DE2760200C2 - - Google Patents

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DE2760200C2
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hydrogen peroxide
phospholipase
betaine
enzyme
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DE2760200A
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Shigeru Ikuta
Yoshifumi Horiuchi
Hideo Misaki
Kazuo Matsuura
Shigeyuki Imamura
Naoki Shizuoka Jp Muto
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Toyo Jozo KK
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Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Bestimmung von Cholin oder Betainaldehyd.
Cholindehydrogenase [EC.1.1.99.1. Cholin: (Akzeptor) Oxidore­ duktase] und Betainaldehyddehydrogenase [EC.1.2.1.8. Betainal­ dehyd: NAD Oxidoreduktase] sind bekannte Enzyme, die auf Cho­ lin oder Cholinaldehyd als Substrat einwirken. Es ist weiter­ hin bekannt, daß diese Enzyme für ihre enzymatischen Wirkungen Coenzyme erfordern [Methods in Enzymology V, 562-570, (1952); ibid I, 674-678 (1955), Academic Press.], und daher werden sie als Dehydrogenasen klassifiziert.
Es wurde gefunden, daß ein Enzym, das die Oxidationsreaktion von Cholin zu Betain katalysiert, von dem Bakterienstamm B-0577, der zum Genus Arthrobacter gehört und aus Boden, der in Kago­ shima, Japan, gesammelt wurde, gebildet wird. Dieses Enzym wurde gereinigt und es wurde festgestellt, daß es ein einziges Enzym ist.
Die Gewinnung, die Charakterisierung sowie die Handhabung dieses Enzyms ist in der hierzu gehörenden Stammanmeldung P 27 16 335 beschrieben, auf die hiermit verwiesen wird.
Das Enzym, Cholinioxydase, katalysiert eine Umsetzung, bei der 1 Mol Cholin zu Betain über den Betainaldehyd unter Bil­ dung von 2 Mol Wasserstoffperoxid oxydiert wird oder bei der 1 Mol Betainaldehyd zu Betain unter Bildung von 1 Mol Wasser­ stoffperoxid oxydiert wird. Damit ist es möglich, Cholin oder Betainaldehyd in einer flüssigen Probe durch Behandlung der Probe mit Cholinoxydase quantitativ zu bestimmen, indem das freigesetzte Wasserstoffperoxid, Betain oder der verbrauchte Sauerstsoff gemessen wird.
Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Verfahren zur quantitativen Bestimmung von Cholin oder Betainaldehyd zu schaffen.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß durch das in den Ansprüchen definierte Verfahren gelöst.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich in klinischen, dia­ gnostischen Untersuchungen für die Analyse von Cholin, Beta­ inaldehyd, Cholinderivaten oder Betainaldehydderivaten in Kör­ perflüssigkeiten.
Die Aktivität des zu verwendenden Enzyms wird wie folgt be­ stimmt:
In 0,50 ml Reaktionsgemisch, das 0,05 ml (0,2 Mol) Tris-HCl- Puffer (pH 8,0), 0,05 ml (3 mg/ml) 4-Aminoantipyrin, 0,10 ml (0,1%) Phenol, 0,10 ml (2 µ/mg) Peroxydase, 0,10 ml (0,1 Mol) Cholinchlorid und 0,10 ml destilliertes Wasser enthält, gibt man 5 µl Enzymlösung und inkubiert 5 min bei 37°C. Für die Beendigung der Reaktion werden 2,5 ml Äthanol zugegeben.
Eine Enzym-Aktivitätseinheit wird als die Aktivität des Enzyms definiert, die 1 µMol Wasserstoffperoxid/min freisetzt. Die Enzymaktivität (Einheiten/ml) wird durch die folgende Glei­ chung berechnet:
Einheiten/ml=A₄₈₀/min×14
worin A₄₈₀ die Änderung pro Minute in der Absorption bei 480 nm bedeutet.
Vorzugsweise wird das erfindungsgemäße Verfahren wie folgt durchgeführt:
0,5 ml eines Gemisches, das Cholin oder Betainaldehyd (0,01 bis 0,05 µMol), Tris-HCl-Puffer (pH 8,0, 200 µMol), 4-Amino­ antipyrin (150 µg), Phenol (200 µg), Peroxydase (0,2 Einhei­ ten) und Cholinoxydase (0,25 Einheiten) enthält, wird 25 min bei 37°C inkubiert und dann wird die Absorption bei 480 nm nach Zugabe von 2,5 ml Äthanol gemessen.
Eine Standardkurve wird hergestellt, indem man aliquote Teile an Wasserstoffperoxid anstelle von Cholin oder Betain zugibt.
Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt, worin ○-○ das Ergebnis unter Verwendung von Cholin als Substrat, ⚫-⚫ das Ergebnis unter Verwendung von Betainaldehyd als Substrat und ∆-∆ das Ergebnis unter Verwendung von Wasserstoffperoxid anstelle des Substrats darstellen. Aus Fig. 1 geht hervor, daß das Enzym die Umsetzung katalysiert, bei der 1 Mol Cholin 2 Mol Wasserstoffperoxid freisetzt und bei der 1 Mol Wasserstoffper­ oxid aus 1 Mol Betainaldehyd freigesetzt wird.
Der Sauerstoffverbrauch wird durch eine Sauerstoffelektrode be­ stimmt und zeigt, daß 2 Mol Sauerstoff bei der Oxydation von 1 Mol Cholin und 1 Mol Sauerstoff bei der Oxydation von 1 Mol Betainaldehyd verbraucht werden.
Das Betain wird quantitativ bestimmt, indem man den pH-Wert des Reaktionsgemisches auf 1 einstellt, das Gemisch auf das 100fache nach Behandlung mit Aktivkohle konzentriert und dann nach dem Reinecke-Salzverfahren analysiert. 1 Mol Beatin wird aus 1 Mol Cholin oder 1 Mol Betainaldehyd gebildet.
Für die im erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Cholin­ oxydase wird kein Coenzym für die Oxydation von Cholin und Betainaldehyd benötigt, da das Substrat direkt mit Sauerstoff unter Freisetzung von Wasserstoffperoxid reagiert. Außerdem besitzt das Enzym andere physiko-chemische Eigenschaften als bekannte Enzyme. Dadurch wird bestätigt, daß die Cholinoxydase ein neues Enzym ist, verglichen mit der bekannten Cholindehydro­ genase und Betainaldehyddehydrogenase.
Die neue Cholinoxydase kann für die Analyse von flüssigen, Cholin oder Betainaldehyd enthaltenden Proben verwendet wer­ den.
Weiterhin kann Cholinoxydase für die Bestimmung der Reinheit von Cholin und Betainaldehyd, die quantitative Bestimmung von Derivaten von Cholin und Betainaldehyd und die Aktivität des Enzyms, das auf die Derivate von Cholin oder Betainaldehyd unter Bildung von Cholin oder Betain­ aldehyd wirkt, verwendet werden.
Beispielsweise kann man eine Cholin oder Betain­ aldehyd enthaltende Probe, z. B. eine wäßrige Lösung oder ein Medium von Cholin oder Betainaldehyd oder eine wäßrige Lösung, die Cholin oder Betainaldehyd, die von ihren Deriva­ ten freigesetzt wurden, verwenden. Besondere Beispiele sind Blut, Serum, Körperflüssigkeit, Gewebehomogenat u.ä. Die Cholinoxydase kann somit für die klinische Diagnose direkt oder zusammen mit anderen chemischen oder enzymatischen Systemen verwendet werden.
Beispiele von Cholinderivaten sind physiologische Phospholipide, wie Lysolecithin, Lecithin und Sphingo­ myeline, biologische Substanzen, wie Acetylcholin, Cytidin­ phosphatcholin und Phosphorylcholin, oder synthetische Ver­ bindungen, wie Benzoylcholin, Propionylcholin, Butylcholin und Succinylcholin. Diese Substanzen sind Cholinderivate, die Cholin durch chemische oder enzymatische Einflüsse freisetzen. Ein Beispiel für die Freisetzung von Cholin aus seinen Deri­ vaten ist z. B. ein chemisches Verfahren, wie eine alkalische oder saure Hydrolyse, oder ein enzymatisches Verfahren, wie eine Kombination aus Phospholipase C, erhalten aus Clostridium welchii oder Bacillus cereus, und alkalischer Phosphatase, erhalten aus Rinder-, Schweine- oder Küken- Dünndarmmucosa, Rinderleber oder E.coli; Phospholipase D, er­ halten aus Kraut, Streptomyces hachÿoensis A 1143 oder Streptomyces chromofuscus A-0848; und Cholinesterase, erhal­ ten aus Rinderblutzellen, dem Zitteraal, Pferdeserum oder Menschenserum. Die oben erwähnten Enzyme und ihre Herkunft sind nur Beispiele und sollen keine Beschränkung darstellen, und es können Enzyme, die Phospholipase C-, alkalische Phos­ phatase-, Phospholipase D- oder Cholinesterase-Aktivität be­ sitzen, verwendet werden. Die Umsetzung von Lecithin mit Phos­ pholipase C und alkalischer Phosphatase kann als Beispiel dienen, da Lecithin zu Diglycerid und Phosphorylcholin durch Phospholipase C hydrolysiert wird und das freigesetzte Phosphorylcholin zu anorganischem Phosphor und Cholin durch die Wirkung der alkalischen Phosphatase gespalten wird. Die Phospholipase D hydrolysiert Lecithin zu Phosphatidsäure (phosphatidic acid) und Cholin. Benzoylcholin wird durch Cholinesterase zu Benzoesäure und Cholin hydrolysiert. Diese enzymatischen Verfahren sind nur Beispiele, bei denen Cholin oder Betainaldehyd aus ihren Derivaten freigesetzt wird und die mit Vorteil verwendet werden können. Die enzymatische Vorbehandlung der Derivate von Cholin und Betainaldehyd kann getrennt unter Freisetzung von Cholin und Betainaldehyd er­ folgen, oder, wenn die enzymatische Vorbehandlung sehr kurz und einfach ist, kann sie gleichzeitig mit der Zugabe der Cholinoxydase erfolgen. Cholinoxydase kann als Pufferlösung oder eingekapselt in Mikrokapseln oder in immobilisierter Form verwendet werden. Die Menge an zugegebener Cholinoxydase be­ trägt etwa 1 Einheit oder bevorzugt 1,5 bis 5 Einheiten, und die Reinheit soll so hoch wie möglich sein; es ist jedoch nicht immer erforderlich, daß eine Qualität allerhöchster Reinheit verwendet wird.
