidase beobachtet. Keine Erhöhung des Leerwerts wurde bei der erfindungsgemäßen Pyruvatoxidase, bei der die verunreinigende ATPase 0,0005% beträgt, beobachtet.

Beispiel 8

Reagentien der folgenden Zusammensetzung, die Pyruvatoxidase mit verunreinigender ATPase von 0,005% und 0,0005% enthielten, wurden hergestellt, und Serumtriglyceride wurden unter Verwendung des Reagens es vergleichend gemessen.
0,2 M PIPES-NaOH (pH 7,3) 0,3 ml
0,1 M ATP 0,15 ml
0,1 M MgCl&sub2; 0,15 ml
10 mM Thiaminpyrophosphat 0,3 ml
0,3% TOOS 0,3 ml
0,2% 4-Aminoantipyrin 0,3 ml
Peroxidase (45 E/ml) 0,3 ml
Glycerinkinase (25 E/ml) 0,05 ml
1 mM FAD 0,05 ml
10 mM Phosphatpuffer (pH 7,3) 0,15 ml
Pyruvatoxidase (500 E/ml) 0,03 ml
0,1 M Phosphoenolpyruvat 0,03 ml
Pyruvatkinase (500 E/ml) 0,03 ml
Lipase (3000 E/ml) 0,03 ml
H&sub2;O 0,56 ml

[Experimentelles Verfahren]

Humanserum (20-100 ul) wurde dem vorstehenden Triglycerid- Farbreagens (3,0 ml) zugesetzt, das entweder eines unmittelbar nach der Herstellung oder eines, das 20 Stunden bei Raumtemperatur im Dunkeln gelagert wurde, ist. Das Gemisch wurde 15 Minuten lang bei 37ºC inkubiert, und dann wurde sofort die Absorption bei 550 nm gemessen. Das Ergebnis ist in Figur 4 gezeigt.
In der Figur bedeuten:
- : unmittelbar nach der Herstellung des Reagenses mit Pyruvatoxidase mit einer Verunreinigung von 0,005% ATPase.
-- : unmittelbar nach der Herstellung des Reagenses mit Pyruvatoxidase mit einer Verunreinigung von 0,0005% ATPase.
- : 20 Stunden gelagertes Reagens mit Pyruvatoxidase mit einer Verunreinigung von 0,005% ATPase.
-- : 20 Stunden gelagertes Reagens mit Pyruvatoxidase mit einer Verunreinigung von 0,0005% ATPase.

Beispiel 9

Die Reagentien der folgenden Zusammensetzungen, welche Pyruvatoxidase mit einer verunreinigenden ATPase von 0,005% und 0,0005% enthielten, wurden hergestellt, und die Hexokinaseaktivität wurde gemessen.
0,2 M HEPES-NaOH (pH 7,6) 0,3 ml
0,1 M ATP 0,15 ml
2 M Glucose 0,30 ml
0,1 M MgCl&sub2; 0,24 ml
10 mM Thiaminpyrophosphat 0,30 ml
0,3% TOOS 0,30 ml
0,2% 4-Aminoantipyrin 0,30 ml
Peroxidase (45 E/ml) 0,30 ml
10 mM Phosphatpuffer (pH 7,6) 0,15 ml
Pyruvatoxidase (500 E/ml) 0,30 ml
0,1 M Phosphoenolpyruvat 0,03 ml
Pyruvatkinase (500 E/ml) 0,03 ml
H&sub2;O 0,57 ml

[Experimentelles Verfahren]

Hexokinase (Oriental Yeast Co.) (50 ul) wurde dem Reagens für den Hexokinase-Assay unmittelbar nach Herstellung oder nach 20stündiger Lagerung im Dunkeln bei Raumtemperatur zugesetzt, und kontinuierlich wurde die Absorption bei 550 nm bei 37ºC gemessen.
Die Hexokinase-Aktivität wurde durch ein Ansteigen der Absorption pro Minute 3 Minuten nach der Enzymzugabe gemessen. (Figur 5)
In Figur 5 bedeuten:
- unmittelbar nach der Herstellung des Reagenses mit Pyruvatoxidase mit einer Verunreinigung von 0,005% ATPase.
-- : unmittelbar nach der Herstellung des Reagenses mit Pyruvatoxidase mit einer Verunreinigung von 0,0005% ATPase.
- : 20 Stunden gelagertes Reagens mit Pyruvatoxidase mit einer Verunreinigung von 0,005% ATPase.
-- : 20 Stunden gelagertes Reagens mit Pyruvatoxidase mit einer Verunreinigung von 0,0005% ATPase.
Wie vorstehend gezeigt, ergibt ein Reagens für den ADP-Assay, das unter Zugabe von Pyruvatoxidase mit einer Verunreinigung von weniger als 0,0005% hergestellt wurde, einen niedrigen erhöhten Leerwert des Farbreagenses, und daher kann das Reagens für lange Zeit gelagert werden.

