DE3153683C2

DE3153683C2 -

Info

Publication number: DE3153683C2
Application number: DE3153683A
Authority: DE
Inventors: Hideo Tagata Shizuoka Jp Misaki; Shigeru Kanazawa Ishikawa Jp Ikuta; Kazuo Tagata Shizuoka Jp Matsuura
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1980-08-12
Filing date: 1981-08-11
Publication date: 1992-05-14
Anticipated expiration: 2001-08-12
Also published as: CA1173767A; GB2087401A; FR2488618A1; IT8123478A0; DE3132121C2; GB2087401B; NL187273B; FR2488618B1; DE3132121A1; NL187273C; NL8103787A; IT1168159B; US4385112A

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Nucleosidbestimmung. Die vorliegende Anmeldung ist eine Ausscheidung aus der deutschen Patentanmeldung P 31 32 121 vom 11.8.81.

Es ist gefunden worden, daß ein Mikroorganismenstamm B-0781, der zur Art Pseudomonas gehört und aus einer Bodenprobe eines Zwiebelfeldes in Ono-shi, Hyogo-ken, Japan isoliert worden ist, in seinen bakteriellen Zellen ein neues Enzym - Nucleosid-Oxidase - produziert, das die folgenden biochemischen Eigenschaften mit Bezug auf die Substratspezifität und die enzymatische Wirkung hat:
Substratspezifität wenigstens für Nucleoside der folgenden Formeln I, Ib und Ic oder deren Derivaten

Darin bedeutet "Base" Nucleinsäurebasereste oder deren Derivate.

Enzymatische Wirkung: Katalytische Aktivität wenigstens für die vorstehenden Substrate bei den nachfolgend dargestellten enzymatischen Reaktionen gemäß den Formeln II, III, IV, V, VI und/oder VII, und zwar für Substrat I

für Substrat Ib

für Substrat 1c

Das neue Enzym weist folgende Parameter auf:
Km-Wert: 4,7×10^-5 (für Adenosin)
isoelektrischer Punkt: etwa pH 4,5 (Elektrophorese mit Träger-Ampholit)
Molekular-Gewicht: etwa 240 000 (Gelfiltrationsverfahren mit Sepharose CL-6B)
optimaler pH-Wert: 5-6 (gemessen durch Glycin-HCl-Puffer)
optimale Temperatur: 45-55°C
Wärmestabilität: stabil unterhalb 60°C während 10 Minuten
pH-Stabilität: sehr stabil bis zu pH 8-9.

Das neue Enzym katalysiert eine oxydierende Reaktion am Zucker-Anteil in Nucleosid als Substrat, wobei Sauerstoff verbraucht und Wasserstoffperoxid erzeugt wird; dieses Enzym wird als Nucleosid-Oxidase bezeichnet.

Die Substratspezifität, enzymatische Wirkung und das Bestimmungsverfahren werden nachfolgend erläutert.

1. Substratspezifität

Die relativen enzymatischen Aktivitäten auf verschiedene Substrate (Nucleoside, Nucleinsäurebasen, Zucker und Nucleotide, jeweils in 1 mM Konzentration) wurden gemessen, siehe Tabelle 1. Wie die Tabelle 1 zeigt, reagiert das Enzym nach der Erfindung auf einen Zuckeranteil und reagiert nicht auf eine Nucleinsäurebase und einen einzelnen Zucker. Auch reagiert das Enzym auf ein Nucleosid, das als Zuckeranteil Ribose, Desoxyribose und Arabinose aufweist. Die Reaktion ist nicht auf diese Art von Basisteilchen der Nucleoside beschränkt.

Eine Reaktion auf Nucleotide ist nicht festgestellt worden.

Das Enzym der vorliegenden Erfindung hat demnach Substrat- Spezifität wenigstens bei Nucleosiden der Formel I, Ib, Ic oder deren Derivaten.

Tabelle 1

2. Enzymatische Wirkung A. Identifizierung des Reaktionsproduktes

Eine Reaktionsmischung (100 ml), bestehend aus 0,2 M Dimethylglutarat-NaOH-Puffer (pH 6,0) 10 ml, Adenosin 500 mg, Nucleosid-Oxidase 180 U (U=Einheit der weiter unten angegebenen Definition), Catalase 15000 U und destilliertem Wasser 90 ml, wird unter Belüftung gerührt und dabei der pH-Wert auf 6 gehalten (gemäß dem Reaktionsablauf nimmt der pH-Wert ab und zeigt die Bildung saurer Substanzen). Nach 90 Minuten bei 37°C wurde der pH-Wert durch Zusetzen von HCl auf 2,0 eingestellt. Die sich niederschlagende Substanz wurde durch Zentrifugieren gesammelt und mit wässeriger HCl (pH 3) gewaschen. Das gewaschene Material wurde durch Zusatz von 1 N-NaOH gelöst und dabei der pH-Wert auf 8,5 eingestellt. Weiter HCl zugesetzt, um den pH-Wert auf 3 einzustellen, und das unlösliche Material wurde gesammelt. Die Elementaranalyse ergab:
C=42,62%, H=3,93%, N=24,9% und O=28,55%, Molekulargewicht: 281, Molekular Formel: C₁₀H₁₁N₅O₅. Das Infrarotspektrum und das UV-Spektrum waren identisch mit authentischer Adenosin-5′-Carboxylsäue.

