WO2009019157A1 - Neue proteasen und wasch- und reinigungsmittel, enthaltend diese neuen proteasen - Google Patents

Neue proteasen und wasch- und reinigungsmittel, enthaltend diese neuen proteasen Download PDF

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WO2009019157A1
WO2009019157A1 PCT/EP2008/059844 EP2008059844W WO2009019157A1 WO 2009019157 A1 WO2009019157 A1 WO 2009019157A1 EP 2008059844 W EP2008059844 W EP 2008059844W WO 2009019157 A1 WO2009019157 A1 WO 2009019157A1
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WO
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protease
acid sequence
amino acid
bacillus
seq
Prior art date
Application number
PCT/EP2008/059844
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English (en)
French (fr)
Inventor
Angrit Weber
Susanne Wieland
Karl-Heinz Maurer
Original Assignee
Henkel Ag & Co. Kgaa
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Publication date
Application filed by Henkel Ag & Co. Kgaa filed Critical Henkel Ag & Co. Kgaa
Publication of WO2009019157A1 publication Critical patent/WO2009019157A1/de

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Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14Hydrolases (3)
    • C12N9/48Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus

Definitions

  • the present invention relates to novel subtilisin-type proteases as well as to sufficiently related proteins and their derivatives as well as to their preparation and their use. It also relates to detergents and cleaners with these novel subtilisin-type proteases, well-related proteins and their derivatives, corresponding washing and cleaning processes and their use.
  • proteases of the subtilisin type are particularly important, which are attributed to the serine proteases due to the catalytically active amino acids. They act as nonspecific endopeptidases, that is, they hydrolyze any acid amide linkages that are internal to peptides or proteins. Their pH optimum is usually in the clearly alkaline range.
  • Subtilases become natural formed by microorganisms; Of these, in particular, the subtilisins formed and secreted by Bacillus species are to be mentioned as the most important group within the subtilases.
  • Proteases are, in addition to other enzymes, established active ingredients of detergents and cleaners. They cause the breakdown of protein-containing stains on the items to be cleaned. At best, there are synergies between the enzymes and the remaining components of the funds concerned.
  • the detergent and detergent proteases subtilases occupy an outstanding position due to their favorable enzymatic properties such as stability or pH optimum. They are also suitable for a variety of other technical uses, for example as components of cosmetics or in the organic-chemical synthesis.
  • subtilisin-type proteases preferably used in detergents and cleaners are the subtilisins BPN 'and Carlsberg, the protease PB92, the subtilisins 147 and 309, the alkaline protease from Bacillus lentus, subtilisin DY and those the subtilases, but no longer Enzymes Thermitase, Proteinase K, and Proteases TW3 and TW7, which can be classified as subtilisins in the narrower sense.
  • the subtilisin BPN ' which is derived from Bacillus amyloliquefaciens, or B. subtilis, is known from the work of Vasantha et al. (1984) in J.
  • protease PB92 is naturally derived from the alkaliphilic bacterium Bacillus nov. spec. 92 and was available under the trade name Maxacal® from Gist-Brocades, Delft, The Netherlands. In its original sequence, it is described in the patent application EP 283075 A2.
  • the subtilisins 147 and 309 are sold under the trade names Esperase®, and Savinase® by the company Novozymes. They are originally from Bacillus strains, which are disclosed in the application GB 1243784 A.
  • protease from Bacillus lentus DSM 5483 (WO 91/02792 A1) is derived from the variants described under the name BLAP®, which are described in particular in WO 92/21760 A1, WO 95/23221 A1, WO 02/088340 A2 and WO 03 / 038082 A2.
  • Subtilisin DY is originally from Nedkov et al. Chem., 1985, Biol. Chem. Hoppe-Seyler, Vol. 366, pp. 421-430.
  • proteases are, for example, those under the trade names Durazym®, Relase®, Everlase®, Nafizym, Natalase®, Kannase® and Ovozyme® from Novozymes, which are available under the trade names, Purafect®, Purafect® OxP, Purafect® Prime and Properase ® from Genencor, sold under the trade name Protosol® by Advanced Biochemicals Ltd., Thane, India, under the trade name Wuxi® by Wuxi Snyder Bioproducts Ltd., China, under the trade names Proleather® and Protease P From Amano Pharmaceuticals Ltd., Nagoya, Japan, and that available under the name Proteinase K-16 from Kao Corp., Tokyo, Japan.
  • proteases used in the compositions according to the invention are either originally derived from microorganisms, for example from microorganisms of the genera Bacillus, Streptomyces, Humicola or Pseudomonas, and / or are produced by biotechnological methods known per se by suitable microorganisms, for example by transgenic expression hosts of the genera Bacillus or by filamentous fungi.
  • the classical procedure for obtaining new enzymes is to take samples of microorganisms from natural habitats and to cultivate them under the conditions considered suitable, for example in an alkaline medium. In this way one obtains enrichment cultures of microorganisms, which with a certain probability also Enzymes, including proteases, which are active under the conditions in question. From this, the microorganisms with the most efficient enzymes are then selected and purified or cloned, for example, by plating on proteinaceous agar plates and measuring the lysis farms formed. Such an approach is described, for example, in the textbook "Alkalophilic Microorganisms. A new microbial world "by K. Horikoshi and T. Akiba (1982), Japan Scientific Societies Press, Springer-Verlag, New York, Heidelberg, Berlin, ISBN 0-387-10924-2, Chapter 2, pages 9-26 ,
  • proteases can be used to improve the washing or cleaning performance together with other enzymes, for example amylases, cellulases, hemicellulases, mannanases, ⁇ -glucosidases, oxidases, oxidoreductases or lipases.
  • enzymes for example amylases, cellulases, hemicellulases, mannanases, ⁇ -glucosidases, oxidases, oxidoreductases or lipases.
  • other active ingredients such as bleaching agents or soil release agents.
  • proteases established for use in detergents are also suitable for cosmetic purposes or for organic-chemical synthesis.
  • proteases with different properties, such as the reaction conditions, the stability or the substrate specificity.
  • the technical utility of the proteases depends on other factors such as stability of the enzyme to high temperatures, oxidizing agents, denaturation by surfactants, folding effects, or desired synergies with other ingredients.
  • proteases in particular of the subtilisin type, which have improved stability with respect to the prior art to temperature influences, pH fluctuations, denaturing or oxidizing agents, proteolytic degradation, high temperatures, acidic or have alkaline conditions or against a change in the redox ratios. Other tasks can be seen in a reduced immunogenicity or reduced allergenic effect.
  • a further particular object of the present invention was to find proteases which, at temperatures of from 20 to 60 ° C., have a good washing performance, preferably an improved washing performance, in comparison with the proteases disclosed in the prior art, in particular those of the subtilisin type, exhibit.
  • Another particular object of the present invention has been to find proteases which have an improved detergency with respect to the proteases known in the art with respect to at least one soiling, preferably with respect to several soils.
  • proteases Other subtasks have been to provide nucleic acids encoding such proteases, and to provide vectors, host cells, and methods of production that can be used to obtain such proteases. Furthermore, appropriate means, in particular washing and cleaning agents, appropriate washing and cleaning methods and corresponding uses for such proteases should be made available. Finally, technical applications for the proteases found should be defined.
  • An object of the invention thus forms a protease comprising an amino acid sequence which is selected from the group consisting of a) amino acid sequence corresponding to the in SEQ ID NO. 3 amino acid sequence is at least 94.2% identical. b) Amino acid sequence corresponding to that shown in SEQ ID NO. 2 amino acid sequence is identical to at least 59% identical.
  • nucleic acids corresponding natural cells
  • suitable methods for their identification in particular based on the nucleic acids molecular biological methods and process elements and agents, washing and Detergents, washing and cleaning processes and associated uses of the proteases concerned.
  • the enzyme indicated in SEQ ID NO.3 has a proteolytic activity, so that the proteases are to be regarded as suitable for their use in detergents and cleaners. Due to the DNA provided, an additional optimization of this enzyme is possible, for example via further point mutations. Furthermore, this DNA can be incorporated into shuffling approaches and thus used to generate completely new proteases.
  • an enzyme is to be understood as meaning a protein which has a specific biocatalytic function.
  • protease is understood as meaning an enzyme which catalyzes the hydrolysis of peptide bonds and is thereby able to cleave peptides or proteins.
  • a protein is a polypeptide composed largely of linear structure composed of the natural amino acids and generally assuming a three-dimensional structure in order to perform its function.
  • a peptide consists of amino acids that are covalently linked to each other via peptide bonds.
  • the term polypeptide clarifies in this regard the fact that this peptide chain usually consists of many amino acids, which are connected to each other via peptide bonds.
  • Amino acids may be in an L and a D configuration, with the amino acids that make up proteins in the L configuration. They are called proteinogenic amino acids.
  • the proteinogenic, naturally occurring L-amino acids are designated by the internationally used 1- and 3-letter codes.
  • pre-proteins ie together with a signal peptide.
  • the N-terminal part of the protein the function of which is usually to ensure the discharge of the protein formed from the producing cell into the periplasm or the surrounding medium and / or its correct folding.
  • the signal peptide is cleaved under natural conditions by a signal peptidase from the rest of the protein, so that this exerts its actual catalytic activity without the initially present N-terminal amino acids.
  • Pro-proteins are inactive precursors of proteins. Their signal sequence precursors are referred to as pre-pro proteins.
  • the mature, ie mature, peptides ie the enzymes processed after their preparation, are preferred over the preproteins.
  • the proteins can be modified by the cells producing them after the production of the polypeptide chain, for example by attachment of sugar molecules, formylations, aminations, etc. Such modifications are posttranslational Modifications called. These post-translational modifications may or may not have an effect on the function of the protein.
  • the enzymatic activity of a considered enzyme can be deduced from the amino acid or nucleotide sequence. This can be qualitatively or quantitatively modified by other regions of the protein that are not involved in the actual reaction. This could, for example, relate to enzyme stability, activity, reaction conditions or substrate specificity.
  • Such a comparison is accomplished by associating similar sequences in the nucleotide or amino acid sequences of the proteins of interest. This is called homologization.
  • a tabular assignment of the respective positions is referred to as alignment.
  • alignments are created using computer programs, such as the algorithms FASTA or BLAST; this procedure is described, for example, by D.J. Lipman and W.R. Pearson (1985) in Science, Vol. 227, pp. 1435-1441.
  • a summary of all matching positions in the compared sequences is called a consensus sequence.
  • Such a comparison also allows a statement about the similarity or homology of the compared sequences to each other. This is represented in percent identity, that is the proportion of identical nucleotides or amino acid residues at the same or in an alignment corresponding positions. A broader concept of homology includes the conserved amino acid substitutions in this value. It then speaks of percent similarity. Such statements can be made about whole proteins or genes or only over individual areas.
  • homologous regions of different proteins are defined by matches in amino acid sequence. These can also be identified by identical function. It goes up to complete identities in the smallest areas, so-called boxes, which few Amino acids include and usually perform essential functions for overall activity.
  • the functions of the homologous regions are to be understood as the smallest partial functions of the function carried out by the entire protein, such as, for example, the formation of individual hydrogen bonds for the complexation of a substrate or transition complex.
  • amino acid sequences according to the invention have, as described in the examples for the present application, been derived from nucleic acids isolated from a proteolytically active bacterium from a soil sample.
  • a nucleic acid sequence according to the invention is shown under SEQ ID NO. 1 indicated.
  • This nucleic acid codes for a polypeptide which has a subtilisin-typical division into signal peptide, propeptide and mature protease.
  • the total length protein is shown under SEQ ID NO. 2 and the mature protease under SEQ ID NO. 3 indicated.
  • SEQ ID NO. 2 the mature protease
  • SEQ ID NO. 3 indicated.
  • the amino acid sequence of the mature, active protease is particularly preferred.
  • this protease was added to the "Non-redundant Genbank" (Altschul, Stephan F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Hheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997): "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs"; Nucleic Acids Res., 25, pp.3389-3402.) A homology comparison with the previously known proteases was performed.
  • the protease was identified, which is disclosed as SEQ ID NO.1 in US Patent Application US 2004/0209343. Like all subsequent homology values via the computer program Vector NTI ® Suite 7.0, available from InforMax, Inc., Bethesda, USA, determined with the specified default parameters identity at the amino acid level is 94.1% (see Figure 1) based on the sequence of the mature enzyme according to SEQ ID NO.3, which comprises 307 amino acids. Thus, the protease found is a new enzyme. Thus, all proteases that are at least 94.2% identical to SEQ ID NO. 3 can be included in the scope of protection. The established B.
  • lentus alkaline protease (SEQ ID NO: 4, see also WO 97/21760 A1) gives an identity of 36.5% over the length of this protease at the amino acid level, again based on the mature enzyme.
  • the BLAST query described above resulted in the next similar database entry as the protease according to database entry AAB93489.1 ("toxin degrading protease") .
  • the determined identity at the amino acid level is 58% based on the sequence of the total protein according to SEQ ID NO All proteases which are at least 59% identical to SEQ ID NO. 2 are included in the scope of protection.
  • the protease is characterized in that it comprises an amino acid sequence which is selected from the group consisting of a) amino acid sequence corresponding to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 3, more preferably at least 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.5 % and most preferably 100% identical b) amino acid sequence corresponding to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO.
  • the protease is characterized in that its washing performance corresponds at least to that of a protease which comprises an amino acid sequence which corresponds to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 4, wherein the washing performance is determined in a washing system containing a detergent in a dosage between 4.5 and 7.0 grams per liter of wash liquor and the protease, wherein the proteases to be compared are used in the same activity and the washing performance over a or more of the soils grass, oil / milk, wholegrain / soot or whole egg / pigment, chocolate milk / soot, cocoa and blood / milk, in each case on cotton or polyester fabrics, in particular against one or more of the soils grass EMPA 164, oil / milk PC-10, wholegrain / soot or whole egg / pigment 10N, chocolate milk / carbon black C-03, cocoa EMPA 112 and blood / milk C-05 on cotton 10N, determined by measuring the whiteness of the was
  • Suitable soils are, for example, the commercially available soils EMPA 164 (grass) and EMPA112 (cocoa) from EMPA Testmaterialien AG (St. Gallen, Switzerland), 10 N (whole egg / pigment) from wfk Testgewebe GmbH (Brüggen-Bracht, Germany) and PC 10 (milk / oil), C-03 (chocolate milk / soot) and C-05 (blood / milk) of the Center For test material (CFT, Viaardingen, The Netherlands).
  • EMPA 164 grass
  • EMPA112 cocoa
  • 10 N whole egg / pigment
  • PC 10 milk / oil
  • C-03 chocolate milk / soot
  • C-05 blood / milk
  • a preferred liquid detergent for such a washing system is composed as follows (all figures in weight percent): 0.3- 0.5% xanthan gum, 0.2-0.4% anti-foaming agent, 6-7% glycerol, 0.3-0.5% ethanol, 4-7% FAEOS (fatty alcohol ether sulfate), 24-28% nonionic surfactants, 1% boric acid, 1-2% sodium citrate (dihydrate), 2-4% soda, 14-16% coconut Fatty acids, 0.5% HEDP (1-hydroxyethane- (1, 1-di-phosphonic acid)), 0-0.4% PVP (polyvinylpyrrolidone), 0-0.05% optical brightener, 0-0.001% dye, balance demineralized water.
  • the dosage of the liquid detergent is between 4.5 and 5.5 grams per liter of wash liquor, for example, 4.9 grams per liter of wash liquor. Preference is given to washing in a pH range between pH 8 and pH 10.5, preferably between pH 8 and pH 9.
  • a preferred powdered detergent for such a washing system is composed as follows (all figures in weight percent): 10% linear alkylbenzenesulfonate (sodium salt), 1.5% C12-C18 fatty alcohol sulfate (sodium salt), 2.0% C12-C18 fatty alcohol with 7 EO, 20% sodium carbonate, 6.5% sodium bicarbonate, 4.0% amorphous sodium disilicate, 17% sodium carbonate peroxohydrate, 4.0% TAED, 3.0% polyacrylate, 1.0% carboxymethylcellulose, 1, 0% phosphonate, 25% sodium sulfate, balance: optional foam inhibitors, optical brightener, fragrances and, if necessary, water ad 100%.
  • the dosage of the liquid detergent is between 6.0 and 7.0 grams per liter of wash liquor, for example, 6.7 grams per liter of wash liquor.
  • the degree of whiteness i. the brightening of the stains, is preferably determined by optical measuring methods, preferably photometrically.
  • a suitable device for this purpose is for example the spectrometer Minolta CM508d.
  • the devices used for the measurement are previously calibrated with a white standard, preferably a supplied white standard.
  • the activity-like use ensures that, even if the ratio of active substance to total protein (the values of the specific activity) diverge, the respective enzymatic properties, for example the washing performance of certain soils, are compared. In general, a low specific activity can be compensated by adding a larger amount of protein.
  • Methods for the determination of the protease activities are familiar to the expert in the field of enzyme technology and are routinely used by him. For example, such methods are disclosed in Tenside, Vol. 7 (1970), pp. 125-132.
  • the protease activity is preferably indicated in PE (protease units).
  • suitable protease activities are 5 or 10 PE (protease units) per ml wash liquor. However, the protease activity is not equal to zero.
  • Proteins can also be grouped into groups of immunologically related proteins by reaction with an antiserum or antibody.
  • the members of a group are characterized by having the same antigenic determinant recognized by an antibody.
  • a further subject of the invention therefore proteases, thereby characterized in that they have at least one and increasingly preferably two, three or four matching antigenic determinants with a protease according to the invention.
  • a protease according to the invention is naturally present in an organism which is isolable from a natural habitat.
  • proteases of the invention can then be isolated from their cell extracts or culture supernatants and prepared.
  • Such an organism is preferably a microorganism, preferably a fungus, a Gram-negative or a Gram-positive bacterium, and of these particularly preferably one of the genus Bacillus.
  • a protease according to the invention is characterized in that it is present in the bacterial strain Bacillus sp. DSM ID 01-189 is naturally present.
  • Proteases or enzymes in general can be further developed by various methods, for example targeted genetic modification by mutagenesis methods, and optimized for specific purposes or with regard to specific properties, for example catalytic activity, stability, etc.
  • Changes in the nucleotide sequence as can be brought about, for example, by molecular biological methods known per se, are accordingly termed mutations.
  • mutations are accordingly termed mutations.
  • the associated organisms are called mutants.
  • the proteins derived from mutant nucleic acids are called variants.
  • deletion, insertion, substitution mutations or fusions lead to deletion, insertion, substitution mutated or fusion genes and at the protein level to corresponding deletion, insertion or substitution variants or fusion proteins.
  • the strategy of introducing targeted point mutations into the known molecules is also referred to as rational protein design.
  • a similar performance improvement strategy is to change the surface charges and / or the isoelectric point of the molecules and, above that, their interactions with the substrate.
  • point mutations can alter the net charge of the subtilisins in order to influence substrate binding, in particular for use in detergents and cleaners.
  • Another, and in particular complementary, strategy is to increase the stability of the proteases in question and thereby increase their effectiveness. Such stabilization can be carried out, for example, via coupling to a polymer or, in particular for detergents and cleaners, by point mutations.
  • Fragments are understood as meaning all proteins or peptides which are smaller than natural proteins and, for example, can be obtained synthetically. Due to their amino acid sequences, they can be assigned to the relevant complete proteins. For example, they may adopt the same structures or perform proteolytic or partial activities, such as the complexation of a substrate. Fragments and deletion variants of starting proteins are in principle similar; while fragments tend to be smaller fragments, the deletion mutants tend to lack only short regions, and thus only individual subfunctions.
  • chimeras or hybrid proteins are to be understood as meaning those proteins whose sequence comprises the sequences or partial sequences of at least two Comprising starting proteins.
  • the source proteins may be derived from different or from the same organism.
  • Chimeric or hybrid proteins may be obtained, for example, by recombinant mutagenesis.
  • the purpose of such recombination may be to induce or modify a particular enzymatic function using the fused protein portion.
  • it is irrelevant whether such a chimeric protein consists of a single polypeptide chain or several subunits on which different functions can be distributed.
  • proteins obtained by insertion mutation are meant those variants obtained by inserting a protein fragment into the starting sequences. They are due to their principle similarity to the chimeric proteins. They differ from those only in the size ratio of the unchanged protein part to the size of the entire protein. In such insertionsmut elected proteins, the proportion of foreign protein is lower than in chimeric proteins.
  • Inversion mutagenesis ie a partial sequence reversal
  • derivatives are understood as meaning those proteins whose pure amino acid chain has been chemically modified.
  • derivatizations can be carried out, for example, biologically in connection with protein biosynthesis by the host cell.
  • they can also be carried out chemically, for example by the chemical transformation of a side chain of an amino acid or by covalent binding of another compound to the protein.
  • Such a compound may, for example, also be other proteins which are bound, for example via bifunctional chemical compounds, to proteins according to the invention.
  • modifications may, for example, affect the substrate specificity or binding strength to the substrate or cause a temporary blockage of the enzymatic activity when the coupled substance is an inhibitor. This can be useful, for example, for the period of storage.
