DE3223874A1

DE3223874A1 - Analysenverfahren fuer lipidkomponenten, mittel zur durchfuehrung der analyse und verfahren zur herstellung eines dafuer verwendeten enzyms

Info

Publication number: DE3223874A1
Application number: DE19823223874
Authority: DE
Inventors: Shigeyuki Imamura; Hidehiko Ishikawa; Kazuo Tagata Shizuoka Matsuura; Hideo Misaki
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1981-06-25
Filing date: 1982-06-25
Publication date: 1983-01-20
Also published as: FR2508487A1; DE3223874C2; IT1157281B; CH664631A5; US4491631A; IT8222048A0; DE3249973C2; CA1215903A; GB2105843B; FR2508487B1; GB2105843A

Description

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Beschreibung

Die Erfindung betrifft ein Assay- bzw. Analysenverfahren für eine Komponente in einer Probe, beispielsweise für eine freie Fettsäure, eine aus einem Fettsäureester freigesetzte Fettsäure, einen Fettsäureester oder die Enzymaktivität, durch die aus einem Fettsäureester freie Fettsäure freigesetzt wird. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Herstellung eines Enzyms, das Aktivitäten von Enoyl-CoA-Hydratase, 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase und 3-Ketoacyl-CoA-Thiolase in einem einzigen Enzymprotein aufweist. ί

Bekannte Enzyme für die ß-Oxidation einer Fettsäure und ihre Enzymwirkungen sind wie folgt. [Reaktion I: Acyl-CoA-Synthetase, EC 6. 2. 1. 3] R-CH₂-CH₂-COOH + ATP + CoASH R-CH₅-CH₉-CO-SCoA + AMP + PPi ^ *

[Reaktion II: Acyl-CoA-Dehydrogenase, EC 1. 3. 99.3] (oder Acyl-CoA-Oxidase)

R-CH₂-CH₂-CO-SCoA - 2H⁺ - 2e⁺ —» R-CH=CH-CO-SCoA

[Reaktion III: Enoyl-CoA-Hydratase, EC 4. 2. 1. 17] R-CH=CH-CO-S-CoA + H_£0 JT^ R-CH-CH₂-CO-SCoA

OH [Reaktion IV: 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase, EC 1. 1.

1. 35]

R-CH=CH-CO-SCoA + NAD⁺ * R-C-CH-CO-SCoA + NADH + H⁺ OH *~~" 8

[Reaktion V: ^-Ketoacyl-CoA-Thiolase, EC 2. 3. 1. 16] R-C-CH₉-CO-SCoA + CoSH —» R-C-SCoA + CH^-C-SCoA

Π *- f Il -2 Il

0 " 0 0

Als enzymatisch^ Analysenverfahren für freie Fettsäure in Serumproben sind die folgenden bekannt.

Proben mit einem Gehalt der freien Fettsäure werden mit Acyl-CoA-Synthetase in Anwesenheit von CoASH (Coenzym A) und ATP (Adenosintriphosphat) unter Bildung von Acyl-CoA, AMP (Adenosinmonophosphat) und Pyrophosphat behandelt. Das gebildete AMP wird mit Myokinaseaktivität in Anwesenheit von ATP unter Bildung von zwei Molverhältnis-

!O sen ADP (Adenosindiphosphat) aus einem Molverhältnis AMP behandelt. Das so gebildete ADP wird mit Phosphoenol pyruvat in Anwesenheit von Pyruvatkinaseaktivität unter Bildung von ATP und Pyruvat behandelt, welches mit Lactatdehydrogenase und reduziertem NAD (Nicotinadenindinucleotid) unter Freisetzung von Lactat und NAD behandelt wird, wobei die verbrauchte Menge an reduziertem NAD photometrisch unter Verringerung der optischen Dichte bei 34-0 nm gemessen wird, wodurch die zwei Molverhältnisse an verbrauchtem, reduzierten NAD aus einem Molverhältnis Fettsäure berechnet werden [Analytical Biochemistry, £8, 341-345 (1979)].

Ein anderes Analysenverfahren für die freie Fettsäure ist bekannt. Bei diesem Verfahren wird die freie Fettsäure mit CoASH und ATP in Anwesenheit von Acyl-CoA-Synthetase unter Bildung von Acyl-CoA, AMP und Pyrophosphat umgesetzt. Die gebildete Acyl-CoA verbraucht Sauerstoff in Anwesenheit von Acyl-CoA-Oxidase unter Bildung von 2,3-trans-Enoyl-CoA und Wasserstoffperoxid. Das so gebildete Wasserstoffperoxid wird mit 4-Aminoantipyrin, 2,4-Dibromphenol und Peroxidase unter Bildung eines Farbkomplexes, der colorimetrisch gemessen wird, umgesetzt; [Anal.Bioehem., 108, 6-10 (1980)].

Diese Analysenverfahren besitzen eine Reihe von Nachteilen. Bei dem Verfahren, bei dem Acyl-CoA-Oxidaseaktivi-

tat verwendet wird, wird das gebildete Wasserstoffperoxid durch CoASH reduziert, und die zweite Reaktionsstufe sollte durchgeführt werden, nachdem die verbleibende CoASH der ersten Reaktionsstufe in die nicht-reduzierende Substanz durch N-Äthylmaleimid überführt wurde. Daher ist eine gleichzeitige Reaktion unmöglich. Es ist ein weiterer Nachteil, daß die Lipaseaktivität im Serum so schwach ist und somit die Menge an aus dem Fettsäureester freigesetzter Fettsäure, ein Substrat für die Lipaseaktivitätsanalyse, so gering ist. Diese Verfahren ermöglichen keine empfindliche Analyse. Bei dem ersteren Analysenverfahren ist die quantitative Bestimmung der erniedrigten Menge an 2 Molverhältnissen von reduziertem NAD aus 1 Molverhältnis der Fettsäure nicht ausreichend empfindlich.

Es wurde nun gefunden, daß die freie Fettsäure oder die aus ihrem Ester freigesetzte Fettsäure in einer Probe leicht nachgewiesen werden kann, indem man verschiedene Verfahren kombiniert. Die Fettsäure wird in Acyl-CoA überführt, welches in Dehydroacyl-CoA umgewandelt wird, die Dehydroacyl-CoA wird in Hydroxyacyl-CoA umgewandelt, die Hydroxyacyl-CoA wird in Ketoacyl-CoA transformiert und die Ketoacyl-CoA wird in Acyl-CoA umgewandelt.

Die bei der letzten Reaktionsstufe gebildete Acyl-CoA besitzt ein Acyl-CoA, welches um 2 Kohlenstoffatome kürzer ist als die Acylgruppe, verglichen mit der Fettsäure in der Probe. Die Acyl-CoA wird zu Dehydroacyl-CoA, Hydroxyacyl-CoA und Ketoacyl-CoA zersetzt, wobei ein Zyklus durchlaufen wird, bei dem 2 Kohlenstoff atome weniger als bei der Fettsäure im Endprodukt in Erscheinung treten.

Dieser Zyklus besitzt eine hohe Zyklusordnung, abhängig von der Zahl der Kohlenstoffatome der Fettsäure in der

Probe. Bei den Zyklusreaktionen der hohen Ordnung können höhere Molverhältnisse der Komponenten, die gebildet oder verbraucht 'werden, wenn man von 1 Molverhältnis Fettsäure ausgeht, als nachweisbare Änderungen nach ver-

B schiedenen Verfahren nachgewiesen werden.

Bei diesem Analysen- bzw. Assayverfahren wird die Fettsäure in der Probe wie folgt abgebaut:

(a) Acyl-CoA wird durch die Einwirkung von Acyl-CoA-Synthetaseaktivität in Anwesenheit von ATP oder GTP und CoASH gebildet;

(b) Acyl-CoA wird in Dehydroacyl-CoA durch Acyl-CoA-Oxidaseaktivität und Sauerstoff umgewandelt;

(c) Dehydroacyl-CoA wird in Hydroxyacyl-CoA

durch Enoyl-CoA-Hydrataseaktivität und Wasser umgewandelt;

(d) Hydroxyacyl-CoA wird in Ketoacyl-CoA durch NAD und 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenaseaktivität transformiert ; und

(e) Ketoacyl-CoA wird zu der um 2 Kohlenstoffatome ärmeren Acyl-CoA durch CoASH und 3-Ketoacyl-CoA-Thiolase transformiert.

Die so gebildete Acyl-CoA wird erneut über den ß-Oxidationszyklus abgebaut, wobei nachweisbare Änderungen im Zyklus nachgewiesen werden können.

Es wurde ebenfalls gefunden, daß ein Bakterienstamm, der zum Genus Pseudomonas gehört und aus einer Bodenprobe isoliert wurde, die auf einer Birnenplantage in Sudamacho, Kitakoma-gun, Yamanashi-ken, Japan, gesammelt.

wurde, ein Enzym bildet, welches Multiaktivenzym-Aktivitäten aufweist, nämlich die von Enoyl-CoÄ-Hydratase der obigen Reaktion III, von 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase .der obigen Reaktion IV und von 3-Ketoacyl-CoA-Thiolase der obigen Reaktion V, und daß dieses Enzym als einfaches Enzymprotein vorliegt (im folgenden als "multi-

aktives Enzym" bezeichnet). Das multiaktive Enzym kann für die Analyse (Assay) einer Fettsäure verwendet werden.

Der Bakterienstamm B-0771 besitzt die folgenden taxonomisehen Eigenschaften.

(A) Makroskopische Beobachtungen:

(1) Nähragarplatte:

die Kolonien sind konvex, rund, mit glatten Enden, semi-glänzend, gräulichweiß bis blaßgelb; keine Bildung an löslichem Pigment.

(2) Nähragarschrägplatte:

lineares, gutes Wachstum; halbglänzend, gräulichweiß bis blaßgelb; keine Bildung an löslichem Pigment.

(3) Flüssige Kultur:

homogen trübe, Präzipitation; keine Kapselbildung.

(B) Mikroskopische Beobachtungen:

gerade oder etwas gebogene Bacilli; einfache oder doppelte, manchmal lange Ketten; 0,4 bis 0,6 χ 0,5 bis 3,0/um; beweglich mit polaren Flagella; keine Sporenbildung.

(C) Physiologische und biochemische Eigenschaften:

Gram-Verfärbung

0.F.-Test 0

Catalase +

Oxidase +

. Lecithinase

Urease
__ SSR-Medium

Christensen-Medium +

Gelatinehydrolyse
Stärkehydrolyse
Caseinhydrolyse

Äsculinhydrolyse -

Argininhydrolyse +

Poly-ß-Kydroxybutyrat(PHB)-Akkumulation Indolbildung

Hydrogensulfatbildung

Acetoinbildung . -

MR-Test

Nitratreduktion

Citratausnutzung +

Säurebildung aus Zucker:

Säurebildung, keine Gasbildung: L(+)-Arabinose, Cellobiose, Fructose, Fucose, Galactose, Glucose, Glycerin, Lactose, Maltose, Mannose, Melibiose, Rhamnose, Saccharose, Trehalose, Xylose;

keine Säurebildung, keine Gasbildung: Adnit, Dulcit, Mesoerythrit, Inosit, Inulin, Mannit, Melezitose, Raffinose, Salicin, Sorbose, Sorbit, Stärke.

