JPS6046953B2 - コリンオキシダ−ゼの改良製造法 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 本発明は、コリンオキシダーゼの改良製造法に関する。

従来、コリンを酸化してベタインアルデヒドとする公知
の酵素としては、酵素番号１．１．９９．１コリン：（
アクセプター）オキシドレダクターゼＪＣｃｈｏｌｉｎ
ｅ： （ａｃｃｅｐｔｏｒ）ｏｘｉｄｏｒｅｄｕｃｔａ
ｓｅ〕、常用名コリンデヒドロゲナーゼ（ｃｈｏｌｉｎ
ｅｄｅｈｙｄｒｏｇｅｎａｓｅ）〔酵素名・酵素反応記
号一覧第７５頁（１９６１）国際酵素委員会・共立出版
〕が挙ら れ、この酵素は次式で示す反応を触媒する。

〔式中、Ａはフラピンアデニシンジ又クレオチド（ＦＡ
Ｄ）、チトクロームＣなどの呼吸鎖成分、フエナジンメ
トサルフエート、フエリサイアナイド、２．６ージクロ
ルフェノールインドフェノール、メチレンブルーなどの
酸化還元色素を示す。〕〔メソウズ イン エンチモロ
ジー（ＭｅｔｈＯｄｓｉｎＥｎｚｙｍＯｌＯｇｙ）Ｖ，
５６２−５７０訓ド（１９６２）アカデミツク・ブレス
（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）〕。

上記反応において、Ａが呼吸鎖成分であるＦ，ＡＤの場
合には、コリンの酸化反応は次式に示す通り進行すると
推定されている。

即ちコリンによつて還元されたＦＡＤ（ＦＡＤＨ，）は
電子をチトクローム系に伝達し、伝達された電子は最終
的に酸素に渡されて水を生成する（これはコリンオキシ
ダーゼ系とも呼ばれる）〔メソウズ イン エンチモロ
ジー（ＭｅｔｈＯｄｓｌｎＥｒｌＺｙＴＴｌＯｌＯｇｙ
）Ｉ，６７４−６７８（１９５５）アカデミツク会ブレ
ス（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）〕。

以上の如く、公知の、コリンのベタインアルデヒドへの
酵素的酸化反応は、種々の電子受容体を伴つて進行する
ものであつて、動物ではミトコンドリアの呼吸鎖、微生
物、例えばシコードモナス会エルギノーサ（Ｐｓｅｕｄ
ＯｍＯｎａｓａｅｒＬｌｇｉｎＯＳａ）Ａ−１６菌株て
は、その細胞膜に結合している電子伝達系の成分が関与
して行なわれると報告されている〔アグリカルチユラル
・アンド・バイオロジカル ケミストリー （，Ａｇｒ
ｉｃｕｌｔＬｌｒ′ＡｌａｎｄＢｌＯｌＯｇｌＣａｌＣ
ｈｅｍｉｓｔｒｙ）ＹＬ，ｌ５ｌ３−１５１４（１９７
５）、日本農芸化学会講演要旨集５１，１００（１９７
６）日本農芸化学会〕。

また、上記コリンデヒドロゲナーゼによつてコリンから
生成したベタインアルデヒドは、酵素番゜号１．２．１
．８ベタインアルデヒドニＮＡＤオキシドレダクターゼ
（ＢｅｔａｉｎａｌｄｅｈｙｄｅＮＡＤＯｘｉｄＯｒｅ
ｄｕｃｔａｓｅ）常用名ベタインアルデヒドデヒドロゲ
ナーゼ（Ｂｅｔａｉｒｌｅａｌｄｅｈｙｄｅｄｅｈｙｄ
ｒＯ〜Ｎａｓｅ）〔酵素名・酵素反応記号一覧第７６（
１９６１）国際酵素委員会報告、共立出版〕によつて、
次式に示す通りの反応によりベタインまで酸化される。

（なお、ＮＡＤはニコチナミドアデニンジヌクレオチド
、ＮＡＤＰはニコチナミドアデニンジヌクレオチドホス
フエートおよびＮＡＤＨ２、ＮＡＤＰＨ２は各々の還元
体を略称したものである。）〔酵素研究法第２巻第４２
５−４２６（１９５０）朝倉書店、メソウズ イン エ
ンチモロジー（ＭｅｔｈＯｃｌｓｉｎＥｍ押０１０（９
））Ｉ，６７４−６７８（１９６２）アカデミツク●ブ
レス（ＡｃａｄｅｍｉｃＰｒｅｓｓ）．日本農芸化学会
講演要旨集５１，１００（１９７６）日本農芸化学会〕
。このベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼは、シュー
ドモナス・エルギノーサＡ−１６菌株より単離、精製さ
れ、その分子量は約１４５０００（ゲル泊過法）、等電
点は５．１、至適ＰＨは８．０〜９．０、安定ＰＨは７
．５ｆＪ′近であることが確認されている。本発明者ら
は、鹿児島県川辺郡川辺町高田のさつまいも畑より分離
したアースロバクター（ＡｒｔｈｒＯｂａｃｔｅｒ）属
に属する細菌Ｂ−０５７７菌株が、その菌体内に、コリ
ンのベタインへの酸化反応を触媒する酵素を生産するこ
とを見い出し、該酵素を単一にまて精製した。

この酵素は、等電点４．６（キャリア・アンホライトを
用いる電気泳動法）、分子量約８４０００±２１００．
（セフアデツクスＧ−１５０ゲル沖過法）の物理的性状
を有し、コリンおよびベタインアルデヒドに基質特異性
を示し、その酵素反応において補酵素の添加を必要とせ
す、基質を直接酸素と反応せしめ、１モルのコリンをベ
タインアルデヒドを経由．してベタインまて酸化して２
モルの過酸化水素を生成せしめ、また１モルのベタイン
アルデヒドをベタインまで酸化して１モルの過酸化水素
を生成せしめる反応を触媒する新規な酵素反応を示すも
のであつて、このような酵素反応を示す新規なコリンオ
キシダーゼであることを見い出し、かつこのようなコリ
ンオキシダーゼ生産能力を有する微生物を用いるコリン
オキシダーゼのための培地中にコリンを添加せしめるこ
とによつて培養時コリンオキシダーゼの生産能を上昇せ
しめることを知゛つた。

また上記の細菌Ｂ−０５７瘤株の肉眼的および顕微鏡的
観察に基く各種培地上における培養の特徴は、次に記載
する通りである。

Ａ肉眼的観察 ２６℃、１８〜４２時間培養の結果、次の通りである。

１肉汁寒天平板培養発育は良好、円形て周囲はなめらか
であり、光沢を有するコンベツクス（ＣＯｎｖｅｘ）状
となる。

集落の色は灰白色（Ｈｕｅｌｌｌ２ｃａ）から淡黄色（
Ｈｕｅｌｌｌ２ｇａ）に変化する。拡散性色素は産生し
ない。２肉汁寒天斜面培養 発育は良好て、線状に生育し光沢を有する。

集落のは灰白色（Ｈｕｅｌｌｌ２ｃａ）から淡黄色（Ｈ
ｕｅｌｌｌ２ｇａ）に変化する。拡散性色素は産生しな
い。３肉汁液体培養 表面発育において、菌膜を形成しないか、もしくは形成
しても非常にうすい。

その培養液は一様に混濁後沈澱を生じるが透明にはなら
ない。４肉汁ゼラチン穿刺培養 表面のみ発育し、その発育は良好である。

ゼラチンを液化しない。５リトマス・ミルク 発育は弱く、２週間位でペプトン化する。

軟かい凝固またはアルカリ化する場合もある。リトマス
は還元しない。注 色の表示記載は１９関年コンテイナ
ー・コーポレイシヨン・オブ●アメリカ（ＣＯｎｔａｉ
ｒｌｅｒＣＯｒｐＯｒａｔｉＯｎＯｆＡｍｅｒｉｃａ）
発行１カラー●ハーモニ●マニュアル（ＣＯｌＯｒＨａ
ｒｍＯｎｙＭａｎｕａｌ）Ｊの表示法に従つた。

Ｂ顕微鏡的観察 １細胞の形、大きさ 肉汁寒天平板培養による、若い細胞（６時間）は桿状で
、大きさは０．５〜０．８×１．５〜２．０μｍで、古
い細胞（比時間）は球状（０．５〜０．８μｍ）も存在
する。

２多形性 肉汁液体培養において、Ｔ字型、Ｙ字型の細胞を観察す
ることがある。

３運動性 なし（軟寒天培地にて観察）。

４胞子 なし。

５グラム染色 若い細胞は陽性、古い細胞は陰性である。

６抗酸性染色 陰性 Ｃ次に生理学的性質を記載する。

硝酸塩の還元 陰性脱窒反応
陰性■けスト
陰性ＶＰテスト
陰性インドールの生成
陰性硫化水素の生成 弱陽
性スターチの加水分解 弱陽性クエン
酸の利用コーザー（ＫＯｓｅｒ）培地 陰
性クリステンゼン（Ｃｈｒｉｓｔｅｎｓｅｎ）培地 陽
性硝酸塩の利用 陰性アンモ
ニウム塩の利用 陰性色素の生成
陰性ウレアーゼ
陽性オキシダーゼ
弱陽性カタラーゼ
陽性生育ＰＨ範囲 ４．０〜１１．
０生育温度範囲 ５〜３ｒＣ酸素に
対する態度 好気性セルロースの加
水分解 陰性力ティンの加水分解
陰性０−Ｆテスト（注１） ０（酸
化的分解）糖より酸の産生（ガスは産生しない）（注２
）１週間以内 グルコース、イノシトール ２週間以内 セロビオース、エリストリトール、フラ クトース
、マルトース、マンニトール、マ ンノース、ソルビト
ール、シクロース、卜 レハロース、スターチ、酸を作
らないもの Ｌ−アラビノース、ヅルシトール、エス クリン、ガ
ラクトース、グリセリン、ラグ トース、メレジトース
、メリビオース、サ リジン、ソルボース、キシロース
、注１；０−Ｆテスト用培地 本細菌Ｂ−０５７爛株は、ペプトンを含む培地では酸を
産生しないため、変法培地（組成：ＮＩｉｉＨ２ＰＯ４
ｌｇｌイーストエキス粉末１ｇ１ＫＣ１０．２ｇ．．Ｍ
ｇＳ０４●７Ｈ２００．２ｇ１グルコース１０ｇ１細菌
用寒天末Ｋｇ、蒸留水１ｅＮＰＨ７．２）を用いた。

