DE102010028008A1

DE102010028008A1 - Verfahren zur Veränderung der Substratspezifität von Polyoloxidasen

Info

Publication number: DE102010028008A1
Application number: DE102010028008A
Authority: DE
Inventors: Nina Mußmann; Dr. O'Connell Timothy; Dr. Maurer Karl-Heinz; Dr. Bornscheuer Uwe; Dr. Gerstenbruch Sandra
Original assignee: Henkel AG and Co KGaA
Current assignee: Henkel AG and Co KGaA
Priority date: 2010-04-21
Filing date: 2010-04-21
Publication date: 2011-10-27

Abstract

Bei einer Polyoloxidase, die eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 83% identisch ist, soll die Substratspezifität verändert werden. Dies gelingt durch Einbringen von einer oder mehreren der Aminosäuresubstitutionen A64V und/oder V125M und/oder V133M und/oder G236D und/oder A244T und/oder G399W oder G399R in die Polyoloxidase.

Description

Die Erfindung liegt auf dem Gebiet der enzymatischen Erzeugung von Wasserstoffperoxid. Die Erfindung betrifft insbesondere die enzymatische Erzeugung von Wasserstoffperoxid durch Polyoloxidasen, die einen mehrwertigen Alkohol als Substrat umsetzen, und schlägt neue Verfahren vor, solche Polyoloxidasen zu erhalten. Die Erfindung betrifft insbesondere Verfahren zur Veränderung der Substratspezifität einer Polyoloxidase durch das Einbringen von einer oder mehreren Aminosäuresubstitutionen in die Polyoloxidase. Die Erfindung betrifft ferner Polyoloxidasen mit veränderter Substratspezifität, hinreichend ähnliche Polyoloxidasen, für sie codierende Nukleinsäuren, Verfahren und Verwendungen dieser Polyoloxidasen sowie sie enthaltende Mittel, insbesondere Wasch- und Reinigungsmittel.
Wasserstoffperoxid wird zur Bleiche, Konservierung oder zur Desinfektion eingesetzt, beispielsweise in Waschmitteln, bei der Stoff-, Papier- und Zellstoffbearbeitung, zur Zahnbleiche oder zur Behandlung von Oberflächen wie Kacheln, Fugen zwischen Kacheln, u. a. Für die herkömmliche chemische Bleiche werden anorganische, alkalische Wasserstoffperoxidlieferanten wie Percarbonat oder Perborat in Kombination mit Bleichboostern (z. B. TAED) eingesetzt. Die Bleichkomponente Wasserstoffperoxid entsteht durch spontanen Zerfall der Additionsverbindung und führt damit schnell aber kurzfristig zu hohen Konzentrationen. Eine schonende Bleiche ist nicht möglich.
Es ist bekannt, dass Oxidasen, beispielsweise Glucoseoxidasen, Cholinoxidasen, Alkoholoxidasen, oder Aminosäureoxidasen, zusammen mit ihren Substraten für die Wasserstoffperoxidgenerierung in Waschmitteln, Kosmetika oder Desinfektionsmitteln eingesetzt werden können, beispielsweise zur Bleiche, zur Farbübertragungshemmung, zur enzymatischen Haarfärbung oder zur Aufhellung von Zähnen. Beispielsweise wird in der internationalen Offenlegungsschrift WO 97/21796 beschrieben, dass Oxidasen aus ihren entsprechenden Substraten unter technischen Bedingungen (z. B. einer Waschmittelmatrix) mit Hilfe von Luftsauerstoff Wasserstoffperoxid freisetzen und damit zur Bleiche eingesetzt werden können. In der internationalen Offenlegungsschrift WO 2007/054203 sind Polyoloxidasen und hierunter insbesondere eine Zuckeralkoholoxidase offenbart und beispielsweise für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln vorgesehen. In der internationalen Patentanmeldung WO 2007/045251 sind kosmetische und therapeutische Anwendungen einer Polyoloxidase aus Streptomyces beschrieben. Die Patentanmeldung US 5472862 offenbart eine Sorbitoloxidase aus Xanthomonas maltophilia. In der Veröffentlichungen von Fraaije et al. (J. Biol. Chem. 282(28), Seiten 20283–20291, 2007), Yamashita M. et al. (J. Biosci. Bioeng. 89(4), Seiten 350–360, 2000), Oda K. et al. (Ann. NY Acad. Sci. 864, Seiten 454–457, 1998) und Hiraga K. et al. (Biosci. Biotechnol. Biochem. 62(2), Seiten 347–353, 1998) sind eine Alditoloxidase aus Streptomyces coelicolor, eine thermostabile Xylitoloxidase aus Streptomyes sp. IKD472 und Sorbitoloxidasen aus Mikroorganismen, beispielsweise eine Sorbitoloxidase aus Streptomyces sp. H-7775, offenbart.
Die enzymatische Erzeugung von Wasserstoffperoxid hat gegenüber der direkten Beigabe zum Produkt unter anderem den Vorteil, dass die Substanz erst unmittelbar bei der Anwendung erzeugt wird, dass Lagerinstabilität vermieden wird, dass ein Verlust des Wasserstoffperoxids während der Lagerung durch Abbau vermieden wird, und dass kein Wasserstoffperoxid als Rezepturbestandteil deklariert werden muss. Weiterer Vorteil ist die kontinuierliche Nachproduktion von Wasserstoffperoxid, während dieses durch seine Aktivität dem Gleichgewicht entzogen wird.
Wünschenswert für eine wirtschaftliche Anwendbarkeit ist die Erzeugung einer ausreichenden Menge von Wasserstoffperoxid. Dies erfordert eine ausreichende spezifische Aktivität der jeweiligen Oxidase hinsichtlich ihres Substrates. Die im Stand der Technik bekannten Polyoloxidasen mit diesbezüglich ausreichender spezifischer Aktivität nutzen als Substrate insbesondere Glucose, Cholin oder Aminosäuren. Diese Substrate sind allerdings von Nachteil: Beispielsweise fördert Glucose das Wachstum von Mikroorganismen und stellt damit ein hygienisches Problem dar. Ferner kann sie kariogen wirken beim Einsatz in der Mundhöhle, beispielsweise bei der Zahnbleiche. Zudem entsteht bei der Oxidation von Glucose mit Luftsauerstoff neben Wasserstoffperoxid Glucono-δ-lacton, das oftmals eine unerwünschte Veränderung des pH-Wertes bedingt. Entsprechendes gilt für Cholin oder Aminosäuren als Substrate für Oxidasen. Cholinoxidase oxidiert mit Luftsauerstoff Cholin zum Aldehyd und letztlich zum Betain, d. h. auch hier entsteht eine freie Säurefunktion, die zu einer pH-Verschiebung führt. Aminosäureoxidasen setzen durch oxidative Desaminierung neben Wasserstoffperoxid Ammoniak frei, was ebenfalls zu einer pH-Verschiebung führt. Ferner können Geruchsbelästigungen durch Ammoniak auftreten.
Daher sind alternative Substrate wünschenswert, bei deren Umsatz diese Nachteile nicht auftreten und/oder die weitere Vorteile aufweisen, beispielsweise eine gute Verträglichkeit des Substrates mit Produktformulierungen, eine zusätzliche gewünschte Wirkung des Substrates in der Produktformulierung, insbesondere eine stabilisierende oder verdickende oder feuchthaltende Wirkung, oder eine vorteilhafte wirtschaftliche Zugänglichkeit zu dem Substrat, beispielsweise aus regenerativen Quellen. Entsprechende Vorteile kann auch das aus der Umsetzung eines Substrates entstandene Produkt zeigen. Diesbezüglich bevorzugte Substrate sind insbesondere mehrfache Alkohole, beispielsweise Glycerin.
Die im Stand der Technik verfügbaren Polyoloxidasen, welche solche vorteilhaften Substrate umsetzen, weisen nur eine geringe spezifische Aktivität hinsichtlich dieser Substrate auf. Somit erfolgt keine ausreichende Wasserstoffperoxid-Bildung.
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass die Substratspezifität von Polyoloxidasen durch ein- oder mehrfache spezifische Aminosäuresubstitution(en) vorteilhaft verändert werden, so dass bevorzugte Substrate, insbesondere mehrfache Alkohole, verstärkt umgesetzt werden und vermehrt Wasserstoffperoxid gebildet wird.
Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Veränderung der Substratspezifität einer Polyoloxidase umfassend folgende Verfahrensschritte:

a) Bereitstellen einer Polyoloxidase, die eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 83% identisch ist,
b) Einbringen von einer oder mehreren der Aminosäuresubstitutionen A64V und/oder V125M und/oder V133M und/oder G236D und/oder A244T und/oder G399W oder G399R in der Zählung gemäß SEQ ID NO. 1 in die Polyoloxidase gemäß a), wobei eine veränderte Substratspezifität der Polyoloxidase nach Schritt b) gegenüber der Polyoloxidase nach Schritt a) mit einem mehrfachen Alkohol als Substrat für die Polyoloxidase bestimmt wird.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Polyoloxidase umfassend eine Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 83% identisch ist und eine oder mehrere der Aminosäuresubstitutionen A64V und/oder V125M und/oder V133M und/oder G236D und/oder A244T und/oder G399W oder G399R in der Zählung gemäß SEQ ID NO. 1 aufweist, wobei die Polyoloxidase eine gegenüber der Polyoloxidase gemäß SEQ ID NO. 1 veränderte Substratspezifität aufweist mit einem mehrfachen Alkohol als Substrat für die Polyoloxidase.
Eine Polyoloxidase im Rahmen der vorliegenden Patentanmeldung umfasst daher sowohl eine mit einem erfindungsgemäßen Verfahren veränderte bzw. hergestellte Polyoloxidase als auch eine Polyoloxidase als solche. Alle Ausführungen zu Polyoloxidasen beziehen sich daher jeweils auf die erfindungsgemäßen Verfahren zur Veränderung bzw. Herstellung einer Polyoloxidase wie auch auf die Polyoloxidasen selbst, d. h. die Polyoloxidasen als Stoff.
Als weitere Erfindungsgegenstände sind mit den erfindungsgemäßen Polyoloxidasen bzw. den mit erfindungsgemäßen Verfahren veränderten Polyoloxidasen für diese Polyoloxidasen codierende Nukleinsäuren, erfindungsgemäße Polyoloxidasen oder Nukleinsäuren enthaltende nicht menschliche Wirtszellen sowie erfindungsgemäße Polyoloxidasen umfassende Mittel, insbesondere Wasch- und Reinigungsmittel, Wasch- und Reinigungsverfahren, und über erfindungsgemäßen Polyoloxidasen definierte Verwendungen verbunden.
Überraschenderweise wurde festgestellt, dass eine erfindungsgemäße Veränderung der Aminosäuresequenz in einer Polyoloxidase, die eine zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Aminosäuresequenz zu mindestens 83% identische Aminosäuresequenz umfasst, eine Veränderung der Substratspezifität bewirkt. Durch das Einbringen von einer oder mehreren der Aminosäuresubstitutionen A64V und/oder V125M und/oder V133M und/oder G236D und/oder A244T und/oder G399W oder G399R in der Zählung gemäß SEQ ID NO. 1 in eine solche Polyoloxidase als Ausgangsenzym wird die Substratspezifität der Polyoloxidase verändert, wobei ein mehrfacher Alkohol das Substrat für die Polyoloxidase ist.
Unter der Aussage, dass eine Polyoloxidase eine Aminosäuresequenz umfasst, ist zu verstehen, dass die Polyoloxidase nicht auf diese Aminosäuresequenz limitiert ist. Vielmehr kann sie sowohl am N-Terminus wie auch am C-Terminus weitere Aminosäuren aufweisen. Vorzugsweise weist die Polyoloxidase am C-Terminus mindestens eine weitere Aminosäure auf. Besonders bevorzugt weist die Polyoloxidase am C-Terminus zusätzlich die Aminosäure G (Gly) oder die Aminosäuren EA (Glu-Ala) auf. Bezug nehmend auf SEQ ID NO. 1 bzw. hierzu entsprechend identischen Sequenzen sind besonders bevorzugte Polyoloxidasen solche, die SEQ ID NO. 1 bzw. eine hierzu entsprechend identische Sequenz und zusätzlich die Aminosäure G (Gly) oder die Aminosäuren EA (Glu-Ala) am C-Terminus aufweisen. Diese Sachverhalte betreffen sowohl erfindungsgemäß zu verändernde (Ausgangsenzyme) als auch erfindungsgemäß resultierende Polyoloxidasen.
Für die Beschreibung von Substitutionen, die genau eine Aminosäureposition betreffen (Aminosäureaustausche), wird folgende Konvention angewendet: zunächst wird die natürlicherweise vorhandene Aminosäure in Form des international gebräuchlichen Einbuchstaben-Codes bezeichnet, dann folgt die zugehörige Sequenzposition und schließlich die eingefügte Aminosäure. Mehrere Austausche innerhalb derselben Polypeptidkette werden durch Schrägstriche voneinander getrennt. Bei Insertionen sind nach der Sequenzposition zusätzliche Aminosäuren benannt. Bei Deletionen ist die fehlende Aminosäure durch ein Symbol, beispielsweise einen Stern oder einen Strich, ersetzt. Beispielsweise beschreibt A95G die Substitution von Alanin an Position 95 durch Glycin, A95AG die Insertion von Glycin nach der Aminosäure Alanin an Position 95 und A95* die Deletion von Alanin an Position 95. Diese Nomenklatur ist dem Fachmann auf dem Gebiet der Enzymtechnologie bekannt. Soweit nicht anders angegeben erfolgt die Zählung der Aminosäurepositionen in der Zählung gemäß SEQ ID NO. 1. Ausgehend von den genannten Positionen in SEQ ID NO. 1 sind die Veränderungspositionen in einer erfindungsgemäßen Polyoloxidase diejenigen, die eben diesen Positionen in einem Alignment zugeordnet sind.
Eine veränderte Substratspezifität ist damit gegeben, wenn die resultierende Polyolxidase, also eine Polyoloxidase umfassend eine Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 83% identisch ist, und in die eine oder mehrere der Aminosäuresubstitutionen A64V und/oder V125M und/oder V133M und/oder G236D und/oder A244T und/oder G399W oder G399R in der Zählung gemäß SEQ ID NO. 1 eingebracht wurden bzw. die eine oder mehrere dieser Aminosäuresubstitutionen aufweist, das gleiche Substrat, nämlich einen mehrfachen Alkohol, unter gleichen Bedingungen unterschiedlich umsetzt im Vergleich zum Ausgangsenzym, in das keine erfindungsgemäße Aminosäuresubstitution eingebracht wurde bzw. das keine solche Aminosäuresubstitution umfasst. Hinsichtlich des gleichen Substrats zeigen sich daher unterschiedliche katalytische Eigenschaften bei der erfindungsgemäßen bzw. erfindungsgemäß veränderten Polyoloxidase im Vergleich mit dem Ausgangsenzym. Insbesondere sind die gebildeten Mengen an Wasserstoffperoxid unterschiedlich, wobei eine erfindungsgemäße bzw. erfindungsgemäß veränderte Polyoloxidase vorzugsweise die Bildung einer größeren Menge an Wasserstoffperoxid katalysiert. Bei dem Ausgangsenzym handelt es sich also um dasjenige Enzym, das in Verfahrensschritt a) bereitgestellt wird. Das Ausgangsenzym ist im Rahmen der Erfindung als Vergleichsenzym heranzuziehen, um eine veränderte Substratspezifität festzustellen. Das Ausgangs- bzw. Vergleichsenzym ist eine Polyoloxidase gemäß SEQ ID NO. 1 mit zwei zusätzlichen Aminosäuren EA (Glu-Ala) am C-Terminus, sofern die veränderte Substratspezifität einer erfindungsgemäßen Polyoloxidase unabhängig von deren Herstellung ermittelt werden soll. Das Substrat ist ein mehrfacher Alkohol. Hierunter ist jede Verbindung zu verstehen, die mindestens zwei Hydroxylgruppen aufweist.
Eine veränderte Substratspezifität liegt insbesondere dann vor, wenn die resultierende Polyoloxidase und das Ausgangsenzym unterschiedliche spezifische Aktivitäten bezüglich des Substrates aufweisen. Die spezifische Aktivität wird wie folgt bestimmt:
Der Test beruht auf einer photometrischen Bestimmung der gebildeten Wasserstoffperoxidmenge mit Hilfe eines Systems aus 4-Aminoantipyrin, Chromotropsäure und Peroxidase (Meerrettich, „horseradish”) und wird üblicherweise in einer Mikrotiterplatte durchgeführt.
30 μl Enzymprobe wird mit 50 μl Test-Mischung (160 mM Substrat, 0,16 mM Hydroxylaminsulfat als Katalaseinhibitor in 50 mM Glycin-NaOH Puffer pH 10) für 10 Minuten unter Schütteln bei 37°C inkubiert. Dann werden 100 μl Peroxidreagenz (12,5 mM Chromotropsäure, 1,2 mM 4-Aminoantipyrin in 200 mM Phosphatpuffer pH 5) zugegeben und die Farbreaktion durch Zugabe von 15 μl Peroxidaselösung (104 U/ml in 200 mM Phosphatpuffer pH 5) gestartet. Die Absorption wird bei 600 nm gemessen.
Vorteilhafterweise erfolgt die Bestimmung der Aktivität mit dem vorstehend beschriebenen Test derart, dass der Test für die direkte Anwendung in Küvetten ausgestaltet ist: 150 μl Enzymprobe wird mit 250 μl Test-Mischung (160 mM Substrat, 0,16 mM Hydroxylaminsulfat als Katalaseinhibitor in 50 mM Glycin-NaOH Puffer pH 10) für 10 Minuten unter Schütteln bei 37°C inkubiert. Dann werden 500 μl Peroxidreagenz (12,5 mM Chromotropsäure, 1,2 mM 4-Aminoantipyrin in 200 mM Phosphatpuffer pH 5) zugegeben und die Farbreaktion durch Zugabe von 75 μl Peroxidaselösung (104 U/mL in 200 mM Phosphatpuffer pH 5) gestartet. Die Absorption wird bei 600 nm gemessen. Eine Einheit (Unit, U) ist die Menge an Enzym, die 1 μmol Wasserstoffperoxid in einer Minute generiert unter den vorstehend genannten Testbedingungen.
Der Proteingehalt der jeweiligen Probe kann mit Hilfe bekannter Methoden, zum Beispiel dem BCA-Verfahren (Bicinchoninsäure: 2,2'-Bichinolyl-4,4'-dicarbonsäure) oder dem Biuret-Verfahren (A. G. Gornall, C. S. Bardawill und M. M. David, J. Biol. Chem., 177 (1948), S. 751–766) bestimmt werden. Vorteilhafterweise wird der Proteingehalt mit Hilfe handelsüblicher Testkits nach deren Protokoll ermittelt, beispielsweise mit dem BCA-Kit des Unternehmens Uptima (Uptima Interchim, Montlçon, Frankreich), das im Rahmen der vorliegenden Patentanmeldung verwendet wurde.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass die Polyoloxidase eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91%, 91,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99%, 99,25%, 99,5%, 99,75% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist. Diese Angaben beziehen sich somit auf eine mit einem erfindungsgemäßen Verfahren zu verändernde bzw. herzustellende Polyoloxidase.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung umfasst eine erfindungsgemäße Polyoloxidase eine Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91%, 91,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99%, 99,25%, 99,5% oder 99,75% identisch ist. Diese Angaben beziehen sich somit auf die resultierende Polyoloxidase. Der maximal mögliche Grad an Identität ergibt sich jeweils aus der Anzahl der vorliegenden erfindungsgemäßen Sequenzveränderungen. Ist beispielsweise lediglich eine Sequenzveränderung gegenüber SEQ ID NO. 1 verwirklicht, so beträgt der maximal mögliche Grad an Identität 99,76%, bei zwei Sequenzveränderungen konsequenterweise 99,52%, bei drei Sequenzveränderungen 99,28%, bei vier Sequenzveränderungen 99%, bei fünf Sequenzveränderungen 98,80% und bei sechs Sequenzveränderungen 98,56%.
Die Bestimmung der Identität von Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen erfolgt durch einen Sequenzvergleich. Dieser Sequenzvergleich basiert auf dem im Stand der Technik etablierten und üblicherweise genutzten BLAST-Algorithmus (vgl. beispielsweise Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W. & Lipman, D. J. (1990) „Basic local alignment search tool." J. Mol. Biol. 215:403-410, und Altschul, Stephan F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Hheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997): „Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of Protein database search programs"; Nucleic Acids Res., 25, S. 3389–3402) und geschieht prinzipiell dadurch, dass ähnliche Abfolgen von Nukleotiden oder Aminosäuren in den Nukleinsäure- bzw. Aminosäuresequenzen einander zugeordnet werden. Eine tabellarische Zuordnung der betreffenden Positionen wird als Alignment bezeichnet. Ein weiterer im Stand der Technik verfügbarer Algorithmus ist der FASTA-Algorithmus. Sequenzvergleiche (Alignments), insbesondere multiple Sequenzvergleiche, werden mit Computerprogrammen erstellt. Häufig genutzt werden beispielsweise die Clustal-Serie (vgl. beispielsweise Chenna et al. (2003): Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs. Nucleic Acid Research 31, 3497–3500), T-Coffee (vgl. beispielsweise Notredame et al. (2000): T-Coffee: A novel method for multiple sequence alignments. J. Mol. Biol. 302, 205–217) oder Programme, die auf diesen Programmen bzw. Algorithmen basieren. In der vorliegenden Patentanmeldung wurden alle Sequenzvergleiche (Alignments) mit dem Computer-Programm Vector NTI^® Suite 10.3 (Invitrogen Corporation, 1600 Faraday Avenue, Carlsbad, Kalifornien, USA) mit den vorgegebenen Standardparametern erstellt, dessen AlignX-Modul für die Sequenzvergleiche auf ClustalW basiert.
Solch ein Vergleich erlaubt auch eine Aussage über die Ähnlichkeit der verglichenen Sequenzen zueinander. Sie wird üblicherweise in Prozent Identität, das heißt dem Anteil der identischen Nukleotide oder Aminosäurereste an denselben bzw. in einem Alignment einander entsprechenden Positionen angegeben. Der weiter gefasste Begriff der Homologie bezieht bei Aminosäuresequenzen konservierte Aminosäure-Austausche in die Betrachtung mit ein, also Aminosäuren mit ähnlicher chemischer Aktivität, da diese innerhalb des Proteins meist ähnliche chemische Aktivitäten ausüben. Daher kann die Ähnlichkeit der verglichenen Sequenzen auch Prozent Homologie oder Prozent Ähnlichkeit angegeben sein. Identitäts- und/oder Homologieangaben können über ganze Polypeptide oder Gene oder nur über einzelne Bereiche getroffen werden. Homologe bzw. identische Bereiche von verschiedenen Nukleinsäure- oder Aminosäuresequenzen sind daher durch Übereinstimmungen in den Sequenzen definiert. Solche Bereiche weisen oftmals identische Funktionen auf. Sie können klein sein und nur wenige Nukleotide bzw. Aminosäuren umfassen. Oftmals üben solche kleinen Bereiche für die Gesamtaktivität des Proteins essentielle Funktionen aus. Es kann daher sinnvoll sein, Sequenzübereinstimmungen nur auf einzelne, gegebenenfalls kleine Bereiche zu beziehen. Soweit nicht anders angegeben beziehen sich Identitäts- bzw. Homologieangaben in der vorliegenden Anmeldung aber auf die Gesamtlänge der jeweils angegebenen Nukleinsäure- oder Aminosäuresäuresequenz.
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Veränderung der Substratspezifität eine Steigerung der spezifischen Aktivität, insbesondere beträgt die Steigerung der spezifischen Aktivität mindestens 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 22,5%, 25%, 27,5%, 30%, 32,5%, 35%, 37,5%, 40%, 42,5%, 45%, 47,5%, 50% gegenüber dem Ausgangsenzym und/oder gegenüber einer Polyoloxidase gemäß SEQ ID NO. 1 mit zwei zusätzlichen Aminosäuren EA (Glu-Ala) am C-Terminus.
Ein bevorzugter mehrfacher Alkohol als Substrat für die Polyoloxidase ist ausgewählt aus

a) Substraten der chemischen Zusammensetzung R1-[-(CHOH)n-(CH2)m-(CHOH)q-]p-R2, wobei R1 und R2 unabhängig voneinander ausgewählt sind unter H, linearen oder verzweigten, substituierten oder unsubstituierten Alkyl-, Alkenyl-, Heteroalkyl-, Alkinyl-, Aryl-, Alkylaryl-, Alkylheteroaryl- und Heteroaryl-Gruppen; wobei p jede ganze Zahl im Bereich von 1 bis 10000, bevorzugt im Bereich von 100 bis 5000 sein kann, m jede ganze Zahl im Bereich von 0 bis 100, bevorzugt im Bereich von 0 bis 10 sein kann, n jede ganze Zahl im Bereich von 0 bis 10 sein kann und q jede ganze Zahl im Bereich von 0 bis 10 sein kann, wobei die Summe von n und q größer oder gleich zwei ist,
b) modifizierten Substraten nach a), wobei die Alkoholfunktionen zu 0 bis 80%, bevorzugt zu 0 bis 40% und besonders bevorzugt zu 0 bis 10% mit Gruppen der Formel R3-CO-Ester formen oder mit Gruppen der Formel R3- Ether bilden, wobei R3 ausgewählt sein kann unter linearen oder verzweigten, substituierten oder unsubstituierten Alkyl-, Alkenyl-, Heteroalkyl-, Alkinyl-, Aryl-, Alkylaryl-, Alkylheteroaryl- und Heteroaryl-Gruppen und wobei Ester kurzkettiger Carbonsäuren C1 bis C8, vorzugsweise C1 bis C4, bevorzugt und Acetat-Gruppen besonders bevorzugt sind, oder
c) Substraten nach a) oder b), weiterhin dadurch modifiziert, dass solche Polyole oder Polyol-Derivate miteinander kreuzvernetzt sind, indem mindestens eine Alkoholfunktion der jeweils zu vernetzenden Moleküle beispielsweise durch C2-Dicarbonsäuren oder längerkettige Dicarbonsäuren über zwei Esterbindungen verbunden sind, oder aber durch andere Kreuzvernetzungen von mindestens einer Alkoholfunktion.

Ein weiterer bevorzugter mehrfacher Alkohol als Substrat für die Polyoloxidase ist ausgewählt aus

a) Zuckeralkoholen, insbesondere unter Mannitol, Sorbitol, Xylitol, Maltitol, Lactitol, Isomalt, Galactitol, Arabitol, Ribitol, Erythritol, Adonitol und Iditol, Glycerin und Ethylenglycol, besonders unter D-Sorbitol, D-Xylitol oder D-Mannitol, ganz besonders unter D-Sorbitol,
b) Cycliten, insbesondere unter myo-Inosit,
c) Ethylenglycol, 1,4-Butandiol, Polyvinylalkohol oder Glycerin,
d) Pseudozuckern, insbesondere unter Pseudopyranosen und Pseudofuranosen, vorzugsweise unter Valiolamin und Valienamin.

