DE2716335C2

DE2716335C2 - Neue Cholinoxydase und Verfahren zu ihrer Herstellung

Info

Publication number: DE2716335C2
Application number: DE2716335A
Authority: DE
Inventors: Yoshifumi Horiuchi; Shigeru Ikuta; Shigeyuki Imamura; Kazuo Matsuura; Hideo Misaki; Naoki Shizuoka Muto
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1976-04-26
Filing date: 1977-04-13
Publication date: 1985-10-17
Also published as: NL189920C; NL189920B; DE2716335A1; NL7704546A; JPS52130984A; DE2760200C2; FR2349599B1; FR2349599A1; US4135980A; GB1575249A; CA1093993A; JPS604716B2

Description

CH₃

worin Ri eine -CH₂OH- oder -CHO-Gruppe bedeutet, 15 (2) optimaler pH-Wert: pH 8 (Tris-HCl-Puffer),

(3) isoelektrischer Punkt: 4,6 (Elektrophorese unter Verwendung eines Ampholyten der lrager-Artj,

(4) Molekulargewicht: 84 000 ± 2100 (Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-150),

(5) Enzymwirkung: katalysiert die Reaktion (I) und (Π)

20 CHj CH₃

CH₃-N⁺-CH₂CH₂-OH + O₂ ► CH₃-N⁺-CH₂CHO + H₂O₂ 0)

CH₃ CH₃

CH₃-N⁺-CH₂CHO + H₂O + O₂ > CH₃-N⁺-CH₂COOH + H₂O₂ OD

(6) die optimale Tempsratur beträgt 40⁰C (Tris-HCl-Puffer),

(7) der stabile pH-Wert liegi bei pH 8 (Tris-HCl· Puffer) und 35 (8) die Wärmestabilität beträgt 40⁰C (Tris-HCl-Puffer).

2 Verfahren zur Herstellung der Cholinoxidase des Anspruchs 1, dadurch gekennzeichnet, daß man Arthrobacter globiformis FERM BP-360 kultiviert, die kultivierte Masse filtriert, die nassen Zellen in einem Puffer suspendiert, anschließend mit Lysozym behandelt und die so erhaltene rohe Cholinoxydase 40 durch für Protein und Enzym bekannte Isolier- und Reinigungsverfahren reinigt.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Kulturmedium einsetzt, dem 0,5 bis 1% Cholin zugegeben worden ist.

4' Die Erfindung betrifft eine neue Enzymcholinoxidase und ein Verfahren zu ihrer Herstellung (vgl. die

|i Ansprüche 1 und 2). Der Anspruch 3 nennt eine Ausgestaltung des Verfahrens nach Anspruch 2.

β Cholindehydrogenase [EC. 1.1.99.1. Cholin: (Akzeptor) Oxidoreduktase] und Betainaldehyddehydrogenase

*'^v 50 [EC. 1.2.1.8. Betainaldehyd: NAD Oxidoreduktase] sind bekannte Enzyme, die auf Cholin oder Cholin-

U aldehyd als Substrat einwirken. Es ist weiterhin bekannt, daß diese Enzyme für ihre enzymatischen Wirkungen

P< Coenzyme erfordern [Methods in Enzymology V, 562-570, (1962): ibid 1,674-678 (1955), Academic Press.],

M und daher werden sie als Dehydrogenase klassifiziert. Die Betainaldehyddehydrogenase wurde aus einem

P Stamm von Pseudomonas aeruginosa A-16 isoliert und gereinigt. Sie besitzt ein Molekulargewicht von etwa

I? 55 145 000 (durch Gelfiltration bestimmt); einen isoelektrischen Punkt von 5,1; einen optimalen pH-Wert von 8,0

£'.·■ bis 9,0; und einen stabilen pH-Wert von etwa 7,5.

-" Es wurde gefunden, daß ein Enzym, daß die Oxydationsreaktion von Cholin zu Betain katalysiert, von dem

'■'·■: Bakterienstamm B-0577, der zum Genus Arthrobacter gehört und aus Boden, der in Kagoshima, Japan, gesammelt wurde, gebildet wird. Dieses Enzym wurde gereinigt, und es wurde festgestellt, daß es ein einziges

i.--i 60 Enzym ist.

KS Dieses Enzym besitzt die folgenden physikalisch-chemischen Eigenschaften: einen isoelektrischen Punkt

1 von 4,6 (Elektrophorese mit einem Träger-Ampholyten); Molekulargewicht etwa 84 000 ± 2100 (Gelfiltration

|/ an Sephadex G-150). Das Enzym besitzt eine Substratspezifität für Cholin und Betainaldehyd, es erfordert kein

te Coenzym, und die Substrate reagieren direkt mit Sauerstoff bei der enzymatischen Reaktion.