B. Dünnschicht-Chromatogramm des Reaktionsproduktes im Verlauf der Reaktion

Ein Reaktionsgemisch, bestehend aus 0,2 M Dimethylglutarat- NaOH-Puffer (pH 6,0) 10 ml, 10 mM Adenosin 5 ml, Nucleosid-Oxidase 20 U, Catalase 1000 U und destilliertem Wasser 45 ml wurden inkubiert bei 37°C. Von dem Reaktionsgemisch wurden nach 0, 5, 10, 20 und 60 Minuten jeweils Proben entnommen. Jede Probe wurde 2 Minuten lang bei 100°C erhitzt und einer Ultrafiltration unterworfen. Für die Dünnschicht-Chromatographie wurde eine Silicagel-Platte verwendet, als Entwicker ein 7 : 3 Gemisch aus Acetonitril und 0,1% wässerigem Amoniumchlorid. Als authentische Standardvergleichsprobe dienten Adenosin, abgekürzt Ad, und Adenosin-5′-Carboxylsäure (Ad-A).

Wie Fig. 1 zeigt, wurde ein Fleck entsprechend einer Verbindung bestätigt, die an der 5′-Hydroxymethyl-Gruppe von Adenosin zur Aldehyd-Gruppe oxidiert worden war. Bei der weiteren Reaktion führte die Oxidation zur 5′-Carboxyl-Gruppe und als Endprodukt wurde Adenosin-5′-Carboxylsäure bestätigt.

C. Größe des Sauerstoff-Verbrauchs und der Wasserstoff peroxid-Erzeugung

Nucleosid-Oxidase (3U) wurde einem Reaktionsgemisch (1,0 ml) zugesetzt, bestehend aus 0,2 M Dimethylglutarat-NaOH-Puffer (pH 6,0) 0,4 ml, 0,2% N, N-Diäthyl-m-toluidin 0,1 ml, 0,3% 4-Aminoantipyrin 0,1 ml, Peroxidase (50 U/ml) 0,1 ml, 1,0 mM Adenosin 0,05 ml und destilliertem Wasser 0,25 ml. Die Menge des verbrauchten Sauerstoffes, gemessen mittels Sauerstoffelektrode, und des erzeugten Wasserstoffperoxid, colorimetrisch bestimmt bei 545 nm wurden gemessen. Es ergaben sich Adenosin 0,05 µMol, verbrauchter Sauerstoff 0,097 µMol und erzeugtes Wasserstoffperoxid 0,101 µMol. Das Ergebnis berechtigt zu der Annahme, daß 1 Mol Adenosin 2 Mole Sauerstoff verbraucht und 2 Mole Wasserstoffperoxid erzeugt.

D. Ammoniakbildung

Bei dieser Reaktion wurde keine Bildung von Ammoniak beobachtet.

Wie erwähnt, katalyisiert das erfindungsgemäße Enzym eine Reaktion, bei der Adenosin über Adenosin-5′-Aldehyd zu Adenosin-5′-Carboxylsäure umgesetzt wird, entsprechend dem nachfolgenden Reaktionsschema:

Das Enzym nach der Erfindung zeigt Substratspezifität bei verschiedenen Nukleosiden der Tabelle 1 und gemäß Formeln I, Ib und Ic. Das Enzym katalysiert zumindest auch eine Reaktion gemäß Formeln II, III, IV, V, VI und/oder VII. Das Enzym ist demnach ein neues Enzym mit bisher unbekannter enzymatischer Wirkung und Substratspezifität.

Die enzymatische Reaktion kann auch durch die folgenden allgemeinen Schemata VIII, IX und X dargestellt werden.
für Substrat I

für Substrat Ib

für Substrat 1c

Hierin ist Base eine Nucleinsäurebase oder deren Derivat.

3. Bestimmungsverfahren

Ein Reaktionsgemisch (0,5 ml), bestehend aus 0,2 M Dimethylglutarat-NaOH-Puffer (pH 6,0) 0,2 ml, 0,2 W/W% (=Gew.-%) N,N-Diäthyl-m-Toluidin 0,05 ml, 0,3 W/W% 4-Aminoantipyrin 0,05 ml, 10mM Adenosin 0,05 ml und destilliertem Wasser 0,10 ml, wurde bei 37°C 3 Minuten lang vorgebrütet. Nach Zusatz der Enzymlösung (20 µl) wurde das Gemisch bei 37°C 10 Minuten lang gebrütet und dann 0,5 ml einer 4 M Harnstoff-Lösung, die 0,2% Cetylpyridiniumchlorid enthielt, zum Stoppen der Reaktion zugesetzt. Die optische Dichte wurde in einer 1,0 cm Zelle bei 545 nm innerhalb 5 Minuten nach Zusatz von 2,0 ml destilliertem Wasser gemessen (As). Zur Kontrolle wurde die Enzymlösung durch destilliertes Wasser (20 µl) ersetzt (A_B).

Der Unterschied (As-A_B) zwischen der optischen Dichte der Enzymlösung (As) und der der Kontrolle (A_B) zeigt die Enzymaktivität. Die Enzymaktivität sollte innerhalb des Wertes von As unter 0,15 gemessen werden.

Eine Einheit (1 U) der Enzymaktivität wird bestimmt durch eine Enzymmenge, die in 1 Minute bei 37°C und Adenosin als Substrat 1 µMol Wasserstoffperoxid erzeugt, und durch die nachfolgende Gleichung dargestellt:
Enzymaktivität (U/ml) = 1,25 X (As-A_B) wobei X das Verdünnungsverhältnis ist.