Wie zuvor erwähnt, wird der Stamm B-0771 mit den Eigenschaften gramnegativ, beweglich mit polaren Flagella, Catalase und Oxidase positiv, aerob in der Natur bei oxidativem Abbau von Glucose als Mikroorganismus erkannt, der zum Genus Pseudomonas gehört.

Unter Bezugnahme auf die Beschreibung von Pseudomonas fragi in J.Gen.Mictrobiol., 2£, 379-408 (1961), ist der Stamm identisch mit den jeweiligen wie folgt.

Stamm Pseudomonas B-0771 fragi

Argininabbau + +

PHB-Akkumulation
Gelatineverflüssigung

Stärkehydrolyse

Caseinhydrolyse

Äsculinabbau

Indolbildung
H₂S-Bildung -

Acetoinbildung

Nitratreduktion - d

Citratausnutzung + +

17

Weiterhin wurden Vergleichsuntersuchungen des Stammes B-0771 und einer Kultur des Typs Pseudomonas fragi ATCC 4973 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Tabelle

	Stamm Pseudomonas	-
	B-0771 frasci ATCC 4973	+
Gram-Verfärbung	-	polar
beweglich	+	0
Flagella	polar	+
O.F-Test	0	+
Catalase	+	-/(+)
Oxidase	+
Urease -SSR/Christensen	■-/(+)	-
Argininabbau	+	-
Stärkehydrolyse	-	-
Gelatineverflüssigung	-	-
Caseinhydrolyse	-	-
Äsculinabbau	-	-
Indolbildung	-	-
H₂S-Bildung		- _ -
Acetoinbildung	-	+
Nitratreduktion	-
Citratausnutzung	+	-
Säurebildung aus Zucker:		+
Adonit	-	+
L(+)-Arabinose	+	- .
Cellobiose	+	-
Dulcit		+
Mesoerythrit	-	+
Fructose	+	+
Fucose	+	+
Galactose	+	+
Glucose		-
Glycerin	(+)
Inosit	-
Inulin

Lactose + +

Maltose + +

Mannit

Mannose + +

Melezitose

Melibiose + +

Raffinose

L(+)-Rhamnose (+) +

Salicin
L-Sorbose
Stärke

Saccharose + +

Trehalose + +

Xylose + +

^!

Wie aus der obigen Tabelle folgt, besitzt der Stamm .B-0771 ähnliche taxonomische Eigenschaften wie der eines Kulturstammes des Typs Pseudomonas fragi ATCC 4973·

Der Stamm B-0771 wird als Pseudomonas fragi B-0771 bezeichnet und wurde am 5. September 1980 im Fermentation Institute, Agency of Industrial Technology & Sciences, M.I.T.I., Japan, unter der Hinterlegungsnummer 5701 hinterlegt.

Der vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Analysenverfahren für eine Komponente in einer Probe zur Verfügung zu stellen, das die folgenden Reaktionsstufen umfaßt:

(a) ein Verfahren, bei dem eine Fettsäure in Acy1-CoA umgewandelt wird;

(b) ein Verfahren, bei dem Acyl-CoA in Dehydroacyl-CoA umgewandelt wird;

(c) ein Verfahren,*bei dem Dehydroacyl-CoA in Hydroxyacyl-CoA umgewandelt wird;

(d) ein Verfahren, bei dem Hydroxyacyl-CoA in Ketoacyl-CoA umgewandelt wird;

(e) ein Verfahren, bei dem Ketoacyl-CoA in Acyl-

CoA umgewandelt wird; und
ein Verfahren, gemäß dem die nachweisbaren Änderungen nachgewiesen werden.

Erfindungsgemäß wird weiterhin eine Zusammensetzung bzw. ein Mittel für die Analyse zur Verfügung gestellt, das mindestens die folgenden Bestandteile enthält:

- ATP oder GTP;

- CoASH;

- NAD;

- Acyl-CoA-Synthetase;
- Acyl-CoA-Oxidase;

- Enoyl-CoA-Hydratase;

- 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase; und

- J-Ketoacyl-CoA-Thiolase.

Erfindungsgemäß soll ein Verfahren zur Herstellung eines multiaktiven Enzyms zur Verfügung gestellt werden, gemäß dem ein Mikroorganismus, der zum Genus Pseudomonas gehört und ein multiaktives Enzym bilden kann, gezüchtet bzw. bebrütet wird und das so gebildete Enzym isoliert wird.

Eine Probe, die erfindungsgemäß analysiert werden kann, ist beispielsweise eine Probe, die eine Fettsäure enthält, bzw. eine Probe, die mindestens eine Fettsäure enthält. Beispiele von Fettsäuren sind Capronsäure Cg, Caprylsäure C₈, Caprinsäure C₁₀, Laurinsäure C₁₂» Myristinsäure C.^, Palmitinsäure C₁^, Palmitoleinsäure, Stearinsäure C₁₈, ölsäure, Linolsäure und Linolensäure.

Weitere Beispiele von Fettsäuren, die analysiert werden können, sind freie Fettsäuren oder Fettsäureester als Komponenten in Milchprodukten, wie Butter, Margarine,

Käse, Schinken, Milch oder Mayonnaise; freie Fettsäuren oder Fettsäureester in solchen Proben, wie Blut und Urin; Reaktionsprodukte ihrer enzymatischen Einwirkungen; freie Fettsäuren oder ihre Salze und Fettsäureester als Komponenten in Arzneimittelzubereitungen; oder Fettsäuren als Substrate für im Handel erhältliche Enzymreagentien oder freigesetzte Fettsäuren, die durch Einwirkung von im Handel erhältlichen Enzymen freigesetzt werden.

Die Fettsäure kann aus dem Fettsäureester durch alkalische Verseifung unter Verwendung von Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid oder durch enzymatische Einwirkung freigesetzt werden. In der Kombination aus Fettsäureester und enzymatischer Aktivität unter Bildung von Fettsäure kann der Fettsäureester analysiert werden, nachdem die Fettsäure freigesetzt wurde, und die enzymatische Aktivität kann ebenfalls analysiert werden, indem man die freigesetzte Fettsäure aus der den Fettsäureester enthaltenden Probe analysiert. Diese Kombinationen sind in keiner Weise beschränkt und alle möglichen Kombinationen, bei denen Fettsäure freigesetzt wird, können verwendet werden.

Bei der Kombination, bei der der Fettsäureester ein Triglycerid ist, wie Monoglycerid, Diglycerid oder Triglycerid, und bei der die enzymatische Aktivität eine Lipaseaktivität·ist, kann das Glycerid oder die Lipaseaktivität analysiert werden, indem man die aus dem Glycerid freigesetzte Fettsäure bestimmt.

Diese Analysen werden bei der Triglyceridanalyse im Serum und bei der pankreatisehen Lipaseanalyse im Serum verwendet. Im letzteren Fall kann eine Trübung im Reaktionssystem vermieden werden, indem man bevorzugt Mono- oder Diglycerid verwendet und Albumin, wie Rinderalbumin, zugibt.

Ein Kombinationssystem für den Fettsäureester und das Enzym,welches auf den Fettsäureester einwirkt, wird im folgenden als Beispiel angegeben.

Fettsäureester Enzymaktivität

Lecithin Phospholipase A₁, Phospholipase

A₂ oder Phospholipase B

Lysolecithin Lysophospholipase

Phosphatidat Phosphatidatphosphotase und

Lipase
Lecithin Phospholipase C und Lipase

Lecithin Phospholipase D, Phosphatidat-

phosphatase und Lipase Acylcholin Cholinesterase

Cholesterinester Cholesterinesterase Lecithin und Cholesterin Lecithincholesterinacyltrans-

ferase, Cholesterinesterase und Lysophospholipase.

Fettsäure-verwandte Komponenten, wie die Substrate und Enzyme, wie sie vorstehend erwähnt wurden, können analysiert werden, indem man die Fettsäure analysiert. Bei den Systemen, bei denen Fettsäure freigesetzt wird, wird die Menge an Reagentien beliebig ausgewählt, abhängig von der Aufgabe und den Reaktionsbedingungen, und sie sollte so sein, daß die Menge an Fettsäure, die bei der Reaktion freigesetzt wird, im wesentlichen ausreicht. Die Reaktionstemperatur für die Freisetzung der Fettsäure beträgt normalerweise etwa 37°C, und die Reaktionszeit sollte natürlich eine Zeit sein, die ausreicht, um die Fettsäure freizusetzen, und sie beträgt mehr als 1 min.

Ausführungsformen für die Reaktionsverfahren (a), (b), (c), (d) und (e), die zuvor angegeben wurden, werden im folgenden erläutert.

' -

(a) Reaktionsverfahren, bei dem die Fettsäure in Acyl-CoA umgewandelt wird:

Beispielsweise kann ein Reaktionsverfahren, bei dem die Acyl-CoA-Synthetaseaktivität, die eine Reaktion aus Fettsäure., ATP und CoASH zum Acyl-CoA, AMP und Pyrophosphat (PPi), ATP und CoASH catalysiert, erwähnt werden.

R-CH₂-CH₂-COOH + ATP + CoASH

(Fettsäure) $

R-CH₂-CH₂-C-SCoA₊AMP₊PPi

(Acyl-CoA)

(b) Reaktionsverfahren, bei dem Acyl-CoA in Dehydroacyl-CoA umgewandelt wird:

Beispielsweise kann ein Reaktionsverfahren, bei dem die Acyl-CoA-Oxidaseaktivität, die eine Reaktion von Acyl-CoA und Sauerstoff zu Dehydroacyl-CoA und Wasserstoffperoxid und Sauerstoff katalysiert, erwähnt werden.

O
R-CH₂-CH₂-C-SCoA + O₂

(Acyl-CoA) S

> R-CH=CH-C-SCoA + H₂O₂

Acyl-CoA-Oxidase (Dehydroacyl-CoA)

(c) Reaktionsverfahren, bei dem Dehydroacyl-CoA in Hydroxyacyl-CoA umgewandelt wird:

Beispielsweise kann ein Reaktionsverfahren, bei dem

die Anoyl-CoA-Hydrataseaktivität, die eine Reaktion von Dehydroacyl-CoA zu Hydroxyacyl-CoA in Gegenwart von Wasser und Wasser katalysiert, erwähnt werden. 0

R-CH=CH-C-SCoA + H₂O

(Dehydroacyl-CoA) ?^H S

—^ R-CH-CH₂-C-SCoA Enoyl-CoA-Hydratase (Hydroxyacyl-CoA)

(d) Reaktionsverfahren, bei dem Hydroxyacyl-CoA in Ketoacyl-CoA umgewandelt wird:

Beispielsweise kann ein Reaktionsverfahren, bei dem 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase, die eine Reaktion von Hydroxyacyl-CoA und NAD zu Ketoacyl-CoA und reduziertem NAD und NAD katalysiert, erwähnt werden.

OH 0

R-CH-CH₂-C-SCoA + NAD
(Hydroxyacyl-CoA) ^α °

It Il

3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase

R-C- CH₂-C-SCoA + reduziertes NAD

Das bei den obigen Verfahren verwendete Enzym kann ein Enzym sein, das aus Tieren oder Mikroorganismen stammt. Es können im Handel erhältliche Enzyme und isolierte Enzyme Jeglichen Ursprungs verwendet werden.

