DE2924470A1

DE2924470A1 - Lactatoxidase, verfahren zu ihrer herstellung und analytisches verfahren und analysensatz

Info

Publication number: DE2924470A1
Application number: DE19792924470
Authority: DE
Inventors: Saburo Harada; Yoshifumi Horiuchi; Kazuo Matsuura; Hideo Misaki
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1978-06-17
Filing date: 1979-06-18
Publication date: 1980-01-03
Also published as: US4237222A; FR2428648A1; GB2042722A; JPS5576A; GB2025426A; DE2954503A1; GB2042722B; JPS5910190B2; DE2924470C2; CA1130739A; FR2428648B1; GB2025426B

Description

Erfindungsgemäß wird eine neue Enzymlactatoxidase durch Züchten von Pediococcus sp. B-0667, Streptococcus sp. B-0668, Aerococcus viridans IFO-12219 oder Aerococcus viridans IFO-12317 hergestellt. Sie ist für die Analyse von L-Milchsäure nützlich, da sie die Reaktion von L-Milchsäure und Sauerstoff unter Bildung von Brenztraubensäure und Wasserstoffperoxid katalysiert.

Ein Kit bzw. ein Analysensatz, der die verschiedenen Reagentien für eine solche Analyse umfaßt, ist ebenfalls Gegenstand der Erfindung.

Die Erfindung betrifft eine neue Enzymlactatoxidase, ein Verfahren zur Herstellung der Lactatoxidase und ihre Verwendung bei der quantitativen Analyse und einen Satz bzw. ein Kit bzw. ein Besteck für eine solche Analyse.

Lactatoxidase (L-Lactat: Sauerstoffoxidoreductase,-E.C. 1.1.3.2) ist ein bekanntes Enzym, das die Reaktion von Milchsäure und Sauerstoff unter Bildung von Essigsäure, Kohlendioxid und Wasser katalysiert:

CH₃CH(OH)COOH + O₂ ) CH₃COOH + CO₂ + H₂O

und das in der Vergangenheit aus dem Stamm Mycobacterium phlei (E. Bakman, Enzyme Handbook, Bd. 1, S. 111, 1979) und Mycobacterium avium (Nature, 170, 207) erhalten worden ist.

Es wurde nun gefunden, daß eine neue Enzymlactatoxidase die Reaktion von Lactat zu Pyruvat katalysiert und eine stöchiometrische Menge von Wasserstoffperoxid erzeugt. Das Enzym kann durch Züchtung von Bakterienstämmen, die zum Genus Pediococcus, Genus Streptococcus und Genus Aerococcus gehören, erzeugt werden.

Die neue erfindungsgemäße Enzymlactatoxidase besitzt wesentlich andere Eigenschaften als das obige bekannte Enzym und sie weist

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die folgende Substratspezifizität und Enzymwirkung auf;

Substratspezifizität: L-Milchsäure Enzymwirkung: katalysiert die folgende Reaktion (I):

CH₃CH(OH)COOH + O₃ > CH₃COCOOH + H₃O₂ (I)

L-Milchsäure Brenztraubensäure

Optimaler pH: etwa 6 bis 7
Optimale Temperatur: etwa 35⁰C

Iso'elektrischer Punkt: pH 4,6 +_ 0,3 (bestimmt durch Elektrophorese unter Verwendung eines Trägerampholiten) Molekulargewicht: 80 000 +_ 10 000 (Gelfiltrationsverfahren unter Verwendung von Sephadex G-150; Warenzeichen)

Das Enzym erfordert nicht die Zugabe von Coenzymen bei seiner Reaktion und es katalysiert direkt die Reaktion der Substratmilchsäure mit Sauerstoff durch Oxidation von 1 Mol Milchsäure zu Pyruvat und unter Bildung von 1 Mol Wasserstoffperoxid.

Die neuen Enzymlactatoxidase liefernden Bakterienstämme werden bezeichnet als Pediococcus sp. B-0667 und Streptococcus sp. B-0668, Diese Stämme wurden aus einer Bodenprobe isoliert, die in einem Rettichfeld in Ohito-cho, Tagata (Japan) gesammelt wurde.

Die oben erwähnten isolierten Stämme B-0667 und B-0668 besitzen die folgenden taxonomischen Eigenschaften:

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A. Beobachtungen auf verschiedenen Medien, Züchtung bei 30°C während 2 Tagen

	Stamm B-0667	Stamm B-0668
Tryptosoj abrühe	Schwaches Wachstum, homogen trüb, später wolleartige Präzipitation	Schwaches Wachstum, homogen trüb, später wolleartige Präzipitation
Tryptosoj aagar- schrägkultur	Schwaches Wachstum, schwach gelb lich, grau, kein Glanz, keine Bil dung von löslichem Pigment	Schwaches Wachstum, schwach gelb lich, grau, kein Glanz, keine Bil·- dung von löslichem Pigment
Tryptosojaagar- platte	Kolonie, klein und flach	Kolonie, klein und flach
Gelatinestich	Wachstum längs des ausgestochenen Randes, keine Gelatineverflüssi gung	Wachstum längs des ausgestochenen Randes,keine Gelatineverflüssfcjung
BCP Milch (14 Tg.)	keine Änderung	keine Änderung

■·-- 7 -

B. Mikroskopische Beobachtung

	Stamm B-0667	Stamm B-0668
Form	kugelförmig, eiförmig.	kugelförmig, eiförmig,
	Paare, 4-formige oder	Paare, 4-formige oder
	kurze Kette	kurze Kette
Größe	0,5-1,0 χ 0,5-1,0 μ	0,8-1,0 χ 1,0-1,2 μ
Motilität	-	-
Sporen	-	-
Gram¹sehe Ver färbung	+	+
Säurebeständigkeit Verfleckung	—	—

C. Physiologische Eigenschaften

	OF-Test	Stamm B-0667	Stamm B-0668
Wachstumsfempera-	Verhalten in Sau
tur 45⁰C	erstoff	-	-
37°C	Nitratreduktion	+	+
30⁰C	Indolbildung	+	+
26°C	Hydrogensulfat-	+	+
10⁰C	bildung	+	+
5°C	+ oder (+)	+_ oder (+)
Halogentoleranz
NaCl 10 %	+	-
6,5 %	+	-
5,0 %	+	+
1,0 %	+	+
0 %	+	-
fermentativ	fermentativ
fakultativ anaerob	fakultativ anaerob