Das neue Enzym nach der Erfindung hat die folgenden physicochemischen und biochemischen Eigenschaften.
Km-Wert: 4,7×10^-5M (für Adenosin)
isoelektrischer Punkt: pH 4,5 (Electrophorese mit Träger- Ampholiten)
Molekulargewicht: etwa 240 000 (Gel-Filtrationsverfahren mit Sepharose CL-6B (Handelsname))
Optimaler pH-Wert (Fig. 2): pH 5-6, gemessen durch Glycin-HCl-Puffer
In Fig. 2 kennzeichnen
○-○: Glydin-HCl-Puffer (40 nM)
⚫-⚫: Demethylglutarat-NaOH-Puffer (40 mM)
∆-∆: Phosphat-Puffer (40 mM).

Sauerstoffverbrauch: gemessen durch Sauerstoffelektrode Optimale Temperatur: 45-55°C, siehe Fig. 3. Die restliche Aktivität bei verschiedenen Temperaturen wurde durch das Bestimmungsverfahren gemessen.
Wärmestabilität: stabil bei 60°C über 10 Minuten, siehe Fig. 4.

Die Enzymaktivität wurde bestimmt nach 10 Minuten Brütung in Phosphat-Puffer (pH 6,0, 40 mM).
pH-Stabilität: pH 8-9, siehe Fig. 5
○-○: Britton-Robinson-Puffer (150 mM),
⚫-⚫: Dimethylglutarat-NaOH-Puffer (150 mM)
∆-∆: Phosphat-Puffer (150 mM).
▲-▲: Tris-HCl-Puffer (150 mM).

Nach Brütung bei 37°C über 60 Minuten wurde das Reaktionsgemisch 40fach verdünnt, und 20 µl wurden für die Bestimmung benutzt.

Tabelle 2 zeigt die Wirkung von Metallionen und anderen:

Metallionen
Relative Aktivität (%)
Kontrolle
100
Mg²⁺⁺	104
BA²⁺	100
Ca²⁺	102
Mn²⁺	110
Zn²⁺	94
Co²⁺	104
EDTA	98
PCMB	102

Die Wirkung auf oberflächenaktive Mittel zeigt Tabelle 3.

Tabelle 3

Die Bakterienart B-0781 hat die nachfolgend angegebene taxonomischen Eigenschaften.

A. Makroskopische Beobachtung bei einer Züchtung über 18-24 Stunden bei 30°C

1. Schrägagar als Nährsubstrat:
lineares Wachstum, fahles gelbgrau bis grauweiß, keine Bildung von löslichem Pigment.
2. Agarplatte als Nährsubstrat:
runde, hügelige Kolonien mit glatten Kanten, halbfluoreszierend, fahles gelblich grau bis grauweiß, keine Bildung von löslichem Pigment.
3. Flüssige Kultur:
Sediment nach vollständiger Dickung, Bildung dünner Häutchen, die jedoch einfach durch leichtes Schütteln zerstört werden.
4. Mehrschicht-Gelatin-Medium:
Wachstum entlang Einstichlinie, keine Gelatin hydrolyse.
5. BCP-Milch-Medium:
Schwachalkalisch. Keine Peptonisierung
6. Anaerobe Züchtung:
Keine Wachstum.

B. Mikroskopische Beobachtung

Gerade oder geringfügig gebogene Stäbe und Kokken. Einzelne oder Doppel-Paare oder kurze Ketten. Beweglich durch polare Flagellen 0,5×0,1-1,5 µ. Keine Sporenbildung. Kein Polymorphismus.

C. Physiologische und biochemische Eigenschaften

Die taxonomischen Eigenschaften der Art B-0781 wurden mit Angaben aus Bergey′s Mannual of Determinative Bacteriology, 8th Ed., 1974, und aus Identification of Medical Bacteriology, 1974, verglichen.

Der Stamm B-0781 wurde als zur Gattung Pseudomonas gehörend bestimmt, da er Gram-negativ ist, positive Catalase und Oxidase-Bildung und oxidierende Zersetzung von Glucose zeigt, durch polare Kokken-Flagellen beweglich ist und auf Schrägagar bei pH gleich 7,0 gutes Wachstum zeigt. Weitere ausführliche Vergleiche zeigen, daß der Stamm B-0781 mit Pseudomonas Putida identisch ist.

Entsprechend den vorstehenden taxonomischen Daten wird der Stamm B-0781 hier mit Pseudomonas Putida B-0781 bezeichnet. Es ist unter FERM-P Nr. 5664 in der ständigen Kultursammlung des Fermentation Institute, Agency of Industrial Technology and Science, M.I.T.I., Japan, niedergelegt worden.

Die vorstehenden Angaben zeigen, daß Nucleosid-Oxidase zumindest eine Substratspezifität für Nucleoside der Formeln I, Ib und Ic hat und Reaktionen insbesondere gemäß II und III katalysiert. Weitere Reaktionsbeispiele zeigen IV-X.

Zur Erzeugung von Nucleosid-Oxidase werden Mikroorganismen, die zur Gruppe Pseudomonas gehören und Nucleosid-Oxidase produzieren, in einem Nährmedium gezüchtet und aus den gezüchteten Zellen Nukleosid-Oxidase isoliert.

Die Erfindung ermöglicht ein Bestimmungsverfahren für Nucleoside in einer Probe, in dem der verbrauchte Sauerstoff und das erzeugte Wasserstoffperoxid gemessen werden.

Nucleosid-Oxidase ist ein Enzym, das zumindest Substratspezifität und enzymatische Wirkung, wie vorstehend erläutert, aufweist, wobei sich keine Ein schränkungen für das Enzym ergeben sollen, soweit gerinfügige Unterschiede z. B. im Molekulargewicht, Km-Wert, Wirkung auf Metallionen und oberflächenaktive Mittel beobachtet worden sind.