注２； 基礎培地（組成：ＮＨ４Ｈ２ＰＯ，ｌｇｌイーストエキ
ス粉末１ｇ．．ＫＣ１０．２ｇ，．ＭｇＳ０４・７Ｈ２
００．２ｇ１細菌用寒天末Ｋｇ、蒸留水１ｅ．．ＰＨ７
．２）を用いた。

以上の諸性質、特にグラム陽性菌、非抗酸性、非運動性
の桿菌または球菌で、分枝することがあるが、線維状に
はならず、糖を酸化的に分解し、カタラーゼ陽性、オキ
シダーゼ弱陽性でセルロースを分解しない性質を示す本
細菌Ｂ−０５７爛株は、バージーズ・マニュアル●オブ
・デイタミネイテイブ・バクテリオロジー（Ｂａｒ？Ｙ
ｓｍａｎｕａｌＯｆＤｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｖｅＢａｃ
ｔｅｒｉＯｌＯｇｙｌｌ９７４によればコリネホーム・
グループ・バクテリア（ＣＯｒｙｎｅｆＯｒｍｇｒＯｕ
ｐＢａｃｔｅｒｉａ）のアースロバクター属に属するも
のを認められた。なお、アースロバクター属と他のコリ
ネホーム・グループ・バクテリアとを比較すれば、明ら
かに次の点で大別される。

コリネバクテリウムニ糖を発酵的に分解する。

（ＣＯｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ロチアニ繊維状と
なり、糖を発酵的に分解する。

（ＲＯｔｈｉａ） クルチアニ糖より酸を産生しない。

（Ｋｕｒｔｈｊａ） セルロモナスニセルロース分解能を有する。

（ＣｅｌｌｕｌＯｍＯｎａｓ）ブレビバクテリウムニ糖
を発酵的に分解する。

（Ｂｒｅｖｉｂａｃｔｅｒｉｕｍ）ミクロバクテリウム
ニ糖を発酵的に分解する。

（ＭｉｃｒＯｂａｃｔｒｉＬｌｒｒｌ）プロピオニバク
テリウムニ嫌気的細菌。

（ＰｒＯｐｉＯｎｉｂａｃｔｒｉｕｒｒｌ）フバクテリ
ウムニ嫌気的細菌（Ｆｌｌｂａｃｔｅｒｉｕｍ） アースロバクターニ糖を酸化的に分解する。

（Ａｒ′ＴｈｒＯｂａｃｔｅｒ）以上の通り、本細菌Ｂ
−０５７瘤株はアースロバクター属に属する菌と認めら
れ、またバージース・マニュアル・オブ◆デイタミネイ
テイブ・バクテリオロジー１９７４によれば、アースロ
バクター属は７種に分けられることが報告されており、
これらの種についてその標準菌株を併行試験および文献
記載の事項に基き、次の通りの結果を得た。

なお、培養温度は２６゜Ｃであり、使用菌株およびその
略号は次の通りである。アースロバクター シンブレツ
クス （Ａｒ′ＴｈｒＯｂａｃｔｅｒｓｌｍｐｌｅｘ）ＩＦＯ
ｌ２Ｏ６９（以下Ｓと略す）。

アースロバクター●グロビフオーミス＊ ＊（Ａ！′ＴｈｒＯｂａｃｔｅｒｇｌＯｂｉｆＯｎｎｉ
ｓ）ＩＦＯｌ２ｌ３７（以下Ｇと略す）。

アースロバクター●シテレウス（ＡｒｔｈｒＯｂａｃｔ
ｅｒｃｉｔｒ′ｅ１）ｓ）ＩＦＯｌ２９５７（以下Ｃと
略す）。

アースロバクター ツメツセンス（ＡｒｔｈｒＯｂａｃ
ｔｅｒｔｕｎｌｅｓｃｅｌｌｓ）ＩＦＯｌ２９６Ｏ（以
下Ｔｕと略す）。

アースロバクター ターレゲンス （Ａｒ′ＴｈｒＯｂａｃｔｅｒｔｅｒＴ′ｅ？Ｎｓ）Ｉ
ＦＯｌ２９６ｌ（以下Ｔｅと略す）。

アースロバクター・ヅユオデカデイス （Ａｒ″ＴｈｒＯｂａｃｔｅｒｄｕＯｄｅｃａｄｉｓ）
ＩＦＯｌ２９５９（以下Ｄと略す）。

アースロバクター フラベツセンス （ＡｒｔｈｒＯｂａｃｔｅｒｆＩａｖｅｓｃｅｒｌｓ）
（以下Ｆと略す）。

なお、ＤおよびＦの菌については、バージース・マニュ
アル・オブ・デイタミネイテイブ・バクテリオロジイー
１９７４に記載の事項のみによるものである。以上の比
較実験に結果おいて、本細菌Ｂ−０５７７菌株は、集落
の色、スターチ分解能、一部の糖よりの酸の産生能を除
いてアースロバクター・グロビフオーミス１Ｆ０１２１
３７に一致している。

またアースロバクター・グロビフオーミスは普通寒天培
地などでは特有の色素は産生しない菌株が多いが、非水
溶性のレモン様の黄色の色素を産生する菌株もある点、
さらに本細菌Ｂ−０５ｎ菌株およびアースロバクター・
グロビフオーミスＩＦ′０１２１３７の両菌株ともスタ
ーチより酸を産生するスターチ分解能の点、さらにまた
アースロバクター●グロビフオーミスＩＦＯｌ２ｌ３７
は、本細菌Ｂ−０５ｎ菌株が酸を産生する糖のうち、エ
リスリトールを除く全部の糖から酸を産生する酸産生能
の点より、本細菌Ｂ−０５７７菌株をアースロバクター
・グロビフオーミスに属するものと同定し、アースロバ
クター●グロビフオーミスＢ−０５７７（ＡｌｈｒＯｂ
ａｃｔｅｒｇｌＯｂｉｆＯｒｍｉｓＢ−０５７７）と命
名した。また本菌は工業技術院微生物工業技術研究所に
微生物受託番号ＲＦＥＲＭ−ＰＮＯ３５ｌ８ョとして寄
託されている。またこの新規な酵素コリンオキシダーゼ
はコリンおよびベタインアルデヒドをその基質とする酵
素であるため、種々の確認試験などの定量手段などを用
いることにより、コリンまたはベタインアルデヒドを含
有する液体にコリンオキシダーゼを作用せしめ、次いて
生成する過酸化水素の定量、生成するベタインの定量、
消費された酸素の定量を行なうことによりコリンまたは
ベタインアルデヒドを含有してなる液体の分析を可能な
らしめるものてあることを見い出した。

本発明は上記の知見に基いて完成されたもので、コリン
オキシダーゼ生産能力を有する微生物を用いるコリンオ
キシダーゼの培養において、用．いる培地にコリンを添
加することを特徴とするコリンオキシダーゼの改良製造
法であり、特にコリンの添加量として、培地に対して０
．５〜１％程度添加することによりコリンオキシダーゼ
の生産性は少なくとも１皓以上も上昇するものである。

本発明の対象とするコリンオキシダーゼとしては、少な
くとも下記の一般式：（式中、Ｒ１は−Ｃｌ（２−０Ｈ
基または−ＣＨＱ基を示す）で表わされる化合物に基質
特異を有し、かつ下記反応式〔１〕および／または〔■
〕で示される酵素作用を有するコリンオキシダーゼと認
められるものであればよく、その元素分析値、添加物に
よる阻害、活性化など多少の相異を”示すものてあつて
も上記の性状、作用を有するものは本発明のそれに包含
されるものであり、この新規なコリンオキシダーゼを得
るための使用菌としては上記の菌はその一例である。

また本発明の改良製造法における使用菌としては、上記
の菌はその一例てあつて、コリンオキシダーゼ生産能力
を有するものであればすべて本発明において使用てきる
。

もちろん微生物は、自然的、人工的に変異を起こしやす
く、本菌も例外てはないが、これらの変異株であつても
コリンオキシダーゼの生産能力を失わない限り本発明に
使用し得ることはいうまでもないことである。本発明を
実施するに当つて、アースロバクター属に属するコリン
オキシダーゼ生産菌による製法について例示すれば、次
の如くである。

即ちアースロバクター属に属するコリンオキシダーゼ生
産菌を、抗生物質、酵素などを生産する通常の方法て培
養する。培養の形態は液体培養ても固体培養でもよいが
、工業的にはコリンオキシダーゼ生産菌の細胞をその生
産用培地に接種し、深部通気攪拌培養を行なうのが有利
である。培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用
いられるものが広く使用される。

窒素源としては利用可能な窒素化合物てあればよく、例
えばコーン・スチーブ・りカー、大豆粉、ペプトン、種
々の肉工キズ、酵母工キズ、硫安、塩化アンモニウムな
どが使用される。炭素源としては、同化可能な炭素化合
物であればよく、例えば糖蜜、ブドウ糖、スターチ加水
分解物などが使用される。その他、食塩、塩化カリウム
、硫酸マグネシウム、リン酸第一カリウム、リン酸第二
カリウムなどの種々の無機塩やディスホームＢＣ−５１
Ｙ１同ＣＡ一２２０１同ＣＡ−３３０（商品名：日産油
脂社製）などの消泡剤が必要に応じて使用される。また
、培地中にコリンを添加せしめることによつて、培養時
コリンオキシダーゼの生産能を上昇せしめることが好ま
しい。このコリンの添加量としては約０．５〜１％程度
であり、この添加によりコリンオキシダーゼの生産性は
少なくとも１皓以上上昇する。培養温度は菌が発育し、
コリンオキシダーゼを生産する範囲内て適宜変更し得る
が、特に好ましくは２５〜３０′Ｃである。培養時間は
条件によつて異なるが、通常１５〜５Ｃ＠間程度であつ
て、コリンオキシダーゼが最高力価に達する時期をみは
からつて適当な時期に培養を終了すればよい。かくして
得られた培養物中において、コリンオキシダーゼはその
菌体内に含有、蓄積されている。