I 65 Dieses neue Enzym, Cholinoxydase, katalysiert die Umsetzung, bei der 1 Mol Cholin zu Betain über den

fr, Betainaldehyd unter Bildung von 2 Mol Wasserstoffperoxid oxydiert wird oder bei der 1 Mol Betainaldehyd

P zu Betain unter Bildung von 1 Mol Wasserstoffperoxid oxydiert wird.

^; Der Stamm B-0577 besitzt die folgenden taxonomischen Eigenschaften.

A. Makroskopische Beobachtung auf verschiedenen Medien, kultiviert bei 26°C während 18 bis 42 Stunden

(1) Bouillonagarplatte:

Wachstum: gut, kreisförmig, glatt an der Peripherie, Änderungen zu glänzend konvex Farbe der Kolonie: gräulich-weiß (Farbton IV₂ ca) bis schwachgelb (Farbton IV₂ ga), kein diffundierbares Pigment;

(2) Bouillon&jarschrägkultur:

Wachstum: gut, fibröses Wachstum, glänzend ^I0

Farbe der Kolonie, gräulich-weiß (Farbton IV₂ ca) bis schwachgelb (Farbton IV₂ ga), kein diffundierbares Pigment;

(3) Bouillonbrühe: 15

keine oder sehr dünne Häutchenbildung auf dem Oberflächenwachstum; kultivierte Brühe trübe und Niederschlagsbildung, nicht transparent;

(4) Bouillongelatinestichkultur:

Wachstum: gut, Wachstum auf der Oberfläche, keine Gelätineverflüssigung;

(5) Lackmusmilch:

Wachstum: schwach, Peptonisierung bei etwa 2 Wochen, manchmal weiche Koagulatbildung oder Alkalischwerden; keine Lackmusreduktion.

Die Farbbestimmung erfolgte entsprechend »Color Harmony Manual« (Container Corporation of America, 1958).

B. Mikroskopische Beobachtungen

(1) Form und Größe der Zellen auf Bouillonagarplatten (6 Stunden Kultivierung: Stäbchen 0_T5 bis 0,8 x 1,5 bis 2,0 μΐη; 18 Stunden Kultivierung: Kügelchen, 0,5 bis 0,8 μΐη;

(2) Polymorphismus: in Bouillonbrühenkultur, manchmal T-formige oder Y-förmige Zellen; 35

(3) Motiütät: keine (auf weichem Agar);

(4) Sporen: keine;

(5) Gram-Anfärbung: junge Zellen: positiv; alte Zellen: negativ;

(6) Säure-Schnellanfarbung: negativ.

C. Physiologische Eigenschaften

Nitratreduktion: negativ

Denitrifikatiorisreaktion: negat'v

MR-Test: negativ

VP-Test: negativ

Indolbildung: negativ

SchwefelwasserstoiTbildung bzw. Hydrogensulfatbildung: schwach positiv Stärkehydrolyse: schwach positiv

Citrat«erwendung: Koser-Medium: negativ; Christensen-Medium: positiv Nitratverwendung: negativ

Ammoniumverwendung: negativ

Pigmentbildung: negativ

Urease: positiv

Oxydase: schwach positiv

Catalase: positiv

Wachstums-pH: 4,0 bis 11,0

Wachstumstemperatur: 5 bis 37°C

Verhalten gegenüber Sauerstoff: aerob

Cellulosehydrolyse: negativ

Caseinhydrolyse: negativ

O-F-Test*): 0 (oxydative Zersetzung)

Säurebildung aus Zucker (keine Gasbildung)**): ₆₅

innerhalb 1 Woche: Glucose, Inosit

innerhalb 2 Wocrun: Cellobiose, Erythrit, Fructose, Maltose, Mannit, Mannose, Sorbit, Saccharose, Trehalose. Stärke

keine Säurebildung:

L·Arabinose, Dulcit, Aesculin, Galactose, Glycerin, Lactose, Melezitose, Melibiose, Salicin, Sorbose, Xylose.

·) O-F-Testmedium: modifiziertes Medium: 1 g NH₄H₂PO₄, 1 g Hefeextraktpulver, 0,2 g KCl, 0,2 g MgSO₄ · 7 HjO, 10 g

Glucose, 2 g Agarpulver, 1 1 destilliertes Wasser, pH 7,2.

··) Grundmedium: 1 g NH₄H₂PO₄, 1 g Hefeextraktpulver, 0,2 g KCl, 0,2 g MgSO₄ · 7 H₂O, 2 g Agarpulver, 1 I destilliertes Wasser, pH 7,2.