In dem inkubierten Gemisch aus Probe und Cholinoxy­ dase werden Wasserstoffperoxid und Betain freigesetzt und dementsprechend wird die Menge an Sauerstoff darin verringert. Die Bestimmung des Sauerstoffs erfolgt bevorzugt nach einem Sauerstoff-Elektrodenverfahren. Die Bestimmung von Betain kann bevorzugt nach dem Reineckate-Verfahren oder nach dem gaschromatographischen Verfahren des veresterten Betains erfolgen. Wasserstoffper­ oxid wird bevorzugt nach einem colorimetrischen Verfahren un­ ter Verwendung eines Reaktionssystems mit einem oder mehreren Farbstoffreagentien durchgeführt. Bevorzugte colorimetrische Verfahren sind z. B. die Umsetzung von Wasserstoffperoxid mit quaternären Titanverbindungen und Xylenolorange oder mit Phenol, 4-Aminoantipyrin und Peroxydase. Bei der letzeren Reaktion inhibiert das Vorhandensein des Phenols die Aktivi­ tät von Cholinoxydase und es wird somit in einer so geringen Menge wie möglich verwendet. Die Menge an 4-Aminoantipyrin liegt über 1/2 Mol oder bevorzugt über 2 Mol, entsprechend dem freigesetzten Wasserstoffperoxid, und die Menge an Peroxydase liegt über 0,1 Einheiten oder bevorzugt über 0,2 bis 0,5 Ein­ heiten. 4-Aminoantipyrin kann durch 4-Aminophenazon ersetzt werden. Die Reagentien können zuvor als Lösung hergestellt werden. Wasserstoffperoxid kann ebenfalls quantitativ durch ein Gemisch aus 2,6-Dichlorphenol, Indophenol und Peroxydase, Guajakol und Peroxydase oder Homovanillinsäure und Peroxydase bestimmt werden.
Von den obigen quantitativen Analysen des Wasser­ stoffperoxids, Betains und Sauerstoff ist die quantitative Bestimmung von Wasserstoffperoxid, bei der ein Gemisch aus Peroxydase und Farbstoffmittel verwendet wird, bevorzugt, da sie genau und leicht durchzuführen ist.
Dementsprechend kann Cholin oder Betainaldehyd in einer Probe quantitativ bestimmt werden, indem man die Menge an Wasserstoffperoxid, Betain oder Sauerstoff bestimmt und Standardkurven anfertigt. Die Reinheit von Cholin oder Betain­ aldehyd kann direkt bestimmt werden, oder man kann auch Deri­ vate von Cholin leicht analysieren.
Die quantitative Bestimmung von Cholin kann eben­ falls durchgeführt werden, indem man die Menge an Zwischen­ produkt Betainaldehyd oder die entsprechende Wasserstoffper­ oxidbildung bestimmt. Das Zwischenprodukt Betainaldehyd wird weiter durch Cholinoxydase unter Bildung von Wasserstoffper­ oxid oxydiert, und daher können Fehler auftreten. Zur Vermei­ dung der Fehler wird ein Inhibitor zugegeben, wie ein Inhibi­ tor, der mit Betainaldehyd eine Schiffsche Base bildet, oder ein solcher, der den Reaktionsweg von Betain ändert; zu die­ sem Zweck ist ein Aldehyddehydrogenase- und NAD- oder NADP- System bevorzugt.
Verschiedene Zusammensetzungen der Reagentien und Enzyme können je nach dem Zweck der Analyse zusammengestellt werden und diese Zusammensetzungen werden als Kit bzw. Be­ steck für die Analyse vorgesehen.
