JPH06169764A - ソルビトールオキシダーゼ、その製法及びその用途 - Google Patents
ソルビトールオキシダーゼ、その製法及びその用途Info
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- JPH06169764A JPH06169764A JP4326871A JP32687192A JPH06169764A JP H06169764 A JPH06169764 A JP H06169764A JP 4326871 A JP4326871 A JP 4326871A JP 32687192 A JP32687192 A JP 32687192A JP H06169764 A JPH06169764 A JP H06169764A
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- C12N9/0006—Oxidoreductases (1.) acting on CH-OH groups as donors (1.1)
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/26—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving oxidoreductase
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- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
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- G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
- G01N2333/902—Oxidoreductases (1.)
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 ソルビトールに作用して酸素を消費し過酸化
水素を生成する新規なソルビトールオキシダーゼを提供
する。 【要約】 下記理化学的性質を有するソルビトールオキシダーゼ。 （１）次の反応を触媒する。 Ｄ−ソルビトール ＋ Ｏ2 → Ｄ−グルコース ＋
Ｈ2 Ｏ2 （２）基質特異性：Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトー
ル、Ｄ−キシリトールおよびＤ−アラビトールに作用す
る。
水素を生成する新規なソルビトールオキシダーゼを提供
する。 【要約】 下記理化学的性質を有するソルビトールオキシダーゼ。 （１）次の反応を触媒する。 Ｄ−ソルビトール ＋ Ｏ2 → Ｄ−グルコース ＋
Ｈ2 Ｏ2 （２）基質特異性：Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトー
ル、Ｄ−キシリトールおよびＤ−アラビトールに作用す
る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は新規なソルビトールオキ
シダーゼ、その製法及びその用途に関するものである。
シダーゼ、その製法及びその用途に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】ソルビトールは生体内でグルコースより
アルドースリダクターゼにより生成する。ソルビトール
は細胞膜透過性が悪く、例えば赤血球等の細胞内に蓄積
しやすい性質を持つ。その結果、浸透圧の上昇、細胞の
膨化等の機能障害が生じる。これは糖尿病における合併
症の要因の一つとされており、また逆に赤血球中のソル
ビトール含量を測定することは糖尿病合併症の指標とな
っている。また近年、多数のアルドースレダクターゼ阻
害剤が糖尿病合併症の治療薬として開発されており、こ
の治癒効果確認のためにも赤血球中のソルビトール含量
測定は注目を集めている。
アルドースリダクターゼにより生成する。ソルビトール
は細胞膜透過性が悪く、例えば赤血球等の細胞内に蓄積
しやすい性質を持つ。その結果、浸透圧の上昇、細胞の
膨化等の機能障害が生じる。これは糖尿病における合併
症の要因の一つとされており、また逆に赤血球中のソル
ビトール含量を測定することは糖尿病合併症の指標とな
っている。また近年、多数のアルドースレダクターゼ阻
害剤が糖尿病合併症の治療薬として開発されており、こ
の治癒効果確認のためにも赤血球中のソルビトール含量
測定は注目を集めている。
【０００３】従来、ソルビトールの酵素的測定法として
下記反応を触媒するソルビトールデヒドロゲナーゼ（L-
Iditol:NAD+ 2-oxidoreductase(EC.1.1.1.14) ）を使用
することが知られていた。
下記反応を触媒するソルビトールデヒドロゲナーゼ（L-
Iditol:NAD+ 2-oxidoreductase(EC.1.1.1.14) ）を使用
することが知られていた。
【０００４】
【化１】
【０００５】該酵素はＮＡＤＨの分子吸光係数が小さい
ため、感度的に問題があった。またＮＡＤＨは蛍光光度
計でも測定できるが、特別な測定装置が必要であり、ま
たこれらの補酵素は試料中のＮＡＤＨ、ＮＡＤ+ 等に測
