JPH0640821B2 - Ｎ―アセチルマンノサミン脱水素酵素 - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】 ＜産業上の利用分野＞ 本発明はＮ−アセチルマンノサミン（以下Ｎ−ＡＮとい
う）に作用してＮ−アセチルマンノサミノラクトンにす
ると共に、ＮＡＤをＮＡＤＨに還元する新規なＮ−アセ
チルマンノサミン脱水素酵素（以下Ｎ−ＡＭＤＨとい
う）に関する。

＜従来の技術＞ 最近、臨床検査の分野において血清中のシアル酸の測定
が行なわれており、急性及び慢性炎症、ショック、外
傷、心筋梗塞、糖尿病、肝疾病、各種癌等の病態を診断
するのに重要な役割を持っている。

このシアル酸を測定するにあたって大別して化学法と酵
素法がある。

化学法は特異性や操作性、更には危険薬品類の使用等、
望ましくない点が多いため徐々に精度の高い酵素法に移
って来ているのが実情である。

酵素法には現在大きく別けてＡ、Ｂ２つの方法が提案さ
れている。

シアル酸にノイラミン酸アルドラーゼを作用させ、Ｎ−
ＡＮとピルビン酸に分解する過程は同一であるが、Ａ法
はＮ−ＡＭをアシルグルコサミン−２−エピメラーゼと
Ｎ−アセチルヘキソサミンオキシダーゼで過酸化水素を
生成させて測定するものであり、Ｂ法はピルビン酸から
ピルビン酸オキシダーゼまたは乳酸脱水素酵素（ＬＤ
Ｈ）で、それぞれ過酸化水素を生成させ、またはＮＡＤ
Ｈを減少させて測定するものである。

＜発明が解決しようとする問題点＞ しかし、Ａ法はアシルグルコサミン−２−エピメラーゼ
が介在する分だけ系は複雑となり、Ｂ法は内因性のピル
ビン酸の影響を受けるという欠点がある。

本発明者等は操作が簡単でしかも精度の高いシアル酸の
測定法について検討したところ、土壌から分離したフラ
ボバクテリウム属に属する１細菌が、Ｎ−ＡＮに作用し
てＮ−アセチルマンノサミノラクトンにすると共に、Ｎ
ＡＤをＮＡＤＨに還元する新規な酵素を生産し、この酵
素がシアル酸の測定に有効に利用出来るということを見
出し本発明を完成した。

すなわち本発明はＮ−ＡＭに作用してＮ−アセチルマン
ノサミノラクトンにすると共に、ＮＡＤをＮＡＤＨに還
元する新規な酵素Ｎ−ＡＭＤＨである。

＜問題点を解決するための手段＞ 以下本発明を具体的に説明する。

本発明における新規酵素Ｎ−ＡＭＤＨの理化学的性質は
下記の通りである。

(1)作用及び基質特異性 次の反応式に示されるごとく、Ｎ−ＡＭとＮＡＤの共存
下でＮ−ＡＭをＮ−アセチルマンノサミノラクトンに酸
化すると共に、ＮＡＤをＮＡＤＨに還元する。

Ｎ−アセチルマンノサミノラクトンは水中では更に自動
的に加水分解されてＮ−アセチルマンノサミン酸にな
る。故に反応は事実上不可逆的である。他の中性糖やヘ
キソサミン、Ｎ−アセチルグルコサミン、Ｎ−アセチル
ガラクトサミンに対しては全く、もしくはほとんど作用
しない。またＮＡＤＰや２，６−ジクロロフェノールイ
ンドフェノール等を電子受容体として、ほとんど利用し
ない。

(2)至適ｐＨ及び安定ｐＨ範囲 トリス−塩酸緩衝液を用いた場合、至適ｐＨは8.0 〜9.
0 である。

またリン酸カリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝液及びグ
リシン−苛性ソーダ緩衝液を用いて酵素活性を測定した
結果は第１図に示すとおりである。

安定ｐＨ範囲は第２図に示すごとく8.5 〜9.5である。

使用緩衝液はリン酸カリウム緩衝液、トリス−塩酸緩衝
液、グリシン−苛性ソーダ緩衝液である。

(3)作用適温の範囲 第３図に示すごとく35〜50℃である。

(4)ｐＨ、温度等による失活の条件 第４図に示すごとく10分間の熱処理では45℃まで安定で
あり、それ以上の温度では急速に失活する。45℃、10分
間の熱処理ではｐＨ8.5〜9.5で安定であり、ｐＨ７以下
では特に不安定である。