Der Begriff Pseudozucker steht für eine Klasse von Verbindungen, in welchen der Ringsauerstoff eines Zuckers durch eine Methylengruppe ersetzt ist. Pseudozucker kommen in freier Form in der Kulturbrühe von Mikroorganismen, vor allem aber als Komponenten von Pseudooligosacchariden als Enzym-Inhibitoren und Antibiotika vor. Zwei Typen werden unterschieden, Pseudopyranosen und Pseudofuranosen. Einige biologisch aktive Pseudozucker werden in der Natur gefunden, Beispiele sind Valiolamin und Valienamin, Bestandteile des Trisaccharid-Antibiotikums Validamycin A bzw. der Acarbose.
Ein besonders bevorzugter mehrfacher Alkohol als Substrat für die Polyoloxidase ist Glycerin. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung liegt die Steigerung der spezifischen Aktivität vor mit Glycerin als Substrat für die Polyoloxidase, insbesondere beträgt die Steigerung der spezifischen Aktivität mindestens 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 22,5%, 25%, 27,5%, 30%, 32,5%, 35%, 37,5%, 40%, 42,5%, 45%, 47,5%, 50% gegenüber dem Ausgangsenzym und/oder gegenüber einer Polyoloxidase gemäß SEQ ID NO. 1 mit zwei zusätzlichen Aminosäuren EA (Glu-Ala) am C-Terminus.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die Polyoloxidase eine FAD-abhängige Polyoloxidase. FAD steht für Flavin-Adenin-Dinucleotid und ist eine prosthetische Gruppe und damit ein Cofaktor für die Polyoloxidase. Eine prosthetische Gruppe bildet einen dauerhaften Teil der Proteinstruktur und ist in der Regel kovalent an das Enzym gebunden. Vorzugsweise ist die Polyoloxidase eine Zuckeralkohol-Oxidase, insbesondere eine Mannitoloxidase, Sorbitoloxidase, Xylitoloxidase, Arabitoloxidase, Polyvinylalkoholoxidase oder Glycerinoxidase.
In weiteren bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist das Verfahren dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) eine der folgenden Aminosäuresubstitutionen oder Kombinationen von Aminosäuresubstitutionen in die Polyoloxidase eingebracht werden: V125M/A244T, G399V, V133M, G236D, A64V/G399R. Eine weitere vorteilhafte Ausführungsform der Erfindung ist demnach auch eine Polyoloxidase, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie eine der folgenden Aminosäuresubstitutionen oder Kombinationen von Aminosäuresubstitutionen aufweist: V125M/A244T, G399V, V133M, G236D, A64V/G399R, insbesondere eine solche, die zu einer in SEQ ID NO. 3 oder SEQ ID NO. 5 oder SEQ ID NO. 7 oder SEQ ID NO. 9 oder SEQ ID NO. 11 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 83% oder zunehmend bevorzugt zu mindestens 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91%, 91,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99%, 99,25%, 99,5%, 99,75% oder 100% identisch ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung handelt es sich um eine Polyoloxidase umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 1 mit einer oder mehreren der Aminosäuresubstitutionen A64V und/oder V125M und/oder V133M und/oder G236D und/oder A244T und/oder G399W oder G399R in der Zählung gemäß SEQ ID NO. 1. Besonders bevorzugt handelt es sich um eine Polyoloxidase umfassend eine Aminosäuresequenz gemäß SEQ ID NO. 3 oder SEQ ID NO. 5 oder SEQ ID NO. 7 oder SEQ ID NO. 9 oder SEQ ID NO. 11.
Proteine können über die Reaktion mit einem Antiserum oder einem bestimmten Antikörper zu Gruppen immunologisch verwandter Proteine zusammengefasst werden. Die Angehörigen einer solchen Gruppe zeichnen sich dadurch aus, dass sie dieselbe, von einem Antikörper erkannte antigene Determinante aufweisen. Sie sind daher einander strukturell so ähnlich, dass sie von einem Antiserum oder bestimmten Antikörpern erkannt werden. Einen weiteren Erfindungsgegenstand bilden daher Polyoloxidasen, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie mindestens eine und zunehmend bevorzugt zwei, drei oder vier übereinstimmende antigene Determinanten mit einer erfindungsgemäßen Polyoloxidase aufweisen. Solche Polyoloxidasen sind auf Grund ihrer immunologischen Übereinstimmungen den erfindungsgemäßen Polyoloxidasen strukturell so ähnlich, dass auch von einer gleichartigen Funktion und Aktivität gegenüber ihren Substraten auszugehen ist.
Zusätzlich zu den vorstehend erläuterten Aminosäureveränderungen können erfindungsgemäße Polyoloxidasen weitere Aminosäureveränderungen, insbesondere Aminosäure-Substitutionen, -Insertionenen oder -Deletionen, aufweisen. Solche Polyoloxidasen sind beispielsweise durch gezielte genetische Veränderung, d. h. durch Mutageneseverfahren, weiterentwickelt und für bestimmte Einsatzzwecke oder hinsichtlich spezieller Eigenschaften (beispielsweise hinsichtlich ihrer katalytischen Aktivität, Stabilität, usw.) optimiert. Ferner können erfindungsgemäße Nukleinsäuren in Rekombinationsansätze eingebracht und damit zur Erzeugung völlig neuartiger Polyoloxidasen oder anderer Polypeptide genutzt werden.
Das Ziel ist es, in die bekannten Moleküle gezielte Mutationen wie Substitutionen, Insertionen oder Deletionen einzuführen, um beispielsweise den Substratumsatz von erfindungsgemäßen Enzymen oder deren Stabilität, beispielsweise in einem Wasch- oder Reinigungsmittel oder in einer Waschflotte, weiter zu verbessern. Hierzu können insbesondere die Oberflächenladungen und/oder der isoelektrische Punkt der Moleküle und dadurch ihre Wechselwirkungen mit dem Substrat verändert werden. So kann beispielsweise die Nettoladung der Enzyme verändert werden, um darüber die Substratbindung insbesondere für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln zu beeinflussen.
Alternativ oder ergänzend kann durch eine oder mehrere entsprechende Mutationen die Stabilität der Polyoloxidase erhöht und dadurch ihr Substratumsatz und/oder ihre Reinigungsleistung verbessert werden. Vorteilhafte Eigenschaften einzelner Mutationen, z. B. einzelner Substitutionen, können sich ergänzen. Eine hinsichtlich bestimmter Eigenschaften bereits optimierte Polyoloxidase, zum Beispiel hinsichtlich ihrer Stabilität gegenüber Tensiden und/oder Bleichmitteln und/oder anderen Komponenten, kann daher im Rahmen der Erfindung zusätzlich weiterentwickelt sein.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher eine Polyoloxidase, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie aus einer Polyoloxidase wie vorstehend beschrieben als Ausgangsmolekül erhaltbar ist durch ein- oder mehrfache konservative Aminosäuresubstitution, wobei die resultierende Polyoloxidase in der Zählung gemäß SEQ ID NO. 1 noch immer mindestens eine der vorstehend beschriebenen Aminosäuresubstitutionen A64V und/oder V125M und/oder V133M und/oder G236D und/oder A244T und/oder G399W oder G399R aufweist. Der Begriff „konservative Aminosäuresubstitution” bedeutet den Austausch (Substitution) eines Aminosäurerestes gegen einen anderen Aminosäurerest, wobei dieser Austausch nicht zu einer Änderung der Polarität oder Ladung an der Position der ausgetauschten Aminosäure führt, z. B. der Austausch eines unpolaren Aminosäurerestes gegen einen anderen unpolaren Aminosäurerest. Konservative Aminosäuresubstitutionen im Rahmen der Erfindung umfassen beispielsweise: G=A=S, I=V=L=M, D=E, N=Q, K=R, Y=F, S=T, G=A=I=V=L=M=Y=F=W=P=S=T.
Alternativ oder ergänzend ist die Polyoloxidase dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einer erfindungsgemäßen Polyoloxidase als Ausgangsmolekül erhaltbar ist durch Fragmentierung, Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutagenese und eine Aminosäuresequenz umfasst, die über eine Länge von mindestens 50, 60, 70, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 210, 220, 230, 240, 250, 260, 265, 266 oder 267 zusammenhängenden Aminosäuren mit dem Ausgangsmolekül übereinstimmt, wobei die resultierende Polyoloxidase in der Zählung gemäß SEQ ID NO. 1 noch immer mindestens eine der vorstehend beschriebenen Aminosäuresubstitutionen A64V und/oder V125M und/oder V133M und/oder G236D und/oder A244T und/oder G399W oder G399R aufweist.
So ist es beispielsweise möglich, an den Termini oder in den Loops des Enzyms einzelne Aminosäuren zu deletieren, ohne dass dadurch die enzymatische Aktivität verloren oder vermindert wird. Ferner kann durch derartige Fragmentierung, Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutagenese beispielsweise auch die Allergenizität betreffender Enzyme gesenkt und somit insgesamt ihre Einsetzbarkeit verbessert werden. Vorteilhafterweise behalten die Enzyme auch nach der Mutagenese ihre enzymatische Aktivität, d. h. ihre enzymatische Aktivität entspricht mindestens derjenigen des Ausgangsenzyms. Auch Substitionen können vorteilhafte Wirkungen zeigen. Sowohl einzelne wie auch mehrere zusammenhängende Aminosäuren können gegen andere Aminosäuren ausgetauscht werden.
Sämtliche Ausführungen gelten auch für die erfindungsgemäßen Verfahren.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine zuvor beschriebene Polyoloxidase, die zusätzlich stabilisiert ist, insbesondere durch eine oder mehrere Mutationen, beispielsweise Substitutionen, oder durch Kopplung an ein Polymer. Denn eine Erhöhung der Stabilität bei der Lagerung und/oder während des Einsatzes, beispielsweise beim Waschprozess, führt dazu, dass die enzymatische Aktivität länger anhält und damit der Substratumsatz und/oder die Reinigungsleistung verbessert werden. Grundsätzlich kommen alle im Stand der Technik beschriebenen und/oder zweckmäßigen Stabilisierungsmöglichkeiten in Betracht. Bevorzugt sind solche Stabilisierungen, die über Mutationen des Enzyms selbst erreicht werden, da solche Stabilisierungen im Anschluss an die Gewinnung des Enzyms keine weiteren Arbeitsschritte erfordern.
Möglichkeiten der Stabilisierung sind beispielsweise:

– Austausch von einem oder mehreren Tyrosin-Resten gegen andere Aminosäuren
– Veränderung der Bindung von Metallionen, beispielsweise durch Austauschen von einer oder mehreren der an der Metallionen-Bindung beteiligten Aminosäure gegen eine oder mehrere negativ geladene Aminosäuren und/oder durch Einführen von Sequenzveränderungen in mindestens einer der Folgen der beiden Aminosäuren Arginin/Glycin;
– Schutz gegen den Einfluss von denaturierenden Agentien wie Tensiden durch Mutationen, die eine Veränderung der Aminosäuresequenz auf bzw. an der Oberfläche des Proteins bewirken;
– Austausch von Aminosäuren, die nahe dem N-Terminus liegen, gegen solche, die insbesondere über nicht-kovalente Wechselwirkungen mit dem Rest des Moleküls in Kontakt treten und somit einen Beitrag zur Aufrechterhaltung der globulären Struktur leisten.