定が妨害される等の問題点があった。また人工電子受容
体を利用するソルビトールデヒドロゲナーゼによりソル
ビトールを測定する報告もあるが、感度は前者より優る
もののまだ感度不足していた。さらに該酵素は膜酵素で
あるため不安定であり、失活しやすいという欠点があっ
た。
ため、感度的に問題があった。またＮＡＤＨは蛍光光度
計でも測定できるが、特別な測定装置が必要であり、ま
たこれらの補酵素は試料中のＮＡＤＨ、ＮＡＤ+ 等に測
定が妨害される等の問題点があった。また人工電子受容
体を利用するソルビトールデヒドロゲナーゼによりソル
ビトールを測定する報告もあるが、感度は前者より優る
もののまだ感度不足していた。さらに該酵素は膜酵素で
あるため不安定であり、失活しやすいという欠点があっ
た。
【０００６】
【発明の解決しようとする課題】ソルビトール測定にお
ける上述の問題点を克服するためにソルビトールオキシ
ダーゼの開発が求められていたが、いまだ見つけられて
いなかった。
ける上述の問題点を克服するためにソルビトールオキシ
ダーゼの開発が求められていたが、いまだ見つけられて
いなかった。
【０００７】
【発明を解決するための手段】本発明者らは上記従来の
ソルビトールデヒドロゲナーゼ系における問題点を解決
するため鋭意研究を重ねた結果、天然の土壌（岐阜県不
破郡関ヶ原町）よりソルビトールオキシダーゼを産生す
る微生物を見いだし、本発明を完成するに至った。
ソルビトールデヒドロゲナーゼ系における問題点を解決
するため鋭意研究を重ねた結果、天然の土壌（岐阜県不
破郡関ヶ原町）よりソルビトールオキシダーゼを産生す
る微生物を見いだし、本発明を完成するに至った。
【０００８】すなわち本発明はＤ−ソルビトールに作用
して酸素を消費し過酸化水素を生成するソルビトールオ
キダーゼである。
して酸素を消費し過酸化水素を生成するソルビトールオ
キダーゼである。
【０００９】また本発明はソルビトールオキシダーゼ生
産能を有するキサントモナス(Xanthomonas) に属する微
生物を培養し、ソルビトールオキシダーゼを生成せし
め、これを採取することを特徴とするソルビトールオキ
シダーゼの製造法である。
産能を有するキサントモナス(Xanthomonas) に属する微
生物を培養し、ソルビトールオキシダーゼを生成せし
め、これを採取することを特徴とするソルビトールオキ
シダーゼの製造法である。
【００１０】さらに本発明はソルビトール、マンニトー
ル、キシリトールおよびアラビトールからなる群から選
ばれた少なくとも１種のポリオールを含有する試料に上
記ソルビトールオキシダーゼを作用させ、生成する過酸
化水素またはＤ−グルコース、マンノース、キシロース
またはアラビノースまたは消費する酸素量を測定して、
上記ポリオールを測定することを特徴とする試料中のポ
リオールの測定法である。
ル、キシリトールおよびアラビトールからなる群から選
ばれた少なくとも１種のポリオールを含有する試料に上
記ソルビトールオキシダーゼを作用させ、生成する過酸
化水素またはＤ−グルコース、マンノース、キシロース
またはアラビノースまたは消費する酸素量を測定して、
上記ポリオールを測定することを特徴とする試料中のポ
リオールの測定法である。
【００１１】本発明の酵素はＤ−ソルビトールに作用し
て過酸化水素を生成する新規な酵素である。本発明酵素
の一例の性質は以下の通りである。 （１）次の反応を触媒する。 Ｄ−ソルビトール ＋ Ｏ2 → Ｄ−グルコース ＋
Ｈ2 Ｏ2 （２）基質特異性：Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトー
ル、Ｄ−キシリトールおよびＤ−アラビトールに作用す
る。 （３）至適ｐＨ：ｐＨ６．５〜７．５ （４）分子量：５４，０００（ゲル濾過法） ４３，０００８ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
て過酸化水素を生成する新規な酵素である。本発明酵素
の一例の性質は以下の通りである。 （１）次の反応を触媒する。 Ｄ−ソルビトール ＋ Ｏ2 → Ｄ−グルコース ＋
Ｈ2 Ｏ2 （２）基質特異性：Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトー
ル、Ｄ−キシリトールおよびＤ−アラビトールに作用す
る。 （３）至適ｐＨ：ｐＨ６．５〜７．５ （４）分子量：５４，０００（ゲル濾過法） ４３，０００８ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）
【００１２】本発明の酵素の起源は上記性質を有するソ
ルビトールオキシダーゼを産生しうるものであれば、動
物、植物、微生物など如何なる起源のものを用いても良
い。好ましくは、上記性質を有するソルビトールオキシ
ダーゼを産生しうるキサントモナス（Xanthomonas)属細
菌であって、好適な例としてはキサントモナス・マルト
フィリア（Xanthomonas maltophilia ）ＴＥ３５３９が
挙げられる。キサントモナス・マルトフィリアＴＥ３５
３９は土壌より分離した菌株であり、その菌学的性質は
以下の通りである。 （ａ）形態 （１）菌形：短 菌 （２）細胞の大きさ：１．２ × ０．３ μｍ （３）細胞の多形性：無し （４）運動性：有り、極鞭毛を有する。 （５）胞子の有無：無し （ｂ）各培地における生育状態 （１）肉汁寒天平板培地：３０℃、４８時間培養で黄色