(5)阻害剤の影響及び安定化 上表は各種金属イオン及び阻害剤を2 ｍＭの濃度で含有
する反応液中での酵素活性を測定したものである。活性
化及び安定化のために特別に寄与する物質は知られてい
ない。

(6)精製方法 本酵素の単離・精製は常法に従って行なうことができ、
例えばＤＥＡＥ−セルロースを用いたカラムクロマトグ
ラフィー、硫安沈殿、ＤＥＡＥ−セファデックスを用い
たカラムクロマトグラフィー、５′−ＡＭＰセファロー
スを用いたカラムクロマトグラフィー、セファデックス
によるゲル濾過等の精製手段を単独もしくは適宜組合わ
せて使用する。

(7)分子量 0.05 Ｍ トリス−塩酸緩衝液（0.1 Ｍ ＮａＣｌ含
有）を用いてセファデックスＧ−200 のカラムによるゲ
ル濾過法により測定した値は約11万〜12万である。

(8)ポリアクリルアミドゲル電気泳動 7.5 ％ポリアクリルアミドゲルを用いて常法によってア
クリルアミドディスク電気泳動を行なった結果、第５図
に示すごとく、ほぼ単一のバンドが認められた。4 ｍＡ
で１時間20分後の泳動距離は28mmである。

(9)等電点 アクリルアミドゲル焦点電気泳動により測定した値は4.
9 である。

(10)活性の測定法 0.05Ｍトリス−塩酸緩衝液（ｐＨ8.2）1.8mlに60ｍＭ
ＮＡＤ溶液0.1 mlを加える。37℃に10分間保った後、酵
素液10μを加え、0.3 ＭＮ−ＡＭ溶液0.1 mlを加えて
混合し、反応を始める。直ちに37℃に保った吸光度測定
用セル（1cm光路）に移し、340ｎｍの波長で１分ごとに
５分または必要であればそれ以上の時間にわたって吸光
度を測定する。１単位は１分間に１μモルのＮＡＤＨを
生成させる酵素量である。

以上のように本酵素はその作用及び基質特異性において
従来全く知られていない新規な酵素である。

次に本発明による新規な酵素Ｎ−ＡＭＤＨの製造法につ
いて説明する。

使用される微生物はフラボバクテリウム属に属し、Ｎ−
ＡＭＤＨ生産能を有する菌株であって、その具体例とし
てはフラボバクテリウムsp.No.141−８が挙げられ、該
菌の変種もしくは変異株も用いられる。フラボバクテリ
ウムsp.No.141−８は本発明者等が土壌中より分離した
菌株であり、その菌学的性質は下記の通りである。

(a) 形 態 顕微鏡的観察（30℃加糖ブイヨン培地、16時間培養） 細胞の大きさ：0.45〜0.5 × 0.5〜11ミクロンの桿菌 細胞の多形性：球状に近いものから比較的長い桿状の
ものまである。末端で相互につながった短い連鎖状態も
散見する。

運動性：認められない。

胞子の有無：形成せず。

グラム染色性：陰性 抗酸性：陰性 (b) 各培地における生育状態 肉汁寒天平板培養：30℃、２日間の培養で直径0.5 mm
の円形平滑で半透明なコロニーを作る。生育は比較的よ
くない。

加糖肉汁寒天平板培養：30℃、２日間で直径0.8 mmの
円形平滑で半透明なコロニー、５日間で2.0 〜2.5 mmの
乳白色の粘液状のコロニーを作る。色素の生成は認めら
れない。

加糖肉汁寒天斜面培地：30℃、２日間で乳濁した粘液
状になり、３日間での培養では下方に流下し底部にたま
る。

加糖肉汁液体培地：30℃、２日間の培養で少し生育す
る。

肉汁ゼラチン穿刺培養：30℃、３日間でわずかに生育
するが液化はしない。

リトマスミルク：変化なし、凝固もしない。

(c) 生理的性質 硝酸塩の還元：陽性 脱窒反応：陰性 ＭＲテスト：陰性。ただし好気的培養では陽性。

ＶＰテスト：陰性 インドールの生成：陰性 硫化水素の生成：陰性 デンプンの加水分解：陰性 クエン酸の利用：陰性 無機窒素源の利用：アンモニアは利用するが硝酸は利
用しない。