  • a further subject of the invention thus represents a protease, which is characterized in that it is obtainable from a protease according to the invention as the starting molecule by fragmentation, deletion, insertion or substitution mutagenesis and an amino acid sequence comprising over a length of at least 300 and increasingly preferably at least 290, 280, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60 and 50 contiguous amino acid positions matches the parent molecule.
  • Insertions and substitutions in subtilases can also give positive results. In principle, this also includes single substitutions of amino acids, but it can also be several contiguous amino acids exchanged for others. This also includes recombinations of larger enzyme sections, such as the above-mentioned fragments, with other proteases or proteins of a different function.
  • proteins according to the invention can also be linked with amylases or cellulases, for example, in order to perform a dual function.
  • a further subject of the invention is a protease, which is characterized in that it is obtainable from a protease according to the invention as the starting molecule and has one or more amino acid substitutions in positions which correspond to the positions 3, 4, 36, 42, 47, 56, 61 , 69, 87, 96, 99, 101, 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141, 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 211, 224, 229, 236, 237 , 242, 243, 255 and 268 of the Bacillus lentus alkaline protease according to SEQ ID NO. 4 are assigned in an alignment.
  • amino acid positions are determined here by an alignment of the amino acid sequence of a protease according to the invention with the amino acid sequence of the alkaline protease from Bacillus lentus, as described in SEQ ID NO. 4 is defined. In this way, so-called homologous positions determined and assigned to each other. An example of such an alignment is given in FIG.
  • a final confirmation in the assignment of homologous positions can ultimately only provide comparative experiments, according to which the two positions assigned to each other on the basis of an alignment in both compared proteases are point mutated in the same way and observed whether in both the enzymatic activity is changed in the same way.
  • BLAP B. lentus alkaline protease
  • the B. lentus alkaline protease is an important reference molecule for the description of new proteases and point mutations in the prior art and the novel proteases described here and thus also their sequence are unknown, it appears advantageous in the assignment of the point mutations to the count the alkaline protease from Bacillus lentus (SEQ ID NO: 4). Furthermore, the count generally depends on the mature (mature) protein.
  • Advantageous positions for sequence alterations, for example by point mutations, of the Bacillus lentus alkaline protease, which are preferably important in transferring to homologous positions of the proteases of the invention and confer advantageous functional properties on the protease, are given below.
  • substitutions 3T and 4I presumably have a stabilizing effect on the molecule to improve its contribution to the washing performance of a detergent or cleaner.
  • Another object of the invention is a protease described above, which is additionally stabilized, in particular by coupling to a polymer.
  • stabilizations are suitable which are possible by virtue of the ultrafilm virtue of the molecule itself (and because of the sequence differences already fall under the embodiments described above). Because these stabilizations require after the protein recovery no further steps.
  • Some point mutations suitable for this purpose are known per se from the prior art. For example, proteases can also be stabilized by replacing certain tyrosine residues with others.
  • Changing the binding of metal ions, in particular the calcium binding sites for example by exchanging one or more of the amino acid involved in the calcium binding for one or more negatively charged amino acids and / or by introducing point mutations in at least one of the sequences of the two amino acids arginine / glycine;
  • Preferred embodiments are those in which the molecule is stabilized in several ways. Because it can be assumed that several stabilizing mutations act additive or synergistic.
  • Another object of the invention is a protease as described above, which is characterized in that it has at least one chemical modification.
  • a protease with such a change is also called a derivative, i. the protease is derivatized.
  • Derivatives are therefore understood as meaning those proteins which are obtained by additional modification from the exported proteins. This is preferably a chemical modification of the proteins according to the invention. Such modifications may affect, for example, stability, substrate specificity, or binding strength to the substrate or enzymatic activity. They can also serve to reduce the allergenicity and / or immunogenicity of the protein and thus, for example, increase its skin compatibility.
  • Such derivatizations in particular chemical modifications, can be carried out, for example, by biological means, for example in connection with protein biosynthesis by the producing host organism.
  • couplings of low molecular weight compounds such as lipids or oligosaccharides are particularly noteworthy.
  • derivatizations can also be carried out chemically, for example by the chemical transformation of a side chain or by covalent bonding of another, for example macromolecular, compound to the protein, for example the coupling of amines to carboxyl groups of an enzyme to alter the isoelectric point.
  • macromolecules such as proteins, for example via bifunctional chemical compounds, can be bound to proteins according to the invention.
  • Such derivatives are particularly suitable for use in detergents or cleaners.
  • protease inhibitors can also be linked to the proteins according to the invention via linkers, in particular amino acid linkers. Couplings with other macromolecular compounds, such as polyethylene glycol, can also enhance the protein for other properties such as stability or skin tolerance.
  • proteins according to the invention can in the broadest sense also be understood as meaning preparations of these proteins.
  • a protein may be associated with various other substances, for example from the culture of the producing microorganisms.
  • a protein may also have been deliberately added to certain other substances, for example to increase its storage stability. Therefore, all preparations of a protein according to the invention are also according to the invention. This is also independent of whether or not it actually exhibits this enzymatic activity in a particular preparation. Because it may be desired that it has no or only low activity during storage, and unfolds its proteolytic function only at the time of use. This can be controlled, for example, via appropriate accompanying substances.
  • nucleic acids are understood to mean the molecules which are naturally constructed from nucleotides and serve as information carriers, which code for the linear amino acid sequence in proteins or enzymes. They can be present as a single strand, as a single strand that is complementary to this single strand, or as a double strand. As the naturally more durable information carrier, the nucleic acid DNA is preferred for molecular biology work. In contrast, for the realization of the invention in a natural environment, such as in an expressing cell, an RNA is formed, which is why essential RNA molecules of the invention are also embodiments of the present invention.
  • the information unit corresponding to a protein is also referred to as gene within the meaning of the present application.
  • a person skilled in the art can use well-known methods such as chemical synthesis or the polymerase chain reaction (PCR) in combination with molecular biological and / or proteinchemical standard methods, using known DNA and / or amino acid sequences, the corresponding nucleic acids to complete genes manufacture.
  • PCR polymerase chain reaction
  • Such methods are, for example, Sambrook, J., Fritsch, EF and Maniatis, T. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd edition CoId Spring Laboratory Press.
  • the nucleic acid molecule which codes for a protease according to the invention is characterized in that it comprises a nucleic acid sequence which is selected from the group consisting of a) nucleic acid sequence which corresponds to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 1 nucleic acid sequence in a portion of at least 300 contiguous nucleotides is at least 59% identical b) nucleic acid sequence corresponding to that shown in SEQ ID NO. 1 is at least 59% identical in the positions 343 to 1269. c) Nucleic acid sequence which corresponds to the nucleic acid sequence shown in SEQ ID NO. 1 nucleic acid sequence is at least 59% identical.
  • the nucleic acid molecule is characterized in that it comprises a nucleic acid sequence which corresponds to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 1, at least 59% and more preferably at least 60%, 65%, 70%, 75%, 80% 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 94.5%, 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.5% and most preferably 100% identical.
  • the nucleic acid molecule which codes for a protease according to the invention is characterized in that it comprises a nucleic acid sequence which corresponds to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 1, at positions 343 to 1269, more preferably at least 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 94.5%. , 95%, 95.5%, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.5%, and most preferably 100% identical.
  • these positions is meant, as explained above, the range coding for the mature, that is also for the active protein.
  • the stop codon is included, because its existence ensures that not a larger, possibly no longer functional, unwanted fusion protein is formed. Thus, in the case of cloning, care must be taken to ensure that a stop codon is also present at this point, if no targeted protein fusion is to be induced via the C-terminus. Should it later turn out that the mature protein is only formed by a part of this sequence, the scope of protection applies accordingly to this part.
  • the nucleic acid molecule is characterized in that it comprises a nucleic acid sequence which corresponds to the amino acid sequence shown in SEQ ID NO. 1 more preferably, at least 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 94.5%, 95%, 95.5 of the indicated nucleic acid sequence %, 96%, 96.5%, 97%, 97.5%, 98%, 98.5%, 99%, 99.5%, and most preferably 100% identical.
  • nucleic acids of which one or preferably several codons have been replaced by synonymous codons are particularly preferred.
  • This aspect relates to the heterologous expression of the proteases in question.
  • every organism in particular every production strain, has a certain codon usage. This can lead to bottlenecks in protein biosynthesis, if the lying on the transgenic nucleic acid codons in the host cell of a relatively small number of loaded tRNAs face. Synonymous codons encode the same amino acids and can be better translated depending on the host. This possibly necessary rewriting thus depends on the choice of the expression system. Especially with samples from unknown, possibly non-cultivable organisms, a corresponding adaptation may be necessary.
  • the present invention involves the production of recombinant proteins.
  • these are to be understood as meaning all genetic engineering or microbiological processes which are based on the genes for the proteins of interest being introduced into a suitable host cell for the production and being transcribed and translated by it.
  • the introduction of the relevant genes via vectors, in particular expression vectors; but also those that cause the gene of interest in the host cell to be inserted into an already existing genetic element, such as the chromosome or other vectors.
  • the functional unit of gene and promoter and any other genetic elements is referred to as expression cassette according to the invention. However, it does not necessarily have to exist as a physical entity.
  • vectors are understood as consisting of nucleic acids which contain a gene of interest as a characteristic nucleic acid region. They can establish this in a species or cell line over several generations or cell divisions as a stable genetic element. Vectors are especially when used in bacteria special plasmids, so circular genetic elements.
  • the nucleic acid is suitably cloned into a vector.
  • Another molecular biological aspect of the invention thus consists in vectors with the genes for the corresponding proteins. These may include, for example, those derived from bacterial plasmids, viruses or bacteriophages, or predominantly synthetic vectors or plasmids with elements of various origins. With the other genetic elements present in each case, vectors are able to establish themselves as stable units in the relevant host cells over several generations. It is irrelevant in the context of the invention whether they establish themselves as extrachomosomal units or integrate into a chromosome or chromosomal DNA. Which of the numerous systems known from the prior art is chosen depends on the individual case. Decisive factors may be, for example, the achievable copy number, the selection systems available, in particular antibiotic resistances, or the cultivability of the host cells capable of accepting the vectors.
  • the vectors form suitable starting points for molecular biological and biochemical investigations of the relevant gene or protein and for further developments according to the invention and ultimately for the amplification and production of proteins according to the invention.
  • a further aspect of the invention thus provides vectors which contain at least one nucleic acid molecule which codes for a protease according to the invention, in particular a nucleic acid molecule as described above.
  • the vector is characterized in that the vector is a cloning vector or an expression vector.
  • Cloning vectors are suitable in addition to the storage, the biological amplification or the selection of the gene of interest for the characterization of the gene in question, such as the creation of a restriction map or sequencing.
  • Cloning vectors are also preferred embodiments of the present invention because they are a transportable and storable form of the claimed DNA. They are also preferred starting points for molecular biology techniques that are not bound to cells, such as the polymerase chain reaction.
  • Expression vectors are chemically similar to the cloning vectors, but differ in those partial sequences that enable them to replicate in the host cells or host organisms optimized for the production of proteins, and there to the gene for expression bring, ie to realize the genetic information of the gene of interest in the host cell as a protein.
  • Preferred embodiments are expression vectors which themselves carry the genetic elements necessary for expression.
  • the expression is influenced, for example, by promoters which regulate the transcription of the gene.
  • expression may be by the natural promoter originally located upstream of this gene, but also by genetic engineering, both by a host cell promoter provided on the expression vector and by a modified or completely different promoter from another organism or host cell.
  • Preferred embodiments are those expression vectors which are regulatable via changes in culture conditions or addition of certain compounds, such as cell density or specific factors, for example inducible vectors.
  • Expression vectors allow the associated protein to be produced heterologously, that is in a cell or host cell other than that from which it can naturally be obtained.
  • the cells may well belong to different organisms or come from different organisms.
  • homologous protein recovery from a gene cell naturally expressing the gene via an appropriate vector is within the scope of the present invention. This may have the advantage that natural translational-related modification reactions on the resulting protein are performed exactly as they would naturally occur.
  • a further embodiment represents expression systems in which additional genes, for example those which are provided on other vectors, influence the production of proteins according to the invention. These may be modifying gene products or those which are to be purified together with the protein according to the invention, for example in order to influence its enzymatic function. These may be, for example, other proteins or enzymes, inhibitors or elements that influence the interaction with various substrates.
  • Alternative embodiments of the present invention may also be cell-free expression systems in which protein biosynthesis is understood in vitro. Such expression systems are also established in the art.
  • Another object of the invention is a non-human host cell, which contains a protease according to the invention or a fragment thereof or which can be excited to produce them, preferably using an expression vector.
  • the in-vivo Synthesis of an enzyme according to the invention ie by living cells, requires the transfer of the associated gene into a host cell, the so-called transformation thereof.
  • all cells that is to say prokaryotic or eukaryotic cells, are suitable as host cells.
  • Preference is given to those host cells which can be handled genetically advantageously, for example, the transformation with the expression vector and / or its stable establishment, for example, unicellular fungi or bacteria.
  • preferred host cells are characterized by good microbiological and biotechnological handling.
  • each protein of the invention can be obtained in this way from a variety of host cells. Also, those host cells are preferred, which are characterized in that they have been obtained after transformation with one of the vectors described above. These may, for example, also be cloning vectors which have been introduced for storage and / or modification, for example in any bacterial strain or another host cell according to the invention. Such steps are common in the storage and further development of related genetic elements. Since the relevant genetic elements can be directly transferred from these host cells into subsequent host cells suitable for expression, the preceding transformation products are also realizations of the subject matter of the invention.
  • Preferred embodiments represent such host cells, which are regulatable in their activity due to genetic regulatory elements which are provided, for example, on the expression vector, but may also be present in these cells from the outset. For example, by controlled addition of chemical compounds that serve as activators, by changing the culture conditions or when reaching a specific cell density, these can be excited for expression. This allows a very economical production of the proteins of interest.
  • Preferred host cells are prokaryotic or bacterial cells.
  • bacteria are distinguished from eukaryotes by shorter generation times and lower demands on culturing conditions.
  • cost-effective methods for obtaining proteins according to the invention can be established.
  • Gram-negative bacteria such as Escherichia coli (E. coli)
  • E. coli Escherichia coli
  • a large number of proteins are secreted into the periplasmic space, ie into the compartment between the two membranes enclosing the cells. This can be advantageous for special applications.
  • Gram-positive bacteria such as, for example, Bacilli or Actinomycetes or other representatives of Actinomycetales, possess no outer membrane, so that secreted proteins are readily released into the nutrient medium surrounding the cells, from which, according to a further preferred embodiment, the expressed proteins according to the invention can be directly purified.
  • a further embodiment of the invention thus represents host cells which are characterized in that they secrete the protease or a fragment thereof into the medium surrounding the host cell.
  • the host cell according to the invention is characterized in that it is a bacterium, in particular one which is selected from the genera of Escherichia, Klebsiella, Bacillus, Staphylococcus, Corynebacterium, Arthrobacter, Streptomyces, Stenotrophomonas and Pseudomonas.
  • the host cell is a bacterium selected from the group of Escherichia coli, Klebsiella planticola, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus alcalophilus, Bacillus globigii, Bacillus gibsonii, Bacillus pumilus, Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Arthrobacter oxidans, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor and Stenotrophomonas maltophilia.
  • the host cells may be altered in their culture conditions requirements, have different or additional selection markers, or express other or additional proteins.
  • these may be those host cells which, in addition to the protein produced according to the invention, also express further, in particular economically interesting, proteins.
  • the host cell may also be a eukaryotic cell, which is characterized in that it has a cell nucleus.
  • a further embodiment of the invention therefore represents a host cell, which is characterized in that it has a cell nucleus.
  • eukaryotic cells are capable of post-translationally modifying the protein formed.
  • fungi such as Actinomycetes or yeasts such as Saccharomyces or Kluyveromyces.
  • yeasts such as Saccharomyces or Kluyveromyces.
  • Modifications that eukaryotic systems perform, especially in connection with protein synthesis include, for example, the binding of low molecular weight compounds such as membrane anchors or oligosaccharides.
  • oligosaccharide modifications can be used, for example, to reduce allergenicity be desirable.
  • coexpression with the enzymes naturally produced by such cells, such as cellulases may be advantageous.
  • thermophilic fungal expression systems may be particularly suitable for the expression of temperature-resistant variants.
  • the host cells according to the invention are cultured and fermented in a manner known per se, for example in discontinuous or continuous systems.
  • a suitable nutrient medium is inoculated with the host cells and the product is harvested from the medium after an experimentally determined period of time.
  • Continuous fermentations are characterized by achieving a flow equilibrium in which over a relatively long period of time cells partly die off but also regrow and at the same time product can be removed from the medium.
  • Fermentation processes are known per se from the prior art and represent the actual large-scale production step, usually followed by a suitable purification method of the product produced, for example the recombinant protein. All fermentation processes which are based on one of the above-described processes for the preparation of the recombinant proteins represent correspondingly preferred embodiments of this subject matter of the invention.
  • the optimum conditions for the production processes used, for the host cells and / or the proteins to be produced must be experimentally determined on the basis of the previously optimized culture conditions of the relevant strains according to the knowledge of the person skilled in the art, for example regarding fermentation volume, media composition, oxygen supply or stirrer speed.
  • Fermentation processes which are characterized in that the fermentation is carried out via a feed strategy, are also contemplated.
  • the media components consumed by the ongoing cultivation are fed;
  • considerable increases in both the cell density and in the dry biomass and / or especially the activity of the protein of interest can be achieved.
  • the fermentation can also be designed so that unwanted metabolic products are filtered out or neutralized by the addition of buffer or matching counterions.
  • the produced protein can be harvested subsequently from the fermentation medium. This fermentation process is preferred over dry matter product processing, but requires the provision of suitable secretion markers and transport systems. Without secretion, the purification of the protein from the cell mass may be required, and various methods are known, such as precipitation, for example, by ammonium sulfate or ethanol, or the chromatographic purification, if necessary, to homogeneity. However, the majority of the described technical methods should manage with an enriched, stabilized preparation.
  • the proteases according to the invention can be made available in the amount required for industrial use.
  • An independent subject matter of the invention thus also provides methods for producing a protease according to the invention.
  • This includes any method which is suitable for producing a protease according to the invention described above or which makes it possible to obtain a protease according to the invention. These include, for example, chemical synthesis methods.
  • nucleotide sequence has been adapted in one, preferably a plurality of codons, to the codon usage of the host strain.
  • An inventive subject matter represents an agent which is characterized in that it contains at least one protease according to the invention as described above.
  • compositions especially mixtures, formulations, solutions, etc., the utility of which is improved by addition of a protein of the invention described above, within the scope of the present invention.
  • these may be, for example, solid mixtures, for example powders with freeze-dried or encapsulated proteins, or gel or liquid agents.
  • Preferred formulations contain, for example, buffer substances, stabilizers, reaction partners and / or cofactors of the proteases and / or other ingredients synergistic with the proteases.
  • this appropriation is to be understood as the areas of application set out below. Further fields of application emerge from the prior art and are described, for example, in the manual "Industrial Enzymes and their Applications" by H. UhNg, Wiley-Verlag, New York, 1998.
  • an agent according to the invention is characterized in that it comprises a detergent, hand washing detergent, dishwashing detergent, hand dishwashing detergent, machine dishwashing detergent, cleaning agent, denture or contact lens care agent, rinse aid, disinfectant, cosmetic agent, pharmaceutical agent or a means for treating filter media, textiles , Furs, paper, skins or leather, especially a laundry detergent or dishwashing detergent.
  • This invention includes all conceivable types of detergents or cleaners, both concentrates and undiluted agents to be used on a commercial scale, in the washing machine or in hand washing or cleaning.
  • detergents for textiles, carpets, or natural fibers for which after present invention, the term detergent is used.
  • An agent according to the invention can be either a means for large consumers or technical users as well as a product for the private consumer, wherein all types of detergents and cleaning agents established in the prior art also constitute embodiments of the present invention.
  • the detergents or cleaning agents according to the invention may contain, in addition to the active ingredient used according to the invention - a protease according to the invention - in principle all known ingredients customary in such agents, where at least another ingredient is present in the agent.
  • the agents according to the invention may in particular be builders, surface-active surfactants, bleaches based on organic and / or inorganic peroxygen compounds, bleach activators, water-miscible organic solvents, enzymes, sequestering agents, electrolytes, pH regulators and other auxiliaries such as optical brighteners, grayness inhibitors, foam regulators and dyes and fragrances and combinations thereof.
  • a combination of a protease according to the invention with one or more further ingredients of the compositions proves to be advantageous, since such an agent has an improved cleaning performance by resulting synergisms, in particular between the protease and the further ingredient.
  • the agent effects an improved removal of stains, for example proteinaceous stains, in comparison with an agent which either contains only one of the two components or also in comparison with the expected cleaning performance of an agent with both components due to the mere addition of respective individual contributions of these two components to the cleaning performance of the agent.
  • the combination of a protease according to the invention with one of the surfactants and / or builders and / or bleaches described below achieves such a synergism.
  • compositions according to the invention may comprise one or more surfactants, in particular anionic surfactants, nonionic surfactants and mixtures thereof, but also cationic, zwitterionic and amphoteric surfactants.
