JPH0667317B2 - Ｎ−アセチルヘキソサミンデヒドロゲナーゼ、その製造法及び該酵素を用いるｎ−アセチルグルコサミン又はｎ−アセチルガラクトサミンの定量法及びその定量用キット - Google Patents
Ｎ−アセチルヘキソサミンデヒドロゲナーゼ、その製造法及び該酵素を用いるｎ−アセチルグルコサミン又はｎ−アセチルガラクトサミンの定量法及びその定量用キットInfo
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- JPH0667317B2 JPH0667317B2 JP63234746A JP23474688A JPH0667317B2 JP H0667317 B2 JPH0667317 B2 JP H0667317B2 JP 63234746 A JP63234746 A JP 63234746A JP 23474688 A JP23474688 A JP 23474688A JP H0667317 B2 JPH0667317 B2 JP H0667317B2
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Description
【発明の詳細な説明】 ＜産業上の利用分野＞ 本発明は、Ｎ−アセチルグルコサミン又はＮ−アセチル
ガラクトサミンに作用して、Ｎ−アセチルグルコサミノ
ラクトン又はＮ−アセチルガラクトサミノラクトンにす
ると共に、酸化型ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレ
オチド（NAD）を還元型ニコチンアミド・アデニン・ジ
ヌクレオチド（NADH）に還元する、新規なＮ−アセチル
ヘキソサミンデヒドロゲナーゼ（以下Ｎ−AHDHという）
とその製造法及びＮ−AHDHを用いるＮ−アセチルグルコ
サミン又はＮ−アセチルガラクトサミンの酵素的定量方
法、及びその定量用キットに関するものである。
ガラクトサミンに作用して、Ｎ−アセチルグルコサミノ
ラクトン又はＮ−アセチルガラクトサミノラクトンにす
ると共に、酸化型ニコチンアミド・アデニン・ジヌクレ
オチド（NAD）を還元型ニコチンアミド・アデニン・ジ
ヌクレオチド（NADH）に還元する、新規なＮ−アセチル
ヘキソサミンデヒドロゲナーゼ（以下Ｎ−AHDHという）
とその製造法及びＮ−AHDHを用いるＮ−アセチルグルコ
サミン又はＮ−アセチルガラクトサミンの酵素的定量方
法、及びその定量用キットに関するものである。
＜従来の技術＞ 細胞表層や体液中の蛋白質等に結合して存在する複合糖
質が生体制御の情報を担っていることが知られて以来、
複合糖質の研究は急速な発展を見せている。その結果、
生体制御の異常と複合糖質の構造異常との関係も少しづ
つ判明してきている。
質が生体制御の情報を担っていることが知られて以来、
複合糖質の研究は急速な発展を見せている。その結果、
生体制御の異常と複合糖質の構造異常との関係も少しづ
つ判明してきている。
又、一連のムコ多糖や複合糖質の代謝異常によりムコ多
糖類が尿中に多量に排出されたり、組織に蓄積されたり
する場合があり、その原因を特定するためにも、それら
の糖類の構造研究は重要である。
糖類が尿中に多量に排出されたり、組織に蓄積されたり
する場合があり、その原因を特定するためにも、それら
の糖類の構造研究は重要である。
又、臨床検査の上においては、腎障害の程度や障害部位
を特定するため、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ
やリゾチーム等、Ｎ−アセチルグルコサミン代謝系の酵
素活性が盛んに測定されている。
を特定するため、β−Ｎ−アセチルグルコサミニダーゼ
やリゾチーム等、Ｎ−アセチルグルコサミン代謝系の酵
素活性が盛んに測定されている。
これらの研究や酵素活性の測定は、Ｎ−アセチルグルコ
サミンの定量が重要な部位を占めており、その優れた測
定法が当業者から要望されていた。
サミンの定量が重要な部位を占めており、その優れた測
定法が当業者から要望されていた。
Ｎ−アセチルグルコサミンの定量は、一般的には化学的
な方法（例えば、モーガン−エルソン法など）で測定さ
れているが、酵素を用いた方法が精度と簡便性において
優れている。その例としては、Ｎ−アセチルヘキソサミ
ン酸化酵素を用いる特開昭59−156299号がある。これは
Ｎ−アセチルヘキソサミンにＮ−アセチルヘキソサミン
酸化酵素を作用させて生成された過酸化水素等の産物を
測定するか、又は反応に伴って吸収された酸素を測定す
ることによって、Ｎ−アセチルヘキソサミンを定量する
ものである。
な方法（例えば、モーガン−エルソン法など）で測定さ
れているが、酵素を用いた方法が精度と簡便性において
優れている。その例としては、Ｎ−アセチルヘキソサミ
ン酸化酵素を用いる特開昭59−156299号がある。これは
Ｎ−アセチルヘキソサミンにＮ−アセチルヘキソサミン
酸化酵素を作用させて生成された過酸化水素等の産物を
測定するか、又は反応に伴って吸収された酸素を測定す
ることによって、Ｎ−アセチルヘキソサミンを定量する
ものである。
＜発明が解決しようとする問題点＞ しかし、該Ｎ−アセチルヘキソサミン酸化酵素は基質特
異性が比較的広いため、N,N′−ジアセチルキトビオー
ス等にも作用を示すことが分っている。この糖はβ−Ｎ
−アセチルグルコサミニダーゼの１回の作用で２分子の
Ｎ−アセチルグルコサミンを生成するため、酵素活性の
高感度測定を行なうのに優れた基質であるが、前述の理
由のために、例えば、尿中のβ−Ｎ−アセチルグルコサ
ミニダーゼを測定する場合の基質として用いることは出
来なかった。
異性が比較的広いため、N,N′−ジアセチルキトビオー