色素の生成：陰性 ウレアーゼ：陽性 オキシダーゼ：陽性 カタラーゼ：陽性 生育の範囲：15℃〜41℃（至適温度30℃）ｐＨ4.5 〜
8.5 （至適ｐＨ 6.5付近） 酸素に対する態度：好気性であるが嫌気的にもわずか
に生育する。

Ｏ−Ｆテスト：変化なし、又は極めて弱い発酵。

糖類から酸及びガスの生成：※は好気的培養による。

(d) その他の性質 ペニシリン耐性：100 単位／mlでも生育する。

食塩耐性：２％以上で生育しない。

コロニー辺縁部の運動性：流動性は見られない。

Tween 80分解：陰性 エクスリンの分解：陰性 以上の新規なＮ−ＡＭＤＨ生産能を有する本菌の分類学
的諸性質を「バージェイズ・マニュアル・オブ・システ
マチック・バクテリオロジー」（1984 年）第１巻の分
類と対比すると、本菌はグラム染色性が陰性、好気性の
無胞子桿菌で運動性を持たず、カタラーゼ陽性、オキシ
ダーゼ陽性で多くの糖から好気的条件で酸を生成する、
ペニシリン耐性であるなどの性質からフラボバクテリウ
ム属に属すると思われる。

好気的条件での糖から酸を生成する性質から、フラボバ
クテリウム・スピリッチボラン（Flavobacterium spir
itivorum）に近縁と思われるが、エスクリンの分解、硝
酸塩の還元、Tween 80の分解などの点で異なっており、
従来知られていない新規な菌株と思われる。

以上の理由により本菌をフラボバクテリウムsp.No.141
−8 命名した。なお、フラボバクテリウムsp.No.141−8
は通商産業省工業技術院微生物工業技術研究所に微工
研条寄第1222 号（ＦＥＲＭ ＢＰ−1222）として寄託
されている。

次に本発明で使用する培地としては、炭素源、窒素源、
無機物、その他の栄養素を適宜含有する培地ならば合成
培地または天然培地のいずれでも使用可能である。炭素
源としてはグルコース、ガラクトース、フラクトース、
キシロース、グリセリン等を用いることができる。窒素
源としてはアンモニウム塩の他にペプトン、カゼイン消
化物、グルタミン酸ソーダ、酵母エキス等の窒素性有機
物が好適に使用できる。無機物としては、ナトリウム、
カリウム、マグネシウム、マンガン、カルシウム、鉄等
の塩類が使用できる。

本発明においては、Ｎ−ＡＭＤＨ生産能を有する菌株を
Ｎ−ＡＭまたはＮ−アセチルグルコサミンを含有する培
地で培養または浸漬したときにＮ−ＡＭＤＨが収量よく
得られる。該培養培地の好適な例としては、Ｎ−ＡＭ0.
5 ％、肉エキス0.1％、ポリペプトン0.5 ％、酵母エキ
ス0.2％、食塩0.14 ％、燐酸水素−カリウム0.1 ％、ｐ
Ｈ 6.8の培地例が挙げられる。そして該培地で30℃、36
時間通気攪拌培養した場合は、Ｎ−ＡＭを他の炭素源に
おきかえた場合の10〜100 培の生産力価を得ることがで
きる。

培養温度は通常20〜40℃の範囲で好適には30〜33℃の範
囲で行なわれる。培養開始のｐＨは通常6 〜8 の範囲で
好適には7 付近である。この様な条件下で20〜40時間振
盪又は深部攪拌培養を行なうか、またはＮ−ＡＭまたは
Ｎ−アセチルグルコサミンを含有しないが、生育に好適
な他の培地に生育した菌株を高濃度に分散させ1 〜10時
間好気的にそれらと共に浸漬すれば、該培養物または菌
体懸濁液中にＮ−ＡＭＤＨが生成蓄積する。