Bei den zuvor beschriebenen analytischen Verfahren wird das spezifische Enzym Phospholipase D, das eine Umset­ zung des Phospholipids katalysiert und Cholin freisetzt, ver­ wendet. Da diese Phospholipase D ein sehr spezifisches und vorteilhaftes Enzym für quantitative Bestimmung von Cholin und seinen Derivaten bei der vorliegenden Erfindung ist, wie dieses Enzym im folgenden näher erläutert.
Die bei der vorliegenden Erfindung verwendete Phospho­ lipase wird bevorzugt durch Züchten von Streptomyces chromofuscus A-0848 oder Streptomyces hachÿoensis A-1143 hergestellt; diese Stämme wurden im Institute for Microbial Industry and Technology, Japan, als FERM-P Nr. 3519 bzw. Nr. 1329 hinterlegt. Diese Hinter­ legung wurde in eine Hinterlegung nach dem "Budapester Vertrag" umgewandelt, wobei die Stämme die Hinter­ legungsnummern FERM-BP 361 bzw. BP 359 erhielten.
Die taxonomischen Eigenschaften der Stämme Strepto­ myces chromofuscus A-0848 FERM-BP Nr. 361 und die physiko­ chemischen Eigenschaften von Phospholipase D sind die folgenden.
Taxonomische Eigenschaften (a) Morphologie
Nach dem makroskopischen Bestimmungen ist das spo­ rentragende Luftmyzelium grau und das Substratmyzelium ist gelblich-braun oder gelblich-orange. Es wird kein lösliches Pigment gebildet.
Die mikroskopischen Beobachtungen auf anorganischem Stärke-Agarmedium bei 30°C während 10 bis 15 Tagen Kultur sind wie folgt:
Luftmyzelium:
Durchmesser 0,6 bis 0,8 µ; gekrümmte und ein­ fache Verzweigung; bildet Sporenketten; 1 bis 3 ge­ wendelte Spiralen aus Sporenketten und weniger als 4 bis 5 gewendelte Spiralen; einige gekrümmte und gerade Sporenketten;
Sporen:
kugelförmig oder elliptisch, 0,6 bis 0,8×0,7 bis 0,9 µ; stachelige Oberfläche;
Substratmyzelium:
entwickelt mit gekrümmter Verzweigung; Durchmesser 0,4 bis 0,6 µ; keine Zellteilung und kein Tragen von Sporen; keine flagellenartigen Sporen und Sporangium;
(b) Analyse des Gesamtmyzeliums (Diaminopimelinsäure)
Das während 6 Tagen auf Bennett′s Medium in einer Schüttelkultur gezüchtete Myzelium wird entsprechend dem Ver­ fahren von Becker et al [Appl.Microbiol., 12 (5), 421-423 (1964)] analysiert. LL-Diaminopimelinsäure wird nachgewiesen; die Mesoform konnte nicht festgestellt werden.
(c) Kultureigenschaften
In den verschiedenen, im folgenden aufgeführten Me­ dien wird bei einer Temperatur unter 30°C während 20 Tagen gezüchtet. Abkürzungen: G=Wachstum; A=Luftmyzelium; S= lösliches Pigment.
  •  (1)Saccharosenitratagar
    G: Spur, keine Färbung; A: Spur; S: keins
  •  (2) Glycerinnitratagar
    G: mäßig - gut, pastellorange (4 ic); A: keins - Spur
    S: nackt dunkelgelb (4gc), Spur
  •  (3) Glucoseasparaginagar
    G: mäßig, bambusfarben (2fb) - amber (3 pe);
    A: schlecht - mäßig, weiß (a); S: keins
  •  (4) Glycerinasparaginagar
    G: mäßig, goldbraun (3 pg-3 pi);
    A: mäßig, silbergrau (3 fe) - naturfarben (3 dc); S: keins
  •  (5) Anorganischer Stärke-Salz-Agar
    G: mäßig - gut, goldbraun (3 pi) - nelkenbraun (3 pl);
    A: mäßig - gut, silbergrau (3 fe) - naturfarben (3 dc); S: keines
  •  (6) Tyrosinagar
    G: mäßig - gut, goldbraun (3 pg - 3 pi);
    A: mäßig - gut, silbergrau (3 fe) - naturfarben (3 dc); S: keins
  •  (7) Glycerinstärkeglutamatagar
    G: mäßig - gut, rostdunkelgelb (5 gc) - ahornfarben (4 le);
    A: mäßig, austernweiß (b) - hellgrau (c); S: keins
  •  (8) Hafermehlagar
    G: mäßig - gut, senfgold (2 ne) - goldbraun (3 pg);
    A: mäßig - gut, naturfarben (3 dc) - beigebraun (3 ig); S: keines
  •  (9) Hefeextrakt-Malzextrakt-Agar
    G: mäßig - gut, amber (3 lc) - gelb-ahornfarben (3 ng);
    A: mäßig, silbergrau (3 fe) - beigebraun (3 ig) - beige (3 gc); S: keins
  • (10) Nähragar
    G: mäßig, amber (3 pe); A: Spur - schlecht, weiß (a); S: keins
  • (11) Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar
    G: mäßig - gut, keine Farbe, umgekehrte Seite: Goldbraun (3 pg);
    A: keins, S: goldbraun (3 pg - 3 pi)
  • (12) Tripton-Hefeextrakt-Medium
    G: gut, amber (3 nc - 3 pc); A: keins, S: keins - gold­ braun (3 pg)
  • (13) Glucose-Pepton-Gelatine-Medium
    G: schlecht, goldbraun (3 pg); A: keins; S: goldbraun (3 pi)
  • (14) Entfettetes Milchmedium
    G: gut - besser, hellamber (3 ic) - hell dunkelgelb (3 gc)
    A: keins; S: ahornfarben (4 le) - pastellorange (4 ic).