-	-
-	-
-	-

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	Stamm B-0667	Stamm B-0668
Gelatinehydrolyse	-	-
S tärkehydrοIy s e	-	-
Äsculinhydrolyse	+	+
Acetoinbildung	-	-
MR-Test	-	-
Catalase	-	-
Oxidase	-	-
Urease (SSR)	-	-
Urease (Christen-	-	-
sen)
Verwendung von	-	-
Z itronensäure
(Christensen)
Säurebildung aus
Zucker
Adonit	-	-
L (+)-Arabinose	-	-
Cellobiose	+	+
Dulcit	-	—
Mesoerythrit	-	-
Fructose	+	+
Fucose	-	-
Galactose	+	+
Glucose	+	+
Glycerin	-	-
Inosit	-	-
Inulin	-	-
Lactose	+	+
Maltose	μ	+
Mannit	+	-
Mannose	+	+
Melezitose	-	-
Melibiose	+	-
Raffinose	+	-
L(+)-Rhamnose	-	-

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— 9 —	Stamm B-0667	2924470	-	-
Salicin (+)	Stamm B-0668	-
L-Sorbose -	- -
Sorbit	+
Stärke -	+
Saccharose +	-
Trehalose +	+
Xylose -
Toleranz bei 60⁰C -
für 30 Min.

Aus "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology" 8. Ausgabe, 1974, und S. T. Cowan und K. J. Steel "Manual for the Identification of Medical Bacteria" Cambridge Press, 1974, folgt, daß die Stämme B-0667 und B-0668, die die oben aufgeführten taxonomischen Eigenschaften aufweisen, insbesondere gram-positiv cocci, Catalase und Oxidase negativ, fermentative Säurebildung aus Glucose und keine Gasbildung aus Zucker (Glucose) zu dem Genus. Pediococcus und Genus Streptococcus gehören.

Ein Vergleich dieser Stämme mit dem Identifizierungsmanual der obigen Literaturstelle ist wie folgt:

In der Tabelle: + = mehr als 85% positiv

- = mehr als 85% negativ d = variiert unter den Stämmen oder Spezies

	Stamm B-0667	Stamm B-0668	genus Pediococcus	genus Streptococcus
Wachstum bei 45⁰C Toleranz bei 60⁰C während 30 Min. Glycerin (Säure bildung) Arabinose (Säure bildung) Halogentoleranz (NaCl 10%)	It I I +	Il I +1	+ + +	d d d d

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Der Stamm B-0667 wird somit als Genus Pediococcus oder Streptococcus bezeichnet. Aus dem obigen "Manual for the Identification of Medical Bacteria" und J. Gen. Microbiol., 2£, 185-197 (1961) folgt, daß die taxonomischen Eigenschaften des Stammes B-0667 fast identisch sind mit denen von Pediococcus urina-equi, jedoch unterscheiden sich die in "Bergey's Manual of Determinative Bacteriology" 8. Ausgabe, 1974 beschriebenen Eigenschaften etwas davon. Der Stamm B-0667 wird daher als Genus Pediococcus angesehen und als Pediococcus sp. B-0667 bezeichnet.

Der Stamm B-0668 ähnelt dem Genus Streptococcus anstelle des Genus Pediococcus. Aus "Manual for the Identification of Medical Bacteria" folgt, daß der Stamm B-0668 Streptococcus faecium var. durans ähnelt, doch werden keine taxonomischen Eigenschaften in "Bergey's Manual" beschrieben und es ist daher unmöglich, einen genauen Vergleich durchzuführen. Der Stamm B-0668 wird daher als Streptococcus sp. B-0668 bezeichnet.

Die Stämme B-0667 und B-0668 wurden in der Dauerhinterlegungsstelle des Institute for Microbial Industry and Technology, Agency of Industrial Science and Technology, M.I.T.I. Japan, unter den Nr. FERM-P No. 4438 bzw. FERM-P No. 4439 hinterlegt. IFO-12219 und IFO-12317 wurden in dem Institute for Fermentation, Osaka, Japan unter diesen Nummern hinterlegt.

Der Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, eine neue Enzymlactatoxidase zur Verfügung zu stellen, die mindestens eine Substratspezifizität für Milchsäure aufweist und die Reaktion der Formel (I):

L-Milchsäure + O₂ > Brenztraubensäure + H₃O₂ (I)

katalysiert.

Erfindungsgemäß soll ein Verfahren für die Herstellung der neuen Enzymlactatoxidase zur Verfügung gestellt werden, das dadurch gekennzeichnet ist, daß man einen Lactatoxidase erzeugenden Mikro-

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Organismus, der zum Genus Pediococcus, Streptococcus oder Aerococcus gehört, in einem Nährkulturmedium züchtet und die so gebildete Lactatoxidase aus dem Kulturmedium isoliert.

Erfindungsgemäß soll weiterhin ein Kit bzw. Satz bzw. Besteck bzw. Analysensatz (im folgenden wird der Einfachheit halber der Ausdruck "Satz" verwendet) für die quantitative Analyse zur Verfügung gestellt werden. Insbesondere soll ein Reaktionssystem zur Verfügung gestellt werden, das Lactatoxidase enthält.

Erfindungsgemäß soll ein analytisches Verfahren für die Bestimmung von Milchsäure in einer Milchsäure enthaltenden Probe oder einem Milchsäure freisetzenden System zur Verfügung gestellt werden, wobei das Verfahren die Behandlung der Probe mit dem Reaktionssystem, das Lactatoxidase enthält, und die Bestimmung der verbrauchten Komponente oder der erzeugten Komponente einschließt.

Anhand der beigefügten Zeichnungen wird die Erfindung näher erläutert.