この様にして得られた培養物中よりコリンオキシダーゼ
を抽出し、粗製のコリンオキシダーゼ含有液を得るため
に、例示すれば、まず培養物を固液分離し、得られる湿
菌体を、必要に応じてトリスー塩酸緩衝液などの溶液に
懸濁せしめ、次いで、リゾチーム処理、超音波処理、フ
レンチプレス処理なとの種々の菌体処理手段を適宜選択
組合せればよい。

特に、リゾチーム処理により、その収率およびその比活
性は良好となる。次いでこの粗製のコリンオキシダーゼ
含有液を、さらに公知の、蛋白質、酵素などの単離、精
，：“製手段を用いて処理することにより精製されたコ
リンオキシダーゼを得ることができる。

例えば、粗製のコリンオキシダーゼ含有液に、アセトン
、メタノール、エタノール、イソプロパノールなどの有
機溶媒による分別沈澱法、硫安などによる塩析法などを
用いて水溶液から沈澱せしめ、回収すればよい。さらに
この沈澱物を、例えば電気泳動法などにて単一の帯を示
すまで精製すればよく、その精製手段としては目的とす
るコリンオキシターゼの性質を利用した手段を用いれば
よく、例えば上記の沈澱物をトリスー塩酸緩衝液などの
媒体に溶解し、これをジエチルアミノエチル−セルロー
ス、−デキストランゲル架橋体などの陰イオン交換体、
デキストランゲル、ポリアクリルアマイドゲルなどのゲ
ル■過剤によるクロマトグラフ法を行なえばよい。また
これらの手段を適宜組合せて、精製すればよく、次いで
これを真空凍結乾燥手段などにより乾燥してコリンオキ
シダーゼの精製粉末を得る。このようにして得られるコ
リンオキシダーゼは次下に述べる理化学的性質を有する
ものてある。

（１）作用コリンを酸化してベタインアルデヒドとなし
、ベタインアルデヒドを酸化してベタインとする。

コリンの場合には、１モルのコリンより１モルのベタイ
ンアルデヒドおよび１モルの過酸化水素を生成し、さら
にこのベタインアルデヒドより１モルのベタインおよび
１モルの過酸化水素を生成する。即ち、１モルのコリン
より１モルのベタイ１ンおよび２モルの過酸化水素を生
成する。またベタインアルデヒドの場合には、１モルの
ベタインアルデヒドより１モルのベタインおよび１モル
の過酸化水素を生成する。（２）力価の測定法 ０．２Ｍトリスー塩酸緩衝液（ＰＨ８．Ｏ）ＭｇノＭＬ
の４−アミノアンチピリン０．０５ｍｔ．．０．１％フ
ェノール０．１０ｍ１１２ＵＩｍ９パーオキシダーゼ（
ＰｅｒＯｘｉ（１ａｓｅ）０．１０ｍｔ１０．１Ｍ塩化
コリン０．１０ｍ１および蒸留水０．１０ｍ１よりなる
反応後０．５０ｍ１に、酵素溶液５μｅ加え、３７℃に
て５分間反応させた後これに２．５ｍ１のエタノールを
加えて反応を止める。

比色は４８０ｒ１ｍで行い、酵素活性は、１分間に１μ
ＭＯｌｅの過酸化水素を生成する活性を１単位（１１１
Ｔ１１ｔ１１Ｕ．）とする。また力価の算出は次式に従
う。酵素活性（Ｕ．ｌｍｌ）＝ΔＡ４８Ｏｌｍｉｎ×１
４（なお、ΔＡ４８Ｏは４８０ｎｍの波長における１分
間の吸光度変化を示す）（３） 基質特異性 上記の力価の測定法における測定法を利用して、その反
応液中の塩化コリンの代りに、種々の基質（ベタインア
ルデヒド、Ｎ−メチルアミノエタノール、Ｎ，Ｎ−ジメ
チルエタノールアミン、モノエタノールアミン、ジエタ
ノールアミン、トリエタノールアミン）を用いて、コリ
ンに対する、相対活性を求めた。

その結果、この酵素は、少なくともコリン、ベタインア
ルデヒドに高い活性を示すものと認められる。

（４）至適ＰＨ トリスー塩酸緩衝液を用いて、コリンオキシダーゼのコ
リンに対する酵素活性を測定した結果、第１図に示す通
りてあつて、その至適ＰＨは８付近と認められる。

（５）至適温度 上記の力価の測定法における測定法を利用して、その温
度条件を変えて酵素反応を行ない、コリンオキシダーゼ
のコリンに対する酵素活性を測定した結果、第２図に示
す通りであつて、その至適温度は４０℃付近と認められ
る。

（６）ＰＨ安定性 ＰＨ６〜７はジメチルグルタル酸緩衝液、ＰＨ７〜８は
トリスー塩酸緩衝液、ＰＨ９〜１０はグリシンー水酸化
ナトリウム緩衝液を用いた。

２５ｍＭの各ＰＨの緩衝液０．ＩｍＬに、酵素溶液（酵
素蛋白質濃度１０μＧｌｍｌ）５μｅを加え、３ＴＣに
て３吟間放置する。

次いでこれに、０．５Ｍトリスー塩酸緩衝液（ＰＨ８．
Ｏ）０．０５ｍ１を加えてＰＨを調節した後、反応後を
加えて、上記の力価の測定法に従つて、コリンオキシダ
ーゼのコリンに対する酵素活性を測定した結果、第３図
に示す通りであつて、そのＰＨ安定性は８付近と認めら
れる。（７）熱安定性 酵素蛋白質１０ｐｇＩｍ１を含有してなる１０ｎ１Ｍト
リスー塩酸緩衝液（ＰＨ８．Ｏ）１ｍ１を各温度にて１
０分間放置し、次いで上記の力価の測定法に従つて、コ
リンオキシダーゼのコリンに対する酵素活性（残存活性
）を測定した結果、第４図に示す通りであつて、酵素は
、４０℃付近では安定であり、４０℃付近を超える温度
では急速に低下するものと認められる。

（８）種々の物質に対する影響 上記の力価の測定法において、種々の添加物を加えて、
コリンオキシダーゼのコリンに対する酵素活性を測定し
た結果、次の通りである。

なお、添加物の内、金属塩の添加量は５ｒＩ１Ｍてあり
、界面活性剤の添加量は０．１％Ｗ／Ｖてある。）
トリトン（ＴｒｌｔＯｎ）Ｘ−１００（界面活性剤：
商品名：和光純薬工業社製） ９５．５アデカト
ール（ＡｄｅｋａｔＯＩ）ＳＯ−１２０（界面活 性剤
：商品名：旭電化工業社製） １０５．７ラウリル硫
酸ナトリウム ９４．３デオキシコール酸ナ
トリウム ９４．３ツウイーン（Ｔｗｅｅｎ）２
０（界面活性剤：商品名：和光純薬工業社製）
９６．６ラウリルベンゼンスルホン酸ナトリウム９１
．０カチオンＤＴ２Ｏ５（界面活性剤：商品名：日産油
脂社製） ６５．９（添加物な
し １００．０）（９）分子量８４
０００±２１００〔セフアデツクスＧ−１５０（商品名
：フアルマシア社製）ゲル沖過法により測定〕。

６５０００±３０００（ＳＤＳポリアクリルアミド電気
泳動法：１０％ポリアクリルアミドゲル、厚さ２７ｒｎ
のスラブ電気泳動、ＳＤＳｌメルカプトエタノール処理
、存在化泳動、１ｃｍ当り３ｎ１Ａの条件）（１１等電
点４．６（キャリア◆アンホライトを用いる電気泳動法
により測定：ＬＫＢ社のキャリア●アンホライトＰＨ４
〜１０の１１０ｍ１カラム、低電圧７００Ｖ１４８時間
泳動、１フラクシヨン２ｍ１にて測定）。

（１１）電気泳動ポリアクリルアミドゲル（ＰＨ８．３
）を用い、ディスク電気泳動法を用いた。

まず、コリンオキシダーゼを電気泳動せしめ、その泳動
終了後のゲルをアミドブラックにて染色した結果、第５
図の１に示す通り、濃青色の一本の帯のみ認められた。

また、コリンオキシダーゼを電気泳動せしめ、その泳動
終了後のゲルを、下記組成よりなる反応液反応液組成 ０．２Ｍトリスー塩酸緩衝液 １．０ｍ１呈色
試液 ２．０ｍ１０．１Ｍ基質
溶液 １．０ｍ１蒸留水
６．０ｍ１１０．０ｍ１（ただし、上
記反応液組成中、呈色試液とは０．１Ｍトリスー塩酸緩
衝液１０ｍ１、５Ｔｎ９１ｍ１０−ジアニジン●エタノ
ール溶液０．３ｍ１１パーオキシダーゼ１０Ｕ．よりな
る組成の試液を示し、基質溶液とは基質である塩化コリ
ンまたはベタインアルデヒドの水溶液を示す。