ス等にも作用を示すことが分っている。この糖はβ−Ｎ
−アセチルグルコサミニダーゼの１回の作用で２分子の
Ｎ−アセチルグルコサミンを生成するため、酵素活性の
高感度測定を行なうのに優れた基質であるが、前述の理
由のために、例えば、尿中のβ−Ｎ−アセチルグルコサ
ミニダーゼを測定する場合の基質として用いることは出
来なかった。
又、尿中に存在する還元性物質は過酸化水素の定量系に
対して影響を与えることが知られており、そのため測定
精度が多少低下する場合があった。しかし、NADH定量系
の場合には、その様な物質の影響は殆どないことが解か
っている。このため測定試料の前処理や測定系の工夫を
最小限に留めることが可能であり、より精度の高い定量
を行なうことが出来る。
対して影響を与えることが知られており、そのため測定
精度が多少低下する場合があった。しかし、NADH定量系
の場合には、その様な物質の影響は殆どないことが解か
っている。このため測定試料の前処理や測定系の工夫を
最小限に留めることが可能であり、より精度の高い定量
を行なうことが出来る。
本発明者等は、この点に着目して改良されたＮ−アセチ
ルヘキソサミンの酵素的測定法の開発を目的として、Ｎ
−アセチルグルコサミン定量用酵素を検索した。その結
果、土壌から分離したシュードモナス属に属する１細菌
にＮ−アセチルグルコサミン又はＮ−アセチルガラクト
サミンに作用して、それぞれＮ−アセチルグルコサミノ
ラクトン又はＮ−アセチルガラクトサミノラクトンにす
ると共に、共存するNADをNADHに還元する新規な酵素Ｎ
−AHDHが含まれていることを発見した。そして、その酵
素がアセチルキトビオースには作用しないことを確認
し、新規なＮ−アセチルグルコサミン又はＮ−アセチル
ガラクトサミンの酵素的定量に応用出来ることを見出し
て、本発明を完成させた。
ルヘキソサミンの酵素的測定法の開発を目的として、Ｎ
−アセチルグルコサミン定量用酵素を検索した。その結
果、土壌から分離したシュードモナス属に属する１細菌
にＮ−アセチルグルコサミン又はＮ−アセチルガラクト
サミンに作用して、それぞれＮ−アセチルグルコサミノ
ラクトン又はＮ−アセチルガラクトサミノラクトンにす
ると共に、共存するNADをNADHに還元する新規な酵素Ｎ
−AHDHが含まれていることを発見した。そして、その酵
素がアセチルキトビオースには作用しないことを確認
し、新規なＮ−アセチルグルコサミン又はＮ−アセチル
ガラクトサミンの酵素的定量に応用出来ることを見出し
て、本発明を完成させた。
すなわち本発明はＮ−アセチルグルコサミンとＮ−アセ
チルガラクトサミンに作用して、それぞれＮ−アセチル
グルコサミノラクトンとＮ−アセチルガラクトサミノラ
クトンにすると共に、NADをNADHに還元する新規な酵素
Ｎ−NADHであり、又、本発明はシュードモナス属に属
し、Ｎ−AHDH生産能を有する菌株を培地に培養し、培養
物よりＮ−AHDHを採取することを特徴とするＮ−AHDHの
製造法である。
チルガラクトサミンに作用して、それぞれＮ−アセチル
グルコサミノラクトンとＮ−アセチルガラクトサミノラ
クトンにすると共に、NADをNADHに還元する新規な酵素
Ｎ−NADHであり、又、本発明はシュードモナス属に属
し、Ｎ−AHDH生産能を有する菌株を培地に培養し、培養
物よりＮ−AHDHを採取することを特徴とするＮ−AHDHの
製造法である。
そして又、本発明はＮ−アセチルグルコサミン又はＮ−
アセチルガラクトサミン含有試料にＮ−AHDHを作用さ
せ、生成するNADHを測定するＮ−アセチルグルコサミン
又はＮ−アセチルガラクトサミンの定量方法であり、
又、少なくともＮ−AHDH、NAD及び緩衝液を含む定量用
キットである。
アセチルガラクトサミン含有試料にＮ−AHDHを作用さ
せ、生成するNADHを測定するＮ−アセチルグルコサミン
又はＮ−アセチルガラクトサミンの定量方法であり、
又、少なくともＮ−AHDH、NAD及び緩衝液を含む定量用
キットである。
＜問題点を解決するための手段＞ 以下本発明を具体的に説明する。
本発明における新規酵素Ｎ−AHDHの理化学的性質は下記
の通りである。
の通りである。
（１）作用及び基質特異性 次の反応式に示されるごとく、Ｎ−アセチルグルコサミ
ン又はＮ−アセチルガラクトサミンをNADとの共存下で
Ｎ−アセチルグルコサミノラクトン又はＮ−アセチルガ
ラクトサミノラクトンに酸化すると共に、NADをNADHに
還元する。
ン又はＮ−アセチルガラクトサミンをNADとの共存下で
Ｎ−アセチルグルコサミノラクトン又はＮ−アセチルガ
ラクトサミノラクトンに酸化すると共に、NADをNADHに
還元する。
Ｎ−アセチルグルコサミン＋NAD→ （Ｎ−アセチルガラクトサミン） Ｎ−アセチルグルコサミノラクトン＋NADH＋H+ （Ｎ−アセチルガラクトサミノラクトン） Ｎ−アセチルマンノサミンに極めて僅かに作用する他
は、N,N′−ジアセチルキトビオースやヘキソサミン、
中性糖に対しては全く、もしくは殆ど作用しない。
は、N,N′−ジアセチルキトビオースやヘキソサミン、
中性糖に対しては全く、もしくは殆ど作用しない。
（２）至適pH及び安定pH範囲 リン酸緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、グリシン−苛性ソ
ーダ緩衝液を用いて酵素活性を測定した結果は第１図に
示すとおりで、至適pHは8.0〜10.5である。
ーダ緩衝液を用いて酵素活性を測定した結果は第１図に
示すとおりで、至適pHは8.0〜10.5である。
安定pH範囲は第２図に示すごとく8.0〜11.5である。
使用緩衝液はリン酸カリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝
液、グリシン−苛性ソーダ緩衝液である。
液、グリシン−苛性ソーダ緩衝液である。
（３）作用適温の範囲 第３図に示すごとく30〜60℃である。
（４）pH、温度等による失活の条件 第４図に示すごとく、0.1Mグリシン−苛性ソーダ緩衝液
（pH9.5）の中では、10分間の熱処理では55℃まで安定
であり、65℃以上では急速に失活する。45℃、10分間の
熱処理ではpH8.0〜11.5で安定であるが、pH6.0以下では
特に不安定である。
（pH9.5）の中では、10分間の熱処理では55℃まで安定
であり、65℃以上では急速に失活する。45℃、10分間の
熱処理ではpH8.0〜11.5で安定であるが、pH6.0以下では
特に不安定である。
（５）阻害剤の影響及び安定化 上表は各種金属イオン及び阻害剤を2mMの濃度で含有す
る反応液中での酸素活性を測定したものである。活性化
及び安定化のために特別に寄与する物質は知られていな
い。
る反応液中での酸素活性を測定したものである。活性化
及び安定化のために特別に寄与する物質は知られていな
い。
（６）精製方法 本酵素の単離・精製は常法に従って行なうことができ、
例えばDEAE−セルロースを用いたカラムクロマトグラフ
ィー、硫安沈殿、DEAE−セファデックスを用いたカラム
クロマトグラフィー、セファデックスＧ−200によるゲ
ル濾過等の精製手段を単独もしくは適宜組合わせて使用
する。
例えばDEAE−セルロースを用いたカラムクロマトグラフ
ィー、硫安沈殿、DEAE−セファデックスを用いたカラム
クロマトグラフィー、セファデックスＧ−200によるゲ
ル濾過等の精製手段を単独もしくは適宜組合わせて使用
する。
（７）分子量 0.05Mトリス−塩酸緩衝液（0.1M NaCl含有）を用いて
セファデックスＧ−200のカラムによるゲル濾過法によ
り測定した値は約12万〜13万である。
セファデックスＧ−200のカラムによるゲル濾過法によ
り測定した値は約12万〜13万である。
（８）ポリアクリルアミドゲル電気泳動 7.5％オリアクリルアミドゲルを用いて常法によってア
クリルアミドディスク電気泳動を行なった結果、第５図
に示すごとく、ほぼ単一のバンドが認められた。7.5％
ポリアクリルアミドゲルでブロムフェノールブルーを指
標とした時、相対移動度は0.41である。
クリルアミドディスク電気泳動を行なった結果、第５図
に示すごとく、ほぼ単一のバンドが認められた。7.5％
ポリアクリルアミドゲルでブロムフェノールブルーを指
標とした時、相対移動度は0.41である。
（９）等電点 アクリルアミドゲル焦点電気泳動により測定した値は4.
7である。
7である。
（10）活性の測定法 0.1Mグリシン−苛性ソーダ緩衝液（pH9.5）1.8mlに60mM
NAD溶液0.1mlを加える。37℃に10分間保った後、酵素
液10μｌを加え、続いて0.3M Ｎ−アセチルグルコサミ
ン溶液0.1mlを加え混合して、反応を始める。直ちに37
℃に保った吸光度測定用セル（1cm光路）に移し、340nm
の波長で１分ごとに５分または必要であればそれ以上の
時間にわたって吸光度を測定する。１単位は１分間に１
μモルのNADHを生成させる酵素量である。
NAD溶液0.1mlを加える。37℃に10分間保った後、酵素
液10μｌを加え、続いて0.3M Ｎ−アセチルグルコサミ
ン溶液0.1mlを加え混合して、反応を始める。直ちに37
℃に保った吸光度測定用セル（1cm光路）に移し、340nm
の波長で１分ごとに５分または必要であればそれ以上の
時間にわたって吸光度を測定する。１単位は１分間に１
μモルのNADHを生成させる酵素量である。
以上のように本酵素はその作用及び基質特異性において
従来全く知られていない新規な酵素である。
従来全く知られていない新規な酵素である。
次に本発明による新規な酵素Ｎ−AHDHの製造法について
説明する。使用される微生物はシュードモナス属に属
し、Ｎ−AHDH生産能を有する菌株であって、その具体例
としては、シュードモナスsp.No.53が挙げられ、該菌の
変種もしくは変異株も用いられる。シュードモナスsp.N
o.53は本発明者等が土壌中より分離した菌株であり、そ
の菌学的性質は下記の通りである。
説明する。使用される微生物はシュードモナス属に属
し、Ｎ−AHDH生産能を有する菌株であって、その具体例
としては、シュードモナスsp.No.53が挙げられ、該菌の
変種もしくは変異株も用いられる。シュードモナスsp.N
o.53は本発明者等が土壌中より分離した菌株であり、そ
の菌学的性質は下記の通りである。
（ａ）形 態 顕微鏡的観察（0.4％酵母エキスを加えた加糖ブイヨン
培地に30℃、18時間培養した） 細胞の大きさ:1.0〜1.1×1.4〜2.6ミクロンの桿菌 細胞の多形性：球状に近いものから比較的長い桿菌の
ものまである。末端でつながった２連鎖状のものは見ら
れるが、それ以上の連鎖は見られない。
培地に30℃、18時間培養した） 細胞の大きさ:1.0〜1.1×1.4〜2.6ミクロンの桿菌 細胞の多形性：球状に近いものから比較的長い桿菌の
ものまである。末端でつながった２連鎖状のものは見ら
れるが、それ以上の連鎖は見られない。
運動性：直線状の早い運動をする。（極鞭毛） 胞子の有無：形成せず。
グラム染色性：陰性 抗酸性：陰性 （ｂ）各培地における生育状態 肉汁寒天平板培養:30℃、３日間の培養で直径1.5mmの
白茶色の全縁、コンベックスの半透明なコロニーを作
る。色素の生成は見られない。
白茶色の全縁、コンベックスの半透明なコロニーを作
る。色素の生成は見られない。
酵母エキス添加（0.4％）加糖肉汁寒天平板培養:30
℃、３日間で直径2.1mm白茶色の全縁、コンベックスの
半透明なコロニーを作る。
℃、３日間で直径2.1mm白茶色の全縁、コンベックスの