Fig. 1 zeigt den optimalen pH-Wert der erfindungsgemäßen Lactase, Fig. 2 zeigt die optimale Temperatur der Lactatoxidase, Fig. 3 zeigt die pH-Stabilität der Lactatoxidase, Fig. 4 zeigt die Wärraestabilität der Lactatoxidase, Fig. 5 zeigt das elektrophoretische Muster der Lactatoxidase, Fig. 6 zeigt das Ergebnis bei der Bestimmung von Wasserstoffperoxid bei einem Bestätigungstest der Wasserstoffperoxidbildung durch die Lactatoxidase, wobei die Standardkurve von ο—ο : L-Milchsäure als Substrat, m—» :

DL-Milchsäure als Substrat, und δ—δ : Substrat durch Wasserstoffperoxid ersetzt ist,

Fig. 7 zeigt das Ergebnis der quantitativen Analyse von Brenztraubensäure bei einem Bestätigungstest der Brenztraubensäurebildung durch Lactatoxidase, worin die Standardkurve β—ο : L-Milchsäure als Substrat, ·—· : DL-Milchsäure als Substrat und δ—& s Substrat durch Wasserstoffperoxid ersetzt ist,

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Fig. 8 zeigt die Ergebnisse der quantitativen Analyse von Serummilchsäure unter Verwendung von Lactatoxidase, worin ο—ο α DL-Milchsäure, die als Substrat verwendet-.wird, ·_· :

Wasserstoffperoxid,4—^: Menschenserum und a i: Menschen-

serum mit Zugabe von DL-Milchsäure bedeuten.

Gemäß einer erfindungsgemäßen Ausführungsform werden Pediococcus sp. B-0667, Streptococcus sp. B-0668, Aerococcus viridans IFO-12219 oder Aerococcus viridans IFO-12317 in einem üblichen Medium für die Enzymbildung gezüchtet. Die Züchtung kann unter Verwendung einer üblichen Flüssigkeitskultur durchgeführt werden. Eine submerse Belüftungskultur ist zur industriellen Erzeugung bevorzugt. Für die Züchtung der Mikroorganismen wird bevorzugt ein übliches Medium verwendet.

Als Kohlenstoffquellen werden bevorzugt assimilierbare Kohlenstoff quellen, wie Glucose, Saccharose, Lactose, Maltose, Fructose, Melassen o.a. verwendet. Als assimilierbare Stickstoffquellen werden bevorzugt Pepton, Polypepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Caseinhydrolysat o.a. verwendet. Verschiedene anorganische Salze, wie Phosphate, Carbonate, Sulfate, Salze von Magnesium, Calcium, Kalium, Natrium, zweiwertiges Eisen, Mangan oder Zink können verwendet werden.

Die Kulturtemperatur kann innerhalb des Bereichs für das Wachstum von Mikrobenzellen und die Bildung von Lactatoxidase ausgewählt werden und beträgt bevorzugt 25-37⁰C. Die Kulturzeit kann variiert werden, abhängig von den Bedingungen, und sie wird beendigt, wenn die Lactatoxidaseproduktion im wesentlichen beendigt ist. Sie beträgt normalerweise 10-40 Std.

Zur Abtrennung der Lactatoxidase aus der Kultur wird die Kulturmasse, um die Zellen zu sammeln, filtriert oder zentrifugiert; diese werden durch Behandlung mit mechanischen Einrichtungen oder mit Enzymen, wie Lysozym, auseinandergerissen bzw. zerstört. Sofern erforderlich, wird die Lactatoxidase durch Zugabe von Ä'thylen-diamintetraessigsäure (EDTA) und einem oberflächenaktiven Mittel, wie Triton X-100 (Warenzeichen) oder Adecatol SO-120 (Warenzeichen) zur Abtrennung des Enzyms solu-

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bilisiert. Die so erhaltene Lösung aus Lactatoxidase wird mit oder ohne Konzentrierung weiter aufbereitet und danach wird das Enzym durch Aussalzen durch Zugabe löslicher Salze, wie Ammoniumsulfat, ausgefällt oder es wird durch Zugabe von mit Wasser mischbaren organischen Lösungsmitteln, wie Methanol, Äthanol, Aceton oder Isopropanol, ausgefällt. Verunreinigungen mit niedrigem Molekulargewicht werden durch Dialyse entfernt. Die Reinigung der Lactatoxidase erfolgt bevorzugt durch Adsorptionschromatographie oder Gelfiltration. Die so erhaltene Enzymlösung wird durch Vakuumkonzentration, Ultrafiltrationkonzentration und Lyophilisierung unter Bildung gepulverter Lactatoxidase behandelt.

Die erfindungsgemäße Lactatoxidase wird anschließend analysiert. Sie besitzt die folgenden physico-chemischen Eigenschaften:

1. Analyseverfahren Reaktionszeit (1,0 ml)

0,2M Dimethylglutarat-NaOH-Puffer (pH 6,5) 0,2 ml

0,5 mM L-Milchsäure 0,1 ml

0,2% (G/V) N,N-Dimethylanilin 0,2 ml

0,2% (G/V) 4-Aminoantipyrin 0,1 ml

45 U/ml Peroxidaselösung 0,1 ml

destilliertes Wasser 0,3 ml

Zu 1,0 ml des obigen Reaktionsgemisches gibt man Lactatoxidaselösung (10 μΐ) und inkubiert bei 37⁰C während 10 Min. 0,5 ml einer 1%igen (Gew./Vol.) Cation FB-500 (Warenzeichen) oberflächenaktives Mittel wird zur Beendigung der Reaktion zugegeben. Anschließend gibt man 1,5 ml destilliertes Wasser zu. Die entstandene Farbe wird durch colorimetrisches Verfahren bei 565 nm gemessen.

Eine Einheit (1 Einheit, 1 U) Enzymaktivität wird als die Aktivität definiert, die 1 μΜοΙ Wasserstoffperoxid pro Minute erzeugt. Die Aktivität wird durch die folgende Gleichung berechnet:

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Enzymaktivität (U/ml) = (/^ A₅₆₅AnXn) χ 15,5

worin /\ ,-,-c die Absorptionsänderung bei 565 nm pro Minute bedeutet.

2. Substratspezifizität

Im obigen Analysenverfahren wird die Milchsäure in dem Reaktionsgemisch durch die folgenden Substanzen zur Bestimmung der Substratspezifizxtät .der Lactatoxidase ersetzt. Die Ergebnisse sind als relative Aktivität für Milchsäure angegeben.

Substrat ' Relative Aktivität (%)

L-Milchsäure 100 Brenztraubensäure 0

DL-tt-Alanin 0

Bernsteinsäure 0

Maleinsäure 0

L-Ascorbinsäure 0

DL-Serin 0

Dihydroxyaceton 2,7

DL-Glycerinsäure 0

Wie oben gezeigt wurde, besitzt die Enzymlactatoxidase eine hohe Spezifizität für L-Milchsäure.

