DE3223874C2

DE3223874C2 -

Info

Publication number: DE3223874C2
Application number: DE3223874A
Authority: DE
Inventors: Shigeyuki Imamura; Hideo Misaki; Hidehiko Ishikawa; Kazuo Tagata Shizuoka Jp Matsuura
Original assignee: Toyo Jozo KK
Current assignee: Asahi Kasei Corp
Priority date: 1981-06-25
Filing date: 1982-06-25
Publication date: 1991-05-02
Also published as: DE3249973C2; CA1215903A; IT8222048A0; FR2508487B1; CH664631A5; IT1157281B; FR2508487A1; US4491631A; GB2105843A; GB2105843B; DE3223874A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Mittel für die Analyse für eine Komponente in einer Probe, beispielsweise für eine freie Fettsäure, einer aus einem Fettsäureester freigesetzten Fettsäure, eines Fettsäureesters oder der Enzymaktivität, durch die aus einem Fettsäureester freie Fettsäure freigesetzt wird, sowie die Verwendung des Mittels.

Bekannte Enzyme für die β-Oxidation einer Fettsäure und ihre Enzymwirkungen sind wie folgt:

[Reaktion I: Acyl-CoA-Synthetase, EC 6. 2. 1. 3]

⇆ R-CH₂-CH₂-CO-SCoA + AMP + PPi.

[Reaktion II: Acyl-CoA-Dehydrogenase, EC 1. 3. 99. 3] (oder Acyl-CoA-Oxidase)

R-CH₂-CH₂-CO-SCoA - 2H⁺ - 2e⁺ ⇆ R-CH=CH-CO-SCoA

[Reaktion III: Enoyl-CoA-Hydratase, EC 4. 2. 1. 17]

[Reaktion IV: 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase, EC 1. 1. 1. 35]

[Reaktion V: 3-Ketoacyl-CoA-Thiolase, EC 2. 3. 1. 16]

Als enzymatische Analysenverfahren für freie Fettsäure in Serumproben sind die folgenden bekannt.

Proben mit einem Gehalt der freien Fettsäure werden mit Acyl-CoA-Synthetase in Anwesenheit von CoASH (Coenzym A) und ATP (Adenosintriphosphat) unter Bildung von Acyl-CoA, AMP (Adenosinmonophosphat) und Pyrophosphat behandelt. Das gebildete AMP wird mit Myokinaseaktivität in Anwesenheit von ATP unter Bildung von zwei Molverhältnissen ADP (Adenosindiphosphat) aus einem Molverhältnis AMP behandelt. Das so gebildete ADP wird mit Phosphoenol pyruvat in Anwesenheit von Pyruvatkinaseaktivität unter Bildung von ATP und Pyruvat behandelt, welches mit Lactatdehydrogenase und reduziertem NAD (Nicotinadenindinucleotid) unter Freisetzung von Lactat und NAD behandelt wird, wobei die verbrauchte Menge an reduziertem NAD photometrisch unter Verringerung der optischen Dichte bei 340 nm gemessen wird, wodurch die zwei Molverhältnisse an verbrauchtem, reduzierten NAD aus einem Molverhältnis Fettsäure berechnet werden [Analytical Biochemistry, 98, 341-345 (1979)].

Ein anderes Analysenverfahren für die freie Fettsäure ist bekannt. Bei diesem Verfahren wird die freie Fettsäure mit CoASH und ATP in Anwesenheit von Acyl-CoA- Synthetase unter Bildung von Acyl-CoA, AMP und Pyrophosphat umgesetzt. Das gebildete Acyl-CoA verbraucht Sauerstoff in Anwesenheit von Acyl-CoA-Oxidase unter Bildung von 2,3-trans-Enoyl-CoA und Wasserstoffperoxid. Das so gebildete Wasserstoffperoxid wird mit 4-Aminoantipyrin, 2,4-Dibromphenol und Peroxidase unter Bildung eines Farbkomplexes, der colorimetrisch gemessen wird, umgesetzt; [Anal. Biochem., 108, 6-10 (1980)].

Diese Analysenverfahren besitzen eine Reihe von Nachteilen. Bei dem Verfahren, bei dem Acyl-CoA-Oxidaseaktivität verwendet wird, wird das gebildete Wasserstoffperoxid durch CoASH reduziert, und die zweite Reaktionsstufe sollte durchgeführt werden, nachdem das verbleibende CoASH der ersten Reaktionsstufe in die nicht-reduzierende Substanz durch N-Äthylmaleinid überführt wurde. Daher ist eine gleichzeitige Reaktion unmöglich. Es ist ein weiterer Nachteil, daß die Lipaseaktivität im Serum so schwach ist und somit die Menge an aus dem Fettsäureester freigesetzter Fettsäure, ein Substrat für die Lipaseaktivitätsanalyse, so gering ist. Diese Verfahren ermöglichen keine empfindliche Analyse. Bei dem ersteren Analysenverfahren ist die quantitative Bestimmung der erniedrigten Menge an 2 Molverhältnissen von reduziertem NAD aus 1 Molverhältnis der Fettsäure nicht ausreichend empfindlich.

Es wurde nun gefunden, daß die freie Fettsäure oder die aus ihrem Ester freigesetzte Fettsäure in einer Probe leicht nachgewiesen werden kann, indem man verschiedene Verfahren kombiniert. Die Fettsäure wird in Acyl-CoA überführt, welches in Dehydroacyl-CoA umgewandelt wird, die Dehydroacyl-CoA wird in Hydroxyacyl-CoA umgewandelt, die Hydroxyacyl-CoA wird in Ketoacyl-CoA transformiert und die Ketoacyl-CoA wird in Acyl-CoA umgewandelt.

Das bei der letzten Reaktionsstufe gebildete Acyl-CoA besitzt ein Acyl-CoA, welches um 2 Kohlenstoffatome kürzer ist als die Acylgruppe, verglichen mit der Fettsäure in der Probe. Das Acyl-CoA wird zu Dehydroacyl-CoA, Hydroxyacyl-CoA und Ketoacyl-CoA zersetzt, wobei ein Zyklus durchlaufen wird, bei dem 2 Kohlenstoffatome weniger als bei der Fettsäure im Endprodukt in Erscheinung treten.

Dieser Zyklus besitzt eine hohe Zyklusordnung, abhängig von der Zahl der Kohlenstoffatome der Fettsäure in der Probe. Bei den Zyklusreaktionen der hohen Ordnung können höhere Molverhältnisse der Komponenten, die gebildet oder verbraucht werden, wenn man von 1 Molverhältnis Fettsäure ausgeht, als nachweisbare Änderungen nach verschiedenen Verfahren nachgewiesen werden.

Bei diesem Analysen- bzw. Assayverfahren wird die Fettsäure in der Probe wie folgt abgebaut:

(a) Acyl-CoA wird durch die Einwirkung von Acyl- CoA-Synthetaseaktivität in Anwesenheit von ATP oder GTP und CoASH gebildet;
(b) Acyl-CoA wird in Dehydroacyl-CoA durch Acyl- CoA-Oxidaseaktivität und Sauerstoff umgewandelt;
(c) Dehydroacyl-CoA wird in Hydroxyacyl-CoA durch Enoyl-CoA-Hydrataseaktivität und Wasser umgewandelt;
(d) Hydroxyacyl-CoA wird in Ketoacyl-CoA durch NAD und 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenaseaktivität transformiert; und
(e) Ketoacyl-CoA wird zu dem um 2 Kohlenstoffatome ärmeren Acyl-CoA durch CoASH und 3-Ketoacyl-CoA- Thiolase transformiert.

Das so gebildete Acyl-CoA wird erneut über den β-Oxidationszyklus abgebaut, wobei nachweisbare Änderungen im Zyklus nachgewiesen werden können.

Ein Bakterienstamm, der zum Genus Pseudomonas gehört und aus einer Bodenprobe isoliert wurde, die auf einer Birnenplantage in Sudamacho, Kitakoma-gun, Yamanashi-ken, Japan, gesammelt wurde, bildet ein Enzym, welches Multiaktivenzym-Aktivitäten aufweist, nämlich die von Enoyl-CoA-Hydratase der obigen Reaktion III, von 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase der obigen Reaktion IV und von 3-Ketoacyl-CoA-Thiolase der obigen Reaktion V. Dieses Enzym liegt als einfaches Enzymprotein vor (es wird im folgenden als "multiaktives Enzym" bezeichnet). Das multiaktive Enzym kann für die Analyse (Assay) einer Fettsäure verwendet werden.

Der Bakterienstamm B-0771 besitzt die folgenden taxonomischen Eigenschaften:

(A) Makroskopische Beobachtungen:
- (1) Nähragarplatte:
  die Kolonien sind konvex, rund, mit glatten Enden, semi-glänzend, gräulichweiß bis blaßgelb; keine Bildung an löslichem Pigment.
- (2) Nähragarschrägplatte:
  lineares, gutes Wachstum; halbglänzend, gräulichweiß bis blaßgelb; keine Bildung an löslichem Pigment.
- (3) Flüssige Kultur:
  homogen trübe, Präzipitation; keine Kapselbildung.
(B) Mikroskopische Beobachtungen:
gerade oder etwas gebogene Bacilli; einfache oder doppelte, manchmal lange Ketten; 0,4 bis 0,6 × 0,5 bis 3,0 µm; beweglich mit polaren Flagella; keine Sporenbildung.