Bevorzugte Ausführungsformen sind solche, bei denen das Enzym auf mehrere Arten stabilisiert wird, da mehrere stabilisierende Mutationen additiv oder synergistisch wirken.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Polyoloxidase wie vorstehend beschrieben, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie mindestens eine chemische Modifikation aufweist. Eine Polyoloxidase mit einer solchen Veränderung wird als Derivat bezeichnet, d. h. die Polyoloxidase ist derivatisiert.
Unter Derivaten werden im Sinne der vorliegenden Anmeldung demnach solche Proteine verstanden, deren reine Aminosäurekette chemisch modifiziert worden ist. Solche Derivatisierungen können beispielsweise in vivo durch die Wirtszelle erfolgen, die das Protein exprimiert.
Diesbezüglich sind Kopplungen niedrigmolekularer Verbindungen wie von Lipiden oder Oligosacchariden besonders hervorzuheben. Derivatisierungen können aber auch in vitro durchgeführt werden, etwa durch die chemische Umwandlung einer Seitenkette einer Aminosäure oder durch kovalente Bindung einer anderen Verbindung an das Protein. Beispielsweise ist die Kopplung von Aminen an Carboxylgruppen eines Enzyms zur Veränderung des isoelektrischen Punkts möglich. Eine solche andere Verbindung kann auch ein weiteres Protein sein, das beispielsweise über bifunktionelle chemische Verbindungen an ein erfindungsgemäßes Protein gebunden wird. Ebenso ist unter Derivatisierung die kovalente Bindung an einen makromolekularen Träger zu verstehen, oder auch ein nichtkovalenter Einschluss in geeignete makromolekulare Käfigstrukturen. Derivatisierungen können beispielsweise die Substratspezifität oder die Bindungsstärke an das Substrat beeinflussen oder eine vorübergehende Blockierung der enzymatischen Aktivität herbeiführen, wenn es sich bei der angekoppelten Substanz um einen Inhibitor handelt. Dies kann beispielsweise für den Zeitraum der Lagerung sinnvoll sein. Derartige Modifikationen können ferner die Stabilität oder die enzymatische Aktivität beeinflussen. Sie können ferner auch dazu dienen, die Allergenizität und/oder Immunogenizität des Proteins herabzusetzen und damit beispielsweise dessen Hautverträglichkeit zu erhöhen. Beispielsweise können Kopplungen mit makromolekularen Verbindungen, beispielsweise Polyethylenglykol, das Protein hinsichtlich der Stabilität und/oder Hautverträglichkeit verbessern.
Unter Derivaten eines erfindungsgemäßen Proteins können auch Präparationen dieser Proteine verstanden werden. Je nach Gewinnung, Aufarbeitung oder Präparation kann ein Protein mit diversen anderen Stoffen vergesellschaftet sein, beispielsweise aus der Kultur der produzierenden Mikroorganismen. Ein Protein kann auch, beispielsweise zur Erhöhung seiner Lagerstabilität, mit anderen Stoffen gezielt versetzt worden sein. Erfindungsgemäß sind deshalb auch alle Präparationen eines erfindungsgemäßen Proteins. Das ist auch unabhängig davon, ob es in einer bestimmten Präparation tatsächlich diese enzymatische Aktivität entfaltet oder nicht. Denn es kann gewünscht sein, dass es bei der Lagerung keine oder nur geringe Aktivität besitzt, und erst zum Zeitpunkt der Verwendung seine enzymatische Funktion entfaltet. Dies kann beispielsweise über entsprechende Begleitstoffe und/oder über die Verfügbarkeit von Substrat für das Enzym gesteuert werden.
Betreffend alle vorstehend beschriebenen Polyoloxidasen bzw. Polyoloxidase-Varianten und/oder -Derivate sind im Rahmen der vorliegenden Erfindung diejenigen besonders bevorzugt, deren spezifische Aktivität gegenüber dem Ausgangsenzym und/oder gegenüber einer Polyoloxidase gemäß SEQ ID NO. 1 mit zwei zusätzlichen Aminosäuren EA (Glu-Ala) am C-Terminus gesteigert ist, insbesondere beträgt die Steigerung der spezifischen Aktivität mindestens 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 22,5%, 25%, 27,5%, 30%, 32,5%, 35%, 37,5%, 40%, 42,5%, 45%, 47,5%, 50%, und insbesondere mit Glycerin als Substrat.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine Nukleinsäure, die für eine erfindungsgemäße Polyoloxidase codiert, sowie ein Vektor enthaltend eine solche Nukleinsäure, insbesondere ein Klonierungsvektor oder ein Expressionsvektor.
Hierbei kann es sich DNA- oder RNA-Moleküle handeln. Sie können als Einzelstrang, als ein zu diesem Einzelstrang komplementärer Einzelstrang oder als Doppelstrang vorliegen. Insbesondere bei DNA-Molekülen sind die Sequenzen beider komplementärer Stränge in jeweils allen drei möglichen Leserastern zu berücksichtigen. Ferner ist zu berücksichtigen, dass verschiedene Codons, also Basentriplets, für die gleichen Aminosäuren codieren können, so dass eine bestimmte Aminosäuresequenz von mehreren unterschiedlichen Nukleinsäuren codiert werden kann. Auf Grund dieser Degeneriertheit des genetischen Codes sind sämtliche Nukleinsäuresequenzen in diesen Erfindungsgegenstand mit eingeschlossen, die eine der vorstehend beschriebenen Polyoloxidasen codieren können. Der Fachmann ist in der Lage, diese Nukleinsäuresequenzen zweifelsfrei zu bestimmen, da trotz der Degeneriertheit des genetischen Codes einzelnen Codons definierte Aminosäuren zuzuordnen sind. Daher kann der Fachmann ausgehend von einer Aminosäuresequenz für diese Aminosäuresequenz codierende Nukleinsäuren problemlos ermitteln. Weiterhin können bei erfindungsgemäßen Nukleinsäuren ein oder mehrere Codons durch synonyme Codons ersetzt sein. Dieser Aspekt bezieht sich insbesondere auf die heterologe Expression der erfindungsgemäßen Enzyme. So besitzt jeder Organismus, beispielsweise eine Wirtszelle eines Produktionsstammes, eine bestimmte Codon-Usage. Unter Codon-Usage wird die Übersetzung des genetischen Codes in Aminosäuren durch den jeweiligen Organismus verstanden. Es kann zu Engpässen in der Proteinbiosynthese kommen, wenn die auf der Nukleinsäure liegenden Codons in dem Organismus einer vergleichsweise geringen Zahl von beladenen tRNA-Molekülen gegenüberstehen. Obwohl für die gleiche Aminosäure codierend führt das dazu, dass in dem Organismus ein Codon weniger effizient translatiert wird als ein synonymes Codon, das für dieselbe Aminosäure codiert. Auf Grund des Vorliegens einer höheren Anzahl von tRNA-Molekülen für das synonyme Codon kann dieses in dem Organismus effizienter translatiert werden.
Beispiele besonders bevorzugter Nukleinsäuren sind in SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 8 und SEQ ID NO. 10 angegeben. Weitere bevorzugte Nukleinsäuren umfassen eine Nukleinsäuresequenz, die zu einer der in SEQ ID NO. 2, SEQ ID NO. 4, SEQ ID NO. 6, SEQ ID NO. 8 oder SEQ ID NO. 10 angegebenen Nukleinsäuresequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 90,5%, 91%, 91,5%, 92%, 92,5%, 93%, 93,5%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99%, 99,25%, 99,5%, 99,75% oder 100% identisch sind.
Einem Fachmann ist es über heutzutage allgemein bekannte Methoden, wie beispielsweise die chemische Synthese oder die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) in Verbindung mit molekularbiologischen und/oder proteinchemischen Standardmethoden möglich, anhand bekannter DNA- und/oder Aminosäuresequenzen die entsprechenden Nukleinsäuren bis hin zu vollständigen Genen herzustellen. Derartige Methoden sind beispielsweise aus Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. 2001. Molekular cloning: a laboratory manual, 3. Edition Cold Spring Laborstory Press. bekannt.
Unter Vektoren werden im Sinne der vorliegenden Erfindung aus Nukleinsäuren bestehende Elemente verstanden, die als kennzeichnenden Nukleinsäurebereich eine erfindungsgemäße Nukleinsäure enthalten. Sie vermögen diese in einer Spezies oder einer Zellinie über mehrere Generationen oder Zellteilungen hinweg als stabiles genetisches Element zu etablieren. Vektoren sind insbesondere bei der Verwendung in Bakterien spezielle Plasmide, also zirkulare genetische Elemente. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird eine erfindungsgemäße Nukleinsäure in einen Vektor kloniert. Zu den Vektoren zählen beispielsweise solche, deren Ursprung bakterielle Plasmide, Viren oder Bacteriophagen sind, oder überwiegend synthetische Vektoren oder Plasmide mit Elementen verschiedenster Herkunft. Mit den weiteren jeweils vorhandenen genetischen Elementen vermögen Vektoren sich in den betreffenden Wirtszellen über mehrere Generationen hinweg als stabile Einheiten zu etablieren. Sie können extrachomosomal als eigene Einheiten vorliegen oder in ein Chromosom bzw. chromosomale DNA integrieren.
Expressionsvektoren umfassen Nukleinsäuresequenzen, die sie dazu befähigen, in den sie enthaltenden Wirtszellen, vorzugsweise Mikroorganismen, besonders bevorzugt Bakterien, zu replizieren und dort eine enthaltene Nukleinsäure zur Expression zu bringen. Die Expression wird insbesondere von dem oder den Promotoren beeinflusst, welche die Transkription regulieren. Prinzipiell kann die Expression durch den natürlichen, ursprünglich vor der zu exprimierenden Nukleinsäure lokalisierten Promotor erfolgen, aber auch durch einen auf dem Expressionsvektor bereitgestellten Promotor der Wirtszelle oder auch durch einen modifizierten oder einen völlig anderen Promotor eines anderen Organismus oder einer anderen Wirtszelle. Im vorliegenden Fall wird zumindest ein Promotor für die Expression einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure zur Verfügung gestellt und für deren Expression genutzt. Expressionsvektoren können ferner regulierbar sein, beispielsweise durch Änderung der Kultivierungsbedingungen oder bei Erreichen einer bestimmten Zelldichte der sie enthaltenen Wirtszellen oder durch Zugabe von bestimmten Substanzen, insbesondere Aktivatoren der Genexpression. Ein Beispiel für eine solche Substanz ist das Galactose-Derivat Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid (IPTG), welches als Aktivator des bakteriellen Lactose-Operons (lac-Operons) verwendet wird. Im Gegensatz zu Expressionsvektoren wird die enthaltene Nukleinsäure in Klonierungsvektoren nicht exprimiert.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine nicht menschliche Wirtszelle, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure oder einen erfindungsgemäßen Vektor beinhaltet, oder die eine erfindungsgemäße Polyoloxidase beinhaltet. Eine erfindungsgemäße Nukleinsäure bzw. ein erfindungsgemäßer Vektor wird bevorzugt in die Wirtszelle eingebracht durch deren Transformation. Bevorzugt wird eine erfindungsgemäße Nukleinsäure bzw. ein erfindungsgemäßer Vektor in einen Mikroorganismus transformiert, der dann eine erfindungsgemäße Wirtszelle darstellt. Alternativ können auch einzelne Komponenten, d. h. Nukleinsäure-Teile bzw. -Fragmente einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure derart in eine Wirtszelle eingebracht werden, dass die dann resultierende Wirtszelle eine erfindungsgemäße Nukleinsäure bzw. einen erfindungsgemäßen Vektor enthält. Dieses Vorgehen eignet sich besonders dann, wenn die Wirtszelle bereits einen oder mehrere Bestandteile einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure bzw. eines erfindungsgemäßen Vektors enthält und die weiteren Bestandteile dann entsprechend ergänzt werden. Verfahren zur Transformation von Zellen sind im Stand der Technik etabliert und dem Fachmann hinlänglich bekannt. Als Wirtszellen eignen sich prinzipiell alle Zellen, das heißt prokaryotische oder eukaryotische Zellen. Bevorzugt sind solche Wirtszellen, die sich genetisch vorteilhaft handhaben lassen, was beispielsweise die Transformation mit der Nukleinsäure oder dem Vektor und dessen stabile Etablierung angeht, beispielsweise einzellige Pilze oder Bakterien. Ferner zeichnen sich bevorzugte Wirtszellen durch eine gute mikrobiologische und biotechnologische Handhabbarkeit aus. Das betrifft beispielsweise leichte Kultivierbarkeit, hohe Wachstumsraten, geringe Anforderungen an Fermentationsmedien und gute Produktions- und/oder Sekretionsraten für Fremdproteine. Erfindungsgemäße Wirtszellen können auch derart ausgestaltet sein, dass sie das (transgen) exprimierte Protein in das die Wirtszellen umgebende Medium sezernieren. Für normalerweise intrazellulär gebildete Proteine kann dieses beispielsweise erreicht werden durch ein geeignetes Sekretionssystem. Beispiele für solche Sekretionssysteme sind die Kopplung der Proteinsequenz an eine geeignete sekretorische Signalsequenz bzw. sekretorisches Signalpeptid und/oder das Bereitstellen geeigneter Transportsysteme und/oder das Bereitstellen weiterer geeigneter Sekretionsmechanismen, die eine Sekretion des gewünschten Proteins bewirken, oder Kombinationen hiervon. Ferner können die Polyoloxidasen von den sie produzierenden Zellen nach deren Herstellung modifiziert werden, beispielsweise durch Anknüpfung von Zuckermolekülen, Formylierungen, Aminierungen, usw. Solche posttranslationale Modifikationen können die Polyoloxidase funktionell beeinflussen.
Weitere bevorzugte Ausführungsformen stellen solche Wirtszellen dar, die aufgrund genetischer Regulationselemente, die beispielsweise auf dem Vektor zur Verfügung gestellt werden, aber auch von vornherein in diesen Zellen vorhanden sein können, in ihrer Aktivität regulierbar sind.
Beispielsweise durch kontrollierte Zugabe von chemischen Verbindungen, die als Aktivatoren dienen, durch Änderung der Kultivierungsbedingungen oder bei Erreichen einer bestimmten Zelldichte können diese zur Expression angeregt werden. Dies ermöglicht eine wirtschaftliche Produktion der erfindungsgemäßen Proteine. Ein Beispiel für eine solche Verbindung ist IPTG wie vorstehend beschrieben.
Bevorzugte Wirtszellen sind prokaryontische oder bakterielle Zellen. Bakterien zeichnen sich durch kurze Generationszeiten und geringe Ansprüche an die Kultivierungsbedingungen aus. Dadurch können kostengünstige Kultivierungsverfahren bzw. Herstellungsverfahren etabliert werden. Zudem verfügt der Fachmann bei Bakterien in der Fermentationstechnik über einen reichhaltigen Erfahrungsschatz. Für eine spezielle Produktion können aus verschiedensten, im Einzelfall experimentell zu ermittelnden Gründen wie Nährstoffquellen, Produktbildungsrate, Zeitbedarf usw., gramnegative oder grampositive Bakterien geeignet sein.
Bei gramnegativen Bakterien wie beispielsweise Escherichia coli wird eine Vielzahl von Proteinen in den periplasmatischen Raum sezerniert, also in das Kompartiment zwischen den beiden die Zellen einschließenden Membranen. Dies kann für spezielle Anwendungen vorteilhaft sein. Ferner können auch gramnegative Bakterien durch die Bereitstellung eines geeigneten Sekretionssystems so ausgestaltet werden, dass sie die Proteine, die normalerweise intrazellulär oder in den periplasmatischen Raum exprimiert werden, in das das Bakterium umgebende Medium ausschleusen. Grampositive Bakterien wie beispielsweise Bacilli oder Actinomyceten oder andere Vertreter der Actinomycetales besitzen demgegenüber keine äußere Membran, so dass sezernierte Proteine sogleich in das die Bakterien umgebende Medium, in der Regel das Nährmedium, abgegeben werden, aus welchem sich die exprimierten Proteine aufreinigen lassen. Sie können dann aus dem Medium direkt isoliert oder weiter prozessiert werden. Ferner können auch grampositive Bakterien durch die Bereitstellung eines geeigneten Sekretionssystems so ausgestaltet werden, dass sie die Proteine, die normalerweise intrazellulär oder in den periplasmatischen Raum exprimiert werden, in das das Bakterium umgebende Medium ausschleusen. Zudem sind grampositive Bakterien mit den meisten Herkunftsorganismen für technisch wichtige Enzyme verwandt oder identisch und bilden meist selbst vergleichbare Enzyme, so dass sie über eine ähnliche Codon-Usage verfügen und ihr Protein-Syntheseapparat naturgemäß entsprechend ausgerichtet ist. Erfindungsgemäße Wirtszellen können ferner hinsichtlich ihrer Anforderungen an die Kulturbedingungen verändert sein, andere oder zusätzliche Selektionsmarker aufweisen oder noch andere oder zusätzliche Proteine exprimieren. Es kann sich insbesondere auch um solche Wirtszellen handeln, die mehrere Proteine oder Enzyme transgen exprimieren.
Die vorliegende Erfindung ist prinzipiell auf alle Mikroorganismen, insbesondere auf alle fermentierbaren Mikroorganismen, besonders bevorzugt auf solche der Gattung Bacillus oder Escherichia, anwendbar und führt dazu, dass sich durch den Einsatz solcher Mikroorganismen erfindungsgemäße Proteine herstellen lassen. Solche Mikroorganismen stellen dann Wirtszellen im Sinne der Erfindung dar.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist die Wirtszelle dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Bakterium ist, bevorzugt eines, das ausgewählt ist aus der Gruppe der Gattungen von Escherichia, Klebsiella, Bacillus, Staphylococcus, Corynebakterium, Arthrobacter, Streptomyces, Stenotrophomonas und Pseudomonas, weiter bevorzugt eines, das ausgewählt ist aus der Gruppe von Escherichia coli, Klebsiella planticola, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus alcalophilus, Bacillus globigii, Bacillus gibsonii, Bacillus clausii, Bacillus halodurans, Bacillus pumilus, Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Arthrobacter oxidans, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor und Stenotrophomonas maltophilia.
Die Wirtszelle kann aber auch eine eukaryontische Zelle sein, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie einen Zellkern besitzt. Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellt daher eine Wirtszelle dar, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie einen Zellkern besitzt. Im Gegensatz zu prokaryontischen Zellen sind eukaryontische Zellen in der Lage, das gebildete Protein posttranslational zu modifizieren. Beispiele dafür sind Pilze wie Actinomyceten oder Hefen wie Saccharomyces oder Kluyveromyces. Dies kann beispielsweise dann besonders vorteilhaft sein, wenn die Proteine im Zusammenhang mit ihrer Synthese spezifische Modifikationen erfahren sollen, die derartige Systeme ermöglichen. Zu den Modifikationen, die eukaryontische Systeme besonders im Zusammenhang mit der Proteinsynthese durchführen, gehören beispielsweise die Bindung niedermolekularer Verbindungen wie Membrananker oder Oligosaccharide. Derartige Oligosaccharid-Modifikationen können beispielsweise zur Senkung der Allergenizität eines exprimierten Proteins wünschenswert sein. Auch eine Coexpression mit den natürlicherweise von derartigen Zellen gebildeten Enzymen, wie beispielsweise Cellulasen oder Lipasen, kann vorteilhaft sein. Ferner können sich beispielsweise thermophile pilzliche Expressionssysteme besonders zur Expression temperaturbeständiger Proteine oder Varianten eignen.
Die erfindungsgemäßen Wirtszellen werden in üblicher Weise kultiviert und fermentiert, beispielsweise in diskontinuierlichen oder kontinuierlichen Systemen. Im ersten Fall wird ein geeignetes Nährmedium mit den Wirtszellen beimpft und das Produkt nach einem experimentell zu ermittelnden Zeitraum aus dem Medium geerntet. Kontinuierliche Fermentationen zeichnen sich durch Erreichen eines Fließgleichgewichts aus, in dem über einen vergleichsweise langen Zeitraum Zellen teilweise absterben aber auch nachwachsen und gleichzeitig aus dem Medium das gebildete Protein entnommen werden kann.
Erfindungsgemäße Wirtszellen werden bevorzugt verwendet, um erfindungsgemäße Polyoloxidasen herzustellen. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist daher ein Verfahren zur Herstellung einer Polyoloxidase umfassend

a) Kultivieren einer erfindungsgemäßen Wirtszelle
b) Isolieren der Polyoloxidase aus dem Kulturmedium oder aus der Wirtszelle.