Die vorstehend in Klammern angegebenen Farbbezeichnungen sind dem Fachmann bekannt und sind aus Colour Harmony Manual, Container Corp. of America (USA 1958) ersichtlich.
(d) Physiologische Eigenschaften (+ = positiv; - = negativ)
  • (1) melaninähnliche Pigmentbildung:
    Pepton-Hefeextrakt-Eisen-Agar: +
    Tripton-Hefeextrakt-Medium: ±
    Tyrosinagar: -
  • (2) Gelatineverflüssigung: Glucose-Pepton-Gelatine-Medium: +
  • (3) Stärkehydrolyse: Stärke-anorganisches Salz-Medium: +
  • (4) Milch: Koagulation: -; Peptonisierung: +
  • (5) Verwendung der Kohlenstoffquelle:
    D-Glucose, L-Arabinose, D-Mannit, L-Rhammose,
    D-Xylose: +
    Inosit, Raffinose: ±
    Saccharose: -
  • (6) Wachstumstemperatur: 10 bis 47°C.
Das Luftmyzelium entwickelt sich aus dem Substratmyzelium ohne Spaltung und enthält viele Sporenketten. Die Eigenschaften des Durchmessers des Myzeliums und die Form der Sporen oder der Zellwände, die LL-Diaminopimelinsäure ent­ halten, ergeben, daß der Stamm zum Genus Streptomyces gehört. Die Eigenschaften, wie als gräuliches Luftmyzelium, spiralförmige Sporenketten, stachelige Sporenoberfläche, gelblich-braunes bis gelblich-oranges Substratmyzelium, keine lösliche Pigmentbildung, melaninähnliche Pigmentbildung auf Pepton- Hefeextrakt-Eisen-Agarmedium, keine melaminähnliche Pigmentbildung auf Tyrosinagarmedium und die Kohlenstoffquellenver­ wendung verschiedener Kohlenstoffquellen zeigen, daß dieser Stamm zu Streptomyces chromofuscus (Preobrazhenskaya et al) Pridham et al gehört und als Streptomyces chromofuscus A-0848 bezeichnet wurde.
Die Züchtung des Stamms und die Erzeugung von Phospholipase D werden zweckdienlich, wie in dem folgenden Bezugs­ beispiel 1 erläutert, durchgeführt.
Die physiko-chemischen Eigenschaften dieser Phosphorlipase D sind die folgenden.
(1) Enzymwirkung
Das Enzym katalysiert die Hydrolyse der Esterbindung bei Phosphat und basischen Stickstoffgruppen von Phospholipid und setzt Phosphorverbindungen und die entsprechende basische Stickstoffverbindung frei.
(2) Analyseverfahren
Zu einem Reagens, das 0,2 Mol Tris-HCl-Puffer (ph 8,0, 0,1 ml), 10 mMol Lecithinemulsion (0,1 ml), 0,1 Mol Calciumchlorid (0,05 ml), 1% Triton X-100 (0,1 ml) und 0,1 ml Wasser enthält, gibt man 0,05 ml Enzymlösung. Nach 10 min Inkubation bei 37°C wird das Gemisch zur Beendigung der Enzymreaktion gekocht und auf 37°C gekühlt. 4-Aminoantipyrin (3 mg/ml, 0,1 ml), Peroxydase (2 Einheiten/ml, 0,1 ml), 0,1% Phenol (0,1 ml), Cholinoxydase (12 Einheiten/ml, 0,1 ml) und 0,1 ml Wasser werden zugegeben. Nach der Inkubation bei 37°C während 20 min werden 2 ml 1%iges Triton X-100 zugegeben und dann wird die optische Dichte bei 500 nm bestimmt.