(C) Physiologische und biochemische Eigenschaften:

Gram-Färbung
-
O. F.-Test	0
Catalase	+
Oxidase	+
Lecithinase	-
Urease @	SSR-Medium	-
Christensen-Medium	+
Gelatinehydrolyse	-
Stärkehydrolyse	-
Caseinhydrolyse	-
Äsculinhydrolyse	-
Argininhydrolyse	+
Poly-β-hydroxybutyrat(PHB)-Akkumulation	-
Indolbildung	-
Hydrogensulfatbildung	-
Acetoinbildung	-
MR-Test	-
Nitratreduktion	-
Citratausnutzung	+

Säurebildung aus Zucker:
Säurebildung, keine Gasbildung:
L(+)-Arabinose, Cellobiose, Fructose, Fucose, Galactose, Glucose, Glycerin, Lactose, Maltose, Mannose, Melibiose, Rhamnose, Saccharose, Trehalose, Xylose;
keine Säurebildung, keine Gasbildung:
Adnit, Dulcit, Mesoerythrit, Inosit, Inulin, Mannit, Melezitose, Raffinose, Salicin, Sorbose, Sorbit, Stärke.

Wie zuvor erwähnt, wird der Stamm B-0771 mit den Eigenschaften gramnegativ, beweglich mit polaren Flagella, Catalase und Oxidase positiv, aerob in der Natur bei oxidativem Abbau von Glucose als Mikroorganismus erkannt, der zum Genus Pseudomonas gehört.

Unter Bezugnahme auf die Beschreibung von Pseudomonas fragi in J. Gen. Micotrobiol., 25, 379-408 (1961), ist der Stamm identisch mit den jeweiligen wie folgt:

Weiterhin wurden Vergleichsuntersuchungen des Stammes B-0771 und einer Kultur des Typs Pseudomonas fragi ATCC 4973 durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 aufgeführt.

Wie aus der obigen Tabelle folgt, besitzt der Stamm B-0771 ähnliche taxonomische Eigenschaften wie der eines Kulturstammes des Typs Pseudomonas fragi ATCC 4973.

Der Stamm B-0771 wird als Pseudomonas fragi B-0771 bezeichnet und wurde am 5. September 1980 im Fermentation Institute, Agency of Industrial Technology & Sciences, M. I. T. I., Japan, unter der Hinterlegungsnummer 5701 hinterlegt. Die FERM-P 5701 Hinterlegung wurde in eine Hinterlegung nach dem Budapester Vertrag FERM BP-1827 umgewandelt.

Dere vorliegenden Erfindung liegt somit die Aufgabe zugrunde, ein Mittel für ein Analysenverfahren für eine Komponente in einer Probe zur Verfügung zu stellen, das die folgenden Reaktionsstufen umfaßt:

(a) ein Verfahren, bei dem eine Fettsäure in Acyl-CoA umgewandelt wird;
(b) ein Verfahren, bei dem Acyl-CoA in Dehydroacyl- CoA umgewandelt wird;
(c) ein Verfahren, bei dem Dehydroacyl-CoA in Hydroxyacyl-CoA umgewandelt wird;
(d) ein Verfahren, bei dem Hydroxyacyl-CoA in Ketoacyl-CoA umgewandelt wird;
(e) ein Verfahren, bei dem Ketoacyl-CoA in Acyl- CoA umgewandelt wird; und
ein Verfahren, gemäß dem die nachweisbaren Änderungen nachgewiesen werden.

Gegenstand der Erfindung ist ein Mittel für die Analyse, welches dadurch gekennzeichnet ist, daß es die folgenden Bestandteile enthält:

- ATP oder GTP,
- CoASH,
- NAD,
- Acyl-CoA-Synthetaseaktivität,
- Acyl-CoA-Oxidaseaktivität,
- Enoyl-CoA-Hydrataseaktivität,
- 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenaseaktivität, und
- 3-Ketoacyl-CoA-Thiolaseaktivität.

Die Erfindung betrifft ebenfalls die Verwendung des oben genannten Mittels in einem Analysenverfahren zum Nachweis einer freien Fettsäure, einer aus einem Fettsäureester freigesetzten Fettsäure, einem Fettsäureester oder der Enzymaktivität, durch die aus einem Fettsäureester freie Fettsäure freigesetzt wird.

Eine Probe, die mit dem erfindungsgemäßen Mittel analysiert werden kann, ist beispielsweise eine Probe, die eine Fettsäure enthält, bzw. eine Probe, die mindestens eine Fettsäure enthält. Beispiele von Fettsäuren sind Capronsäure C₆, Caprylsäure C₈, Caprinsäure C₁₀, Laurinsäure C₁₂, Myristinsäure C₁₄, Palmitinsäure C₁₆, Palmitoleinsäure, Stearinsäure C₁₈, Ölsäure, Linolsäure und Linolensäure.

Weitere Beispiele von Fettsäuren, die analysiert werden können, sind freie Fettsäuren oder Fettsäureester als Komponenten in Milchprodukten, wie Butter, Margarine, Käse, Schinken; Milch oder Mayonnaise; freie Fettsäuren oder Fettsäureester in solchen Proben, wie Blut und Urin; Reaktionsprodukte ihrer enzymatischen Einwirkungen; freie Fettsäuren oder ihre Salze und Fettsäureester als Komponenten in Arzneimittelzubereitungen; oder Fettsäuren als Substrate für im Handel erhältliche Enzymreagentien oder freigesetzte Fettsäuren, die durch Einwirkung von im Handel erhältlichen Enzymen freigesetzt werden.

Die Fettsäure kann aus dem Fettsäureester durch alkalische Verseifung unter Verwendung von Natriumhydroxid oder Kaliumhydroxid oder durch enzymatische Einwirkung freigesetzt werden. In der Kombination aus Fettsäureester und enzymatischer Aktivität unter Bildung von Fettsäure kann der Fettsäureester analysiert werden, nachdem die Fettsäure freigesetzt wurde, und die enzymatische Aktivität kann ebenfalls analysiert werden, indem man die freigesetzte Fettsäure aus der den Fettsäureester enthaltenden Probe analysiert. Diese Kombinationen sind in keiner Weise beschränkt und alle möglichen Kombinationen, bei denen Fettsäure freigesetzt wird, können verwendet werden.

Bei der Kombination, bei der der Fettsäureester ein Triglycerid ist, wie Monoglycerid, Diglycerid oder Triglycerid, und bei der die enzymatische Aktivität eine Lipaseaktivität ist, kann das Glycerid oder die Lipaseaktivität analysiert werden, indem man die aus dem Glycerid freigesetzte Fettsäure bestimmt.

Diese Analysen werden bei der Triglyceridanalyse im Serum und bei der pankreatischen Lipaseanalyse im Serum verwendet. Im letzteren Fall kann ein Trübung im Reaktionssystem vermieden werden, indem man bevorzugt Mono- oder Diglycerid verwendet und Albumin, wie Rinderalbumin, zugibt.

Ein Kombinationssystem für den Fettsäureester und das Enzym, welches auf den Fettsäureester einwirkt, wird im folgenden als Beispiel angegeben:

Fettsäureester
Enzymaktivität
Lecithin
Phospholipase A₁, Phospholipase A₂ oder Phospholipase B
Lysolecithin	Lysophospholipase
Phosphatidat	Phosphatidatphosphatase und Lipase
Lecithin	Phospholipase C und Lipase
Lecithin	Phospholipase D, Phosphatidatphosphatase und Lipase
Acylcholin	Cholinesterase
Cholesterinester	Cholesterinesterase
Lecithin und Cholesterin	Lecithincholesterinacyltransferase, Cholesterinesterase und Lysophospholipase

Fettsäure-verwandte Komponenten, wie die Substrate und Enzyme, wie sie vorstehend erwähnt wurden, können analysiert werden, indem man die Fettsäure analysiert. Bei den Systemen, bei denen Fettsäure freigesetzt wird, wird die Menge an Reagentien beliebig ausgewählt, abhängig von der Aufgabe und den Reaktionsbedingungen, und sie sollte so sein, daß die Menge an Fettsäure, die bei der Reaktion freigesetzt wird, im wesentlichen ausreicht. Die Reaktionstemperatur für die Freisetzung der Fettsäure beträgt normalerweise etwa 37°C, und die Reaktionszeit sollte natürlich eine Zeit sein, die ausreicht, um die Fettsäure freizusetzen, und sie beträgt mehr als 1 min.

Ausführungsformen für die Reaktionsverfahren (a), (b), (c), (d) und (e), die zuvor angegeben wurden, werden im folgenden erläutert.

(a) Reaktionsverfahren, bei dem die Fettsäure in Acyl- CoA umgewandelt wird

Beispielsweise kann ein Reaktionsverfahren, bei dem die Acyl-CoA-Synthetaseaktivität, die eine Reaktion aus Fettsäure, ATP und CoASH zum Acyl-CoA, AMP und Pyrophosphat (PPi), ATP und CoASH katalysiert, erwähnt werden.