(e) Reaktionsverfahren bei dem Ketoacyl-CoA in Acyl-CoA umgewandelt wird:

Beispielsweise kann ein Reaktionsverfahren, bei dem 3-Ketoacyl-CoA-CoA-Thiolase auftritt, die eine Reaktion von Ketoacyl-CoA zu Acyl-CoA und Acethyl-CoA in Anwesenheit von CoASH und CoASH katalysiert, erwähnt werden.

O O
R-C-CHo-C-SCoA + CoASH

R-C-SCoA + CH₃-C-SCoA

3-Keotacyl-CoA (Acyl-CoA) Thi olas e-Aktivität

Beispiele für den Ursprung der Acyl-CoA-Synthetase werden im folgenden erläutert. Meerschweinchenleber [j.Biol.Chem.,204, 329 (1953)];

Ratten-, Mäuse-, Rinder- und Schweineleber (JA-OS 55-74791);

Escherichia coli [Eur.J.Biochem., T2» 576 (1970)]; Bacillus megaterium [Biochem., 4(1), 85 (1965)]; Aerobacter aerogenes IFO 3318, Seratia marcescens IFO 3052, Proteus mirabilis IFO 3849, Staphylococcus aureus IFO 3060, Pseudomonas aeruginosa IFO 3919, Fusarium oxysporum IFO 5942, Gibberella fujikuroi IFO 6604 und Candida lipolytica IFO 0717 [J.Bateriol., 105(3), 1216 (1971); ibid., H4(1), 249 (1973); JA-OS 55-74790; ibid. Nr.55-99187].

Eine weitere Ausführungsform von Acyl-CoA-Synthetase ist ein Enzym, welches die Reaktion der Fettsäure, GTP und CoASH zu Acyl-CoA, GDP und Orthophosphat katalysiert [bovine liver, J. Biol.Chem., 222(6), 1694 (1964)].

Möglichkeiten für den Ursprung von Acyl-CoA-Oxydase sind: Rattenleber [Biochem.Biophys.Res.Comm., 8j£(2), (1978)]; Candida utilis, Candida lipolytica IFO 1548, Candida tropicalis IFO 0589» Saccharomyces cerevisiae IFO 0213, Saccharomyces cerevisiae Y0036 FERM-P Nr.5174 (DSM 2138) (JA-OS 56-51991); Eupenicillium Javanicum IFO 7992, Monascus sp. M-4800 FERM-P Nr. 5225 (DSM 2136) (ibid., Nr. 56-61991); Aspergillus candidus M-4815 FERM-P Nr. 5226 (DSM 2135) (ibid.,Nr. 56-61991); Arthrobacter sp. B-0720 FERM-P Nr. 5224 (DSM 2137) (ibid., Nr.51-61991); Macrophomina phaseoli ATCC 14383, Cladosporium resinae IFO 6367 [Arch.Biochem.Biophys., 176, 591 . (1976), JA-OS Nr.55-118391, ibid., Nr. 56-8683, ibid.Nr.56-61991].

Die obige Acyl-CoA-Oxidase kann durch Acyl-CoA-Dehydrogenase [EC 1. 3· 99. 3, Acyl-CoA: (Akzeptor) Oxidoreductase] ersetzt werden. Dieses Enzym kann beispielsweise aus Schweine-, Rinder- und Schafsleber erhalten werden [J.Biol.Chem., 218, 717 (1956), ibid., 21J3, 701 (1956), J.Am.Chem.Soc, 75., 2787 (1953), Biochim.Biophys. Acta, 22, 475 (1956)].

Bei der Reaktion von Acyl-CoA zu Dehydroacyl-CoA wird, ein Elektronenakzeptor, z.B. 2,6-Dichlorphenolindophenol, 2-(p-Jodphenyl)-3-(p-nitrophenyl)-S-phenyl^H-tetrazoliumchlorid (INT), 3-(4,5-Dimethyl)-2-thiazolyl-2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumbromid (MTT), 3,3·-(4,4'-Biphenylen)-bis-(2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumchlorid) (neo-TB), 3,3'-(3,3'-Dimethoxy-4,4'-biphenylen)-bis-[2-(p-nitrophenyl)- 5-phenyl-2H-tetrazoliumchlorid] (NTB), 3,3'-(3,3'-Dimethoxy-4,4'-bis-[2,5-bis-(p-nitrophenyl)]-2H-tetrazoliumchlorid] (TNTB] oder 3,3'-(3,3'-Dimethoxy-4,4»-biphenylen) -bis-(2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumch'lorid) (TB), mit Phenazinmethosulfat verwendet.

Enzyme, die Enoyl-CoA-Hydrataseaktivität, 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenaseaktivität und 3-Ketoacyl-CoA-Thiolaseaktivität zeigen, werden bevorzugt aus Geweben, in denen sie enthalten sind, isoliert [j.Biol.Chem. 218, 971 (1956), ibid., 202, ⁶31 (1954), ibid., 208, 345 (1954), Angew.Chem., 54, 687 (1952), und Biochim. Biophys. Acta, 26, 448 (1957)].

Das multiaktive Enzym, welches Enoyl-CoA-Hydrataseaktivi- !0 tat, 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenaseaktivität und 3-Ketoacyl-CoA-Thiolaseaktivität in einem einzigen Enzymprotein enthält, wird bevorzugt verwendet. Beispiele von Mikroorganismen, die dieses Enzym erzeugen, sind Escherichia coli [Proc.Natl.Acad.Sci., 74(2), 492 (1977)] und Pseudomonas fragi B-0771 FERM-P Nr. 5701.

Das aus Pseudomonas fragi B-0771 FERM-P Nr.5701 erhaltene Enzym besitzt die folgenden Eigenschaften. (1) Analysenverfahren für die Enzymaktivität

(a) Analysenverfahren für die Enoyl-CoA-Hydrataseaktivität: _ml

0,2 M Tris-HCl-Puffer (pH 9,0) 0,4

1 M KCl 0,1

40 mM NAD 0,1

15 mM Palmitenoyl-CoA 0,1

196 Rinderserumalbumin 0,05

0,25% Nitrotetrazoliumblau 0,1

125 E/ml 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase

(Boehringer) 0,01

destilliertes Wasser 0,04

—*—

insgesamt 1,00 ml

Das obige Reaktionsgemisch wird 2 min bei 37⁰C vorinkubiert (vorbebrütet) und die Enzymlösung wird zugegeben und dann wird 10 min bei 37⁰C bebrütet. 0,596 Natriumdodecylsulfat (2,0 ml) werden zur Beendigung der Reaktion zugesetzt und die optische Dichte (Absorption bei

^{wird tei} einer Wellenlänge von 550 nm bestimmt.

Eine Einheit (1 E) des Enzyms wird als Menge des Enzyms definiert, welche 1/umol reduziertes NAD in 1 min freisetzt. Die Enzymaktivität wird durch die folgende Gleichung definiert:

(b) Analysenverfahren für 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase ml

0,2, M Tris-HCl-Puffer (pH 8,5) 0,5

1 M KCl 0,05

40 mM NAD 0,1

15 mM 3-Hydroxypalmitoyl-CoA 0,1

1% Rinderserumalbumin 0,05

0,25% Nitrotetrazoliumblau 0,1

30 E/ml Diaporase 0,1

insgesamt 1,00 ml

Die Enzymlösung (50/ul) wird zu dem obigen Reaktionsgemisch zugegeben, das 2 min bei 27°C vorbebrütet wird,und dann wird 10 min bei 37°C bebrütet. 0,5# Natriumdodecylsulfat (2,0 ml) werden zur Beendigung der Reaktion zugegeben und dann wird die Absorption bei 550 nm(AAcc₀) bestimmt. Eine Einheit (1 E) wird als .Menge des Enzyms definiert, das 1/umol reduziertes NAD in 1 min freisetzt. Die Enzymaktivität wird gemäß der folgenden Gleichung definiert:
Enzymaktivität (E/ml) = AA₅₅₀ x^x ^rffi x ^₀-

(c) Analysenverfahren für 3-Ketoacyl-CoA-Thiolase: . ml

0,2 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) 0,2

10 mM CoASH 0,05

0,2 mM 3-Ketomalmitoyl-CoA 0,1

100 mM MgCl₂ · 0,1

1 mM Dithiothreit 0,1

dest. Wasser 0,45

insgesamt 1,00 ml

Zu dem Reaktionsgemisch in einer 1 ml Quarzzelle gibt man bei 37°C 20/ul Enzymlösung und inkubiert bei 37°C. Die erniedrigte Menge an 3-Ketopalmitoyl-CoA, die entsprechend der Reaktion verbraucht wird, wird zu einem be stimmten Zeitpunkt durch Änderung der optischen Dichte (Absorption) bei 303 mn (0D,_Q,) erneut bestimmt. Eine Einheit (1 E) wird als Menge des Enzyms definiert, die 1/umol 3-Ketopalmitoyl-CoA in 1 min verbraucht. Die Enzymaktivität wird in der folgenden Gleichung definiert:

Enzymaktivität (E/ml) = (OD₃₀₃Mn) χ γ^ χ

(2) Enzymeinwirkung

Es werden die folgenden Enzymaktivitäten beobachtet.

Enoyl-CoA-Hydratase: katalysiert eine Reaktion, bei der 1 Mol Hydroxyacyl-CoA aus 1 Mol Dehydroacyl-CoA und 1 Mol Wasser gebildet wird.

3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase: katalysiert eine Reaktion, bei der 1 Mol Ketoacyl-CoA und 1 Mol reduziertes NAD aus 1 Mol Hydroxyacyl-CoA und 1 Mol NAD gebildet werden.

3-Ketoacyl-CoA-Thiolase: katalysiert eine Reaktion, bei der 1 Mol Acyl-CoA und 1 Mol Acetyl-CoA aus 1 Mol Ketoacyl-CoA und 1 Mol CoASH gebildet werden.

(3) Augenschein für ein einziges Enzymprotein Das rohe Enzym wird aus Mikrobenzellen von Pseudomonas fragi B-0771 hergestellt und mittels verschiedener Reinigungsverfahren gereinigt. Die Enzymaktivität wird jeweils gemäß den zuvor erwähnten Analysenverfahren bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt. Die in Tabelle 2 gewählten Abkürzungen haben folgende Bedeutung:

EHA = Enoyl-CoA-Hydrataseaktivität HDA = 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenas«aktivität KTA = 3-Ketoacyl-CoA-Thiolaseaktivität

Tabelle 2

	EHA (E/mg)	HDA	KTA (E/mg)
rohes Enzym	36,1	18,2	15,1
DEAE-Cellulose CL-6B Säule	58,9	30,0	24,5
Hydroxyapatit Gel-Säule	210,3	105,0	85,6
Tyopeal HW-60 Säule	216,5	110,0	90,2

(Die Enzymaktivität wird durch die Menge an Enzymprotein korrigiert.)

Jede Enzymaktivität entspricht genau einem Verhältnis von Aktivität bei jeder Reinigungsstufe, und diese drei Enzymaktivitäten verbleiben im gleichen Protein, Daher sind alle drei Enzymaktivitäten in einem einzigen Enzymprotein lokalisiert.

Das in dem folgenden Beispiel erhaltene, gereinigte Enzym (2,0 mg) (gereinigt mittels Toypeal HW-60 Säulenchromatographie) wird in einer isoelektrischen Fokussierelektrophorese unter Verwendung eines Trägerampholyten befördert und jede Enzymaktivität wird gemessen. Drei Enzymaktivitäten werden in einem einzigen Peak in einer Fraktion bei pH 4,9 nachgewiesen.