からクリーム色のコロニーを形成する。コロニーの周縁
は全縁（Entire）であり、凸状（Convex）である。表面
は円滑（smooth）で光沢を有し、不透明である。 （２）肉汁液体培養：生育は良好で一様に混濁する。 （３）肉汁ゼラチン穿刺培養：生育は良好で上部のみ糸
状（Filiform）に生育する。ゼラチンは液化する。 （４）リトマスミルク：色に変化はない。ミルクは固化
する。
ルビトールオキシダーゼを産生しうるものであれば、動
物、植物、微生物など如何なる起源のものを用いても良
い。好ましくは、上記性質を有するソルビトールオキシ
ダーゼを産生しうるキサントモナス（Xanthomonas)属細
菌であって、好適な例としてはキサントモナス・マルト
フィリア（Xanthomonas maltophilia ）ＴＥ３５３９が
挙げられる。キサントモナス・マルトフィリアＴＥ３５
３９は土壌より分離した菌株であり、その菌学的性質は
以下の通りである。 （ａ）形態 （１）菌形：短 菌 （２）細胞の大きさ：１．２ × ０．３ μｍ （３）細胞の多形性：無し （４）運動性：有り、極鞭毛を有する。 （５）胞子の有無：無し （ｂ）各培地における生育状態 （１）肉汁寒天平板培地：３０℃、４８時間培養で黄色
からクリーム色のコロニーを形成する。コロニーの周縁
は全縁（Entire）であり、凸状（Convex）である。表面
は円滑（smooth）で光沢を有し、不透明である。 （２）肉汁液体培養：生育は良好で一様に混濁する。 （３）肉汁ゼラチン穿刺培養：生育は良好で上部のみ糸
状（Filiform）に生育する。ゼラチンは液化する。 （４）リトマスミルク：色に変化はない。ミルクは固化
する。
【００１３】 （ｃ）生理学的性質 （１）グラム染色性： −（陰性） （２）硝酸塩の還元： − （３）脱窒反応： − （４）ＭＲテスト： − （５）ＶＰテスト： − （６）インドールの生成： − （７）硫化水素の生成： − （８）デンプンの加水分解： − （９）クエン酸の利用：Koser の培地 −、Christensen の培地 ＋ （１０）色素の生成：細胞内に水溶性黄色色素生成。 （１１）ウレアーゼ： − （１２）オキシダーゼ： − （１３）カタラーゼ： ＋ （１４）β−ガラクトシダーゼ： ＋ （１５）アルギニンジヒドラーゼ： − （１６）リジンカルボキシラーゼ： − （１７）オルニチンカルボキシラーゼ： − （１８）トリプトファンデアミナーゼ： − （１９）β−グルコシダーゼ： − （２０）プロテアーゼ： ＋ （２１）生育の範囲： 生育温度 ２０℃ ＋ ３０℃ ＋ ３７℃ − ４０℃ − 生育ｐＨ ｐＨ４ − ｐＨ７ ＋ ｐＨ９ ＋ （２２）酸素に対する態度：好気性 （２３）Ｏ−Ｆテスト（Hugh Leifson法）：−（糖を分解せず） （２４）糖から酸およびガスの生成 酸 ガス Ｌ−アラビノース − − Ｄ−キシロース − − Ｄ−グルコース − − Ｄ−マンノース ＋ − Ｄ−フラクトース ＋ − Ｄ−ガラクトース − − マルトース ＋ − シュークロース − − ラクトース − − トレハロース − − Ｄ−ソルビトール − − Ｄ−マンニトール − − イノシトール − − グリセリン ＋ − デンプン − − ラムノース − − Ｄ−メリビオース − − Ｄ−アミダクリン − − （２５）有機化合物の利用 Ｄ−グルコース ＋ Ｌ−アラビノース ＋ Ｄ−マンノース ＋ Ｄ−マンニトール ＋ Ｄ−ソルビトール ＋ Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミン− マルトース ＋ グルコン酸カリウム ＋ ｎ−カプリン酸塩 − アジピン酸 − ｄｌ−リンゴ酸 ＋ クエン酸ナトリウム ＋ 酢酸フェニル −
【００１４】上記菌学的性質同定のための実験法は主と
して長谷川武治編著、改訂版「微生物の分類と同定」学
会出版センター（１９８５年）によって行った。また分
類同定の基準として「バージッス・マニュアル・オブ・
システマチック・バクテリオロジー」（１９８４）を参
考にした。以上の文献および菌学的性質から本菌はキサ
ントモナス属に属するとみなされる。更にキサントモナ
ス属中ではXanthomonas campestrisおよびXanthomonas
maltophilia と一致した点が多かった。本菌株は植物病
原性は認められず、またペアの菌となって存在すること
も認められた。さらにグルコースより酸を生成せず、マ
ルトースより酸を生成したためキサントモナス・マルト
フィリア（Xantomonas maltophilia）ＴＥ３５３９と命
名した。なお本菌は工業技術院微生物工業技術研究所に
微工研菌第１３２９６号として寄託されている。
して長谷川武治編著、改訂版「微生物の分類と同定」学
会出版センター（１９８５年）によって行った。また分
類同定の基準として「バージッス・マニュアル・オブ・
システマチック・バクテリオロジー」（１９８４）を参
考にした。以上の文献および菌学的性質から本菌はキサ
ントモナス属に属するとみなされる。更にキサントモナ
ス属中ではXanthomonas campestrisおよびXanthomonas
maltophilia と一致した点が多かった。本菌株は植物病