）に浸し、３ｒＣ１２０〜３紛間放置して、現われる帯
を確認した。その結果、基質溶液として塩化コリンを用
いた酵素反応生成物による染色は、第５図の２に示す通
りであつて、赤色の一本の帯が認められ、また基質溶液
としてベタインアルデヒドを用いた酵素反応生成物によ
る染色は、第５図の３に示す通りであつて、赤色の一本
の帯が認められた。さらに、これらの染色されたゲルは
水洗後７％酢酸に浸し固定する。さらにまた、この第５
図の１，２，３により明らかな通り、ゲル上に示された
泳動度は全て同一であり、単一の帯を認めることにより
、このコリンオキシダーゼは単一の蛋白質であることが
確認された。（１２）作用機序の確認試験 コリンあるいはベタインアルデヒドを０．０１〜０．０
５μＭＯｌｅｌトリスー塩酸緩衝液（ＰＨ８．Ｏ）１０
μＭＯＩｅｌ４−アミノアンチピリン１５０ｐｇフェノ
ール１００μｇ１パーオキシダーゼ０．２Ｕ．、コリン
オキシダーゼ０．２５Ｕ．を含有する反応液０．５ｍ１
を、３ｒｃ１２５分間反応せしめ、しかる後２．５ｍ１
のエタノールを加えて４８０ｎｍにて吸光度を測定した
。

また、コリン、ベタインアルデヒドに代りに、定量の過
酸化水素を加えて同様に行なつて、検量線を求めた。そ
の結果は第６図に示す通りであつて、図中、０−０は基
質としてコリンを用いた場合の測定結果であり、●−●
は基質としてベタインアルデヒドを用いた測定結果であ
り、さらにΔ一Δは基質の代りに過酸化水素を用いた検
量線を示す測定結果であり、これらの図は酵素がコリン
１モルより過酸化水素２モルを生成する反応およびベタ
インアルデヒド１モルより過酸化水素１モルを生成する
反応を触媒することを示すものてある。また上記試料に
て、酸素電極を用いて酸素の消費量を測定した結果、コ
リン１モルが酸化されるとき酸素２モルが消費され、ベ
タインアルデヒド１モルが酸化されるとき酸素１モルが
消費されることを確認した。

さらに上記試料の反応終了物より生成したベタインの定
量は、該反応終了物をまずＰＨｌに調節し、次いでこれ
を活性炭処理した後１００倍濃縮して、これをライネツ
ケ塩（ＲｅｉｒｌｅｃｋｅＳａｌｔ）法により定量して
行つた、コリン１モルよりベタイン１モル、ベタインア
ルデヒド１モルよりベタイン１モルが生成されることを
確認した。

以上の通り、コリンオキシダーゼは、コリンおよびベタ
インアルデヒドを基質として作用して酸化せしめる際、
補酵素を必要とせず、直接酸素と反応せしめ、過酸化水
素を生成せしめることより、公知のコリンデヒドロゲナ
ーゼやベタインアルデヒドロゲナーゼと異なつたものと
認められ、コリンオキシダーゼは従来には知られていな
い新規な酵素と認められる。

また上記の理化学的性質の酵素の作用機序の確認試験に
使用した定量手段はその一例であるが、以下に述べる通
り、新規な酵素コリンオキシダーゼは上記の確認試験と
同様な定量手段、例えば過酸化水素の定量、生成するベ
タインの定量、消費された酸素の定量などの手段を用い
ることにより、コリンまたはベタインアルデヒドを含有
してなる液体の分析を可能ならしめたものてある。

またこの酵素はコリンやベタインアルデヒドの試薬の純
度測定、コリンやベタインアルデヒドの誘導体を分解せ
しめて生成するコリンやベタインアルデヒドを測定して
なるコリンやベタインアルデヒドの誘導体の定量、コリ
ンやベタインアルデヒドの誘導体を分解してコリンやベ
タインアルデヒトを生成せしめる酵素の活性測定などの
酵素的定量の方法を提供するものてある。本発明に使用
されるコリンまたはベタインアルデヒドを含有してなる
液体とは、コリンまたはベタインアルデヒドそのものの
水または水性媒体の溶液であつてもよく、またコリンま
たはベタインアルデヒドの誘導体であつて、この誘導体
よりコリンまたはベタインアルデヒドを遊離せしめたも
のであつてもよい。

また上記水性媒体として、好ましくは、コリンオキシダ
ーゼに対し阻害効果を及ぼさない、例えばトリスー塩酸
緩衝液が挙げられる。さらにコリンの誘導体としては、
例えば生体内においてリン脂質として知られている、リ
ゾレシチン、レシチン、スフィンゴミエリンさらにアセ
チルコリン、シチジンリン酸コリン、ホスホリルコリン
などの生体内成分や、ベンゾイルコリン、プロピオニル
コリン、ブチリルコリン、サクシニルコリンなどの合成
物であつて、要は化学的または酵素的手段にてコリンを
遊離し得るそれらの誘導体であればよい。またこれらの
誘導体よりコリンを遊離せしめる手段としては、例えば
アルカリ分解又は酸分解などの化学的手段が挙られ、ま
たクロストリジウム●ウエルチ（ＣｌＯｓｔｒｉｄｉｕ
ｍｌｗｅｌｃｈｉｉ）、バチルス セレウス（Ｂａｃｊ
ｌｌｕｓｃｅｒｅｕｓ）などのホスホリパーゼＣ（Ｐｈ
ＯｓｐｈＯＩｉｐａｓｅＣ）と牛、プタ、ニワトリの小
腸粘膜、牛の肝臓、エシエリシア コリー（ＥｓＯｈｅ
ｒｉｃｈｉａｃＯｌｌ）などのアルカリホスファターゼ
（ＡｌｌｃａｌｌｎｅｐｈＯｓｐｈａｔａｓｅ）との組
合せ、キャベツ、ストレプトマイセス、ハチジヨウエン
シス（ＳｔｒｅｐｔＯｍｙｃｅｓｈａｃｈｉｊＯｅｎｓ
ｊｓ）Ａｌｌ４くストレプトマイセス◆クロモフスカス
（ＳｔｒｅｐｔＯｍｙｃｅｓｃｈｒＯｍＯｆｕｓｃｕｓ
）Ａ−０８４８などのホスホリパーゼＤ（ＰｈＯｓｐｈ
ＯｌｌｐａｓｅＤ）、牛血球、電気ウナギ、馬血清、人
血清などのコリンエステラーゼ（ＣｈＯｌｌｎｅｅｓｔ
ｅｒａｓｅ）などの酵素手段が挙られる。

なお上記の酵素およびその由来は何んら限定されるもの
でなく、各々ホスホリパーゼＣ１アルカリホスフアーゼ
、ホスホリパーゼＤ１コリンエステラーゼの活性を有し
ているものであればよい。さらに詳しく述べれば、例え
ばホスホリパーノゼＣとアルカリホスファターゼによる
レシチンに対する反応は、次式に示す通りであつて、レ
シチンはホスホリパーゼＣにより、ジグリセリドとホス
ホリルコリンに加水分解され、さらにこのホスホリルコ
リンはアルカリホスファターゼにベンゾイルコリンはコ
リンエステラーゼにより安息香酸とコリンとに分解され
るものである。

上記の酵素は一例であつて、さらにコリンまたはベタイ
ンアルデヒドの誘導体よりコリンまたはベタインアルデ
ヒドを遊離し得る手段であれば、如何なる手段であつて
もよい。なお、これらの前処理をｒ＋［；１，１二Ｅテ
１１０／．：ＦＯＺミ＊より無機リン酸とコリリンに分
解されるものである。またホスホリパーゼＤによるレシ
チンに対する反応は次式に示す通りであり、レシチンは
ホスホリパーゼＤによりホスフアチジン酸とコリンに加
水分解されるものである。

さら、０にコリンエステラーゼによるベンゾイルコリン
に対する反応は、次式に示す通りてあるり、てあるため
、別工程とすることなく、対応する酵素および目的とす
るコリンオキシダーゼとを同時に加えて、以下に述べる
操作を行なう。

この様にして用意された、コリンまたはベタインアルデ
ヒドを含有する液体に、コリンオキシダーゼを作用せし
めるのであるが、このコリンオキシダーゼは、緩衝液に
溶解した溶液であつてもよく、さらにその酵素活性を劣
化せしめない状態にて、マイクロカプセル化手段、樹脂
または多糖類などとの共有結合手段、吸着手段などの公
知の酵，素固定化手段を施したものであつてもよい。

またこのコリンオキシダーゼの添加量としては、試料の
量などによつて異なるが、酵素による反応時間の好適な
短時間とせしめるのに、１単位以上であればよく、好ま
しくは１．５〜５単位程度である。また用いるコリンオ
キシダーゼの比活性は高いものほど反応にとつて良好で
あることは言うまでもないことてあるが必ずしも最高純
度のものを要求するものではない。このようにして、該
液体にコリンオキシダーゼ＼を添加して、一定時間イン
キユベイトした該液体中には、過酸化水素およびベタイ
ンが生成され、対応した酸素の減少が起きる。

次いで、これらの過酸化水素、ベタイン、酸素の測定を
行なうのであるが、酸素の測定については、上記した通
り、酸素電極を用いる方法が最も簡便であり、ベタイン
についても一例として上記したライネツケ塩法が好まし
く、またベタインをエステル化してガスクロマトグラフ
ィーなどによる測定方法もある。また過酸化水素の測定
法としては好ましくは過酸化水素と反応してその色調に
変化を生する１種もしくは２種以上の呈色剤からなるシ
ステムによつて、比色測定によつて測定することが好ま
しい。測定する方法としては、例えば、生成する過酸化
水素と反応して安定した赤色を形成する４価のチタン化
合物とキシレノールオレンジによる反応、或はフェノー
ル、４−アミノアンチピリンおよびパーオキシダーゼに
よる反応などを利用する方法などが挙られる。このフェ
ノール、４−アミノアンチピリン、パーオキシダーゼに
よる反応を利用する過酸化水素の測定において、フェノ
ールはコリンオキシダーゼの活性を阻害するため、最小
限の濃度とすることが好ましいく、また４−アミノアン
チピリンは生成する過酸化水素量に対し１１２モル以上
、好ましくは２モル以上、さらにパーオキシダーゼは０
．１Ｕ以上、好ましくは０．２〜０．５Ｕ程度使用する
ことが望ましい。さらに４−アミンアンチピリンの代り
に４−アミノフェノゾーンを用いてもよく、これらの各
試薬は溶液としてあらかじめ混合、調製すればよい。こ
のようにして呈色せしめた色調を適当な波長にて測定し
、その検量線より存在する過酸化水素を定量し、存在す
るコリンまたはベタインアルデヒドもしくはコリンの誘
導体またはベタインアルデヒドの誘導体の定量、または
コリンの誘導体を加水分解する酵素活性などの定量を行
なう。また上記の方法以外に、２．６ージクロルフェノ
ールインドフェノールとパーオキシダーゼの組合せによ
る過酸化水素の定量測定、グアヤク脂とパーオキシダー
ゼの組合せによる過酸化水素の定量測定、ホモバニリン
酸とパーオキシダーゼの組合せによる過酸化水素の定量
測定など種々の方法が挙げられる。上記の過酸化水素、
ベタイン、酸素の定量において、特に過酸化水素の定量
、さらに過酸化水素をパーオキシダーゼおよび呈色剤に
よつて定量する方法が簡便かつ正確であるため好ましい
。