(4) Substratspezifizität

3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenaseaktivität wird unter Verwendung von 3-Hydroxyacyl-CoA mit den folgenden Kohlenstoff zahlen gemessen.
Substrat · Relative Aktivität (%)

3-Hydroxycaproyl-CoA 56,5

3-Hydroxycaprylyl-CoA 88,1

3-Hydroxycapryl-CoA 99,0

3-Hydroxylauryl-CoA 100,0

3-Hydroxymyristoyl-CoA 98,0

3-Hydroxypalmitoyl-CoA 75,5

3-Hydroxystearyl-CoA 30,5

η 3«,-

3-Hydroxyarachidoyl-CoA 9»5

3-Hydroxyoleyl-CoA 57,5

3-Hydroxylinolenyl-CoA 99,0

Das Enzym besitzt also mindestens Substratspezifizitat bei Palmitoenoyl-CoA und 3-Ketopalmitoyl-CoA.

(5) Optimaler pH

3-Hydroxypalmitoyl-CoA wird als Substrat verwendet. Die 3-Hydroxyacyl-CoA-Aktivität wird unter Verwendung von Tris-HCl-Puffer bei pH 7,5 bis 9,5 bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt. Der optimale pH liegt bei ungefähr pH 9.

(6) pH-Stabilität

!5 Enzymlösung (5 E/ml), gelöst in verschiedenen 10 mM Pufferlösungen (pH 4 bis 7: DimethyIglutarat-NaOH-Puffer; pH 7,5 bis 9: Tris-HCl-Puffer),wird 60 min bei 37°C inkubiert, und die verbleibende Aktivität wird gemäß einem Analysenverfahren für die 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenaseaktivität gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 dargestellt, wobei das Enzym bei pH 5 bis 8 stabil ist.

(7) Wärmestabilität

Enzymlösung (15 E/ml), gelöst in 10 mM Dimethylglutarat-NaOH-Puffer (pH 7,0) ,wird 10 min bei verschiedenen Temperaturen inkubiert, und die verbleibende Aktivität wird gemäß dem Analysenverfahren für die 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenaseaktivität gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 dargestellt, wobei das Enzym bis zu etwa 50⁰C stabil ist.

(8) Isoelektrischer Punkt

Die isoelektrische Fokussierung unter Verwendung eines Trägerampholyten erfolgt zur Messung des isoelektrischen Punktes des Enzyms, wobei der isoelektrische Punkt pH 4,9 beträgt.

(9) Einfluß von Metallionen

Der Einfluß von Metallionen auf die 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenaseaktivität wird bestimmt.

Metallion Relative Aktivität (%)

Vergleich 100

1 mM CaCl₂ 113

1 mM MgCl₂ 113

1 mM MnCl₂ 32

1 mM ZnCl₂ 25

1 mM CuCl₂ 12

1mM BaCl₂ 106

1 mM NiCl₂ 95

1 mM CoCl₂ 34

(10) Einfluß von oberflächenaktiven Mitteln

Der Einfluß von oberflächenaktiven Mitteln auf die 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenaseaktivität wird bestimmt.

Oberflächenaktives Mittel Relative Aktivität (96)

Vergleich 100

0,196 Triton X-100 96

0,196 Adekatol SO-145 81

0,196 Laurylbenzolsulfonat 0

0,196 Natriumlaurylsulfat 0

0,196 Natriumdesoxycholat 2

0,196 Cetyltrimethylammoniumchlorid O

0,196 Cetylpyridiniumchlorid O

Wie erläutert, besitzt das erfindungsgemäße multiaktive Enzym Enoyl-CoA-Hydrataseaktivität, 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenaseaktivität und 3-Ketoacyl-CoA-Thiolaseaktivitat in einem einzigen Enzymprotein.

Ein Verfahren zur Herstellung des multiaktiven Enzyms wird im folgenden erläutert.

Die für die Herstellung des multiaktiven Enzyms verwendeten Mikroorganismen sind nicht auf das oben erwähnte Pseudomonas fragi B-0771 FERM-P Nr.5701 beschränkt, und andere Stämme, die zum Genus Pseudomonas gehören und multiaktives Enzym ergeben, können ebenfalls bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden.

Bei einer bevorzugten Ausführungsform werden Mikroorganismen, die multiaktives Enzym erzeugen und zu Pseudomonas gehören, in einem an sich bekannten Medium für die Enzymerzeugung bebrütet. Für die Fermentierung können feste und flüssige Kulturen verwendet werden, es ist jedoch eine submerse Belüftungskultur für die industrielle Produktion bevorzugt.

Nährquellen, die bei herkömmlichen Züchtungen für Mikroorganismen verwendet werden können, können ebenfalls verwendet werden. Assimilierbare Kohlenstoffquellen, wie Glucose, Saccharose, Lactose, Stärke, Maltose, Dextrin, Melassen und Glycerin, können eingesetzt werden. Assimilierbare Stickstoffquellen, wie Maisquellwasser, Sojabohnenpulver, Baumwollsamenöl, Weizengluten, Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Hefepulver und Caseinhydrolysat, können ebenfalls verwendet werden. Salze, wie Phosphat, Sulfat und andere Salze von Magnesium, Calcium, Kalium, Natrium, Zink, Eisen und Mangan, können erforderlichenfalls eingesetzt werden. Zur Verbesserung der Produktivität des multiaktiven Enzyms werden bevorzugt Fettsäuren mit 8 bis 20 C-Atomen, wie ölsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, zu dem Medium zugegeben.

Die Bebrütungstemperatur kann zum Züchten der Mikroorganismen und bei der Bildung des Enzyms variiert werden und beträgt 26 bis J52°C, vorzugsweise 30°C. Die Züchtungszeit hängt von den verwendeten Bedingungen ab und beträgt gewöhnlich 10 bis 40 h. Die Züchtung sollte natürlich be-

endet werden, wenn eine maximale Enzymaktivität erhalten wurde.

Das so gebildete, multiaktive Enzym ist in den Zellen der Mikroorganismen enthalten.

Die Isolierung des Enzymswird wie folgt durchgeführt. Zunächst werden die gezüchteten Zellen durch Filtrieren oder Zentrifugieren gesammelt. Die Zellen werden mittels Beschallung, mit einer französischen Presse, Glasperlenbehandlung oder Lysozymbehandlung, wobei oberflächenaktive Mittel, wie Triton X-100 (Warenzeichen) oder Adekatol SO-145 (Warenzeichen) gegebenenfalls zugesetzt werden können, zerstört bzw. zerkleinert.

Das Enzym wird durch Zugabe von mit Wasser mischbaren, organischen Lösungsmitteln, wie Methanol, Äthanol oder Aceton, und durch Aussalzen unter Zugabe von Ammoniumchlorid präzlpitiert. Das ausgefallene, rohe Enzym wird gereinigt, indem man das rohe Enzym löst, in einem Cellophanrohr dialysiert und unter Verwendung von DEAE-Cellulose, DEAE-Sephalose, CM-Sephadex oder ein Ionenaustauschharz chromatographiert und unter Verwendung von Sephadex G-200, Sephalose CL-6B, Sephacryl S-200 oder Toyopeal HW-60 gelfiltriert. Das erhaltene Enzym wird unter Bildung des gereinigten, multiaktiven Enzyms lyophilisiert.

Die in jedem enzymatlschen Verfahren verwendete Menge an Enzym kann eine für die Enzymreaktion ausreichende Menge sein und wird in Abhängigkeit von der Menge und der Kohlenstoffzahl der Fettsäure in einer Probe variiert und ist somit nicht begrenzt. Beispielsweise wird man, wenn die Probe 0,005 bis*0,05 /uMol C₁₈-Ölsäure enthält und man 5 bis 10 min bei 37⁰C umsetzt, eine Acyl-CoA-synthetaseaktivität von im allgemeinen über 1 E, vorzugsweise

5 bis 15 E, erhalten, und das erfindungsgemäße, multiaktive Enzym in einer Menge von gewöhnlich über 0,1 E, bevorzugt 1 bis 25 E, verwenden.

Die Menge an Reagentien bei den Reaktionsstufen, z.B. ATP oder GTP und CoASH bei dem Verfahren (a), NAD bei dem Verfahren (d) und CoASH bei dem Verfahren (e), sollte eine Menge sein, die ausreicht für das Produkt in einer Menge der Fettsäure in der Probe und die Anzahl von

!O ß-Oxidationszyklen, abhängig von der Anzahl der Kohlenstoff atome in der Fettsäure. Beispielsweise sollte im Falle von 0,01/uMol ölsäure die Menge an ATP oder GTP über 0,1/uMol, vorzugsweise 0,5/uMol; die Menge an CoASH über 0,1 und vorzugsweise über 0,5/uMol; und die Menge an NAD über 0,1 und vorzugsweise über 0,5/uMol liegen.

Bei der Reaktionsstufe (b) wird die enzymatisch^ Wirkung von Acyl-CoA-Oxidase unter Mithilfe von gelöstem Sauerstoff in der Probe erfolgen, und bei der Stufe (c) kann Wasser in der Probe verwendet werden.

Wasserlösliche Magnesiumsalze, wie Magnesiumchlorid, das Magnesiumionen erzeugt, können bevorzugt für die Acyl-CoA-Synthetasereaktion verwendet werden. Bei der Reaktionsstufe (b) sollte das Wasserstoffperoxid, das durch Einwirkung der Acyl-CoA-Oxidase gebildet wird, bevorzugt durch Catalaseeinwirkung entfernt werden.

Mittel bzw. Komponenten für die Analyse, die mindestens ATP oder GTP und CoASH, NAD, Acyl-CoA-Synthetaseaktivität, Acyl-CoA-Oxidaseaktivität, Enoyl-CoA-Hydrataseaktivitat, 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenaseaktivität und 3-Ketoacyl-CoA-Thiolaseaktivität enthalten, können hergestellt werden.
35

Bei der vorliegenden Erfindung wird das zuvor beschriebene, multiaktive Enzym bevorzugt verwendet. Wie erläutert, werden wasserlösliches Magnesiumsalz, Catalase und nichtionische oberflächenaktive Mittel, wie Triton X-100 (Warenzeichen), als Mittel zugegeben. Die Lösung wird hergestellt, indem man neutrales bis schwach alkalisches Wasser oder Puffer zusetzt. Im Falle der Analyse eines Fettsäureesters werden Fettsäure freisetzende Mittel, wie ein Enzym, zu den Mitteln zugegeben oder alternativ wird im Falle der Analyse der Aktivität eines Enzyms auf einen Fettsäureester ein Fettsäureester zuvor zu den Komponenten zugesetzt. Beispiels weise wird dem Mittel für die Analyse der Lipaseaktivität ein Glycerid, bevorzugt ein Monoglycerid

!5 oder ein Diglycerid, als Analysenkpmponente zugesetzt. Bevorzugt wird Albumin zugefügt. Bei einem Mittel für die Triglyceridanalyse wird beispielsweise Lipase zugegeben.

Weitere Ausführungsformen von Mitteln für die Analyse bzw. Zusammensetzungen für die Analyse werden im folgenden näher erläutert.