Wie erwähnt, kann Nucleosid-5′-Carboxylat dadurch gebildet werden, daß Nucleosid-Oxidase nach der Erfindung auf Nucleoside unter aeroben Bedingungen in einem wässerigen Medium einwirkt.

Da das erfindungsgemäße Enzym auf die 5′-Hydroxymethyl-Gruppe des Nucleosids in der Probe auf der Basis der enzymatischen Wirkung und der Substratspezifität einwirkt, kann die Bestimmung des Nucleosids oder der enzymatischen Aktivität in Nucleosid-Systemen so erfolgen, daß die Menge des verbrauchten Sauerstoffes oder des erzeugten Wasserstoffperoxids gemessen wird.

Wie erwähnt, können für die Erfindung Mikroorganismen benutzt werden, die zur Gattung Pseudomonas gehören und Nucleosid-Oxidase erzeugen. Eine grundsätzliche Beschränkung auf die Gattung Pseudomonas besteht aber nicht, da natürliche und künstliche Mutanten dieser Mikroorganismen benutzt werden können. So können genetische Änderungsverfahren eingesetzt werden, um die Fähigkeit der Erzeugung von Nucleosid-Oxidase zu übertragen, wie eine Übertragung der entsprechenden Gene von dem benutztem Stamm auf andere Zellen. Durch diese Verfahren erzeugte Nucleosid-Oxidase liegt ebenfalls im Rahmen der Erfindung.

Im allgemeinen werden Mikroorganismen, die zur Gattung Pseudomonas gehören und Nucleosid-Oxidase erzeugen, in einem üblichen Nährmedium für die Enzym-Produktion gezüchtet. Hierfür sind flüssige oder feste Kulturen möglich. Für die industrielle Produktion ist eine Züchtung unter Flüssigkeitsabdeckung und mit Belüftung vorteilhaft.

Übliche Nährmedien können benutzt werden. Als Quelle für assimilierbaren Stickstoff sind verwendbar Mais- Keimungsflüssigkeit, Fleischextrakt, Sojabohnenmehl, Kasein, Peptone, Hefeextrakt, Ammoniumsulfat oder Ammoniumchlorid. Als Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff sind höhere Fettsäuren, Melasse, Glucose oder Stärkehydrolysate verwendbar. Falls erforderlich können anorganische Salze, wie NaCl, KCl, Magnesiumsulfat, Kaliumhydrogenphosphat oder Kaliumhydrogenphosphat dem Medium zugesetzt werden. Die Produktion von Nucleosid-Oxidase kann dadurch verbessert werden, daß 0,5-1% einer höheren Fettsäure, wie Oleinsäure oder Palmitinsäure zugesetzt wird.

Die Züchtungstemperatur kann in Abhängigkeit von dem Wachstum der Mikroorganismen geändert werden und liegt vorzugsweise bei etwa 25-35°C. Die Züchtungszeit kann entsprechend den Voraussetzungen gewählt werden, und liegt vorzugsweise bei 15-50 Stunden. Die Kultur kann beendet werden, wenn die höchste Produktivität an Nucleosid-Oxidase in dem Medium vorüber ist.

Nucleosid-Oxidase wird in den Zellen von Mikrooganismen angesammelt.

Zur Extraktion des Enzyms aus den Zellen werden die gezüchteten Zellen gesammelt und die dabei erhaltenen nassen Zellen werden in einem Phosphat-Puffer oder Tris-HCl-Puffer suspendiert. Die Weiterbehandlung erfolgt mit üblichen Zell-Zersetzungsverfahren, wie z. B. Lysozymbehandlung, Beschallung und Filterpressenbehandlung (French press treatment), wodurch ein roher Saft erhalten wird.

Die rohe Enzymlösung kann durch übliche Reinigungsverfahren für Protein gereinigt werden. Z. B. wird eine das Enzym enthaltende Flüssigkeit einer Aceton-, Methanol-, Äthanol- oder Isopropanol-Sedimentation oder einer Aussalzung durch z. B. Ammoniumsulfat, NaCl oder Aluminiumsulfat unterworfen, um das Enzym zu sedimentieren und zu sammeln. Das derart erhaltene Pulver wird gereinigt, bis es elektrophoretisch ein einzelnes Band zeigt. Z. B. wird das sedimentierte Enzym in einem Phosphat-Puffer suspendiert und chromatographiert, indem ein Ionenaustauscher, wie Diäthylaminoäthyldextran-Gel, Diäthylaminoäthyl-Cellulose und Triäthylaminoäthyldextran-Gel und Gel-Filtration mit Dextran-Gel oder Polyacrylamid benutzt wird. Das gereinigte Pulver des Enzyms kann durch Gefriertrocknung erhalten werden.

Nucleosid-5′-Carboxylsäure kann hergestellt werden, indem Nucleoside mit Nucleosid-Oxidase in roher oder gereinigter Form zur Reaktion gebracht werden. Das Enzym kann in Form einer Lösung oder in nicht beweglicher Form eingesetzt werden. Beispiele für Nucleoside sind Nucleoside oder deren Derivate, die eine 5′-Hydroxymethyl-Gruppe aufweisen, wie Adenosin, Guanosin, Thymidin, Inosin, Xanthosin, Uridin, Arabinosylcytosin, Arabinosyladenin, 2′-Desoxyadenosin oder 2′-Desoxyguanosin.

Ein für die Reaktion geeignetes wässeriges Medium hat einen stabilen pH-Bereich für Nucleosid-Oxidase; Beispiele für wässerige Medien mit pH 6-9 sind Dimethylglutarat- NaOH-Puffer, Phosphat-Puffer oder Tris-HCl- Puffer.