  • Suitable nonionic surfactants are in particular alkyl glycosides and ethoxylation and / or propoxylation of alkyl glycosides or linear or branched alcohols each having 12 to 18 carbon atoms in the alkyl moiety and 3 to 20, preferably 4 to 10 alkyl ether groups.
  • N-alkyl-amines vicinal diols, fatty acid esters and fatty acid amides, which correspond to said long-chain alcohol derivatives with respect to the alkyl moiety, and of alkylphenols having 5 to 12 carbon atoms in the alkyl radical.
  • the nonionic surfactants used are preferably alkoxylated, advantageously ethoxylated, in particular primary, alcohols having preferably 8 to 18 carbon atoms and on average 1 to 12 moles of ethylene oxide (EO) per mole of alcohol, in which the alcohol radical can be linear or preferably methyl-branched in the 2-position or may contain linear and methyl-branched radicals in the mixture, as they are usually present in Oxoalkoholresten.
  • EO ethylene oxide
  • alcohol ethoxylates with linear radicals of alcohols of natural origin having 12 to 18 carbon atoms, for example of coconut, palm, tallow or oleyl alcohol, and on average 2 to 8 EO per mole of alcohol are preferred.
  • Preferred ethoxylated alcohols include, for example, Ci 2 - C 4 alcohols containing 3 EO or 4 EO, C 9 -C i-alcohols containing 7 EO, C 3 -C 5 alcohols containing 3 EO, 5 EO, 7 EO or 8 EO, Ci 2 -Ci 8 alcohols with 3 EO, 5 EO or 7 EO and mixtures of these, such as mixtures of Ci 2 -Ci 4 alcohol with 3 EO and Ci 2 -Ci 8 alcohol with 7 EO.
  • the degrees of ethoxylation given represent statistical means which, for a particular product, may be an integer or a fractional number.
  • Preferred alcohol ethoxylates have a narrow homolog distribution (narrow rank ethoxylates, NRE).
  • fatty alcohols with more than 12 EO can also be used. Examples of these are (TaIg) fatty alcohols with 14 EO, 16 EO, 20 EO, 25 EO, 30 EO or 40 EO.
  • agents for use in mechanical processes usually extremely low-foam compounds are used. These preferably include Ci 2 -C 8 -Alkylpolyethylenglykol- polypropylene glycol ethers containing up to 8 moles of ethylene oxide and propylene oxide units in the molecule.
  • the nonionic surfactants also include alkyl glycosides of the general formula RO (G) x in which R is a primary straight-chain or methyl-branched, in particular 2-methyl-branched aliphatic radical having 8 to 22, preferably 12 to 18 carbon atoms and G represents a glycose unit having 5 or 6 C atoms, preferably glucose.
  • the degree of oligomerization x which indicates the distribution of monoglycosides and oligoglycosides, is any number - the size to be determined analytically as well can take broken values - between 1 and 10; preferably x is 1, 2 to 1, 4.
  • polyhydroxy fatty acid amides of the formula (III) in which R 1 is CO for an aliphatic acyl radical having 6 to 22 carbon atoms, R 2 is hydrogen, an alkyl or hydroxyalkyl radical having 1 to 4 carbon atoms and [Z] is a linear or branched polyhydroxyalkyl radical having 3 to 10 carbon atoms and 3 to 10 hydroxyl groups:
  • the polyhydroxy fatty acid amides are preferably derived from reducing sugars having 5 or 6 carbon atoms, in particular from glucose.
  • the group of polyhydroxy fatty acid amides also includes compounds of the formula (IV)
  • R 3 is a linear or branched alkyl or alkenyl radical having 7 to 12 carbon atoms
  • R 4 is a linear, branched or cyclic alkylene radical or an arylene radical having 2 to 8 carbon atoms
  • R 5 is a linear, branched or cyclic alkyl radical or a Aryl radical or an oxy-alkyl radical having 1 to 8 carbon atoms, wherein dC 4 alkyl or phenyl radicals are preferred
  • [Z] is a linear polyhydroxyalkyl radical whose alkyl chain is substituted with at least two hydroxyl groups, or alkoxylated, preferably ethoxylated or propoxylated derivatives this rest stands.
  • [Z] is also obtained here preferably by reductive amination of a sugar such as glucose, fructose, maltose, lactose, galactose, mannose or xylose.
  • a sugar such as glucose, fructose, maltose, lactose, galactose, mannose or xylose.
  • the N-alkoxy- or N-aryloxy-substituted compounds can then be converted into the desired polyhydroxy fatty acid amides, for example by reaction with fatty acid methyl esters in the presence of an alkoxide as catalyst.
  • nonionic surfactants used either as the sole nonionic surfactant or in combination with other nonionic surfactants, in particular together with alkoxylated fatty alcohols and / or alkyl glycosides, are alkoxylated, preferably ethoxylated or ethoxylated and propoxylated fatty acid alkyl esters, preferably from 1 to 4 carbon atoms in the alkyl chain, especially fatty acid methyl ester.
  • Nonionic surfactants of the amine oxide type for example N-cocoalkyl-N, N-dimethylamine oxide and N-tallowalkyl-N, N-dihydroxyethylamine oxide, and the fatty acid alkanolamides may also be suitable.
  • the amount of these nonionic surfactants is preferably not more than that of the ethoxylated fatty alcohols, especially not more than half thereof.
  • gemini surfactants come so-called gemini surfactants into consideration. These are generally understood as meaning those compounds which have two hydrophilic groups per molecule. These groups are usually separated by a so-called “spacer”. This spacer is typically a carbon chain that should be long enough for the hydrophilic groups to be spaced sufficiently apart for them to act independently of each other.
  • Such surfactants are generally characterized by an unusually low critical micelle concentration and the ability to greatly reduce the surface tension of the water.
  • gemini surfactants not only such "dimer”, but also corresponding to "trimeric” surfactants understood.
  • Suitable gemini surfactants are, for example, sulfated hydroxy mixed ethers or dimer alcohol bis and trimer alcohol tris sulfates and ether sulfates.
  • End-capped dimeric and trimeric mixed ethers are characterized in particular by their bi- and multi-functionality.
  • the end-capped surfactants mentioned have good wetting properties and are low foaming, so that they are particularly suitable for use in machine washing or cleaning processes.
  • gemini-polyhydroxy fatty acid amides or poly-polyhydroxy fatty acid amides it is also possible to use gemini-polyhydroxy fatty acid amides or poly-polyhydroxy fatty acid amides.
  • sulfuric acid monoesters of the straight-chain or branched C 7 -C 2 -substituted alcohols ethoxylated with from 1 to 6 mol of ethylene oxide such as 2-methyl-branched C 9 -C 11 -alcohols having on average 3.5 mol of ethylene oxide (EO) or C 12 C 18 fatty alcohols with 1 to 4 EO.
  • EO ethylene oxide
  • the preferred anionic surfactants also include the salts of alkylsulfosuccinic acid, which are also referred to as sulfosuccinates or as sulfosuccinic acid esters, and the monoesters and / or diesters of sulfosuccinic acid with alcohols, preferably fatty alcohols and in particular ethoxylated fatty alcohols.
  • alcohols preferably fatty alcohols and in particular ethoxylated fatty alcohols.
  • Preferred sulfosuccinates contain C 8 - to C 18 - fatty alcohol residues or mixtures of these.
  • Particularly preferred sulfosuccinates contain a fatty alcohol residue derived from ethoxylated fatty alcohols, which by themselves are nonionic surfactants.
  • Sulfosuccinates whose fatty alcohol residues are derived from ethoxylated fatty alcohols with a narrow homolog distribution, are again particularly preferred.
  • alk (en) ylsuccinic acid having preferably 8 to 18 carbon atoms in the alk (en) yl chain or salts thereof.
  • Suitable further anionic surfactants are fatty acid derivatives of amino acids, for example N-methyltaurine (Tauride) and / or N-methylglycine (sarcosides).
  • sarcosides or the sarcosinates and here especially sarcosinates of higher and optionally monounsaturated or polyunsaturated fatty acids such as oleyl sarcosinate.
  • anionic surfactants are particularly soaps into consideration.
  • Particularly suitable are saturated fatty acid soaps, such as the salts of lauric acid, myristic acid, palmitic acid, stearic acid, hydrogenated erucic acid and behenic acid and, in particular, soap mixtures derived from natural fatty acids, for example coconut, palm kernel or tallow fatty acids. Together with these soaps or as a substitute for soaps, it is also possible to use the known alkenylsuccinic acid salts.
  • the anionic surfactants may be in the form of their sodium, potassium or ammonium salts and as soluble salts of organic bases, such as mono-, di- or triethanolamine.
  • the anionic surfactants are preferably present in the form of their sodium or potassium salts, in particular in the form of the sodium salts.
  • Surfactants are present in inventive compositions in proportions of preferably 5 wt .-% to 50 wt .-%, in particular from 8 wt .-% to 30 wt .-%.
  • An agent according to the invention preferably contains at least one water-soluble and / or water-insoluble, organic and / or inorganic builder.
  • the water-soluble organic builder substances include polycarboxylic acids, in particular citric acid and sugar acids, monomeric and polymeric aminopolycarboxylic acids, in particular methylglycine diacetic acid, nitrilotriacetic acid and ethylenediaminetetraacetic acid and polyaspartic acid, polyphosphonic acids, in particular aminotris (methylenephosphonic acid), ethylenediaminetetrakis (methylenephosphonic acid) and 1-hydroxyethane-1, 1-diphosphonic acid, polymeric hydroxy compounds such as dextrin and polymeric (poly) carboxylic acids, in particular the accessible by oxidation of polysaccharides or dextrins polycarboxylates, polymeric acrylic acids, methacrylic acids, maleic acids and copolymers thereof, which also small amounts of polymerizable substances without carboxylic acid functionality
  • the molecular weight of the homopolymers of unsaturated carboxylic acids is generally between 3,000 and 200,000, of the copolymers between 2,000 and 200,000, preferably 30,000 to 120,000, each based on the free acid.
  • a particularly preferred acrylic acid-maleic acid copolymer has a molecular weight of from 30,000 to 100,000.
  • Commercially available products are, for example, Sokalan® CP 5, CP 10 and PA 30 from BASF.
  • Suitable, although less preferred, compounds of this class are copolymers of acrylic acid or methacrylic acid with vinyl ethers, such as vinylmethyl ethers, vinyl esters, ethylene, propylene and styrene, in which the proportion of the acid is at least 50% by weight.
  • the first acidic monomer or its salt is derived from a monoethylenically unsaturated C 3 -C 8 -carboxylic acid and preferably from a C 3 -C 4 -monocarboxylic acid, in particular from (meth) -acrylic acid.
  • the second acidic monomer or its salt may be a derivative of a C 4 -C 8 -dicarboxylic acid, with maleic acid being particularly preferred, and / or a derivative of an allylsulfonic acid substituted in the 2-position with an alkyl or aryl radical.
  • Such polymers generally have a molecular weight between 1,000 and 200,000.
  • Further preferred copolymers are those which preferably have as monomers acrolein and acrylic acid / acrylic acid salts or vinyl acetate.
  • the organic builder substances can, in particular, for the preparation of liquid agents, in the form of aqueous solutions, preferably in the form of 30 to 50 weight percent aqueous solutions. All of the acids mentioned are generally used in the form of their water-soluble salts, in particular their alkali metal salts.
  • organic builder substances may be present in amounts of up to 40% by weight, in particular up to 25% by weight and preferably from 1% by weight to 8% by weight. Quantities close to the stated upper limit are preferably used in paste-form or liquid, in particular water-containing, agents according to the invention.
  • Suitable water-soluble inorganic builder materials are, in particular, alkali metal silicates, alkali metal carbonates and alkali metal phosphates, which may be in the form of their alkaline, neutral or acidic sodium or potassium salts.
  • alkali metal silicates alkali metal carbonates and alkali metal phosphates, which may be in the form of their alkaline, neutral or acidic sodium or potassium salts.
  • examples of these are trisodium phosphate, tetra sodium diphosphate, disodium dihydrogen diphosphate, pentasodium triphosphate, so-called sodium hexametaphosphate, oligomeric trisodium phosphate with degrees of oligomerization of from 5 to 1000, in particular from 5 to 50, and the corresponding potassium salts or mixtures of sodium and potassium salts.
  • Crystalline or amorphous alkali metal aluminosilicates in amounts of up to 50% by weight, preferably not more than 40% by weight, and in liquid agents, in particular from 1% by weight to 5% by weight, are particularly suitable as water-insoluble, water-dispersible inorganic builder materials.
  • suitable aluminosilicates have no particles with a particle size greater than 30 .mu.m and preferably consist of at least 80% by weight of particles having a size of less than 10 .mu.m.
  • Their calcium binding capacity which can be determined according to the specifications of the German patent DE 24 12 837, is generally in the range of 100 to 200 mg CaO per gram.
  • Suitable substitutes or partial substitutes for the said aluminosilicate are crystalline alkali silicates which may be present alone or in a mixture with amorphous silicates.
  • the alkali metal silicates useful as builders in the compositions according to the invention preferably have a molar ratio of alkali metal oxide to SiO 2 of less than 0.95, in particular of 1: 1, 1 to 1: 12, and may be amorphous or crystalline.
  • Preferred alkali metal silicates are the sodium silicates, in particular the amorphous sodium silicates, with a molar ratio of Na 2 O: SiO 2 of 1: 2 to 1: 2.8.
  • the crystalline silicates which may be present alone or in admixture with amorphous silicates, are crystalline layer silicates with the general formula Na 2 Si x O 2x + I y H 2 O are used in which x, known as the modulus, an integer of 1, 9 to 22, in particular 1, 9 to 4 and y is a number from 0 to 33 and preferred values for x are 2, 3 or 4.
  • Preferred crystalline layered silica Silicates are those in which x in the abovementioned general formula assumes the values 2 or 3. In particular, both ⁇ - and ⁇ -sodium disilicates (Na 2 Si 2 O 5 y H 2 O) are preferred.
  • amorphous alkali silicates practically anhydrous crystalline alkali silicates of the abovementioned general formula in which x is a number from 1, 9 to 2.1, can be used in inventive compositions.
  • a crystalline sodium layer silicate with a modulus of 2 to 3 is used, as can be prepared from sand and soda. Crystalline sodium silicates with a modulus in the range of 1.9 to 3.5 are used in a further preferred embodiment of compositions according to the invention.
  • Crystalline layer-form silicates of formula (I) given above are sold by Clariant GmbH under the trade name Na-SKS, eg Na-SKS-1 (Na 2 Si 22 O 45 XH 2 O, Kenyaite), Na-SKS-2 (Na 2 Si 14 O 29 XH 2 O, magadiite), Na-SKS-3 (Na 2 Si 8 O 17 XH 2 O) or Na-SKS-4 (Na 2 Si 4 O 9 XH 2 O, makatite).
  • Na-SKS eg Na-SKS-1 (Na 2 Si 22 O 45 XH 2 O, Kenyaite)
  • Na-SKS-2 Na 2 Si 14 O 29 XH 2 O, magadiite
  • Na-SKS-3 Na 2 Si 8 O 17 XH 2 O
  • Na-SKS-4 Na 2 Si 4 O 9 XH 2 O, makatite
  • Na-SKS-5 OC-Na 2 Si 2 O 5
  • Na-SKS-7 ⁇ -Na 2 Si 2 0 5 , natrosilite
  • Na-SKS-9 NaHSi 2 O 5 3H 2 O
  • Na-SKS-10 NaHSi 2 O 5 3H 2 O, kanemite
  • Na-SKS-11 t-Na 2 Si 2 0 5
  • Na-SKS-13 NaHSi 2 O 5
  • Na-SKS-6 5-Na 2 Si 2 O 5 .
  • composition according to the invention a granular compound of crystalline phyllosilicate and citrate, of crystalline phyllosilicate and of the above-mentioned (co-) polymeric polycarboxylic acid, or of alkali silicate and alkali metal carbonate, such as, for example, commercially available under the name Nabion® 15, is used ,
  • Builder substances are preferably present in the compositions according to the invention in amounts of up to 75% by weight, in particular 5% by weight to 50.
  • suitable peroxygen compounds are in particular organic peracids or pers acid salts of organic acids, such as phthalimidopercaproic acid, perbenzoic acid or salts of diperdodecanedioic acid, hydrogen peroxide and under the washing conditions hydrogen peroxide donating inorganic salts, which include perborate, percarbonate, persilicate and / or persulfate Caroat belong into consideration.
  • organic peracids or pers acid salts of organic acids such as phthalimidopercaproic acid, perbenzoic acid or salts of diperdodecanedioic acid, hydrogen peroxide and under the washing conditions hydrogen peroxide donating inorganic salts, which include perborate, percarbonate, persilicate and / or persulfate Caroat belong into consideration.
  • solid peroxygen compounds are to be used, they can be used in the form of powders or granules, which can also be enveloped in a manner known in principle.
  • an agent according to the invention contains peroxygen compounds, they are present in amounts of preferably up to 50% by weight, in particular from 5% by weight to 30% by weight.
  • bleach stabilizers such as phosphonates, borates or metaborates and metasilicates and magnesium salts such as magnesium sulfate may be useful.
  • bleach activators it is possible to use compounds which, under perhydrolysis conditions, give aliphatic peroxycarboxylic acids having preferably 1 to 10 C atoms, in particular 2 to 4 C atoms, and / or optionally substituted perbenzoic acid.
  • aliphatic peroxycarboxylic acids having preferably 1 to 10 C atoms, in particular 2 to 4 C atoms, and / or optionally substituted perbenzoic acid.
  • suitable Substances which carry O- and / or N-acyl groups of said C atom number and / or optionally substituted benzoyl groups.
  • polyacylated alkylenediamines in particular tetraacetylethylenediamine (TAED), acylated triazine derivatives, in particular 1,5-diacetyl-2,4-dioxohexahydro-1,3,5-triazine (DADHT), acylated glycolurils, in particular tetraacetylglycoluril (TAGU), N- Acylimides, in particular N-nonanoylsuccinimide (NOSI), acylated phenolsulfonates, in particular n-nonanoyl or isononanoyloxybenzenesulfonate (n- or iso-NOBS), carboxylic anhydrides, in particular phthalic anhydride, acylated polyhydric alcohols, in particular triacetin, ethylene glycol diacetate, 2,5-diacetoxy- 2,5-dihydrofuran and enol esters
  • TAED
  • hydrophilic substituted acyl acetals and the acyl lactams are also preferably used.
  • Combinations of conventional bleach activators can also be used.
  • Such bleach activators can, in particular in the presence of the abovementioned hydrogen peroxide-supplied bleach, in the usual amount range, preferably in amounts of from 0.5 wt .-% to 10 wt .-%, in particular 1 wt .-% to 8 wt .-%, based on However, total agent, be included, missing when using percarboxylic acid as the sole bleach, preferably completely.
  • sulfone imines and / or bleach-enhancing transition metal salts or transition metal complexes may also be present as so-called bleach catalysts.
  • organic solvents which can be used in addition to water include alcohols having 1 to 4 C atoms, in particular methanol, ethanol, isopropanol and tert-butanol, diols having 2 to 4 C -Ato- men, in particular ethylene glycol and propylene glycol, and mixtures thereof and derived from the said classes of compounds ethers.
  • Such water-miscible solvents are preferably present in the compositions according to the invention in amounts of not more than 30% by weight, in particular from 6% by weight to 20% by weight.
  • the compositions according to the invention may contain system and environmentally acceptable acids, in particular citric acid, acetic acid, tartaric acid, malic acid, lactic acid, glycolic acid, succinic acid, glutaric acid and / or adipic acid, but also mineral acids, in particular sulfuric acid, or bases, in particular ammonium or alkali metal hydroxides.
  • Such pH regulators are present in the compositions according to the invention in amounts of preferably not more than 20% by weight, in particular from 1.2% by weight to 17% by weight.
  • Graying inhibitors have the task of keeping suspended from the textile fiber dirt suspended in the fleet.
  • Water-soluble colloids of mostly organic nature are suitable for this purpose, for example starch, glue, gelatin, salts of ether carboxylic acids or ether sulfonic acids of starch or of cellulose or salts of acidic sulfuric acid esters of cellulose or starch.
  • water-soluble polyamides containing acidic groups are suitable for this purpose.
  • starch derivatives can be used, for example aldehyde starches.
  • cellulose ethers such as carboxymethylcellulose (Na salt), methylcellulose, hydroxyalkylcellulose and mixed ethers, such as methylhydroxyethylcellulose, methylhydroxypropylcellulose, methylcarboxymethylcellulose and mixtures thereof, for example in amounts of from 0.1 to 5% by weight, based on the compositions ,
  • Detergents according to the invention may contain, for example, derivatives of diaminostilbenedisulfonic acid or their alkali metal salts as optical brighteners, although they are preferably free of optical brighteners for use as color detergents.
  • optical brighteners for use as color detergents.
  • salts of 4,4'-bis (2-anilino-4-morpholino-1, 3,5-triazinyl-6-amino) stilbene-2,2'-disulphonic acid or compounds of similar construction which are used instead of the morpholino Group carry a diethanolamino group, a methylamino group, an anilino group or a 2-methoxyethylamino group.