従つて、この過酸化水素、ベタイン、酸素の測定値、お
よびそれらの検量線より、使用した液体中のコリンまた
はベタインアルデヒドの量的関係を求めればよく、コリ
ンまたはベタインアルデヒドそのものである試薬などの
純度測定においてはそのままの値から容易に求められ、
コリンなどの誘導体を用いて酸素などにて処理した場合
においノては、測定値からコリン誘導体の量的関係を求
めるか、測定値から使用した酵素活性の関係を求めるこ
とによつて分析されるものてある。また上記分析法は、
コリンオキシダーゼによるコリンのベタインアルデヒド
を経由したベタイン７への酸化反応を利用した分析手段
を挙げたものであるが、またこの酸化反応過程の中間生
成物たるベタインアルデヒドまたはその生成量に対応す
る過酸化水素を定量してコリンの定量を行つてもよい。

しかしこの生成したベタインアルデヒドはさフらにコリ
ンオキシダーゼにより酸化され過酸化水素を生じるため
、測定誤差を生じる欠点を有しており、そのため生成し
たベタインアルデヒドがコリンオキシダーゼによつて次
工程の酸化作用を受けないような反応阻害剤、例えばベ
タインアルデヒトと容易にシツク塩基などを形成する阻
害剤やベタインアルデヒドデヒドロゲナーゼとＮＡＤま
たはＮＡＤＰとによる反応系路を変更せしめるコリンオ
キシダーゼのベタインへの阻害剤を添加するなどの方法
が推定される。さらに、これらの分析法において使用さ
れる種々の組成は適宜選択変更されるものであつて、ま
たこの分析法はその分析の目的に応じて、それぞれ適宜
選択された組成を有するキットとして組立てられるもの
である。

また上記の分析法において使用する、リン脂質よりコリ
ンを遊離せしめるホスホリパーゼＤについて詳しく述べ
る。使用するホスホリパーゼＤとしては、ストレプトマ
イセス●ハチジヨウエンシスＡｌｌ４３菌株やストレプ
トマイセス・クロモフスカスＡ−０８４８菌株由来の酵
素が挙られ、これらの菌株は、工業的技術院微生物工業
技術研究所に各々微生物受託番号ＲＦＥＲＭ−ＰＮＯ．
ｌ３２９Ｊ（特開昭４８−９９３８６号）、ｒ′ＦＥＲ
Ｍ−ＰＮＯ．３５ｌ９ョとして寄託されている。

特にストレプトマイセス◆クロモフスカスＡ−０８４８
−菌株ＲＦＥＲＭ−ＰＮＯ３５ｌ９．ｊの菌学的性状、
培養手段、精製手段、さらに得られるホスホリパーゼＤ
の理化学性質などを述べれば、次の通りである。菌学的
性状 （ａ）形態 肉眼的観察によれば、胞子を形成した気菌糸は灰色を呈
し、基生菌糸は黄褐色ないし黄橙色を呈し、可溶性色素
は通常生成しない。

スターチ、無機塩寒天培地上で、３０゜Ｃ１１０〜１５
５日間培養観察し、顕微鏡観察した所見は次の通りであ
る。

気菌糸は直径０．６〜０．８μ、波状て単純分枝をなし
て伸長し、多数の胞子の連鎖を形成する。

胞子の連鎖は通常ゆるく１〜３回巻いた螺旋を形成３（
ＳｐｉｒａＩｅｓ）し、まれに４〜５回巻いた螺旋もみ
られ、またときには波状または直状で螺旋を形成しない
もの（ＲＦ）もみられる。胞子は球形ないし楕円形で、
大きさは０．６〜０．８×０．７〜０．９μであり、表
面にとげ状の突起を形成している。基生菌４ｒ糸は分枝
をもつて屈出状に伸長し、直径０．４〜０．６μで、菌
糸の分裂や胞子の着生は認められない。鞭毛胞子や胞子
のうちの着生も認められない。（ｂ）全菌体分析による
ジアミノピメリン酸の分析ベネツツ（Ｂｅｎｎｅｔｔ″
ｓ）培地で６日間振盪培養した菌体をベカー（Ｂｅｃｋ
ｅｒ）らの方法〔アプライド マイクロパイオロジー（
ＡｐｐＩｉｅｄＭｉｃｒＯｂｌＯｌＯｇｙ）乎（５）４
２１−４２３（１９６４）〕で分析した結果、ＬＬ−ジ
アミノピメリン酸が検出され、メソ（ＭｅｓＯ）一型は
検出されなかつた。（ｃ）培養的性状下記の培地を用い
、３０℃、２０日間培養観察した性状は、次に示す通り
であつて、色の表示は１力ｊラー●ハーモニ●マニユア
ルョに従つた。

（１）シユクロース・硝酸塩寒天培地生育：僅少、無色
。

気菌糸：僅少。

可溶性色素：生じない。

（２）グリセリン・硝酸塩寒天培地 生育：中程度ないし良好、パステル・オレンジ（Ｐａｓ
ｔｅｌＯｒａｎ？；４１ｃ）。

気菌糸：生じない、ないし僅少。

可溶性色素；ヌード タン（ＮｕｄｅＴａｎ：４ｇＣ）
、僅かに生じる。

（３）グルコース・アスパラギン寒天培地生育：中程度
、バンプー（ＢａｍｂＯ；２ｆｂ）ないしアンパー（，
Ａｎｌｂａｒ；３ｐｅ）。

気菌糸：貧弱ないし中程度、ホワイト （Ｗｈｉｔｅ；ａ）。

可溶性色素：生じない。

（４）グリセリン・アスパラギン寒天培地生育：中程度
、ゴールデン ブラウン （ＧＯｌｄｅｎＢｒＯｗｎ；３ｐｇ−３ｐｉ）。

気菌糸：中程度、シルバー●グレイ（ＳｉｌｖｅｒＧｒ
ａｙ；３ｆｅ）ないしナチユラル（Ｎａｔｕｒａｌ３ｄ
ｃ）。可溶性色素：生じない。（５）スターチ・無機塩
寒天培地 生育：中程度ないし良好、ゴールデン・ブラウン（３ｐ
ｊ）ないしクロブ・ブラウン（ＣＩＯｖｅＢｒＯｗｒｌ
；３ｐり。

気菌糸；中程度ないし良好、シルバー・グレイ（３ｆｅ
）ないしナチユラル（３ｄｃ）、一部ホワイトニａ）。

可溶性色素：生じない。６）チロシン寒天培地 生育：中程度ないし良好、ゴールデン・ブラウン（３ｐ
ｇ−３ｐｉ）。

気菌糸：中程度ないし良好、シルバー・グレイ（３ｆｅ
）ないしナチユラル（３ｄｃ）。

可溶性色素：生じない。

（７）グリセリン●スターチ・グルタメイト寒天培地生
育：中程度ないし良好、ルスト タン （ＲＬｌＳｔＴａｎ；５ｇｃ）ないしメイプル（Ｍａｐ
ｌｅ；４１ｅ）。

気菌糸：中程度、オイスター・ホワイト （０ｙｓｔｅｒＷｈｉｔｅ；ｂ）ないしライト・グレイ
（Ｌｔ．Ｇｒａｙ；Ｃ）。

可溶性色素：生じない。

（８）オート●ミル寒天培地 生育：中程度ないし良好、マスタード・コールド（Ｍｕ
ｓｔａｒｄＧＯｌｄ；２ｒ１ｅ）ないしゴールデン●ブ
ラウン（３ｐｇ）。

気菌糸：中程度ないし良好、ナチユラル （３ｃ１ｃ）ないしベイジ◆ブラウン（ＢｅｉｇｅＢｒ
Ｏｗｎ；３１ｇ）。

可溶性色素：生じない。

（９）イースト・麦芽寒天培地 生育：中程度ないし良好、アンパー（３１ｃ）ないしイ
エロー●メイプル（ＹｅｌｌＯｗＭａｐｌｅ；３ｒ１ｇ
）。

気菌糸：中程度、シルバー・グレイ（３ｆｅ）ないしベ
イジ・ブラウン（３１ｇ）ないしベイジ（３ｇｃ）。

可溶性色素：生じない。

（１０）栄養寒天培地 生育：中程度、アンパー（３ｐｅ）。

気菌糸：僅少ないし貧弱、ホワイト（ａ）。

可溶性色素：生じない。（１１）ペプトン・イースト・
鉄寒天培地生育：中程度ないし良好、無色、裏面；ゴー
ルデン・ブラウン（３ｐｇ）。

気菌糸：生じない。

可溶性色素：ゴールデン・ブラウン（３ｐｇ一３ｐｊ）
。

（１２）トリブトン◆イーストエキス培地生育：良好、
アンパー◎ｘ−３ｐｃ）。

気菌糸：生じない。

可溶性色素：生じない、ないしゴールデン・ブラウン（
３ｐｉ）。

（１３）グルコース◆ペプトン●ゼラチン培地生育：貧
弱、ゴールデン・ブラウン（３ｐｇ）。

気菌糸：生じない。可溶性色素：ゴールデン●ブラウン
（３ｐｉ）。

（１０脱脂乳培地生育：良好ないし極めて良好、ライト
・アンパー（ＬｔＡｍｌｘｌｌ−ｒ：３１ｃ）ないしラ
イト・タン（ＬｔＴａｎ：３ｇｃ）。

気菌糸：生じない。

可溶性色素：メイプル（４１ｅ）ないしパステル●オレ
ンジ（４１ｃ）。

（ｄ）生理的性状 （１）メラニン様色素の生成：ペプトン●イースト・鉄
寒天培地で陽性、トリプトン・イーストエキス培地で凝
陽性、チロシン寒天培地で陰性。

（２）ゼラチンの液化：グルコース●ペプトン・ゼラチ
ン培地て陽性。

（３）スターチの加水分解：スターチ・無機塩寒天培地
で陽性。

・（４）脱脂乳：凝固；陰性、ペプトン化；陽性。

（５）炭素源の同化性：Ｄ−グルコース、Ｌ−アラビノ
ース、Ｄ−マンニット、Ｌ−ラムノース、Ｄ−キシロー
スは陽性、イノシトール、ラフィノースは凝陽性、シユ
クロースは陰性。（６）生育温度：１０〜４７℃。