Eine Enzymaktivitäts-Einheit wird als die Aktivität des Enzyms definiert, die 1 µMol Cholin/min freisetzt. Die Enzymaktivität (Einheit/ml oder E/ml) wird durch die Gleichung
Einheiten/ml = Δ A₅₀₀×0,55
angegeben, worin Δ A₅₀₀ die Änderung der optischen Dichte bei 500 nm bedeutet.
(3) Substratspezifizität
Die relative Aktivität auf verschiedenen Substraten ist wie folgt:
Substrat
Relative Aktivität, %
Lecithin
51
Sphingomyelin 19
Lysolecithin 100
(4) pH-Stabilität
Eine Enzymlösung (1 mg/ml) wird 60 min bei 37°C auf verschiedenen Pufferlösungen inkubiert. pH 5: Acetatpuffer; pH 6 bis 7: Dimethylglutarat-NaOH-Puffer; es werden jeweils 10 mMol verwendet und dann wird die Phospholipase D-Aktivität bestimmt. Wie aus Fig. 2 hervorgeht, ist das Enzym bei pH 7 bis 9 stabil.
(5) Optimaler pH
Wie aus Fig. 3 hervorgeht, liegt der optimale pH-Bereich des Enzyms zwischen pH 7 und 9.
(6) Wärmestabilität
Enzymlösung (1 mg/ml) in 10 mMol Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) wird 10 min bei 40, 50, 60, 70 bzw. 80°C inkubiert. Wie aus Fig. 4 hervorgeht, ist das Enzym bis zu 70°C stabil.
(7) Enzymwirkung auf Serumphospholipide
Probe 1: 0,2 Mol Tris-HCl-Puffer (pH 8,0)|0,2 ml
im Handel erhältliches Serum 0,5 ml
0,1 Mol CaCl₂ o,1 ml
60 E/ml Phospholipase D 0,1 ml
destilliertes Wasser 0,1 ml
Probe 2: 0,2 Mol Tris-HCl-Puffer (pH 8,0)|0,2 ml
im Handel erhältliches Serum 0,5 ml
0,1 Mol CaCl₂ 0,1 ml
60 E/ml Phospholipase D 0,1 ml
Phosphatidat-phosphatase 2 Einheiten
destilliertes Wasser|0,1 ml
Probe 3: 0,2 Mol Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) 0,2 ml
im Handel erhältliches Serum 0,5 ml
0,1 Mol CaCl₂ 0,1 ml
destilliertes Wasser 0,2 ml
Die Proben 1, 2 und 3 werden 30 min bei 37°C inkubiert, anschließend werden Chloroform-Methanol (2 : 1,6 ml) und Wasser (1 ml) gut vermischt. Das Gemisch wird 10 min bei 3000 U/min zentrifugiert. Die abgetrennte Chloroformschicht wird im Vakuum getrocknet und an einer Dünnschichtplatte (Entwicklungsmittel: Chloroform : Methanol : Wasser = 65 : 25 : 3) chromatographiert. Das Phospholipid auf der Platte wird identifiziert, indem man blaues Molybdänreagens aufsprüht. Phosphatidyläthanolamin, Phosphatidylcholin, Sphingomyelin, Lyso­ phosphatidylcholin und Phosphatidsäure werden auf Dünnschichtplatten als Kontrolle chromatographiert. Die Ergebnisse sind in Fig. 5 dargestellt, worin folgende Bedeutungen verwendet werden:
1 = Probe 1; 2 = Probe 2; 3 = Probe 3;
4 = Standardphospholipid [Phosphatidyläthanolamin (A); Phos­ phatidylcholin (B); Sphingomyelin (C) und Lysophosphatidyl­ cholin (E)];
5 = Standardphospholipid [Phosphatidsäure (D)].
Aus Fig. 5 geht hervor, daß das Serum (Probe 3) Phosphatidyläthanolamin, Phosphatidylcholin, Sphingomyelin und Lysophosphatidylcholin enthält. Das mit Phospholipase D (Probe 1) behandelte Serum zeigt nur Phosphatidsäure (Nr. 1). Das mit Phospholipase D und Phosphatidatphosphatase behandelte Serum (Probe 2) zeigt keinen Flecken (Nummer 2). Daher wird das Serum-Phospholipid durch Phospholipase D zu Phosphatidsäure hydrolysiert und die so gebildete Phosphatidsäure wird zu anorganischem Phosphat und Diglycerid durch Phosphatidat­ phosphatase hydrolysiert. Das Ergebnis zeigt, daß das Serum- Phosphatidyläthanolamin ein Substrat für diese Phospholipase D ist.