(b) Reaktionsverfahren, bei dem Acyl-CoA in Dehydroacyl- CoA umgewandelt wird

Beispielsweise kann ein Reaktionsverfahren, bei dem die Acyl-CoA-Oxidaseaktivität, die eine Reaktion von Acyl- CoA und Sauerstoff zu Dehydroacyl-CoA und Wasserstoffperoxid und Sauerstoff katalysiert, erwähnt werden.

(c) Reaktionsverfahren, bei dem Dehydroacyl-CoA in Hydroxyacyl-CoA umgewandelt wird

Beispielsweise kann ein Reaktionsverfahren, bei dem die Enoyl-CoA-Hydrataseaktivität, die eine Reaktion von Dehydroacyl-CoA zu Hydroxyacyl-CoA in Gegenwart von Wasser und Wasser katalysiert, erwähnt werden.

(d) Reaktionsverfahren, bei dem Hydroxyacyl-CoA in Ketoacyl-CoA umgewandelt wird

Beispielsweise kann ein Reaktionsverfahren, bei dem 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase, die eine Reaktion von Hydroxyacyl-CoA und NAD zu Ketoacyl-CoA und reduziertem NAD und NAD katalysiert, erwähnt werden.

Das bei den obigen Verfahren verwendete Enzym kann ein Enyzm sein, das aus Tieren oder Mikroorganismen stammt. Es können im Handel erhältliche Enzyme und isolierte Enyzme jeglichen Ursprungs verwendet werden.

(e) Reaktionsverfahren, bei dem Ketoacyl-CoA in Acyl-CoA umgewandelt wird

Beispielsweise kann ein Reaktionsverfahren, bei dem 3- Ketoacyl-CoA-CoA-Thiolase auftritt, die eine Reaktion von Ketoacyl-CoA zu Acyl-CoA und Acethyl-CoA in Anwesenheit von CoASH und CoASH katalysiert, erwähnt werden.

Beispiele für den Ursprung der Acyl-CoA-Synthetase werden im folgenden erläutert:

Meerschweinchenleber [J. Biol. Chem., 204, 329 (1953)];
Ratten-, Mäuse-, Rinder- und Schweineleber (JP-OS 55-74 791);
Escherichia coli [Eur. J. Biochem., 12, 576 (1970)];
Bacilluse megaterium [Biochem., 4(1), 85 (1965)];
Aerobacter aerogenes IFO 3318, Seratia marcescens IFO 3052, Proteus mirabilis IFO 3849, Stphylococcus aureus IFO 3060, Pseudomonas aeruginosa IFO 3919, Fusarium oxysporum IFO 5942, Gibberella fujikuroi IFO 6604 und Candida lipolytica IFO 0717 [J. Bateriol., 105(3), 1216 (1971); ibid., 114(1), 249 (1973); JP-OS 55-74 790; ibid. Nr. 55-99 187].

Eine weitere Ausführungsform von Acyl-CoA-Synthetase ist ein Enzym, welches die Reaktion der Fettsäure, GTP und CoASH zu Acyl-CoA, GDP und Orthophosphat katalysiert [bovine liver, J. Biol. Chem., 239(6), 1694 (1964)].

Möglichkeiten für den Ursprung von Acyl-CoA-Oxydase sind: Rattenleber [Biochem. Biophys. Res. Comm., 83 (2), 479 (1978)]; Candida utilis, Candida lipolytica IFO 1548, Candida tropicalis IFO 0589, Saccharomyces cerevisiae IFO 0213, Saccharomyces cerevisiae Y0036 FERM-P Nr. 5174 (DSM 2138) (JA-OS 56-51 991); Eupenicillium javanicum IFO 7992, Monascus sp. M-4800 FERM-P Nr. 5225 (DSM 2136) (ibid., Nr. 56-61 991); Aspergillus candidus M-4815 FERM- P Nr. 5226 (DSM 2135) (ibid., Nr. 56-61 991); Arthrobacter sp. B-0720 FERM-P Nr. 5224 (DSM 2137) (ibid., Nr. 51- 61 991); Macrophomina phaseoli ATCC 14 383, Cladosporium resinae IFO 6367 [Arch. Biochem. Biophys., 176, 591 (1976), JA-OS Nr. 55-1 18 391, ibid., Nr. 56-8683, ibid. Nr. 56-61 991].

Die obige Acyl-CoA-Oxidase kann durch Acyl-CoA-Dehydrogenase [EC 1. 3. 99. 3, Acyl-CoA: (Akzeptor) Oxidoreductase] ersetzt werden. Dieses Enzym kann beispielsweise aus Schweine-, Rinder- und Schafsleber erhalten werden [J. Biol. Chem., 218, 717 (1956), ibid., 218, 701 (1956), J. Am. Chem. Soc., 75, 2787 (1953), Biochem. Biophys. Acta, 22, 475 (1956)].

Bei der Reaktion von Acyl-CoA zu Dehydroacyl-CoA wird ein Elektronenakzeptor, z. B. 2,6-Dichlorphenolindophenol, 2-(p-Jodphenyl)-3-(p-nitrophenyl)-5-phenyl-2H-tetrazoliumchlorid (INT), 3-(4;5-Dimethyl)-2-thiazolyl-2,5-diphenyl- 2H-tetrazoliumbromid (MTT), 3,3′-(4,4′-Biphenylen)- bis-(2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumchlorid) (neo-TB), 3,3′- (3,3′-Dimethoxy-4,4′-biphenylen)-bis-[2-(p-nitrophenyl)- 5-phenyl-2H-tetrazoliumchlorid] (NTB), 3,3′-(3,3′-Dimethoxy- 4,4′-bis-[2,5-bis-(p-nitrophenyl)]-2H-tetrazoliumchlorid) (TNTB) oder 3,3′-(3,3′-Dimethoxy-4,4′-biphenylen)- bis-(2,5-diphenyl-2H-tetrazoliumchlorid) (TB), mit Phenazinmethosulfat verwendet.

Enzyme, die Enoyl-CoA-Hydrataseaktivität, 3-Hydroxyacyl- CoA-Dehydrogenaseaktivität und 3-Ketoacyl-CoA-Thiolaseaktivität zeigen, werden bevorzugt aus Geweben, in denen sie enthalten sind, isoliert [J. Biol. Chem. 218, 971 (1956), ibid., 207, 631 (1954), ibid., 208, 345 (1954), Angew. Chem., 64, 687 (1952), und Biochim. Biophys. Acta, 26, 448 (1957)].

Das multiaktive Enzym, welches Enoyl-CoA-Hydrataseaktivität, 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenaseaktivität und 3-Ketoacyl- CoA-Thiolaseaktivität in einem einzigen Enzymprotein enthält, wird bevorzugt verwendet. Beispiele von Mikroorganismen, die dieses Enzym erzeugen, sind Escherichia coli [Proc. Natl. Acad. Sci., 74 (2), 492 (1977)] und Pseudomonas fragi B-0771 FERM BP-1827.

Das aus Pseudomonas fragi B-0771 FERM BP-1827 erhaltene Enzym besitzt die folgenden Eigenschaften.

(1) Analysenverfahren für die Enzymaktivität (a) Analysenverfahren für die Enoyl-CoA-Hydrataseaktivität


ml
0,2 M Tris-HCl-Puffer (pH 9,0)
0,4
1 M KCl	0,1
40 mM NAD	0,1
15 mM Palmitenoyl-CoA	0,1
1% Rinderserumalbumin	0,05
0,25% Nitrotetrazoliumblau	0,1
125 E/ml 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase (Boehringer)	0,01
destilliertes Wasser	0,04
insgesamt	1,00

Das obige Reaktiongsgemisch wird 2 min bei 37°C vorinkubiert (vorbebrütet) und die Enzymlösung wird zugegeben und dann wird 10 min bei 37°C bebrütet. 0,5% Natriumdodecylsulfat (2,0 ml) werden zur Beendigung der Reaktion zugesetzt und die optische Dichte (Absorption bei ΔA₅₅₀) wird bei einer Wellenlänge von 550 nm bestimmt.