以上の通り、本菌株は分裂を生じない真性の基生菌糸よ
り、多数の胞子の連鎖をもつ気菌子を生じ、また菌糸の
直径および胞子の大きさ、さらに細胞壁にＬＬ−ジアミ
ノピメリン酸を含有するこ）となどよりストレプトマイ
セス属に属するものと認められる。

また本菌株の特徴として、気菌糸は灰色を呈し、胞子の
連鎖は主として螺旋を形成し、胞子の表面はとけ状を呈
し、基生菌糸は黄褐色ないし黄橙色て、通常可溶性色素
を生成せす、７メラニン様色素はペプトン・イースト・
鉄寒天培地で生成し、チロシン寒天培地では生成しない
こと、および炭素源の同化能は比較的広範囲に及んでい
ることがなどが挙られ、このような特徴を有する菌種を
種々の文献より検索すれば、ストレプトマイセス◆クロ
モフスカス〔プロブレムス●オブ●クラシフイケイシヨ
ン●オブ◆アクチノマイセテスーアンダゴニスツ（Ｐｒ
ＯｂｌｅｍｓＯｆｃｌａｓｓｊｆｉｃａｔｌＯｎＯｆａ
ＣｔｉＩｌＯｍｙＣｅｔｅＳ−ＡｎｔａｇＯｎｉｓｔｓ
）１７６−１７７（１９５７）、インターナショナル・
シャーナル・オブ・システマテイク・バクテリオロジー
（１ｎｔｅｒｎａｔｊ０ｎａ１Ｊ０ｕｍａ１０ｆＳｙｓ
ｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒ１０１０ｇｙ）移（４）３
０７−３０９（１９６８）、アプライド マィクロバイ
オロジー （ＡｐｐｌｉｅｄＭｌｃｒＯｂｌＯｌＯｇｙ
）６５２−７９（１９５８））〕が類似菌として挙られ
、さらに本菌株とストレプトマイセス争クロモフスカス
とを詳細に比較すれば、形態的にはストレプトマイセス
善クロモフスカスの方が螺旋の形成がやや良好なこと、
培養的性状においてグリセリン壺スターチ壺グルタメイ
ト寒天培地およびグリセリン・硝酸塩培地上で可溶性色
素の生成の有無などの相違が両菌株の比較実験にて認め
られたものが、これらの多少の相違は菌株間の相違と認
め、他の諸性状においてはよく一致していることより、
本菌株をストレプトマイセス・クロモフスカス（ブレオ
ブラソエンスカラ譬エト［相］オル）プリグム魯エト争
オル〔ＳｔｒｅｐｔＯｍｙｃｅｓｃｈｒＯｍＯｆｕｓｃ
ｕｓ（Ｐｒｅｂｒａｚｈｅｎｓｋａｙａｅｔａｌ）Ｐｒ
ｌｄｈａｍｅｔａｌ〕に属するものと同定し、本菌株を
ストレプトマイセス・クロモフスカスＡ−０８４８と命
名した。次いで、本菌株を培養してホスホリパーセＤを
得るに当つて、本菌株を、酵素を生産する通常の方法て
培養すれはよく、その培養の形態は通常液体培養を行な
うが、工業的には深部通気攪拌培養を行なうのが有利で
ある。培地の栄養源としては、微生物の培養に通常用い
られるものが広く使用され得る。炭素源としては同化可
能な炭素化合物てあればよく、例えばブドウ糖、シヨ糖
、乳糖、スターチ、デキストリン、糖蜜、グリセリンな
どが使用される。窒素源としては、利用可能な窒素化合
物であればよく、例えばコーン・スチーブ・りカー、大
豆粉、綿実粉、小麦グルテン、ペプトン、肉工キズ、酵
母工キズ、力ティン加水分解物などが使用される。その
他、リン酸塩、マグネシウム、カルシウム、カリウム、
鉄、マンガン、亜鉛などの塩類が必要に応じて使用され
る。培養温度は本菌が発育し、ホスホリパーゼＤを生産
する範囲内て適宜変更し得るが、特に好ましくは２５〜
３０゜Ｃであり、また培養時間は条件によつて異なるが
、ホスホリパーゼＤが最高力価に達する時期をみはから
つて適当な時期に培養を終了すればよく、通常、２〜４
日程度てある。このようにして得られた培養物からホス
ホリパーゼＤを採取するのであるが、本酵素は水に易溶
性てあつて、主として培養液中に存在する。培養液中に
存在するホスホリパーゼＤは、培養戸液を濃縮するか、
もしくは濃縮することなく可溶性塩類、例えば硫安など
で半飽和または飽和沈澱せるか、または親水性有機溶媒
、例えばメタノール、エタノール、アセトンなどを添加
することにより沈澱させることがてきる。沈澱物は水ま
たは緩衝液に溶解し、半透膜て透析することにより低分
子不純物を除去することがてきる。また吸着剤、イオン
交換体あるいはゲル枦過剤などを用いて不純物を除去し
てもよい。これらの手段により得られる酵素溶液を、減
圧濃縮、凍結乾燥などの操作により処理して固形の粗製
ホスホリパーゼＤを得ることができる。さらにこの粗製
ホスホリパーゼＤは、蛋白質、酵素などの精製に通常用
いられる手段、例えば吸着剤、イオン交換体、ゲルろ過
剤などを用いて精製され、さらにジエチルアミノエチル
セルロースおよびデキストランゲル架橋体（商品名：セ
フアデツクスＧ−５０）カラムクロマトグラフィーによ
り精製される。次にホスホリパーゼＤの理化学性質につ
いて述べる。（１）作用 リン脂質のリン酸と含窒素塩基とのエステル結合に作用
してリン化合物と相当する含窒素塩基と遊離する。

レシチンについての作用を例示すれば次式の通りてある
。（２）力価の測定法 ０．２Ｍトリスー塩酸緩衝液（ＰＨ８．Ｏ）０．１ｍ１
，１０ｒＴ１Ｍレシチンエマルジョン０．１ＴｒＬ１ぃ
０．ＩＭ塩化カルシウム０．０５ｍ１，１％トリトンＸ
−１０００．１ｍ１，水０．１ｍ１よりなる反応液に
、酵素溶液０．０５ｍ１を加え３７℃、１吟間反応させ
た後、５分間煮沸して反応を停止した。

次いて反応液を３７℃まで冷却し、これに、４−アミノ
アンチピリン（３ｍ９１ｍ１）０．１ｍ１１２ｕ．Ｉｍ
１パーオキシダーゼ０．１ｍ１１０．１％フェノール０
．１ｍ１１１２ｕ．ｈ１コリンオキシダーゼ０．１ｍ１
１水０．１ｍ１を加えて３７℃、２紛間反応せしめた後
１％トリトンＸ−１００、２ｍ１を加え、５００ｒ１ｍ
の吸光度を求めた。ホスホリパーゼＤｌｌ単位（Ｕｎｊ
ｔ．Ｕ．）は１分間に１μＭＯｌｅのコリンを生５成せ
しめる酵素活性と定めた。また力価の算出は次式に従つ
た。Ｕ．Ｉｍｌ＝ΔＡ５ＯＯＸＯ．５５ （式中、ΔＡ５ＯＯは５００ｒ１ｍにおける吸光度を示
す）（３）基質特異性 上記の力価の測定の反応液において、基質としてレシチ
ン、リゾレシチン、スフィンゴミエリンのエマルジョン
（１０ｎ１Ｍ１０．１ｍ１）を用い、同様の操作を行な
い、コリンの定量をして、リゾレシーチンに対する酵素
作用を１００として相対活性を求めた。

基 質 相対活性レシチン
５１％スフィンゴミエリン
１９％リゾレシチン
１００％（４）ＰＨ安定性ＰＨ５：酢酸緩衝
液、ＰＨ６〜７：ジメチルグルタル酸一水酸化ナトリウ
ム緩衝剤、ＰＨ８〜９：トリスー塩酸緩衝液、ＰＨｌＯ
：グリシンー水酸化ナトリウム緩衝液（各々１０１１１
Ｍ）の各々ＰＨて、酵素溶液（１ｍｇＩｍ１）を３７℃
、６紛間インキユベイトした後、上記の力価の測定法に
従つてホスホリパーゼＤの活性を求めた結果、第７図に
示す通り、酵素はＰＨ７〜９て比較的安定てあると認め
られる。

（５） 至適ＰＨＰＨ６〜７．５：ジメチルグルタル酸
一水酸化ナトリウム緩衝液、ＰＨ７〜９：トリスー塩酸
緩衝液、ＰＨ９〜１０：グリシンー水酸化ナトリウム緩
衝液の各々の緩衝液を用い、上記の力価の測定法に従つ
てホスホリパーゼＤの活性を求めた結果、第８図に示す
通りであつて、その至適ＰＨは７．５〜８付近と認めら
れる。