原性は認められず、またペアの菌となって存在すること
も認められた。さらにグルコースより酸を生成せず、マ
ルトースより酸を生成したためキサントモナス・マルト
フィリア（Xantomonas maltophilia）ＴＥ３５３９と命
名した。なお本菌は工業技術院微生物工業技術研究所に
微工研菌第１３２９６号として寄託されている。
【００１５】本発明の酵素を製造するにあたっては、上
記ソルビトールオキシダーゼ生産菌を栄養培地に培養
し、該培養物からソルビトールオキシダーゼを採取する
ことにより製造できる。ソルビトールオキシダーゼ生産
菌の培養にあたって使用する培地としては、使用菌株が
資化しうる炭素源、窒素源、無機物、その他必要な栄養
素を適量含有するものであれば、合成培地、天然培地い
ずれも使用できる。炭素源としては、例えばグルコー
ス、グリセロール等が使用される。窒素源としては、例
えばペプトン類、肉エキス、酵母エキス等の窒素含有天
然物や、塩化アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の
無機窒素含有化合物が使用される。無機物としては、リ
ン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム等
が使用される。またソルビトールオキシダーゼの生産誘
導物質として、ソルビトールを培地に添加しておくこと
が望ましい。
記ソルビトールオキシダーゼ生産菌を栄養培地に培養
し、該培養物からソルビトールオキシダーゼを採取する
ことにより製造できる。ソルビトールオキシダーゼ生産
菌の培養にあたって使用する培地としては、使用菌株が
資化しうる炭素源、窒素源、無機物、その他必要な栄養
素を適量含有するものであれば、合成培地、天然培地い
ずれも使用できる。炭素源としては、例えばグルコー
ス、グリセロール等が使用される。窒素源としては、例
えばペプトン類、肉エキス、酵母エキス等の窒素含有天
然物や、塩化アンモニウム、クエン酸アンモニウム等の
無機窒素含有化合物が使用される。無機物としては、リ
ン酸カリウム、リン酸ナトリウム、硫酸マグネシウム等
が使用される。またソルビトールオキシダーゼの生産誘
導物質として、ソルビトールを培地に添加しておくこと
が望ましい。
【００１６】培地は通常振盪培養、あるいは通気撹拌培
養で行う。培養温度は２０〜３５℃、好ましくは２５〜
３０℃、培養ｐＨは５〜９の範囲で、好ましくは６〜８
に制御するのが良い。これら以外の条件下でも使用する
菌株が生育すれば実施できる。培養期間は通常１〜７日
で生育し、菌体内にソルビトールオキシダーゼが生産蓄
積される。
養で行う。培養温度は２０〜３５℃、好ましくは２５〜
３０℃、培養ｐＨは５〜９の範囲で、好ましくは６〜８
に制御するのが良い。これら以外の条件下でも使用する
菌株が生育すれば実施できる。培養期間は通常１〜７日
で生育し、菌体内にソルビトールオキシダーゼが生産蓄
積される。
【００１７】本発明の酵素の精製法は一般に使用される
精製法を用いれば良い。例えば、抽出法には超音波破
砕、ガラスビーズを用いる機械的な破砕、フレンチプレ
ス、界面活性化剤などいづれを用いても良い。さらに抽
出液については、硫安やぼう硝などの塩析法、塩化マグ
ネシウムや塩化カルシウムなどの金属凝集法、プロタミ
ンやポリエチレンイミンなどの凝集法、さらにはＤＥＡ
Ｅ（ジエチルアミノエチル）−セファロース、ＣＭ（カ
ルボキシメチル）−セファロースなどのイオン交換クロ
マト法などにより精製することができる。またこれらの
方法で得られた粗酵素液や精製酵素液は、例えば、スプ
レードライや凍結乾燥により粉末化できる。さらには適
当な担体に固定化して固定化酵素として使用できる。
精製法を用いれば良い。例えば、抽出法には超音波破
砕、ガラスビーズを用いる機械的な破砕、フレンチプレ
ス、界面活性化剤などいづれを用いても良い。さらに抽
出液については、硫安やぼう硝などの塩析法、塩化マグ
ネシウムや塩化カルシウムなどの金属凝集法、プロタミ
ンやポリエチレンイミンなどの凝集法、さらにはＤＥＡ
Ｅ（ジエチルアミノエチル）−セファロース、ＣＭ（カ
ルボキシメチル）−セファロースなどのイオン交換クロ
マト法などにより精製することができる。またこれらの
方法で得られた粗酵素液や精製酵素液は、例えば、スプ
レードライや凍結乾燥により粉末化できる。さらには適
当な担体に固定化して固定化酵素として使用できる。
【００１８】次に本発明のソルビトールオキシダーゼの
活性測定法を示す。下記の反応混液を調製する。 基質溶液（ソルビトールを０．２Ｍとなるよう０．１Ｍ Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解） ５０ ｍｌ ０．１％ ４−アミノアンチピリン水溶液 １０ ｍｌ ０．１％ フェノール水溶液 ２０ ｍｌ ０．０２５％ ペルオキシダーゼ（東洋紡製）水溶液 ２０ ｍｌ 反応混液３．０ｍｌをキュベットにとり、３７℃で約５
分間予備加温する。酵素溶液０．０５ｍｌを加え反応を
開始し、３７℃に制御された分光光度計で５００ｎｍの
吸光度変化を３〜４分間記録し、その初期直線部分から
１分間当りの吸光度変化を求める。盲検は酵素液の代わ
りに、０．１Ｍ Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０を加