半透明なコロニーを作る。
酵母エキス添加（0.4％）加糖肉汁寒天斜面培養:30
℃、24時間の培養で良好に生育する。表面平滑で脂肪光
沢があり、半透明である。
℃、24時間の培養で良好に生育する。表面平滑で脂肪光
沢があり、半透明である。
酵母エキス添加（0.4％）加糖肉汁液体培地：静置培
養では極めて生育が悪く、30℃、２日間で、僅かに表面
に菌膜らしいものが生じ、時間がたつと沈殿する。振盪
培養を行なうと、30℃、24時間で均一によく生育する。
養では極めて生育が悪く、30℃、２日間で、僅かに表面
に菌膜らしいものが生じ、時間がたつと沈殿する。振盪
培養を行なうと、30℃、24時間で均一によく生育する。
肉汁ゼラチン穿刺培養:24℃、３日間で僅かに生育す
るがゼラチンの液化はしない。
るがゼラチンの液化はしない。
リトマスミルク:30℃、５日間で僅かに酸性反応を示
し、弱く凝固し、上に透明液を分離した。
し、弱く凝固し、上に透明液を分離した。
（ｃ）生理的性質 硝酸塩の還元：陰性 脱窒反応：陰性 MRテスト：陰性 VPテスト：陰性 インドールの生成：陰性 硫化水素の生成：陽性（酢酸鉛試験紙） デンプンの加水分解：陰性 クエン酸の利用：陰性 無機窒素源の利用：陰性 色素の生成：陰性 ウレアーゼ：陰性 オキシダーゼ：陽性 カタラーゼ：陽性 生育の範囲:13℃〜36℃（至適温度29℃） pH4.6〜8.5（至適pH、中性付近） 酸素に対する態度：極めて好気的 Ｏ−Ｆテスト：酸化的 糖類から酸及びガスの生成： （ｄ）その他の性質 ポリ−β−ハイドロキシブチル酸エステルを蓄積しな
い。
い。
蛍光性色素を生成しない。
40℃で生育しない。
H2をエネルギー源として利用しない。
アルギニンジハイドロラーゼを生産しない。
以上の新規なＮ−AHDH生産能を有する本菌の分類学的諸
性質を「バージェイズ・マニュアル・オブ・システマチ
ック・バクテリオロジー」（1984年）第１巻の分類と対
比すると、本菌はグラム染色性が陰性、好気性の無胞子
桿菌で極鞭毛を持つ、カタラーゼ陽性菌であることか
ら、シュードモナス属に属すると思われる。菌体内にポ
リ−β−ハイドロキシブチレートを蓄積せず、黄色色素
や蛍光性物質も生産せず、生育にグルコースを利用す
る、40℃で生育しない等の性質から、シュードモナス
スツッセリ（Pseudomonas stutzeri）に近縁であると
思われる。しかしながら、脱窒反応、デンプン分解反
応、トレハロースの利用などの点で異なっており、従来
知られていない新規な菌株と思われる。
性質を「バージェイズ・マニュアル・オブ・システマチ
ック・バクテリオロジー」（1984年）第１巻の分類と対
比すると、本菌はグラム染色性が陰性、好気性の無胞子
桿菌で極鞭毛を持つ、カタラーゼ陽性菌であることか
ら、シュードモナス属に属すると思われる。菌体内にポ
リ−β−ハイドロキシブチレートを蓄積せず、黄色色素
や蛍光性物質も生産せず、生育にグルコースを利用す
る、40℃で生育しない等の性質から、シュードモナス
スツッセリ（Pseudomonas stutzeri）に近縁であると
思われる。しかしながら、脱窒反応、デンプン分解反
応、トレハロースの利用などの点で異なっており、従来
知られていない新規な菌株と思われる。
以上の理由により本菌をシュードモナスsp.No.53と命名
した。なお、シュードモナスsp.No.53は通商産業省 工
業技術院 微生物工業技術研究所に微工研条寄第2057号
（FERM BP−2057）として寄託されている。
した。なお、シュードモナスsp.No.53は通商産業省 工
業技術院 微生物工業技術研究所に微工研条寄第2057号
（FERM BP−2057）として寄託されている。
次に本発明で使用する培知としては、炭素源、窒素源、
無機物、その他の栄養素を適宜含有する培地ならば、合
成培地又は天然培地のいずれでも使用可能である。炭素
源としてはグルコース、ガラクトース、フラクトース等
を用いることができる。窒素源としてはペプトン、カゼ
イン消化物、グルタミン酸、酵母エキス等の窒素性有機
物が好適に使用できる。無機物としては、ナトリウム、
カリウム、マグネシウム、マンガン、カルシウム、鉄等
の塩類が使用できる。
無機物、その他の栄養素を適宜含有する培地ならば、合
成培地又は天然培地のいずれでも使用可能である。炭素
源としてはグルコース、ガラクトース、フラクトース等
を用いることができる。窒素源としてはペプトン、カゼ
イン消化物、グルタミン酸、酵母エキス等の窒素性有機
物が好適に使用できる。無機物としては、ナトリウム、
カリウム、マグネシウム、マンガン、カルシウム、鉄等
の塩類が使用できる。
本発明においては、Ｎ−AHDH生産能を有する菌株をＮ−
アセチルグルコサミン又はＮ−アセチルガラクトサミン
を含有する培地で培養したときにＮ−AHDHが収量よく得
られる。該培養培地の好適な例としては、Ｎ−アセチル
グルコサミン0.5％、酵母エキス0.5％、ポリペプトン0.
3％、リン酸−カリウム0.2％、硫酸マグネシウム0.05
％、塩化カルシウム0.01％、硫酸第一鉄0.01％（pH7.
0）の培地例が挙げられる。そして該培地で30℃、20時
間、通気攪拌培養した場合には、Ｎ−アセチルグルコサ
ミンをＮ−アセチルガラクトサミン以外の他の糖に置き
換えた場合の10〜100倍の生産力価を得ることができ
る。
アセチルグルコサミン又はＮ−アセチルガラクトサミン
を含有する培地で培養したときにＮ−AHDHが収量よく得
られる。該培養培地の好適な例としては、Ｎ−アセチル
グルコサミン0.5％、酵母エキス0.5％、ポリペプトン0.
3％、リン酸−カリウム0.2％、硫酸マグネシウム0.05
％、塩化カルシウム0.01％、硫酸第一鉄0.01％（pH7.