  • brighteners of the substituted diphenylstyrene type may be present, for example, the alkali salts of 4,4'-bis (2-sulfostyryl) -diphenyl, 4,4'-bis (4-chloro-3-sulfostyryl) -diphenyl, or 4 - (4-chlorostyryl) -4 '- (2-sulfostyryl).
  • Mixtures of the aforementioned optical brightener can be used.
  • foam inhibitors are, for example, soaps of natural or synthetic origin, which have a high proportion of C 18 -C 24 fatty acids.
  • Suitable non-surfactant foam inhibitors are, for example, organopolysiloxanes and mixtures thereof with microfine, optionally silanized silica and paraffins, waxes, microcrystalline waxes and mixtures thereof with silanated silica or bis-fatty acid alkylene diamides. It is also advantageous to use mixtures of various foam inhibitors, for example those of silicones, paraffins or waxes.
  • the foam inhibitors in particular silicone and / or paraffin-containing foam inhibitors, are bound to a granular, water-soluble or dispersible carrier substance.
  • a granular, water-soluble or dispersible carrier substance In particular, mixtures of paraffins and bistearylethylenediamide are preferred.
  • the ingredients to be selected as well as the conditions under which the agent is used, such as temperature, pH, ionic strength, redox ratios or mechanical influences, should be optimized for the particular cleaning problem.
  • usual temperatures for detergents and cleaning agents are present in areas of 1O 0 C for manual compositions over 4O 0 C and 6O 0 C to 95 ° for machine agents or industrial applications. Since the temperature is usually infinitely adjustable in modern washing machines and dishwashers, all intermediate stages of the temperature are included.
  • the ingredients of the respective agents are coordinated. Synergies in terms of cleaning performance are preferred. Particularly preferred in this regard are synergies that exist in a temperature range between 2O 0 C and 6O 0 C, as well as the protease contained in the agents is catalytically active in this temperature range.
  • an agent according to the invention in particular a washing or cleaning agent, further comprises
  • grayness inhibitor 0.01 to 5% by weight of grayness inhibitor and / or
  • the agent may further comprise optical brighteners, preferably from 0.01% to 5% by weight.
  • compositions according to the invention presents no difficulties and can be carried out in a known manner, for example by spray-drying or granulation, enzymes and possibly other thermally sensitive ingredients such as, for example, bleaching agents optionally being added separately later.
  • inventive compositions having an increased bulk density in particular in the range from 650 g / l to 950 g / l, a process comprising an extrusion step is preferred.
  • compositions according to the invention in tablet form, which may be monophasic or multiphase, monochromatic or multicolor and in particular consist of one or more layers, in particular two layers
  • the procedure is preferably such that all constituents - if appropriate one per layer - in one Mixer mixed together and the Mixture by means of conventional tablet presses, such as eccentric or rotary presses, pressed with compressive forces in the range of about 50 to 100 kN, preferably at 60 to 70 kN.
  • a tablet produced in this way has a weight of 10 g to 50 g, in particular 15 g up to 40 g.
  • the spatial form of the tablets is arbitrary and can be round, oval or angular, with intermediate forms are also possible. Corners and edges are advantageously rounded. Round tablets preferably have a diameter of 30 mm to 40 mm.
  • the size of rectangular or cuboid-shaped tablets, which are introduced predominantly via the metering device, for example the dishwasher, is dependent on the geometry and the volume of this metering device.
  • Exemplary preferred embodiments have a base area of (20 to 30 mm) x (34 to 40 mm), in particular of 26x36 mm or 24x38 mm.
  • Liquid or pasty compositions according to the invention in the form of customary solvent-containing solutions are generally prepared by simply mixing the ingredients, which can be added in bulk or as a solution in an automatic mixer.
  • Embodiments of the present invention thus comprise all such solid, powdered, liquid, gelatinous or paste-like administration forms of the agents, which if appropriate can also consist of several phases and can be present in compressed or uncompressed form.
  • a further embodiment of the invention therefore represents agents which are characterized in that they are present as a one-component system. Such means preferably consist of one phase. Of course, means according to the invention may also consist of several phases.
  • the washing or cleaning agent is therefore characterized in that it is divided into several components.
  • the solid dosage forms according to the invention also include extrudates, granules, tablets or pouches, which may be present both in large packages and in portions.
  • the agent is present as a free-flowing powder, in particular with a bulk density of 300 g / l to 1200 g / l, in particular 500 g / l to 900 g / l or 600 g / l to 850 g / l.
  • agents according to the invention may also be liquid, gelatinous or pasty.
  • a further embodiment of the invention is therefore characterized in that the washing or Detergent in liquid, gel or pasty form, in particular in the form of a non-aqueous liquid detergent or a non-aqueous paste or in the form of an aqueous liquid detergent or a water-containing paste.
  • an agent according to the invention is characterized in that it contains the protease in an amount of from 2 ⁇ g to 20 mg, preferably from 5 ⁇ g to 17.5 mg, more preferably from 20 ⁇ g to 15 mg and most preferably from 50 ⁇ g to 10 mg contains per g of the agent.
  • the washing or cleaning agent according to the invention may be packaged in a container, preferably an air-permeable container, from which it is released shortly before use or during the washing process.
  • the protease contained in the composition and / or other ingredients of the composition may further be coated with a substance which is impermeable to the enzyme at room temperature or in the absence of water, which becomes permeable to the enzyme under conditions of use of the agent.
  • Such an embodiment of the invention is thus characterized in that the protease is coated with a substance which is impermeable to the protease at room temperature or in the absence of water.
  • compositions according to the invention may contain only one protease. Alternatively, they may also contain other proteases or other enzymes in a concentration effective for the effectiveness of the agent.
  • a further subject of the invention thus represents agents which further comprise one or more further enzymes, wherein in principle all enzymes established in the prior art for these purposes can be used.
  • Preferred enzymes which can be used as enzymes are all enzymes which can develop a catalytic activity in the agent according to the invention, in particular proteases, amylases, cellulases, hemicellulases, mannanases, tannases, xylanases, xanthanases, .beta.-glucosidases, carrageenases, oxidases, oxidoreductases or lipases, and preferably their mixtures.
  • These enzymes are basically of natural origin; Starting from the natural molecules, improved variants are available for use in detergents and cleaners, which are preferably used accordingly.
  • compositions according to the invention preferably contain enzymes in total amounts of 1 ⁇ 10 -8 to 5 percent by weight, based on active protein.
  • the enzymes are from 0.001 to 5% by weight, more preferably from 0.01 to 5% by weight, even more preferably from 0.05 to 4% by weight and most preferably from 0.075 to 3.5% by weight.
  • the protein concentration can be determined by known methods, for example, the BCA method (bicinchoninic acid, 2,2'-biquinolyl-4,4'-dicarboxylic acid) or the biuret method (AG Gornall, CS Bardawill and MM David, J. Biol. Chem., 177 (1948), pp. 751-766).
  • the further enzymes support the action of the agent, for example the cleaning performance of a washing or cleaning agent, with regard to certain soiling or stains.
  • the enzymes show synergistic effects with respect to their action against certain stains or stains, ie the enzymes contained in the middle composition mutually support each other in their cleaning performance.
  • the agent according to the invention is therefore characterized in that it contains at least one further enzyme which comprises a protease, amylase, cellulase, hemicellulase, mannanase, tannase, xylanase, xanthanase, ⁇ -glucosidase, carrageenase, oxidase, oxidoreductase or a lipase.
  • the enzymes used in agents of the invention are either originally from microorganisms, such as the genera Bacillus, Streptomyces, Humicola, or Pseudomonas, and / or are produced by biotechnological methods known per se by suitable microorganisms, for example by transgenic expression hosts of the genera Bacillus or by filamentous fungi ,
  • protease activity in such agents can be determined by the method described in Tenside, Vol. 7 (1970), pp. 125-132. It is given in PE (protease units).
  • a separate subject of the invention is the use of an above-described agent according to the invention for the removal of protease-sensitive stains on textiles or hard surfaces, i. for cleaning textiles or hard surfaces.
  • agents according to the invention can be used, in particular in accordance with the properties described above, to remove proteinaceous impurities from textiles or from hard surfaces.
  • Embodiments provide, for example Hand washing, manual removal of stains from textiles or hard surfaces, or use in conjunction with a machine process.
  • the relevant agents according to the invention preferably detergents or cleaning agents, are provided according to one of the embodiments set forth above.
  • a further subject of the invention are processes for the cleaning of textiles or of hard surfaces, in which an agent according to the invention is used at least in one of the process steps.
  • the process for the cleaning of textiles or hard surfaces is accordingly characterized in that an agent according to the invention is used in at least one process step.
  • Methods for cleaning textiles are generally distinguished by the fact that various cleaning-active substances are applied to the items to be cleaned in a plurality of process steps and washed off after the action time, or that the items to be cleaned are otherwise treated with a detergent or a solution of this agent.
  • a single substep of such a process for the mechanical cleaning of textiles may consist in optionally adding, in addition to stabilizing compounds, Salts or buffer substances is applied as the only cleaning-active component of an enzyme according to the invention.
  • Another object of the invention are methods for cleaning textiles or hard surfaces, which are characterized in that in at least one Process step, a protease according to the invention is proteolytically active, in particular such that the protease in an amount of 40 micrograms to 4 g, preferably from 50 micrograms to 3 g, more preferably from 100 micrograms to 2 g and most preferably from 200 micrograms to 1 g is used per application.
  • Alternative embodiments of this subject matter of the invention are also processes for the treatment of textile raw materials or for textile care in which a protease according to the invention becomes active in at least one of the process steps.
  • These may be, for example, processes in which materials for processing in textiles are prepared, for example for anti-fungal finishing, or, for example, for processes which enrich the cleaning of worn textiles with a nourishing component.
  • processes in which materials for processing in textiles are prepared for example for anti-fungal finishing, or, for example, for processes which enrich the cleaning of worn textiles with a nourishing component.
  • they are processes for the treatment of textile raw materials, fibers or textiles with natural constituents, in particular with wool or silk.
  • enzymes according to the invention are advantageously usable in agents according to the invention, in particular detergents and cleaners, and processes, in particular washing and cleaning processes. They can be used to remove proteinaceous contaminants from textiles or hard surfaces. Embodiments include, for example, hand washing, manual removal of stains from fabrics or hard surfaces, or use in conjunction with a machine process.
  • Another object of the invention is therefore the use of a protease according to the invention, as described above for the cleaning of textiles or hard surfaces.
  • the protease is used in an amount of from 40 ⁇ g to 4 g, preferably from 50 ⁇ g to 3 g, more preferably from 100 ⁇ g to 2 g and most preferably from 200 ⁇ g to 1 g per application.
  • the relevant enzymes according to the invention are provided within the scope of an agent according to the invention, preferably a washing or cleaning agent according to the invention.
  • Another embodiment of this subject invention is the use of a protease according to the invention for activating or deactivating ingredients of detergents or cleaners.
  • proteolysis activates another component, for example, if it is a hybrid protein of the actual enzyme and the corresponding inhibitor.
  • Another example of such regulation is that in which an active component for protecting or controlling its activity is encapsulated in a material which is attacked by proteolysis.
  • Proteases according to the invention can thus be used for inactivation, activation or release reactions, in particular in multiphase agents.
  • protease for the recovery or treatment of raw materials or intermediates in textile production, in particular for the removal of protective layers on fabrics;
  • the present invention is also realized in the form of such a protease-containing agent of the present invention, which are cosmetics. This is understood to mean all types of cleansing and conditioning agents for human skin or hair, in particular cleansing agents.
  • proteases are also used as bioactive components in skin care agents to aid in the breakdown of desmosome structures that are increased in dry skin.
  • proteases according to the invention can be developed further, for example via amino acid substitutions and / or point mutations.
  • proteases according to the invention in particular those which are controlled in their activity, for example after mutagenesis or by addition of corresponding substances interacting with them, are also suitable as active components in skin or hair cleansing or care preparations.
  • Particularly preferred are such preparations of these Enzymes which are stabilized as described above, for example by coupling to macromolecular carriers and / or derivatized by point mutations in highly allergenic positions, so that they have a higher skin compatibility for humans.
  • proteolytic enzymes for cosmetic purposes are also included in this subject matter, in particular in appropriate agents, such as shampoos, soaps or washing lotions, or in care products that are offered, for example in the form of creams. Also, the use in a peeling drug, or for its production is included.
  • subtilases In addition to the use in detergents and cleaners and cosmetics numerous applications of proteases, in particular subtilases are established in the prior art. An overview of this is provided, for example, by the handbook “Industrial Enzymes and their Applications” by H. Uhlig, Wiley-Verlag, New York, 1998. All of these techniques can be enriched by proteases according to the invention.
  • an alkaline protease for the biochemical analysis or for the synthesis of low molecular weight compounds or of proteins
  • an alkaline protease for the preparation, purification or synthesis of natural substances or biological valuable substances, preferably in the context of appropriate agents or processes;
  • an alkaline protease for the treatment of natural raw materials, in particular for surface treatment, more particularly in a process for the treatment of leather, preferably in the context of appropriate agents or processes;
  • an alkaline protease according to the invention for the treatment of photographic films, in particular for the removal of gelatin-containing or similar protective layers;
  • proteases according to the invention in all other fields of technology is included in the scope of protection of the present application, for which it has proven to be suitable.
  • the following examples further illustrate the invention without, however, limiting it thereto.
  • DSM ID 01-189 0.1 g of a soil sample were suspended in 1 ml of sterile 0.9% NaCl solution and on agar plates containing milk powder (1, 5% agar, 0.5% NaCl, O, 1% K 2 HPO 4 , 0.1% yeast extract, 2% peptone, 1% milk powder, pH 10).
  • a proteolytically active bacterium was isolated on the basis of a clarification center and was identified as Bacillus sp.
  • DSMZ German Collection of Microorganisms and Cell Cultures
  • the proteolytically active bacterium Bacillus sp. DSM ID 01-189 was in Horikoshi medium pH9
  • the chromosomal DNA of this bacterium was prepared according to standard methods, treated with the restriction enzyme Sau 3A and the resulting fragments in the
  • the transformants were first regenerated on DM3 medium and then seeded on milk powder-containing agar plates (TBY Skimmilk plates, see Example 1). Proteolytically active clones were identified by their lysis sites. One of the resulting proteolytically active clones was selected, the plasmid (vector) of which was isolated and the gene fragment (insert) contained in this vector was sequenced by standard methods.
  • the approx. 2 kb insert contains an open reading frame of about 1 kb whose nucleic acid sequence (DNA sequence) codes for a protease of the type of highly alkaline subtilisins (SEQ ID NO. 1). The sequence was amplified by PCR, cloned in the E. coli vector pUC19 and deposited under the Budapest Treaty at the DSMZ German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH (Inhoffen No 7B, D-38124 Braunschweig) under the number DSM 19494.
  • FIG. 1 Alignment of the mature protease according to the invention (SEQ ID NO: 3) with proteases from the prior art, calculated using the program Vector NTI Suite Ver.7 (InforMax, Inc. Bethesda, USA) under standard parameters.
  • SEQ ID NO.3 Alkaline protease according to the invention according to SEQ ID NO. 3 (mature enzyme)
  • Blap WT Alkaline protease from Bacillus lentus DSM 5483 (WO 92/21760 A1)

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft neue Proteasen vom Subtilisin-Typ sowie hinreichend verwandte Proteine und deren Derivate sowie deren Herstellung und deren Verwendung. Sie betrifft außerdem Wasch- und Reinigungsmittel mit diesen neuen Proteasen vom Subtilisin-Typ, hinreichend verwandten Proteinen und deren Derivaten, entsprechende Wasch- und Reinigungsverfahren und deren Verwendung.

Description

Neue Proteasen und Wasch- und Reinigungsmittel, enthaltend diese neuen Proteasen
Die vorliegende Erfindung betrifft neue Proteasen vom Subtilisin-Typ sowie hinreichend verwandte Proteine und deren Derivate sowie deren Herstellung und deren Verwendung. Sie betrifft außerdem Wasch- und Reinigungsmittel mit diesen neuen Proteasen vom Subtilisin-Typ, hinreichend verwandten Proteinen und deren Derivaten, entsprechende Wasch- und Reinigungsverfahren und deren Verwendung.
Proteasen gehören zu den technisch bedeutendsten Enzymen überhaupt. Hierunter sind wiederum Proteasen vom Subtilisin-Typ (Subtilasen, Subtilopeptidasen, EC 3.4.21.62) besonders wichtig, welche aufgrund der katalytisch wirksamen Aminosäuren den Serin-Proteasen zugerechnet werden. Sie wirken als unspezifische Endopeptidasen, das heißt, sie hydrolysieren beliebige Säureamidbindungen, die im Inneren von Peptiden oder Proteinen liegen. Ihr pH-Optimum liegt meist im deutlich alkalischen Bereich. Einen Überblick über diese Familie bietet beispielsweise der Artikel „Subtilases: Subtilisin-like Proteases" von R. Siezen, Seite 75-95 in „Subtilisin enzymes", herausgegegeben von R. Bott und C. Betzel, New York, 1996. Subtilasen werden natürlicherweise von Mikroorganismen gebildet; hierunter sind insbesondere die von Bacillus-Spezies gebildeten und sekretierten Subtilisine als bedeutendste Gruppe innerhalb der Subtilasen zu erwähnen.
Proteasen sind neben anderen Enzymen etablierte aktive Inhaltsstoffe von Wasch- und Reinigungsmitteln. Sie bewirken dabei den Abbau proteinhaltiger Anschmutzungen auf dem Reinigungsgut. Günstigenfalls ergeben sich Synergieeffekte zwischen den Enzymen und den übrigen Bestandteilen der betreffenden Mittel. Unter den Wasch- und Reinigungsmittelproteasen nehmen Subtilasen aufgrund ihrer günstigen enzymatischen Eigenschaften wie Stabilität oder pH- Optimum eine herausragende Stellung ein. Sie eignen sich daneben noch für eine Vielzahl weiterer technischer Verwendungsmöglichkeiten, beispielsweise als Bestandteile von Kosmetika oder in der organisch-chemischen Synthese.
Beispiele für die in Wasch- und Reinigungsmitteln bevorzugt eingesetzten Proteasen vom Subtilisin-Typ sind die Subtilisine BPN' und Carlsberg, die Protease PB92, die Subtilisine 147 und 309, die Alkalische Protease aus Bacillus lentus, Subtilisin DY und die den Subtilasen, nicht mehr jedoch den Subtilisinen im engeren Sinne zuzuordnenden Enzyme Thermitase, Proteinase K und die Proteasen TW3 und TW7. Das Subtilisin BPN', welches aus Bacillus amyloliquefaciens, beziehungsweise B. subtilis stammt, ist aus den Arbeiten von Vasantha et al. (1984) in J. Bacteriol., Volume 159, S. 811-819 und von J. A. Wells et al. (1983) in Nucleic Acids Research, Volume 11 , S. 7911-7925 bekannt. Subtilisin BPN' dient insbesondere hinsichtlich der Numerierung der Positionen als Referenzenzym der Subtilisine. Subtilisin Carlsberg ist in weiterentwickelter Form unter dem Handelsnamen Alcalase® von der Firma Novozymes A/S, Bagsvaerd, Dänemark, erhältlich. Sie wird in den Publikationen von E. L. Smith et al. (1968) in J. Biol. Chem., Volume 243, S. 2184-2191 , und von Jacobs et al. (1985) in Nucl. Acids Res., Band 13, S. 8913-8926 beschrieben und wird natürlicherweise von Bacillus licheniformis gebildet. Die Protease PB92 wird natürlicherweise von dem alkaliphilen Bakterium Bacillus nov. spec. 92 produziert und war unter dem Handelsnamen Maxacal® von der Fa. Gist- Brocades, Delft, Niederlande, erhältlich. In ihrer ursprüglichen Sequenz wird sie in der Patentanmeldung EP 283075 A2 beschrieben. Die Subtilisine 147 und 309 werden unter den Handelsnamen Esperase®, beziehungsweise Savinase® von der Firma Novozymes vertrieben. Sie stammen ursprünglich aus Bacillus-Stämmen, die mit der Anmeldung GB 1243784 A offenbart werden. Von der Protease aus Bacillus lentus DSM 5483 (WO 91/02792 A1 ) leiten sich die unter der Bezeichnung BLAP® geführten Varianten ab, die insbesondere in WO 92/21760 A1 , WO 95/23221 A1 , WO 02/088340 A2 und WO 03/038082 A2 beschrieben werden. Subtilisin DY ist ursprünglich von Nedkov et al. 1985 in Biol. Chem Hoppe-Seyler, Band 366, S. 421-430 beschrieben. Weitere verwendbare Proteasen sind beispielsweise die unter den Handelsnamen Durazym®, Relase®, Everlase®, Nafizym, Natalase®, Kannase® und Ovozyme® von der Firma Novozymes, die unter den Handelsnamen, Purafect®, Purafect® OxP, Purafect® Prime und Properase® von der Firma Genencor, das unter dem Handelsnamen Protosol® von der Firma Advanced Biochemicals Ltd., Thane, Indien, das unter dem Handelsnamen Wuxi® von der Firma Wuxi Snyder Bioproducts Ltd., China, die unter den Handelsnamen Proleather® und Protease P® von der Firma Amano Pharmaceuticals Ltd., Nagoya, Japan, und das unter der Bezeichnung Proteinase K-16 von der Firma Kao Corp., Tokyo, Japan, erhältlichen Enzyme.