Eine Einheit (1 E) des Enzyms wird als Menge des Enzyms definiert, welche 1 µmol reduziertes NAD in 1 min freisetzt. Die Enzymaktivität wird durch die folgende Gleichung definiert:

(b) Analysenverfahren für 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase


ml
0,2 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,5)
0,5
1 M KCl	0,05
40 mM NAD	0,1
15 mM 3-Hydroxypalmitoyl-CoA	0,1
1% Rinderserumalbumin	0,05
0,25% Nitrotetrazoliumblau	0,1
30 E/ml Diaporase	0,1
insgesamt	1,00

Die Enzymlösung (50 µl) wird zu dem obigen Reaktionsgemisch zugegeben, das 2 min bei 27°C vorbebrütet wird, und dann wird 10 min bei 37°C bebrütet. 0,5% Natriumdodecylsulfat (2,0 ml) werden zur Beendigung der Reaktion zugegeben und dann wird die Absorption bei 550 nm (ΔA₅₅₀) bestimmt. Eine Einheit (1 E) wird als Menge des Enzyms definiert, das 1 µmol reduziertes NAD in 1 min freisetzt. Die Enzymaktivität wird gemäß der folgenden Gleichung definiert:

(c) Analysenverfahren für 3-Ketoacyl-CoA-Thiolase


ml
0,2 M Tris-HCl-Puffer (pH 8,0)
0,2
10 mM CoASH	0,05
0,2 mM 3-Ketopalmitoyl-CoA	0,1
100 mM MgCl₂	0,1
1 mM Dithiothreit	0,1
dest. Wasser	0,45
insgesamt	1,00

Zu dem Reaktionsgemisch in einer 1 ml-Quarzzelle gibt man bei 37°C 20 µl Enzymlösung und inkubiert bei 37°C. Die erniedrigte Menge an 3-Ketopalmitoyl-CoA, die entsprechend der Reaktion verbraucht wird, wird zu einem bestimmten Zeitpunkt durch Änderung der optischen Dichte (Absorption) bei 303 nm (OD₃₀₃) erneut bestimmt. Eine Einheit (1 E) wird als Menge des Enzyms definiert, die 1 µmol 3-Ketopalmitoyl-CoA in 1 min verbraucht. Die Enzymaktivität wird in der folgenden Gleichung definiert:

(2) Enzymeinwirkung

Es werden die folgenden Enzymaktivitäten beobachtet:

Enoyl-CoA-Hydratase: katalysiert eine Reaktion, bei der 1 Mol Hydroxyacyl-CoA aus 1 Mol Dehydroacyl-CoA und 1 Mol Wasser gebildet wird.
3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase: katalysiert eine Reaktion, bei der 1 Mol Ketoacyl-CoA und 1 Mol reduziertes NAD aus 1 Mol Hydroxyacyl-CoA und 1 Mol NAD gebildet werden.
3-Ketoacyl-CoA-Thiolase: katalysiert eine Reaktion, bei der 1 Mol Acyl-CoA und 1 Mol Acetyl-CoA aus 1 Mol Ketoacyl- CoA und 1 Mol CoASH gebildet werden.

(3) Augenschein für ein einziges Enzymprotein

Das rohe Enzym wird aus Mikrobenzellen von Pseudomonas fragi B-0771 hergestellt und mittels verschiedener Reinigungsverfahren gereinigt. Die Enzymaktivität wird jeweils gemäß den zuvor erwähnten Analysenverfahren bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 aufgeführt. Die in Tabelle 2 gewählten Abkürzungen haben folgende Bedeutung:

EHA = Enoyl-CoA-Hydrataseaktivität
HDA = 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenaseaktivität
KTA = 3-Ketoacyl-CoA-Thiolaseaktivität

Tabelle 2

Jede Enzymaktivität entspricht genau einem Verhältnis von Aktivität bei jeder Reinigungsstufe, und diese drei Enzymaktivitäten verbleiben im gleichen Protein. Daher sind alle drei Enzymaktivitäten in einem einzigen Enzymprotein lokalisiert.

Das in dem folgenden Beispiel erhaltene, gereinigte Enzym (2,0 mg) (gereinigt mittels Toypeal HW-60 Säulenchromatographie) wird in einer isoelektrischen Fokussierelektrophorese unter Verwendung eines Trägerampholyten befördert und jede Enzymaktivität wird gemessen. Drei Enzymaktivitäten werden in einem einzigen Peak in einer Fraktion bei pH 4,9 nachgewiesen.

(4) Substratspezifizität

3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenaktivität wird unter Verwendung von 3-Hydroxyacyl-CoA mit den folgenden Kohlenstoffzahlen gemessen:

Substrat
Relative Aktivität (%)
3-Hydroxycaproyl-CoA
56,5
3-Hydroxycaprylyl-CoA	88,1
3-Hydroxycapryl-CoA	99,0
3-Hydroxylauryl-CoA	100,0
3-Hydroxymyristoyl-CoA	98,0
3-Hydroxypalmitoyl-CoA	75,5
3-Hydroxystearyl-CoA	30,5
3-Hydroxyarachidoyl-CoA	9,5
3-Hydroxyoleyl-CoA	57,5
3-Hydroxylinolenyl-CoA	99,0

Das Enzym besitzt also mindestens Substratspezifizität bei Palmitoenoyl-CoA und 3-Ketopalmitoyl-CoA.

(5) Optimaler pH

3-Hydroxypalmitoyl-CoA wird als Substrat verwendet. Die 3-Hydroxyacyl-CoA-Aktivität wird unter Verwendung von Tris-HCl-Puffer bei pH 7,5 bis 9,5 bestimmt. Die Ergebnisse sind in Fig. 1 dargestellt. Der optimale pH liegt ungefähr pH 9.

(6) pH-Stabilität

Enzymlösung (5 E/ml), gelöst in verschiedenen 10 mM Pufferlösungen (pH 4 bis 7: Dimethylglutarat-NaOH-Puffer; pH 7,5 bis 9: Tris-HCl-Puffer), wird 60 min bei 37°C inkubiert, und die verbleibende Aktivität wird gemäß einem Analysenverfahren für die 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenaseaktivität gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 2 dargestellt, wobei das Enzym bei pH 5 bis 8 stabil ist.

(7) Wärmestabilität

Enzymlösung (15 E/ml), gelöst in 10 mM Dimethylglutarat- NaOH-Puffer (pH 7,0), wird 10 min bei verschiedenen Temperaturen inkubiert, und die verbleibende Aktivität wird gemäß dem Analysenverfahren für die 3-Hydroxyacyl-CoA- Dehydrogenaseaktivität gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 3 dargestellt, wobei das Enzym bis zu etwa 50°C stabil ist.

(8) Isoelektrischer Punkt

Die isoelektrische Fokussierung unter Verwendung eines Trägerampholyten erfolgt zur Messung des isoelektrischen Punktes des Enyzms, wobei der isoelektrische Punkt pH 4,9 beträgt.

(9) Einfluß von Metallionen

Der Einfluß von Metallionen auf die 3-Hydroxyacyl-CoA- Dehydrogenaseaktivität wird bestimmt.

Metallion
Relative Aktivität (%)
Vergleich
100
1 mM CaCl₂	113
1 mM MgCl₂	113
1 mM MnCl₂	32
1 mM ZnCl₂	25
1 mM CuCl₂	12
1 mM BaCl₂	106
1 mM NiCl₂	95
1 mM CoCl₂	34

(10) Einfluß von oberflächenaktiven Mitteln

Der Einfluß von oberflächenaktiven Mitteln auf die 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenaseaktivität wird bestimmt.

Oberflächenaktives Mittel
Relative Aktivität (%)
Vergleich
100
0,1% Triton X-100	96
0,1% Adekatol SO-145	81
0,1% Laurylbenzolsulfonat	0
0,1% Natriumlaurylsulfat	0
0,1% Natriumdesoxycholat	2
0,1% Cetyltrimethylammoniumchlorid	0
0,1% Cetylpyridiniumchlorid	0

Wie erläutert, besitzt das multiaktive Enzym Enoyl-CoA-Hydrataseaktivität, 3-Hydroxyacyl-CoA- Dehydrogenaseaktivität und 3-Ketoacyl-CoA-Thiolaseaktivität in einem einzigen Enzymprotein.

Ein Verfahren zur Herstellung des multiaktiven Enzyms wird im folgenden erläutert.

Die für die Herstellung des multiaktiven Enzyms verwendeten Mikroorganismen sind nicht auf das oben erwähnte Pseudomonas fragi B-0771 FERM BP-1829 beschränkt, und andere Stämme, die zum Genus Pseudomonas gehören und multiaktives Enzym ergeben, können ebenfalls bei der vorliegenden Erfindung verwendet werden.

Es werden Mikroorganismen, die multiaktives Enzym erzeugen und zu Pseudomonas gehören, in einem an sich bekannten Medium für die Enzymerzeugung bebrütet. Für die Fermentierung können feste und flüssige Kulturen verwendet werden, es ist jedoch eine submerse Belüftungskultur für die industrielle Produktion bevorzugt.

Nährquellen, die bei herkömmlichen Züchtungen für Mikroorganismen verwendet werden können, können ebenfalls verwendet werden. Assimilierbare Kohlenstoffquellen, wie Glucose, Saccharose, Lactose, Stärke, Maltose, Dextrin, Melassen und Glycerin, können eingesetzt werden. Assimilierbare Stickstoffquellen, wie Maisquellwasser, Sojabohnenpulver, Baumwollsamenöl, Weizengluten, Pepton, Fleischextrakt, Hefeextrakt, Hefepulver und Caseinhydrolysat, können ebenfalls verwendet werden. Salze, wie Phosphat, Sulfat und andere Salze von Magnesium, Calcium, Kalium, Natrium, Zink, Eisen und Mangan, können erforderlichenfalls eingesetzt werden. Zur Verbesserung der Produktivität des multiaktiven Enzyms werden bevorzugt Fettsäuren mit 8 bis 20 C-Atomen, wie Ölsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, zu dem Medium zugegeben.

Die Bebrütungstemperatur kann zum Züchten der Mikroorganismen und bei der Bildung des Enzyms variiert werden und beträgt 26 bis 32°C, vorzugsweise 30°C. Die Züchtungszeit hängt von den verwendeten Bedingungen ab und beträgt gewöhnlich 10 bis 40 h. Die Züchtung sollte natürlich beendet werden, wenn eine maximale Enzymaktivität erhalten wurde.