Mittel bzw. Zusammensetzungen für die Analyse der Phospholipase A₁-Aktivität, Phospholipase A₂-Aktivität und Phospholipase B-Aktivität enthalten Lecithin als Fettsäureester;

Mittel für die Analyse der Lysophospholipaseaktivität enthalten Lysolecithin als Fettsäureester; Mittel für die Analyse der Phosphates eaktivi tat enthalten Phosphatidat als Fettsäureester und Lipaseaktivität;

Mittel für die Analyse der Phospholipase C-Aktivität enthalten Lecithin als Fettsäure und Lipaseaktivitat;

Mittel für die Analyse der Phospholipase D-Aktivität enthalten Lecithin als Fettsäure, Phosphatidatphosphataseaktivität und Lipaseaktivität; Mittel für die Analyse der Cholinesteraseaktivität enthalten Acylcholin als Fettsäureester; Mittel für die Analyse der Cholesterinesteraseaktivität enthalten Sterinester als Fettsäureester; Mittel für die Analyse von Lecithin enthalten Phospholipase A₁-Aktivität, Phospholipase A₂-Aktivität, Phospholipase B-Aktivität, Phospholipase C-Aktivltät und Lipaseaktivität oder Phospholipase D-Aktivität und Phosphatidatphosphataseaktivität und Lipaseaktivität; Mittel für die Analyse von Lysolecithin enthalten Lysophospholipaseaktivität;

Mittel für die Analyse von Cholesterinester enthalten Cholesterinesteraseaktivität;

Mittel für die Analyse der Lecithin-Cholesterin-Acyl-Transferaseaktivität enthalten Fettsäureester von Cholesterin und Lecithin und Cholesterinesteraseaktivitat oder Lysophospholipaseaktivität; und Mittel für die Analyse von Cholesterin enthalten Lecithin als Fettsäureester, Lecithincholesterinacyltransferaseaktivität und Cholesterinesteraseaktivität oder Lysophospholipaseaktivität.

Die Fettsäure in der Probe kann unter Verwendung der oben erwähnten Zusammensetzungen bzw. Mittel für die Analyse analysiert werden. Die Menge der Probe beträgt im allgemeinen mehr als 5/ul und wird mit mehr als 1 ml der Lösung der Mittel für die Analyse vermischt. Die Analyse erfolgt zweckdienlich bei 37°C. Die Bebrütungszeit beträgt im allgemeinen mehr als 1 min und bevorzugt 5 bis 10 min, und sie ist bevorzugt eine längere Zeit für eine höhere Empfindlichkeit.

Das Medium für die Analyse ist bevorzugt eine Pufferlösung innerhalb des stabilen pH-Bereichs der Enzyme und ist im allgemeinen schwach sauer oder eine alkalische Lösung, wie Wasser, Phosphatpuffer von pH 6,5 bis 8, Tris-HCl-Puffer, Imidazo1-HCl-Puffer, Dimethylglutarat-NaOH-Puffer oder Pipes-NaOH-Puffer.

Nach der Inkubation werden die nachweisbaren Änderungen der Reaktion analysiert. Die nachweisbaren Änderungen müssen mindestens 1 Mol verbrauchte Komponenten oder erzeugte Komponenten in einem ß-Oxidationszyklus betragen.

Bevorzugt werden Mengenänderungen an reduziertem NAD aus NAD in der Reaktion bestimmt. Der Nachweis für reduziertes NAD erfolgt, indem man die spezifische Absorption des reduzierten NAD mißt. NAD besitzt eine maximale Absorption bei 260 nm, wohingegen reduzierte NAD eine maximale Absorption bei 260 bis 340 nm aufweist, und somit wird die Absorption bei 320 bis 360 nm, bevorzugt bei 340 nm, verwendet.

Der Nachweis des reduzierten NAD kann weiterhin nach einem colorimetrisehen Analysenverfahren, welches auf der Verfärbung eines Elektronentransfersystems, wie eines Elektronenakzeptors für reduziertes NAD, beruht, erfolgen. Verfärbungsreagentien des Elektronentransfersystems sind Elektronenakzeptoren, z.B. wasserlösliche Tetrazoliumsalze, wie INT, MTT, Neo-TB, NTB, TNTB und TB, und diese werden bevorzugt mit Diaphorase und Phenazinmethosulfat für die Verbesserung des Elektronentransports verwendet. Das Elektronentransferreagens kann bevorzugt den Komponenten für die Analyse, welche zuvor beschrieben wurden, vor der Reaktion oder nach der Reaktion zugegeben werden.

' .

Das bei der Reaktion gebildete, reduzierte NAD kann mit den Elektronentransferreagentien unter Bildung einer Farbänderung umgesetzt werden, die bei ihrer Absorptions wellenlänge bestimmt werden kann.
5

Eine weitere Ausführungsform für die Analyse des reduzierten NAD besteht darin, daß das reduzierte NAD analysiert wird, indem man ein Enzym, wie reduzierte NAD-Oxidase, verwendet. Das Enzym, für das reduziertes NAD das Substrat ist, wird bevorzugt nach an sich bekannten Immobilisierungsverfahren immobilisiert. Das immobilisierte Enzym wird in der Sauerstoffelektrode unter Bildung einer reduzierten NAD-Oxidaseelektrode gesammelt.

Die Menge an verbrauchtem Sauerstoff aus dem reduzierten NAD, der sich während der Reaktion bildet, kann elektrisch gemessen werden.

Die Menge an Fettsäure kann, bezogen auf die Menge an ge bildetem, reduzierten NAD, bestimmt werden. Die Menge an Fettsäureester oder Enzymaktivität in der Probe kann durch die Menge an Fettsäure bestimmt werden.

Verbrauchte Reagentien, wie CoASH, oder gebildete Acyl-CoA können ebenfalls durch nachweisbare Änderungen analysiert werden.

Das erfindungsgemäße Analysenverfahren und die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen zur Durchführung der Analysen sind einfach und besitzen eine hohe Empfindlichkeit, und man kann daher bei der klinischen Diagnose für die pankreatische Funktion eine Lipaseaktivitätsanalyse durchführen.

Die erfindungsgemäßen Analysenverfahren für Acyl-CoA-Synthetase und Acyl-CoA-Oxidase werden im folgenden erläutert .

ι (1) Analysenverfahren für die Acyl-CoA-Synthetaseakti-

vi tat	insgesamt	ml
(I) Reaktionsgemisch I:		0,2
0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,5)	0,1
10 mM ATP	0,1
10 mM MgCl₂	0,05
10 mM CoASH
5% Triton X-100 mit einem Gehalt an 1 mM	0,2
Palmitinsäurelösung	0,35
destilliertes Wasser	1,00 m

(II) Reaktionsgemisch II: ml

0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,5) 0,5

20 mM N-Äthylmaleimid 0,1

15 mM 4-Aminoantipyrin 0,3

0,396 3-Methyl-N-äthyl-N-(ß-hydroxyäthyl)-

(ß-hydroxyäthyl)-anilin 0,25

Peroxidase (100 PPE/ml) 0,1

0,596 Natriumazid 0,1

Acyl-CoA-Oxidase (120 E/ml) 0,1

destilliertes Wasser . 0,55

insgesamt 2,00 ml

Enzymlösung (50/ul) wird zu dem Reaktionsgemisch I gegeben und dann wird 10 min bei 37°C inkubiert. Das Reaktionsgemisch II wird zugesetzt, 5 min bei 37°C inkubiert und dann wird die Absorption bei 550 nm (AAecq)gemessen. Die Enzymaktivität wird gemäß folgender Gleichung definiert: ^ /₁₀ Enzymaktivität (E/mg) = x §^| x C⁺

⁺C = Konzentration der Acyl-CoA-Synthetase in

einer Enzymlösung {mg/ml)

(2) Analysenverfahren für die Acyl-CoA-Oxidaseaktivität

ml

0,2 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0) 0,1

5 mM 4-Aminoantipyrin 0,05

3 mM Diäthylmetatoluidin 0,05

0,5 mg/ml Peroxidase 0,05

25 mM Palmitoyl-CoA 0,02

destilliertes Wasser 0,23

insgesamt 0,50 ml

Enzymlösung (10/Ul) wird dem obigen Reaktionsgemisch zugesetzt und man inkubiert 10 min bei 37°C Die Reaktion wird durch Zugabe von 4M Harnstoff (0,5 ml) beendet, dann wird 1% Triton X-100 (2 ml) zugesetzt und dann wird colorimetrisch bei 545 nm die Menge an gebildetem Wasserstoffperoxid gemessen. 1 Enzymeinheit (1 E) wird als Menge an Enzym definiert, die 1/uMol Wasserstoffperoxid in 1 min freisetzt.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1 Herstellung des multiaktiven Enzyms

In einen 500 ml Erlenmeyerkolben gibt man 100 ml eines Mediums, das 1,5% Pepton, 0,5% gepulverten Hefeextrakt, 0,2% KCl, 0,1% NaCl, 0,1% K₂HPO₄, 0,05% MgSO₄ und 0,75% ölsäure enthält und einen pH von 7,5 aufweist. Insgesamt 15 Kolben, die das gleiche, zuvor beschriebene Medium enthalten,werden bei 120⁰C sterilisiert und mit Pseudomonas fragi B-0771 FERM-P Nr.5701 bei 30⁰C inokuliert und dann 20 h in einer Rotationsschüttelvorrichtung unter Schütteln bebrütet. Die vereinigten Medien werden 20 min bei 5000 U/min zentrifugiert, wobei man Bakterienzellen erhält*. Die Zellen werden in eine Lysozymlösung (36Ο ml; 1,50 mg in 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,0) gegeben; man erhält eine rohe Lösung des multiaktiven En-

zyms (340 ml, spezifische Aktivität = 3,0 E/mg als 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenaseaktivität).

Die Isolierung und Reinigung des Enzyms werden folgendermaßen durchgeführt. Zuvor abgekühltes Aceton (-20⁰C, 290 ml) wird zu der rohen Lösung (290 ml) aus multiaktivem Enzym gegeben, dann wird in einem Eisbad gekühlt und der Niederschlag gesammelt. Der Niederschlag wird in 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) mit einem Gehalt an 1 M KCl gelöst und 10 min bei 12 000 U/min zur Entfernung unlöslicher Materialien zentrifugiert. Die überstehende Lösung (45 ml) wird gesammelt und mit einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung (22,5 ml, pH 7,0) versetzt. Der Niederschlag wird durch lOminütiges Zentrifugieren bei 12 000 U/min entfernt. Gesättigte Ammoniumsulfatlösung (28 ml) wird zu der überstehenden Lösung (57 ml) zugesetzt. Der Niederschlag wird in 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) mit einem Gehalt an 1 M KCl gelöst und unter Verwendung eines Cellophanrohrs gegenüber 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5? 2,0 1) 20 h bei 4⁰C dialysiert. Das Dialysat wird lyophilisiert, und man erhält multiaktives Enzympulver (77 mg), welches eine spezifische Aktivität von 18,2 E/mg als 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenaseaktivität zeigt.