3. Enzymreaktion

Das Enzym katalysiert die Oxidationsreaktion von Milchsäure und Sauerstoff unter Bildung von Brenztraubensäure und Wasserstoffperoxid.

CH₃CH(OH)COOH + O₂ ) CH₃COCOOH + H₂O₂

4. Optimaler pH

Der Einfluß des pH auf die Lactatoxidaseaktivität wird durch Analyse der Enzymaktivität an Milchsäure 40 mM Acetatpuffer (pH 4 bis 4,5), 40 mM Dimethylgutarat-NaOH-Puffer (pH 4 bis 8, 40 mM Phosphatpuffer (pH 6,3 bis 8), 40 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7 bis 9) und 40 mM Glycinpuffer (pH 9 bis 10) bestimmt. Die Ergebnisse sind in

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Fig. 1 dargestellt, aus der folgt, daß der optimale pH-Wert 6 bis 7 beträgt.

5. Optimale Temperatur

Die Lactatoxidaseaktivität auf Milchsäure wird entsprechend dem zuvor beschriebenen AnaIysenverfahren gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 dargestellt, wobei die optimale Temperatur etwa 35°C beträgt.

6. Isoelektrischer Punkt

pH 4,6 _+ 0,3 (bestimmt durch Elektrophorese unter Verwendung eines Trägerampholiten)

7. Molekulargewicht

80 000 _+ 10 000 (bestimmt durch Gelfiltrationsverfahren unter Verwendung von Sephadex G-150; Warenzeichen der Pharmacia Co.). 40 000 _+ 5 000 (bestimmt durch SBS-Polyacrylamidelektrophorese)

Diese Werte lassen vermuten, daß das erfindungsgemäße Enzym ein Dimeres ist.

8. pH-Stabilität

Zu Lactatoxidase (5 μg Protein) gibt man 0,1 ml 0,1M Dimethylglutarat-NaOH-Puffer für pH 4 bis 7, 0,1 ml 0,1M Phosphatpuffer für pH 6,3 bis 8 oder 0,1 ml 0,1M Tris-HCl-Puffer für pH 7 bis

9. läßt bei 50⁰C während 10 Min. stehen und kühlt in Eis. 10 μΐ Enzymlösung werden entnommen und die Enzymaktivität wird bestimmt. Wie aus Fig. 3 folgt, ist das Enzym bei pH 6,8 bis 8,5 stabil.

9. Wärmestabilität

Die Wärmestabilität des Enzyms wird bestimmt, indem man in 0,1M Phosphatpuffer (pH 7,0, 0,1 ml), der die Enzymlactatoxidase enthält (Enzymprotein 5 pg),bei jeder Temperatur von 0 bis 80⁰C während 10 Min. inkubiert und in Eis kühlt. 10 μΐ Enzymlösung werden entnommen und dann wird die Lactatoxidaseaktivität entsprechend dem zuvor beschriebenen Verfahren bestimmt. Wie aus

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Fig. 4 folgt, ist das Enzym unter 4 0⁰C stabil und die Aktivität geht über 40⁰C schnell verloren.

10. Einfluß auf verschiedene Substanzen

Dor Einfluß auf verschiedene Substanzen der Enzymaktivität wird bestimmt, indem man die im folgenden aufgeführte} Substanz zugibt, nie Zugabemenge beträgt 10 mM für Metallsalz und EDTA, 0,1i (Gew./ Vol.) für oberflächenaktives Mittel und 0,05 mM für p-Chlormercui ibenzoat (PCMB), 10 μΜ für Flavinadenindinucleotid (F/iD) , 0,1 mM iiii Fl avininononucleotid (FMN) und Riboflavin.

Zugegeben e Subs taη ζ keine Zugabe MnC 1 ₂ MgCl₂ CaCl₂ CoCl ₂

FeCl₃ EDTA

PCMB

Riboflavin

Natriumlaurylbenzolsulfonat Natriumdodecylsulfat Adekatol Sü-120 (Warenzeichen) Triton X-100 (Warenzeichen) Bridge-35 (Warenzeichen) Cetyltetraammoniumbromid Cation FB-500 (Warenzeichen) Cation DT-205 (Warenzeichen)

Relative Aktivität (-, ) 100,0

97,4 101,7 105,5 9 5,7

95,3 8,12

98,0

89,7 101,3 94 ,0 90,4 21,5 1*8

102,8 107,2 98,2

10,8 3,7

88,6

11. Elektrophorese

Die Polyacrylamidscheiben- Elektrophorese wurden unter Verwendung von Polyacrylamid-Gel (pH 7,5) und Tris-Barbitalpuffer (pH 7,15) bei einem konstanten Strom (4 mA/gel.) durchgeführt. Wie aus Fig.

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5 folgt, ist das elektrophoretisch gewonnene Gel, das durch Amido schwarz gefärbt wurde, eine einzige dunkelblaue Bande, die die Enzymlactatoxidase als einziges Protein zeigt.

12. Art der Enzymwirkung

Bei dem erfindungsgemäßen Lactatoxidase-Analysenverfahren bzw. -Assayverfahren wird das folgende Reaktionsgemisch verwendet:

DL-Milchsäure oder L-Milchsäure 0 bis 0,4 μΜοΙ

Dimethylgutarat-NaOH-Puffer (pH 6,5) 4 0 μΜοΙ

4-Aminoantipyrin 300 ^g

N,N-Dimethylanilin 200 ng

Peroxidase 4,5 U

Lactatoxidase (200 U/mg) 2 U

1,0 ml des obigen Reaktionsgemisches werden bei 37⁰C während 10 Min. inkubiert. Danach werden 0,5 ml einer 1%igen (Gew./Vol.) Cation FB-500 (Warenzeichen)-Lösung und 1,5 ml destilliertes Wasser zugegeben. Die entstandene Farbe wird nach einem colorimetrischen Verfahren bei 565 nm bestimmt.

Die Standardkurve wird hergestellt, indem man Wasserstoffperoxid anstelle von Milchsäure zugibt.

Wie aus Fig. 6 folgt, worin «—° die L-Milchsüure, die als Substrat verwendet wurde, bedeutet,·-* die D-Milchsäure, die als Substrat verwendet wurde, bedeutet und a—Adas Wasserstoffperoxid, das anstelle des Substrats verwendet wird, bedeutet, katalysiert die erfindungsgemäße Enzymlactatoxidase die Reaktion, bei der 1 Mol L-Milchsäure gebildet wird.