Das so gebildete, multiaktive Enzym ist in den Zellen der Mikroorganismen enthalten.

Die Isolierung des Enzyms wird wie folgt durchgeführt. Zunächst werden die gezüchteten Zellen durch Filtrieren oder Zentrifugieren gesammelt. Die Zellen werden mittels Beschallung, mit einer französischen Presse, Glasperlenbehandlung oder Lysozymbehandlung, wobei oberflächenaktive Mittel, wie Triton X-100 (Warenzeichen) oder Adekatol SO-145 (Warenzeichen) gegebenenfalls zugesetzt werden können, zerstört bzw. zerkleinert.

Das Enzym wird durch Zugabe von mit Wasser mischbaren, organischen Lösungsmitteln, wie Methanol, Äthanol oder Aceton, und durch Aussalzen unter Zugabe von Ammoniumchlorid präzipitiert. Das ausgefallene, rohe Enzym wird gereinigt, indem man das rohe Enzym löst, in einem Cellophanrohr dialysiert und unter Verwendung von DEAE-Cellulose, DEAE-Sephalose, CM-Sephadex oder ein Ionenaustauschharz chromatographiert und unter Verwendung von Sephadex G-200, Sephalose CL-6B, Sephacryl S-200 oder Toyopeal HW-60 gelfiltriert. Das erhaltene Enzym wird unter Bildung des gereinigten, multiaktiven Enzyms lyophilisiert.

Die in jedem enzymatischen Verfahren verwendete Menge an Enzym kann eine für die Enzymreaktion ausreichende Menge sein und wird in Abhängigkeit von der Menge und der Kohlenstoffzahl der Fettsäure in einer Probe variiert und ist somit nicht begrenzt. Beispielsweise wird man, wenn die Probe 0,005 bis 0,05 µMol C₁₈-Ölsäure enthält und man 5 bis 10 min bei 37°C umsetzt, eine Acyl-CoA-synthetaseaktivität von im allgemeinen über 1 E, vorzugsweise 5 bis 15 E, erhalten, und das multiaktive Enzym in einer Menge von gewöhnlich über 0,1 E, bevorzugt 1 bis 25 E, verwenden.

Die Menge an Reagentien bei den Reaktionsstufen, z. B. ATP oder GTP und CoASH bei dem Verfahren (a), NAD bei dem Verfahren (d) und CoASH bei dem Verfahren (e), sollte eine Menge sein, sie ausreicht für das Produkt in einer Menge der Fettsäure in der Probe und die Anzahl von β-Oxidationszyklen, abhängig von der Anzahl der Kohlenstoffatome in der Fettsäure. Beispielsweise sollte im Falle von 0,01 µMol Ölsäure die Menge an ATP oder GTP über 0,1 µMol, vorzugsweise 0,5 µMol; die Menge an CoASH über 0,1 und vorzugsweise über 0,5 µMol; und die Menge an NAD über 0,1 und vorzugsweise über 0,5 µMol liegen.

Bei der Reaktionsstufe (b) wird die enzymatische Wirkung von Acyl-CoA-Oxidase unter Mithilfe von gelöstem Sauerstoff in der Probe erfolgen, und bei der Stufe (c) kann Wasser in der Probe verwendet werden.

Wasserlösliche Magnesiiumsalze, wie Magnesiumchlorid, das Magnesiumionen erzeugt, können bevorzugt für die Acyl- CoA-Synthetasereaktion verwendet werden. Bei der Reaktionsstufe (b) sollte das Wasserstoffperoxid, das durch Einwirkung der Acyl-CoA-Oxidase gebildet wird, bevorzugt durch Catalaseeinwirkung entfernt werden.

Mittel bzw. Komponenten für die Analyse, die mindestens ATP oder GTP und CoASH, NAD, Acyl-CoA-Synthetaseaktivität, Acyl- CoA-Oxidaseaktivität, Enoyl-CoA-Hydrataseaktivität, 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenaseaktivität und 3-Ketoacyl- CoA-Thiolaseaktivität enthalten, können hergestellt werden.

Bei der vorliegenden Erfindung wird das multiaktive Enzym bevorzugt verwendet. Wie erläutert, werden wasserlösliches Magnesiumsalz, Catalase und nichtionische oberflächenaktive Mittel, wie Triton X-100 (Warenzeichen), als Mittel zugegeben. Die Lösung wird hergestellt, indem man neutrales bis schwach alkalisches Wasser oder Puffer zusetzt. Im Falle der Analyse eines Fettsäureesters werden Fettsäure freisetzende Mittel, wie ein Enzym, zu den Mitteln zugegeben oder alternativ wird im Falle der Analyse der Aktivität eines Enzyms auf einen Fettsäureester ein Fettsäureester zuvor zu den Komponenten zugesetzt. Beispielsweise wird dem Mittel für die Analyse der Lipaseaktivität ein Glycerid, bevorzugt ein Monoglycerid oder ein Diglycerid, als Analysenkomponente zugesetzt. Bevorzugt wird Albumin zugefügt. Bei einem Mittel für die Triglyceridanalyse wird beispielsweise Lipase zugegeben.

Weitere Ausführungsformen von Mitteln für die Analyse bzw. Zusammensetzungen für die Analyse werden im folgenden näher erläutert:

Mittel bzw. Zusammensetzungen für die Analyse der Phospholipase A₁-Aktivität, Phospholipase A₂-Aktivität und Phospholipase B-Aktivität enthalten Lecithin als Fettsäureester;
Mittel für die Analyse der Lysophospholipaseaktivität enthalten Lysolecethin als Fettsäureester;
Mittel für die Analyse der Phosphataseaktivität enthalten Phosphatidat als Fettsäureester und Lipaseaktivität;
Mittel für die Analyse der Phospholipase C-Aktivität enthalten Lecithin als Fettsäure und Lipaseaktivität;
Mittel für die Analyse der Phospholipase D-Aktivität enthalten Lecithin als Fettsäure, Phosphatidatphosphataseaktivität und Lipaseaktivität;
Mittel für die Analyse der Cholinesteraseaktivität enthalten Acylcholin als Fettsäureester;
Mittel für die Analyse der Cholinsterinesteraseaktivität enthalten Sterinester als Fettsäureester;
Mittel für die Analyse von Lecithin enthalten Phospholipase A₁-Aktivität, Phospholipase A₂-Aktivität Phospholipase B-Aktivität, Phospholipase C-Aktivität und Lipaseaktivität oder Phospholipase D-Aktivität und Phosphatidatphosphataseaktivität und Lipaseaktivität;
Mittel für die Analyse von Lysolecithin enthalten Lysophospholipaseaktivität;
Mittel für die Analyse der Cholinesterinester enthalten Cholinsterinesteraseaktivität;
Mittel für die Analyse der Lecithin-Cholesterin- Acyl-Transferaseaktivität enthalten Fettsäureester von Cholesterin und Lecithin und Cholesterinesteraseaktivität oder Lysophospholipaseaktivität; und
Mittel für die Analyse von Cholesterin enthalten Lecithin als Fettsäureester, Lecithincholesterinacyltransferaseaktivität und Cholesterinesteraseaktivität oder Lysophospholipaseaktivität.

Die Fettsäure in der Probe kann unter Verwendung der oben erwähnten Zusammensetzungen bzw. Mittel für die Analyse analysiert werden. Die Menge der Probe beträgt im allgemeinen mehr als 5 µl und wird mit mehr als 1 ml der Lösung der Mittel für die Analyse vermischt. Die Analyse erfolgt zweckdienlich bei 37°C. Die Bebrütungszeit beträgt im allgemeinen mehr als 1 min und bevorzugt 5 bis 10 min, und sie ist bevorzugt eine längere Zeit für eine höhere Empfindlichkeit.

Das Medium für die Analyse ist bevorzugt eine Pufferlösung innerhalb des stabilen pH-Bereichs der Enzyme und ist im allgemeinen schwach sauer oder eine alkalische Lösung, wie Wasser, Phosphatpuffer von pH 6,5 bis 8, Tris-HCl-Puffer, Imidazol-HCl-Puffer, Dimethylglutarat- NaOH-Puffer oder Pipes-NaOH-Puffer.

Nach der Inkubation werden die nachweisbaren Änderungen der Reaktion analysiert. Die nachweisbaren Änderungen müssen mindestens 1 Mol verbrauchte Komponenten oder erzeugte Komponenten in einem β-Oxidationszyklus betragen.

Bevorzugt werden Mengenänderungen an reduziertem NAD aus NAD in der Reaktion bestimmt. Der Nachweis für reduziertes NAD erfolgt, indem man die spezifische Absorption des reduzierten NAD mißt. NAD besitzt eine maximale Absorption bei 260 nm, wohingegen reduzierte NAD eine maximale Absorption bei 260 bis 340 nm aufweist, und somit wird die Absorption bei 320 bis 360 nm, bevorzugt bei 340 nm, verwendet.