Aerobe Bedingungen können hergestellt werden durch in einem wässerigen Medium gelösten Sauerstoff oder Vorbelüftung des Mediums mit Luft oder Sauerstoff. Da für Nucleoside mit einer 5′-Hydroxymethyl-Gruppe pro Mol je 2 Mole Sauerstoff benötigt werden, bedeuten aerobe Bedingungen zumindest einen Überschuß über die benötigten 2 Mole Sauerstoff.

Für das Enzym wird als Brütungstemperatur eine stabile Temperatur benötigt, vorzugsweise im Bereich von etwa Raumtemperatur.

Die Menge und Konzentration der Nucleosid-Oxidase oder der Nucleoside mit 5′-Hydroxymethyl-Gruppe sind nicht beschränkt. Die Brütungszeit hängt von der Menge und Konzentration des Enzyms oder der Substrate und anderen Reaktionsbedingungen ab und beträgt vorzugsweise mehr als 20 Minuten. Die Reaktion wird beendet, indem die restlichen Substrate oder die erzeugte Nucleosid- 5′-Carboxylsäure in einer Probe durch Dünnschicht- Chromatographie überprüft werden.

Bei der Reaktion bildet sich Wasserstoffperoxid, und vorzugsweise wird vorhergehend Catalase dem Reaktionsmedium zugesetzt, um das Wasserstoffperoxid durch Umwandlung in Wasserstoff- und Sauerstoffmoleküle zu entfernen.

Die erzeugte Nucleosid-5′-Carboxylsäure kann aus dem Reaktionsgemisch isoliert werden, indem wässerige Chlorwasserstoff- oder Schwefelsäure zugesetzt und der pH-Wert auf 2-3 gestellt wird, um die Nucleosid-5′- Carboxylsäure auszufällen. Zur weiteren Reinigung kann die Adsorbtionschromatographie an Ionenaustauscher oder eine Umkristallisierung angewendet werden.

Durch diese Verfahren kann Nucleosid-5′-Carboxylsäure von verschiedenen Nucleosiden hergestellt werden, die eine 5′-Hydroxymethyl-Gruppe aufweisen.

Die Anwendung von Nucleosid-Oxidase nach der Erfindung auf der Grundlage ihrer Substrat-Spezifität und Enzymwirkung für ein neues Bestimmungsverfahren und als Reagenz zur Bestimmung von Nucleosiden wird nachfolgend erläutert.

Die Nucleosidbestimmung erfolgt aufgrund des Verbrauchs von Sauerstoff und der Erzeugung von Wasserstoffperoxid und Nucleosid-5′- Carboxylsäure bei Einwirkung auf das Nucleosid unter Verwendung von Nucleosid-Oxidase als Reagenz.

Vorteilhaft wird bei dem Verfahren gemäß Erfindung zur Messung der erzeugten Wasserstoffperoxidmenge eingesetzt.

Zur Messung der erzeugten Wasserstoffperoxidmenge enthält das Reagenz eine Komponente, die mit Wasserstoffperoxid reagiert und es in eine nachweisbare Substanz umwandelt.

Vorzugsweise kommt ein Peroxidase enthaltendes Chromogen bei dem erfindungsgemäßen Bestimmungsverfahren zur Anwendung.

Die zu analysierenden Proben enthalten zumindest ein Nucleosid mit einer 5′-Hydroxymethyl-Gruppe der Formel

Hierin sind R₁, R₂ und R₃ Wasserstoff oder Hydroxy- Gruppen, und "Base" hat dieselbe Bedeutung wie weiter oben.

Beispiele für Proben sind: Reagenzprobe enthaltend die vorerwähnten Nucleoside; Probe zur Bestimmung der Aktivität von Ribonuclease oder Desoxyribonuclease, in der RNA, DNA oder deren Oligonucleatid hydrolysiert wird durch entsprechende Hydrolasen, wie Ribonuclease oder Desoxyribonuclease, um Nucleotid zu bilden, das mit Nucleotidase oder Alkalin-Phosphatase behandelt wird, um Nucleosid zu erzeugen, oder zur Bestimmung der Substrat-RNA oder -DNA; Probe zur Bestimmung der Aktivität von Nucleotidase, wobei Nucleotid, wie AMP, durch Nucleotidase hydrolysiert wird, um Nucleosid freizusetzen, oder zur Bestimmung von deren Substrat AMP; Probe zur Bestimmung der Aktivität von Enzym, das Nucleosid freisetzt, z. B. Adenosin-Bildung durch S-Adenosyl- L-Homocystein Hydrolase oder Guanosin- oder Desoxyguanosin-Bildung durch Guanosin-Phosphorylase, oder zur Bestimmung von deren Substrat; Probe zur Bestimmung der Aktivität von Enzymen, die Nucleosid als Substrat zersetzen, z. B. Hydrolyse von Nucleosid durch Nucleosidase, Hydrolyse von Inosin durch Inosinase, Hydrolyse von Uridin durch Urdidinnucleosidase, Zersetzung von Uridin durch Uridinphosphorylase, oder Zersetzung von Thymidin durch Thymidinphosphorylase; Probe zur Bestimmung von Enzym, das eine 5′-Hydroxy-Gruppe von Nucleosid als Substrat phosphoryliert, z. B. Phosphorylierung der 5′-Hydroxy-Gruppe von Adenosin durch Adenosinkinase, von Uridin durch Uridinkinase oder von Thymidin durch Thymidinkinase; und Probe zur quantitativen Bestimmung von Purin-Nucleosid in einem Reaktionssystem von Nucleosid-Phosphorylase oder der enzymatischen Aktivität von Purin-Nucleosid- Phosphorylase.