77 mg des Enzyms werden in 20 ml Wasser gelöst und auf eine Säule (3 χ 11 cm) aus DEAE-Sephalose CL-6B (Farmacia Co.) gegeben, die mit 10 mM Tris-HCl-Puffer äquilibriert und mit dem gleichen Puffer gewaschen wurde. Die Eluierung erfolgt mit einem linearen Gradienten unter Verwendung von 500 ml 10 mM Tris-HCl-Puffer und des gleichen, 0,4 M KCl enthaltenden Puffers mit einer Eluierungsgeschwindigkeit von 52 ml/h. Jeweils 9 ml-Fraktionen werden gesammelt und es werden die aktiven Fraktionen Nr. 71 bis 80 (90 ml) erhalten, die eine spezifische Aktivität von 30,0 E/mg als 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydro-

genäse-Aktiv!tat aufweisen. Die aktive Fraktion.wird gegenüber 10 mM Phosphatpufferlösung (pH 7,5; 2 1) dialysiert und auf eine mit Hydroxyapatitgel gepackte Säule (2 χ 10 cm) gegeben. Die Eluierung erfolgt gemäß einem linearen Gradienten mit 300 ml eines 10 mM Phosphatpuffers (pH 7»5) und 300 ml eines 0,5 M Phosphatpuffers (pH 7,5) bei einer Eluierungsgeschwindigkeit von 33 ml/h. Je 5 ml-Fraktionen werden gesammelt und man erhält die aktiven Fraktionen Nr. 46 bis 62 (85 ml) (Enoylacyl-CoA-Hydrataseaktivitat = 210,3 E/mg; 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenaseaktivität =105 E/mg; 3-Ketoacyl-CoA-Thiolaseaktivität =85,6 E/mg), welche durch Ultrafiltration (Amicon Co. XM-50) konzentriert wurden. Das Konzentrat wird auf eine mit Toyopeal HW-60 (Toyo Soda Co.) gepackte Säule (1,1 χ 90 cm) gegeben und mit 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) mit einem Gehalt an 0,5 M KCl gelfiltriert. Jeweils 3,5 ml Fraktionen werden gesammelt und die aktiven Fraktionen Nr. 23 bis 27 (17,5 ml) werden erhalten.' Die Lösung wird lyophilisiert; man erhält gereinigtes multiaktives Enzym (20 mg, 110 E/mg als 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenäse).

Beispiel 2

30 1 des gleichen Mediums wie in Beispiel 1 (versetzt mit Antischaummittel Silicon KM-72 der Shinetsu Chem. Co.) werden in einen 30 1 Kolbenfermentator gegeben und 20 min bei 120⁰C sterilisiert. 500 ml Kulturmedium von Pseudomonas fragi B-0771 FERM-P Nr. 5701 werden inokuliert und 17 h bei 30⁰C, 300 U/min., 20 l/min bebrütet. Das Kulturmedium wird zentrifugiert, und man erhält die gezüchteten Zellen. Die Zellen werden mit Lysozym (3 g) in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) behandelt, und man erhält eine multiaktive Enzymlösung (6 1) (15,6 E/ml als 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenaseaktivität). 35

Beispiel 3 "

Quantitative Bestimmung verschiedener Fettsäuren

Mittel für die Analyse ml

0,2 M Pipes-NaOH-Puffer (pH 7,3) 0,5

10 mM NAD 0,2

10 mM MgCl₂ 0,3

10 mM ATP 0,3

3% Triton X-100 0,1

10 mM CoASH 0,2

Acyl-CoA-Synthetaselösung (40 E/ml),

(Toyo Jozo Co.) ■ 0,02

Acyl-CoA-Oxidase (400 E/ml) 0,02

Catalase (150 E/ml; Sigma Chem.Co.) 0,05 multiaktives Enzym (Enoyl-CoA-Hydrataseaktivität = 400 E/ml; 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenaseaktivität =200 E/ml; 3-Keto-

acyl-CoA-Thiolaseaktivität = 163 E/ml) 0,05

destilliertes Wasser 1.26

insgesamt 3,00 ml

25/Ul einer Probe, enthaltend 3 mM/ml Fettsäure (0,05 /uMol), werden zu dem obigen Mittel für die Analyse (3»00 ml) zugesetzt, dann Inkubiert man 5 min bei 37°C und bestimmt die Menge an reduziertem NAD durch Absorption bei 340 nm (OD,^q ). Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 aufgeführt. Wie die Tabelle zeigt, ist die optische Dichte bei 340 nm proportional der Anzahl der Kohlenstoffatome der Fettsäure in der Probe.

Beispiel 4 Quantitative Analyse von ölsäure 20/ul einer Probe mit einem Gehalt an ölsäure (jeweils 0,01/uMol, 0,02/uMol, 0,03/uMol, 0,04/uMol und 0,05 /uMol) werden zu dem Mittel für die Analyse (3»00 ml) des Beispiels 3 zugesetzt. Es wird 5 min bei 37⁰C inkubiert und die Menge an reduziertem NAD durch Absorption bei 340 nm gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 dargestellt (·-·). In Fig. 4 ist mit (o-o) die Vergleichs-

analyse gemäß einem in Anal.Bioehem., beschriebenen Verfahren gezeigt.

341 (1979),

Wie aus Fig. 4 folgt, ist das erfindungsgemäße Analysenverfahren hinsichtlich der Empfindlichkeit im Vergleich mit dem bekannten Analysenverfahren überlegen.

	Tabelle 3	(0)	^OC34O nm
Fettsäure	Zahl der Kohlen stoff a tome (Zahl der Unsättigung)	(0)	0,089
Capronsäure	6	(0)	0,175
Caprylsäure	8	(0)	0,267
Caprinsäure	10	(0)	0,356
Laurinsäure	12	(0)	0,444
Myristinsäure	14	(D	0,530
Palmitinsäure	16	(0)	0,529
Palmitoleinsäure	' 16	(D	0,622
Stearinsäure	18	(2)	0,628
ölsäure	18	(3)	0,619
Linolsäure	18		0,630
Linolensäure	18

Beispiel 5 Analyse von Ölsäure

Mittel für die Analyse ml

0,2 M Pipes-NaOH-Puffer (pH 7,3) 0,5

10 mM NAD 0,2

10 mM MgCl₂ 0,2

10 mM ATP ' 0,2

Λ% Triton X-100 0,2

10 mM CoASH 0,2

Acyl-CoA-Synthetase (40 E/ml) 0,02

Acyl-CoA-Oxidase (400 E/ml) 0,02

multiaktives Enzym (Enoyl-CoA-Hydratase=

400 E/ml: 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase=

200 E/ml); 3-Ketoacyl-CoA-Thiolase=i63 E/ml) 0,01

Catalase (150 E/ml) 0,05

Diaphorase (30 VmI; Toyo Jozo Co.) 0,1 0,25% NTB ' · ♦ ■ · 0,2 destilliertes Wasser 1,10

insgesamt 3,00 ml 20/Ul einer Probe mit einem Gehalt an ölsäure (0,005, 0,01, 0,015, 0,02 bzw. 0,025/uMol)werden zu dem obigen Mittel für die Analyse (3,00 ml) zugesetzt, und dann wird 10 min bei 37°C inkubiert.

Die Absorption bei 550 nm der blau-purpurnen Verfärbung, die entsprechend der Menge an bei der Reaktion gebildetem, reduzierten NAD auftritt, wird gemessen (0D_Kt-n ««,) · Das Ergebnis ist in Fig. 5 (·-·) angegeben. In Fig.

zeigt (0-0) die Vergleichsanalyse gemäß dem Verfahren in Anal.Bioehem., 108. 6 (1980) [Absorption bei 505 nm, ^OD5O5 nm^]·

Die Ergebnisse zeigen, daß das erfindungsgemäße Verfahren ein hochempfindliches Analysenverfahren ist, verglichen mit dem bekannten Verfahren.

Beispiel 6 Analyse von Lipase(Serumlipase)-Aktivität

Mittel für die Analyse ml

0,2 M Pipes-NaOH-Puffer (pH 7,3) 0,2

10 mM NAD 0,15

10 mM MgCl₂ 0,15

10 mM ATP 0,15

2% Triton X-100, enthaltend 10 mM 1,2-

dioleylglycerid 0,10

10 mM CoASH · 0,15

2M KCl 0,1

'5% Rinderserumalbumin 0,1

Acyl-CoA-Synthetase (40 E/ml) 0,2

Acyl-CoA-Oxidase (400 E/ml) 0,02

multiaktives Enzym (Enoyl-CoA-Hydratase= 400 E/ml; 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase=200 E/ml; 3-Ketoacyl-CoA-Thiolase= 163 E/ml) 0,05

Catalase (150 E/ml) 0,05

destilliertes Wasser 0,08

insgesamt 1,5 ml

Das obige Mittel für die Analyse (1,5 ml) wird mit Human serum (50 /Ul) vermischt, bei 37°C inkubiert und gleichzeitig wird die Bildung an reduziertem NAD bei 340 nm bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 aufgeführt.

Tabelle 4

Reaktionszeit (min) ^0D340 nm

0 0,120

_1B 3 0,377

5 0,400

7 0,412

8 0,420 13 0,476

Aus den obigen Ergebnissen folgt, daß die Fettsäure in dem Serum vor der Fettsäure reagiert, die aus dem Diglycerid durch den Einfluß von Serumlipase freigesetzt wird, und daß die Reaktion der freien Fettsäure in dem Serum innerhalb von 7 min Reaktionszeit beendigt ist. Die Erhöhung der Absorption nach dieser Zeit beruht auf dem reduzierten NAD, das bei der ß-Oxidation von Fettsäure, die aus dem Diglycerid durch den Einfluß der Serumlipase freigesetzt wird, gebildet wurde. Die Lipaseaktivität wird daher durch eine Erhöhung der Absorption in einem Intervall von 5 min zwischen 8 und 13 min gemessen; sie beträgt 3»44 E/l.

Die Lipaseaktivität wird gemäß der folgenden Gleichung bestimmt:

Lipaseaktivität (E/l)= AOD⁺ χ

χ φ- χ ^x 1000

⁺A0D bedeutet den Unterschied zwischen OD,^₀ nach 13 min nach Reaktionsbeginn und dem von 8 min nach Reaktionsbeginn. Die Zahl der ß-Oxidationszyklen ist

Bei der Serumlipaseanalyse wird eine Zusammensetzung für die Analyse ohne Zugabe von Glyuerid hergestellt, und Proben für die Analyse der Serumlipase werden zugegeben, um den Einfluß der freien Fettsäure im Serum auszuschließen. Die Lipaseaktivität kann analysiert werden, indem man die obige Zusammensetzung für die Analyse zugibt, ohne daß die freie Fettsäure im Serum einen Einfluß hat.

Beispiel 7

Mittel für die Triglyceridanalyse ml

0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,5) 0,5

10 mM NAD 0,3

10 mM MgCl₂ 0,4

10 mM ATP 0,3

3% Triton X-100 0,1

10 mM CoASH 0,4

Acyl-CoA-Synthetase (40 E/ml) 0,03

Acyl-CoA-Oxidase (400 E/ml) 0,03

multiaktives Enzym (Enoyl-CoA-Hydratase=

400 E/ml; 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase=

200 E/ml; 3-Ketoacyl-CoA-Thiolase=163 E/ml) 0,07

_on Catalase (150 E/ml) 0,07

Liphase (10 000 E/ml; Toyo Jozo Co.) 0,03

destilliertes Wasser 0,77

insgesamt 3»00 ml

Die Zusammensetzung für den Triglyceridassay kann folgendercaaßen verwendet werden.