Dieser Erfindungsgegenstand umfasst bevorzugt Fermentationsverfahren. Fermentationsverfahren sind an sich aus dem Stand der Technik bekannt und stellen den eigentlichen großtechnischen Produktionsschritt dar, in der Regel gefolgt von einer geeigneten Aufreinigungsmethode des hergestellten Produktes, beispielsweise der erfindungsgemäßen Polyoloxidase. Alle Fermentationsverfahren, die auf einem entsprechenden Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Polyoloxidase beruhen, stellen Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstandes dar.
Fermentationsverfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, dass die Fermentation über eine Zulaufstrategie durchgeführt wird, kommen insbesondere in Betracht. Hierbei werden die Medienbestandteile, die durch die fortlaufende Kultivierung verbraucht werden, zugefüttert. Hierdurch können beträchtliche Steigerungen sowohl in der Zelldichte als auch in der Zellmasse bzw. Trockenmasse und/oder vor allem der Aktivität der interessierenden Polyoloxidase erreicht werden. Ferner kann die Fermentation auch so gestaltet werden, dass unerwünschte Stoffwechselprodukte herausgefiltert oder durch Zugabe von Puffer oder jeweils passende Gegenionen neutralisiert werden.
Die hergestellte Polyoloxidase kann aus dem Fermentationsmedium geerntet werden. Ein solches Fermentationsverfahren Ein solches Fermentationsverfahren erfordert jedoch die Zurverfügungstellung von geeigneten Wirtszellen oder von einem oder mehreren geeigneten Sekretionssystem(en), damit die Wirtszellen die Polyoloxidase in das Fermentationsmedium sezernieren. Ohne Sekretion kann alternativ die Isolation der Polyoloxidase aus der Wirtszelle, d. h. eine Aufreinigung derselben aus der Zellmasse, erfolgen, beispielsweise durch Fällung mit Ammoniumsulfat oder Ethanol, oder durch chromatographische Reinigung.
Alle vorstehend ausgeführten Sachverhalte können zu Verfahren kombiniert werden, um erfindungsgemäße Polyoloxidasen herzustellen.
Die erfindungsgemäß einsetzbaren Polyol-Oxidasen können vorteilhaft in Körperpflegemittel, Haarpflegemittel, Haarwaschmittel; Süßigkeiten, insbesondere zahnpflegende Süßigkeiten, z. B. Bonbons oder Kaugummis; Mund-, Zahn- und Zahnprothesenpflegemittel, Zahnspangenpflegemittel, Kosmetika, Therapeutika, Waschmittel, Reinigungsmittel, Aufhellungsmittel, Bleichmittel, Desinfektionsmittel, Nachspülmittel, Handwaschmittel, Handgeschirrspülmittel, Maschinengeschirrspülmittel und Mittel zur bleichenden oder desinfizierenden Behandlung von Filtermedien, Textilien, Pelzen, Papier, Fellen oder Leder eingebracht werden.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Mittel, das dadurch gekennzeichnet ist, dass es eine erfindungsgemäße Polyoloxidase wie vorstehend beschrieben sowie ein Substrat für die Polyoloxidase enthält. Bevorzugte Substrate sind solche wie vorstehend für die Polyoloxidase beschrieben. Bevorzugt ist das Mittel ein Wasch- oder Reinigungsmittel, ein Bleichmittel, ein Desinfektionsmittel oder ein Kosmetikum. Da erfindungsgemäße Polyoloxidasen vorteilhaft sind für die enzymatische Erzeugung von Wasserstoffperoxid, sind diese Mittel insbesondere für bleichende Anwendungen geeignet und vorteilhaft. Erfindungsgemäß besonders bevorzugt ist das Mittel ein Wasch- oder Reinigungsmittel, ein Bleichmittel oder ein Desinfektionsmittel, insbesondere eines enthaltend ein Bleichsystem, das in der Lage ist, unter Anwendungsbedingungen des Mittels Wasserstoffperoxid zu erzeugen, und gegebenenfalls enthaltend Tensid, organischen und/oder anorganischen Builder sowie sonstige übliche Bestandteile in derartigen Mitteln. Das Bleichsystem besteht hierbei aus einer erfindungsgemäßen Polyoloxidase und einem Substrat für die Polyoloxidase. Das Substrat ist vorzugsweise ein mehrfacher Alkohol, weiter bevorzugt ein Substrat wie vorstehend beschrieben und besonders bevorzugt Glycerin, Sorbitol, Xylitol, Ethylenglycol oder Polyvinylalkohol, insbesondere Glycerin. Ein erfindungsgemäßes Wasch-, Reinigungs-, Bleich- oder Desinfektionsmittel weist vorzugsweise eine Polyoloxidase-Aktivität von 0,1 U/mg bis 5000 U/mg auf und zunehmend bevorzugt von 1 U/mg bis 2000 U/mg, von 5 U/mg bis 1000 U/mg und von 10 U/mg bis 990 U/mg.
Die Menge des im erfindungsgemäßen Mittel enthaltenen Substrats für die Polyoloxidase richtet sich nach der zum Erzielen des gewünschten Bleichergebnisses erforderlichen Wasserstoffperoxidmenge. Insbesondere für erfindungsgemäße Wasch, Reinigungs-, Bleich- oder Desinfektionsmittel kann als Anhaltspunkt dienen, dass bei Enzym-Substrat-Systemen, die pro Mol umgesetztem Substrat ein Mol Wasserstoffperoxid freisetzen, die Anwesenheit von etwa 0,05 Gew.-% bis 1 Gew.-% des Substrats in der Wasch-, Bleich- oder Reinigungsflotte in der Regel zur Erzielung eines guten Bleichergebnisses oder Desinfektionsergebnisses genügt. Beispielsweise beträgt die Substratkonzentration von 0,1 mM bis 1 M und zunehmend bevorzugt von 1–900 mM, 10–800 mM, 25–600 mM, 30–400 mM, 40–200 mM und besonders bevorzugt von 50–100 mM. Falls sich bereits in einer Anschmutzung genügend Substrat befindet, kann gegebenenfalls auch auf die Zugabe von zusätzlichem Substrat verzichtet werden.
Als Waschmittel können hierbei alle festen, flüssigen bzw. fließfähigen, gelförmigen, portionsverpackten oder individuell portionierbaren, pulverförmigen, granulierten, zu Tabletten verpressten, pastenförmigen, versprühbaren oder in sonstigen üblichen Darreichungsformen konfektionierten Mittel zur maschinellen oder manuellen Textilwäsche dienen. Zu den Waschmitteln zählen ferner Waschhilfsmittel, die bei der manuellen oder maschinellen Textilwäsche zum eigentlichen Waschmittel hinzudosiert werden, um eine weitere Wirkung zu erzielen. Zu den Reinigungsmitteln werden alle, ebenfalls in sämtlichen genannten Darreichungsformen vorkommenden Mittel zur Reinigung harter Oberflächen, manuelle und maschinelle Geschirrspülmittel, Teppichreiniger, Scheuermittel, Glasreiniger, WC-Duftspüler, usw. gezählt. Textilvor- und Nachbehandlungsmittel sind schließlich auf der einen Seite solche Mittel, mit denen das Wäschestück vor der eigentlichen Wäsche in Kontakt gebracht wird, beispielsweise zum Anlösen hartnäckiger Verschmutzungen, auf der anderen Seite solche, die in einem der eigentlichen Textilwäsche nachgeschalteten Schritt dem Waschgut weitere wünschenswerte Eigenschaften wie angenehmen Griff, Knitterfreiheit oder geringe statische Aufladung verleihen. Zu letztgenannten Mittel werden u. a. die Weichspüler gerechnet. Desinfektionsmittel sind beispielsweise Händedesinfektionsmittel, Flächendesinfektionsmittel und Instrumentendesinfektionsmittel, die ebenfalls in sämtlichen genannten Darreichungsformen vorkommen können. Ein Desinfektionsmittel bewirkt vorzugsweise eine Keimreduktion um einen Faktor von mindestens 10⁴, das heißt dass von ursprünglich 10.000 vermehrungsfähigen Keimen (so genannte koloniebildende Einheiten – KBE) nicht mehr als ein Einziger überlebt. Bevorzugte Desinfektionsmittel bewirken eine Keimreduktion um einen Faktor von mindestens 10⁵. „Fließfähig” im Sinne der vorliegenden Anmeldung sind dabei Mittel, welche gießbar sind und Viskositäten bis hin zu mehreren 10.000 mPas aufweisen können. Die Viskosität kann mit üblichen Standardmethoden (beispielsweise Brookfleld-Viskosimeter LVT-II bei 20 U/min und 20°C, Spindel 3) gemessen werden und liegt vorzugsweise im Bereich von 5 bis 10000 mPas. Bevorzugte Mittel haben Viskositäten von 10 bis 8000 mPas, wobei Werte zwischen 120 bis 3000 mPas besonders bevorzugt sind. Erfindungsgemäße Bleichmittel zeichnen sich durch eine bleichende Wirkung und/oder Aufhellungsleistung an bleichbaren Materialien oder Gegenständen aus und umfassen ein Bleichsystem, das aus einer erfindungsgemäßen Polyoloxidase und einem Substrat für die Polyoloxidase besteht. Ein erfindungsgemäßes Bleichmittel kann daher auch ein Wasch-, Reinigungs- oder Desinfektionsmittel sein, ist aber nicht auf diese Mittelarten beschränkt.
Erfindungsgemäße Mittel können als solche oder nach Verdünnen mit bzw. Auflösen in Wasser eingesetzt werden. Sofern es sich um ein flüssiges Mittel handelt, kann es als solches eingesetzt werden. Es kann jedoch auch mit insbesondere Wasser verdünnt werden. Eine solche Verdünnung kann leicht hergestellt werden, indem eine abgemessene Menge des Mittels in einer weiteren Menge Wasser verdünnt wird in bestimmten Gewichtsverhältnissen von Mittel:Wasser und optional diese Verdünnung geschüttelt wird, um eine gleichmäßige Verteilung des Mittels im Wasser sicherzustellen. Mögliche Gewichts- oder Volumenverhältnisse der Verdünnungen sind von 1:0 Mittel:Wasser bis 1:10000 oder 1:20000 Mittel:Wasser, vorzugsweise von 1:10 bis 1:2000 Mittel:Wasser. Ferner kann auch eine ursprünglich festes Mittel, also beispielsweise eine pulverförmige Zubereitung oder eine in Tablettenform, in einer Flüssigkeit und vorzugsweise in Wasser gelöst werden.
Die erfindungsgemäßen Mittel, insbesondere Wasch-, Reinigungs-, Bleich- oder Desinfektionsmittel, die als insbesondere pulverförmige Feststoffe, in nachverdichteter Teilchenform, als homogene Lösungen oder Suspensionen vorliegen können, können neben einer erfindungsgemäßen Polyoloxidase alle bekannten und in derartigen Mitteln üblichen Inhaltsstoffe enthalten, wobei bevorzugt mindestens ein weiterer Inhaltsstoff in dem Mittel vorhanden ist. Die erfindungsgemäßen Mittel können insbesondere Tenside, Builder, Persauerstoffverbindungen oder Bleichaktivatoren enthalten. Ferner können sie wassermischbare organische Lösungsmittel, weitere Enzyme, Sequestrierungsmittel, Elektrolyte, pH-Regulatoren und/oder weitere Hilfsstoffe wie optische Aufheller, Vergrauungsinhibitoren, Schaumregulatoren sowie Farb- und Duftstoffe sowie Kombinationen hiervon enthalten.
Insbesondere eine Kombination einer erfindungsgemäßen Polyoloxidase mit einem oder mehreren weiteren Inhaltsstoff(en) des Mittels ist vorteilhaft, da ein solches Mittel eine verbesserte Reinigungs-, Bleich- oder Desinfektionsleistung durch sich ergebende Synergismen aufweist. Insbesondere durch die Kombination einer erfindungsgemäßen Polyoloxidase mit einem der nachfolgend beschriebenen Tenside und/oder einem der nachfolgend beschriebenen Builder und/oder einer der nachfolgend beschriebenen Persauerstoffverbindungen und/oder einem weiteren Enzym, insbesondere einer Perhydrolase, wird ein solcher Synergismus erreicht.
Die erfindungsgemäßen Mittel können ein oder mehrere Tenside enthalten, wobei insbesondere anionische Tenside, nichtionische Tenside und deren Gemische in Frage kommen, aber auch kationische und/oder amphotere Tenside enthalten sein können. Geeignete nichtionische Tenside sind insbesondere Alkylglykoside und Ethoxylierungs- und/oder Propoxylierungsprodukte von Alkylglykosiden oder linearen oder verzweigten Alkoholen mit jeweils 12 bis 18 C-Atomen im Alkylteil und 3 bis 20, vorzugsweise 4 bis 10 Alkylethergruppen. Weiterhin sind entsprechende Ethoxylierungs- und/oder Propoxylierungsprodukte von N-Alkyl-aminen, vicinalen Diolen, Fettsäureestern und Fettsäureamiden, die hinsichtlich des Alkylteils den genannten langkettigen Alkoholderivaten entsprechen, sowie von Alkylphenolen mit 5 bis 12 C-Atomem im Alkylrest brauchbar.
Geeignete anionische Tenside sind insbesondere Seifen und solche, die Sulfat- oder Sulfonat-Gruppen mit bevorzugt Alkaliionen als Kationen enthalten. Verwendbare Seifen sind bevorzugt die Alkalisalze der gesättigten oder ungesättigten Fettsäuren mit 12 bis 18 C-Atomen. Derartige Fettsäuren können auch in nicht vollständig neutralisierter Form eingesetzt werden. Zu den brauchbaren Tensiden des Sulfat-Typs gehören die Salze der Schwefelsäurehalbester von Fettalkoholen mit 12 bis 18 C-Atomen und die Sulfatierungsprodukte der genannten nichtionischen Tenside mit niedrigem Ethoxylierungsgrad. Zu den verwendbaren Tensiden vom Sulfonat-Typ gehören lineare Alkylbenzolsulfonate mit 9 bis 14 C-Atomen im Alkylteil, Alkansulfonate mit 12 bis 18 C-Atomen, sowie Olefinsulfonate mit 12 bis 18 C-Atomen, die bei der Umsetzung entsprechender Monoolefine mit Schwefeltrioxid entstehen, sowie alpha-Sulfofettsäureester, die bei der Sulfonierung von Fettsäuremethyl- oder -ethylestern entstehen.
Derartige Tenside sind in den erfindungsgemäßen Reinigungs- oder Waschmitteln in Mengenanteilen von vorzugsweise 5 Gew.-% bis 50 Gew.-%, insbesondere von 8 Gew.-% bis 30 Gew.-%, enthalten, während die erfindungsgemäßen Desinfektionsmittel wie auch erfindungsgemäße Reinigungsmittel vorzugsweise 0,1 Gew.-% bis 20 Gew.-%, insbesondere 0,2 Gew.-% bis 5 Gew.-% Tenside, enthalten.
Die erfindungsgemäßen Mittel, insbesondere wenn es sich bei ihnen um solche handelt, die für die Behandlung von Textilien vorgesehen sind, können als kationische Aktivsubstanzen mit textilweichmachender Wirkung insbesondere einen oder mehrere der kationischen, textilweichmachenden Stoffe der allgemeinen Formeln X, XI oder XII enthalten:

worin jede Gruppe R¹ unabhängig voneinander ausgewählt ist aus C_1-5-Alkyl, -Alkenyl- oder -Hydroxyalkylgruppen; jede Gruppe R² unabhängig voneinander ausgewählt ist aus C_8-28-Alkyl- oder -Alkenylgruppen; R³ = R¹ oder (CH₂)-T-R²; R⁴ = R¹ oder R² oder (CH₂)-T-R²; T = -CH₂-, -O-CO- oder -CO-O- und n eine ganze Zahl von 0 bis 5 ist. Die kationischen Tenside weisen übliche Anionen in zum Ladungsausgleich notwendiger Art und Anzahl auf, wobei diese neben beispielsweise Halogeniden auch aus den anionischen Tensiden ausgewählt werden können. In bevorzugten Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung kommen als kationische Tenside Hydroxyalkyl-trialkyl-ammonium-verbindungen, insbesondere C_12-18-Alkyl(hydroxyethyl)dimethylammoniumverbindungen, und vorzugsweise deren Halogenide, insbesondere Chloride, zum Einsatz. Ein erfindungsgemäßes Mittel enthält vorzugsweise 0,5 Gew.-% bis 25 Gew.-%, insbesondere 1 Gew.-% bis 15 Gew.-% kationisches Tensid.
Ein erfindungsgemäßes Mittel enthält vorzugsweise mindestens einen wasserlöslichen und/oder wasserunlöslichen, organischen und/oder anorganischen Builder. Zu den wasserlöslichen organischen Buildersubstanzen gehören Polycarbonsäuren, insbesondere Citronensäure und Zuckersäuren, monomere und polymere Aminopolycarbonsäuren, insbesondere Methylglycindiessigsäure, Nitrilotriessigsäure und Ethylendiamintetraessigsäure sowie Polyasparaginsäure, Polyphosphonsäuren, insbesondere Aminotris(methylenphosphonsäure), Ethylendiamintetrakis(methylenphosphonsäure) und 1-Hydroxyethan-1,1-diphosphonsäure, polymere Hydroxyverbindungen wie Dextrin sowie polymere (Poly-)carbonsäuren, insbesondere durch Oxidation von Polysacchariden beziehungsweise Dextrinen zugänglichen Polycarboxylate, und/oder polymere Acrylsäuren, Methacrylsäuren, Maleinsäuren und Mischpolymere aus diesen, die auch geringe Anteile polymerisierbarer Substanzen ohne Carbonsäurefunktionalität einpolymerisiert enthalten können. Die relative Molekülmasse der Homopolymeren ungesättiger Carbonsäuren liegt im allgemeinen zwischen 5 000 und 200 000, die der Copolymeren zwischen 2 000 und 200 000, vorzugsweise 50 000 bis 120 000, jeweils bezogen auf freie Säure. Ein besonders bevorzugtes Acrylsäure-Maleinsäure-Copolymer weist eine relative Molekülmasse von 50 000 bis 100 000 auf. Geeignete, wenn auch weniger bevorzugte Verbindungen dieser Klasse sind Copolymere der Acrylsäure oder Methacrylsäure mit Vinylethern, wie Vinylmethylethern, Vinylester, Ethylen, Propylen und Styrol, in denen der Anteil der Säure mindestens 50 Gew.-% beträgt. Als wasserlösliche organische Buildersubstanzen können auch Terpolymere eingesetzt werden, die als Monomere zwei ungesättigte Säuren und/oder deren Salze sowie als drittes Monomer Vinylalkohol und/oder einem veresterten Vinylalkohol oder ein Kohlenhydrat enthalten. Das erste saure Monomer beziehungsweise dessen Salz leitet sich von einer monoethylenisch ungesättigten C₃-C₈-Carbonsäure und vorzugsweise von einer C₃-C₄-Monocarbonsäure, insbesondere von (Meth)-acrylsäure ab. Das zweite saure Monomer beziehungsweise dessen Salz kann ein Derivat einer C₄-C₈-Dicarbonsäure, wobei Maleinsäure besonders bevorzugt ist, und/oder ein Derivat einer Allylsulfonsäure, die in 2-Stellung mit einem Alkyl- oder Arylrest substituiert ist, sein. Derartige Polymere weisen im Allgemeinen eine relative Molekülmasse zwischen 1 000 und 200 000 auf. Weitere bevorzugte Copolymere sind solche, die als Monomere Acrolein und Acrylsäure/Acrylsäuresalze beziehungsweise Vinylacetat aufweisen. Die organischen Buildersubstanzen können, insbesondere zur Herstellung flüssiger Mittel, in Form wässriger Lösungen, vorzugsweise in Form 30- bis 50-gewichtsprozentiger wässriger Lösungen eingesetzt werden. Alle genannten Säuren werden in der Regel in Form ihrer wasserlöslichen Salze, insbesondere ihre Alkalisalze, eingesetzt.
Derartige organische Buildersubstanzen können gewünschtenfalls in Mengen bis zu 40 Gew.-%, insbesondere bis zu 25 Gew.-% und vorzugsweise von 1 Gew.-% bis 8 Gew.-% enthalten sein. Mengen nahe der genannten Obergrenze werden vorzugsweise in pastenförmigen oder flüssigen, insbesondere wasserhaltigen, erfindungsgemäßen Mitteln eingesetzt.
Als wasserlösliche anorganische Buildermaterialien kommen insbesondere polymere Alkaliphosphate, die in Form ihrer alkalischen neutralen oder sauren Natrium- oder Kaliumsalze vorliegen können, in Betracht. Beispiele hierfür sind Tetranatriumdiphosphat, Dinatriumdihydrogendiphosphat, Pentanatriumtriphosphat, so genanntes Natriumhexametaphosphat sowie die entsprechenden Kaliumsalze beziehungsweise Gemische aus Natrium- und Kaliumsalzen. Als wasserunlösliche, wasserdispergierbare anorganische Buildermaterialien werden insbesondere kristalline oder amorphe Alkalialumosilikate, in Mengen von bis zu 50 Gew.-%, vorzugsweise nicht über 40 Gew.-% und in flüssigen Mitteln insbesondere von 1 Gew.-% bis 5 Gew.-%, eingesetzt. Unter diesen sind die kristallinen Natriumalumosilikate in Waschmittelqualität, insbesondere Zeolith A, P und gegebenenfalls X, bevorzugt. Mengen nahe der genannten Obergrenze werden vorzugsweise in festen, teilchenförmigen Mitteln eingesetzt. Geeignete Alumosilikate weisen insbesondere keine Teilchen mit einer Korngröße über 30 μm auf und bestehen vorzugsweise zu wenigstens 80 Gew.-% aus Teilchen mit einer Größe unter 10 μm. Ihr Calciumbindevermögen, das nach den Angaben der deutschen Patentschrift DE 24 12 837 bestimmt werden kann, liegt in der Regel im Bereich von 100 bis 200 mg CaO pro Gramm.
Geeignete Substitute beziehungsweise Teilsubstitute für das genannte Alumosilikat sind kristalline Alkalisilikate, die allein oder im Gemisch mit amorphen Silikaten vorliegen können. Die in den erfindungsgemäßen Mitteln als Gerüststoffe brauchbaren Alkalisilikate weisen vorzugsweise ein molares Verhältnis von Alkalioxid zu SiO₂ unter 0,95, insbesondere von 1:1,1 bis 1:12 auf und können amorph oder kristallin vorliegen. Bevorzugte Alkalisilikate sind die Natriumsilikate, insbesondere die amorphen Natriumsilikate, mit einem molaren Verhältnis Na₂O:SiO₂ von 1:2 bis 1:2,8. Als kristalline Silikate, die allein oder im Gemisch mit amorphen Silikaten vorliegen können, werden vorzugsweise kristalline Schichtsilikate der allgemeinen Formel Na₂Si_xO_2x ₊₁·yH₂O eingesetzt, in der x, das sogenannte Modul, eine Zahl von 1,9 bis 4 und y eine Zahl von 0 bis 20 ist und bevorzugte Werte für x 2, 3 oder 4 sind. Bevorzugte kristalline Schichtsilikate sind solche, bei denen x in der genannten allgemeinen Formel die Werte 2 oder 3 annimmt. Insbesondere sind sowohl β- als auch δ-Natriumdisilikate (Na₂Si₂O₅·yH₂O) bevorzugt. Auch aus amorphen Alkalisilikaten hergestellte, praktisch wasserfreie kristalline Alkalisilikate der oben genannten allgemeinen Formel, in der x eine Zahl von 1,9 bis 2,1 bedeutet, können in erfindungsgemäßen Mitteln eingesetzt werden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfindungsgemäßer Mittel wird ein kristallines Natriumschichtsilikat mit einem Modul von 2 bis 3 eingesetzt, wie es n aus Sand und Soda hergestellt werden kann. Kristalline Natriumsilikate mit einem Modul im Bereich von 1,9 bis 3,5 werden in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfindungsgemäßer Mittel eingesetzt. In einer bevorzugten Ausgestaltung erfindungsgemäßer Mittel setzt man ein granulares Compound aus Alkalisilikat und Alkalicarbonat ein, wie es zum Beispiel unter dem Namen Nabion^® 15 im Handel erhältlich ist. Falls als zusätzliche Buildersubstanz auch Alkalialumosilikat, insbesondere Zeolith, vorhanden ist, beträgt das Gewichtsverhältnis Alumosilikat zu Silikat, jeweils bezogen auf wasserfreie Aktivsubstanzen, vorzugsweise 1:10 bis 10:1. In Mitteln, die sowohl amorphe als auch kristalline Alkalisilikate enthalten, beträgt das Gewichtsverhältnis von amorphem Alkalisilikat zu kristallinem Alkalisilikat vorzugsweise 1:2 bis 2:1 und insbesondere 1:1 bis 2:1.
Buildersubstanzen sind in den erfindungsgemäßen Mitteln vorzugsweise in Mengen bis zu 60 Gew.-%, insbesondere von 5 Gew.-% bis 40 Gew.-%, enthalten.
Als für den Einsatz in erfindungsgemäßen Mitteln geeignete Persauerstoffverbindungen kommen insbesondere organische Persäuren beziehungsweise persaure Salze organischer Säuren, wie Phthalimidopercapronsäure, Perbenzoesäure oder Salze der Diperdodecandisäure, Wasserstoffperoxid und unter den Waschbedingungen Wasserstoffperoxid abgebende anorganische Salze, zu denen Perborat, Percarbonat, Persilikat und/oder Persulfat wie Caroat gehören, in Betracht. Sofern feste Persauerstoffverbindungen eingesetzt werden sollen, können diese in Form von Pulvern oder Granulaten verwendet werden, die auch in im Prinzip bekannter Weise umhüllt sein können. Falls ein erfindungsgemäßes Mittel Persauerstoffverbindungen enthält, sind diese in Mengen von vorzugsweise bis zu 50 Gew.-%, insbesondere von 5 Gew.-% bis 30 Gew.-%, vorhanden. Der Zusatz geringer Mengen bekannter Bleichmittelstabilisatoren wie beispielsweise von Phosphonaten, Borsten beziehungsweise Metaboraten und Metasilikaten sowie Magnesiumsalzen wie Magnesiumsulfat kann zweckdienlich sein.
Als Bleichaktivatoren können Verbindungen, die unter Perhydrolysebedingungen Peroxocarbonsäuren oder Peroxoimidsäuren bilden, und/oder übliche die Bleiche aktivierende Übergangsmetallkomplexe eingesetzt werden. Die fakultativ, insbesondere in Mengen von 0,5 Gew.-% bis 6 Gew.-%, vorhandene Komponente der Bleichaktivatoren umfasst die üblicherweise verwendeten N- oder O-Acylverbindungen, beispielsweise mehrfach acylierte Alkylendiamine, insbesondere Tetraacetylethylendiamin, acylierte Glykolurile, insbesondere Tetraacetylglykoluril, N-acylierte Hydantoine, Hydrazide, Triazole, Urazole, Diketopiperazine, Sulfurylamide und Cyanurate, außerdem Carbonsäureanhydride, insbesondere Phthalsäureanhydrid, Carbonsäureester, insbesondere Natrium-isononanoyl-phenolsulfonat, und acylierte Zuckerderivate, insbesondere Pentaacetylglukose, sowie kationische Nitrilderivate wie Trimethylammoniumacetonitril-Salze. Die Bleichaktivatoren können zur Vermeidung der Wechselwirkung mit den Perverbindungen bei der Lagerung in bekannter Weise mit Hüllsubstanzen überzogen beziehungsweise granuliert worden sein, wobei mit Hilfe von Carboxymethylcellulose granuliertes Tetraacetylethylendiamin mit mittleren Korngrößen von 0,01 mm bis 0,8 mm, granuliertes 1,5-Diacetyl-2,4-dioxohexahydro-1,3,5-triazin, und/oder in Teilchenform konfektioniertes Trialkylammoniumacetonitril besonders bevorzugt ist. In Wasch- oder Reinigungsmitteln sind derartige Bleichaktivatoren vorzugsweise in Mengen bis zu 8 Gew.-%, insbesondere von 2 Gew.-% bis 6 Gew.-%, jeweils bezogen auf gesamtes Mittel, enthalten.
Ein erfindungsgemäßes Mittel enthält die Polyoloxidase vorteilhafterweise in einer Menge von 2 μg bis 20 mg, vorzugsweise von 5 μg bis 17,5 mg, besonders bevorzugt von 20 μg bis 15 mg und ganz besonders bevorzugt von 50 μg bis 10 mg pro g des Mittels. Ferner kann die in dem Mittel enthaltene Polyoloxidase, und/oder weitere Inhaltsstoffe des Mittels, mit einer bei Raumtemperatur oder bei Abwesenheit von Wasser für das Enzym undurchlässigen Substanz umhüllt sein, welche unter Anwendungsbedingungen des Mittels durchlässig für das Enzym wird. Eine solche Ausführungsform der Erfindung ist somit dadurch gekennzeichnet, dass die Polyoloxidase mit einer bei Raumtemperatur oder bei Abwesenheit von Wasser für die Polyoloxidase undurchlässigen Substanz umhüllt ist. Ferner kann auch das Substrat für die Polyoloxidase mit einer solchen Substanz umhüllt sein. Diesbezüglich bevorzugte Substrate sind solche wie vorstehend für die Polyoloxidase beschrieben. Weiterhin kann auch das Mittel selbst in einem Behältnis, vorzugsweise einem luftdurchlässigen Behältnis, verpackt sein, aus dem es kurz vor Gebrauch oder während seiner Anwendung, beispielsweise während des Wasch,- Reinigungs-, Bleich- oder Desinfektionsvorgangs, freigesetzt wird.
In weiteren Ausführungsformen der Erfindung ist das Mittel dadurch gekennzeichnet, dass es

(a) in fester Form vorliegt, insbesondere als rieselfähiges Pulver mit einem Schüttgewicht von 300 g/l bis 1200 g/l, insbesondere 500 g/l bis 900 g/l, oder
(b) in pastöser oder in flüssiger Form vorliegt, und/oder
(c) als Einkomponentensystem vorliegt, oder
(d) in mehrere Komponenten aufgeteilt ist.