Die Brütungstemperatur für diese Proben und Nucleosid-Oxidase liegt allgemein bei 37°C, und die Brütungszeit ist nicht begrenzt. Die Reaktion verläuft gemäß den Reaktionsschemata II, III, IV, V, VI und/oder VII oder VIII, IX und/oder X, wie eben dargestellt, und zur Bestimmung wird die Menge des verbrauchten Sauerstoffs oder des erzeugten Wasserstoffperoxids gemessen. Sauerstoff wird vorzugsweise durch eine Sauerstoffelektrode gemessen, und Wasserstoffperoxid wird durch elektrische Mittel, wie eine Wasserstoffperoxid-Elektrode, oder chemische Mittel bestimmt, z. B. durch Benutzung üblicher bekannter Reagenzien durch quantitativen Bestimmung von Wasserstoffperoxid, z. B. eine Kombination von Phenol, 4-Aminoantipyrin und Peroxidase, eine Kombination von Phenol, 4-Amino- Phenazol und Peroxidase, oder eine Kombination von N,N′-Diäthyl-m-Toluidin, 4-Aminoantipyrin und Peroxidase.

Die Menge von Nucleosid in der Probe kann dabei bestimmt werden gemäß dem Phänomen des Verbrauchs von 2 Molen Sauerstoff und der Bildmenge von 2 Molen Wasserstoffperoxid von 1 Mol Nucleosid.

Eine Ausführungsform zur Bestimmung von Nucleosid in einer Probe besteht darin, daß die aliquote Probe, die in einem Puffer gelöst ist, einer Lösung von Nucleosid-Oxidase 1-20 U zugesetzt, bei 37°C gebrütet und der verbrauchte Sauerstoff durch Sauerstoffelektrode gemessen oder das erzeugte Wasserstoffperoxid durch Wasserstoffperoxidelektrode bestimmt wird. Auch kann das erzeugte Wasserstoffperoxid bestimmt werden durch Zusatz von N,N-Diäthyl-m-Toluidin, 4-Aminoantipyrin und Peroxidase, und die Mischung wird bei 37°C gebrütet und es wird dann bei 545 nm colorimetrisch gemessen. Eine weitere Möglichkeit der Bestimmung der enzymatischen Aktivität besteht darin, daß nach einer über eine entsprechende Zeit andauernden enzymatischen Reaktion das verbrauchte oder erzeugte Nucleosid durch die weiter oben erläuterten Verfahren bestimmt wird. Adenosin-Kinase kann bestimmt werden durch Messung der Menge des verbrauchten Adenosins nach Brütung des Gemisches von Adenosin-Kinase, ATP und Adenosin. Nucleotidase kann bestimmt werden durch Messungen der Menge des verbrauchten Sauerstoffes oder des erzeugten Wasserstoffperoxides in der Reaktion mit Nucleosid-Oxidase und Adenosin, das durch enzymatische Wirkung auf eine Substanz-ATP gebildet wird. Für die Bestimmung des RNA-Gehaltes oder der Ribonuclease-Aktivität in einer Probe wird RNA mit Ribonuclease zur Reaktion gebracht, um Nucleotid zu bilden, das zu Nucleosid umgewandelt wird durch die Wirkung von Nucleotidase oder Alkalinphosphatase, worauf das, derart erhaltene Nucleosid quantitativ durch Nucleosid-Oxidase gemessen wird, so daß damit der RNA-Gehalt oder die Ribonuclease-Aktivität bestimmt ist.

Wie bereits betont, kann das neue Enzym Nucleosid-Oxidase vorteilhaft für die quantitative Analyse verschiedener Nucleoside, für die Bestimmung der enzymatischen Aktivität mit bezug auf Nucleosid als Substrat sowie für Bestimmungen der enzymatischen Aktivität verwendet werden, bei der ein Nucleosid oder dessen Substrat gebildet wird.

Beispiele hierfür werden nachfolgend gegeben.

Beispiel 1

Ein Medium (100 ml, pH 7,0) enthaltend Pepton 1,0 w/w%, Kasein 1,0 w/w%, Oleinsäure 1,0 w/w%, Hefeextrakt-Pulver 0,5 w/w%, KCl 0,2 w/w%, K₂HPO₄ 0,1 w/w%, MgSO₄ · 7H₂O 0,05 w/w% und 20 Minuten lang bei 120°C in einem Erlenmeyer-Kolben sterilisiert, wurde mit Pseudomonas putida B-0781, FERM-P Nr. 5664 geimpft und ein Tag lang bei 30°C gezüchtet. Mit dieser Saatkultur wurde das gleiche Medium, wie vorstehend erwähnt, beimpft (20 l mit 0,1% Zusatz von Desfoam BC-51Y (Handelsname) in einem 30-l-Fermentationsgefäß) und mit sterilisierter Belüftung bei 30°C 42 Stunden lang und mit 350 Upm bebrütet, wobei die Belüftung 20 l/min betrug.