Ein Vergleich mit Bergey's Manual of Determinative Bacteriology, ed. 1974, zeigt, daß der Stamm-B-0577, der die oben erwähnten taxonomischen Eigenschaften besitzt, insbesondere gram-positiv ist, nicht säurebeständig ist und kein beweglicher Bazillus oder Coccus ist und verzweigt und nichtfaserartig ist und Zucker oxydativ zersetzt, eine positive Catalasereaktion zeigt, eine schwach positive Oxydasereaktion zeigt und CeIIobiose nicht zersetzt, zu dem Genus Arthrobacter in der Coryneform-Bakteriengruppe gehört.

Ein Vergleich des Stamms B-0577 mit den Kulturen von sieben Species, die zum Genus Arthrobacter gehören und die in dem oben erwähnten Bergey's Manual, 1974, beschrieben werden, zeigt die in der folgenden Tabelle aufgeführten Ergebnisse.

²⁰ In der Tabelle bedeuten:

+ positive Reaktion oder Säurebildung aus Zucker innerhalb einer Woche, (±) schwach positive Reaktion oder Säurebildung innerhalb von 1 bis 2 Wochen,

negative Reaktion, 25 AB Arthrobacter.

Tabelle Kulturtemperatur: 26 ⁰C

Mikroorganismus Stamm B-0577

AB simplex AB globiformis AH citreus AB tumesccns AB terregcns IFO 12069 IFO 12 137 IFO 12957 IFO 12960 IFO 12961

/VB duodecadis AB flavescens Bemerkun<?en IFO 12 959

Gram-Einfärbung Säurebeständige Verfärbung

Sporen Oxydase Catalase Urease Urease

Gelatine-

Verflüsüigung Stärkehydrolyse Caseinhydrolyse Cellulosehydrolyse

Acetoin MR-Test

Nitratreduktion Lackmusmilch Citratverwendung Citratverwendung

OF-F-Test

Farbe der Kolonie

S-R

Peptonisierung

schwache Peptonisierung

O OO

schwach gelb gräulich-weiß

0 gelb

S-R

Koagulation keine Änderung

O NT

gräulich-weiß gelb

S-R

SSR-Medium

Christensen-

Medium

2 Tage Kultur, Eazier-Verfahren

2 Tage Kultur, Jodometrie

Bleiacetat-Papierverfahren

Simmons-Medium

Christensen-Medium

s;assss«s«^:^p2r:?-^^; '■■··,

Fortsetzung

Tujt Mikroorganismus

Stamm B-0577 AB simplex AB globiformis AB citreus AB tumescens AB terregens All duodecadis AB flavescens Bemerkungen IFO 12 069 IFO 12137 IFO 12 957 IFO 12 960 IFO 12 961 IFO 12 959

Säurebilclung aus Zucker

Arabinose - - + +(+)-

Cellobiose (+) - (+) - (+)

Dulcit - - + - -

Erythrit (+)----

Aesculin - - - - -

Fructose (+) (+) + (+) (+) -

Galactose - (+) (+)

Glucose + + + (+) (+)

Glycerin - + + - -

Inosit + - (+) - (+) -

Lactose - ---(+)-

Maltose (+)----

Mannit (+)-+--

Mannose (+) - (+)

Melezitose - _ + _ _

Melibiose - - + - (+)

Raffinose - - + - (+)

Salicin - - + + -

Sorbose - -

Sorbit (+) - + (+) (+)

!stärke (+)-+--

Saccharose (+) (+) + (+) (+)

ι Trehalose (+) (+) + (+) (f)

: Xylose - - + + + -

! S-R: beobachtete slübchcnförmige, kugelförmige, T- oder Y-förmige Zellen.
NT; nicht geprüft.
Arthrobacter duodecadis IFO 12 959 und Arth. flavesceus wurden nur nach der Beschreibung in Bergey's Manuai, 1974, mitverglichen: der ersteie Stamm wächst nicht auf Nähragarmedium.

U)

Man stellt fest, daß die taxonomischen Eigenschaften des Stammes B-0577 identisch sind mit denen des Siammes Arthrobacter globiformis IFO 12 137, mit Ausnahme der Farbe der Kolonie, der Stärkezersetzung (etwas unterschiedlich) und der Säurebildung aus einigen Zuckern. Hinsichtlich der Farbe der Kolonie bildet Arthrobacter globiformis kein charakteristisches Pigment auf Nähragar, jedoch wird gelegentlich bzw. von einigen Stämmen ein mit Wasser unmischbare», zitronengelbes Figment gebildet. Beide Stämme bilden aus Stärke Säure (Stärkezersetzung); weiterhin bildet Arthrobacter globiformis IFO 12 137 aus allen Zuckern Säure, wohingegen der Stamm B-0577 Säure bildet, ausgenommen aus Erythrit. Der Stamm B-0577 wird daher als Arthrobacter globiformis eingeteilt und als Arthrobacter globiformis B-0577 bezeichnet. Dieser Stamm wurde bei der permanenten Sammlung im Institute for Microbial Industry and Technology, Agency of Industrial Science and Technology, Japan, unter der Nummer FERM-P Nr. 3518 hinterlegt. Diese Hinterlegung wurde in eine Hinterlegung nach dem »Budapester Vertrag...« umgewandelt, wobei der Stamm die Hinterlegungsnummer FERM BP-360 erhielt.