Der Nachweis des reduzierten NAD kann weiterhin nach einem colorimetrischen Analysenverfahren, welches auf der Verfärbung eines Elektronentransfersystems, wie eines Elektronenakzeptors für reduziertes NAD, beruht, erfolgen. Verfärbungsreagentien des Elektronentransfersystems sind Elektronenakzeptoren, z. B. wasserlösliche Tetrazoliumsalze, wie INT, MTT, Neo-TB, NTB, TNTB und TB, und diese werden bevorzugt mit Diaphorase und Phenazinmethosulfat für die Verbesserung des Elektronentransports verwendet. Das Elektronentransferreagens kann bevorzugt den Komponenten für die Analyse, welche zuvor beschrieben wurden, vor der Reaktion oder nach der Reaktion zugegeben werden.

Das bei der Reaktion gebildete, reduzierte NAD kann mit den Elektronentransferreagentien unter Bildung einer Farbänderung umgesetzt werden, die bei ihrer Absorptionswellenlänge bestimmt werden kann.

Eine weitere Ausführungsform für die Analyse des reduzierten NAD besteht darin, daß das reduzierte NAD analysiert wird, indem man ein Enzym, wie reduzierte NAD- Oxidase, verwendet. Das Enzym, für das reduziertes NAD das Substrat ist, wird bevorzugt nach an sich bekannten Immobilisierungsverfahren immobilisiert. Das immobilisierte Enyzm wird in der Sauerstoffelektrode unter Bildung einer reduzierten NAD-Oxidaseelektrode gesammelt.

Die Menge an verbrauchtem Sauerstoff aus dem reduzierten NAD, der sich während der Reaktion bildet, kann elektrisch gemessen werden.

Die Menge an Fettsäure kann, bezogen auf die Menge an gebildetem, reduzierten NAD, bestimmt werden. Die Menge an Fettsäureester oder Enzymaktivität in der Probe kann durch die Menge an Fettsäure bestimmt werden.

Verbrauchte Reagentien, wie CoASH, oder gebildete Acyl- CoA können ebenfalls durch nachweisbare Änderungen analysiert werden.

Das erfindungsgemäße Mittel und seine Verwendung zur Durchführung der Analysen sind einfach und besitzen eine hohe Empfindlichkeit, und man kann daher bei der klinischen Diagnose für die pankreatische Funktion eine Lipaseaktivitätsanalyse durchführen.

Die erfindungsgemäße Verwendung des Mittels in Analysenverfahren für Acyl-CoA- Synthetase und Acyl-CoA-Oxidase werden im folgenden erläutert.

(1) Verwendung des Mittels in einem Analysenverfahren für die Acyl-CoA-Synthetaseaktivität

(I) Reaktionsgemisch I

ml
0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,5)
0,2
10 mM ATP	0,1
10 mM MgCl₂	0,1
10 mM CoASH	0,05
5% Triton X-100 mit einem Gehalt an 1 mM Palmitinsäurelösung	0,2
destilliertes Wasser	0,35
insgesamt	1,00

(II) Reaktionsgemisch II

ml
0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,5)
0,5
20 mM N-Äthylmaleimid	0,1
15 mM 4-Aminoantipyrin	0,3
0,3% 3-Methyl-N-äthyl-N-(β-hydroxyäthyl)-(β-hydroxyäthyl)-anilin	0,25
Peroxidase (100 PPE/ml)	0,1
0,5% Natriumazid	0,1
Acyl-CoA-Oxidase (120 E/ml)	0,1
destilliertes Wasser	0,55
insgesamt	2,00

Enzymlösung (50 µl) wird zu dem Reaktionsgemisch I gegeben und dann wird 10 min bei 37°C inkubiert. Das Reaktionsgemisch II wird zugesetzt, 5 min bei 37°C inkubiert und dann wird die Absorption bei 550 nm (ΔA₅₅₀) gemessen. Die Enzymaktivität wird gemäß folgender Gleichung definiert:

(2) Verwendung des Mittels in einem Analysenverfahren für die Acyl-CoA-Oxidaseaktivität


ml
0,2 M Tris-HCl-puffer (pH 8,0)
0,1
4 mM 4-Aminoantipyrin	0,05
3 mM Diäthylmetatoluidin	0,05
0,5 mg/ml Peroxidase	0,05
25 mM Palmitoyl-CoA	0,02
destilliertes Wasser	0,23
insgesamt	0,50

Enzymlösung (10 µl) wird dem obigen Reaktionsgemisch zugesetzt und man inkubiert 10 min bei 37°C. Die Reaktion wird durch Zugabe von 4 M Harnstoff (0,5 ml) beendet, dann wird 1% Triton X-100 (2 ml) zugesetzt und dann wird colorimetrisch bei 545 nm die Menge an gebildetem Wasserstoffperoxid gemessen. 1 Enzymeinheit (1 E) wird als Menge an Enyzm definiert, die 1 µMol Wasserstoffperoxid in 1 min freisetzt.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Herstellungsbeispiel 1 Herstellung des multiaktiven Enzyms

In einen 500 ml Erlenmeyerkolben gibt man 100 ml eines Mediums, das 1,5% Pepton, 0,5% gepulverten Hefeextrakt, 0,2% KCl, 0,1% NaCl, 0,1% K₂HPO₄, 0,05% MgSO₄ und 0,75% Ölsäure enthält und einen pH von 7,5 aufweist. Insgesamt 15 Kolben, die das gleiche, zuvor beschriebene Medium enthalten, werden bei 120°C sterilisiert und mit Pseudomonas fragi B-0771 FERM BP-1827 bei 30°C inokuliert und dann 20 h in einer Rotationsschüttelvorrichtung unter Schütteln bebrütet. Die vereinigten Medien werden 20 min bei 5000 U/min zentrifugiert, wobei man Bakterienzellen erhält. Die Zellen werden in eine Lysozymlösung (360 ml; 1,50 mg in 10 mM Phosphatpuffer, pH 7,0) gegeben; man erhält eine rohe Lösung des multiaktiven Enzyms (340 ml, spezifische Aktivität=3,0 E/mg als 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenaseaktivität).

Die Isolierung und Reinigung des Enzyms werden folgendermaßen durchgeführt. Zuvor abgekühltes Aceton (-20°C, 290 ml) wird zu der rohen Lösung (290 ml) aus multiaktivem Enzym gegeben, dann wird in einem Eisbad gekühlt und der Niederschlag gesammelt. Der Niederschlag wird in 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) mit einem Gehalt an 1 M KCl gelöst und 10 Min bei 12 000 U/min zur Entfernung unlöslicher Materialien zentrifugiert. Die überstehende Lösung (45 ml) wird gesammelt und mit einer gesättigten Ammoniumsulfatlösung (22,5 ml, pH 7,0) versetzt. Der Niederschlag wird durch 10minütiges Zentrifugieren bei 12 000 U/min entfernt. Gesättigte Ammoniumsulfatlösung (28 ml) wird zu der überstehenden Lösung (57 ml) zugesetzt. Der Niederschlag wird in 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5) mit einem Gehalt an 1 M KCl gelöst und unter Verwendung eines Cellophanrohrs gegenüber 10 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,5; 2,0 l) 20 h bei 4°C dialysiert. Das Dialysat wird lyophilisiert, und man erhält multiaktives Enzympulver (77 mg), welches eine spezifische Aktivität von 18,2 E/mg als 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenaseaktivität zeigt.

77 mg des Enzyms werden in 20 ml Wasser gelöst und auf eine Säule (3×11 cm) aus DEAE-Sephalose CL-6B (Farmacia Co.) gegeben, die mit 10 mM Tris-HCl-Puffer äquilibriert und mit dem gleichen Puffer gewaschen wurde. Die Eluierung erfolgt mit einem linearen Gradienten unter Verwendung von 500 ml 10 mM Tris-HCl-Puffer und des gleichen, 0,4 M KCl enthaltenden Puffers mit einer Eluierungsgeschwindigkeit von 52 ml/h. Jeweils 9 ml-Fraktionen werden gesammelt und es werden die aktiven Fraktionen Nr. 71 bis 80 (90 ml) erhalten, die eine spezifische Aktivität von 30,0 E/mg als 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase-Aktivität aufweisen: Die aktive Fraktion wird gegenüber 10 mM Phosphatpufferlösung (pH 7,5; 2 l) dialysiert und auf eine mit Hydroxyapatitgel gepackte Säule (2×10 cm) gegeben. Die Eluierung erfolgt gemäß einem linearen Gradienten mit 300 ml einer 10 mM Phosphatpuffers (pH 7,5) und 300 ml eines 0,5 M Phosphatpuffers (pH 7,5) bei einer Eluierungsgeschwindigkeit von 33 ml/h. Je 5 Ml-Fraktionen werden gesammelt und man erhält die aktiven Fraktionen Nr. 46 bis 62 (85 ml) (Enoylacyl-CoA-Hydrataseaktivität =210,3 E/mg; 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenaseaktivität =105 E/mg; 3-Ketoacyl-CoA-Thiolaseaktivität =85,6 E/mg), welche durch Ultrafiltration (Amicon Co. XM-50) konzentriert wurden. Das Konzentrat wird auf eine mit Toyopeal HW-60 (Toyo Soda Co.) gepackte Säule (1,1×90 cm) gegeben und mit 10 mM Tris-HCl-Puffer (ph 7,5) mit einem Gehalt an 0,5 M KCl gelfiltriert. Jeweils 3,5 ml Fraktionen werden gesammelt und die aktiven Fraktionen Nr. 23 bis 27 (17,5 ml) werden erhalten. Die Lösung wird lyophilisiert; man erhält gereinigtes multiaktives Enzym (20 mg, 110 E/mg als 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase).