0）の培地例が挙げられる。そして該培地で30℃、20時
間、通気攪拌培養した場合には、Ｎ−アセチルグルコサ
ミンをＮ−アセチルガラクトサミン以外の他の糖に置き
換えた場合の10〜100倍の生産力価を得ることができ
る。
培養温度は通常20〜35℃の範囲で好適には30℃の近傍で
行なわれる。培養開始のpHは通常６〜８の範囲、好適に
は７近辺である。この様な条件下で20〜30時間振盪又は
深部攪拌培養を行なえば、該培養物中にＮ−AHDHが生成
蓄積する。
行なわれる。培養開始のpHは通常６〜８の範囲、好適に
は７近辺である。この様な条件下で20〜30時間振盪又は
深部攪拌培養を行なえば、該培養物中にＮ−AHDHが生成
蓄積する。
Ｎ−AHDHは通常は菌体中に存在するので培養物を遠心分
離、あるいは濾過によって菌体だけを分離するのが好ま
しい。これを適量の緩衝液中で破壊して酵素を可溶化す
ることによって溶液中に放出させる。
離、あるいは濾過によって菌体だけを分離するのが好ま
しい。これを適量の緩衝液中で破壊して酵素を可溶化す
ることによって溶液中に放出させる。
菌体の破壊方法はダイノミル、フレンチプレス、超音波
等の物理的なものや、トリトンＸ−100、ラウリル硫酸
ソーダ、EDTA糖の化学的方法、リゾチーム等の酵素的方
法を単独または併用して用いることができる。この様に
して得られた菌体破壊液から核酸を常法によって除去
し、濾過または遠心分離によって不溶物を除きＮ−AHDH
を得る。
等の物理的なものや、トリトンＸ−100、ラウリル硫酸
ソーダ、EDTA糖の化学的方法、リゾチーム等の酵素的方
法を単独または併用して用いることができる。この様に
して得られた菌体破壊液から核酸を常法によって除去
し、濾過または遠心分離によって不溶物を除きＮ−AHDH
を得る。
更にＮ−AHDHは必要により酵素の単離精製の常法に従っ
て、例えば（１）DEAE−セルロース塔によるカラムクロ
マトグラフィー、（２）硫安による分画沈殿、（３）DE
AE−セファデックス塔によるカラムクロマトグラフィ
ー、（４）セファデックスによるゲル濾過等の方法、又
はその他の方法を必要に応じて組合わせて用いることに
より、精製されたＮ−AHDHを得ることができる。
て、例えば（１）DEAE−セルロース塔によるカラムクロ
マトグラフィー、（２）硫安による分画沈殿、（３）DE
AE−セファデックス塔によるカラムクロマトグラフィ
ー、（４）セファデックスによるゲル濾過等の方法、又
はその他の方法を必要に応じて組合わせて用いることに
より、精製されたＮ−AHDHを得ることができる。
次に本発明によるＮ−アセチルグルコサミン又はＮ−ア
セチルガラクトサミンの定量法及びその定量用キットに
ついて具体的に説明する。
セチルガラクトサミンの定量法及びその定量用キットに
ついて具体的に説明する。
本発明の測定原理は下記に示す通りである。
すなわち試料中のＮ−アセチルグルコサミン又はＮ−ア
セチルガラクトサミンにＮ−AHDHを作用させ、この生成
されたNADHを公知の測定方法、例えば紫外部34nmの吸光
度を測定する方法等によって測定することができる。
セチルガラクトサミンにＮ−AHDHを作用させ、この生成
されたNADHを公知の測定方法、例えば紫外部34nmの吸光
度を測定する方法等によって測定することができる。
またＮ−AHDHを固体に保持させて試料と接触させること
により、生成したNADHを同時に測定することもできる。
また共存するラクテートデヒドロゲナーゼ（LDH）の影
響を防ぐために必要であればオキサミド酸や蓚酸等の阻
害剤を適量添加することもできる。
により、生成したNADHを同時に測定することもできる。
また共存するラクテートデヒドロゲナーゼ（LDH）の影
響を防ぐために必要であればオキサミド酸や蓚酸等の阻
害剤を適量添加することもできる。
本発明に用いるＮ−AHDHはいかなる起源のものでも使用
出来るが、例えばシュードモナス属に属する細菌から選
ばれた菌を培養して得られるＮ−AHDHを用いることが好
ましい。
出来るが、例えばシュードモナス属に属する細菌から選
ばれた菌を培養して得られるＮ−AHDHを用いることが好
ましい。
シュードモナス属に属する上記酵素生産菌としては、例
えばシュードモナスsp.No.53（FERM BP−2057）等が挙
げられる。
えばシュードモナスsp.No.53（FERM BP−2057）等が挙
げられる。
試料中のＮ−アセチルグルコサミン又はＮ−アセチルガ
ラクトサミンに上記Ｎ−AHDHを作用させる場合には、pH
7〜11及び温度60℃以下、好ましくはpH8〜10.5及び温度
30〜55℃の条件で、通常は１〜20分間程度反応させる。
pHの調整には前記pH範囲を維持することができ、かつ酵
素反応を阻害しない任意の緩衝液が用いられ、例えばリ
ン酸カリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、グリシン−
苛性ソーダ緩衝液等が好適に使用できる。
ラクトサミンに上記Ｎ−AHDHを作用させる場合には、pH
7〜11及び温度60℃以下、好ましくはpH8〜10.5及び温度
30〜55℃の条件で、通常は１〜20分間程度反応させる。
pHの調整には前記pH範囲を維持することができ、かつ酵
素反応を阻害しない任意の緩衝液が用いられ、例えばリ
ン酸カリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝液、グリシン−
苛性ソーダ緩衝液等が好適に使用できる。
Ｎ−AHDHの作用により生成されるNADHの定量はいかなる
方法を用いても良いが、最も一般的に用いられている方
法は、紫外部340nmにおける吸光度を測定する方法であ
る。可視部に吸収を持つ色素に転換して定量する方法
は、フェナジンメトサルフェートとニトロブルーテトラ
ゾリウムと共に反応させて生成したダイホルマザンの57
0nmにおける吸光度を測定するものや、NADH酸化酵素
〔J.Biochem98 1433（1985）〕やフェナジンメトサルフ
ェート又はそれに類する作用をする電子伝達体、又は金
属イオンと反応させて生成した過酸化水素をパーオキシ