Die in erfindungsgemäßen Mitteln eingesetzten Proteasen stammen entweder ursprünglich aus Mikroorganismen, beispielsweise aus Mikroorganismen der Gattungen Bacillus, Streptomyces, Humicola, oder Pseudomonas, und/oder werden nach an sich bekannten biotechnologischen Verfahren durch geeignete Mikroorganismen produziert, beispielsweise durch transgene Expressionswirte der Gattungen Bacillus oder durch filamentöse Fungi.
Das klassische Vorgehen zur Gewinnung neuer Enzyme besteht darin, Mikroorganismen-haltige Proben aus natürlichen Habitaten zu entnehmen und unter den als geeignet angesehenen Bedingungen - zum Beispiel in alkalischem Milieu - zu kultivieren. Auf diese Weise erhält man Anreicherungskulturen von Mikroorganismen, die mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit auch Enzyme, darunter Proteasen enthalten, welche unter den betreffenden Bedingungen aktiv sind. Hieraus werden dann beispielsweise über Ausplattieren auf proteinhaltigen Agarplatten und Ausmessen der gebildeten Lysehöfe die Mikroorganismen mit den leistungsfähigsten Enzyme ausgewählt und aufgereinigt beziehungsweise die betreffenden Gene kloniert. Solch ein Vorgehen wird beispielsweise in dem Lehrbuch „Alkalophilic Mikroorganisms. A new microbial world" von K.Horikoshi und T.Akiba (1982), Japan Scientific Societies Press, Springer-Verlag, New York, Heidelberg, Berlin, ISBN 0-387-10924-2, Kapitel 2, Seiten 9-26 beschrieben.
Hinsichtlich der Anwendung von Proteasen in Wasch- und Reinigungsmitteln ist bekannt, dass Proteasen zur Verbesserung der Wasch- beziehungsweise Reinigungsleistung zusammen mit weiteren Enzymen, beispielsweise Amylasen, Cellulasen, Hemicellulasen, Mannanasen, ß- Glucosidasen, Oxidasen, Oxidoreduktasen oder Lipasen eingesetzt werden können. Ebenso ist der Einsatz von Proteasen in Waschmitteln in Kombination mit anderen Wirkstoffen wie etwa Bleichmitteln oder Soil-Release-Wirkstoffen dem Fachmann bekannt.
Es ist ferner bekannt, dass einige für den Einsatz in Waschmitteln etablierte Proteasen auch für kosmetische Zwecke oder für die organisch-chemische Synthese geeignet sind.
Die hier beispielhaft dargestellten, diversen technischen Einsatzgebiete erfordern Proteasen mit unterschiedlichen Eigenschaften, was beispielsweise die Reaktionsbedingungen, die Stabilität oder die Substratspezifität angeht. Umgekehrt hängen die technischen Einsatzmöglichkeiten der Proteasen, beispielsweise im Kontext einer Wasch- oder Reinigungsmittelrezeptur, von weiteren Faktoren wie Stabilität des Enzyms gegenüber hohen Temperaturen, gegenüber oxidierenden Agentien, dessen Denaturierung durch Tenside, von Faltungseffekten oder von erwünschten Synergien mit anderen Inhaltsstoffen ab.
Somit besteht nach wie vor ein hoher Bedarf an technisch einsetzbaren Proteasen, die aufgrund der Vielzahl ihrer Einsatzgebiete in ihrer Gesamtheit ein breites Spektrum an Eigenschaften bis hin zu sehr subtilen Leistungsunterschieden abdecken.
Die Basis hierfür wird durch neue Proteasen erweitert, welche ihrerseits hinsichtlich spezieller Einsatzgebiete gezielt weiterentwickelt werden können.
Der vorliegenden Erfindung lag also die Aufgabe zugrunde, weitere, noch nicht bekannte Proteasen aufzufinden. Das jeweilige Wildtyp-Enzym sollte sich vorzugsweise dadurch auszeichnen, dass seine Leistung bei Verwendung in einem entsprechenden Mittel derjenigen der für diesen Zweck etablierten Enzyme zumindest nahe kommt und idealerweise übertrifft. Hierbei war insbesondere der Beitrag zur Leistung eines Wasch- oder Reinigungsmittels von Interesse. Weitere Aufgaben der vorliegenden Erfindung werden darin gesehen, Proteasen, insbesondere vom Subtilisin-Typ, bereitzustellen, die gegenüber dem Stand der Technik eine verbesserte Stabilität gegenüber Temperatureinflüssen, pH-Wert-Schwankungen, denaturierenden oder oxidierenden Agentien, proteolytischem Abbau, hohen Temperaturen, sauren oder alkalischen Bedingungen oder gegenüber einer Veränderung der Redox-Verhältnisse aufweisen. Weitere Aufgaben können in einer verringerten Immunogenität bzw. verringerten allergenen Wirkung gesehen werden.
Eine weitere besondere Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, Proteasen ausfindig zu machen, die bei Temperaturen von 20 bis 60 0C eine gute Waschleistung, vorzugsweise eine verbesserte Waschleistung im Vergleich zu den im Stand der Technik offenbarten Proteasen, insbesondere denjenigen vom Subtilisin-Typ, aufweisen.
Eine weitere besondere Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es, Proteasen ausfindig zu machen, die in Bezug auf die im Stand der Technik bekannten Proteasen eine verbesserte Waschleistung in Bezug auf zumindest eine Anschmutzung, vorzugsweise in Bezug auf mehrere Anschmutzungen, aufweisen.
Weitere Teilaufgaben bestanden darin, Nukleinsäuren zur Verfügung zu stellen, die für derartige Proteasen kodieren, und Vektoren, Wirtszellen und Herstellverfahren zur Verfügung zu stellen, die zur Gewinnung derartiger Proteasen genutzt werden können. Ferner sollten entsprechende Mittel, insbesondere Wasch- und Reinigungsmittel, entsprechende Wasch- und Reinigungsverfahren sowie entsprechende Verwendungsmöglichkeiten für derartige Proteasen zur Verfügung gestellt werden. Schließlich sollten technische Einsatzmöglichkeiten für die gefundenen Proteasen definiert werden.
Die Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst gemäß der Lehre des Anspruchs 1. Einen Gegenstand der Erfindung bildet somit eine Protease umfassend eine Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus a) Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 3 angegebenen Aminosäuresequenz zu mindestens 94,2% identisch ist. b) Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz zu mindestens 59% identisch ist.
Hiermit sind als weitere Erfindungsgegenstände die zugehörigen Nukleinsäuren, entsprechende natürliche Zellen, geeignete Verfahren zu ihrer Identifizierung, insbesondere auf den Nukleinsäuren aufbauende molekularbiologische Verfahren und Verfahrenselemente sowie Mittel, Wasch- und Reinigungsmittel, Wasch- und Reinigungsverfahren und über die betreffenden Proteasen gekennzeichnete Verwendungsmöglichkeiten verbunden.
Bereits das in SEQ ID NO.3 angegebene Enzym weist eine proteolytische Aktivität auf, so dass die Proteasen für ihre Anwendung in Wasch- und Reinigungsmitteln als geeignet anzusehen sind. Aufgrund der zur Verfügung gestellten DNA ist eine zusätzliche Optimierung dieses Enzyms, beispielsweise über weitere Punktmutationen möglich. Ferner kann diese DNA in Shuffling-Ansätze eingebracht und damit zur Erzeugung völlig neuartiger Proteasen genutzt werden.
Unter einem Enzym ist im Sinne der vorliegenden Anmeldung ein Protein zu verstehen, das eine bestimmte biokatalytische Funktion ausübt. Unter Protease im Sinne der vorliegenden Anmeldung wird ein Enzym verstanden, welches die Hydrolyse von Peptidbindungen katalysiert und dadurch in der Lage ist, Peptide oder Proteine zu spalten.
Ein Protein ist im Sinne der vorliegenden Anmeldung ein aus den natürlichen Aminosäuren zusammengesetztes, weitgehend linear aufgebautes, zur Ausübung seiner Funktion zumeist eine dreidimensionale Struktur annehmendes Polypeptid. Ein Peptid besteht aus Aminosäuren, die über Peptidbindungen miteinander kovalent verbunden sind. Die Bezeichnung Polypeptid verdeutlicht diesbezüglich den Sachverhalt, dass diese Peptidkette in der Regel aus vielen Aminosäuren besteht, die über Peptidbindungen miteinander verbunden sind. Aminosäuren können in einer L- und einer D-Konfiguration vorliegen, wobei die Aminosäuren, aus denen Proteine bestehen, in der L-Konfiguration vorliegen. Sie werden als proteinogene Aminosäuren bezeichnet. In der vorliegenden Anmeldung werden die proteinogenen, natürlich vorkommenden L-Aminosäuren mit den international gebräuchlichen 1- und 3-Buchstaben-Codes bezeichnet. Zahlreiche Proteine werden als sogenannte Präproteine, also zusammen mit einem Signalpeptid gebildet. Darunter ist dann der N-terminale Teil des Proteins zu verstehen, dessen Funktion zumeist darin besteht, die Ausschleusung des gebildeten Proteins aus der produzierenden Zelle in das Periplasma oder das umgebende Medium und/oder dessen korrekte Faltung zu gewährleisten. Anschließend wird das Signalpeptid unter natürlichen Bedigungen durch eine Signalpeptidase vom übrigen Protein abgespalten, so dass dieses seine eigentliche katalytische Aktivität ohne die zunächst vorhandenen N-terminalen Aminosäuren ausübt. Pro-Proteine sind inaktive Vorstufen von Proteinen. Deren Vorläufer mit Signalsequenz werden als Prä-Pro-Proteine bezeichnet. Für technische Anwendungen sind aufgrund ihrer enzymatischen Aktivität die maturen, d.h. reifen Peptide, d.h. die nach ihrer Herstellung prozessierten Enzyme gegenüber den Präproteinen bevorzugt. Die Proteine können von den sie produzierenden Zellen nach der Herstellung der Polypeptidkette modifiziert werden, beispielsweise durch Anknüpfung von Zuckermolekülen, Formylierungen, Aminierungen, usw. Solche Modifikationen werden als posttranslationale Modifikationen bezeichnet. Diese posttranslationalen Modifizierungen können, müssen jedoch nicht einen Einfluss auf die Funktion des Proteins ausüben.
Im Sinne der vorliegenden Erfindung werden alle Enzyme, Proteine, Fragmente und Derivate, sofern sie nicht explizit als solche angesprochen zu werden brauchen, unter dem Oberbegriff Proteine zusammengefasst.
Durch Vergleich mit bekannten Enzymen, die beispielsweise in allgemein zugänglichen Datenbanken hinterlegt sind, lässt sich aus der Aminosäure- oder Nukleotid-Sequenz die enzymatische Aktivität eines betrachteten Enzyms folgern. Diese kann durch andere Bereiche des Proteins, die nicht an der eigentlichen Reaktion beteiligt sind, qualitativ oder quantitativ modifiziert werden. Dies könnte beispielsweise die Enzymstabilität, die Aktivität, die Reaktionsbedingungen oder die Substratspezifität betreffen.
Solch ein Vergleich geschieht dadurch, dass ähnliche Abfolgen in den Nukleotid- oder Aminosäuresequenzen der betrachteten Proteine einander zugeordnet werden. Dies nennt man Homologisierung. Eine tabellarische Zuordnung der betreffenden Positionen wird als Alignment bezeichnet. Bei der Analyse von Nukleotidsequenzen sind wiederum beide komplementären Stränge und jeweils allen drei möglichen Leserastern zu berücksichtigen; ebenso die Degeneriertheit des genetischen Codes und die organismenspezifische Verwendung der Codons (Codon-Usage). Inzwischen werden Alignments über Computerprogramme erstellt, wie beispielsweise durch die Algorithmen FASTA oder BLAST; dieses Vorgehen wird beispielsweise von D. J. Lipman und W. R. Pearson (1985) in Science, Band 227, S. 1435-1441 beschrieben.
Eine Zusammenstellung aller in den verglichenen Sequenzen übereinstimmenden Positionen wird als Konsensus-Sequenz bezeichnet.
Solch ein Vergleich erlaubt auch eine Aussage über die Ähnlichkeit oder Homologie der verglichenen Sequenzen zueinander. Diese wird in Prozent Identität, das heißt dem Anteil der identischen Nukleotide oder Aminosäurereste an denselben bzw. in einem Alignment einander entsprechenden Positionen wiedergegeben. Ein weiter gefaßter Homologiebegriff bezieht die konservierten Aminosäure-Austausche in diesen Wert mit ein. Es ist dann von Prozent Ähnlichkeit die Rede. Solche Aussagen können über ganze Proteine oder Gene oder nur über einzelne Bereiche getroffen werden.
Homologe Bereiche von verschiedenen Proteinen sind durch Übereinstimmungen in der Aminosäuresequenz definiert. Diese können auch durch identische Funktion gekennzeichnet sein. Sie geht bis zu völligen Identitäten in kleinsten Bereichen, sogenannten Boxen, die nur wenige Aminosäuren umfassen und meist für die Gesamtaktivität essentielle Funktionen ausüben. Unter den Funktionen der homologen Bereiche sind kleinste Teilfunktionen der vom gesamten Protein ausgeübten Funktion zu verstehen, wie beispielsweise die Ausbildung einzelner Wasserstoffbrückenbindungen zur Komplexierung eines Substrats oder Übergangskomplexes.
Die erfindungsgemäßen Aminosäuresequenzen sind, wie in den Beispielen zur vorliegenden Anmeldung beschrieben, von Nukleinsäuren abgeleitet worden, die aus einem proteolytisch aktiven Bakterium aus einer Bodenprobe isoliert worden sind.
Eine erfindungsgemäße Nukleinsäuresequenz ist unter SEQ ID NO. 1 angegeben. Diese Nukleinsäure codiert für ein Polypeptid, welches eine für Subtilisine typische Einteilung in Signalpeptid, Propeptid und reife (mature) Protease aufweist. Das Gesamtlängenprotein ist unter SEQ ID NO. 2 und die reife (mature) Protease unter SEQ ID NO. 3 angegeben. Hiermit ist das tatsächlich aktive reife Protein gemeint, weil dieses die technisch relevante Funktion ausübt. Besonders bevorzugt ist daher die Aminosäuresequenz der reifen, aktiven Protease.
Wie in Beispiel 3 dargestellt ist, wurde zu dieser Protease in der "Non-redundant Genbank" (Altschul, Stephan F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Hheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997): "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs"; Nucleic Acids Res., 25, S.3389-3402.) ein Homologievergleich mit den bisher bekannten Proteasen durchgeführt.
Als hierzu nächstähnliches beschriebenes Enzym wurde die Protease identifiziert, die als SEQ ID NO.1 in der US-Patentanmeldung US 2004/0209343 offenbart ist. Die wie alle nachfolgenden Homologiewerte über das Computer-Programm Vector NTI® Suite 7.0, erhältlich von der Firma InforMax, Inc., Bethesda, USA, mit den vorgegebenen Default-Parametern ermittelte Identität auf Aminosäureebene beträgt 94,1 % (vergleiche Figur 1 ), bezogen auf die Sequenz des reifen (mature) Enzyms gemäß SEQ ID NO.3, die 307 Aminosäuren umfasst. Somit handelt es sich bei der gefundenen Protease um ein neues Enzym. In den Schutzbereich eingeschlossen werden können somit alle Proteasen, die mindestens zu 94,2% identisch zu SEQ ID NO.3 sind. Zu der etablierten B. lentus-Alkalischen Protease (SEQ ID NO. 4, vgl. auch WO 97/21760 A1 ) ergibt sich über die Länge dieser Protease auf Aminosäureebene eine Identität von 36,5%, wiederum bezogen auf das reife Enzym. Bezogen auf das Gesamtlängen-Protein gemäß SEQ ID NO. 2 ergab die vorstehend beschriebene BLAST-Abfrage als nächstähnlichen Datenbank-Eintrag die Protease gemäß Datenbankeintrag AAB93489.1 („toxin degrading protease"). Die ermittelte Identität auf Aminosäureebene beträgt 58% bezogen auf die Sequenz des Gesamtproteins gemäß SEQ ID NO. 2. Daher werden alle Proteasen in den Schutzbereich eingeschlossen, die mindestens zu 59% identisch zu SEQ ID NO. 2 sind. In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Protease dadurch gekennzeichnet, dass sie eine Aminosäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus a) Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 3 angegebenen Aminosäuresequenz zunehmend bevorzugt zu mindestens 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist b) Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz zu mindestens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist die Protease dadurch gekennzeichnet, dass ihre Waschleistung mindestens derjenigen einer Protease entspricht, die eine Aminosäuresequenz umfasst, die der in SEQ ID NO. 4 angegebenen Aminosäuresequenz entspricht, wobei die Waschleistung in einem Waschsystem bestimmt wird, das ein Waschmittel in einer Dosierung zwischen 4,5 und 7,0 Gramm pro Liter Waschflotte sowie die Protease enthält, wobei die zu vergleichenden Proteasen aktivitätsgleich eingesetzt sind und die Waschleistung gegenüber einer oder mehrerer der Anschmutzungen Gras, Öl/Milch, Ganzei/Ruß bzw. Vollei/Pigment, Schokoladenmilch/Ruß, Kakao und Blut/Milch, jeweils auf Baumwoll- oder Polyestergewebe, insbesondere gegenüber einer oder mehrerer der Anschmutzungen Gras EMPA 164, Öl/Milch PC-10, Ganzei/Ruß bzw. Vollei/Pigment 10N, Schokoladenmilch/Ruß C-03, Kakao EMPA 112 und Blut/Milch C-05 auf Baumwolle 10N, bestimmt wird durch Messung des Weißheitsgrades der gewaschenen Textilien, der Waschvorgang für mindestens 30 Minuten, optional 60 Minuten, bei einer Temperatur von 4O0C erfolgt und das Wasser eine Wasserhärte zwischen 15,5 und 16,5° deutscher Härte aufweist.
Erfindungsgemäß sind die Begriffe Ganzei/Ruß bzw. Vollei/Pigment hinsichtlich der Anschmutzungen als gleichwertig und einander entsprechend zu betrachten. Geeignete Anschmutzungen sind beispielsweise die kommerziell erhältlichen Anschmutzungen EMPA 164 (Gras) und EMPA112 (Kakao) der EMPA Testmaterialien AG (St. Gallen, Schweiz), 10N (Vollei/Pigment) der wfk Testgewebe GmbH (Brüggen-Bracht, Deutschland) sowie PC-10 (Milch/Öl), C-03 (Schokoladenmilch/Ruß) und C-05 (Blut/Milch) des Center For Testmaterials (CFT, Viaardingen, Niederlande).
Ein bevorzugtes flüssiges Waschmittel für ein solches Waschsystem ist wie folgt zusammengesetzt (alle Angaben in Gewichts-Prozent): 0,3- 0,5% Xanthan Gum, 0,2-0,4% Anti-Schaummittel, 6-7% Glycerin, 0,3-0,5% Ethanol, 4-7% FAEOS (Fettalkoholethersulfat) , 24-28% nichtionische Tenside, 1 % Borsäure, 1-2% Natriumeitrat (Dihydrat), 2-4% Soda, 14-16% Kokosnuss-Fettsäuren, 0,5% HEDP (1-Hydroxyethan-(1 ,1-di-phosphonsäure)), 0-0,4% PVP (Polyvinylpyrrolidon), 0-0,05% optischer Aufheller, 0-0,001 % Farbstoff, Rest demineralisiertes Wasser. Bevorzugt beträgt die Dosierung des flüssigen Waschmittels zwischen 4,5 und 5,5 Gramm pro Liter Waschflotte, beispielsweise 4,9 Gramm pro Liter Waschflotte. Bevorzugt wird gewaschen in einem pH- Wertebereich zwischen pH 8 und pH 10,5, bevorzugt zwischen pH 8 und pH 9.
Ein bevorzugtes pulverförmiges Waschmittel für ein solches Waschsystem ist wie folgt zusammengesetzt (alle Angaben in Gewichts-Prozent): 10 % lineares Alkylbenzolsulfonat (Natrium-Salz), 1 ,5 % C12-C18-Fettalkoholsulfat (Natrium-Salz), 2,0 % C12-C18-Fettalkohol mit 7 EO, 20 % Natriumcarbonat, 6,5 % Natriumhydrogencarbonat, 4,0 % amorphes Natriumdisilikat, 17 % Natriumcarbonat-peroxohydrat, 4,0 % TAED, 3,0 % Polyacrylat, 1 ,0 % Carboxymethylcellulose, 1 ,0 % Phosphonat, 25 % Natriumsulfat, Rest: optional Schauminhibitoren, optischer Aufheller, Duftstoffe und ggfs. Wasser ad 100%. Bevorzugt beträgt die Dosierung des flüssigen Waschmittels zwischen 6,0 und 7,0 Gramm pro Liter Waschflotte, beispielsweise 6,7 Gramm pro Liter Waschflotte. Bevorzugt wird gewaschen in einem pH-Wertebereich zwischen pH 9 und pH 11.