Da das neue Enyzm, Cholinoxydase, ein Enzym ist, für das Cholin und Betainaldehyd Substrate sind, kann Cholin oder Betainaldehyd in einer flüssigen Probe durch behandlung der Probe mit Cholinoxydase quantitativ bestimmt werden, indem man das freigesetzte Wasserstoffperoxid, Betain oder den verbrauchten Sauerstoff mißt.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein neues Enzym, Cholinoxydase, zu schaffen, das mindestens die folgenden Eigenschaften aufweist:

Substratspezifität: für eine Verbindung der Formel

CH₃-N⁺-CH₂-R₁

/

in der R₁ -CH₂OH oder -CHO bedeutet;

optimaler pH-Wert: 8 (Tris HCl-Puffer);

isoelcktrischer Punkt: 4,6 (Elektrophorese auf einem Amphoiyten der Träger-Art);

Molekulargewicht: 84 000 ±2100 [Gelfiltration unter Verwendung von Sephadex G-150];

Enzymwirkung: katalysiert Reaktion (I) und (II)

CH₃ \ CH₃-N	⁺ —CH₂CH₂OH	+	O₂ >	CH₃ CH₃-N ⁺	CH₃	-CH₂CHO + H₂O₂	0)	35
CH₃ ⁷				ch/	·■ CH₃
CH₃ CH₃-N				CH₃			40
CH₃	⁺—CH₂CHO +	H	₂0 + O₂	-N⁺-CH₂COOH + H₂O₂	OD
					45

Erflndungsgemäß soll weiterhin ein Verfahren zur Herstellung der neuen Enzym-Cholinoxydase geschaffen werden, bei dem ein bestimmter, diese Cholinoxydase bildender Mikroorganismus, der zum Genus Arthrobacler gehört, kultiviert wird und die cholinoxydase aus der Kulturmasse isoliert wird.

Erfindungsgemäß wird Arthrobacter globiformis B-0577 = FERM BP-360 in einem für die Antibiotika- oder Enzym-Erzeugung üblichen Medium kultiviert. Für eine industrielle Produktion ist eine submerse Belüftungskultur bevorzugt.

Bevorzugt werden an sich übliche Medien für Mikroorganismen verwendet. Als Stickstoffquellen können assimilierbare Stickstoffquellen, wie Maisquellwasser, Sojabohnenpulver, Pepton, Fleischextrakte, Hefeextrakte, Ammoniumsulfat, Ammoniumchlorid o.a., verwendet werden, Assimilierbare Kohlenwasserstoffquellen, wie Melassen, Glucose, Stärkehydrolysate o.a., können bevorzugt verwendet werden. Verschiedene anorganische Salze, wie Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Kaliumhydrogenphosphat oder Kaliumdihydrogenphosphat, und Antischaummittel können gegebenenfalls verwendet werden. Die Zugabe von Cholin zu dem Medium aktiviert die Erzeugung von Cholinoxydase. Durch die Zugabe von 0,5 bis 1% Cholin kann eine um das Zehnfache höhere Produktivität erhalten werden.

Die Kulturtemperatur kann in dem Bereich liegen, wie er für das Wachstum mikrobieller Zellen und der Enzymerzeugung üblich ist, bevorzugt beträgt sie 25 bis 30⁰C. Die Kulturzeit kann variieren, abhängig von den Bedingungen, und beträgt im allgemeinen 15 bis 50 Stunden. Die Kultur kann natürlich beendigt werden, wenn die Cholinoxydase-Produktion eine maximale Potenz erreicht hat

Cholinoxydase ist ein endo-Enzym, das in den Zellen der Mikroorganismen vorkommt

Die Extraktion der Cholinoxydase aus der Kulturmasse erfolgt folgendermaßen: Die kultivierte Masse bzw. Kulturmasse (diese Ausdrücke werden im folgenden synonym verwendet) wird filtriert, und die nassen Zellen werden in einem Puffer, wie bis-HCl-Puffer, suspendiert und anschließend mit Lysozym, Ultraschall und einer

»french press« behandelt Die Lysozyni-Behandlung erfolgt bevorzugt Die so erhaltene rohe Cholinoxydase wird durch für Protein und Enzym bekannte Isolier- und Reinigungsverfahren gereinigt Beispielsweise wird bevorzugt eine fraktionierte Ausfallung durch Aceton, Methanol, Äthanol oder Isopropanol und ein Aussalzen durch Ammonjimsulfat durchgeführt Eine weitere Reinigung kann z. B. durch Elektrophorese oder Chromatographie erfolgen, wobei die rohe Cholinoxydase in tris-HCl-Puffer gelöst wird und unter Verwendung von Anionenaustauschern, wie vernetztes Diäthylamino-äthylcellulose- oder -dextran-gel, oder von Gelfiltrationsmitteln, wie Dextrangel oder Polyacrylamidgel, chromatographiert wird. Gereinigtes Cholinoxydasepulver kann durch Gefriertrocknung hergestellt werden.
Die erfindungsgemäße Cholinoxydase besitzt die folgenden physiko-chemischen Eigenschaften.