Die aus Streptomyces chromofuscus A-0848 erhaltene Phospholipase D ist hinsichtlich des optimalen pH-Werts, der pH-Stabilität und der Wärmestabilität besser als solche von Streptomyces hachÿoensis A-1143. Weiterhin ist die durch St. hachÿoensis A-1143 hergestellte Phospholipase D mit Phospholipase C verunreinigt, was nachteilig ist, da dadurch Nebenreaktionen auftreten. Erfindungsgemäß wird daher die durch St. chromofuscus A-0858 gebildete Phospholipase D bevorzugt bei der quantitativen Bestimmung von Phospholipid verwendet.
Im folgenden wird das erfindungsgemäße Verfahren unter Verwendung der Cholinoxydase näher erläutert.
Beispiel 1 Quantitative Bestimmung von Cholin
0,5 ml eines Reaktionsgemisches aus Wasserstoffperoxid (0,01 bis 0,05 µMol), Tris-HCl-Puffer (pH 8,0, 22 µMol), 4-Aminoantipyrin (150 µl), Phenol (200 µg), Peroxidase (0,2 E) und Cholinoxydase (0,25 E) wird 25 min bei 37°C inkubiert. Dann gibt man 25 ml Äthanol hinzu und bestimmt die Absorption bei 480 nm zur Bestimmung einer Standardkurve für das Wasserstoffperoxid.
In dem obigen Reaktionsgemisch wird das Wasserstoffperoxid durch Cholinchlorid ersetzt und dann wird die Absorption nach dem gleichen Verfahren zur quantitativen Bestimmung des Cholingehalts durch Vergleich mit der Standardkurve des Wasserstoffperoxids bestimmt.
Beispiel 2
Beispiel 1 wird wiederholt, wobei das Cholin durch Betainaldehyd ersetzt wird und die Reinheit des Betainaldehydreagens bestimmt wird.
Beispiel 3 Quantitative Bestimmung eines Phospholipids
Reaktionsgemisch
0,2 Mol Tris-HCl-Puffer (pH 8,0)|0,15 ml
3 mg/ml 4-Aminoantipyrin 0,50 ml
0,1% Phenol 0,30 ml
1% Triton X-100 0,30 ml
10 mMol CaCl₂ 0,30 ml
15 E/ml Cholinoxydase 0,10 ml
2 E/ml Peroxydase 0,10 ml
12 E/ml Phospholipase D 0,10 ml
destilliertes Wasser 1,15 ml
insgesamt 3,00 ml
Durch Silikagel-Säulenchromatographie gereinigtes Eigelblecithin oder im Handel erhältliches Serum werden mit dem Reaktionsgemisch 20 min bei 37°C inkubiert und dann werden bei 500 nm colorimetrische Messungen durchgeführt. Man erhält die in den Fig. 6 bzw. 7 dargestellten Ergebnisse (Fig. 6: Eigelblecithin; Fig. 7: Handelsserum). Aus den Ergebnissen für das Lecithin in Fig. 6 wird das freigesetzte Cholin in Eigelblecithin mit einer Standardkurve von Wasserstoffperoxid, wie zuvor erläutert, bestimmt, und somit kann die molare Menge an Eigelblecithin durch die Menge an Cholin bestimmt werden. Nach dem gleichen Verfahren kann das Serum-Phospholipid quantitativ bestimmt werden. Die verwendete Phospholipase D wird durch Streptomyces chromfuscus A-0848 gebildet und die verwendete Menge liegt über 0,5 Einheiten, bevorzugt beträgt sie 1 bis 5 Einheiten.
Beispiel 4 Quantitative Bestimmung von Cholinesterase
Reaktionsgemisch
0,2 Mol Tris-HCl-Puffer (pH 8,0)|0,05 ml
3 mg/ml 4-Aminoantipyrin 0,05 ml
0,1% Phenol 0,10 ml
2 E/ml Peroxydase 0,10 ml
20 E/ml Cholinoxydase 0,20 ml
50 mMol Benzoylcholin 0,02 ml
insgesamt 0,52 ml
Zu dem Reaktionsgemisch gibt man in 10facher Verdünnung (physiologische Salzlösung) gesundes Menschenserum und inkubiert 30 min bei 37°C. Nach der Zugabe von 0,2 mMol (3,0 ml) Neostigminlösung (Inhibitor von Cholinesterase) wird das Gemisch 10 min bei Umgebungstemperatur stehengelassen und dann bei 500 nm colorimetrisch gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 8 dargestellt.
Die Serum-Cholinesterase-Aktivität kann durch die Menge an freigesetztem Cholin aus Benzoylcholin in einem Reaktionsgemisch bestimmt werden. Das freigesetzte Cholin wird durch das System aus Cholinoxydase, Peroxydase, 4-Amino­ antipyrin und Phenol bestimmt.
Eine Cholinesterase-Aktivitätseinheit ist als die Aktivität definiert, die einer Enzymmenge entspricht, die in 1,0 ml Serum 2 µMol Wasserstoffperoxid/min bei 37°C frei­ setzt.