MfT -ttf'

30/Ul Serum werden zu der gleichen Zusammensetzung für die Analyse wie in Beispiel 3 zugegeben, welche nützlich ist, um den Einfluß der freien Fettsäure im Serum auszuschließen. Dann wird 10 min bei 37°C inkubiert und die Probe gesammelt (1 ml, entsprechend 10/Ul Serum). Die Probe wird mit dem obigen Mittel für die Triglyceridanalyse vermischt, und dann wird die Erhöhung der Absorption bei 340 nm bestimmt. Oder die Zusammensetzung für Triglycerid wird direkt mit Serum (10/ul) vermischt und dann wird die Erhöhung der Absorption bei 340 nm 10 min nach Reaktionsbeginn gemessen.

Beispiel 8

Zusammensetzung für die Analyse von Phospholipase A₁-Aktivität, Phospholipase .A₂-Aktivität oder die Phospholipase B-Aktivität

In Beispiel 3 werden 1,26 ml destilliertes Wasser in dem Mittel für die Analyse durch 10 mM Lecithinlösung (0,2 ml) und destilliertes Wasser (1,06 ml) ersetzt, wo-"bei man eine Zusammensetzung für die Analyse der obigen Enzymaktivitäten erhält.

Beispiel 9

Zusammensetzung für die Analyse von Lysophospholipase-

Aktivität

In Beispiel 3 werden 1,26 ml destilliertes Wasser durch 10 mM Lysolecithinlösung (0,2 ml) und destilliertes Wasser (1,06 ml) ersetzt, wobei man eine Zusammensetzung für die. Analyse der Lysophospholipase-Aktivität erhält.

Beispiel 10

Zusammensetzung für die Analyse von Phosphataseaktivität In Beispiel 3 werden 1,26 ml Wasser durch 10 ml Phosphatida tlösung (0,2.ml), Lipase (10 000 E/ml; 0,05 ml) und destilliertes Wasser (1,01 ml) ersetzt, wobei man eine Zusammensetzung für die Analyse der Phosphataseaktivität erhält.

Beispiel 11

Zusammensetzung für die Analyse der Phospholipase C-

Aktivität ·

In Beispiel 7 werden 0,77 ml destilliertes Wasser in der Zusammensetzung für die Triglyceridanalyse durch 10 mM Lecithinlösung (0,2 ml) und destilliertes Wasser (0,57 ml) ersetzt, wobei man die Zusammensetzung für die Analyse der Phospholipase C-Aktivität erhält. Diese Zusammensetzung wird ebenfalls durch ein Glycerid beeinflußt, und wenn eine Glycerid enthaltende Probe verwendet wird, sollte die Menge an Fettsäure aus dem Glycerid abgezogen werden.

Beispiel 12

Zusammensetzung für die Analyse von Phospholipase C-

Aktivität

Die Zusammensetzung für die Reaktion, bei der Fettsäure freigesetzt wird,(2,0 ml), welche 10 mM Lecithinlösung (0,2 ml), Lipase (5000 E/ml; 0,08 ml), 0,2 M Phosphatpufferlösung (pH 7,5; 0,50 ml) und destilliertes Wasser (1,22 ml) enthält, wird hergestellt.

Diese Zusammensetzung und die Zusammensetzung für die Analyse in Beispiel 3 werden zusammen für die Zusammensetzung für die Analyse der Phospholipase C-Aktivität verwendet.

Die Zusammensetzung für die Reaktion, bei der Fettsäure freigesetzt wird, (2,0 ml) wird zu der Probe, die Phospholipase C (20/ul) enthält zugesetzt, und dann wird 10 min bei 37⁰C inkubiert. 3,00 ml der Zusammensetzung des Beispiels 3 werden zugegeben, dann wird 5 min bei 37⁰C inkubiert und die Absorption bei 3^0 nm gemessen.

Beispiel 13

Zusammensetzlang für die Analyse der Phospholipase D-

Aktivität

Die Zusammensetzung für die "Freisetzung von Fettsäure (2,0 ml), die 10 mM Lecithinlösung (0,2 ml), Phosphatidat phosphatase (50 E/ml, Toyo Jozo Co.; 0,05 ml), Lipase (10 000 E/ml; 0,05 ml), 0,2 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,5, 0,6 ml) und destilliertes Wasser (1,1 ml) enthält, wird hergestellt. Diese Zusammensetzung wird zusammen mit der Zusammensetzung von Beispiel 3 für die Analyse von Phospholipase D verwendet.

Beispiel 14

Zusammensetzung für die Analyse der Cholinesteraseakti-

vität

In Beispiel 3 werden 1,26 ml destilliertes Wasser durch 2 mM Palmitoyl-Cholinester-Lösung (0,2 ml) und destilliertes Wasser (1,06 ml) ersetzt, wobei man die Zusammensetzung für die Analyse der Cholinesteraseaktivität erhält.

Beispiel 15

Zusammensetzung für die Analyse der Cholesterinesterase-

aktivität

In Beispiel 3 werden 1,26 ml destilliertes Wasser durch 5 mM 3-Oleoyl-Cholesterinester-Lösung (0,2 ml) und destilliertes Wasser (1,06 ml) ersetzt, wobei man die Zusammensetzung für die Analyse der Cholesterinesteraseaktivität erhält.

Beispiel 16

Zusammensetzung für die Analyse der I^cithincholesterinacyl-Tränsferaseaktivität

Die Zusammensetzung für.die Freisetzung von Fettsäure (2,0 ml), die 5 mM Cholesterinlösung (0;2 ml), 5 mM Lecithinlösung (0,2 ml), Lysophospholipase (80 E/ml;

0,05 ml) und 0,396 Triton X-100 in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,5; 1,55 ml) enthält, wird hergestellt.

Diese Zusammensetzung wird zusammen mit der Zusammensetzung des Beispiels 3 für die Analyse der Lecithincholesterinacyl-Transferaseaktivität verwendet.

Beispiel 17

Zusammensetzung für die Analyse von Cholesterinester In Beispiel 3 werden 1,26 ml destilliertes Wasser durch Cholesterinesterase (350 E/ml, Toyo Jozo Co.; 0,2 ml) und destilliertes Wasser (1,06 ml) ersetzt, wobei man die Zusammensetzung für die Analyse von Cholesterinester erhält.

Beispiel für die Acvl-CoA-Oxidase-Erzeugung

10 ml eines Mediums, das Λ% ölsäure, 0,25% Hefeextrakt, 196 Pepton, 0,296 KCl, 0,196 K₂HPO₄, 0,0596 MgSO₄.7Η_£0 und 0,296 Antischaummittel (Disfoam BC-51Y) enthält, werden in Reagenzglas nach der Sterilisierung gegeben. Arthrobacter sp. B-0720 FERM-P Nr. 5224 wird inokuliert und dann wird bei 30°C über Nacht unter Schütteln bebrütet..

Diese Kultur wird in 5 1 des gleichen Mediums in einem 8 1 Fermentationskolben überführt und dann erfolgt eine submerse Belüftungskultur bei 30°C während 20 h, 600 U/min unter 5 l/min Belüftung. Die gezüchteten Zellen werden abzentrifugiert und in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0), 2 mM EDTA und 0,5 mg/ml Lysozym suspendiert und dann wird 60 min bei 37⁰C gerührt. DNA-ase (5 mg) wird zugegeben, dann wird 10 min gerührt und 20 min bei 10 000 U/min zentrifugiert.·

200 ml Aceton werden zu dem Überstand zugegeben, es wird zentrifugiert und erneut 1,8-1 Aceton zugegeben. Der er-

haltene Niederschlag wird abzentrifugiert und in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0; 200 ml) gelöst. Unlösliches Material wird abzentrifugiert und gesättigte Ammoniumsulfatlösung wird zu dem Überstand bei 30- bis 75%iger Sättigung zugesetzt. Der Niederschlag wird in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0; 40 ml) gelöst und entsalzt,' indem man ihn auf eine Säule von Acrylamidgel (Biogel P-2; Biorad Co.) gibt. Er wird dann auf eine Säule von Calciumphosphatgel gegeben, gewaschen und gemäß der linearen Gradientenelution mit 0,05 bis 0,5 M Phosphatpuffer (pH 7,0) eluiert. Die aktiven Fraktionen (etwa 0,45 M) werden gesammelt, durch Ultrafiltration (Diaflow-Membran PM-10; Amicon Col) konzentriert und lyophilisiert. Man erhält Acyl-CoA-Oxidase (spezifische Aktivität = 5,5 E/ ag, Gesamtaktivität = 850 E, Ausbeute 8,5%).

Kurze Erläuterung der Zeichnungen:

Fig. 1 optimaler pH von 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenaseaktivität in einem multiaktiven Enzym, hergestellt aus Pseudomonas fragi B-0771 FERM-P Nr.5701;

Fig. 2 pH-Stabilität der 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenaseaktivitat in einem multiaktiven Enzym;

Fig. 3 Wärmestabilität der 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenaseaktivität in einem multiaktiven Enzym; Fig. 4 Standard-Analysenkurve für Ölsäure;

Fig. 5 Standard-Analysenkurve für ölsäure.

Der in den Ansprüchen verwendete Ausdruck "Phosphatidinsäure" entspricht dem angelsächsischen Ausdruck "phospha tidic acid".

Leerseite

Claims

KRAUS &'Wk\sä'RT 322387A

PATE NTANWÄLTE

UND ZUGELASSENE VERTRETER VOR DEM EUROPÄISCHEN PATENTAMT

DR. WALTER KRAUS DIPLOMCHEMIKER . DR.-INQ. ANNEKÄTE WEISERT DIPL.-ING. FACHRICHTUNS CHEMIE IRMGARDSTRASSE 15 · D-8OOO MÜNCHEN 71 · TELEFON Ο89/7Θ7Ο77-7Θ 7O78 ■ TELEX OS-212156 kpatd

TELEGRAMM KRAUSPATENT

3364 AW/to

TOYO JOZO KABUSHIKI KAISHA Tagata, Japan

Analysenverfahren für Lipidkomponenten, Mittel zur Durchführung der Analyse und Verfahren zur Herstellung eines

dafür verwendeten Enzyms

Patentansprüche

Analysenverfahren für die Komponenten in einer Probe, dadurch gekennzeichnet, daß die folgenden Verfahren ablaufen:

(a) ein Reaktionsverfahren für die Umwandlung einer Fettsäure in Acy1-CoA;

(b) ein Reaktionsverfahren für die Umwandlung von Acyl-CoA in Dehydroacyl-CoA;

(c) ein Reaktionsverfahren für die Umwandlung von Dehydroacyl-CoA in Hydroxyacy1-CoA;

(d) ein Reaktionsverfahren für die Umwandlung von Hydroxyacyl-CoA in Ketoacyl-CoA; und

(e) ein Reaktionsverfahren für die Umwandlung von Ketoacyl-CoA in Acyl-CoA,

und bei dem die nachweisbaren Änderungen gemessen werden.
2. Analysenverfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Reaktionsverfahren die folgenden sind:

(a) ein Reaktionsverfahren, bei dem Fettsäure, CoASH, ATP oder GTP und Acyl-CoA-Synthetaseaktivität auftreten;

(b) ein Reaktionsverfahren, bei dem Acyl-CoA, Sauerstoff und Acyl-CoA-Oxidaseaktivität auftreten;

(c) ein Reaktionsverfahren, bei dem Dehydroacyl-CoA, Wasser und Enoyl-CoA-Hydrataseaktivität auftreten; (cQ ein Reaktionsverfahren, bei dem Hydroxyacyl-CoA, NAD und 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenaseaktivität auftreten; und