10

(1) Enzymwirkung

Cholin wird unter Bildung von Betainaldehyd oxydiert und Betainaldehyd wird zu Betain oxydiert
Bei der Oxydation von 1 Mol Cholin wird 1 Mol Betainaldehyd und 1 Mol Wasserstoffperoxid freigesetzt is Das 1 Mol Betainaldehyd wird weiter unter Bildung von 1 Mol Betain und 1 Mol Wasserstoffperoxid oxydiert.

Also setzt 1 Mol Cholin 1 Mol Betain und 2 Mol Wasserstoffperoxid frei. 1 Mol Betainaldehyd setzt 1 Mol Betain und 1 Mol Wasserstoffperoxid frei.

(2) Enzymversuch

20

In 0,50 ml Reaktionsgemisch, das 0,05 ml ίθ,2 Mol) Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), 0,05 ml (3 mg/ml) 4-Aminoantipyrin, 0,10 ml (0,1%) Phenol, 0,10 ml (2 μ/mg) Peroxydase, 0,10 ml (0,1 Mol) Cholinchlorid und 0,10 ml destilliertes Wasser enthält, gibt man 5 μΐ Enzymlösung und inkubiert 5 min bei 37°C. Für die Beendigung der Reaktion werden 2,5 ml Äthanol zugegeben.

Eine Enzym-Aktivitätseinheit wird als die Aktivität des Enzyms definiert, die 1 μΜοΙ Wasserstoffperoxid/min freisetzt. Die Enzymaktivität (Einheiten/ml) wird durch die folgende Gleichung berechnet:

Einheiten/ml = Δ A₄₈₀ZmJn χ 14
worin Δ A₄₈₀ die Änderung pro Minute in der Absorption bei 480 nm bedeutet.

30

(3) Substratepezifität
Die relative Aktivität auf verschiedene Substrate ist wie folgt:

35 40

Das Enzym besitzt eine höhere Aktivität für Cholin und Betainaldehyd.

(4) Optimaler pH

pH 8, wie in Fig. 1 dargestellt; Cholin wird als Substrat verwendet.
50

(5) Optimale Temperatur

etwa 40⁰C, wie in Fig. 2 dargestellt; Cholin wird als Substrat verwendet.

« (6) pH-Stabilität

Für einen pH-Wert von 6 bis 7 wird Dimethylglutarsäure-Puffer, für einen pH-Wert von 7 bis 8 Tris-HCl

Puffer und für einen pH-Wert von 9 bis 10 Glycin-NaOH-Puffer verwendet. Zu 25 mMol jedes Puffers (0,1 ml gibt man 5 μΐ Enzymlösung (Protein 10 ng/ml) und läßt 30 min bei 37°C stehen. Nach der Einstellung de:

pH-Wertes durch Zugabe von 0,5 Mol Tris-HCl-Puffer (pH 8,0, 0,05 ml) wird die Enzymaktivität bestimmt Cholin wird als Substrat verwendet. Aus Fig. 3 geht hervor, daß der stabile pH-Wert bei etwa pH 8 liegt.

(7) Wärmestabilität

Die Wärmestabilität des Enzyms wird bestimmt, indem man 10 mMol Tris-HCI-Puffer (1 ml, pH 8,0), de Enzym (Protein 10 μg/ml) enthält, unter Verwendung von Cholin als Substrat 10 min bei verschiedenen Tem peraturen inkubiert. Wie aus Fig. 4 erkennbar ist, ist das Enzym bei etwa 4O⁰C stabil, und die Aktivita nimmt über 4O⁰C schnell ab.