Beispiel 10

Humanserum (20 ul, drei Probentypen A, B und C) wurde dem Reagens für den GOT-Aktivitätsassay (1,0 ml) der folgenden Zusammensetzung zugesetzt und 30 Minuten bei 37ºC inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von McIlvain-Puffer (pH 5,5, 2,0 ml), enthaltend 1% Triton X-100 und 0,1 M EDTA, gestoppt, und die Absorption bei 550 nm wurde gemessen. Reaktionslösungen ohne Zugabe von L-Aspartat und α-Ketoglutarat wurden hergestellt und wie vorstehend für den Leerwert-Assay behandelt.
0,5 M HEPES-NaOH (pH 7,0) 0,08 ml
0,2 M KH&sub2;PO&sub4;-NaOH (pH 7,0) 0,02 ml
0,2 M L-Aspartat (pH 7,0) 0,5 ml
0,2 M α-Ketoglutarat (pH 7,0) 0,05 ml
20 mM Thiaminpyrophosphat 0,05 ml
0,5 mM MgCl&sub2; 0,01 ml
20 mM 4-Aminoantipyrin 0,05 ml
20 mM TOOS 0,05 ml
Peroxidase (45 E/ml) 0,05 ml
Pyruvatoxidase (160 E/ml) 0,05 ml
Oxalacetatdecarboxylase 0,05 ml
H&sub2;O 0,04 ml Humanserum Lactat Pyruvatoxidase aus dem Stand der Technik erfindungsgemäße Pyruvatoxidase Absorption Leerwert Unterschied
Wie das Ergebnis zeigt, wurde eine Erhöhung der Absorption in dem Leerwert-Assay unter Verwendung von Pyruvatoxidase aus dem Stand der Technik infolge der Serumlactat-Interferenz beobachtet, und so sollten Absorptionsunterschiede sorgfältig bestimmt werden. Im Gegensatz dazu wurde kein Ansteigen im Leerwert-Assay unter Verwendung der erfindungsgemäßen Pyruvatoxidase beobachtet, und so ist die erfindungsgemäße Pyruvatoxidase nicht mit Lactatoxidase verunreinigt und kann ohne Berechnung des Absorptionsunterschiedes zwischen dem Assay und dem Leerwert verwendet werden.
Erfindungsgemäß wurden die Basensequenz des Pyruvatoxidasegens und die Aminosäuresequenz der Pyruvatoxidase bereitgestellt. Ebenso wurde ein Verfahren zur Produktion der Pyruvatoxidase auf gentechnischem Weg bereitgestellt.
Ferner zeigt das Assayverfahren unter Verwendung der erfindungsgemäßen Pyruvatoxidase fast keine Erhöhung des Leerwerts, und so kann das Reagens über lange Zeit gelagert werden.

Claims

1. Pyruvat-Oxidase mit der Fähigkeit, die Umsetzung von Pyruvat, Phosphat und Sauerstoff unter Bildung von Acetylphosphat, Kohlendioxid und Wasserstoffperoxid zu katalysieren, einem ATPase-Gehalt von weniger als 0,0005% und im wesentlichen fehlender Lactatoxidase-Aktivität, und umfassend die Aminosäuresequenz gemäß Figur 2 der Figuren.

2. Polypeptid mit Pyruvat-Oxidase-Aktivität nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Polypeptid aus der in Figur 2 der Figuren gezeigten Aminosäuresequenz oder einer solchen Sequenz, worin der N-terminale Met-Rest durch einen anderen Aminosäurerest, ein Wasserstoffatom oder eine Acetylgruppe substituiert ist, und der andere terminale Lys-Rest an einen Aminosäurerest, -OH oder -NH&sub2; gebunden ist, besteht.

3. Polydesoxyribonucleinsäure, die exogen ist und eine Basensequenz, die ein Polypeptid nach Anspruch 2 codiert, besitzt.

4. Polydesoxyribonucleinsäure nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Basensequenz, wie in Figur 2 der Figuren gezeigt, ist oder eine solche Sequenz ist, in der das 5'-terminale ATG-Codon durch ein anderes Codon, ausgenommen TAA, TAG oder TGA, oder durch Wasserstoff ersetzt ist, und das 3'-terminale AAA-Codon an ein Codon oder ein Wasserstoffatom gebunden ist.