Der Weißheitsgrad, d.h. die Aufhellung der Anschmutzungen, wird bevorzugt mit optischen Messverfahren bestimmt, bevorzugt photometrisch. Ein hierfür geeignetes Gerät ist beispielsweise das Spektrometer Minolta CM508d. Üblicherweise werden die für die Messung eingesetzten Geräte zuvor mit einem Weißstandard, bevorzugt einem mitgelieferten Weißstandard, kalibriert.
Durch den aktivitätsgleichen Einsatz wird sichergestellt, dass auch bei einem etwaigen Auseinanderklaffen des Verhältnisses von Aktivsubstanz zu Gesamtprotein (die Werte der spezifischen Aktivität) die jeweiligen enzymatischen Eigenschaften, also beispielsweise die Waschleistung an bestimmten Anschmutzungen, verglichen werden. Generell gilt, dass eine niedrige spezifische Aktivität durch Zugabe einer größeren Proteinmenge ausgeglichen werden kann. Verfahren zur Bestimmung der Proteaseaktivitäten sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Enzymtechnologie geläufig und werden von ihm routinemäßig angewendet. Beispielsweise sind solche Verfahren offenbart in Tenside, Band 7 (1970), S. 125-132. Die Proteaseaktivität wird vorzugsweise in PE (Protease-Einheiten) angegeben. Beispielsweise geeignete Proteaseaktivitäten betragen 5 oder 10 PE (Protease-Einheiten) pro ml Waschflotte. Die Proteaseaktivität ist jedoch nicht gleich Null.
Proteine können auch über die Reaktion mit einem Antiserum oder einem bestimmten Antikörper zu Gruppen immunologisch verwandter Proteine zusammengefaßt werden. Die Angehörigen einer Gruppe zeichnen sich dadurch aus, dass sie dieselbe, von einem Antikörper erkannte antigene Determinante aufweisen. Einen weiteren Erfindungsgegenstand bilden daher Proteasen, dadurch gekennzeichnet sind, dass sie mindestens eine und zunehmend bevorzugt zwei, drei oder vier übereinstimmende antigene Determinanten mit einer erfindungsgemäßen Protease aufweisen.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist eine erfindungsgemäße Protease natürlicherweise in einem Organismus vorhanden, der aus einem natürlichen Habitat isolierbar ist.
Diese Ausführungsform ist deshalb besonders vorteilhaft, weil dann der zugehörige Organismus selbst in Kultur genommen werden kann. Vorteilhafterweise lassen sich dann aus dessen Zellextrakten oder Kulturüberständen die erfindungsgemäßen Proteasen isolieren und herstellen.
Bevorzugt handelt es sich bei einem solchen Organismus um einen Mikroorganismus, vorzugsweise um einen Pilz, um ein gramnegatives oder um ein grampositives Bakterium, und hierunter besonders bevorzugt um eines der Gattung Bacillus.
Denn besonders für diese Organismen sind im Stand der Technik Kultivierungsmethoden bekannt und etabliert. Das gilt insbesondere für Bacilli, die in der technischen Enzymherstellung eine herausragende Rolle einnehmen. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist eine erfindungsgemäße Protease dadurch gekennzeichnet, dass sie in dem Bakterienstamm Bacillus sp. DSM ID 01-189 natürlicherweise vorhanden ist.
Proteasen bzw. Enzyme im allgemeinen können durch verschiedene Verfahren, z.B. gezielte genetische Veränderung durch Mutageneseverfahren, weiterentwickelt und für bestimmte Einsatzzwecke oder hinsichtlich spezieller Eigenschaften, beispielsweise katalytische Aktivität, Stabilität, usw., optimiert werden. Änderungen der Nukleotidsequenz, wie sie beispielsweise durch an sich bekannte molekularbiologische Methoden herbeigeführt werden können, werden demnach als Mutationen bezeichnet. Je nach Art der Änderung kennt man beispielsweise Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutationen oder solche, bei denen verschiedene Gene oder Teile von Genen miteinander fusioniert (shuffling) werden; dies sind Genmutationen. Die zugehörigen Organismen werden als Mutanten bezeichnet. Die von mutierten Nukleinsäuren abgeleiteten Proteine werden als Varianten bezeichnet. So führen beispielsweise Deletions-, Insertions-, Substitutionsmutationen oder Fusionen zu deletions-, insertions-, substitutionsmutierten oder Fusionsgenen und auf Proteinebene zu entsprechenden Deletions-, Insertions- oder Substitutionsvarianten, beziehungsweise Fusionsproteinen. Die Strategie, in die bekannten Moleküle gezielte Punktmutationen einzuführen, etwa um die Waschleistung der Proteasen, beispielsweise Subtilisinen, zu verbessern, wird auch als Rationales Protein-Design bezeichnet. Eine ähnliche Strategie der Leistungsverbesserung besteht darin, die Oberflächenladungen und/oder den isoelektrischen Punkt der Moleküle und darüber ihre Wechselwirkungen mit dem Substrat zu verändern. So kann beispielsweise über Punktmutationen die Nettoladung der Subtilisine verändert werden, um darüber die Substratbindung insbesondere für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln zu beeinflussen. Eine weitere, insbesondere ergänzende Strategie besteht darin, die Stabilität der betreffenden Proteasen zu erhöhen und damit ihre Wirksamkeit zu erhöhen. Eine solche Stabilisierung kann beispielsweise über Kopplung an ein Polymer oder, insbesondere für Wasch- und Reinigungsmittel, durch Punktmutationen erfolgen.
Eine moderne Richtung der Enzymentwicklung besteht darin, Elemente aus bekannten, miteinander verwandten Proteinen über statistische Verfahren zu neuen Enzymen mit bislang nicht erreichten Eigenschaften zu kombinieren. Solche Verfahren werden auch unter dem Oberbegriff Directed Evolution zusamengefaßt. Dazu gehören beispielsweise die sogenannte „StEP"-Methode, „Random priming recombination", „DNA-Shuffling", „RACHITT" oder „Recombining ligation reaction" (RLR).
Für die Beschreibung von Punktmutationen, die genau eine Aminosäureposition betreffen (Aminosäureaustausche), wird folgende Konvention angewendet: zunächst wird die natürlicherweise vorhandene Aminosäure in Form des international gebräuchlichen Einbuchstaben-Codes bezeichnet, dann folgt die zugehörige Sequenzposition und schließlich die eingefügte Aminosäure. Mehrere Austausche innerhalb derselben Polypeptidkette werden durch Schrägstriche voneinander getrennt.
Es ist aus dem Stand der Technik weiterhin allgemein bekannt, dass sich vorteilhafte Eigenschaften einzelner Mutationen, z.B. einzelner Punktmutationen, ergänzen können. Eine hinsichtlich bestimmter Eigenschaften bereits optimierte Protease, zum Beispiel hinsichtlich ihrer Stabilität gegenüber Tensiden oder anderen Komponenten, kann erfindungsgemäß zusätzlich weiterentwickelt werden.
Unter Fragmenten werden alle Proteine oder Peptide verstanden, die kleiner sind als natürliche Proteine und beispielsweise auch synthetisch erhalten werden können. Aufgrund ihrer Aminosäuresequenzen können sie den betreffenden vollständigen Proteinen zugeordnet werden. Sie können beispielsweise gleiche Strukturen annehmen oder proteolytische Aktivitäten oder Teilaktivitäten ausüben, wie beispielsweise die Komplexierung eines Substrats. Fragmente und Deletionsvarianten von Ausgangsproteinen sind prinzipiell gleichartig; während Fragmente eher kleinere Bruchstücke darstellen, fehlen den Deletionsmutanten eher nur kurze Bereiche, und damit nur einzelne Teilfunktionen.
Unter Chimären oder hybriden Proteinen sind im Sinne der vorliegenden Anmeldung solche Proteine zu verstehen, deren Sequenz die Sequenzen oder Teilsequenzen von mindestens zwei Ausgangsproteinen umfasst. Die Ausgangsproteine können diesbezüglich aus verschiedenen oder aus demselben Organismus stammen. Chimäre oder hybride Proteine können beispielsweise durch Rekombinationsmutagenese erhalten werden. Der Sinn einer solchen Rekombination kann beispielsweise darin bestehen, mithilfe des heranfusionierten Proteinteils eine bestimmte enzymatische Funktion herbeizuführen oder zu modifizieren. Es ist dabei im Sinne der vorliegenden Erfindung unwesentlich, ob solch ein chimäres Protein aus einer einzelnen Polypeptidkette oder mehreren Untereinheiten besteht, auf weiche sich unterschiedliche Funktionen verteilen können.
Unter durch Insertionsmutation erhaltene Proteine sind solche Varianten zu verstehen, die durch Einfügen eines Proteinfragments in die Ausgangssequenzen erhalten worden sind. Sie sind ihrer prinzipiellen Gleichartigkeit wegen den Chimären Proteinen zuzuordnen. Sie unterscheiden sich von jenen lediglich im Größenverhältnis des unveränderten Proteinteils zur Größe des gesamten Proteins. In solchen insertionsmutierten Proteinen ist der Anteil an Fremdprotein geringer als in Chimären Proteinen.
Inversionsmutagenese, also eine partielle Sequenzumkehrung, kann als Sonderform sowohl der Deletion, als auch der Insertion angesehen werden. Dasselbe gilt für eine von der ursprünglichen Aminosäureabfolge abweichende Neugruppierung verschiedener Molekülteile. Sie kann sowohl als Deletionsvariante, als Insertionsvariante, als auch als Shuffling-Variante des ursprünglichen Proteins angesehen werden.
Unter Derivaten werden im Sinne der vorliegenden Anmeldung solche Proteine verstanden, deren reine Aminosäurekette chemisch modifiziert worden ist. Solche Derivatisierungen können beispielsweise biologisch im Zusammenhang mit der Proteinbiosynthese durch die Wirtszelle erfolgen. Hierfür können molekularbiologische Methoden eingesetzt werden. Sie können aber auch chemisch durchgeführt werden, etwa durch die chemische Umwandlung einer Seitenkette einer Aminosäure oder durch kovalente Bindung einer anderen Verbindung an das Protein. Bei solch einer Verbindung kann es sich beispielsweise auch um andere Proteine handeln, die beispielsweise über bifunktionelle chemische Verbindungen an erfindungsgemäße Proteine gebunden werden. Derartige Modifizierungen können beispielsweise die Substratspezifität oder die Bindungsstärke an das Substrat beeinflussen oder eine vorübergehende Blockierung der enzymatischen Aktivität herbeiführen, wenn es sich bei der angekoppelten Substanz um einen Inhibitor handelt. Dies kann beispielsweise für den Zeitraum der Lagerung sinnvoll sein. Ebenso ist unter Derivatisierung die kovalente Bindung an einen makromolekularen Träger zu verstehen, genauso wie auch ein nichtkovalenter Einschluss in geeignete makromolekulare Käfigstrukturen. Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellt somit eine Protease dar, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie aus einer erfindungsgemäßen Protease als Ausgangsmolekül erhaltbar ist durch Fragmentierung, Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutagenese und eine Aminosäuresequenz umfasst, die über eine Länge von mindestens 300 und zunehmend bevorzugt mindestens 290, 280, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60 und 50 zusammenhängenden Aminosäurepositionen mit dem Ausgangsmolekül übereinstimmt.
So ist es beispielsweise möglich, an den Termini oder in den Loops des Enzyms einzelne Aminosäuren zu deletieren, ohne daß dadurch die proteolytische Aktivität verlorengeht. Durch derartige Deletionen kann beispielsweise oftmals auch die Allergenizität betreffender Proteasen gesenkt und somit insgesamt ihre Einsetzbarkeit verbessert werden. Die Fragmentierung kommt dem nachstehend ausgeführten Aspekt der Insertions- oder Substitutionsmutagenese und/oder auch einer möglichen Fusion mit anderen Enzymen zugute. Hinsichtlich des beabsichtigten Einsatzes dieser Enzyme ist es besonders bevorzugt, wenn sie auch nach der Fragmentierung oder Deletionsmutagenese eine proteolytische Aktivität besitzen.
Auch Insertionen und Substitionen in Subtilasen können voteilhafte Wirkungen begründen. Prinzipiell gehören hierzu auch Einzelaustausche von Aminosäuren, es können aber auch mehrere zusammenhängende Aminosäuren gegen andere ausgetauscht werden. Hierzu gehören auch Neukombinationen von größeren Enzymabschnitten, so den oben genannten Fragmenten, mit anderen Proteasen oder Proteinen anderer Funktion. So ist es beispielsweise möglich, ein erfindungsgemäßes Protein oder Teile davon über peptidische Linker oder direkt als Fusionsprotein mit Bindungsdomänen aus anderen Proteinen, etwa der Cellulose- Bindungsdomäne, zu versehen und dadurch die Hydrolyse des Substrats effektiver zu gestalten. Ebenso können erfindungsgemäße Proteine beispielsweise auch mit Amylasen oder Cellulasen verknüpft werden, um eine Doppelfunktion auszuüben.
Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellt eine Protease dar, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie aus einer erfindungsgemäßen Protease als Ausgangsmolekül erhaltbar ist und einen oder mehrere Aminosäureaustausche in Positionen aufweist, die den Positionen 3, 4, 36, 42, 47, 56, 61 , 69, 87, 96, 99, 101 , 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141 , 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 211 , 224, 229, 236, 237, 242, 243, 255 und 268 der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus gemäß SEQ ID NO. 4 in einem Alignment zugeordnet sind. Die Aminosäurepositionen werden hierbei durch ein Alignment der Aminosäuresequenz einer erfindungsgemäßen Protease mit der Aminosäuresequenz der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus, wie sie in SEQ ID NO. 4 angegeben ist, definiert. Auf diese Art und Weise werden so genannte homologe Positionen bestimmt und einander zugeordnet. Ein Beispiel für ein solches Alignment ist in Figur 1 angegeben.
Eine endgültige Bestätigung in der Zuordnung homologer Positionen, d.h. insbesondere deren funktionelle Entsprechung, können letztlich nur Vergleichsversuche liefern, wonach die beiden auf der Basis eines Alignments einander zugeordneten Positionen in beiden miteinander verglichenen Proteasen auf die gleiche Weise punktmutiert werden und beobachtet wird, ob bei beiden die enzymatische Aktivität auf gleiche Weise verändert wird. Geht beispielsweise ein Aminosäureaustausch in einer bestimmten Position der B. lentus-Alkalische Protease (BLAP) mit einer Erhöhung von KM oder einem anderen enzymatischen Parameter einher, und wird tendenziell die gleiche Verschiebung des KM-Werts in einer erfindungsgemäßen Protease-Variante beobachtet, deren Aminosäureaustausch durch dieselbe eingeführte Aminosäure erreicht wurde, so ist hierin die Bestätigung dieses Erfindungsaspekts zu sehen.
Da die B. lentus-Alkalische Protease im Stand der Technik ein wichtiges Referenzmolekül zur Beschreibung neuer Proteasen und von Punktmutationen darstellt und die hier beschriebenen neuen Proteasen und somit auch ihre Sequenz bislang unbekannt sind, erscheint es vorteilhaft, in der Zuordnung der Punktmutationen auf die Zählung der Alkalische Protease aus Bacillus lentus (SEQ ID NO. 4) Bezug zu nehmen. Weiterhin richtet sich die Zählung im Allgemeinen nach dem reifen (maturen) Protein. Vorteilhafte Positionen für Sequenzveränderungen, beispielsweise durch Punktmutationen, der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus, die übertragen auf homologe Positionen der erfindungsgemäßen Proteasen bevorzugt von Bedeutung sind und der Protease vorteilhafte funktionelle Eigenschaften verleihen, werden nachfolgend angegeben. Es sind die Positionen 3, 4, 36, 42, 47, 56, 61 , 69, 87, 96, 99, 101 , 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141 , 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 21 1 , 224, 229, 236, 237, 242, 243, 255 und 268, zuzuordnen in einem Alignment mit SEQ ID NO. 4 und damit in der Zählung gemäß SEQ ID NO. 4. Vorteilhaft sind insbesondere beispielsweise Substitutionen 3T, 4I, 61 A, 99G, 99A, 99S, 154D, 154E, 211 D, 211 G und 21 1 E, sofern die entsprechend homologen Positionen nicht schon natürlicherweise von einer dieser bevorzugten Aminosäuren eingenommen werden.
In den genannten Positionen liegen in dem Wildtypmolekül der B. lentus-Alkalischen Protease folgende Aminosäurereste: S3, V4, S36, N42, A47, T56, G61 , T69, E87, A96, R99, A101 , 1102, S104, N114, H1 18, A120, S130, S139, T141 , S142, S154, S157, A188, V193, V199, G205, L211 , A224, K229, S236, N237, N242, H243, N255 beziehungsweise T268.
Die Austausche 3T und 4I führen vermutlich über einen Stabilisierungseffekt auf das Molekül zu einer Verbesserung dessen Beitrags zur Wasch leistung eines Wasch- oder Reinigungsmittels. Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine zuvor beschriebene Protease, die zusätzlich stabilisiert ist, insbesondere durch Kopplung an ein Polymer.
Denn eine Erhöhung der Stabilität bei der Lagerung und/oder während des Einsatzes, beispielsweise beim Waschprozess führt dazu, daß ihre Aktivität länger anhält und damit in der Wirkung verstärkt wird. Als Stabilisierungsmöglichkeiten kommen alle im Stand der Technik beschriebenen und zweckmäßigen Strategien in Betracht.
Alternativ hierzu sind auch solche Stabilisierungen geeignet, die über Pu nktm utagenese des Moleküls selbst möglich sind (und aufgrund der Sequenzunterschiede bereits unter die oben beschriebenen Ausführungsformen fallen). Denn diese Stabilisierungen erfordern im Anschluß an die Proteingewinnung keine weiteren Arbeitsschritte. Einige hierfür geeignete Punktmutationen sind an sich aus dem Stand der Technik bekannt. So können Proteasen beispielsweise auch dadurch stabilisiert werden, dass man bestimmte Tyrosin-Reste gegen andere austauscht.
Weitere Möglichkeiten sind beispielsweise:
- Veränderung der Bindung von Metallionen, insbesondere der Calcium-Bindungsstellen, beispielsweise durch Austauschen von einer oder mehreren der an der Calcium-Bindung beteiligten Aminosäure gegen eine oder mehrere negativ geladene Aminosäuren und/oder durch Einführen von Punktmutationen in mindestens einer der Folgen der beiden Aminosäuren Arginin/Glycin;
- Schutz gegen den Einfluß von denaturierenden Agentien wie Tensiden durch Mutationen, die eine Veränderung der Aminosäuresequenz auf bzw. an der Oberfläche des Proteins bewirken;
- Austausch von Aminosäuren, die nahe dem N-Terminus liegen, gegen solche, die vermutlich über nicht-kovalente Wechselwirkungen mit dem Rest des Moleküls in Kontakt treten und somit einen Beitrag zur Aufrechterhaltung der globulären Struktur leisten.
Bevorzugte Ausführungsformen sind solche, bei denen das Molekül auf mehrere Arten stabilisiert wird. Denn es kann davon ausgegangen werden, dass mehrere stabilisierende Mutationen additiv oder synergistisch wirken.
Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellt eine Protease wie vorstehend beschrieben dar, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie mindestens eine chemische Modifikation aufweist. Eine Protease mit einer solchen Veränderung wird auch als Derivat bezeichnet, d.h. die Protease ist derivatisiert.
Unter Derivaten werden daher solche Proteine verstanden, die durch eine zusätzliche Modifikation aus den ausgeführten Proteinen erhalten werden. Bevorzugt handelt es sich hierbei um eine chemische Modifikation der erfindungsgemäßen Proteine. Derartige Modifikationen können beispielsweise die Stabilität, Substratspezifität oder die Bindungsstärke an das Substrat oder die enzymatische Aktivität beeinflussen. Sie können auch dazu dienen, um die Allergenizität und/oder Immunogenizität des Proteins herabzusetzen und damit beispielsweise dessen Hautverträglichkeit zu erhöhen.
Solche Derivatisierungen, insbesondere chemische Modifikationen, können beispielsweise auf biologischem Wege erfolgen, etwa im Zusammenhang mit der Proteinbiosynthese durch den produzierenden Wirtsorganismus. Hier sind Kopplungen niedrigmolekularer Verbindungen wie von Lipiden oder Oligosacchariden besonders hervorzuheben.