Diese Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen alle festen, pulverförmigen, flüssigen, gelförmigen oder pastösen Darreichungsformen erfindungsgemäßer Mittel, die gegebenenfalls auch aus mehreren Phasen bestehen können sowie in komprimierter oder nicht komprimierter Form vorliegen können. Das Mittel kann als rieselfähiges Pulver vorliegen, insbesondere mit einem Schüttgewicht von 300 g/l bis 1200 g/l, insbesondere 500 g/l bis 900 g/l oder 600 g/l bis 850 g/l. Alternativ kann das Mittel auch flüssig, gelförmig oder pastös sein, beispielsweise in Form eines nicht-wässrigen Flüssigwaschmittels oder einer nicht-wässrigen Paste oder in Form eines wässrigen Flüssigwaschmittels oder einer wasserhaltigen Paste. Weiterhin kann das Mittel als Einkomponentensystem vorliegen. Solche Mittel bestehen bevorzugt aus einer Phase. Alternativ kann ein Mittel auch aus mehreren Phasen bestehen. Ein solches Mittel ist demnach in mehrere Komponenten aufgeteilt.
Die Herstellung erfindungsgemäßer fester Mittel bietet keine Schwierigkeiten und kann auf bekannte Weise, zum Beispiel durch Sprühtrocknen oder Granulation, erfolgen, wobei Enzyme und eventuelle weitere thermisch empfindliche Inhaltsstoffe wie zum Beispiel Bleichmittel gegebenenfalls später separat zugesetzt werden. Zur Herstellung erfindungsgemäßer Mittel mit erhöhtem Schüttgewicht, insbesondere im Bereich von 650 g/l bis 950 g/l, ist ein einen Extrusionschritt aufweisendes Verfahren bevorzugt.
Zur Herstellung von erfindungsgemäßen Mitteln in Tablettenform, die einphasig oder mehrphasig, einfarbig oder mehrfarbig und insbesondere aus einer Schicht oder aus mehreren, insbesondere aus zwei Schichten bestehen können, geht man vorzugsweise derart vor, dass man alle Bestandteile – gegebenenfalls je einer Schicht – in einem Mischer miteinander vermischt und das Gemisch mittels herkömmlicher Tablettenpressen, beispielsweise Exzenterpressen oder Rundläuferpressen, mit Presskräften im Bereich von etwa 50 bis 100 kN, vorzugsweise bei 60 bis 70 kN verpreßt. Insbesondere bei mehrschichtigen Tabletten kann es von Vorteil sein, wenn mindestens eine Schicht vorverpreßt wird. Dies wird vorzugsweise bei Presskräften zwischen 5 und 20 kN, insbesondere bei 10 bis 15 kN durchgeführt. Man erhält so problemlos bruchfeste und dennoch unter Anwendungsbedingungen ausreichend schnell lösliche Tabletten mit Bruch- und Biegefestigkeiten von normalerweise 100 bis 200 N, bevorzugt jedoch über 150 N. Vorzugsweise weist eine derart hergestellte Tablette ein Gewicht von 10 g bis 50 g, insbesondere von 15 g bis 40 g auf. Die Raumform der Tabletten ist beliebig und kann rund, oval oder eckig sein, wobei auch Zwischenformen möglich sind. Ecken und Kanten sind vorteilhafterweise abgerundet. Runde Tabletten weisen vorzugsweise einen Durchmesser von 30 mm bis 40 mm auf. Insbesondere die Größe von eckig oder quaderförmig gestalteten Tabletten, welche überwiegend über die Dosiervorrichtung beispielsweise der Geschirrspülmaschine eingebracht werden, ist abhängig von der Geometrie und dem Volumen dieser Dosiervorrichtung. Beispielhaft bevorzugte Ausführungsformen weisen eine Grundfläche von (20 bis 30 mm) × (34 bis 40 mm), insbesondere von 26 × 36 mm oder von 24 × 38 mm auf.
Flüssige beziehungsweise pastöse erfindungsgemäße Mittel in Form von übliche Lösungsmittel enthaltenden Lösungen werden in der Regel durch einfaches Mischen der Inhaltsstoffe, die in Substanz oder als Lösung in einen automatischen Mischer gegeben werden können, hergestellt. Verfahren zur Herstellung erfindungsgemäßer Mittel stellen demnach einen eigenen Erfindungsgegenstand dar. Alle Verfahren, mit denen ein Mittel, wie es in der vorliegenden Anmeldung beschrieben ist, erhalten werden kann, werden in den Schutzbereich dieses Erfindungsgegenstandes eingeschlossen.
Erfindungsgemäße Mittel können ausschließlich eine Polyoloxidase enthalten. Alternativ können sie auch weitere Enzyme in einer für die Wirksamkeit des Mittels zweckmäßigen Konzentration enthalten. Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellen somit Mittel dar, die ferner eines oder mehrere weitere Enzyme umfassen, wobei prinzipiell alle im Stand der Technik für diese Zwecke etablierten Enzyme einsetzbar sind. Als weitere Enzyme bevorzugt einsetzbar sind alle Enzyme, die in dem erfindungsgemäßen Mittel eine katalytische Aktivität entfalten können, insbesondere eine Protease, Amylase, Cellulase, Hemicellulase, Mannanase, Pectinase, Tannase, Xylanase, Xanthanase, Xyloglucanase, β-Glucosidase, Carrageenase, Perhydrolase, Oxidase, Oxidoreduktase oder eine Lipase, sowie vorzugsweise deren Gemische. Vorteilhafterweise enthält ein erfindungsgemäßes Mittel neben der Polyoloxidase als weiteres Enzym mindestens eine Perhydrolase. Eine Perhydrolase ist ein Enzym, welches in der Lage ist, eine Reaktion zu katalysieren, die zu einer Bildung von Persäure führt. Bevorzugt erfolgt die Bildung einer ausreichenden Menge von Persäure bzw. Persäuren für reinigende, bleichende oder desinfizierende Anwendungen. Eine erfindungsgemäß einzusetzende Perhydrolase ist insbesondere jedes Enzym, welches in der Lage ist, eine perhydrolytische Reaktion zu katalysieren, in der aus mindestens einem Carbonsäureester mit Hilfe von Wasserstoffperoxid mindestens eine Percarbonsäure als bleichendes Agens freigesetzt wird nach folgendem Schema: R1-COOCH₃-R2 + H₂O₂ → R1-COOOH + CH₃-R2-OH, wobei R1 und R2 jeweils beliebige Reste sein können, die identisch oder unterschiedlich sein können, beispielsweise CH₃CH2CH₂COOCH₃ + H₂O₂ → CH₃CH₂CH₂COOOH + CH₃OH.
Erfindungsgemäße Perhydrolasen können unterschiedlichen Enzymklassen angehören, beispielsweise kann es sich um proteolytische Enzyme handeln, die die Perhydrolyse-Reaktion als Nebenaktivität aufweisen, um Arylesterasen, und andere. Relevant für den Einsatz als Perhydrolase ist lediglich die Fähigkeit des Enzyms, die Bildung einer Persäure katalysieren zu können und insbesondere eine der vorstehend genannten Reaktionen katalysieren zu können. Bevorzugte Perhydrolasen sind weiter solche, die ein hohes Verhältnis von Perhydrolyse zu Hydrolse aufweisen. Da viele als erfindungsgemäße Perhydrolasen einsetzbare Enzyme auch hydrolytische Reaktionen katalysieren, ist ein solches Verhältnis vorteilhaft. Besonders bevorzugt ist das Verhältnis von Perhydrolyse zu Hydrolse größer als 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30 in dem jeweiligen Mittel.
Erfindungsgemäße Mittel enthalten Enzyme vorzugsweise in Gesamtmengen von 1 × 10^–8 bis 5 Gewichts-Prozent bezogen auf aktives Protein. Bevorzugt sind die Enzyme von 0,001 bis 5 Gew.-%, weiter bevorzugt von 0,01 bis 5 Gew.-%, noch weiter bevorzugt von 0,05 bis 4 Gew.-% und besonders bevorzugt von 0,075 bis 3,5 Gew.-% in erfindungsgemäßen Mitteln enthalten, wobei jedes enthaltene Enzym in den genannten Mengenverhältnissen vorliegen kann. Die Proteinkonzentration kann mit Hilfe bekannter Methoden, zum Beispiel dem BCA-Verfahren (Bicinchoninsäure; 2,2'-Bichinolyl-4,4'-dicarbonsäure) oder dem Biuret-Verfahren (A. G. Gornall, C. S. Bardawill und M. M. David, J. Biol. Chem., 177 (1948), S. 751–766) bestimmt werden. Die Proteaseaktivität in derartigen Mitteln kann wiederum nach einer in Tenside, Band 7 (1970), S. 125–132 beschriebenen Methode ermittelt werden.
Da erfindungsgemäße Mittel insbesondere auf Grund der vorstehend beschriebenen Eigenschaften der enthaltenen Polyoloxidase vorteilhaft hinsichtlich der enzymatischen Erzeugung von Wasserstoffperoxid sind, insbesondere in einer Waschflotte, Bleichzusammensetzung oder Desinfektionslösung, ist ein weiterer Gegenstand der Erfindung die Verwendung eines erfindungsgemäßen Mittels zur enzymatischen Erzeugung von Wasserstoffperoxid, insbesondere in einer Waschflotte, Bleichzusammensetzung oder Desinfektionslösung. Ferner kann ein erfindungsgemäßes Mittel verwendet werden zur Entfernung von Anschmutzungen, insbesondere von bleichbaren Anschmutzungen, auf Textilien oder harten Oberflächen. Alle Sachverhalte, Gegenstände und Ausführungsformen, die für erfindungsgemäße Mittel beschrieben sind, sind auch auf diese Erfindungsgegenstände anwendbar.
Ein weiterer Erfindungsgegenstand ist ein Verfahren zur enzymatischen Erzeugung von Wasserstoffperoxid, insbesondere in einer Waschflotte, Bleichzusammensetzung oder Desinfektionslösung, das dadurch gekennzeichnet ist, dass in mindestens einem Verfahrensschritt ein erfindungsgemäßes Mittel angewendet ist, oder dass in mindestens einem Verfahrensschritt eine erfindungsgemäße Polyoloxidase oder eine nach einem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltene Polyoloxidase in Gegenwart eines Substrates für die Polyoloxidase katalytisch aktiv ist, insbesondere derart, dass die Polyoloxidase in einer Menge von 40 μg bis 4 g, vorzugsweise von 50 μg bis 3 g, besonders bevorzugt von 100 μg bis 2 g und ganz besonders bevorzugt von 200 μg bis 1 g pro Anwendung eingesetzt ist.
Insbesondere handelt es sich um solche Verfahren, bei denen das Wasserstoffperoxid in situ (an Ort und Stelle) erzeugt wird. Ein solches Verfahren zur enzymatischen Erzeugung von Wasserstoffperoxid wird beispielsweise verwirklicht, wenn ein Waschmittel, eine Bleichzusammensetzung oder eine Desinfektionslösung angewendet wird. Bevorzugte erfindungsgemäße Verfahren sind daher Wasch- oder Reinigungsverfahren, Bleichverfahren oder Desinfektionsverfahren. Hierunter fallen sowohl manuelle als auch maschinelle Verfahren, wobei maschinelle Verfahren bevorzugt sind. Alle denkbaren Verfahren zur enzymatischen Erzeugung von Wasserstoffperoxid können in wenigstens einem der Verfahrensschritte um die Anwendung eines erfindungsgemäßen Mittels oder um die Anwendung einer erfindungsgemäßen Polyoloxidase oder einer nach einem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Polyoloxidase bereichert werden und stellen dann Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar. Alle Sachverhalte, Gegenstände und Ausführungsformen, die für erfindungsgemäße Polyoloxidasen bzw. sie enthaltende Mittel beschrieben sind, sind auch auf diesen Erfindungsgegenstand anwendbar. Daher wird an dieser Stelle ausdrücklich auf die Offenbarung an entsprechender Stelle verwiesen mit dem Hinweis, dass diese Offenbarung auch für die vorstehenden erfindungsgemäßen Verfahren gilt. Bevorzugte Substrate sind insbesondere solche wie vorstehend beschrieben.
Alternative Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstandes stellen auch Verfahren zur Behandlung von Textilrohstoffen oder zur Textilpflege dar. Hierunter sind Verfahren für Textilrohstoffe, Fasern oder Textilien mit natürlichen Bestandteilen bevorzugt, und ganz besonders für solche mit Wolle oder Seide.
Ein weiterer Erfindungsgegenstand ist die Verwendung eines erfindungsgemäßen Mittels zur enzymatischen Erzeugung von Wasserstoffperoxid, insbesondere zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen, zur Bleiche oder zur Desinfektion, oder einer erfindungsgemäßen Polyoloxidase oder einer nach einem erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Polyoloxidase in Gegenwart eines Substrates für die Polyoloxidase zur enzymatischen Erzeugung von Wasserstoffperoxid, insbesondere zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen, zur Bleiche oder zur Desinfektion, insbesondere derart, dass die Polyoloxidase in einer Menge von 40 μg bis 4 g, vorzugsweise von 50 μg bis 3 g, besonders bevorzugt von 100 μg bis 2 g und ganz besonders bevorzugt von 200 μg bis 1 g pro Anwendung eingesetzt ist.
Alle Sachverhalte, Gegenstände und Ausführungsformen, die für erfindungsgemäße Polyoloxidasen bzw. sie enthaltende Mittel beschrieben sind, sind auch auf diesen Erfindungsgegenstand anwendbar. Daher wird an dieser Stelle ausdrücklich auf die Offenbarung an entsprechender Stelle verwiesen mit dem Hinweis, dass diese Offenbarung auch für die vorstehende erfindungsgemäße Verwendung gilt. Bevorzugte Substrate sind insbesondere solche wie vorstehend beschrieben.
Beispiele
Alle molekularbiologischen Arbeitsschritte folgen Standardmethoden, wie sie beispielsweise in dem Handbuch von Fritsch, Sambrook und Maniatis „Molecular cloning: a laboratory manual", Cold Spring Harbour Laborstory Press, New York, 1989, oder vergleichbaren einschlägigen Werken angegeben sind. Enzyme und Baukästen (Kits) wurden nach den Angaben der jeweiligen Hersteller eingesetzt.
Beispiel 1: Erzeugung von Mutanten mit verbesserter spezifischer Aktivität hinsichtlich eines mehrfachen Alkohols als Substrat, beispielsweise Glycerin, mittels Error-Prone PCR:
In dem Wildtyp-Gen gemäß SEQ ID NO. 1 mit N-terminalem His-Tag im pQE80L Vektor (Fa. Qiagen, Hilden) wurden mittels Genemorph II Random Mutagenesis-Kit (Fa. Stratagene, La Jolla, CA 92037, USA) zufällige Mutationen eingeführt. Die Bedingungen für die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) waren wie folgt: 30 ng Vektor-DNA (als Matrize), 5 μl HF Puffer, 1 μl 40 mM dNTP-Mix, 1 μl Mutazymell-Polymerase, je 1,25 μl 10 μM Primer (Muta_pQE_Bamf CGGGATCCATGAGCGACATCACGGTC vgl. SEQ ID NO. 12, Muta_pQE_Hindr CCCAAGCTTCCGCGAGCACCCCGC vgl. SEQ ID NO. 13) ad 50 μl mit bidest. Wasser; Programm: 1:96°C 5 min, 2:96°C 30 s, 3:60°C 30 s, 4:72°C 1,5 min, 30 Zyklen der Schritte 2 bis 4, 5:72°C 10 min. Durch die Primer wurden BamHl und HindIII Schnittstellen eingefügt. Nach Restriktion der durch die PCR erhaltene DNA mit BamHI und HindIII (Fa. Fermentas, St.-Leon-Rot) nach Standardprotokoll wurde der Gen-Pool in pQE80L ligiert und in den Expressionsstamm E. coli 8L21(DE3)Gold transformiert.
Die so erzeugten Mutanten wurden in Deep-Well-Platten kultiviert und auf Wasserstoffperoxid-Bildung auf das Substrat Glycerin hin untersucht. Die Kultivierung erfolgte für 24 h mit 200 Umdrehungen pro Minute (rpm) bei 30°C in 1 ml Overnight Express Autoinduction Kit (Fa. Merck Chemicals Ltd., Nottingham) Medium. Die Zellmasse wurde durch Zentrifugation abgetrennt. Das Zellpellet wurde zum Aufschluss in 50 μl BugBuster-Reagenz mit Benzonase (Fa. Merck Chemicals Ltd., Nottingham) aufgelöst und anschließend durch Zentrifugation geklärt.
In dem erhaltenen Extrakt wurde die Polyoloxidase-Aktivität bestimmt wie vorstehend beschrieben: 30 μl Enzymprobe wurde mit 50 μl Test-Mischung (160 mM Substrat, 0,16 mM Hydroxylaminsulfat als Katalaseinhibitor in 50 mM Glycin-NaOH Puffer pH 10) für 10 Minuten unter Schütteln bei 37°C inkubiert. Dann wurden 100 μl Peroxidreagenz (12,5 mM Chromotropsäure, 1,2 mM 4-Aminoantipyrin in 200 mM Phosphatpuffer pH 5) zugegeben und die Farbreaktion durch Zugabe von 15 μl Peroxidaselösung (104 U/ml in 200 mM Phosphatpuffer pH 5) gestartet. Die Absorption wurde bei 600 nm gemessen.
Beispiel 2: Expression und Reinigung interessanter Mutanten:
Die Expression der heterologen Gene erfolgte in 100 ml des Overnight Express Autoinduction Kits (Merck Chemicals Ltd., Nottingham)-Mediums, Inkubation bei 30°C und 215 rpm in einem 500 ml Erlenmeyerkolben mit Schikanen. Nach 24 Stunden wurde die Zellmasse durch Zentrifugation abgetrennt. Das Zellpellet wurde in 20 ml BugBuster-Reagenz aufgelöst und anschließend durch Zentrifugation geklärt. Die Aufreinigung erfolgte durch Nickel-IMAC („immobilised metal affinity chromatography”) in Anlehnung an die Anweisungen des Herstellers (Fa. Qiagen, Hilden) für die nicht-denaturierende Aufreinigung. Die spezifische Aktivität des Eluats lag unter 1 U/mg, die Reinheit wurde mit einer SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (PAGE) nach Coomassie-Färbung auf ≥ 95% bestimmt.
Die Bestimmung der Poyoloxidase-Aktivität erfolgte mit dem vorstehend beschriebenen Test analog für Anwendung in Küvetten: 150 μl Enzymprobe wurde mit 250 μl Test-Mix (160 mM Substrat, 0,16 mM Hydroxylaminsulfat als Katalaseinhibitor in 50 mM Glycin-NaOH Puffer pH 10) für 10 Minuten unter Schütteln bei 37°C inkubiert. Dann wurden 500 μl Peroxidreagenz (12,5 mM Chromotropsäure, 1,2 mM 4-Aminoantipyrin in 200 mM Phosphatpuffer pH 5) zugegeben und die Farbreaktion durch Zugabe von 75 μl Peroxidaselösung (104 U/mL in 200 mM Phosphatpuffer pH 5) gestartet. Die Absorption wurde bei 600 nm gemessen. Der Proteingehalt wurde mittels BCA-Kit des Unternehmens Uptima (Uptima Interchim, Montluçon, Frankreich) nach Protokoll bestimmt. Die zur Verbesserung der spezifischen Aktivität führenden Mutationen wurden durch Sequenzierung der Mutanten ermittelt.
Beispiel 3: Vergleich der spezifischen Aktivitäten aufgereinigter Polyoloxidase-Varianten hinsichtlich Glycerin als Substrat
Das Vergleichsenzym ist eine Polyoloxidase gemäß SEQ ID NO. 1 mit zwei zusätzlichen Aminosäuren EA (Glu-Ala) am C-Terminus. Die Aktivität dieser Polyoloxidase wird als 100% gewertet. Im Vergleich zu diesem Enzym zeigten erfindungsgemäße Polyoloxidasen folgende spezifische Aktivitäten:

Polyoloxidase 1 (SEQ ID NO. 3): 155%

Polyoloxidase 2 (SEQ ID NO. 5): 113%

Polyoloxidase 3 (SEQ ID NO. 7): 127%

Polyoloxidase 4 (SEQ ID NO. 9): 115%

Polyoloxidase 5 (SEQ ID NO. 11): 109%
Es wird deutlich, dass erfindungsgemäße Polyoloxidasen eine verbesserte spezifische Aktivität hinsichtlich eines mehrfachen Alkohols als Substrat, insbesondere Glycerin, aufweisen.
Sequenzprotokoll – freier Text

V125M, A244T
G399W
V133M
G236D
A64V, G399R
Primer Muta_pQE_Bamf
Primer Muta_pQE_Hindr

ZITATE ENTHALTEN IN DER BESCHREIBUNG
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Zitierte Patentliteratur

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WO 2007/054203 [0003]
WO 2007/045251 [0003]
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Zitierte Nicht-Patentliteratur

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Fritsch, Sambrook und Maniatis „Molecular cloning: a laboratory manual”, Cold Spring Harbour Laborstory Press, New York, 1989 [0102]

Claims

Verfahren zur Veränderung der Substratspezifität einer Polyoloxidase umfassend folgende Verfahrensschritte: a) Bereitstellen einer Polyoloxidase, die eine Aminosäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 83% identisch ist, b) Einbringen von einer oder mehreren der Aminosäuresubstitutionen A64V und/oder V125M und/oder V133M und/oder G236D und/oder A244T und/oder G399W oder G399R in der Zählung gemäß SEQ ID NO. 1 in die Polyoloxidase gemäß a), wobei eine veränderte Substratspezifität der Polyoloxidase nach Schritt b) gegenüber der Polyoloxidase nach Schritt a) mit einem mehrfachen Alkohol als Substrat für die Polyoloxidase bestimmt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Veränderung der Substratspezifität eine Steigerung der spezifischen Aktivität umfasst, insbesondere wobei die Steigerung der spezifischen Aktivität mindestens 1% gegenüber dem Ausgangsenzym beträgt, und/oder der mehrfache Alkohol als Substrat für die Polyoloxidase ausgewählt ist aus a) Zuckeralkoholen, insbesondere unter Mannitol, Sorbitol, Xylitol, Maltitol, Lactitol, Isomalt, Galactitol, Arabitol, Ribitol, Erythritol, Adonitol und Iditol, Glycerin und Ethylenglycol, besonders unter D-Sorbitol, D-Xylitol oder D-Mannitol, ganz besonders unter D-Sorbitol, b) Cycliten, insbesondere unter myo-Inosit, c) Ethylenglycol, 1,4-Butandiol, Polyvinylalkohol oder Glycerin, d) Pseudozuckern, insbesondere unter Pseudopyranosen und Pseudofuranosen, vorzugsweise unter Valiolamin und Valienamin, und/oder die Polyoloxidase eine FAD-abhängige Polyoloxidase ist, und/oder die Polyoloxidase eine Zuckeralkohol-Oxidase, Glycerinoxidase, Sorbitoloxidase oder Xylitoloxidase ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass in Schritt b) eine der folgenden Aminosäuresubstitutionen oder Kombinationen von Aminosäuresubstitutionen in die Polyoloxidase eingebracht werden: V125M/A244T, G399V, V133M, G236D, A64V/G399R.
Polyoloxidase umfassend eine Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 83% identisch ist und eine oder mehrere der Aminosäuresubstitutionen A64V und/oder V125M und/oder V133M und/oder G236D und/oder A244T und/oder G399W oder G399R in der Zählung gemäß SEQ ID NO. 1 aufweist, wobei die Polyoloxidase eine gegenüber der Polyoloxidase gemäß SEQ ID NO. 1 veränderte Substratspezifität aufweist mit einem mehrfachen Alkohol als Substrat für die Polyoloxidase.
Polyoloxidase nach Anspruch 4, dadurch gekennzeichnet, dass die veränderte Substratspezifität eine Steigerung der spezifischen Aktivität umfasst, insbesondere wobei die Steigerung der spezifischen Aktivität mindestens 5% gegenüber der der Polyoloxidase gemäß SEQ ID NO. 1 beträgt, und/oder der mehrfache Alkohol als Substrat für die Polyoloxidase ausgewählt ist aus a) Zuckeralkoholen, insbesondere unter Mannitol, Sorbitol, Xylitol, Maltitol, Lactitol, Isomalt, Galactitol, Arabitol, Ribitol, Erythritol, Adonitol und Iditol, Glycerin und Ethylenglycol, besonders unter D-Sorbitol, D-Xylitol oder D-Mannitol, ganz besonders unter D-Sorbitol, b) Cycliten, insbesondere unter myo-Inosit, c) Ethylenglycol, 1,4-Butandiol, Polyvinylalkohol oder Glycerin, d) Pseudozuckern, insbesondere unter Pseudopyranosen und Pseudofuranosen, vorzugsweise unter Valiolamin und Valienamin, und/oder die Polyoloxidase eine FAD-abhängige Polyoloxidase ist, und/oder die Polyoloxidase eine Zuckeralkohol-Oxidase, Glycerinoxidase, Sorbitoloxidase oder Xylitoloxidase ist.
Polyoloxidase nach Anspruch 4 oder 5, dadurch gekennzeichnet, dass sie eine der folgenden Aminosäuresubstitutionen oder Kombinationen von Aminosäuresubstitutionen aufweist: VI 25M/A244T, G399V, V133M, G236D, A64V/G399R, insbesondere eine, die zu der in SEQ ID NO. 3 oder SEQ ID NO. 5 oder SEQ ID NO. 7 oder SEQ ID NO. 9 oder SEQ ID NO. 11 angegebenen Aminosäuresequenz über deren Gesamtlänge zu mindestens 83% identisch ist.
Nukleinsäure codierend für eine Polyoloxidase nach einem der Ansprüche 4 bis 6 oder codierend für eine nach einem Verfahren der Ansprüche 1 bis 3 erhaltenen Polyoloxidase.
Vektor enthaltend eine Nukleinsäure nach Anspruch 7, insbesondere ein Klonierungsvektor oder ein Expressionsvektor.
Nicht menschliche Wirtszelle, die eine Nukleinsäure nach Anspruch 7 oder einen Vektor nach Anspruch 8 beinhaltet, oder die eine Polyoloxidase nach einem der Ansprüche 4 bis 6 beinhaltet, oder die eine nach einem Verfahren der Ansprüche 1 bis 3 erhaltene Polyoloxidase beinhaltet.
Wirtszelle nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Zellkern besitzt, oder dass sie ein Bakterium ist, bevorzugt eines, das ausgewählt ist aus der Gruppe der Gattungen von Escherichia, Klebsiella, Bacillus, Staphylococcus, Corynebakterium, Arthrobacter, Streptomyces, Stenotrophomonas und Pseudomonas, weiter bevorzugt eines, das ausgewählt ist aus der Gruppe von Escherichia coli, Klebsiella planticola, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus alcalophilus, Bacillus globigii, Bacillus gibsonii, Bacillus pumilus, Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Arthrobacter oxidans, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor und Stenotrophomonas maltophilia.
Verfahren zur Herstellung einer Polyoloxidase umfassend a) Kultivieren einer Wirtszelle gemäß einem der Ansprüche 9 oder 10 b) Isolieren der Polyoloxidase aus dem Kulturmedium oder aus der Wirtszelle.
Mittel, insbesondere ein Wasch- oder Reinigungsmittel, Bleichmittel, Desinfektionsmittel oder Kosmetikum, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens eine Polyoloxidase nach einem der Ansprüche 4 bis 6 oder eine nach einem Verfahren der Ansprüche 1 bis 3 erhaltene Polyoloxidase sowie ein Substrat für die Polyoloxidase enthält, insbesondere in einer Menge von 2 μg bis 20 mg, vorzugsweise von 5 μg bis 17,5 mg, besonders bevorzugt von 20 μg bis 15 mg und ganz besonders bevorzugt von 50 μg bis 10 mg pro g des Mittels, und/oder dass es mindestens eine Polyoloxidase nach einem der Ansprüche 4 bis 6 oder eine nach einem Verfahren der Ansprüche 1 bis 3 erhaltene Polyoloxidase sowie ein Substrat für die Polyoloxidase enthält und die Polyoloxidase in dem Mittel mit einer bei Raumtemperatur oder bei Abwesenheit von Wasser für die Polyoloxidase undurchlässigen Substanz umhüllt ist.
Mittel nach Anspruch 12, dadurch gekennzeichnet, dass es (a) in fester Form vorliegt, insbesondere als rieselfähiges Pulver mit einem Schüttgewicht von 300 g/l bis 1200 g/l, insbesondere 500 g/l bis 900 g/l, oder (b) in pastöser oder in flüssiger Form vorliegt, und/oder (c) als Einkomponentensystem vorliegt, oder (d) in mehrere Komponenten aufgeteilt ist.
Verfahren zur enzymatischen Erzeugung von Wasserstoffperoxid, insbesondere in einer Waschflotte, Bleichzusammensetzung oder Desinfektionslösung, dadurch gekennzeichnet, dass in mindestens einem Verfahrensschritt ein Mittel nach einem der Ansprüche 12 oder 13 angewendet ist, oder dass in mindestens einem Verfahrensschritt eine Polyoloxidase nach einem der Ansprüche 4 bis 6 oder eine nach einem Verfahren der Ansprüche 1 bis 3 erhaltene Polyoloxidase in Gegenwart eines Substrates für die Polyoloxidase katalytisch aktiv ist, insbesondere derart, dass die Polyoloxidase in einer Menge von 40 μg bis 4 g, vorzugsweise von 50 μg bis 3 g, besonders bevorzugt von 100 μg bis 2 g und ganz besonders bevorzugt von 200 μg bis 1 g pro Anwendung eingesetzt ist.
Verwendung eines Mittels nach einem der Ansprüche 12 oder 13 zur enzymatischen Erzeugung von Wasserstoffperoxid, insbesondere zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen, zur Bleiche oder zur Desinfektion, oder einer Polyoloxidase nach einem der Ansprüche 4 bis 6 oder einer nach einem Verfahren der Ansprüche 1 bis 3 erhaltenen Polyoloxidase zur enzymatischen Erzeugung von Wasserstoffperoxid in Gegenwart eines Substrates für die Polyoloxidase, insbesondere zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen, zur Bleiche oder zur Desinfektion, insbesondere derart, dass die Polyoloxidase in einer Menge von 40 μg bis 4 g, vorzugsweise von 50 μg bis 3 g, besonders bevorzugt von 100 μg bis 2 g und ganz besonders bevorzugt von 200 μg bis 1 g pro Anwendung eingesetzt ist.