Herstellungsbeispiel 2

30 l des gleichen Mediums wie in Herstellungsbeispiel 1 (versetzt mit Antischaummittel Silicon KM-72 der Shinetsu Chem. Co.) werden in einen 30 l Kolbenfermentator gegeben und 20 min bei 120°C sterilisiert. 500 ml Kulturmedium von Pseudomonas fragi B-0771 FERM BP-1827 werden inokuliert und 17 h bei 30°C, 300 U/min, 20 l/min bebrütet. Das Kulturmedium wird zentrifugiert, und man erhält die gezüchteten Zellen. Die Zellen werden mit Lysozym (3 g) in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0) behandelt, und man erhält eine multiaktive Enzymlösung (6 l) (15,6 E/ml als 3-Hydroxylacyl-CoA-Dehydrogenaseaktivität).

Beispiel 1 Quantitative Bestimmung verschiedener Fettsäuren

Mittel für die Analyse

ml
0,2 M Pipes-NaOH-Puffer (pH 7,3)
0,5
10 mM NAD	0,2
10 mM MgCl₂	0,3
10 mM ATP	0,3
3% Triton X-100	0,1
10 mM CoASH	0,2
Acyl-CoA-Synthetaselösung (40 E/ml), (Toyo Jozo Co.)	0,02
Acyl-CoA-Oxidase (400 E/ml)	0,02
Catalase (150 E/ml; Sigma Chem. Co.)	0,05
multiaktives Enzym (Enoyl-CoA-Hydrataseaktivität=400 E/ml; 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenaseaktivität=200 E/ml; 3-Ketoacyl-CoA-Thiolaseaktivität=163 E/ml)	0,05
destilliertes Wasser	1,26
insgesamt	3,00

25 µl einer Probe, enthaltend 3 mM/ml Fettsäure (0,05 µMol), werden zu dem obigen Mittel für die Analyse (3,00 ml) zugesetzt, dann inkubiert man 5 min bei 37°C und bestimmt die Menge an reduziertem NAD durch Absorption bei 340 nm (OD_{340 nm}). Die Ergebnisse sind in Tabelle 3 aufgeführt. Wie die Tabelle zeigt, ist die optische Dichte bei 340 nm proportional der Anzahl der Kohlenstoffatome der Fettsäure in der Probe.

Beispiel 2 Quantitative Analyse von Ölsäure

20 µl einer Probe mit einem Gehalt an Ölsäure (jeweils 0,01 µMol, 0,02 µMol, 0,03 µMol, 0,04 µMol und 0,05 µMol) werden zu dem Mittel für die Analyse (3,00 ml) des Beispiels 3 zugesetzt. Es wird 5 min bei 37°C inkubiert und die Menge an reduziertem NAD durch Absorption bei 340 nm gemessen. Die Ergebnisse sind in Fig. 4 dargestellt (⚫-⚫). In Fig. 4 ist mit (○-○) die Vergleichsanalyse gemäß einem in Anal. Biochem., 98, 341 (1979), beschriebenen Verfahren gezeigt.

Wie aus Fig. 4 folgt, ist die erfindungsgemäße Verwendung des Mittels hinsichtlich der Empfindlichkeit im Vergleich mit dem bekannten Analysenverfahren überlegen.

Tabelle 3

Beispiel 3 Analyse von Ölsäure

Mittel für die Analyse

ml
0,2 M Pipes-NaOH-Puffer (pH 7,3)
0,5
10 mM NAD	0,2
10 mM MgCl₂	0,2
10 mM ATP	0,2
1% Triton X-100	0,2
10 mM CoASH	0,2
Acyl-CoA-Synthetase (40 E/ml)	0,02
Acyl-CoA-Oxidase (400 E/ml)	0,02
multiaktives Enzym (Enoyl-CoA-Hydratase=400 E/ml; 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase=200 E/ml; 3-Ketoacyl-CoA-Thiolase=163 E/ml)	0,01
Catalase (150 E/ml)	0,05
Diaphorase (30 E/ml; Toyo Jozo Co.)	0,1
0,25% NTB	0,2
destilliertes Wasser	1,10
insgesamt	3,00

20 µl einer Probe mit einem Gehalt an Ölsäure (0,005, 0,01, 0,015, 0,02 bzw. 0,025 µMol) werden zu dem obigen Mittel für die Analyse (3,00 ml) zugesetzt, und dann wird 10 min bei 37°C inkubiert.

Die Absorption bei 550 nm der blau-purpurnen Verfärbung, die entsprechend der Menge an bei der Reaktion gebildetem, reduzierten NAD auftritt, wird gemessen (OD_{550 nm}). Das Ergebnis ist in Fig. 5 (⚫-⚫) angegeben. In Fig. 5 zeigt (○-○) die Vergleichsanalyse gemäß dem Verfahren in Anal. Biochem., 108, 6 (1980) [Absorption bei 505 nm, OD_{505 nm}].

Die Ergebnisse zeigen, daß die erfindungsgemäße Verwendung des Mittels ein hochempfindliches Analysenverfahren ist, verglichen mit dem bekannten Verfahren.

Beispiel 4 Analyse von Lipase (Serumlipase)-Aktivität

Mittel für die Analyse

ml
0,2 M Pipes-NaOH-Puffer (pH 7,3)
0,2
10 mM NAD	0,15
10 mM MgCl₂	0,15
10 mM ATP	0,15
2% Triton X-100, enthaltend 10 mM 1,2-dioleylglycerid	0,10
10 mM CoASH	0,15
2 M KCl	0,1
5% Rinderserumalbumin	0,1
Acyl-CoA-Synthetase (40 E/ml)	0,2
Acyl-CoA-Oxidase (400 E/ml)	0,02
multiaktives Enzym (Enoyl-CoA-Hydratase=400 E/ml; 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase=200 E/ml; 3-Ketoacyl-CoA-Thiolase=163 E/ml)	0,05
Catalase (150 E/ml)	0,05
destilliertes Wasser	0,08
insgesamt	1,5

Das obige Mittel für die Analyse (1,5 ml) wird mit Humanserum (50 µl) vermischt, bei 37°C inkubiert und gleichzeitig wird die Bildung an reduziertem NAD bei 340 nm bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 aufgeführt.

Reaktionszeit (min)
OD_{340 nm})
0
0,120
3	0,377
5	0,400
7	0,412
8	0,420
13	0,476

Aus den obigen Ergebnissen folgt, daß die Fettsäure in dem Serum vor der Fettsäure reagiert, die aus dem Diglycerid durch den Einfluß von Serumlipase freigesetzt wird, und daß die Reaktion der freien Fettsäure in dem Serum innerhalb von 7 min Reaktionszeit beendigt ist. Die Erhöhung der Absorption nach dieser Zeit beruht auf dem reduzierten NAD, das bei der β-Oxidation von Fettsäure, die aus dem Diglycerid durch den Einfluß der Serumlipase freigesetzt wird, gebildet wurde. Die Lipaseaktivität wird daher durch eine Erhöhung der Absorption in einem Intervall von 5 min zwischen 8 und 13 min gemessen; sie beträgt 3,44 E/l.

Die Lipaseaktivität wird gemäß der folgenden Gleichung bestimmt:

Bei der Serumlipaseanalyse wird eine Zusammensetzung für die Analyse ohne Zugabe von Glycerid hergestellt, und Proben für die Analyse der Serumlipase werden zugegeben, um den Einfluß der freien Fettsäure im Serum auszuschließen. Die Lipaseaktivität kann analysiert werden, indem man die obigen Zusammensetzung für die Analyse zugibt, ohne daß die freie Fettsäure im Serum einen Einfluß hat.

Beispiel 5

Mittel für die Triglyceridanalyse

ml
0,2 M Phosphatpuffer (pH 7,5)
0,5
10 mM NAD	0,3
10 mM MgCl₂	0,4
10 mM ATP	0,3
3% Triton X-100	0,1
10 mM CoASH	0,4
Acyl-CoA-Synthetase (40 E/ml)	0,03
Acyl-CoA-Oxidase (400 E/ml)	0,03
multiaktives Enzym (Enoyl-CoA-Hydratase=400 E/ml; 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenase=200 E/ml; 3-Ketoacyl-CoA-Thiolase=163 E/ml)	0,07
Catalase (150 E/ml)	0,07
Liphase (10 000 E/ml; Toyo Jozo Co.)	0,03
destilliertes Wasser	0,77
insgesamt	3,00

Die Zusammensetzung für den Triglyceridassay kann folgendermaßen verwendet werden.

30 µl Serum werden zu der gleiche Zusammensetzung für die Analyse wie in Beispiel 1 zugegeben, welche nützlich ist, um den Einfluß der freien Fettsäure im Serum auszuschließen. Dann wird 10 min bei 37°C inkubiert und die Probe gesammelt (1 ml, entsprechend 10 µl Serum). Die Probe wird mit dem obigen Mittel für die Triglyceridanalyse vermischt, und dann wird die Erhöhung der Absorption bei 340 nm bestimmt. Oder die Zusammensetzung für Triglycerid wird direkt mit Serum (10 µl) vermischt und dann wird die Erhöhung der Absorption bei 340 nm 10 min nach Reaktionsbeginn gemessen.