（６）熱安定性 １０ｒｎＭトリスー塩酸緩衝液（ＰＨ８．Ｏ）、酵素溶
液濃度０』９１ｍ１）の条件で、４０、５０１６０、７
０、８０℃の各々の温度にて１紛間インキユベイトした
後、上記の力価の測定法に従つてホスホリパーゼＤの活
性を求めた結果、第９図に示す通りてあつて、酵素は７
０゜Ｃまで安定である。

（７）血清リン脂質への作用 条件１の試料 ０．△外リスー塩酸緩衝液（ＰＨ８．Ｏ） ０．２ｍ
１市販品血清 ０．５ｍ１０．
１ＭＣａＣ１２０．１ｍ１６０Ｕ．Ｉｍ１ホスホリパー
ゼ ０．１ｍＬ蒸留水
０．１ｍ１条件２の試料０．△ひリスー塩酸
緩衝液（ＰＨ８．Ｏ） ０．２ｍｔ市販品血清
０．５ｍＬ０．１ＭＣａＣｊ２０．
１ｍ１６０ｕ．ＩｍｔホスホリパーゼＤＯ．ｌｍｌホス
フアチジン酸ホスファターゼ ２Ｕ．蒸留水
０．１ｍ１条件３の試料０．２
Ｍトリスー塩酸緩衝液（ＰＨ８．Ｏ） ０．２ｍ１市
販品血清 ０．５ｍＬ０．１Ｍ
ＣａＣ１２０．１ｍｔ蒸留水
０．２ｍＬなお、上記各条件における試料を用いた
、市販品血清はハイランド（ＨｙＩａｎｄ）社製の製品
であり、ホスフアチジン酸ホフアターゼはストレプトマ
イセス ミラビリス（ＳｔｒｅｐｔＯｍｙｃｅｓｍｊｒ
ａｂｉＩｉｓ）Ａ−２３１３菌株より得られたホスフア
チジン酸ホスファターゼ（特開昭５０−１４２７（１）
号）てある。

上記の条件で、１、２および３の試料を３ｒｃ１３紛間
反応せしめた後、各々にクロロホルムニメタノール（２
：１）６ｍ１、次いで水１ｍ１を加えて充分混合し、３
０００ｒ′Ｐｍｌｌ紛間遠心分離し、そのクロロホルム
層を回収した。

このクロロホルム層を減圧乾固し、シリカゲルＧ（東京
化成工業社製）にて薄層クロマトグラフィーを行ない（
展開ノ溶媒；クロロホルムニメタノールニ水＝６５：２
５：３）、プレート乾燥後、モリブデンブルー試薬によ
り、リン脂質の確認を行なつた。また、標準リン脂質と
して、ホスファチジルエタノールアミン、ホスファチジ
ルコリン、スフインゴミエリン、リゾホスフアチジルコ
リン、ホスフアチジン酸を用いて、上記と同一の条件で
薄層クロマトグラフィーを行なつた。その結果は、第１
０図に示す通りであつて、１は条件１の試料のスポット
、２は条件２の試料のスポット、３は条件３の試料のス
ポット、４はホスファチジルエタノールアミン、ホスフ
ァチジルコリン、スフィンゴミエリンおよびリソホスフ
アチジルコリンよりなる標準リン脂質のスポット、５は
ホスフアチジン酸である標準リン脂質のスポットを示し
、Ａは標準リン脂質より判明したホスファチジルエタノ
ールアミンのスポット、Ｂは同様ホスファチジルコリン
、Ｃは同様スフィンゴミエリン、Ｄは同様ホスフアチジ
ン酸、Ｅは同様リゾホスフアチジルコリンを示す。

第１０図より、血清（条件３の試料）中にはホスファチ
ジルエタノールアミン、ホスファチジルコリン、スフィ
ンゴミエリンおよびリゾホスフアチジルコリンが存在す
ることが明らかである。この血清にホスホリパーゼＤを
作用せしめる（条件１の試料）とホスフアチジン酸のみ
存在する。さらにこの血清にホスホリパーゼＤおよびホ
スフアチジン酸ホスファターゼを作用せしめる（条件２
の試料）と全くスポットが見られないことより、血清中
のリン脂質はホスホリパーゼＤによりホスフアチジン酸
にまで分解され、さらにこのホスフアチジン酸がホスフ
アチジン酸ホスファターゼにより無機リン酸とジグリセ
リドに分解されたと推定される。またこの結果は、この
ホスホリパーゼＤが、血清中のホスファチジルエタノー
ルアミンをも基質とし得る酵素であることを示している
。このホスホリパーゼＤ即ちストレプトマイセス・クロ
モフスカスＡ−０８４８菌株より得られるホスホリパー
ゼＤは、ストレプトマイセス・ハチジヨウエンシスＡｌ
ｌ４３菌株より得られるホスホリパーゼＤ（特開昭４８
−９９３８６号）よりも至適ＰＨ，．ＰＨ安定性、熱安
定性においてより優れており、さらにストレプトマイセ
ス●ハチジヨウエンシスＡｌｌ４３菌株はホスホリパー
ゼＤのほかにホスホリパーゼＣをも生産する（特開昭４
９−５５８９３号）た・め、ほぼ完全な精製を行なわな
い限り、その最終標品にホスホリパーゼＣの混入を伴い
、これによる副反応を生じる欠点を有している。

従つて、本発明に使用されるリン脂質の分析定量用のホ
スホリパーゼＤとしてはストレプトマイセス◆クロモフ
スカスＡ−０８５８菌株より得られるホスホリパーゼＤ
が好ましい。次に、本発明におけるコリンオキシダーゼ
の製法およびその酵素を用いてなる種々の分析法を具体
的に述べるが、本発明はこれらによつて何んら限定され
るものではない。

実施例１ コリン１．０％、ＫＣｌＯ．５％、Ｋ２ｌｌＰＯ４Ｏ．
ｌ％、ノＭｇＳＯ４・７Ｈ２００．０５％、酵母工キズ
０．２５％、フイシユ◆ソルブル（ＦｉｓｈｓＯｌｕｂ
ｌｅ）１．０％、デスホームＣＡ−２２００．１％より
なる培地１００ｍ１（ＰＨ７．２）を５００ｍ１容三角
フラスコに加え、１２０′Ｃｌ２吟間滅菌処理し、次い
でこれにアースロバクター・グロ・ビフオーミスＢ−０
５ｎ菌株を接種し、３０゜Ｃ、１日間培養して種菌を得
た。

次いで、この種菌を、上記と同一組成を有す培養液１０
ｅを有してなる滅菌後の３０ｆ容シャー●フアメンター
に移植し、３０℃、２日間、２００ｒｐｍ、２０ｅＩｍ
ｉｎの滅菌空気の条・件下通気攪拌培養し、得られる培
養液を遠心分離して集菌し、この菌体を１０ｎ１Ｍトリ
スー塩酸緩衝液（ＰＨ８．Ｏ）、２１Ｔ１ＭＥＤＴＡ（
エチレンジアミンテトラアセテイクアシド）、１％ＫＣ
ｌよりなる溶液１′にて洗浄した。この洗浄菌体を１ｅ
の１０ｒＴ１ＭＩＪン酸緩衝液（ＰＨ７．Ｏ）、２ｒＴ
１ＭＥＤＴＡ１１％ＫＣｌょりなる溶液に懸濁し、これ
にリゾチーム（長瀬産業社製、塩化リゾチーム）２００
ｍｇを加え、３７℃、３０分間攪拌した。リゾチーム処
理後、溶液を５０００ｒ′Ｐｍｌｌ紛間遠心分離し、得
られた上清液にアセトン１ｆを加えて析出する不純物を
遠心にて除去し、さらにこれにアセトンを加えて６５％
アセトン濃度とし、次いで５０００ｒｐｍ１１紛間遠心
分離して沈澱物を回収し、これを４０ｍ１の１０ｒＴ１
Ｍトリスー塩酸緩衝液（ＰＨ８．Ｏ）、２ｒｒ１ＭＥＤ
ＴＡ１１％ＫＣｌよりなる溶液に溶解し、不溶部分は遠
心して除去した。

次いでこれに６０ｍＬの飽和硫安溶液を加えて１５分間
攪拌した後、１２０００ｒｐｍにて１５分間遠心分離を
行い、得られた沈澱物を１５ｍ１の１０ｒＴ１Ｍリン酸
緩衝液（ＰＨ７．Ｏ）、２ｒＴ１ＭＥＤＴＡよりなる溶
液に溶解し、これを流速３０ｍＬＩｈｒにてセフアデツ
クスＧ一２５（ＳｅｐｈａｄｅｘＧ−２５）のカラムに
通じて脱塩した後、得られた溶液を、ＰＨ７．Ｏで緩衝
化したＤＥＡＥ−セルロースカラム（カラム径２．０×
７．０ｃｍ）に通じて酵素を吸着せしめ、さらに０．２
Ｍ〜０．５Ｍ（７）ＫＣｌのイオン強度勾配を用いて溶
出せしめた。約０．４ＭＫＣ１濃度での溶出画分を回収
して活性画分１７．２ｍ１を得た（流速、１．４ｍ１Ｉ
ｍｉｎ１１フラクシヨン；６ｍ１）。さらにこの活性画
分１７２ｗｔ１を透析膜（セルロースアセテート）にて
７時間透析せしめ（外液；５ｍＭン酸緩衝液、２ｒＴ１
ＭＥＤＴＡよりなる溶液）、次いでこの透析液を凍結乾
燥した。得られた凍結乾燥物を、１０ｍ１の１０ｍＭト
リスー塩酸緩衝液（ＰＨ８．Ｏ）、２ｒＴ１ＭＥＤＴＡ
１１％ＫＣｌよりなを溶液に溶解せしめた後、セフアデ
ツクスＧ−２００を用いたカラムクロマトグラフィを行
ない（カラム径：２．８×９．５ｃｍ１流速；０．１８
ｍ１Ｉｍｉｎ１１フラクシヨンニ６ｍ１）、そのフラク
シヨンＮＯ．４２〜４８の活性画分を回収し、凍結乾燥
した。次いで同様のセフアデツクス操作を行つた。この
得られた凍結乾燥物は、先の電気泳動の結果において述
べた通り、唯一の蛋白質の帯を示すものであつた。
全活性全蛋白質量比活性菌体抽出液 ９
９８ｕ．７６８０ｍク０．１３Ｌ！／Ｍ７アセトン沈Ｓ
９ＯＯｕ．５８Ｏｍｖｌ．５５ＵＺｍ７硫安沈澱 ８
２５ｕ．３００ｍ７２．７５Ｕβ７ＤＥＡＥ−セルロー
ス４２０ｕ．１１５ｍ７３．６５Ｕ／Ｍ７セフアテツク
スＧ−２０ａ．１）３９０ｕ．５８．２ｍ（Ｉ６．７Ｏ
Ｕ７ｍνセフアテツクスＧ−２０ＣＸ２）３８０ｕ．５
５．９７１１ｆ６８０Ｕ／Ｍｖまた各採取工程における
、コリンオキシダーゼの全活性、全蛋白質量、比活性は
上記表に示す通．りてある。実施例２（コリンの定量） 過酸化水素０．０１〜０．０５μＭＯｌｅ、トリスー塩
酸緩衝液（ＰＨ８．Ｏ）１０μＭＯｌｅｌ４−アミノア
ンチビリン１５０μｇ１フェノール２００Ｐｇ１パーオ
キシーダーゼ０．２Ｌ］、コリンオキシダーゼ０．２５
Ｕ．を含有する反応液０．５ｍ１を、３７℃にて２紛間
反応せしめた後エタノール２．５ｍ１を加えて４８０ｒ
１ｍにおける吸光度を測定して、過酸化水素の検量線を
得た。