Ｎ−ＡＭＤＨは通常は菌株中に存在するので培養物を遠
心分離、あるいは濾過によって菌株だけを分離するのが
好ましい。これを適量の緩衝液中で破壊して酵素を可溶
化することによって溶液中に放出させる。

菌株の破壊方法はダイノミル、フレンチプレス、超音波
等の物理的なものや、トリトンＸ−100 、ラウリル硫酸
ソーダ、ＥＤＴＡ等の化学的方法、リゾチーム等の酵素
的な方法を単独または併用して用いることができる。こ
の様にして得られた菌株破壊液から核酸を常法によって
除去し、濾過または遠心分離によって不溶物を除きＮ−
ＡＭＤＨを得る。

更にＮ−ＡＭＤＨは必要により酵素の単離精製の常法に
従って、例えば(1)ＤＥＡＥ−セルロース塔によるカラ
ムクロマトグラフィー、(2)硫安による分画沈殿、(3)Ｄ
ＥＡＥ−セファデックス塔によるカラムクロマトグラフ
ィー、(4)５′−ＡＭＰセファロース塔によるカラムク
ロマトグラフィー、(5)セファデックスによるゲル濾過
等の方法、またはその他の方法を必要に応じ組合わせて
用いることにより、精製されたＮ−ＡＭＤＨを得ること
ができる。

＜発明の効果＞ 本発明の新規なＮ−ＡＭＤＨを用いるとＮ−ＡＭの定量
を精度よく行なうことができ、これに基づいてシアル酸
の量を知ることができる。その結果、種々の病態診断を
効率よく行なうことができる。

＜実施例＞ 実施例１ フラボバクテリウムsp.No.141−8 （微工研条寄第1222
号、ＦＥＲＭ ＢＰ−1222）をグルコース0.75％、酵母
エキス0.2 ％、ポリペプトン0.5 ％、肉エキス0.1 ％、
食塩0.14％、燐酸水素−カリウム0.1 ％を含有した種培
地（ｐＨ 8.0）50mlが入った300 ml容三角フラスコに接
種した。

30℃で24時間振盪培養した後、同じ培地2 が入ったジ
ャーファーメンター（株式会社 いわしや生物科学
製）に植菌し、30℃、36時間通気（2 ／min ）攪拌
（400 rpm）培養した。この培養液を8000 rpm で20分間
遠心分離して菌体を集めた。

これをＮ−ＡＭ0.2 ％、肉エキス0.1 ％、ポリペプトン
0.5 、酵母エキス0.2％、食塩0.14％、燐酸水素一カリ
ウム0.1 ％、ｐＨ6.8 を含有した培地2 の入った同じ
ジャーファーメンターに移し、同じ培養条件で培養を続
けた。６時間後にＮ−ＡＭＤＨの活性は最高に達した。

実施例２ フラボバクテリウムsp.No.141−8 をＮ−ＡＭ 0.5％、
ポリペプトン0.8 ％、肉エキス0.1 ％、酵母エキス0.2
％、燐酸水素一カリウム0.1 ％を含有した種培地（ｐＨ
6.8）50mlに実施例１と同様に植菌し30℃で24時間振盪
した。

これを同じ培地2 が入ったミニジャーファーメンター
に植え、30℃、40時間通気（２／min ）攪拌（400 rp
m ）に培養した。Ｎ−ＡＭＤＨは菌株に蓄積されてい
た。

実施例３ 実施例１と同様にして得た1.7 kgの生菌体に0.02 Ｍト
リス−塩酸緩衝液ｐＨ8.0 （以下これを標準緩衝液と呼
ぶ）10を加え、更に0.5 ％トリトンＸ−100 、ＥＤＴ
Ａ2 ｍＭになる様に各々加えた。低温室で１晩攪拌を行
ない均一な懸濁液を得た。これをダイノミル（スウェー
デン、シンマルエンタープライズ社 製）によって破砕
（3000 rpm）した。8000 rpmで20分間遠心分離すること
によって上澄7.3 を得た。

これに湿潤状態のＤＥＡＥ−セルロース1.4 kgを投入
し、ｐＨ8.0 に調整した後30分間攪拌を行ない該酵素を
吸着させた。ブフナー漏斗に移して濾過した後、標準緩
衝液4 で洗浄し、更に0.3Ｍの食塩を含有した標準緩
衝液5 で洗浄してこの部分を集め、これをホローファ
イバー限外濾過装置（旭化成工業株式会社 製）によっ
て1 まで濃縮した。