ダーゼと各種色原体と共に発色させて、それぞれの好適
な波長での吸光度を測定するものがある。過酸化水素に
導かれたものはルミノールと共に発光させて検出するこ
ともできる。また適当に選択した複数の酸化還元指示薬
と電子伝達体を共存させて、その色調の特徴から半定量
的に検出することも可能である。これらの検出方法はそ
の特徴によって使いわければ良い。
方法を用いても良いが、最も一般的に用いられている方
法は、紫外部340nmにおける吸光度を測定する方法であ
る。可視部に吸収を持つ色素に転換して定量する方法
は、フェナジンメトサルフェートとニトロブルーテトラ
ゾリウムと共に反応させて生成したダイホルマザンの57
0nmにおける吸光度を測定するものや、NADH酸化酵素
〔J.Biochem98 1433（1985）〕やフェナジンメトサルフ
ェート又はそれに類する作用をする電子伝達体、又は金
属イオンと反応させて生成した過酸化水素をパーオキシ
ダーゼと各種色原体と共に発色させて、それぞれの好適
な波長での吸光度を測定するものがある。過酸化水素に
導かれたものはルミノールと共に発光させて検出するこ
ともできる。また適当に選択した複数の酸化還元指示薬
と電子伝達体を共存させて、その色調の特徴から半定量
的に検出することも可能である。これらの検出方法はそ
の特徴によって使いわければ良い。
本発明のＮ−アセチルグルコサミン又はＮ−アセチルガ
ラクトサミン定量用キットは、Ｎ−AHDH、NADと生成さ
れるNADHを定量するための酵素や試薬類、及びこれらの
反応を円滑に進めるための緩衝用試薬からなっている。
この試薬類、酵素類は液剤、固形剤もしくは凍結乾燥さ
れた製剤とし、必要に応じて使用前に緩衝液に溶解混合
して測定用試薬とする。
ラクトサミン定量用キットは、Ｎ−AHDH、NADと生成さ
れるNADHを定量するための酵素や試薬類、及びこれらの
反応を円滑に進めるための緩衝用試薬からなっている。
この試薬類、酵素類は液剤、固形剤もしくは凍結乾燥さ
れた製剤とし、必要に応じて使用前に緩衝液に溶解混合
して測定用試薬とする。
測定方法はＮ−アセチルグルコサミン又はＮ−アセチル
ガラクトサミン含有試料に直接作用させることによって
NADHを生成させる。そしてこれをそのまま、あるいはNA
DH定量用試薬を加えることによってNADHを測定する。こ
れらの測定方法は１試薬系でも２試薬系でも良く、さら
に何試薬系で測定しても良い。
ガラクトサミン含有試料に直接作用させることによって
NADHを生成させる。そしてこれをそのまま、あるいはNA
DH定量用試薬を加えることによってNADHを測定する。こ
れらの測定方法は１試薬系でも２試薬系でも良く、さら
に何試薬系で測定しても良い。
＜発明の効果＞ 本発明によれば新規なＮ−AHDHを用いるとＮ−アセチル
グルコサミン又はＮ−アセチルガラクトサミンの定量を
精度良く行なうことが出来、これに基づいてβ−Ｎ−ア
セチルグルコサミニダーゼの活性等を知ることが出来
る。その結果、複合糖質の構造解析や腎臓障害の病態診
断を効率良く行なうことが出来、当業者にとって極めて
有意義である。
グルコサミン又はＮ−アセチルガラクトサミンの定量を
精度良く行なうことが出来、これに基づいてβ−Ｎ−ア
セチルグルコサミニダーゼの活性等を知ることが出来
る。その結果、複合糖質の構造解析や腎臓障害の病態診
断を効率良く行なうことが出来、当業者にとって極めて
有意義である。
次に本発明を実施例により説明する。
＜実施例＞ 実施例１ シュードモナスsp.No.53（微工研条寄第2057号、FERM
BP−2057）をＮ−アセチルグルコサミン0.5％、酵母エ
キス0.5％、ポリペプトン0.3％、リン酸一カリウム0.2
％、硫酸マグネシウム0.05％、塩化カルシウム0.01％、
硫酸第一鉄0.01％を含有した種培地（pH7.2）20mlが入
った150ml容三角フラスコに接種した。30℃で24時間、
振盪培養した後、同じ培地２が入ったジャーファーメ
ンター（株式会社いわしや生物科学製）に植菌し、30℃
で18時間、通気（２／分）攪拌（500r.p.m.）培養し
た。生産されたＮ−AHDHは、菌体に蓄積していた。
BP−2057）をＮ−アセチルグルコサミン0.5％、酵母エ
キス0.5％、ポリペプトン0.3％、リン酸一カリウム0.2
％、硫酸マグネシウム0.05％、塩化カルシウム0.01％、
硫酸第一鉄0.01％を含有した種培地（pH7.2）20mlが入
った150ml容三角フラスコに接種した。30℃で24時間、
振盪培養した後、同じ培地２が入ったジャーファーメ
ンター（株式会社いわしや生物科学製）に植菌し、30℃
で18時間、通気（２／分）攪拌（500r.p.m.）培養し
た。生産されたＮ−AHDHは、菌体に蓄積していた。
実施例２ 実施例１と同様にして得た0.96kgの生菌体に0.02Mトリ
ス−塩酸緩衝液（pH8.0）（以下、これを標準緩衝液と
呼ぶ）５を加え、更に0.5％トリトンＸ−100、EDTA10
mMになる様に各々加えた。低温室（５℃）内で一晩攪拌
を行ない、均一な懸濁液を得た。これをダイノミル（ス
イス、ウィーリー・Ａ・バッコーヘン社製）によって破
砕（3000r.p.m.）した。8000r.p.m.で20分間、遠心分離
することによって上澄液5.1を得た。
ス−塩酸緩衝液（pH8.0）（以下、これを標準緩衝液と
呼ぶ）５を加え、更に0.5％トリトンＸ−100、EDTA10
mMになる様に各々加えた。低温室（５℃）内で一晩攪拌
を行ない、均一な懸濁液を得た。これをダイノミル（ス
イス、ウィーリー・Ａ・バッコーヘン社製）によって破
砕（3000r.p.m.）した。8000r.p.m.で20分間、遠心分離
することによって上澄液5.1を得た。
これに湿潤状態のDEAE−セルロース3.5kgを投入し、pH
8.0に調整した後、30分間、攪拌を行ない、該酵素を吸
着させた。ブフナー漏斗に移して濾過した後、標準緩衝
液10で洗浄し、更に0.3Mの食塩を含有した標準緩衝液
７で洗浄して、この部位を集めた。これをホローファ
イバー限界濾過装置（旭化成工業株式会社 製）によっ
て、1.4まで濃縮した。112gの粉末硫安を加えて溶か