え、上記同様に操作を行う。ソルビトールオキシダーゼ
の活性の表示は、上記条件下で１分間に１マイクロモル
のソルビトールを酸化する酵素量を１単位（Ｕ）とす
る。
活性測定法を示す。下記の反応混液を調製する。 基質溶液（ソルビトールを０．２Ｍとなるよう０．１Ｍ Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に溶解） ５０ ｍｌ ０．１％ ４−アミノアンチピリン水溶液 １０ ｍｌ ０．１％ フェノール水溶液 ２０ ｍｌ ０．０２５％ ペルオキシダーゼ（東洋紡製）水溶液 ２０ ｍｌ 反応混液３．０ｍｌをキュベットにとり、３７℃で約５
分間予備加温する。酵素溶液０．０５ｍｌを加え反応を
開始し、３７℃に制御された分光光度計で５００ｎｍの
吸光度変化を３〜４分間記録し、その初期直線部分から
１分間当りの吸光度変化を求める。盲検は酵素液の代わ
りに、０．１Ｍ Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ７．０を加
え、上記同様に操作を行う。ソルビトールオキシダーゼ
の活性の表示は、上記条件下で１分間に１マイクロモル
のソルビトールを酸化する酵素量を１単位（Ｕ）とす
る。
【００１９】また本発明はソルビトール、マンニトー
ル、キシリトールまたはアラビトールからなる群から選
ばれた少なくとも１種のポリオールを含有する試料に、
上記性質を有するソルビトールオキシダーゼを作用さ
せ、生成する過酸化水素またはＤ−グルコース、マンノ
ース、キシロースまたはアラビノースまたは消費する酸
素量を測定して、上記ポリオールを測定する。
ル、キシリトールまたはアラビトールからなる群から選
ばれた少なくとも１種のポリオールを含有する試料に、
上記性質を有するソルビトールオキシダーゼを作用さ
せ、生成する過酸化水素またはＤ−グルコース、マンノ
ース、キシロースまたはアラビノースまたは消費する酸
素量を測定して、上記ポリオールを測定する。
【００２０】ソルビトール、マンニトール、キシリトー
ル、アラビトール等のポリオールを含む試料としては赤
血球等の生体試料や食品などを挙げることができる。過
酸化水素の測定法としては過酸化水素電極を用いる方
法、通常の発色法および蛍光法を使用して行うことがで
きる。発色法としては、４−アミノアンチピリン、フェ
ノール誘導体またはアニリン誘導体を使用するペルオキ
ダーゼによる発色系、ベンゾチアゾリノンを使用するペ
ルオキシダーゼによる発色系などが挙げられる。蛍光法
としてはアクリジニウムエステル、ルミジェニンまたは
その誘導体、ルミノールまたはその誘導体を使用する方
法が挙げられる。グルコースの測定法としては、グルコ
ースデヒドロゲナーゼによる紫外部測定法、ヘキソキナ
ーゼ／グルコース−６−リン酸デヒヒドロゲナーゼによ
る紫外部測定法などがある。またジアホラーゼ等を用い
たホルマザン反応を使用する方法もある。マンノース、
キシロース、アラビノースも公知方法に従って測定す
る。消費する酸素の測定法としては、ワールブルグ検圧
法および酸素電極等を利用する方法が挙げられる。
ル、アラビトール等のポリオールを含む試料としては赤
血球等の生体試料や食品などを挙げることができる。過
酸化水素の測定法としては過酸化水素電極を用いる方
法、通常の発色法および蛍光法を使用して行うことがで
きる。発色法としては、４−アミノアンチピリン、フェ
ノール誘導体またはアニリン誘導体を使用するペルオキ
ダーゼによる発色系、ベンゾチアゾリノンを使用するペ
ルオキシダーゼによる発色系などが挙げられる。蛍光法
としてはアクリジニウムエステル、ルミジェニンまたは
その誘導体、ルミノールまたはその誘導体を使用する方
法が挙げられる。グルコースの測定法としては、グルコ
ースデヒドロゲナーゼによる紫外部測定法、ヘキソキナ
ーゼ／グルコース−６−リン酸デヒヒドロゲナーゼによ
る紫外部測定法などがある。またジアホラーゼ等を用い
たホルマザン反応を使用する方法もある。マンノース、
キシロース、アラビノースも公知方法に従って測定す
る。消費する酸素の測定法としては、ワールブルグ検圧
法および酸素電極等を利用する方法が挙げられる。
【００２１】本発明では上記ポリオールを含有する試料
に本発明のソルビトールオキシダーゼを次の条件にて作
用させ、生成物または酸素量を測定する。本発明の酵素
を含有する試薬と試料をｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ６
〜８、温度５０℃以下、好ましくは２５〜４０℃の条件
で、通常５〜１５分間反応させる。使用する緩衝液とし
てはリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液ま
たはＧＯＯＤの緩衝液が好ましい。本発明では測定対象
であるポリオールをレート法によってもエンド法によっ
ても測定することができる。
に本発明のソルビトールオキシダーゼを次の条件にて作
用させ、生成物または酸素量を測定する。本発明の酵素
を含有する試薬と試料をｐＨ５〜９、好ましくはｐＨ６
〜８、温度５０℃以下、好ましくは２５〜４０℃の条件
で、通常５〜１５分間反応させる。使用する緩衝液とし
てはリン酸緩衝液、トリス塩酸緩衝液、ホウ酸緩衝液ま
たはＧＯＯＤの緩衝液が好ましい。本発明では測定対象