Weiterhin wird der Sauerstoffverbrauch mit einer Sauerstoffelektrode (YSI-Lösungssauerstoffmeter) gemessen und 1 Mol Sauerstoff wird bei der Oxidation von 1 Mol Milchsäure verbraucht.

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Brenztraubensäure wird nach dem folgenden Verfahren nachgewiesen.

1,0 ml Reaktionsgemisch, das Dimethylglutarat-NaOH-Puffer (40 μΜοΙ), Catalase (400 μg), L-Milchsäure oder DL-Milchsäure (0 bis 0,5 μΜοΙ) und Lactatoxidase (2 U) enthält, wird bei 37°C während 10 Min. inkubiert· Das Reaktionsgemisch wird in kochendem Wasser während 5 Min. zur Beendigung der Reaktion erhitzt. Nach dem Kühlen mit Eis werden 0,1 ml 1OmM NADH₂ und 1,9 ml destilliertes Wasser zugegeben und dann wird das denaturierte Protein durch Zentrifugieren entfernt. Die überstehende Lösung (2,5 ml) wird in eine Quartzzelle gestellt, bei 37°C preinkubiert, dann wird Lactatdehydrogenase (20 U, Rinderleber, Boehringer Mannheim GmbH)-Lösung (5 ml) zugegeben, dann wird bei 37⁰C während 5 Min. inkubiert und nach dem colorimetrischen Verfahren bei 34 0 nm gemessen. Die Standardkurve wird hergestellt, indem man Brenztraubensäure anstelle von L-Milchsäure zugibt.

Wie aus Fig. 7 folgt, worin p~-o die als Substrat verwendete Milchsäure bedeutet,·—· die als Substrat verwendete DL-Milchsäure bedeutet, undA-zi Brenztraubensäure bedeutet, wird Brenztraubensäure anstelle des Substrats verwendet.

1,0 ml des obigen Reaktionsgemisches werden bei 37⁰C während 10 Min. inkubiert und die so gebildete (^ -Ketosäure wird nach dem Hydrazinverfahren unter Verwendung von 2,4-Dinitrophenylhydrazin gemessen. 1 Mol (/■ -Ketosäure wird aus 1 Mol L-Milchsäure gebildet. Die erfindungsgemäße Enzymlactatoxidase wirkt auf L-Milchsäure und katalysiert die Reaktion, bei der 1 Mol Brenztraubensäure gebildet und 1 Mol Sauerstoff verbraucht wird.

Wie zuvor erläutert wurde, wirkt die erfindungsgemäße Enzymlactatoxidase direkt auf Milchsäure zusammen mit Sauerstoff und erfordert kein (.oenzyni bei der Oxidation von L-Milchsäure und Bildung von Brenztraubensäure und Wasserstoffperoxid. Die physico-chemi- £>fhe;n I; iqenschaf t en den erf i ndunysgeinäßen Enzyms .sowie der isoelektrisch.-Punkt von fll ■!,(., d,n; Molekül arcjewicht ν >n 80 000 +

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oxidase an. Hieraus folgt, daß die erfindungsgemäße Lactatoxidase ein neues Enzym ist.

Bei dem obigen Bestätigungstest für die Art der Wirkung der Lactatoxidase ist die quantitative Analyse des freigesetzten Wasserstoffperoxids, Pyruvats und des verbrauchten Sauerstoffs ein Beispiel für die L-Milchsäureanalyse. Es wurde weiterhin gefunden, daß die Lactatoxidase für ein neues, quantitatives, analytisches Verfahren von L-Milchsäure verwendet werden kann, bei dem das erzeugte Wasserstoffperoxid und die Brenztraubensäure und der verbrauchte Sauerstoff und ein Analysensatz für die Milchsäureanalyse verwendet werden. Das neue analytische Verfahren für L-Milchsäure und der Analysensatz für die L-Milchsäureanalyse können für die Bestimmung der Reinheit eines Milchsäurereagens, der quantitativen Bestimmung der Milchsäure im Serum, die Analyse von Milchsäurederivaten, die bei ihrer Zersetzung Milchsäure freisetzen, und für die Aktivität eines Enzyms, das Milchsäure freisetzt, verwendet werden. Die Erfindung betrifft weiterhin einen Analysensatz für solche Analysen.

Gegenstand der Erfindung ist weiterhin ein analytisches Verfahren für die Bestimmung der Milchsäure in einer Probe, bei dem man Lactatoxidase in einer Milchsäure enthaltenden Probe inkubiert und das so erzeugte Wasserstoffperoxid,

und die gebildete Brenztraubensäure

oder den verbrauchten Sauerstoff mißt. Die Erfindung betrifft außerdem einen Kit bzw. einen Analysensatz für die Milchsäureanalyse in einer Probe, der ein Reaktionssystem umfaßt, das mindestens Lactatoxidase enthält.

Irgendwelche Proben, die Milchsäure als Substrat für die Lactatoxidase enthalten, können analysiert werden. Beispielsweise können Milchsäureproben Medikamente, die Lactat, wie Calciumlactat und Eisen(II)lactat enthalten, in Milchsäure im Serum Milchsäurefermentationsprodukte von Milchsäurebakterien, wie Lactobacillus plantarum und Pediococcus lindneri, verwendet werden. Die quantitative Analyse von Brenztraubensäure in einerFtobe. kann durchgeführt werden durch Milchsäurebildung durch Umsetzung mit Brenz-

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traubensäure und Lactatdehydrogenase. Weiterhin können erwähnt werden Enzymaktivitätassay und die quantitative Analyse von Lactatdehydrogenase. Diese Proben können in einem wässrigen Medium, bevorzugt in einer Pufferlösung von pH 6 bis 7, analysiert werden.

Der Gehalt an Lactatoxidase kann für eine wesentliche Enzymreaktion, bei der die Milchsäure in der Probe oxidiert wird, ausgewählt werden. Beispielsweise werden bevorzugt zwei Einheiten Lactatoxidase verwendet. Das Enzym kann selbst oder in Pufferlösung oder in lyophilisierter Form verwendet werden. Die Lactatoxidase kann in mikroeingekapselter Form oder in immobilisierter Form mit kovalenter Bindung mit einem organischen oder anorganischen Träger oder an einem Träger adsorbiert vorliegen.