し、良く攪拌した。
8.0に調整した後、30分間、攪拌を行ない、該酵素を吸
着させた。ブフナー漏斗に移して濾過した後、標準緩衝
液10で洗浄し、更に0.3Mの食塩を含有した標準緩衝液
７で洗浄して、この部位を集めた。これをホローファ
イバー限界濾過装置（旭化成工業株式会社 製）によっ
て、1.4まで濃縮した。112gの粉末硫安を加えて溶か
し、良く攪拌した。
２時間放置した後、900r.p.m.で20分間、遠心分離して
上澄液1.4を得た。これに更に粉末硫安364gを加え、
良く溶かして一晩低温室に放置した。
上澄液1.4を得た。これに更に粉末硫安364gを加え、
良く溶かして一晩低温室に放置した。
生じた沈殿を12000r.p.m.で20分間、遠心分離して集
め、４％硫安を含有した標準緩衝液1.4に溶解した。
これを予め硫安６％を含有した標準緩衝液で平衡化した
フェニルセファロースCL−4B（スウェーデン、ファルマ
シア社 製）のカラム（直径9cm×高さ40cm）に通して
酵素を吸着させ、エチレングリコールの濃度勾配（０→
30％）と硫安の逆濃度勾配（４→０％）を合わせもった
標準緩衝液20で溶出した。
め、４％硫安を含有した標準緩衝液1.4に溶解した。
これを予め硫安６％を含有した標準緩衝液で平衡化した
フェニルセファロースCL−4B（スウェーデン、ファルマ
シア社 製）のカラム（直径9cm×高さ40cm）に通して
酵素を吸着させ、エチレングリコールの濃度勾配（０→
30％）と硫安の逆濃度勾配（４→０％）を合わせもった
標準緩衝液20で溶出した。
活性部位を集めて限外濾過装置で0.5まで濃縮し、更
に0.1M食塩を含有した標準緩衝液３を用いて、酵素液
の濾過透析を行なった。これを予め0.1M食塩含有した標
準緩衝液で平衡化したDEAE−セウァデックスＡ−50のカ
ラム（直径9cm×高さ30cm）に通して吸着させ、0.1Mか
ら0.3Mの食塩濃度勾配をもった標準緩衝液20で溶出し
た。
に0.1M食塩を含有した標準緩衝液３を用いて、酵素液
の濾過透析を行なった。これを予め0.1M食塩含有した標
準緩衝液で平衡化したDEAE−セウァデックスＡ−50のカ
ラム（直径9cm×高さ30cm）に通して吸着させ、0.1Mか
ら0.3Mの食塩濃度勾配をもった標準緩衝液20で溶出し
た。
活性部を限外濾過装置で50mlまで濃縮し、うち5mlをポ
リアクリルアミドディスク電気泳動法に基づいて、蛋白
質を分離回収する調整用電気泳動装置（株式会社 富士
理研 製）にかけた。
リアクリルアミドディスク電気泳動法に基づいて、蛋白
質を分離回収する調整用電気泳動装置（株式会社 富士
理研 製）にかけた。
この際に使用したポリアクリルアミドゲルは7.5％、電
流は10mA、回収用の緩衝液は0.012M トリス−0.1Mグリ
シン緩衝液（pH8.3）であった。
流は10mA、回収用の緩衝液は0.012M トリス−0.1Mグリ
シン緩衝液（pH8.3）であった。
分離回収した活性部を限界濾過装置で濃縮し、更にコロ
ジオンバック濃縮装置で1mlまで濃縮した。これを0.1M
食塩を含有したセファデックスＧ−200のカラム（直径
2.5cm×高さ95cm）を用いてゲル濾過を行なった。
ジオンバック濃縮装置で1mlまで濃縮した。これを0.1M
食塩を含有したセファデックスＧ−200のカラム（直径
2.5cm×高さ95cm）を用いてゲル濾過を行なった。
すべての粗酵素溶液を同様に処理して酵素を精製した。
得られた活性部を集めて濃縮し、精製酵素1980単位を得
た。これは第５図に示す通り、ディスク電気泳動によっ
て、殆ど単一バンドを示す酵素標品であった。
得られた活性部を集めて濃縮し、精製酵素1980単位を得
た。これは第５図に示す通り、ディスク電気泳動によっ
て、殆ど単一バンドを示す酵素標品であった。
実施例３ 溶液中のＮ−アセチルグルコサミンの濃度を下記試薬を
用いて下記方法により定量した。
用いて下記方法により定量した。
1.試薬 0.1Mリン酸カリウム緩衝液（pH7.4） 1.7ml NAD（60mM） 0.1ml Ｎ−AHDH（250単位／ml） 0.1ml 試料溶液 0.1ml 2.定量方法 各試料をそれぞれ所定量試験管にとり、37℃で10分間反
応させ340nmで吸光度を測定し、同様にして試料溶液の
かわりに水を同量加えて反応さえた場合の吸光度を差し
ひいて試料溶液の吸光度とした。別に既知濃度のＮ−ア
セチルグルコサミン溶液を同様にして得た検量線から、
試料中のＮ−アセチルグルコサミンの濃度を求めた。第
６図に検量線を示す。
応させ340nmで吸光度を測定し、同様にして試料溶液の
かわりに水を同量加えて反応さえた場合の吸光度を差し
ひいて試料溶液の吸光度とした。別に既知濃度のＮ−ア
セチルグルコサミン溶液を同様にして得た検量線から、
試料中のＮ−アセチルグルコサミンの濃度を求めた。第
６図に検量線を示す。
実施例４ 溶液中のＮ−アセチルガラクトサミンの濃度を下記試薬
を用いて下記方法により定量した。
を用いて下記方法により定量した。
1.試薬 0.1Mリン酸カリウム緩衝液（pH8.0）（0.3％トリトンＸ
−100含有） 115μｌ フェナジンメトサルフェート（1mg／ml） ５μｌ ニトロブル−テトラゾリウム（10mg／ml） ５μｌ NAD（60mM） 10μｌ Ｎ−AHDH（155単位／ml） 15μｌ 試料溶液 50μｌ 2.定量方法 上記試薬を各々所定量試験管にとり、37℃で15分間反応
させた。その後0.3規定塩酸2.0mlを添加して良く攪拌し
た。生成した色素を570nmで吸光度を測定した。試料溶
液のかわりに吸を同量添加して同様に反応処理したもの
の吸光度をブランクとして差しひき、試料の吸光度とし
た。別に既知濃度のＮ−アセチルガラクトサミン溶液を
同様にして得た検量線から試料溶液中のＮ−アセチルガ
ラクトサミンの濃度を求めた。
−100含有） 115μｌ フェナジンメトサルフェート（1mg／ml） ５μｌ ニトロブル−テトラゾリウム（10mg／ml） ５μｌ NAD（60mM） 10μｌ Ｎ−AHDH（155単位／ml） 15μｌ 試料溶液 50μｌ 2.定量方法 上記試薬を各々所定量試験管にとり、37℃で15分間反応