であるポリオールをレート法によってもエンド法によっ
ても測定することができる。
【００２２】
【発明の効果】本発明の酵素はソルビトールに作用して
過酸化水素を生成する新規な酵素であって、ソルビトー
ル、マンニトール、キシリトール、アラビトール等のポ
リオールを効率良く測定できる。特にソルビトールは糖
尿病合併症の成因といわれ、これを感度良く測定する方
法が長く望まれていた。本発明のソルビトールオキシダ
ーゼを用いる方法により、このことが可能になった。
過酸化水素を生成する新規な酵素であって、ソルビトー
ル、マンニトール、キシリトール、アラビトール等のポ
リオールを効率良く測定できる。特にソルビトールは糖
尿病合併症の成因といわれ、これを感度良く測定する方
法が長く望まれていた。本発明のソルビトールオキシダ
ーゼを用いる方法により、このことが可能になった。
【００２３】
【実施例】以下実施例を挙げて本発明を具体的に示す。 実施例１ ソルビトール １％、ポリペプトン １％、酵母エキス
０．５％、ＮａＣｌ０．５％を含む培地（ｐＨ７．
０）１００ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに移し、１
２１℃、１５分間オートクレーブを行った。種菌とし
て、キサントモナス・マルトフィリア（Xanthomonas ma
ltophilia ）ＴＥ３５３９（微工研寄第１３２９６号）
を一白金耳植菌し、３０℃で時間培養し、種培養液とし
た。次に同培地６ｌを１０ｌ容ジャーファーメンターに
移し、１２１℃で１５分間オートクレーブを行い、放冷
後、種培養液１００ｍｌを移し、３００ｒｐｍ，通気量
２ｌ／分、３０℃で時間培養した。培養液を遠心分離に
て集菌し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁
した。フィレンチプレスで処理し、遠心分離を行い、上
清液を得た。得られた粗酵素液を硫安分画、ＤＥＡＥ−
セファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロー
スクロマトグラフィー、セファデックスＧ−２００によ
るゲルろ過により比活性１３Ｕ／ｍｇにまで精製した。
得られたソルビトールオキシダーゼは下記の特性を有し
ていた。 (1) 下記の反応を触媒した。 Ｄ−ソルビトール ＋ Ｏ2 → Ｄ−グルコース ＋
Ｈ2 Ｏ2 (2) 基質特異性 各種の単糖およびその誘導体を基質とした時の酵素活性
を測定した。ソルビトールに対する活性値を１００とし
て表した。
０．５％、ＮａＣｌ０．５％を含む培地（ｐＨ７．
０）１００ｍｌを５００ｍｌ容坂口フラスコに移し、１
２１℃、１５分間オートクレーブを行った。種菌とし
て、キサントモナス・マルトフィリア（Xanthomonas ma
ltophilia ）ＴＥ３５３９（微工研寄第１３２９６号）
を一白金耳植菌し、３０℃で時間培養し、種培養液とし
た。次に同培地６ｌを１０ｌ容ジャーファーメンターに
移し、１２１℃で１５分間オートクレーブを行い、放冷
後、種培養液１００ｍｌを移し、３００ｒｐｍ，通気量
２ｌ／分、３０℃で時間培養した。培養液を遠心分離に
て集菌し、５０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）に懸濁
した。フィレンチプレスで処理し、遠心分離を行い、上
清液を得た。得られた粗酵素液を硫安分画、ＤＥＡＥ−
セファロースクロマトグラフィー、フェニルセファロー
スクロマトグラフィー、セファデックスＧ−２００によ
るゲルろ過により比活性１３Ｕ／ｍｇにまで精製した。
得られたソルビトールオキシダーゼは下記の特性を有し
ていた。 (1) 下記の反応を触媒した。 Ｄ−ソルビトール ＋ Ｏ2 → Ｄ−グルコース ＋
Ｈ2 Ｏ2 (2) 基質特異性 各種の単糖およびその誘導体を基質とした時の酵素活性
を測定した。ソルビトールに対する活性値を１００とし
て表した。
【００２４】
【表１】
【００２５】(3) Ｋｍ値 ソルビトールに対するＫｍ値は０．６０ｍＭであった。 (4) 至適ｐＨ ５０ｍＭ Ｋ−リン酸緩衝液（ｐＨ５．５〜８．０）、
５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５〜８．５）中
での酵素活性を測定した。その結果は図１に示す通りで
あって、至適ｐＨは６．５〜７．５であった。 (5) 安定ｐＨ Britton-Robinson's緩衝液（ｐＨ３−１２）で２５℃、
２４時間保存してその残存活性を測定した。その結果は
図２に示す通りであって、安定ｐＨはｐＨ５〜１１であ
った。 (6) 至適温度 各温度における酵素活性を測定した。その結果は図３に
示す通りであって、至適温度は５５℃であった。 (7) 熱安定性 本発明の酵素を５０ｍＭ Ｋ−リン酸（ｐＨ８．０）中
で１５分間保温した後、残存する酵素活性を測定した。
その結果は図４に示す通りであって、６０℃まで安定で
あった。 (8) 分子量 ５４，０００（ゲルろ過法） ４３，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） (9) 等電点 ４．０ （等電点電
気泳動） (10) 吸収スペクトル 精製酵素は２７３ｎｍに鋭いピーク、３５０ｎｍおよび
４５０ｎｍになだらかなピークを有しており、典型的な