これに125 ｇの硫安を加え、溶かしてよく攪拌し、２時
間放置した後9000 rpmで20分間遠心分離して上澄850 ml
を得た。更に硫安166 ｇを加えよく溶かして１晩低温室
に放置した。

生じた沈殿を12000 rpmで20分間遠心分離して集め、標
準緩衝液850 mlに溶かした。これに硫安35ｇを加えて溶
かし、あらかじめ硫安4 ％を含有した標準緩衝液に平衡
化したフェニルセファロースＣＬ−４Ｂ（スウェーデ
ン、ファルマシア社製）のカラム（直径5 cm×高さ34c
m）に通して酵素を吸着させた。これをエチレングリコ
ールの濃度勾配（０→30％）と硫安の逆濃度勾配（4 →
０％）をもった標準緩衝液10で溶出した。

これを限外濾過装置で濃縮し、0.1 Ｍ食塩を含有した標
準緩衝液に対して透析した。これをあらかじめ0.1 Ｍ食
塩含有標準緩衝液で平衡化したＤＥＡＥ−セファデック
スＡ−50のカラム（直径5 cm×高さ52cm）に通して吸着
させ、0.1 Ｍから0.28 Ｍの食塩濃度勾配をもった標準
緩衝液10で溶出した。

活性部を限外濾過装置で濃縮した後、0.01 Ｍリン酸カ
リウム緩衝液ｐＨ 6.5に対して透析した。これをあらか
じめ0.01 Ｍリン酸カリウム緩衝液ｐＨ6.0 に平衡化し
た５′−ＡＭＰ−セファロースＣＬ−４Ｂ（スウェーデ
ン、ファルマシア社製）のカラム（直径4 cm×高さ16c
m）に通して吸着させ、0.01 Ｍリン酸緩衝液ｐＨ 6.0、
4 と0.5 Ｍ食塩を含有した0.01 Ｍリン酸緩衝液ｐＨ
8.0 、4 を用いた食塩濃度勾配とｐＨ勾配をもった緩
衝液で溶出した。

活性部をｐＨ8.0 に調整した後、限外濾過装置、更にコ
ロジオンバック濃縮装置で1 mlまで濃縮し、0.1 Ｍ食塩
を含有した標準緩衝液に対して透析した。これを0.1 Ｍ
食塩を含有した標準緩衝液で平衡化したセファデックス
Ｇ−200 のカラム（直径2.5 cm×高さ95cm）によってゲ
ル濾過を行なった。

活性部を集め濃縮して精製Ｎ−ＡＭＤＨ220 単位を得
た。これは第５図に示す通りディスク電気泳動によっ
て、ほとんど単一バンドを示す酵素標品であった。

【図面の簡単な説明】

第１図は本酵素の至適ｐＨを示すグラフであり、第２図
は安定ｐＨを示すグラフである。第３図は本酵素の作用
適温の範囲を示すグラフであり、第４図は本酵素の熱安
定性を示すグラフである。第５図は電気泳動によるバン
ドを示す図である。なお、第１図及び第２図における使
用緩衝液はそれぞれリン酸カリウム緩衝液（○−○）、
トリス−塩酸緩衝液（△−△）及びグリシン−カセイソ
ーダ緩衝液（●−●）である。

Claims (1)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】下記(1)〜(3)の理化学的性質を有するＮ−
   アセチルマンノサミン脱水素酵素 (1)作用及び基質特異性 Ｎ−アセチルマンノサミンから水素を奪ってＮ−アセチ
   ルマンノサミノラクトンにすると共に、補酵素 NAD を
   NADH に還元する。 他のヘキソースまたはＮ−アセチルヘキソサミンに対し
   ては、ほとんどもしくは全く作用しない。 (2)至適 pH 及び安定 pH 範囲 トリス−塩酸緩衝液をもちいた場合、至適 pH は8.0〜
   9.0であり、安定 pH 範囲は8.5〜9.5である。 (3)分子量 0.05Ｍトリスー塩酸緩衝液（0.1 Ｍ NaCl 含有）を用い
   てセファデックスＧ−200によるゲル濾過法により測定
   した値は約11万〜12万である。