5. Rekombinanter Vektor, umfassend eine Polydesoxyribonucleinsäure nach Anspruch 3 oder 4.

6. Vektor nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß er ein Plasmid ist.

7. Vektor nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasmid pOXI3 mit der Restriktionskarte nach Figur 1 ist.

8. Transformant, umfassend einen Mikroorganismus, der mit einem Vektor nach Anspruch 5, 6 oder 7 transformiert worden ist.

9. Transformant nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus ein Escherichia coli-Stamm ist.

10. Transformant nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß er Escherichia coli W3110 pOXI3 (FERM BP-1565) ist.

11. Verfahren zur Produktion von Pyruvat-Oxidase, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Transformanten nach Anspruch 8, 9 oder 10 züchtet und ein Polypeptid, das aus einer Pyruvat-Oxidase besteht oder sie enthält, aus dem Züchtungsprodukt isoliert.

12. Assay-Verfahren auf ADP, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) ATP und Pyruvat aus ADP und Phosphoenol-Pyruvat durch Transphosphorylierung unter Verwendung von Pyruvat- Kinase erzeugt,

(b) nachweisbare Veränderungen durch Erzeugung von Acetylphosphat, Kohlendioxid und Wasserstoffperoxid durch Wirkung einer Pyruvat-Oxidase nach Anspruch 1 an dem in Stufe (a) erzeugten Pyruvat hervorruft, und

(c) die nachweisbaren Veränderungen durch Wirkung eines Enzyms und eines Reagenses nachweist.

13. Assay-Verfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß das ADP ein in einer ADP-erzeugenden Reaktion vorhandenes ADP oder ein ADP in einer ADP-verbrauchenden Reaktion ist.

14. Assay-Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die ADP-erzeugende Reaktion aus den folgenden Reaktionen ausgewählt ist:

1. Hexokinasereaktion;

ATP + D-Hexose T ADP + D-Hexose-6-phosphat

2. Glucokinasereaktion;

ATP + D-Glucose T ADP + D-Glucose-6-phosphat

3. Amylasereaktion (mit Maltase);

Glucosepolymeres (lösliche Stärke, Amylose oder ein anderes Oligosaccharid oder Derivate davon) + nH&sub2;O D-Glucose + Maltose, und Maltose + 2H&sub2;O T 2 D-Glucose ATP + D-Glucose T ADP + D-Glucose-6-phosphat

4. Adenosinkinasereaktion;

ATP + Adenosin T ADP + AMP

5. Thymidinkinasereaktion;

ATP + Thymidin T ADP + Thymidin-5'-phosphat

6. NAD-Kinasereaktion;

ATP + NAD&spplus; T ADP + NADP&spplus;

7. Enzymatische Reaktion aus NADH + H&spplus; zur Erzeugung von NAD&spplus;;

NADH + H&spplus; + Substrat A (oxidierte Form) T NAD&spplus; + H&sub2;A und ATP + NAD&spplus; T ADP + NADP&spplus;

8. Riboflavinkinasereaktion;

ATP + Riboflavin T ADP + Flavin-5'-phosphat

9. Glycerinkinasereaktion;

ATP + Glycerin T ADP + Glycerin-3-phosphat

10. Triglyceridassayreaktion (mit Lipase);

Triglycerid + 3H&sub2;O T Glycerin + 3 Fettsäuren und ATP + Glycerin T ADP + Glycerin-3-phosphat

11. Lipaseassayreaktion;

Di- oder Triglycerid + nH&sub2;O T Glycerin + n Fettsäure, und ATP + Glycerin T ADP + Glycerin-3-phosphat

12. Cholinkinasereaktion;

ATP + Cholin T ADP + Cholinphosphat

13. Cholinesteraseassayreaktion;

Cholinester (Fettsäureester oder Arylester; RCOO) + H&sub2;O T Cholin + RCOO- und ATP + Cholin T ADP + Cholinphosphat

14. Phospholipid(Lecithin)assayreaktion (mit Phospholipase D);

Lecithin + H&sub2;O T Phosphatidat + Cholin und ATP + Cholin T ADP + Cholinphosphat

15. Proteinkinasereaktion; ATP + Protein T ADP + Phosphoprotein, und

16. Creatinkinasereaktion; ATP + Creatin T ADP + Creatinphosphat.

15. Assay-Verfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die ADP-verbrauchende Reaktion aus den folgenden Reaktionen ausgewählt ist:

1. Carbamatkinasereaktion;

ADP + Carbamoylphosphat T NH&sub3; + ATP + CO&sub2;

2. Phosphoglyceratkinasereaktion;

ADP + D-1,3-Bisphosphoglycerat T ATP + 3-Glycerin-D-glycerat

3. Formeatkinasereaktion;

ADP + Formylphosphat T ATP + Formeat

4. Creatinkinasereaktion;

ADP + Creatinphosphat T ATP + Creatin

5. Ammoniumkinasereaktion;

ADP + Phosphoramid T ATP + NH&sub4;&spplus;

6. Myokinasereaktion;

2ADP T ATP + AMP.