Substrat	Relative Aktivität
Cholin	100,0
Betainaldehyd	50,0
N-Methylaminoäthanol	3,6
Dimethyläthanolamin	sa
Monoäthanolamin	0,4
Diäthanolamin	0,0
Triäthanolamin	3,6

Zugegebene Substanz	Relative Aktivität
CaCl₂	101,0
MgCl₂	100,0
FeCl₃	0,0
ZnCl₂	7,9
MnCl,	97,7
CoCl₂	30,7
MoCl₂	58,0
KCl	93,2
NaCl	96,6
NH₄Cl	100,0
LiCl	96.6
BaCl₂	103,4
Triton X-IOO	95,5
Adekatol SO-120	105,7
Natriumlauiylsulfat	94,3
Natriumdeoxycholat	94,3
Tween 20	%,6
Natriumlauryl-benzolsulfonat	91,0
Kation DT 205	65,9
Keine Zugabe	100,0

(8) Einfluß von verschiedenen Verbindungen

Der Einfluß verschiedener Verbindungen auf das Enzym wird bestimmt, indem man 5 mMol Metallsalz oder 0,1% Gew./Vol. Detergens zugibt

(9) Molekulargewicht

84 000 ± 2100 (Sephadex G-150-Gelfiltration).

(10) Isoelektrischer Punkt
4,6 (Elektrophorese unter Verwendung eines Ampholyten der Träger-Art). 35

(11) Elektrophorese

Durch Amidoschwarz wird das Enzym bei der Scheiben-Elektrophorese unter Verwendung von Polyacrylamidgcl (pH 8,3) verfärbt. Man beobachtet eine einzige, dunkelblaue Bande, wie in Fig. 5-1 dargestellt. 40

Die Bande des Enzyms wird weiterhin festgestellt, indem man das Gel, das die elektrophoretisch behandelte Probe enthält, in das folgende Reaktionsgemisch 20 bis 30 min bei 37°C stellt:

Reaktionsgemisch (insgesamt 10 ml)

0,2 Mol TrisHCI-Puffer 1,0 ml 45

Farbstoff*) 2,0 ml

0,1 Mol Substratlösung**) 1,0 ml

destilliertes Wasser 6,0 ml

*) Der 1'arbstofT enthält 0,1 Mol Tris-HCl-PufTer (10 ml), S mg/ml o-Dianisidin-äthanollösung (0,3 ml) und Peroxydase 50 [<|

(10 Einheilen). ^

··) WäUrigc Lösung aus Cholinchlorid oder Betainaldehyd.

Eine einzige rote Bande wird, wie in Fig. 5-2 dargestellt, beobachtet, wenn man Cholinchlorid als Substrat verwendet, und eine einzige, rote Bande wird ebenfalls, wie in Fig. 5-3 dargestellt, beobachtet, wenn man 55 Betainaldehyd als Substrat verwendet. Die gefärbten Gele werden durch 7%ige Essigsäure nach dem Waschen mit Wasser fixiert.

Wie aus den Fig. 5-1,2, 3 hervorgeht, sind die elektrophoretischen Mobilitäten an dem Gel identisch und zeigen eine einzige Bande, wodurch die gereinigte Cholinoxydase als einziges Protein identifiziert wird.

(12) Wirkungsmechanismus

0,5 ml eines Gemisches, das Cholir. oder Betainaldehyd (0,01 bis 0,05 μΜοΙ), Tris-HCI-Pufier (pH 8,0, 200μΜοΙ), 4-Aminoantipyrin (150μg), Phenol (200 μg), Peroxydase (0,2 Einheiten) und Cholinoxydase (0,25 Einheiten) enthält, wird 25 min bei 37⁰C inkubiert, und dann wird die Absorption bei 480 nm nach der 65 Zugabe von 2,5 ml Äthanol gemessen.

Mine Standardkurve wird hergestellt, indem man aliquote Teile an Wasserstoffperoxid anstelle von Cholin oder Belain zugibt.

Die Ergebnisse sind in Fig. 6 dargestellt, worin O-O das Ergebnis unter Verwendung von Cholin als Substrat, ·—· das Ergebnis unter Verwendung von Betainaldehyd als Substrat und Δ-Δ das Ergebnis unter Verwendung von Wasserstoffperoxid ansteile des Substrate darstellen. Aus Fig. 6 geht hervor, daß das Enzym die Umsetzung katalysiert, bei der 1 Mol Cholin 2 Mol Wasserstoffperoxid freisetzt und bei der 1 Mol Betain-

5 aldehyd freigesetzt wird.

Der SauerstofrVerbrauch wird durch eine Sauerstoffelektrode bestimmt und zeigt, daß 2 Mol Sauerstoff bei der Oxydation von 1 Mol Cholin und 1 Mol Sauerstoff bei der Oxydation von 1 Mol Betainaldehyd verbraucht werden.
Das Betain wird quantitativ bestimmt, indem man den pH-Wert des Reaktionsgemisches auf 1 einstellt, das

ίο Gemisch auf das lOOfache nach Behandlung mit Aktivkohle konzentriert und dann nach dem Reinecke-Salzverfahren analysiert. 1 Mol Betain wird aus 1 Mol Cholin oder 1 Mol Betainaldehyd gebildet.