Die gezüchteten Zellen wurden gesammelt, indem 10 Minuten lang bei 5000 Upm zentrifugiert wurde. Die gesammelten Zellen wurden mit Wasser (7 l) gewaschen und im selben Verfahren, wie eben erwähnt, gesammelt. Die Zellen, die dann in einem 10 mM EDTA enthaltenden 20 mM Phosphat-Puffer (pH 7,0, 5 l) suspendiert wurden, wurden mit Lysozym (schließliche Lysozym-Konzentration 0,5 mg/ml versetzt, und es wurde 5 Stunden lang bei 37°C umgerührt, um die Zellen zu zerstören. Die überschießende Flüssigkeit (4,2 l, 2,86 U/ml) wurde durch Zentrifugieren bei 5000 Upm für 10 Minuten erhalten. Der überschießenden Flüssigkeit wurde kaltes Azeton (-20°C, 2,5 l) zugesetzt und zur Sedimentation 10 Minuten lang bei 5000 Upm zentrifugiert, um die Überschußflüssigkeit (11150 U) zu erhalten. Dieser Überschußflüssigkeit wurde weiteres kaltes Azeton, (2,5 l) zugesetzt, 10 Minuten bei 5000 Upm zentrifugiert und dadurch das sedimentierte Material erhalten. Der Niederschlag wurde in 20 mM Phosphat-Puffer (pH 7,0, 1,0 l) gelöst und es wurde 15 Minuten lang bei 5000 Upm zur Abtrennung unlöslicher Teile zentrifugiert. Die überschießende Flüssigkeit (9700 U) wurde bei 50°C 20 Minuten lang behandelt, und das durch die Wärme denaturierte Protein wurde durch Sedimentation abgetrennt, die bei 5000 Upm über 10 Minuten eintrat, so daß Flüssigkeit mit 9400 U erhalten wurde. Der überschießenden Lösung wurde Ammoniumsulfat (319 g) bis zur 0,42 Sättigung zugesetzt und bei 15 000 Upm über 10 Minuten sedimentiert, um den Niederschlag abzutrennen, danach 140 g Ammoniumsulfat zugefügt, um den Niederschlag zu erhalten. Der Niederschlag, der in 20 mM Phosphat-Puffer (pH 7,5, 50 ml) gelöst wurde, wurde bei 15 000 Upm 10 Minuten lang zur Abtrennung von unlöslichen Teilchen zentrifugiert. Die überschießende Lösung (7800 U) wurde in einer Zellophanröhre gegen 20 mM Phosphat-Puffer über Nacht dialysiert. Die Dialyse-Lösung wurde in eine Kolonne (2,6×60 cm) aus DEAE-Zellulose (Ergebnis der Firma Selver Co.) eingefüllt, mit 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) ins Gleichgewicht gebracht und mit einem linearen Gradienten von 0-0,5 M KCl in 20 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) eluiert; die eluierte Fraktion wurde bei 0,15-0,25 M KCl-Konzentration (5760 U) gesammelt und mittels Amicon PM-10-Membran (Handelsname) konzentriert. Dieses Konzentrat wurde in eine Kolonne (2,6×90 cm) aus Sephacryl S-2000 (Handelsname der Pharmacia Co.) gefüllt. Aktive Fraktionen mit Enzymaktivität, überprüft auf Absorbtion bei 280 nm, wurden gesammelt und gefriergetrocknet und damit gereinigtes Nucleosid-Oxidase-Pulver (51,0 mg, 3675 U) erhalten.

Beispiel 2

Ein Gemisch aus Adenosin (500 mg), Nucleosid-Oxidase (180 U), Catalase (15 000 U) und destilliertem Wasser (90 ml) wird 0,2 M Dimethylglutarat-NaOH-Puffer (pH 6,0, 10 ml) zugesetzt und mit Umrühren bei 150 Upm 90 Minuten lang bebrütet bei 37°C und einer Belüftung von 20 ml/min (pH wurde so eingestellt, daß der pH-Wert der Inkubationsmischung reguliert wurde). Nach der Inkubation wurde pH auf den Wert 2,0 durch Zusatz von 0,1 N HCl eingestellt, um das Material zu sedimentieren. Der Niederschlag wurde gesammelt durch Zentrifugation (15 000 Upm, 10 Minuten), gewaschen mit wässeriger HCl (pH 3), gelöst in 1 N NaOH und erneut ausgefällt durch Einstellung auf pH 3 mittels Zusatz von HCl, worauf die sich ergebenden Kristalle (465 mg) gesammelt wurden. Das Produkt wurde identifiziert als autentische Adenosin- 5′-Carboxylsäure mittels Elementaranalyse, Molekulargewichtsbestimmung, IR- und UV-Spektrum und Dünnschicht- Chromatographie.

Beispiel 3

Im Beispiel 2 wurde Adnosin ersetzt durch Guanosin, Thymidin, Cytidin, Inosin, Xanthosin, Uridin, Arabinosylcytosin, Arabinocyladenin, 2′-Desoxyadenosin und 2′-Desoxyguanosin (jeweils 300 mg), so daß die nachfolgenden 5′-Carboxylsäuren erhalten wurden.

Substrat
Produkt
Guanosin
Guanosin-5′-Carboxylsäure (268 mg)
Thymidin	Thymidin-5′-Carboxylsäure (245 mg)
Inosin	Inosin-5′-Carboxylsäure (254 mg)
Xanthosin	Xanthosin-5′-Carboxylsäure (265 mg)
Uridin	Uridin-5′-Carboxylsäure (258 mg)
Arabinosylcytosin	Arabinosylcytosin-5′-Carboxylsäure (220 mg)
Arabinosyladenin	Arabinosyladenin-5′-Carboxylsäure (267 mg)
2′-Desoxyadenosin	2′-Desoxyadenosin-5′-Carboxylsäure (270 mg)
2′-Desoxyguanosin	2′-Desoxyguanosin-5′-Carboxylsäure (266 mg)

Beispiel 4

Ein Gemisch (0,95 ml), bestehend aus den folgenden Komponenten, wurde bei 37°C vorgebrütet:

0,2 M Dimethylglutarat-NaOH-Puffer (pH 6,0)\|0,4 ml
0,2 w/w% N,N-Diäthyl-m-Toluidin	0,1 ml
0,3 w/w% 4-Aminoantipyrin	0,1 ml
Peroxidase (50 U/ml)	0,1 ml
Nucleosid-Oxidase	10 U
destilliertes Wasser	0,25 ml
Gesamt	0,95 ml

Diese Lösung wurde mit Adenosinlösung (0,05 ml) in verschiedenen Konzentrationen und destilliertem Wasser (2,0 ml) versetzt und bei 545 nm kolorimetrisch gemessen. Wie Fig. 6 zeigt, wurde der Adenosin-Gehalt einfach und mit guter Genauigkeit analysiert.