Die Analyse erfolgt durch Inkubieren mit einer Probe und der Lactatoxidase. Die Inkubationszeit und Temperatur können bis zu einer wesentlichen Enzymreaktion ausgewählt werden, vorzugsweise 5 bis 30 Min. bei 35 bis 37⁰C. Als Folge werden Wasserstoffperoxid und Brenztraubensäure in der Probe erzeugt und Sauerstoff wird verbraucht. Das Wasserstoffperoxid, die Brenztraubensäure oder der Sauerstoff werden bestimmt.

Der Sauerstoff kann am einfachsten mit einer Sauerstoffelektrode gemessen werden. Die Brenztraubensäure kann bestimmt werden, indem man das Lactatdehydrogenaseverfahren oder das Hydrationsverfahren verwendet. Die Brenztraubensäure kann weiterhin mit einem Reaktionsgemisch analysiert werden, das ein spezifisches Enzym für Pyruvat, wie Pyruvatoxidase (150 U/ ml, 20 μΐ), 10 mM Thiaminpyrophosphat (20 μΐ), 1 mM FAD (10 μΐ), 10 HiMMnCl₂ (50 μΐ), Peroxidase (45 U/ml, 0,1 ml), 0,2% N,N-Dimethylanilin (0,2 ml), 0,3% 4-Aminoantipyrin (0,1 ml) und 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,5^,1 ml) enthält.

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Das Wasserstoffperoxid kann mit einer Wasserstoffperoxidelektrode oder nach einem colorimetrischen Verfahren bestimmt werden, das ein Indikatorsystem aus einem oder mehreren Chromogenen, die durch Kuppeln mit Wasserstoffperoxid reagieren, umfaßt. Beispiele solcher Indikatoren sind Kombinationen aus 4-wertigen Titanverbindungen und Xylenolorange, das mit Wasserstoffperoxid unter Bildung einer stabilen roten Farbe kuppelt, oder einer Kombination aus Phenol oder Ν,Ν-Dxmethylanilin, 4-Aminoantipyrin und Peroxidase, wobei die Verfärbung gemessen wird. - In dem Reaktionssystem aus Phenol oder N,N-Dimethylanilin, 4-Aminoantipyrin und Peroxidase beträgt die Menge an Phenol oder Ν,Ν-Dimethylanilin etwa 0,005 bis 0,05% und die Menge an 4-Aminoantipyrin mehr als das Äquimolare, bevorzugt der 2-molare Überschuß an dem gebildeten Wasserstoffperoxid und die Menge an Peroxidase kann über 1 U liegen. Der so hergestellte Indikator kann gegebenenfalls mit Lactatoxidase zusammen hergestellt werden oder eine Menge von 0*01 bis 1 mM PCMB kann zugegeben werden. Die so gebildete Farbe wird colorimetrisch mit einer geeigneten Wellenlänge bestimmt und das erzeugte Wasserstoffperoxid kann durch Kalkulation aus der entsprechenden Standardkurve bestimmt werden. Die Zugabe von PCMB ist für die Stabilisierung der Farbe bei der Serumanalyse wirksam.

Das analytische Verfahren, bei dem die erfindungsgemäß hergestellte, neue Lactatoxidase und ein Analysensatz verwendet werden, kann mit Vorteil für die quantitative Analyse von Milchsäure in Serum, als Reinheitstest für Milchsäurereagentien,für die quantitative Analyse von Milchsäure bei der Milchsäurefermentierung für die Analyse von Enzymen, die auf Milchsäure als Substrat wirken,verwendet werden, indem man das gebildete Wasserstoffperoxid, die gebildete Brenztraubensäure oder den verbrauchten Sauerstoff mißt.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung. In den Beispielen sind alle Prozentgehalte als Gew./Vol.% angegeben.

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Beispiel 1

Vier Proben von Kulturmedium (je 100 ml, pH 7),enthaltend Glucose (2%), Pepton (1%), Hefeextrakt (0,5%), NaCl (0,2%), KH₃PO₄ (0,1%), K₂HPO₄ (0,1%), MgSO₄7H₂O (0,05%) und CaCO₃ (0,3%), werden in einem Erlenmeyer-Kolben bei 120⁰C während 20 Min. sterilisiert. Jedes Medium wird mit einem Stamm von Pediococcus sp. B-0667 FERM-P No. 4438, Streptococcus sp. B-0668 FERM-P No. 4439, Aerococcus viridans IFO-12219 bzw. Aerococcus viridans IFO-12317 inokuliert und dann wird bei 30⁰C während 15 Std. mit 300 Rpm. unter Schütteln gezüchtet. Anschließend werden die gezüchteten Zellen abzentrifugiert, mit 10 mM Phosphatpiiffer (pH 6,5) gewaschen und dann wird erneut zentrifugiert. Die Bakterienzellen werden gesammelt. Die so erhaltenen Zellen werden in 10 mM Phosphatpuffer (10 ml, pH 8,0), enthaltend 0,02% Lysozym und 0,1% Triton X-100, suspendiert und dann wird bei 37⁰C während 60 Min. inkubiert. Das überstehende Material, das durch Zentrifugieren erhalten wird und das Lactatoxidase enthält, wird gesammelt. Die Enzymaktivität des überstehenden Materials ist in der folgenden Tabelle angegeben:

Stamm Enzymaktivität (U/ml)

B-0667 0,24

B-0668 0,31

IFO-12219 0,42

IFO-12317 0,43

Beispiel 2

20 1 eines Mediums, das die gleichen Komponenten, wie in Beispiel 1 beschrieben, enthält, werden in ein 30 1-Fermentationsstandgefäß gegeben. Dann gibt man Disform BC-51Y (Warenzeichen) bis zu einer Konzentration von 0,1% zu und sterilisiert mit Dampf. Bei 200 ml Kulturbrühe von Pediococcus sp. B-0667 FERM-P No. 4438, auf gleiche Weise, wie in Beispiel 1 beschrieben, gezüchtet, werden zugegeben und dann wird bei 30⁰C während 15 Std. gezüchtet. Die Bakterienzellen werden durch Abzentrifugieren gesammelt (etwa 400 g), in einer Lysozymlösung (0,2 mg/ml, 4 1) wieder suspendiert, und dann