フラビン酵素のパターンを示した（図５）。
５０ｍＭ トリス塩酸緩衝液（ｐＨ７．５〜８．５）中
での酵素活性を測定した。その結果は図１に示す通りで
あって、至適ｐＨは６．５〜７．５であった。 (5) 安定ｐＨ Britton-Robinson's緩衝液（ｐＨ３−１２）で２５℃、
２４時間保存してその残存活性を測定した。その結果は
図２に示す通りであって、安定ｐＨはｐＨ５〜１１であ
った。 (6) 至適温度 各温度における酵素活性を測定した。その結果は図３に
示す通りであって、至適温度は５５℃であった。 (7) 熱安定性 本発明の酵素を５０ｍＭ Ｋ−リン酸（ｐＨ８．０）中
で１５分間保温した後、残存する酵素活性を測定した。
その結果は図４に示す通りであって、６０℃まで安定で
あった。 (8) 分子量 ５４，０００（ゲルろ過法） ４３，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） (9) 等電点 ４．０ （等電点電
気泳動） (10) 吸収スペクトル 精製酵素は２７３ｎｍに鋭いピーク、３５０ｎｍおよび
４５０ｎｍになだらかなピークを有しており、典型的な
フラビン酵素のパターンを示した（図５）。
【００２６】実施例２ 反応液としてリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）５０ｍＭ，４
−アミノアンチピリン０．５０ｍＭ、フェノール２．０
ｍＭ、ペルオキシダーゼ（東洋紡製）４．５Ｕ／ｍｌお
よび本発明の酵素１Ｕ／ｍｌを含む反応試薬を準備し、
その１ｍｌにソルビトールを０、０．１、０．２、０．
３，０．４，０．５マイクロモル含む６種類の試料溶液
を０．０５ｍｌを加えて反応を開始した。３７℃で５分
間反応させ、分光高度計で５００ｎｍの吸光度を測定し
た。結果は図６に示す通りであって、ソルビトールの量
が０〜０．５マイクロモルまで直線になり、定量が可能
であった。
−アミノアンチピリン０．５０ｍＭ、フェノール２．０
ｍＭ、ペルオキシダーゼ（東洋紡製）４．５Ｕ／ｍｌお
よび本発明の酵素１Ｕ／ｍｌを含む反応試薬を準備し、
その１ｍｌにソルビトールを０、０．１、０．２、０．
３，０．４，０．５マイクロモル含む６種類の試料溶液
を０．０５ｍｌを加えて反応を開始した。３７℃で５分
間反応させ、分光高度計で５００ｎｍの吸光度を測定し
た。結果は図６に示す通りであって、ソルビトールの量
が０〜０．５マイクロモルまで直線になり、定量が可能
であった。
【図１】本発明の酵素の反応ｐＨと相対活性との関係を
示すグラフである。
示すグラフである。
【図２】本発明の酵素のｐＨ安定性を示すグラフであ
る。
る。
【図３】本発明の酵素の反応温度と相対活性との関係を
示すグラフである。
示すグラフである。
【図４】本発明の酵素の熱安定性を示すグラフである。
【図５】本発明の酵素の吸収スペクトルである。
【図６】ソルビトールの検量線である。
Claims (4)
- 【請求項１】 Ｄ−ソルビトールに作用して酸素を消費
し過酸化水素を生成する新規なソルビトールオキダー
ゼ。 - 【請求項２】 下記理化学的性質を有する請求項１に記
載されるソルビトールオキシダーゼ。 （１）次の反応を触媒する。 Ｄ−ソルビトール ＋ Ｏ2 → Ｄ−グルコース ＋
Ｈ2 Ｏ2 （２）基質特異性：Ｄ−ソルビトール、Ｄ−マンニトー
ル、Ｄ−キシリトールおよびＤ−アラビトールに作用す
る。 （３）至適ｐＨ：ｐＨ６．５〜７．５ （４）分子量：５４，０００（ゲルろ過法） ４３，０００（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ） - 【請求項３】 ソルビトールオキシダーゼ生産能を有す
るキサントモナス(Xanthomonas) に属する微生物を培養
し、ソルビトールオキシダーゼを生成せしめ、これを採
取することを特徴とするソルビトールオキシダーゼの製
造法。 - 【請求項４】 ソルビトール、マンニトール、キシリト
ールおよびアラビトールからなる群から選ばれた少なく
とも１種のポリオールを含有する試料に、請求項１記載
のソルビトールオキシダーゼを作用させ、生成する過酸
化水素またはＤ−グルコース、マンノース、キシロース
またはアラビノースまたは消費する酸素量を測定して、
上記ポリオールを測定することを特徴とする試料中のポ
リオールの測定法。
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32687192A JP3216739B2 (ja) | 1992-12-07 | 1992-12-07 | ソルビトールオキシダーゼ、その製法及びその用途 |
| US08/162,628 US5472862A (en) | 1992-12-07 | 1993-12-07 | Sorbitol oxidase from Xanthomonas maltophilia FERM BP-4512 |
| US08/471,388 US5741687A (en) | 1992-12-07 | 1995-06-06 | Sorbitol oxidase reagent from xanthomonas |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP32687192A JP3216739B2 (ja) | 1992-12-07 | 1992-12-07 | ソルビトールオキシダーゼ、その製法及びその用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06169764A true JPH06169764A (ja) | 1994-06-21 |