(e) ein Reaktionsverfahren, bei dem Ketoacyl-CoA, CoASH und 3-Ketoacyl-CoA-Thiolaseaktivität auftreten.
3. Analysenverfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch

gekennzeichnet, daß die Reaktionsverfahren (c), (d) und (e) auf der Enzymaktivität eines multiaktiven Enzyms beruhen, welches Enoyl-CoA-Hydrataseaktivität, 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenaseaktivität und 3-Ketoacyl-CoA-Thiolaseaktivität in einem einzigen Enzymprotein aufweist.
4. Analysenverfahren nach Anspruch 3» dadurch gekennzeichnet, daß das multiaktive Enzym ein Enzym ist,

welches man aus einem Stamm von Mikroorganismen erhält, der multiaktives Enzym bilden kann und zu Pseudomonas fragi gehört.
5· Analysenverfahren nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, daß der das multiaktive Enzym erzeugende Stamm, der zu Pseudomonas fragi gehört, Pseudomonas fragi B-0771 FERM-P Nr. 5701 (hinterlegt am 5. September 1980) 1st.
6. Analysenverfahren nach Anspruch 1, 2 oder 3» dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren zur Bestimmung der nachweisbaren Änderungen ein Verfahren für die quantitative Bestimmung der Menge an reduziertem NAD, das beim Reaktionsverfahren gebildet wird, ist.
7. Analysenverfahren nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die quantitative Bestimmung der Menge an reduziertem NAD nicht durch spezifische Absorption bei einer Wellenlänge für NAD erfolgt, sondern innerhalb eines Wellenlängenbereichs,der für die spezifische Absorption für reduziertes NAD gilt.
8. Analysenverfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Wellenlänge in dem Absorptionswellenlängenbereich ungefähr 320 bis 360 nm beträgt.
9. Analysenverfahren nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Wellenlänge in dem Absorptions-Wellenlängenbereich ungefähr 340 nm beträgt.
10. Analysenverfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, daß die quantitative Bestimmung der Menge an reduziertem NAD colorimetrisch mittels eines Ubertragungschromogens für ein Wasserstoffatom, einem Akzeptor für ein Wasserstoffatom der reduzierten NAD, erfolgt.
11. Analysenverfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß das Ubertragungschromogen für das Wasserstoff atom ein Akzeptor für ein Wasserstoffatom von reduziertem NAD, ein Wasserstoffatom-Ubertragungssystem ist, welches Diaphorase und ein wasserlösliches Tetrazoliumsalz enthält.
12. Analysenverfahren nach einem der Ansprüche 1
bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die in der Probe zu XO analysierende Komponente eine Fettsäure ist.
13· Analysenverfahren nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, daß die Fettsäure in der zu analysierenden Probe eine Fettsäure ist, die aus einer Probe, welche
einen Fettsäureester enthält, durch Enzymaktivität, die Fettsäure aus dem Fettsäureester bildet, freigesetzt
worden ist.
14. Analysenverfahren nach Anspruch 13, dadurch gekennzeichnet, daß die Analyse entweder die Analyse eines Fettsäureesters oder die Analyse einer Enzymaktivität ist. -
15. Analysenverfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Fettsäureester ein Mono-

glycerid, Diglycerid oder Triglycerid ist und daß die
Enzymaktivität Lipaseaktivität ist.
16. Analysenverfahren nach Anspruch 15, dadurch gekennzeichnet, daß die Analyse der Lipaseaktivität unter Zugabe von Albumin erfolgt.
17. Analysenverfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch, gekennzeichnet, daß die Fettsäure Lecithin ist

und daß die Enzymaktivität Phospholipase A₁-Aktivität,

Phospholipase Ä£-Aktivität oder Phospholipase B-Aktivität ist.
18. Analysenverfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Fettsäureester Lysolecithin ist und daß die Enzymaktivität Lysophospholipase-Aktivität ist.
19· Analysenverfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Fettsäureester Phosphatidinsäure ist und daß die Enzymaktivität Phosphatidinsäurephosphataseaktivität und Lipaseaktivität ist.
20. Analysenverfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Fettsäureester Lecithin ist und daß die Enzymaktivität Phospholipase C-Aktivität und Lipaseaktivität ist.
21. Analysenverfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Fettsäureester Lecithin ist und daß die Enzymaktivität Phospholipase D-Aktivität, Phosphatidinsäurephosphataseaktivität und Lipaseaktivität ist.
22. Analysenverfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Fettsäureester Acylcholin ist und daß die Enzymaktivität Cholinesteraseaktivität ist.
23. Analysenverfahren nach Anspruch 13 oder 14, dadurch gekennzeichnet, daß der Fettsäureester Sterinester ist und daß die Enzymaktivität Cholesterinesteraseaktivität ist.

Il
24. Analysenverfahren nach einem der Ansprüche 1 "bis 11, dadurch gekennzeichnet, daß die Fettsäure aus

einer Probe, die Lecithin und Cholesterin enthält, mittels einer Enzymaktivität von Lecithin:Cholesterinacyltransferaseaktivität oder Lysophospholipaseaktivität freigesetzt wird.
25. Analysenverfahren nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß man Lecithin, Cholesterin oder Enzymaktivität analysiert.
26. Mittel für die Analyse, dadurch gekennzeichnet, daß es mindestens die folgenden Bestandteile enthält:

- ATP oder GTP,

- CoASH,

- NAD,

- Acyl-CoA-Synthetaseaktivität,

- Acyl-CoA-Oxidaseaktivität,

- Enoyl-CoA-Hydrataseaktivität,

- 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenaseaktivität, und

- 3-Ketoacyl-CoA-Thiolaseaktivität.
27. Mittel für die Analyse nach Anspruch 26, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel ein wasserlösliches Magnesiumsalz enthält, welches Magnesiumionen erzeugt.
28. Mittel für die Analyse nach Anspruch 26 oder 27, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Mittel für die Analyse von Fettsäure umfaßt.
29. Mittel für die Analyse nach Anspruch 26 oder 27, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel für die Analyse mindestens einen Fettsäureester oder eine Enzymaktivität enthält, die aus dem Fettsäureester Fettsäure freisetzt, und daß es zur Analyse von einer der Komponenten des Fettsäureesters und der Enzymaktivität dient. 35
30. Mittel für die Analyse nach Anspruch 29» dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel für die Analyse ein Mittel ist, um Lipaseaktivität zu analysieren, und daß es Monoglycerid, Diglycerid oder Triglycerid als Fettsäureester enthält.
31. Mittel für die Analyse nach Anspruch 30, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel für die Analyse von Lipase Albumin enthält.
32. Mittel für die Analyse nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel für die Analyse ein Mittel für die Analyse eines Fettsäureesters ist und Enzymaktivität von Lipase enthält.
33. Mittel für die Analyse nach Anspruch 32, dadurch gekennzeichnet, daß es ein Mittel für die Analyse von Triglycerid enthält.
34. Mittel für die Analyse nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel für die Analyse ein Mittel ist, welches der Analyse von Phospholipase A₁-Aktivität, Phospholipase A₂-Aktivität oder Phospholipase B-Aktivität dient und Lecithin als Fettsäureester enthält.
35. Mittel für die Analyse nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel für die Analyse ein Mittel für die Analyse von Lysophospholipase-Aktivität ist und Lysolecithin als Fettsäureester enthält.
36. Mittel für die Analyse nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel für die Analyse ein Mittel für die Analyse von Phosphatidinsäurephosphatase-Aktivität ist und Phosphatidinsäure als Fettsäureester enthält.
37. Mittel für die Analyse nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel für die Analyse ein Mittel für die Analyse von Phospholipase C-Aktivität ist und Lecithin als Fettsäureester und Lipase als Enzymaktivität enthält.
38. Mittel für die Analyse-nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel für die Analyse ein Mittel für die Analyse von Phospholipase D-Aktivität ist und Lecithin als Fettsäureester und Phosphatidinsäurephosphatase und Lipase als Enzymaktivitäten enthält.
39. Mittel für die Analyse nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel für die Analyse ein Mittel für die Analyse von Cholinesteraseaktivität ist und Acylcholin als Fettsäureester enthält.
40. Mittel für die Analyse nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel für die Analyse ein Mi ttel für die Analyse von Cholesterinesteraseaktivität ist und Cholesterinester als Fettsäureester enthält.
41. Mittel für die Analyse nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel für die Analyse ein Mi ttel für die Analyse von Lecithin ist und Enzymaktivitäten von Phospholipase A₁, Phospholipase A₂» Phospholipase B, Phospholipase C und Lipase oder Enzymaktivitäten von Phospholipase D, Phosphatidinsäurephosphatase und Lipase enthält.
42. Mittel für die Analyse nach Anspruch 29, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel für die Analyse ein Mittel für die Analyse von Cholesterinester ist und Enzymaktivität von Cholesterinesterase enthält.
43. Mittel für die Analyse nach Anspruch 29» dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel für die Analyse ein Mittel für die Analyse von Lecithin:Gholesterinacyltransferaseaktivität ist und Cholesterin und Lecithin als Fettsäureester und Enzymaktivität von Cholesterinesterase oder Lysophospholipase enthält.
44. Mittel für die Analyse nach Anspruch 29» dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel für die Analyse ein Mi ttel für die Analyse von Cholesterin ist und Lecithin als Fettsäureester und Enzymaktivitäten von Lecithin: Cholesterinacyltransferase und Cholesterinesterase oder Lysophospholipase enthält.
45. Mittel für die Analyse nach einem der Ansprüche 26 "bis 44, dadurch gekennzeichnet, daß die Enzymaktivität ein multiaktives Enzym ist, welches eine Enoyl-CoA-Hydrataseaktivität, 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenaseaktivität und 3-Ketoacyl-CoA-Thiolaseaktivität in einem einzigen Enzymprotein enthält.
46. Mittel für die Analyse nach Anspruch 45» dadurch gekennzeichnet, daß das multiaktive Enzym ein aus einem Mikroorganismus, der zu Pseudomonas fragi gehört und multiaktives Enzym erzeugt, erhaltenes Enzym ist.
47. Mittel für die Analyse nach Anspruch 46, dadurch gekennzeichnet, daß der das multiaktive Enzym erzeugende Stamm Pseudomonas fragi B-0771 FERM-P Nr.5701 ist.
48. Mittel für die Analyse nach einem der Ansprüche 26 bis 47, dadurch gekennzeichnet, daß das Mittel für die Analyse ein Wasserstoffatom-Transferchromogen, ein Akzeptor für ein Wasserstoffatom von reduziertem NAD, enthält.
49. Mittel für die Analyse nach Anspruch 48, dadurch gekennzeichnet, daß das Wasserstoffatom-Transferchromogen Diaphorase und ein wasserlösliches Tetrazoliumsalz enthält.
50. Verfahren zur Herstellung eines Enzyms, dadurch

gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus, der zum Genus Pseudomonas gehört und der ein Enzym mit Enoyl-CoA-Hydratase-Aktivität, 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase-Aktivität und ^-Ketoacyl-CoA-Thiolase-Aktivität aufweist, züchtet und das Enzym isoliert.
51. Verfahren nach Anspruch 50, dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus ein Stamm ist, der zu Pseudomonas fragi gehört.
52. Verfahren nach Anspruch 511 dadurch gekennzeichnet, daß der Mikroorganismus Pseudomonas fragi B-0771 FERM-P Nr. 5701 ist.