Wie zuvor erwähnt, erfordert die erfindungsgemäße Cholinoxydase kein Coenzym für die Oxydation von Cholin und Betainaldehyd, und das Substrat reagiert direkt mit Sauerstoff unter Freisetzung von Wasserstoffperoxid. Außerdem besitzt das Enzym andere physiko-chemische Eigenschaften als bekannte Enzyme.

is Dadurch wird bestätigt, daß die Cholinoxydase ein neues Enzym ist, verglichen mit der bekannten CholindehydrO3enase und Betainaldehyddehydrogenase.

Die neue Cholinoxydase kann für die Analyse von flüssigen, Cholin oder Betainaldehyd enthaltenden Proben verwendet werden.
Weiterhin kann Cholinoxydase für die Bestimmung der Reinheit von Cholin oder Betainaldehyd, die quantitative Besti&äoung von Derivaten von Cholin und Betainaldehyd und die Aktivität des Enzyms, das auf die Derivate von Cholin oder Betainaldehyd unter Bildung von Cholin oder Betainaldehyd wirkt, verwendet werden.

Beispielsweise kann man eine Cholin oder Betainaldehyd enthaltende Probe, z. B. eine wäßrige Lösung oder ein Medium von Cholin oder Betainaldehyd oder eine wäßrige Lösung, die Cholin oder Betainaldehyd, die von ihren Derivaten freigesetzt wurden, verwenden. Besondere Beispiele sind Blut, Serum, Körperflüssigkeit, Gewebehomogenat u.a. Die Cholinoxydase kann somit für die klinische Diagnose direkt oder zusammen mit anderen chemischen oder enzymatischen Systemen verwendet werden.

Beispiele von Cholinderivaten sind physiologische Phospholipide, wie Lysolecithin, Lecithin und Sphingomyeline, biologische Substanzen, wie Acetylcholin, Cytidinphosphatcholin und Phosphorylcholin, oder syn-

thetische Verbindungen, wie Benzoylcholin, Propionylcholin, Butylcholin and Succinylcholin. Diese Substanzen sind Cholinderivate, die Cholin durch chemische oder enzymatische Einflüsse freisetzen. Ein Beispiel für die Freisetzung von Cäolin aos seinen Derivaten ist z.B. ein chemisches Verfahren, wie eine alkalische oder saure Hydrolyse, oder ein «nzymatisches Verfahren, wie eine Kombination aus Phospholipasc C, erhalten aus Clostridium welchii oder Bacil öS cereus, und alkalischer Phosphatase, erhalten aus Rinder-, Schweine- oder Küken-Dünndarmmucosa, Rinderleber oder E.coli; Phospholipase D, erhalten aus Kraut, Streptomyccs hachijoensis oder Streptomyces chromofuscus; und Choiinesterase, erhalten aus Rinderbiutzeiien, dem Zitteraal, Pferdeserum oder Menschenserum. Die oben erwähnten Enzyme und ihre Herkunft sind nur Beispiele, und es könnern Enzyme, die Phospholipase C-, alkalische Phosphatase-, Phospholipase D- oder Cholinestcrase-Aktivität besitzen, verwendet werden. Die Umsetzung von Lecithin mit Phosphoiipase vJ und alkalischer Phosphatase kann als Beispiel dienen, da Lecithin zu Diglycerid und Phosphorylcholin durch Phospholipase C hydrolysiert wird und das freigesetzte Phosphorylcholin zu anorganischem Phosphor und Cholin durch die Wirkung der alkalischen Phosphatase gespalten wird. Die Phospholipase D hydrolysiert Lecithin zu Phosphatidsäure und Cholin. Benzoylcholin wird durch Choiinesterase zu Benzoesäure und Cholin hydrolysiert. Diese enzymatischen Verfahren sind nur Beispiele, bei denen Cholin oder Betainaldehyd aus ihren Derivaten freigesetzt wird und die mit Vorteil verwendet werden können. Die enzymatische Vorbehandlung der Derivate von Cholin und Betainaldehyd kann getrennt unter Freisetzung von Cholin und Betainaldehyd erfolgen, oder, wenn die enzymatische Vorbehandlung sehr kurz und einfach ist, kann sie gleichzeitig mit der Zugabe der Cholinoxydase erfolgen. Cholinoxydase kann als Pufferlösung oder eingekapselt in Mikrokapseln oder in immobilisierter Form verwendet werden.