Beispiel 5

Eine Mischung (0,95 ml) der gleichen Zusammensetzung wie in Beispiel 4 wurde bei 37°C vorgebrütet. Adenosin-Probe-Lösung (0,05 ml) in verschiedenen Konzentrationen wurde zugefügt, bei 37°C 20 Minuten lang gebrütet, und der verbrauchte Sauerstoff mittels Sauerstoffelektrode (Produkt der Firma Ishikawa Manufacturing Co.) gemessen. Wie Fig. 7 zeigt, ergab sich eine gute Genauigkeit für die quantitative Analyse auf Adenosin.

Beispiele 6-12

Die Adenosinlösung im Beispiel 4 wurde ersetzt durch verschiedene Konzentrationen von Guanosin, Thymidin, Inosin, Uridin, 2′-Desoxyadenosin, Arabinosyladenin oder Bredinin (4-Carbamoyl-1-β-Ribofuranosyl-Imidazolium-5-Olat), und die Reaktionsbedingungen waren die selben wie die der Beispiele 4 und 5. Die Ergebnisse sind dargestellt in Fig. 8 für Guanosin, Fig. 9 für Thymidin, Fig. 10 für Inosin, Fig. 11 für Uridin, Fig. 12 für 2′-Desoxyadenosin, Fig. 13 für Arabinosyladenin und Fig. 14 für Bredinin (mit Sauerstoffelektrode- Verfahren) mit guter Genauigkeit.

Beispiel 13
0,2 M Dimethylglutarat-NaOH-Puffer (pH 6,0)\|0,4 ml
0,2 w/w% N,N-Diäthyl-m-Toluidin	0,1 ml
0,3 w/w% 4-Aminoantipyrin	0,1 ml
Peroxidase (50 U/ml)	0,1 ml
Nucleosid-Oxidase	5 U
destilliertes Wasser	0,25 ml
Gesamt	0,95 ml

Ein dem vorstehend entsprechendes Gemisch wurde zubereitet. Adenosin-Kinase-Lösung (0,1 ml), hergestellt nach dem Verfahren gemäß J. Biol. Chem. 193, 481-495 (1951), wurde zugesetzt zu 0,2 M Dimethylglutarat-NaOH-Puffer (pH 6,0), enthaltend ATP 5 mM, Adenosin 5 mM und MgCl₂ 10 mM (0,4 ml), und bei 37°C inkubiert. Bei 0,5 und 10 Minuten wurde eine Reaktionsprobe (0,02 ml) genommen, auf 70°C erwärmt und dem vorstehend angegebenen Reaktionsgemisch zugesetzt, das bei 37°C 20 Minuten lang gebrütet wurde, worauf kolorimetrisch bei 545 nm gemessen wurde. Das Ergebnis ist in Fig. 15 dargestellt.

Beispiel 14
0,2 M Dimethylglutarat-NaOH-Puffer (pH 6,0)\|0,4 ml
0,2 w/w% N,N-Diäthyl-m-Toluidin	0,1 ml
0,3 w/w% 4-Aminoantipyrin	0,1 ml
Peroxidase (50 U/ml)	0,1 ml
20 mM AMP	0,05 ml
Nucleosid-Oxidase	10 U
destilliertes Wasser	0,2 ml
Gesamt	0,95 ml

Das Reaktionsgemisch (0,95 ml) der vorstehend angegebenen Zusammensetzung wurde bei 37°C vorgebrütet. Nucleotidase- Lösung (Erzeugnis der Firma Sigma Co.) (0,05 ml) wurde zugesetzt, bei 37°C 20 Minuten lang gebrütet und kolorimetrisch bei 545 nm gemessen.

Das Ergebnis ist in Fig. 16 dargestellt. Nucleotidase wurde mit guter Genauigkeit quantitativ analysiert.

Beispiel 15

Eine Reaktionsmischung (0,95 ml) enthaltend RNA und Nucleotidase, wurde mit Ribonuclease-Lösung (0,05 ml) bei 37°C 30 Minuten lang gebrütet. 0,05 ml davon wurden auf 80°C erwärmt und dem gleichen Reaktionsgemisch (0,95 ml) wie in Beispiel 4 zugesetzt. Die Reaktionsmischung wurde bei 37°C 20 Minuten lang gebrütet, und es wurde bei 545 nm kolorimetrisch gemessen.

Das Ergebnis ist in Fig. 17 dargestellt. Mit guter Genauigkeit wurde Ribonuclease analysiert.

Claims

1. Verfahren zur Nucleosidbestimmung aufgrund des Verbrauches von Sauerstoff und der Erzeugung von Wasserstoffperoxid und Nucleosid-5′-Carboxylsäure bei Einwirkung auf das Nucleosid unter Verwendung von Nucleosid-Oxidase als Reagenz.

2. Verfahren nach Anspruch 1, bei dem ein Reagenz zur Messung der erzeugten Wasserstoffperoxidmenge eingesetzt wird.