Beispiel 6 Zusammensetzung für die Analyse von Phospholipase A₁-Aktivität, Phospholipase A₂-Aktivität oder die Phospholipase B-Aktivität

In Beispiel 1 werden 1,26 ml destilliertes Wasser in dem Mittel für die Analyse durch 10 mM Lecithinlösung (0,2 ml) und destilliertes Wasser (1,06 ml) ersetzt, wobei man eine Zusammensetzung für die Analyse der obigen Enzymaktivitäten erhält.

Beispiel 7 Zusammensetzung für die Analyse von Lysophospholipase-Aktivität

In Beispiel 1 werden 1,26 ml destilliertes Wasser durch 10 mM Lysolecithinlösung (0,2 ml) und destilliertes Wasser (1,06 ml) ersetzt, wobei man eine Zusammensetzung für die Analyse der Lysophospholipase-Aktivität erhält.

Beispiel 8 Zusammensetzung für die Analyse von Phosphataseaktivität

In Beispiel 1 werden 1,26 ml Wasser durch 10 ml Phosphatidatlösung (0,2 ml), Lipase (10 000 E/ml; 0,05 ml) und destilliertes Wasser (1,01 ml) ersetzt, wobei man eine Zusammensetzung für die Analyse der Phosphataseaktivität erhält.

Beispiel 9 Zusammensetzung für die Analyse der Phospholipase C-Aktivität

In Beispiel 5 werden 0,77 ml destilliertes Wasser in der Zusammensetzung für die Triglyceridanalyse durch 10 mM Lecithinlösung (0,2 ml) und destilliertes Wasser (0,57 ml) ersetzt, wobei man die Zusammensetzung für die Analyse der Phospholipase C-Aktivität erhält. Diese Zusammensetzung wird ebenfalls durch ein Glycerid beeinflußt, und wenn eine Glycerid enthaltende Probe verwendet wird, sollte die Menge an Fettsäure aus dem Glycerid abgezogen werden.

Beispiel 10 Zusammensetzung für die Analyse von Phospholipase C-Aktivität

Die Zusammensetzung für die Reaktion, bei der Fettsäure freigesetzt wird, (2,0 ml), welche 10 mM Lecithinlösung (0,2 ml), Lipase (5000 E/ml; 0,08 ml), 0,2 M Phosphatpufferlösung (pH 7,5; 0,50 ml) und destilliertes Wasser (1,22 ml) enthält, wird hergestellt.

Diese Zusammensetzung und die Zusammensetzung für die Analyse in Beispiel 1 werden zusammen für die Zusammensetzung für die Analyse der Phospholipase C-Aktivität verwendet.

Die Zusammensetzung für die Reaktion, bei der Fettsäure freigesetzt wird, (2,0 ml) wird zu der Probe, die Phospholipase C (20 µl) enthält zugesetzt, und dann wird 10 min bei 37°C inkubiert. 3,00 ml der Zusammensetzung des Beispiels 1 werden zugegeben, dann wird 5 min bei 37°C inkubiert und die Absorption bei 340 nm gemessen.

Beispiel 11 Zusammensetzung für die Analyse der Phospholipase D-Aktivität

Die Zusammensetzung für die Freisetzung von Fettsäure (2,0 ml), die 10 mM Lecithinlösung (0,2 ml), Phosphatidatphosphatase (50 E/ml; Toyo Jozo Co.; 0,05 ml), Lipase (10 000 E/ml; 0,05 ml), 0,2 M Tris-HCl-Puffer (pH 7,5, 0,6 ml) und destilliertes Wasser (1,1 ml) enthält, wird hergestellt. Diese Zusammensetzung wird zusammen mit der Zusammensetzung von Beispiel 1 für die Analyse von Phospholipase D verwendet.

Beispiel 12 Zusammensetzung für die Analyse der Cholinesteraseaktivität

In Beispiel 1 werden 1,26 ml destilliertes Wasser durch 2 mM Palmitoyl-Cholinester-Lösung (0,2 ml) und destilliertes Wasser (1,06 ml) ersetzt, wobei man die Zusammensetzung für die Analyse der Cholinesteraseaktivität erhält.

Beispiel 13 Zusammensetzung für die Analyse der Cholesterinesteraseaktivität

In Beispiel 1 werden 1,26 ml destilliertes Wasser durch 5 mM 3-Oleoyl-Cholesterinester-Lösung (0,2 ml) und destilliertes Wasser (1,06 ml) ersetzt, wobei man die Zusammensetzung für die Analyse der Cholesterinesteraseaktivität erhält.

Beispiel 14 Zusammensetzung für die Analyse der Lecithincholesterinacyl-Transferaseaktivität

Die Zusammensetzung für die Freisetzung von Fettsäure (2,0 ml), die 5 mM Cholesterinlösung (0,2 ml), 5 mM Lecithinlösung (0,2 ml), Lysophospholipase (80 E/ml; 0,05 ml) und 0,3% Triton X-100 in 0,1 M Phosphatpuffer (pH 7,5; 1,55 ml) enthält, wird hergestellt.

Diese Zusammensetzung wird zusammen mit der Zusammensetzung des Beispiels 1 für die Analyse der Lecithincholesterinacyl-Transferaseaktivität verwendet.

Beispiel 15 Zusammensetzung für die Analyse von Cholesterinester

In Beispiel 1 werden 1,26 ml destilliertes Wasser durch Cholesterinesterase (350 E/ml, Toyo Jozo Co.; 0,2 ml) und destilliertes Wasser (1,06 ml) ersetzt, wobei man die Zusammensetzung für die Analyse von Cholesterinester erhält.

Beispiel für die Acyl-CoA-Oxidase-Erzeugung

10 ml eines Mediums, das 1% Ölsäure, 0,25% Hefeextrakt, 1% Pepton, 0,2% KCl, 0,1% K₂HPO₄, 0,05% MgSO₄ · 7 H₂O und 0,2% Antischaummittel (Disofam BC-51Y) enthält, werden in Reagenzglas nach der Sterilisierung gegeben. Arthrobacter sp. B-0720 FERM-P Nr. 5224 wird inokuliert und dann wird bei 30°C über Nacht unter Schütteln bebrütet.

Diese Kultur wird in 5 l des gleichen Mediums in einem 8 l Fermentationskolben überführt und dann erfolgt eine submerse Belüftungskultur bei 30°C während 20 h, 600 U/min unter 5 l/min Belüftung. Die gezüchteten Zellen werden abzentrifugiert und in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0), 2 mM EDTA und 0,5 mg/ml Lysozym suspendiert und dann wird 60 min bei 37°C gerührt. DNA-ase (5 mg) wird zugegeben, dann wird 10 min gerührt und 20 min bei 10 000 U/min zentrifugiert.

200 ml Aceton werden zu dem Überstand zugegeben, es wird zentrifugiert und erneut 1,8 l Aceton zugegeben. Der erhaltene Niederschlag wird abzentrifugiert und in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0; 200 ml) gelöst. Unlösliches Material wird abzentrifugiert und gesättigte Ammoniumsulfatlösung wird zu dem Überstand bei 30- bis 75%iger Sättigung zugesetzt. Der Niederschlag wird in 10 mM Phosphatpuffer (pH 7,0; 40 ml) gelöst und entsalzt, indem man ihn auf eine Säule von Acrylamidgel (Biogel P-2; Biorad Co.) gibt. Er wird dann auf eine Säule von Calciumphosphatgel gegeben, gewaschen und gemäß der linearen Gradientenelution mit 0,05 bis 0,5 M Phosphatpuffer (pH 7,0) eluiert. Die aktiven Fraktionen (etwa 0,45 M) werden gesammelt, durch Ultrafiltration (Diaflow-Membran PM-10; Amicon Col) konzentriert und lyophilisiert. Man erhält Acyl-CoA-Oxidase (spezifische Aktivität=5,5 E/mg, Gesamtaktivität=850 E, Ausbeute 8,5%).

Kurze Erläterungen der Zeichnungen:

Fig. 1 optimaler pH von 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenaseaktivität in einem multiaktiven Enzym, hergestellt aus Pseudomonas fragi B-0771 FERM BP-1827;

Fig. 2 pH-Stabilität der 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenaseaktivität in einem multiaktiven Enzym;

Fig. 3 Wärmestabilität der 3-Hydroxyacyl-CoA-Dehydrogenaseaktivität in einem multiaktiven Enzym;

Fig. 4 Standard-Analysenkurve für Ölsäure;

Fig. 5 Standard-Analysenkurve für Ölsäure.

Der in den Ansprüchen verwendete Ausdruck "Phosphatidinsäure" entspricht dem angelsächsischen Ausdruck "phosphatidic acid".

Claims

1. Mittel für die Analyse, dadurch gekennzeichnet, daß es die folgenden Bestandteile enthält:

2. Verwendung des Mittels nach Anspruch 1 in einem Analysenverfahren zum Nachweis einer freien Fettsäure, einer aus einem Fettsäureester freigesetzten Fettsäure, einem Fettsäureester oder der Enzymaktivität, durch die aus einem Fettsäureester freie Fettsäure freigesetzt wird.