50 Im folgenden wird das Herstellungsverfahren von Cholinoxydase näher erläutert.

Beispiel 1

100 ml eines Mediums, das 1,0% Cholin, 0,5% KCl, 0,1% K₂HPO₄, 0,05% MgSO₄ ■ 7 H₂O, 0,25% Hefeextrakt, 1,0% lösliche Fischbestandteile und 0,1% Desform CA-200 in einem 500-ml-Erlenmeyerkolben enthält, wird 20 min bei 120°C sterilisiert. Nach der Inokulation mit Arthrobacter globiformis B-0577 = FERM BP-360 wird 1 Tag bei 30⁰C eine Impfkultur kultiviert. Diese wird dann in 101 des gleichen, sterilisierten Mediums in ein 30-1-Fermentergefäß gegeben und 2 Tage bei 30⁰C und 200 U/min, Belüftung 20 l/min, kultiviert. Die Bakterienzellen, die durch Abzentrifugieren erhalten werden, werden 30 min bei 37°C und Rühren mit 1 1 einer Lösung gewaschen, die 10 mMol Tric-HCl-Puffer (pH 8,0),2 mMol EDTA und 1% KCl enthält. Man gibt 200 mg Lysozymchlorid hinzu und rührt 30 min bei 37°C. Zu der durch Zentrifugieren bei 5000 U/min während 15 min erhaltenen, überstehenden Lösung gibt man 1 1 Aceton und trennt den unreinen Niederschlag ab. Aceton wird bis zu einer Konzentration von 65% Zugegeben, dann wird der Niederschlag durch Abzentrifugieren während 15 min bei 5000 U/min abgetrennt. Der Niederschlag wird ir. 40 ml einer Lösung gelöst, die 10 mMol tric-HCl-Puffer (pH 8,0), 2 mMol EDTA und 1% KCl enthält. Der unlösliche Teil wird abzentrifugicrt. Zu der überstehenden Lösung gibt man 60 ml gesättigtes Ammoniumsulfat und rührt 15 min. Dann wird 15 min bei 12 000 U/min zentrifugiert. Der Niederschlag wird in 15 ml einer Lösungsmittelmischung aus 10 mMol

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Phosphatpuffer (pH 7,0) und 2 mMol EDTA. gelöst und mittels Durchleiten durch eine Sephadex G-25-Säule (Strömungsrate: 30 ml/h) entsalzt Die entsalzte Lösung wird durch eine DEAE-Cellulose-Säule (2,0 χ 7,0 cm, gepuffert auf pH 7,0) zur Adsorption des Enzyms geleitet. Es wird mit einer 0,2 bis 0,5 Mol KCl-Lösung gradientenartig eluiert. Das Eluat mit einer Konzentration von etwa 0,4 Mol KCl wird gesammelt (Strömungsrate: 1,4 ml/min, je 6 ml-Fraktionen). Die aktive Fraktion (172 ml) wird durch eine Celluloseacetat-Membran während 7 h (Außenlösung: ein Gemisch aus 5 mMol Phosphatpuffer und 2 mMol EDTA) dialysiert und dann gefriergetrocknet. Das so erhaltene Lyophilisat wird in einem Gemisch aus 10 mMol tris-HCl-Puffsr (10 ml, pH 8,0), 2 mMol EDTA und 1% KCl gelöst und an Sephadex G-200-Säule (2,8 x 9,5 cm, Strömungsrate: 0,18 ml/:nin, jeweils 6 ml-Fraktionen) chromatographiert. Die aktiven Fraktionen Nr. 42 bis 48 werden gesammelt, gefriergetrocknet und erneut der Sephadex-Säulenchroinatographie unterworfen.

Das so erhaltene, gefriergetrocknete Enzym zeigt bei der Elektrophorese eine einzige Proteinbande. Die Reinigungswerte sind die folgenden:

Reinigungsstufe	Gesamt	Gesamt-	Spezifische
	einheit	protein	Aktivität
	(E)	(mg)	(E/mg)
Rohextrakt	998	7680	0,13
Acetonniederschlag	900	580	1,55
Ammoniumsuifatniederschlag	825	300	2,75
DEAE-Cellulose	420	115	3,65
Erstes Sephadex G-200	390	58,2	6,70
Zweites Sephadex G-200	380	55,9	6,80

In den beigefügten Zeichnungen zeigen:

Fig. 1 den optimalen pH-Wert von Cholinoxydase;

Fig. 2 die optimale Temperatur für Cholinoxydase;

Fig. 3 die pH-Stabilität von Cholinoxydase;

Fig. 4 die Wärmestabilität von Cholinoxydase;

Fig. 5 das elektrophoretische Muster von Cholinoxydase;

Fig. 6 Standardkurven für Cholin, Betainaldehyd.

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Hierzu 2 Blatt Zeichnungen

40 45 50 55 60 65

Claims

Patentansprüche:

1. Eüzymcholinoxydase, dadurch gekennzeichnet, daß sie zumindest die folgenden Eigenschaften besitzt:
(1) Substratspezmtät: eine spezifische Aktivität für eine Verbindung der allgemeinen Formel

CH₃
10 CH₃-N⁺-CH₂-Ri