Derivatisierungen können aber auch auf chemischem Wege durchgeführt werden, etwa durch die chemische Umwandlung einer Seitenkette oder durch kovalente Bindung einer anderen, beispielsweise makromolekularen Verbindung an das Protein, beispielsweise die Kopplung von Aminen an Carboxylgruppen eines Enzyms zur Veränderung des isoelektrischen Punkts. Es können ferner auch Makromoleküle wie Proteine, etwa über bifunktionelle chemische Verbindungen, an erfindungsgemäße Proteine gebunden werden. So ist es beispielsweise möglich, ein erfindungsgemäßes Protein auch über einen Nichtprotein-Linker mit einer spezifischen Bindungsdomäne zu versehen. Solche Derivate eignen sich besonders für den Einsatz in in Wasch- oder Reinigungsmitteln. Ferner können auch Protease-Inhibitoren über Linker, insbesondere Aminosäure-Linker, an die erfindungsgemäßen Proteine gebunden werden. Kopplungen mit sonstigen makromolekularen Verbindungen, wie etwa Polyethylenglykol, können das Protein auch hinsichtlich weiterer Eigenschaften wie Stabilität oder Hautverträglichkeit verbessern.
Unter Derivaten erfindungsgemäßer Proteine können im weitesten Sinne auch Präparationen dieser Proteine verstanden werden. Je nach Gewinnung, Aufarbeitung oder Präparation kann ein Protein mit diversen anderen Stoffen vergesellschaftet sein, beispielsweise aus der Kultur der produzierenden Mikroorganismen. Ein Protein kann auch, beispielsweise zur Erhöhung seiner Lagerstabilität, mit bestimmten anderen Stoffen gezielt versetzt worden sein. Erfindungsgemäß sind deshalb auch alle Präparationen eines erfindungsgemäßen Proteins. Das ist auch unabhängig davon, ob es in einer bestimmten Präparation tatsächlich diese enzymatische Aktivität entfaltet oder nicht. Denn es kann gewünscht sein, daß es bei der Lagerung keine oder nur geringe Aktivität besitzt, und erst zum Zeitpunkt der Verwendung seine proteolytische Funktion entfaltet. Dies kann beispielsweise über entsprechende Begleitstoffe gesteuert werden. Insbesondere die gemeinsame Präparation von Proteasen mit Protease-Inhibitoren ist vorteilhaft und aus dem Stand der Technik bekannt. Die Lösung einer Teilaufgabe und somit einen eigenständigen Erfindungsgegenstand bilden Nukleinsäuremoleküle, die für eine erfindungsgemäße Protease kodieren sowie Vektoren, enthaltend solche Nukleinsäuremoleküle.
Unter Nukleinsäuren sind im Sinne der vorliegenden Anmeldung die natürlicherweise aus Nukleotiden aufgebauten als Informationsträger dienenden Moleküle zu verstehen, die für die lineare Aminosäureabfolge in Proteinen oder Enzymen kodieren. Sie können als Einzelstrang, als ein zu diesem Einzelstrang komplementärer Einzelstrang oder als Doppelstrang vorliegen. Als der natürlicherweise dauerhaftere Informationsträger ist die Nukleinsäure DNA für molekularbiologische Arbeiten bevorzugt. Demgegenüber wird für die Realisierung der Erfindung in natürlicher Umgebung, wie beispielsweise in einer exprimierenden Zelle, eine RNA gebildet, weshalb erfindungswesentliche RNA-Moleküle ebenfalls Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darstellen.
Bei DNA sind die Sequenzen beider komplementärer Stränge in jeweils allen drei möglichen Leserastern zu berücksichtigen. Ferner ist zu berücksichtigen, dass verschiedene Codon-Triplets für dieselben Aminosäuren codieren können, so dass eine bestimmte Aminosäure-Abfolge von mehreren unterschiedlichen und möglicherweise nur geringe Identität aufweisenden Nukleotid- sequenzen abgeleitet werden kann, was als Degeneriertheit des genetischen Codes bezeichnet wird. Außerdem weisen verschiedene Organismen Unterschiede im Gebrauch dieser Codons auf. Aus diesen Gründen müssen sowohl Aminosäuresequenzen als auch Nukleotidsequenzen in die Betrachtung des Schutzbereichs einbezogen werden. Daher sind sämtliche Nukleotidsequenzen in die Erfindung mit eingeschlossen, die eine der vorstehend beschriebenen Proteasen kodieren können. Der Fachmann ist in der Lage, diese Nukleotidsequenzen zweifelsfrei zu bestimmen, da trotz der Degeneriertheit des genetischen Codes einzelnen Codons definierte Aminosäuren zuzuordnen sind. Daher kann der Fachmann ausgehend von einer sind jeweils nur als eine beispielhafte Codierung für eine bestimmte Aminosäurefolge anzusehen.
Die einem Protein entsprechende Informationseinheit wird auch im Sinne der vorliegenden Anmeldung als Gen bezeichnet.
Einem Fachmann ist es über heutzutage allgemein bekannte Methoden, wie beispielsweise die chemische Synthese oder die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) in Verbindung mit molekularbiologischen und/oder proteinchemischen Standardmethoden möglich, anhand bekannter DNA- und/oder Aminosäuresequenzen die entsprechenden Nukleinsäuren bis hin zu vollständigen Genen herzustellen. Derartige Methoden sind beispielsweise aus Sambrook, J., Fritsch, E. F. and Maniatis, T. 2001. Molecular cloning: a laboratory manual, 3. Edition CoId Spring Laboratory Press, bekannt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das Nukleinsäuremolekül, das für eine erfindungsgemäße Protease kodiert, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus a) Nukleinsäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleinsäuresequenz in einem Teilstück von mindestens 300 zusammenhängenden Nukleotiden mindestens zu 59% identisch ist b) Nukleinsäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleinsäuresequenz in den Positionen 343 bis 1269 mindestens zu 59% identisch ist c) Nukleinsäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleinsäuresequenz mindestens zu 59% identisch ist.
In weiteren Ausführungsformen der Erfindung ist das Nukleinsäuremolekül dadurch gekennzeichnet, dass es eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleinsäuresequenz in einem Teilstück von zunehmend bevorzugt 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000, 1100 zusammenhängenden Nukleinsäureresten mindestens zu 59% und zunehmend bevorzugt zu mindestens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Nukleinsäuremolekül, das für eine erfindungsgemäße Protease kodiert, dadurch gekennzeichnet, dass es eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleinsäuresequenz in den Positionen 343 bis 1269 zunehmend bevorzugt zu mindestens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist. Mit diesen Positionen ist wie vorstehend erläutert der Bereich gemeint, der für das reife (mature), das heißt auch für das aktive Protein codiert. Auch das Stop-Codon ist einbezogen, denn dessen Existenz sorgt dafür, dass nicht ein größeres, evtl. nicht mehr funktionsfähiges, ungewolltes Fusionsprotein gebildet wird. Somit ist bei einer Klonierung darauf zu achten, dass an dieser Stelle ebenfalls ein Stop-Codon liegt, wenn nicht gezielt über den C-Terminus eine Proteinfusion herbeigeführt werden soll. Sollte sich später herausstellen, dass das reife (mature) Protein nur von einem Teil dieser Sequenz gebildet wird, so gilt der Schutzbereich entsprechend für diesen Teil.
In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Nukleinsäuremolekül dadurch gekennzeichnet, dass es eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleinsäuresequenz zunehmend bevorzugt zu mindestens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist.
Bevorzugt sind solche Nukleinsäuren, die für reife (mature) Proteine codieren, und zunehmend bevorzugt sind besonders solche, die für zunehmend aktivere Varianten der erfindungsgemäßen Proteine codieren.
Weiterhin bevorzugt sind solche Nukleinsäuren, von denen eines oder vorzugsweise mehrere Codons durch synonyme Codons ersetzt worden sind.
Dieser Aspekt bezieht sich auf die heterologe Expression der betreffenden Proteasen. So besitzt jeder Organismus, insbesondere jeder Produktionsstamm, eine gewisse Codon-Usage. Hierbei kann es zu Engpässen in der Proteinbiosynthese kommen, wenn die auf der transgenen Nukleinsäure liegenden Codons in der Wirtszelle einer vergleichsweise geringen Zahl von beladenen tRNAs gegenüberstehen. Synonyme Codons codieren dagegen für dieselben Aminosäuren und können in Abhängigkeit vom Wirt besser translatiert werden. Dieses gegebenenfalls notwendige Umschreiben hängt somit ab von der Wahl des Expressionssystems. Insbesondere bei Proben aus unbekannten, eventuell nicht kultivierbaren Organismen kann eine entsprechende Anpassung notwendig sein.
Die vorliegende Erfindung umfasst die Herstellung rekombinanter Proteine. Hierunter sind erfindungsgemäß alle gentechnischen oder mikrobiologischen Verfahren zu verstehen, die darauf beruhen, dass die Gene für die interessierenden Proteine in eine für die Produktion geeignete Wirtszelle eingebracht und von dieser transkribiert und translatiert werden. Geeigneterweise erfolgt die Einschleusung der betreffenden Gene über Vektoren, insbesondere Expressionsvektoren; aber auch über solche, die bewirken, dass das interessierende Gen in der Wirtszelle in ein bereits vorhandenes genetisches Element wie das Chromosom oder andere Vektoren eingefügt werden kann. Die funktionelle Einheit aus Gen und Promotor und eventuellen weiteren genetischen Elementen wird erfindungsgemäß als Expressionskassette bezeichnet. Sie muss dafür jedoch nicht notwendigerweise auch als physische Einheit vorliegen.
Unter Vektoren werden im Sinne der vorliegenden Erfindung aus Nukleinsäuren bestehende Elemente verstanden, die als kennzeichnenden Nukleinsäurebereich ein interessierendes Gen enthalten. Sie vermögen dieses in einer Spezies oder einer Zellinie über mehrere Generationen oder Zellteilungen hinweg als stabiles genetisches Element zu etablieren. Vektoren sind insbesondere bei der Verwendung in Bakterien spezielle Plasmide, also zirkuläre genetische Elemente.
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung wird die Nukleinsäure geeigneterweise in einen Vektor kloniert. Ein weiterer molekularbiologischer Aspekt der Erfindung besteht somit in Vektoren mit den Genen für die entsprechenden Proteine. Dazu können beispielsweise solche gehören, die sich von bakteriellen Plasmiden, von Viren oder von Bacteriophagen ableiten, oder überwiegend synthetische Vektoren oder Plasmide mit Elementen verschiedenster Herkunft. Mit den weiteren jeweils vorhandenen genetischen Elementen vermögen Vektoren sich in den betreffenden Wirtszellen über mehrere Generationen hinweg als stabile Einheiten zu etablieren. Es ist dabei im Sinne der Erfindung unerheblich, ob sie sich extrachomosomal als eigene Einheiten etablieren oder in ein Chromosom bzw. chromosomale DNA integrieren. Welches der zahlreichen aus dem Stand der Technik bekannten Systeme gewählt wird, hängt vom Einzelfall ab. Ausschlaggebend können beispielsweise die erreichbare Kopienzahl, die zur Verfügung stehenden Selektionssysteme, darunter vor allem Antibiotikaresistenzen, oder die Kultivierbarkeit der zur Aufnahme der Vektoren befähigten Wirtszellen sein.
Die Vektoren bilden geeignete Ausgangspunkte für molekularbiologische und biochemische Untersuchungen des betreffenden Gens oder zugehörigen Proteins und für erfindungsgemäße Weiterentwicklungen und letztlich für die Amplifikation und Produktion erfindungsgemäßer Proteine.
Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellen somit Vektoren dar, die mindestens ein Nukleinsäuremolekül beinhalten, welches für eine erfindungsgemäße Protease kodiert, insbesondere ein Nukleinsäuremolekül, wie es vorstehend beschrieben ist. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist der Vektor dadurch gekennzeichnet, dass der Vektor ein Klonierungsvektor oder ein Expressionsvektor ist. Klonierungsvektoren eignen sich neben der Lagerung, der biologischen Amplifikation oder der Selektion des interessierenden Gens für die Charakterisierung des betreffenden Gens, etwa über das Erstellen einer Restriktionskarte oder die Sequenzierung. Klonierungsvektoren sind auch deshalb bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, weil sie eine transportierbare und lagerfähige Form der beanspruchten DNA darstellen. Sie sind auch bevorzugte Ausgangspunkte für molekularbiologische Techniken, die nicht an Zellen gebunden sind, wie beispielsweise die Polymerasekettenreaktion.
Expressionsvektoren sind chemisch den Klonierungsvektoren ähnlich, unterscheiden sich aber in jenen Teilsequenzen, die sie dazu befähigen, in den für die Produktion von Proteinen optimierten Wirtszellen oder Wirtsorganismen zu replizieren und dort das enthaltene Gen zur Expression zu bringen, d.h. die genetische Information des interessierenden Gens in der Wirtszelle als Protein zu realisieren. Bevorzugte Ausführungsformen sind Expressionsvektoren, die selbst die zur Expression notwendigen genetischen Elemente tragen. Die Expression wird beispielsweise von Promotoren beeinflußt, welche die Transkription des Gens regulieren. So kann die Expression durch den natürlichen, ursprünglich vor diesem Gen lokalisierten Promotor erfolgen, aber auch nach gentechnischer Fusion sowohl durch einen auf dem Expressionsvektor bereitgestellten Promotor der Wirtszelle als auch durch einen modifizierten oder einen völlig anderen Promotor eines anderen Organismus oder einer anderen Wirtszelle.
Bevorzugte Ausführungsformen sind solche Expressionsvektoren, die über Änderungen der Kulturbedingungen oder Zugabe von bestimmten Verbindungen, wie beispielsweise die Zelldichte oder spezielle Faktoren, regulierbar sind, beispielsweise induzierbare Vektoren. Expressionsvektoren ermöglichen, dass das zugehörige Protein heterolog, also in einer anderen Zelle bzw. Wirtszelle als derjenigen, aus der es natürlicherweise gewonnen werden kann, produziert wird. Die Zellen können dabei durchaus zu verschiedenen Organismen zugehörig sein oder von verschiedenen Organismen stammen. Auch eine homologe Proteingewinnung aus einer das Gen natürlicherweise exprimierenden Wirtszelle über einen passenden Vektor liegt innerhalb des Schutzbereichs der vorliegenden Erfindung. Diese kann den Vorteil aufweisen, dass natürliche, mit der Translation in einem Zusammenhang stehende Modifikationsreaktionen an dem entstehenden Protein genauso durchgeführt werden, wie sie auch natürlicherweise ablaufen würden.
Eine weitere Ausführungsform stellen Expressionssysteme dar, bei denen zusätzliche Gene, beispielsweise solche, die auf anderen Vektoren zur Verfügung gestellt werden, die Produktion erfindungsgemäßer Proteine beeinflussen. Hierbei kann es sich um modifizierende Genprodukte handeln oder um solche, die mit dem erfindungsgemäßen Protein gemeinsam aufgereinigt werden sollen, etwa um dessen enzymatische Funktion zu beeinflussen. Dabei kann es sich beispielsweise um andere Proteine oder Enzyme, um Inhibitoren oder um solche Elemente handeln, die die Wechselwirkung mit verschiedenen Substraten beinflussen.
Alternative Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können auch zellfreie Expressionssysteme sein, bei denen die Proteinbiosynthese in vitro nachvollzogen wird. Derartige Expressionssysteme sind im Stand der Technik ebenfalls etabliert.
Ein weiterer Gegenstand der Erfindung ist eine nicht menschliche Wirtszelle, die eine erfindungsgemäße Protease oder ein Fragment derselben beinhaltet oder die zu deren Herstellung angeregt werden kann, vorzugsweise unter Einsatz eines Expressionsvektors. Die in-vivo- Synthese eines erfindungsgemäßen Enzyms, also die durch lebende Zellen, erfordert den Transfer des zugehörigen Gens in eine Wirtszelle, deren sogenannte Transformation. Als Wirtszellen eignen sich prinzipiell alle Zellen, das heißt prokaryotische oder eukaryotische Zellen. Bevorzugt sind solche Wirtszellen, die sich genetisch vorteilhaft handhaben lassen, was beispielsweise die Transformation mit dem Expressionsvektor und/oder dessen stabile Etablierung angeht, beispielsweise einzellige Pilze oder Bakterien. Zudem zeichnen sich bevorzugte Wirtszellen durch eine gute mikrobiologische und biotechnologische Handhabbarkeit aus. Das betrifft beispielsweise leichte Kultivierbarkeit, hohe Wachstumsraten, geringe Anforderungen an Fermentationsmedien und gute Produktions- und Sekretionsraten für Fremd proteine. Häufig müssen aus der Fülle an verschiedenen im Stand der Technik zur Verfügung stehenden Systemen die optimalen Expressionssysteme für den Einzelfall experimentell ermittelt werden. Jedes erfindungsgemäße Protein kann auf diese Weise aus einer Vielzahl von Wirtszellen gewonnen werden. Auch solche Wirtszellen sind bevorzugt, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie nach Transformation mit einem der oben beschriebenen Vektoren erhalten worden sind. Dabei kann es sich beispielsweise auch um Klonierungsvektoren handeln, die zur Lagerung und/oder Modifikation beispielsweise in einen beliebigen Bakterienstamm oder eine andere erfindungsgemäße Wirtszelle eingebracht worden sind. Solche Schritte sind in der Lagerung und in der Weiterentwicklung betreffender genetischer Elemente allgemein verbreitet. Da aus diesen Wirtszellen die betreffenden genetischen Elemente in nachfolgende, zur Expression geeignete Wirtszellen unmittelbar übertragen werden können, handelt es sich auch bei den vorangegangenen Transformationsprodukten um Verwirklichungen des betreffenden Erfindungsgegenstands.
Bevorzugte Ausführungsformen stellen solche Wirtszellen dar, die aufgrund genetischer Regulationselemente, die beispielsweise auf dem Expressionsvektor zur Verfügung gestellt werden, aber auch von vornherein in diesen Zellen vorhanden sein können, in ihrer Aktivität regulierbar sind. Beispielsweise durch kontrollierte Zugabe von chemischen Verbindungen, die als Aktivatoren dienen, durch Änderung der Kultivierungsbedingungen oder bei Erreichen einer bestimmten Zelldichte können diese zur Expression angeregt werden. Dies ermöglicht eine sehr wirtschaftliche Produktion der interessierenden Proteine.
Bevorzugte Wirtszellen sind prokaryontische oder bakterielle Zellen. Bakterien zeichnen sich gegenüber Eukaryonten in der Regel durch kürzere Generationszeiten und geringere Ansprüche an die Kultivierungsbedingungen aus. Dadurch können kostengünstige Verfahren zur Gewinnung erfindungsgemäßer Proteine etabliert werden. Bei gram-negativen Bakterien, wie beispielsweise Escherichia coli (E. coli), werden eine Vielzahl von Proteinen in den periplasmatischen Raum sekretiert, also in das Kompartiment zwischen den beiden die Zellen einschließenden Membranen. Dies kann für spezielle Anwendungen vorteilhaft sein. Grampositive Bakterien, wie beispielsweise Bacilli oder Actinomyceten oder andere Vertreter der Actinomycetales, besitzen demgegenüber keine äußere Membran, so dass sekretierte Proteine sogleich in das die Zellen umgebende Nährmedium abgegeben werden, aus welchem sich nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform die exprimierten erfindungsgemäßen Proteine direkt aufreinigen lassen.
Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellen somit Wirtszellen dar, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie die Protease oder ein Fragment derselben in das die Wirtszelle umgebende Medium sezernieren.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Wirtszelle dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Bakterium ist, insbesondere eines, welches ausgewählt ist aus der Gruppe der Gattungen von Escherichia, Klebsiella, Bacillus, Staphylococcus, Corynebakterium, Arthrobacter, Streptomyces, Stenotrophomonas und Pseudomonas.
Besonders bevorzugt handelt es sich bei der Wirtszelle um ein Bakterium, welches ausgewählt ist aus der Gruppe von Escherichia coli, Klebsiella planticola, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus alcalophilus, Bacillus globigii, Bacillus gibsonii, Bacillus pumilus, Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Arthrobacter oxidans, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor und Stenotrophomonas maltophilia.
Die Wirtszellen können hinsichtlich ihrer Anforderungen an die Kulturbedingungen verändert sein, andere oder zusätzliche Selektionsmarker aufweisen oder andere oder zusätzliche Proteine exprimieren. Es kann sich insbesondere um solche Wirtszellen handeln, die zusätzlich zu dem erfindungsgemäß hergestellten Protein noch weitere, insbesondere wirtschaftlich interessante Proteine exprimieren.
Die Wirtszelle kann aber auch eine eukaryontische Zelle sein, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie einen Zellkern besitzt. Einen weitere Ausführungsform der Erfindung stellt daher eine Wirtszelle dar, die dadurch gekennzeichnet ist, dass sie einen Zellkern besitzt.
Im Gegensatz zu prokaryontischen Zellen sind eukaryontische Zellen in der Lage, das gebildete Protein posttranslational zu modifizieren. Beispiele dafür sind Pilze wie Actinomyceten oder Hefen wie Saccharomyces oder Kluyveromyces. Dies kann beispielsweise dann besonders vorteilhaft sein, wenn die Proteine im Zusammenhang mit ihrer Synthese spezifische Modifikationen erfahren sollen, die derartige Systeme ermöglichen. Zu den Modifikationen, die eukaryontische Systeme besonders im Zusammenhang mit der Proteinsynthese durchführen, gehören beispielsweise die Bindung niedermolekularer Verbindungen wie Membrananker oder Oligosaccharide. Derartige Oligosaccharid-Modifikationen können beispielsweise zur Senkung der Allergenizität wünschenswert sein. Auch eine Coexpression mit den natürlicherweise von derartigen Zellen gebildeten Enzymen, wie beispielsweise Cellulasen, kann vorteilhaft sein. Ferner können sich beispielsweise thermophile pilzliche Expressionssysteme besonders zur Expression temperaturbeständiger Varianten eignen.