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wird Triton X-100 (Warenzeichen, 4g), EDTA (3 g) und 1 M Phosphatpuffer (pH 8, 40 ml) zugegeben. Dap Gemisch wird bei 37⁰C während 60 Min. zur Zerstörung der Zellen gerührt. Zu der überstehenden, beim Zentrifugieren erhaltenen Lösung (3,7 1, 5200 U) gibt man 1,48 1 Aceton und die ausgefallenen Verunreinigungen werden abzentrifugiert. Zu der überstehenden Lösung gibt man bis zu 65%iger Konzentration Aceton. Der beim Zentrifugieren bei 5000 Rpm während 10 Min. erhaltene Niederschlag wird in 10 mM Shosphatpuffer (pH 7, 400 ml) gelöst und der unreine Niederschlag wird durch Zentrifugieren abgetrennt. 470 ml gesättigtes Ammoniumsulfat" werden zugegeben und dann wird 20 Min. gerührt. Der Niederschlag, der durch Zentrifugieren bei 12 000 Rpm während 10 Min. erhalten wurde, wird in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7, 100 ml) gelöst. Die Lösung wird gegenüber 10 mM Phosphatpuffer über Nacht dialysiert und durch eine Säule (2,6 χ 50 cm) aus DEAE-Cellulose, gepuffert bei pH 7, zur Absorption des Enzyms geleitet und dann wird stufenweise eluiert mit einer Ionengradientenstärke von 0,1 bis 0,6 M KCl. Die Fraktionen, äie bei etwa 0,5 M KCl ablaufen, werden gesammelt und sie enthalten die aktive Enzymfraktion (140 ml).

Zu der Lösung gibt man gesättigtes Ammoniumsulfat (185 ml) und der Niederschlag wird abzentrifugiert. Zu der überstehenden Lösung wird gesättigte. Ammoniumsulfatlösung (145 ml) gegeben und der Niederschlag wird abzentrifugiert.

Nach dem Auflösen des Niederschlags in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0, 50 ml) und Dialyse zum Entsalzen wird die Lösung auf eine Säule DEAE-Sephadex A-50 (Warenzeichen) (2,6 χ 50 cm), die mit 10 mM Phosphatpuffer gepuffert ist, zur Absorption des Enzyms gegeben und dann wird die Fraktion durch Gradientenelution mit einer lonenstärke von 0,2 bis 0,6 M KCl chromatographiert. Die Fraktionen, die mit 0,5 M KCl abfließen, werden gesammelt (160 Bl). Anschließend wird zur Entsalzung dialysiert und dann wird lyophilisiert. Das lyophilisierte Pulver wird in einem Gemisch aus 10 M Phosphatpuffer (pH 7,0, 5 ml) und 0,1 M KCl gelöst und an einer Säule aus Sephadex G-150 (Warenzeichen) (2,5 χ 73 cm, Strömungsrate 8 ml/min., 5,2 ml/Fraktion) chromatographiert.Die

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aktiven Fraktionen Nr. 27 bis 35 werden gesammelt, durch Dialyse entsalzt und lyophilisiert. Das lyöphilisierte Enzym zeigt eine einzige Bande bei der Elektrophorese, wie zuvor erläutert. Das Reinigungsschema ist wie folgt:

	Gesamt- protein (mg)	Gesamt- aktivit. (U)	Spezifische Aktivität (U/mg)
Zellenextrakt	34040	5200	0,028
Acetonprecipitat	3652	4780	1,31
1.Ammoniumsulfatprecipitat	2378	4590	1,93
DEAE-Cellulose	663	3672	5,80
2.Ammoniumsulfatprecipitat	163	3253	19,9
DEAE-Sephadex A-50	44,7	2667	59,7
Sephadex G-150	13,07	2614	200

Beispiel 3

Quantitative Bestimmung der L-Milchsäure Reaktionsgemisch

0,2 M Dimethylglutarat-NaOH-Puffer Peroxidase (45 U/ml)

0,3% 4-Aminoantipyrin 0,2% Ν,Ν-Dimethylanilin 5 mM L-Milchsäure oder 5 mM DL-Milchsäure

0,2 ml 0,1 ml 0,1 ml 0,2 ml 0 bis 80 μΐ

destilliertes Wasser bis zum Gesamtvolumen von 1 ml

Zu 1 ml des obigen Reaktionsgemisches gibt man L-Lactatoxidaselösung (100 U/ml, 20 μΐ), inkubiert bei 37°C während 20 Min., und gibt 1%-iges Cation FB-500 (Warenzeichen, 0,5 ml) und destilliertes Wasser (1,5 ml) zu. Die entstandene Farbe wird nach einem colorimetrischen Verfahren bei 565 nm gemessen. Das Ergebnis ist identisch mit der Menge an Milchsäure, die mit einer Standardkurve von Wasserstoffperoxid, wie zuvor erläutert, bestimmt wurde.

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Beispiel 4

Eine Zusammensetzung für die Milchsäureanalyse nach einem colorimetrischen Verfahren enthält die folgenden Bestandteile:

0,1 M Dimethylglutarat-NaOH-Puffer TO ml

Peroxidase (45 U/ml) 5 ml

0,3% 4-Aminoantipyrin 5 ml

Lactatoxidase (100 U/ml) 1 ml

Saccharose 20 mg

Das obige Gemisch wird bei -40^ - 50⁰C bei 0,01 bis 0,05 mmHg während 3 Std. zur Herstellung des Reagens (A) eines Kits für die Lactatanalyse (für 5 ml Präparationen) lyophilisiert. Zusätzliche wässrige Lösung (5 ml), enthaltend 0,2% N,N-Dimethylanilin und 8 μΜοΙ PCMB, werden zugegeben.

Zu dem Reagens (A) des Kits gibt man die zusätzliche Lösung vollständig und dann weiter destilliertes Wasser, bis man 50,0 ml Lösung erhält. Die so hergestellte Reagenslösung wird für die Analyse in Mengen von 1,0 ml pro einem Test verwendet.