させた。その後0.3規定塩酸2.0mlを添加して良く攪拌し
た。生成した色素を570nmで吸光度を測定した。試料溶
液のかわりに吸を同量添加して同様に反応処理したもの
の吸光度をブランクとして差しひき、試料の吸光度とし
た。別に既知濃度のＮ−アセチルガラクトサミン溶液を
同様にして得た検量線から試料溶液中のＮ−アセチルガ
ラクトサミンの濃度を求めた。
実施例５ 牛腎臓から抽出したβ−Ｎ−アセチルグルコサミニダー
ゼの活性を下記試薬を用い、下記方法によって定量し
た。
ゼの活性を下記試薬を用い、下記方法によって定量し
た。
1.試薬 A.0.1Mクエン酸ソーダ緩衝液（pH4.4） 0.3ml N,N′−ジアセチルキトビオース（50mM） 0.1ml 試料溶液 0.1ml B.0.2Mグリシン−苛性ソーダ緩衝液（pH10.0） 1.3ml NAD（60mM） 0.1ml Ｎ−AHDH（250単位／ml） 0.1ml 2.定量方法 試薬Ａを各々所定量試験管にとり、37℃で15分間反応さ
せた。これに試薬Ｂを各々所定量混合したものを加え
て、再び37℃で10分間反応させた。これを340nmで吸光
度を測定し、試料溶液のかわりに水を同量用いて反応さ
せた場合の吸光度を差しひいて、試料の吸光度とした。
試料溶液中の酵素活性は次の式から算出した。
せた。これに試薬Ｂを各々所定量混合したものを加え
て、再び37℃で10分間反応させた。これを340nmで吸光
度を測定し、試料溶液のかわりに水を同量用いて反応さ
せた場合の吸光度を差しひいて、試料の吸光度とした。
試料溶液中の酵素活性は次の式から算出した。
第１図は本酵素の至適pHを示すグラフであり、第２図は
安定pHを示すグラフである。第３図は本酵素の作用適温
の範囲を示すグラフであり、第４図は本酵素の熱安定性
を示すグラフである。第５図は電気泳動によるバンドを
示す図である。第６図は実施例３における検量線であ
る。なお、第１図及び第２図における使用緩衝液はそれ
ぞれリン酸カリウム緩衝液（○−○）、トリス−塩酸緩
衝液（△−△）及びグリシン−苛性ソーダ緩衝液（●−
●）である。
安定pHを示すグラフである。第３図は本酵素の作用適温
の範囲を示すグラフであり、第４図は本酵素の熱安定性
を示すグラフである。第５図は電気泳動によるバンドを
示す図である。第６図は実施例３における検量線であ
る。なお、第１図及び第２図における使用緩衝液はそれ
ぞれリン酸カリウム緩衝液（○−○）、トリス−塩酸緩
衝液（△−△）及びグリシン−苛性ソーダ緩衝液（●−
●）である。
Claims (4)
- 【請求項１】下記（１）〜（４）の理化学的性質を有す
るＮ−アセチルヘキソサミンデヒドロゲナーゼ。 （１）作用及び基質特異性 Ｎ−アセチルグルコサミン又はＮ−アセチルガラクトサ
ミンから水素を奪って、Ｎ−アセチルグルコサミノラク
トン又はＮ−アセチルガラクトサミノラクトンにすると
共に、補酵素NADをNADHに還元する。 （２）至適pH:8.0〜10.5 （３）安定pH:8.0〜11.0 （４）分子量：約12〜13万 - 【請求項２】シュードモナス属に属し、Ｎ−アセチルヘ
キソサミンデヒドロゲナーゼ生産能を有する菌株を培地
に培養し、培養物よりＮ−アセチルヘキソサミンデヒド
ロゲナーゼを採取することを特徴とするＮ−アセチルヘ
キソサミンデヒドロゲナーゼの製造法。 - 【請求項３】Ｎ−アセチルグルコサミン又はＮ−アセチ
ルガラクトサミン含有試料にＮ−アセチルヘキソサミン
デヒドロゲナーゼを作用させ、生成するNADHを測定する
ことを特徴とするＮ−アセチルグルコサミン又はＮ−ア
セチルガラクトサミンの定量方法。 - 【請求項４】Ｎ−アセチルヘキソサミンデヒドロゲナー
ゼ、NAD、及び緩衝液を含む、Ｎ−アセチルグルコサミ
ン又はＮ−アセチルガラクトサミンの定量用キット。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63234746A JPH0667317B2 (ja) | 1988-09-21 | 1988-09-21 | Ｎ−アセチルヘキソサミンデヒドロゲナーゼ、その製造法及び該酵素を用いるｎ−アセチルグルコサミン又はｎ−アセチルガラクトサミンの定量法及びその定量用キット |
| US07/407,150 US5068190A (en) | 1988-09-21 | 1989-09-14 | N-acetylhexosamine-dehydrogenase, process for producing same, method for the quantitative analysis of N-acetylglucosamine or N-acetylgalactosamine using same and kit for use in the quantitative analysis |
| DE3931399A DE3931399A1 (de) | 1988-09-21 | 1989-09-20 | N-acetylhexosamin-dehydrogenase, verfahren zu deren herstellung, verfahren zur quantitativen analyse von n-acetylglucosamin oder n-acetylgalactosamin unter verwendung derselben, sowie kit fuer die quantitative analyse |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP63234746A JPH0667317B2 (ja) | 1988-09-21 | 1988-09-21 | Ｎ−アセチルヘキソサミンデヒドロゲナーゼ、その製造法及び該酵素を用いるｎ−アセチルグルコサミン又はｎ−アセチルガラクトサミンの定量法及びその定量用キット |
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Family
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