Aktivität (E/ml) = Δ A₅₀₀/min×4,8.
Das Gemisch aus Cholinesterase und Benzoylcholin kann durch andere Gemische aus Cholinderivathydrolasen und Cholinderivaten ersetzt werden, und so wird ein quantitatives analytisches System für verschiedene Enzymaktivitäten und Cholinderivate geschaffen.
Bezugsbeispiel Herstellung von Phospholipase D
Ein Medium, das 2% Pepton, 2% Lactose, 0,1% NaCl, 0,05% KH₂PO₄, 0,05% MgSO₄ · 7 H₂O und 0,5% Desform BC-51Y ent­ hält, wird in einem 500 ml Erlenmeyerkolben (20 min bei 120°C sterilisiert) mit Streptomyces chromofuscus A-0848 FERM-P Nr. 3519 inokuliert und 3 Tage bei 26°C gezüchtet. Diese Impfkultur wird in 20 l des gleichen Mediums in einen 20 l Kolbenfermenter gegeben und aerob 2 Tage bei 26°C (300 U/min, 20 l/min) kultiviert. Das Kulturfiltrat zeigt eine Aktivität und 0,5 E/ml. 18 l Kulturfiltrat werden bis auf 3 l konzentriert und 2,4 l Aceton werden zugegeben. Der Niederschlag wird abzentrifugiert. 2 l Aceton werden zu der überstehenden Lösung gegeben und das ausgefallene Material wird gesammelt und anschließend in 500 ml gereinigtem Wasser gelöst. Zu der Lösung gibt man 350 ml Aceton und trennt die ausgefallenen Ver­ unreinigungen ab. 330 ml Aceton werden zu der überstehenden Lösung gegeben, der Niederschlag wird abgetrennt und in 200 ml reinem Wasser gelöst. Zu der Lösung gibt man erneut 200 ml gesättigtes Ammoniumsulfat. Nach dem Isolieren durch Zentrifugieren wird der Niederschlag in gereinigtem Wasser gelöst, durch Sephadex G-25 entsalzt und gefriergetrocknet. Man erhält rohes Pulver aus Phospholipase D (5 E/mg, 700 mg).
In den beigefügten Zeichnungen zeigen:
Fig. 1 Standardkurven für Cholin, Betainaldehyd und Wasserstoffperoxid;
Fig. 2 die pH-Stabilität von Phospholipase D;
Fig. 3 den optimalen pH-Wert von Phospholipase D;
Fig. 4 die Wärmestabilität von Phospholipase D;
Fig. 5 das Dünnschichtchromatogramm der Phospholipase D-Wirkung auf Serum-Phospholipid;
Fig. 6 das Ergebnis der quantitativen Analyse bei Ei­ gelblecithin;
Fig. 7 das Ergebnis der quantitativen Analyse von Serum-Phospholipid; und
Fig. 8 das Ergebnis der quantitativen Analyse bei Menschen­ serum-Cholinesterase.

Claims (14)

1. Verfahren zur Bestimmung von Cholin oder Betainaldehyd, dadurch gekennzeichnet, daß man eine Cholin oder Betainaldehyd enthaltende Probe mit Cholinoxydase behandelt und das freigesetzte Wasser­ stoffperoxyd, das Betain oder den verbrauchten Sauerstoff bestimmt.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man als Probe ein Cholinderivat oder ein Betainaldehydderivat zusammen mit einem Hydro­ lysereagenz dafür verwendet.
3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Cholinderivat ein Phospholipid ist.
4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß das Phospholipid Lecithin, Lysolecithin oder Sphingomyelin ist.
5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Hydrolysereagenz Phospholipase D ist.
6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Phospholipase D ein Enzym ist, das aus der Kultur von Streptomyces chromafuscus A-0848 erhalten wird.
7. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Cholinderivat Benzoylcholin ist.
8. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß das Hydrolysereagenz Cholinesterase ist.
9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung durchgeführt wird, indem man das Wasserstoffperoxid mißt.
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Messung des Wasserstoffperoxids unter Verwendung eines Systems durchgeführt wird, das einen oder mehrere Farbstoffe enthält, die in Abhängigkeit von der Konzentration an Wasserstoffperoxid ihre Farbe ändern.
11. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Bestimmung des Wasserstoffperoxids unter Verwendung von Peroxydase durchgeführt wird.
12. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß der Farbstoff in einer Menge verwendet wird, die, bezogen auf eine Menge von 1 Mol gebildetem Wasserstoffperoxid, einem zweifachen molaren Überschuß entspricht.
13. Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das System 4-Aminoantipyrin, Phenol und Peroxydase enthält.
14. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Probe Phospholipid, Phospholipase D, Cholinoxydase, 4-Aminoantipyrin, Phenol und Peroxydase enthält.
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