Beispiel 5

Jeweils aliquote Lösungen (1,0 ml) der Reagenslösung für die Milchsäureanalyse werden in Reaktionsröhrchen gegeben. Dazu gibt man 5 mM DL-Milchsäurelösung (je 0 bis 100 μΐ) (für die Kontrolle) oder 2,5 mM Wasserstoffperoxid (je 0 bis 100 μΐ) (für die Eichkurve durch Wasserstoffperoxid) oder Menschenserum (je 0 bis 100 μΐ), oder Menschenserum (50 μΐ) zusammen mit 5 mM DL-Milchsäure (je 0 bis 100 μΐ) und das Gemisch wird bei 37°C während 20 Min. inkubiert. 1%iges Cation FB-500 (Viarenzeichen, 0,5 ml) und destilliertes Wasser (1,5 ml) werden zu jeder Probe gegeben und die Absorption bei 565 nm wird colorimetrisch gemessen.

Si Ft C; <3> θ "P ff fl <η β

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Wie aus Fig. 8 folgt, worin c—ο die Kontrolle mit DL-Milchsäure, •—»die Eichkurve durch Wasserstoffperoxid, Δ—,■&. die Menge an Milchsäure in Menschenserum, bestimmt durch die Menge an Wasserstoffperoxid, undj—4die Menge an Milchsäure in Menschenserum unter Zugabe von DL-Milchsäure bedeuten, werden bei der Analyse von Milchsäure in Menschenserum und Serum, zu dem Milchsäure zugegeben wurde, gute Ergebnisse erhalten.

Ende der Beschreibung

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L e er s e i t e

Claims

PATENTANWÄLTE DR WALTER KRAUS DIPLOMCHEMIKER : DR-ING. ANNEKÄTE WEISERT DIPL.-ING. FACHRICHTUNG CHEMIE IRMGARDSTRASSE 15 - D-BOOO MÜNCHEN 71 · TELEFON 089/797077-797078 · TELEX O5-212156 kpatd TELEGRAMM KRAUSPATENT 2209 AW/li TOYO JOZO KABUSHIKI KAISHA7 T a g a t a (Japan) Lactatoxidase, Verfahren zu ihrer Herstellung und analytisches Verfahren und Analysensatz Patentansprüche

1. Eine Enzymlactatoxidase, dadurch gekennzeichnet, daß sie mindestens die folgende Substratspezifizität und Enzymwirkung aufweist:

Substratspezifizität: L-Milchsäure

Enzymwirkung: sie katalysiert .die folgende Reaktion (I)

L-Milchsäure + O₂" '—> Brenztraubensäure + H₃O₂ (I)

2. Enzymlactatoxidase nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzym einen optimalen pH von 6 bis 7, eine optimale Temperatur von etwa 35°C,einen isoelektrischen Punkt pH 4,6 +_ 0,3 (bestimmt
durch Elektrophorese unter Verwendung eines Trägeraitipholiten) und
ein Molekulargewicht von 80 000 ^ 10 000 aufweist.

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3. Verfahren .zur Herstellung einer Lactatoxidase, die mindestens eine Substratspezifizität für L-Milchsäure aufweist und die Reaktion (I)

L-Milchsäure + O₂ } Brenztraubensäure + H₃O₂ (I)

katalysiert, dadurch gekennzeichnet, daß man einen Lactatoxidase erzeugenden Mikroorganismus, der zum Genus, ausgewählt unter Pediococcus, Streptococcus und Aerococcus gehört, in einem Nährkulturmedium züchtet und die so gebildete Lactatoxidase aus dem Kulturmedium abtrennt.

4. Verfahren nach Anspruch 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Lactatoxidase einen optimalen pH von 6 bis 7, eine optimale Temperatur von etwa 35⁰C, einen isoelektrischen Punkt von pH 4,6 _+ 0,3 (bestimmt durch Elektrophorese unter Verwendung eines Trägerampholiten) und ein Molekulargewicht von 80 000 +_ 1 0 000 aufweist.

5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus ausgewählt wird aus der Gruppe, die enthält Pediococcus sp. B-0667 (FERM-P Nr. 4438), Streptococcus sp. B-0668 (FERM-P Nr. 4439), Aerococcus viridans IFO-12219 und Aerococcus viridans IFO-12317.

6. Verfahren zur Analyse von Milchsäure in einer Milchsäure enthaltenden Probe oder in einem Milchsäure freisetzenden System , dadurch gekennzeichnet, daß man die Probe mit der Lactatoxidaas behandelt und das gebildete Wasserstoffperoxid, die gebildete Brenztraubensäure oder den verbrauchten Sauerstoff mißt.

7. Verfahren zur Analyse von Milchsäure nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Lactatoxidase mindestens eine Substratspezifizität für L-Milchsäure aufweist und daß das Enzym eine solche Wirkung besitzt, daß es die Reaktion (I)

L-Milchsäure + O₂ ^ Brenztraubensäure + H₃O₂ (I)

katalysiert.

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8. Verfahren zur Analyse von Milchsäure, dadurch gekennzeichnet, daß die Lactatoxidase einen optimalen pH von 6 bis 7, eine optimale Temperatur von etwa 35⁰C, einen isoelektrischen Punkt von pH 4,6 +_ 0,3 (bestimmt durch Elektrophorese unter Verwendung eines Trägerampholiten) und ein Molekulargewicht von 80 000 +_

10 000 besitzt.

9. Analysensatz für Milchsäure, dadurch gekennzeichnet, daß er ein mindestens Lactatoxidase umfassendes System aufweist.

10. Analysensatz nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß die Lactatoxidase mindestens eine Substratspezifizität für L-Milchsäure besitzt und daß durch die Enzymwirkung die Reaktion

(I) von

L-Milchsäure + O₂ ) Brenztraubensäure + Η,Ο- (I)

katalysiert wird.

11. Analysensatz nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß die Lactatoxidase einen optimalen pH von 6 bis 7, eine optimale Temperatur von etwa 35⁰C, einen isoelektrischen Punkt von pH 4,6 +_ 0,3 (bestimmt durch Elektrophorese unter Verwendung eines Trägerampholiten) und ein Molekulargewicht von 80 000 +_ 10 000 besitzt.

12. Analysensatz nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß der Satz mindestens eine Kombination aus Lactatoxidase und einen Indikator für Wasserstoffperoxid umfaßt.

13. Analysensatz nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß der Indikator für Wasserstoffperoxid mindestens eine Zusammensetzung aus 4-Aminoantipyrin, Ν,Ν-Dimethylanilin und Peroxidase enthält.

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