| JP3216739B2 JP3216739B2 (ja) | 2001-10-09 |
Family
ID=18192667
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP32687192A Expired - Fee Related JP3216739B2 (ja) | 1992-12-07 | 1992-12-07 | ソルビトールオキシダーゼ、その製法及びその用途 |
Country Status (2)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5472862A (ja) |
| JP (1) | JP3216739B2 (ja) |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0889242A (ja) * | 1994-09-21 | 1996-04-09 | Ikeda Shokken Kk | キシリトールオキシダーゼ、その製造法および糖アルコールの測定法 |
| WO2013062102A1 (ja) * | 2011-10-27 | 2013-05-02 | 国立大学法人香川大学 | ポリオール酸化酵素 |
| JP2018082644A (ja) * | 2016-11-22 | 2018-05-31 | 国立大学法人 香川大学 | ポリオール酸化酵素 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100322449B1 (ko) | 1999-06-07 | 2002-02-07 | 김순택 | 리튬 이차 전지용 전해액 및 이를 사용한 리튬 이차 전지 |
| BRPI0617481A2 (pt) * | 2005-10-21 | 2011-07-26 | Danisco | composiÇço que compreende um sistema enzimÁtico acoplado |
| DE102010028008A1 (de) | 2010-04-21 | 2011-10-27 | Henkel Ag & Co. Kgaa | Verfahren zur Veränderung der Substratspezifität von Polyoloxidasen |
| CN107632083A (zh) * | 2017-09-08 | 2018-01-26 | 浙江省气象科学研究所 | 快速测定气溶胶中阿糖醇和甘露醇的方法 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0698026B2 (ja) * | 1987-12-28 | 1994-12-07 | 東洋紡績株式会社 | ポリアミンの測定法 |
| JP2763635B2 (ja) * | 1988-02-08 | 1998-06-11 | ユニバーシティ カレッジ カーディフ コンサルタンツ リミティド | 生体液中のジアミンの検出 |
-
1992
- 1992-12-07 JP JP32687192A patent/JP3216739B2/ja not_active Expired - Fee Related
-
1993
- 1993-12-07 US US08/162,628 patent/US5472862A/en not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-06-06 US US08/471,388 patent/US5741687A/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0889242A (ja) * | 1994-09-21 | 1996-04-09 | Ikeda Shokken Kk | キシリトールオキシダーゼ、その製造法および糖アルコールの測定法 |
| WO2013062102A1 (ja) * | 2011-10-27 | 2013-05-02 | 国立大学法人香川大学 | ポリオール酸化酵素 |
| KR20140096077A (ko) | 2011-10-27 | 2014-08-04 | 고쿠리츠다이가쿠호우징 카가와다이가쿠 | 폴리올 산화 효소 |
| JP2018082644A (ja) * | 2016-11-22 | 2018-05-31 | 国立大学法人 香川大学 | ポリオール酸化酵素 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| US5741687A (en) | 1998-04-21 |
| US5472862A (en) | 1995-12-05 |
| JP3216739B2 (ja) | 2001-10-09 |
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