16. Assay-Verfahren auf ATP, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) ADP und eine Phosphatverbindung aus ATP und einer Nicht-Phosphatverbindung durch Transphosphorylierung unter Verwendung einer Kinase erzeugt,

(b) ATP und Pyruvat aus dem in Stufe (a) erzeugten ADP und Phosphoenolpyruvat durch Transphosphorylierung unter Verwendung einer Pyruvat-Kinase erzeugt,

(c) nachweisbare Veränderungen durch Erzeugung von Acetylphosphat, Kohlendioxid und Wasserstoffperoxid durch Wirkung einer Pyruvat-Oxidase nach Anspruch 1 an dem in Stufe (b) erzeugten Pyruvat hervorruft, und

(d) die nachweisbaren Veränderungen durch Wirkung eines Enzyms und eines Reagenses nachweist.

17. Assay-Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß das ATP ein vorhandenes ATP, ATP in einer ATP-verbrauchenden Reaktion oder ATP in einer ATP-erzeugenden Reaktion ist.

18. Assay-Verfahren nach Anspruch 17, dadurch gekennzeichnet, daß die ATP-verbrauchende Reaktion aus den folgenden Reaktionen ausgewählt ist:

1. Methionin-Adenosyltransferasereaktion; ATP + L-Methionin + H&sub2;O T S-Adenosyl-L-methionin + PPi + Pi

2. Hexokinasereaktion;

ATP + D-Hexose T ADP + D-Hexose-6-phosphat

3. Glucokinasereaktion;

ATP + D-Glucose T ADP + D-Glucose-6-phosphat

4. Amylasereaktion (mit Maltase);

Glucosepolymeres (lösliche Stärke, Amylose oder ein anderes Oligosaccharid oder Derivate davon) + nH&sub2;O T D-Glucose + Maltose, und Maltose + 2H&sub2;O T 2 D-Glucose ATP + D-Glucose T ADP + D-Glucose-6-phosphat

5. Adenosinkinasereaktion;

ATP + Adenosin T ADP + AMP

6. Thymidinkinasereaktion;

ATP + Thymidin T ADP + Thymidin-5'-phosphat

7. NAD-Kinasereaktion;

ATP + NAD&spplus; T ADP + NADP&spplus;

8. Enzymatische Reaktion aus NADH + H&spplus; unter Erzeugung von NAD&spplus;;

9. Riboflavinkinasereaktion;

ATP + Riboflavin T ADP + Flavin-5'-phosphat

10. Glycerinkinasereaktion;

ATP + Glycerin T ADP + Glycerin-3-phosphat

11. Triglyceridassayreaktion (mit Lipase); Triglycerid + 3H&sub2;O Glycerin + 3 Fettsäure, und ATP + Glycerin T ADP + Glycerin-3-phosphat

12. Lipaseassayreaktion;

Di- oder Triglycerid + nH&sub2;O TGlycerin + n Fettsäure, und ATP + Glycerin ADP + Glycerin-3-phosphat

13. Cholinkinasereaktion;

ATP + Cholin T ADP + Cholinphosphat

14. Cholinesteraseassayreaktion;

Cholinester (Fettsäureester oder Arylester; RCOO) + H&sub2;O T Cholin + RCOO&supmin; und ATP + Cholin T ADP + Cholinphosphat

15. Phospholipid(Lecithin)assayreaktion (mit Phospholipase D);

16. Proteinkinasereaktion;

ATP + Protein ADP + Phospho-Protein

17. Creatinkinasereaktion; ATP + Creatin T ADP + Creatinphosphat.

19. Assay-Verfahren auf eine Nicht-Phosphatverbindung, dadurch gekennzeichnet, daß man

(a) ADP und eine Phosphatverbindung aus ATP und einer Nicht-Phosphatverbindung durch Transphosphorylierung unter Verwendung von Kinase erzeugt,

(b) ATP und Pyruvat aus dem in Stufe (a) erzeugten ADP und Phosphoenolpyruvat durch Transphosphorylierung unter Verwendung von Pyruvat-Kinase erzeugt,

(c) nachweisbare Veränderungen durch Erzeugung von Acetylphosphat, Kohlendioxid und Wasserstoffperoxid durch Wirkung einer Pyruvat-Oxidase nach Anspruch 1 auf das in Stufe (b) erzeugte Pyruvat hervorruft, und