次いで、上記の反応液中の過酸緩水素の代りに塩化コリ
ンを加え、同様に行なつてその吸光度を測定し、過酸化
水素の検量線よりコリンを定量した。実施例３（ベタイ
ンアルデヒドの定量） 上記実施例２のコリンの代りにベタインアルデヒドを用
いて同様に行なうことにより、ベタインアルデヒド試薬
のベタインアルデヒド純度を測定した。

実施例４（リン脂質の定量） 下記組成を有する反応液に、 反応液組成 ０．２Ｍトリスー塩酸緩衝液（ＰＨ８．Ｏ） ０．１
５ｍ１３ｍ９１ｍ１４−アミノアンチピリン ０．５
０ｍ１０．１％フェノール ０．３
０ｍＬ１％トリトンＸ−１０００．３０ｍｔ１０ｒＴ１
ＭＣａＣ１。

０．３０ｍ１１５ＵＩｍ１ コリンオキシダーゼ ０．１０ｍ１２ｕＩｍ１
パーオキシダーゼ ０．１０ｍ１１２Ｌ１１
ｍＬホスホリパーゼＤＯ．ｌＯｍｌ蒸留水
１．１５ｍ１３．００ｍ１シリカゲル
カラムクロマトグラフィーにより精製した卵黄レシチン
或は市販品血清（ハイランド社製）を各々添加し、３ｒ
ｃ１２吟間反応せしめた後、５００ｒ１ｍにて比色測定
した結果、第１１図および第１２図に示す通りである（
第１１図は卵黄レシチンに対する測定結果を示した、第
１２図は市販品血清に対する測定結果を示す。

この第１１図（卵黄レシチンの測定結果）と先の過酸化
水素の検量線とより、卵黄レシチン中の遊離されたコリ
ン量が算出され、さらにこのコリン量より卵黄レシチン
のモル数が求められる。同様、この第１２図（血清の測
定結果）と先の過酸化水素の検量線とより血清中のリン
脂質が定量される。なお、上記方法に用いたホスホリパ
ーゼＤは、ストレプトマスセス・クロモフスカスＡ−０
８４８菌株より得られたホスホリパーゼＤであつて、そ
の使用量は一般に０．５Ｕ．以上、好ましくは１〜５Ｕ
．程度てある。実施例５（コリンエステラーゼの測定）
下記組成を有する反応液に、 反応液組成 ０．２Ｍトリスー塩酸緩衝液（ＰＨ８．Ｏ） ０．０
５ｍ１３ＴｆＬｇ１ｍｔ４−アミノアンチピリン ０
．０５ｍ１０．１％フェノール ０
．１０ｍ１２ｕ．／Ｍｔパーオキシダーゼ
０．１０ｍ１２０Ｕ．Ｉｍ１コリンオキシダーゼ
０．２０ｍ１５０ｒＴ１Ｍベンゾイルコリン
０．０２ｍ１０．５２ｍ１生理食塩水にて１＠
希釈したヒト血清（健康人より採取）を加え、３７℃、
３紛間反応せしめ、次いでこれに０．２ｒＴ１Ｍネオス
チグミン溶液（コリンエステラーゼ阻害剤）３．０ｍ１
加えた後さらに室温下１吟間放置して５０（９）ｍにて
比色測定した結果、第１３図に示す通りであつて、血清
中コリンエステラーゼ活性は、反応液中のベンゾイルコ
リンより遊離されたコリンの量より（コリンはコリンオ
キシダーゼ、パーオキシダーゼ、４−アミノアンチピリ
ン、フェノール系により定量）測定されたものであつて
、この吸光度より血清中コリンエステラーゼの活性が求
められる。

またコリンエステラーゼの活性は、血清１．０ｍ１の酵
素が３７℃で１分間に２μＭＯｌｅの過酸化水素を生じ
たとき、１Ｕ。として表わすことがてきる。活性Ｕ．Ｉ
ｍｌ＝ΔＡ５ＯＯｌｍｊｎ×４．８上記コリンエステラ
ーゼ、ベンゾイルコリンの組合せの代りに他のコリン誘
導体の加水分解酵素および他のコリン誘導体を組合せて
用いることにより種々の酵素活性の測定や、コリン誘導
体の定量に使用し得る反応系を設定し得る。

参考例１ペプトン２％、ラクトース２％、ＮａＣｌＯ．
ｌ％、ＫＨ２ＰＯ４Ｏ．Ｏ５％、ＭｇＳＯ４・７Ｈ２０
０．０５％、デスホーｍｌ℃−５１Ｙ０．５％よりなる
組成の培地１００Ｔｎ１を有する５００ｍ１容三角フラ
スコ（１２０℃、２吟間滅菌処理）にストレプトマイセ
ス●クロモフスカスＡ−０８４８菌株を接種し、２６゜
Ｃ１３日間培養して種菌を得、これを上記と同一組成よ
りなる培地２０ｅを有する３０ｅ容シャー・フアーメン
ターに移植し、２６゜Ｃ１２日間、３００ｒ′Ｐｍｌ２
ＯｅＩｍｌｎの条件下通気攪拌培養した。

この培養液は０．５Ｕ．１ｍ１の活性を示す。この培養
物を遠心分離して得た培養；ｐ液１８ｅを３ｅになるま
で減圧濃縮し、この濃縮液にアセトン２．４ｅを加え、
生じた沈澱物を遠心分離して除去した。得られた上清液
にさらにアセトン２ｅを加えて生じた沈澱物を遠心分離
にて回収し、これを５００ｍ１の精製水に溶解せしめた
後、これにアセトン３５０ＴｒＬｔ加えて沈澱する不純
物を遠心分離により除去し、その上清液にアセトン３３
０ｍＬを加えて生じた沈物を遠心分離により回収し、こ
れを２００ｍ１の製精水に溶解した。これに、飽和硫安
溶液２００ｍ１を加えて生じた沈物を遠心分離により回
収した後、これを５０ｍ１の精製水に溶解し、セフアデ
ツクスＧ−２５により脱塩した後凍結乾燥して５ｕ．Ｉ
ｍ９の活性を有する粗製ホスホリパーゼＤの粉末７００
ｍ９を得た。本発明においては、この粗製ホスホリパー
ゼＤをそのまま利用したものであつて、必ずしも完全に
精製したものと必要とするものではなく、またこの粗製
ホスホリパーゼＤは上記記載の一般的手段にて精製し、
この精製ホスホリパーゼＤを用いてもよい。

【図面の簡単な説明】

第１図はコリンオキシダーゼの至適ＰＨを示し、第２図
はコリンオキシダーゼの至適温度を示し、第３図はコリ
ンオキシダーゼのＰＨ安定性を示し、第４図はコリンオ
キシダーゼの熱安定性を示し、第５図はコリンオキシダ
ーゼの電気泳動図を示し、第６図はコリン・ベタインア
ルデヒドおよび過酸化水素の検量線を示し、第７図はホ
スホリパーゼＤ（７）ＰＨ安定性を示し、第８図はホス
ホリパーゼＤの至適ＰＨを示し、第９図はホスホリパー
ゼＤの熱安定性を示し、第１０図はホスホリパーゼＤ・
の血清リン脂質の分解作用を示す薄層クロマトグラムを
示し、第１１図は卵黄レシチンの定量結果を示し、第１
２図は血清リン脂質の定量結果を示し、第１３図はヒト
血清コリンエステラーゼ活性の測定結果を示す。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ 少なくとも下記の一般式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （式中、Ｒ＿１は−ＣＨ＿２−ＯＨ基または−ＣＨＯ基
   を示す）で表わされる化合物に基質特異性を有し、かつ
   下記反応式〔 I 〕および／または〔II〕：▲数式、化
   学式、表等があります▼▲数式、化学式、表等がありま
   す▼〔 I 〕▲数式、化学式、表等があります▼ ▲数式、化学式、表等があります▼〔II〕で示される酵
   素作用を有するコリンオキシダーゼ生産能力を有する微
   生物を用いる該コリンオキシダーゼの培養による培養物
   からの採取製造の培養培地にいて、用いる培地にコリン
   を添加することを特徴とする該コリンオキシダーゼの改
   良製造法。 ２ コリンの添加量が、培地に対して０．５〜１％であ
   る特許請求の範囲第１項記載のコリンオキシダーゼの改
   良製造法。