Die erfindungsgemäßen Wirtszellen werden in an sich bekannter Weise kultiviert und fermentiert, beispielsweise in diskontinuierlichen oder kontinuierlichen Systemen. Im ersten Fall wird ein geeignetes Nährmedium mit den Wirtszellen beimpft und das Produkt nach einem experimentell zu ermittelnden Zeitraum aus dem Medium geerntet. Kontinuierliche Fermentationen zeichnen sich durch Erreichen eines Fließgleichgewichts aus, in dem über einen vergleichsweise langen Zeitraum Zellen teilweise absterben aber auch nachwachsen und gleichzeitig Produkt aus dem Medium entnommen werden kann.
Fermentationsverfahren sind an sich aus dem Stand der Technik bekannt und stellen den eigentlichen großtechnischen Produktionsschritt dar, in der Regel gefolgt von einer geeigneten Aufreinigungsmethode des hergestellten Produktes, beispielsweise des rekombinanten Proteins. Alle Fermentationsverfahren, die auf einem der oben ausgeführten Verfahren zur Herstellung der rekombinanten Proteine beruhen, stellen entsprechend bevorzugte Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstandes dar.
Hierbei müssen die für die eingesetzten Herstellungsverfahren, für die Wirtszellen und/oder die herzustellenden Proteine jeweils optimalen Bedingungen anhand der zuvor optimierten Kulturbedingungen der betreffenden Stämme nach dem Wissen des Fachmanns, beispielsweise hinsichlich Fermentationsvolumen, Medienzusammensetzung, Sauerstoffversorgung oder Rührergeschwindigkeit experimentell ermittelt werden.
Fermentationsverfahren, die dadurch gekennzeichnet sind, dass die Fermentation über eine Zulaufstrategie durchgeführt wird, kommen ebenfalls in Betracht. Hierbei werden die Medienbestandteile, die durch die fortlaufende Kultivierung verbraucht werden, zugefüttert; man spricht auch von einer Zufütterungsstrategie. Hierdurch können beträchtliche Steigerungen sowohl in der Zelldichte, als auch in der Biotrockenmasse und/oder vor allem der Aktivität des interessierenden Proteins erreicht werden.
Analog dazu kann die Fermentation auch so gestaltet werden, dass unerwünschte Stoffwechselprodukte herausgefiltert oder durch Zugabe von Puffer oder jeweils passende Gegenionen neutralisiert werden. Das hergestellte Protein kann nachträglich aus dem Fermentationsmedium geerntet werden. Dieses Fermentationsverfahren ist gegenüber der Produktaufbereitung aus der Trockenmasse bevorzugt, erfordert jedoch die Zurverfügungstellung geeigneter Sekretionsmarker und Transportsysteme. Ohne Sekretion ist u.U. die Aufreinigung des Proteins aus der Zellmasse erforderlich, auch dazu sind verschiedene Verfahren bekannt, wie Fällung z.B. durch Ammoniumsulfat oder Ethanol, oder die chromatographische Reinigung, wenn erforderlich bis zur Homogenität. Die Mehrzahl der beschriebenen technischen Verfahren dürfte jedoch mit einer angereicherten, stabilisierten Präparation auskommen.
Alle bereits oben ausgeführten Elemente können zu Verfahren kombiniert werden, um erfindungsgemäße Proteine herzustellen. Es ist dabei für jedes erfindungsgemäße Protein eine Vielzahl von Kombinationsmöglichkeiten an Verfahrensschritten denkbar. Das optimale Verfahren muß für jeden konkreten Einzelfall experimentell ermittelt werden.
Durch Expression oder Klonierung können die erfindungsgemäßen Proteasen in der für den technischen Einsatz erforderlichen Menge zur Verfügung gestellt werden.
Einen eigenständigen Erfindungsgegenstand stellen somit auch Verfahren zur Herstellung einer erfindungsgemäßen Protease dar. Dazu gehört jedes Verfahren, das zur Herstellung einer oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Protease geeignet ist beziehungsweise das den Erhalt einer erfindungsgemäßen Protease ermöglicht. Hierzu zählen beispielsweise auch chemische Syntheseverfahren.
Demgegenüber bevorzugt sind jedoch alle im Stand der Technik etablierten, oben in einzelnen Aspekten bereits angesprochenen molekularbiologischen, mikrobiologischen beziehungsweise biotechnologischen Herstellverfahren, die auf den oben bezeichneten erfindungsgemäßen Proteinen, Nukleinsäuremolekülen, Vektoren oder Wirtszellen aufbauen. Hierfür kann entsprechend dem oben Gesagten beispielsweise auf die im Sequenzprotokoll unter SEQ ID NO. 1 angegebene Nukleinsäure oder hieraus erhaltene Mutanten oder Teilsequenzen zurückgegriffen werden.
Vorzugsweise handelt es sich dabei um Verfahren, die unter Einsatz einer zuvor bezeichneten Nukleinsäure, vorzugsweise unter Einsatz eines vorstehend beschriebenen Vektors und besonders bevorzugt vorzugsweise unter Einsatz einer zuvor bezeichneten, vorteilhafterweise gentechnisch modifizierten Wirtszelle erfolgen. Denn hierdurch wird die entsprechend bevorzugte genetische Information in mikrobiologisch verwertbarer Form zur Verfügung gestellt. Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung können auf der Grundlage der zugehörigen Nukleinsäuresequenzen auch zellfreie Expressionssysteme sein, bei denen die Proteinbiosynthese in vitro nachvollzogen wird. Alle bereits oben ausgeführten Elemente können auch zu neuen Verfahren kombiniert werden, um erfindungsgemäße Proteine herzustellen. Es ist dabei für jedes erfindungsgemäße Protein eine Vielzahl von Kombinationsmöglichkeiten an Verfahrensschritten denkbar, so dass optimale Verfahren für jeden konkreten Einzelfall experimentell ermittelt werden müssen.
Entsprechend dem oben Gesagten sind unter den genannten Verfahren weiterhin solche bevorzugt, bei denen die Nukleotidsequenz in einem, vorzugsweise mehreren Codons an die Codon-Usage des Wirtsstamms angepasst worden ist.
Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellt ein Mittel dar, das dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens eine erfindungsgemäße Protease wie vorstehend beschrieben enthält.
Hiermit werden alle Arten von Mitteln, insbesondere Gemische, Rezepturen, Lösungen etc., deren Einsetzbarkeit durch Zugabe eines oben beschriebenen, erfindungsgemäßen Proteins verbessert wird, in den Schutzbereich der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Es kann sich dabei je nach Einsatzgebiet beispielsweise um feste Gemische, beispielsweise Pulver mit gefriergetrockeneten oder verkapselten Proteinen, oder um gelförmige oder flüssige Mittel handeln. Bevorzugte Rezepturen enthalten beispielsweise Puffersubstanzen, Stabilisatoren, Reaktionspartner und/oder Cofaktoren der Proteasen und/oder andere mit den Proteasen synergistische Inhaltsstoffe. Insbesondere sind darunter Mittel für die weiter unten ausgeführten Einsatzgebiete zu verstehen. Weitere Einsatzgebiete gehen aus dem Stand der Technik hervor und werden beispielsweise in dem Handbuch „Industrial enyzmes and their applications" von H. UhNg, Wiley-Verlag, New York, 1998 dargestellt.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist ein erfindungsgemäßes Mittel dadurch gekennzeichnet, dass es ein Waschmittel, Handwaschmittel, Spülmittel, Handgeschirrspülmittel, Maschinengeschirrspülmittel, Reinigungsmittel, Zahnprothesen- oder Kontaktlinsenpflegemittel, Nachspülmittel, Desinfektionsmittel, kosmetisches Mittel, pharmazeutisches Mittel oder ein Mittel zur Behandlung von Filtermedien, Textilien, Pelzen, Papier, Fellen oder Leder, ist, insbesondere ein Wäschewaschmittel oder ein Geschirrspülmittel.
Zu diesem Erfindungsgegenstand zählen alle denkbaren Wasch- bzw. Reinigungsmittelarten, sowohl Konzentrate als auch unverdünnt anzuwendende Mittel, zum Einsatz im kommerziellen Maßstab, in der Waschmaschine oder bei der Hand-Wäsche beziehungsweise -Reinigung. Dazu gehören beispielsweise Waschmittel für Textilien, Teppiche, oder Naturfasern, für die nach der vorliegenden Erfindung die Bezeichnung Waschmittel verwendet wird. Dazu gehören beispielsweise auch Geschirrspülmittel für Geschirrspülmaschinen oder manuelle Geschirrspülmittel oder Reiniger für harte Oberflächen wie Metall, Glas, Porzellan, Keramik, Kacheln, Stein, lackierte Oberflächen, Kunststoffe, Holz oder Leder; für solche wird nach der vorliegenden Erfindung die Bezeichnung Reinigungsmittel verwendet.
Ein erfindungsgemäßes Mittel kann sowohl ein Mittel für Großverbraucher oder technische Anwender als auch ein Produkt für den Privatverbraucher sein, wobei alle im Stand der Technik etablierten Wasch- und Reinigungsmittelarten ebenfalls Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darstellen.
Die erfindungsgemäßen Wasch- oder Reinigungsmittel, die als insbesondere pulverförmige Feststoffe, in nachverdichteter Teilchenform, als homogene Lösungen oder Suspensionen vorliegen können, können außer dem erfindungsgemäß eingesetzten Wirkstoff - einer erfindungsgemäßen Protease - im Prinzip alle bekannten und in derartigen Mitteln üblichen Inhaltsstoffe enthalten, wobei mindestens ein weiterer Inhaltsstoff in dem Mittel vorhanden ist. Die erfindungsgemäßen Mittel können insbesondere Buildersubstanzen, oberflächenaktive Tenside, Bleichmittel auf Basis organischer und/oder anorganischer Persauerstoffverbindungen, Bleichaktivatoren, wassermischbare organische Lösungsmittel, Enzyme, Sequestrierungsmittel, Elektrolyte, pH-Regulatoren und weitere Hilfsstoffe wie optische Aufheller, Vergrauungsinhibitoren, Schaumregulatoren sowie Färb- und Duftstoffe sowie Kombinationen hiervon enthalten.
Insbesondere eine Kombination einer erfindungsgemäßen Protease mit einem oder mehreren weiteren lnhaltsstoff(en) der Mittel erweist sich als vorteilhaft, da ein solches Mittel eine verbesserte Reinigungsleistung durch sich ergebende Synergismen, insbesondere zwischen der Protease und dem weiteren Inhaltsstoff, aufweist. Dies bedeutet, dass das Mittel eine verbesserte Entfernung von Anschmutzungen, beispielsweise proteinhaltigen Anschmutzungen, bewirkt im Vergleich mit einem Mittel, welches entweder nur eine der beiden Komponenten beinhaltet, oder auch im Vergleich zur erwarteten Reinigungsleistung eines Mittels mit beiden Komponenten auf Grund der bloßen Addition der jeweiligen Einzelbeiträge dieser beiden Komponenten zur Reinigungsleistung des Mittels. Insbesondere durch die Kombination einer erfindungsgemäßen Protease mit einem der nachfolgend beschriebenen Tenside und/oder Buildersubstanzen und/oder Bleichmittel wird ein solcher Synergismus erreicht.
Die erfindungsgemäßen Mittel können ein Tensid oder mehrere Tenside enthalten, wobei insbesondere anionische Tenside, nichtionische Tenside und deren Gemische, aber auch kationische, zwitterionische und amphotere Tenside in Frage kommen. Geeignete nichtionische Tenside sind insbesondere Alkylglykoside und Ethoxylierungs- und/oder Propoxylierungsprodukte von Alkylglykosiden oder linearen oder verzweigten Alkoholen mit jeweils 12 bis 18 C-Atomen im Alkylteil und 3 bis 20, vorzugsweise 4 bis 10 Alkylethergruppen. Weiterhin sind entsprechende Ethoxylierungs- und/oder Propoxylierungsprodukte von N-Alkyl-aminen, vicinalen Diolen, Fettsäureestern und Fettsäureamiden, die hinsichtlich des Alkylteils den genannten langkettigen Alkoholderivaten entsprechen, sowie von Alkylphenolen mit 5 bis 12 C- Atomen im Alkylrest brauchbar.
Als nichtionische Tenside werden vorzugsweise alkoxylierte, vorteilhafterweise ethoxylierte, insbesondere primäre Alkohole mit vorzugsweise 8 bis 18 C-Atomen und durchschnittlich 1 bis 12 Mol Ethylenoxid (EO) pro Mol Alkohol eingesetzt, in denen der Alkoholrest linear oder bevorzugt in 2-Stellung methylverzweigt sein kann beziehungsweise lineare und methylverzweigte Reste im Gemisch enthalten kann, so wie sie üblicherweise in Oxoalkoholresten vorliegen. Insbesondere sind jedoch Alkoholethoxylate mit linearen Resten aus Alkoholen nativen Ursprungs mit 12 bis 18 C-Atomen, z.B. aus Kokos-, Palm-, Taigfett- oder Oleylalkohol, und durchschnittlich 2 bis 8 EO pro Mol Alkohol bevorzugt. Zu den bevorzugten ethoxylierten Alkoholen gehören beispielsweise Ci2- Ci4-Alkohole mit 3 EO oder 4 EO, C9-Ci i-Alkohole mit 7 EO, Ci3-Ci5-Alkohole mit 3 EO, 5 EO, 7 EO oder 8 EO, Ci2-Ci8-Alkohole mit 3 EO, 5 EO oder 7 EO und Mischungen aus diesen, wie Mischungen aus Ci2-Ci4-Alkohol mit 3 EO und Ci2-Ci8-Alkohol mit 7 EO. Die angegebenen Ethoxylierungsgrade stellen statistische Mittelwerte dar, die für ein spezielles Produkt eine ganze oder eine gebrochene Zahl sein können. Bevorzugte Alkoholethoxylate weisen eine eingeengte Homologenverteilung auf (narrow ränge ethoxylates, NRE). Zusätzlich zu diesen nichtionischen Tensiden können auch Fettalkohole mit mehr als 12 EO eingesetzt werden. Beispiele hierfür sind (TaIg-) Fettalkohole mit 14 EO, 16 EO, 20 EO, 25 EO, 30 EO oder 40 EO. Insbesondere in Mitteln für den Einsatz in maschinellen Verfahren werden üblicherweise extrem schaumarme Verbindungen eingesetzt. Hierzu zählen vorzugsweise Ci2-Ci8-Alkylpolyethylenglykol- polypropylenglykolether mit jeweils bei zu 8 Mol Ethylenoxid- und Propylenoxideinheiten im Molekül. Man kann aber auch andere bekannt schaumarme nichtionische Tenside verwenden, wie zum Beispiel Ci2-Ci8-Alkylpolyethylenglykol-polybutylenglykolether mit jeweils bis zu 8 Mol Ethylenoxid- und Butylenoxideinheiten im Molekül sowie endgruppenverschlossene Alkylpolyalkylenglykol- mischether. Besonders bevorzugt sind auch die hydroxylgruppenhaltigen alkoxylierten Alkohole, wie sie in der europäischen Patentanmeldung EP 0 300 305 beschrieben sind, sogenannte Hydroxymischether. Zu den nichtionischen Tensiden zählen auch Alkylglykoside der allgemeinen Formel RO(G)x eingesetzt werden, in der R einen primären geradkettigen oder methylverzweigten, insbesondere in 2-Stellung methylverzweigten aliphatischen Rest mit 8 bis 22, vorzugsweise 12 bis 18 C-Atomen bedeutet und G für eine Glykoseeinheit mit 5 oder 6 C-Atomen, vorzugsweise für Glucose, steht. Der Oligomerisierungsgrad x, der die Verteilung von Monoglykosiden und Oligoglykosiden angibt, ist eine beliebige Zahl - die als analytisch zu bestimmende Größe auch gebrochene Werte annehmen kann - zwischen 1 und 10; vorzugsweise liegt x bei 1 ,2 bis 1 ,4. Ebenfalls geeignet sind Polyhydroxyfettsäureamide der Formel (IM), in der R1CO für einen aliphatischen Acylrest mit 6 bis 22 Kohlenstoffatomen, R2 für Wasserstoff, einen Alkyl- oder Hydroxyalkylrest mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen und [Z] für einen linearen oder verzweigten Polyhydroxyalkylrest mit 3 bis 10 Kohlenstoffatomen und 3 bis 10 Hydroxylgruppen steht:
R2 R1-CO-N-[Z] (III)
Vorzugsweise leiten sich die Polyhydroxyfettsäureamide von reduzierenden Zuckern mit 5 oder 6 Kohlenstoffatomen, insbesondere von der Glucose ab. Zur Gruppe der Polyhydroxyfettsäureamide gehören auch Verbindungen der Formel (IV),
R4-O-R5
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in der R3 für einen linearen oder verzweigten Alkyl- oder Alkenylrest mit 7 bis 12 Kohlenstoffatomen, R4 für einen linearen, verzweigten oder cyclischen Alkylenrest oder einen Arylenrest mit 2 bis 8 Kohlenstoffatomen und R5 für einen linearen, verzweigten oder cyclischen Alkylrest oder einen Arylrest oder einen Oxy-Alkylrest mit 1 bis 8 Kohlenstoffatomen steht, wobei d-C4-Alkyl- oder Phenylreste bevorzugt sind, und [Z] für einen linearen Polyhydroxyalkylrest, dessen Alkylkette mit mindestens zwei Hydroxylgruppen substituiert ist, oder alkoxylierte, vorzugsweise ethoxylierte oder propoxylierte Derivate dieses Restes steht. [Z] wird auch hier vorzugsweise durch reduktive Aminierung eines Zuckers wie Glucose, Fructose, Maltose, Lactose, Galactose, Mannose oder Xylose erhalten. Die N-Alkoxy- oder N-Aryloxy-substituierten Verbindungen können dann beispielsweise durch Umsetzung mit Fettsäuremethylestern in Gegenwart eines Alkoxids als Katalysator in die gewünschten Polyhydroxyfettsäureamide überführt werden. Eine weitere Klasse bevorzugt eingesetzter nichtionischer Tenside, die entweder als alleiniges nichtionisches Tensid oder in Kombination mit anderen nichtionischen Tensiden, insbesondere zusammen mit alkoxylierten Fettalkoholen und/oder Alkylglykosiden, eingesetzt werden, sind alkoxylierte, vorzugsweise ethoxylierte oder ethoxylierte und propoxylierte Fettsäurealkylester, vorzugsweise mit 1 bis 4 Kohlenstoffatomen in der Alkylkette, insbesondere Fettsäuremethylester. Auch nichtionische Tenside vom Typ der Aminoxide, beispielsweise N-Kokosalkyl-N,N-dimethylaminoxid und N-Talgalkyl-N,N-dihydroxyethylaminoxid, und der Fettsäurealkanolamide können geeignet sein. Die Menge dieser nichtionischen Tenside beträgt vorzugsweise nicht mehr als die der ethoxylierten Fettalkohole, insbesondere nicht mehr als die Hälfte davon. Als weitere Tenside kommen sogenannte Gemini-Tenside in Betracht. Hierunter werden im Allgemeinen solche Verbindungen verstanden, die zwei hydrophile Gruppen pro Molekül besitzen. Diese Gruppen sind in der Regel durch einen sogenannten "Spacer" voneinander getrennt. Dieser Spacer ist in der Regel eine Kohlenstoffkette, die lang genug sein sollte, dass die hydrophilen Gruppen einen ausreichenden Abstand haben, damit sie unabhängig voneinander agieren können. Derartige Tenside zeichnen sich im Allgemeinen durch eine ungewöhnlich geringe kritische Micellkonzentration und die Fähigkeit, die Oberflächenspannung des Wassers stark zu reduzieren, aus. In Ausnahmefällen werden unter dem Ausdruck Gemini-Tenside nicht nur derartig "dimere", sondern auch entsprechend "trimere" Tenside verstanden. Geeignete Gemini-Tenside sind beispielsweise sulfatierte Hydroxymischether oder Dimeralkohol-bis- und Trimeralkohol-tris-sulfate und -ethersulfate. Endgruppenverschlossene dimere und trimere Mischether zeichnen sich insbesondere durch ihre Bi- und Multifunktionalität aus. So besitzen die genannten endgruppenverschlossenen Tenside gute Netzeigenschaften und sind dabei schaumarm, so dass sie sich insbesondere für den Einsatz in maschinellen Wasch- oder Reinigungsverfahren eignen. Eingesetzt werden können aber auch Gemini-Polyhydroxyfettsäureamide oder Poly-Polyhydroxy- fettsäureamide. Geeignet sind auch die Schwefelsäuremonoester der mit 1 bis 6 Mol Ethylenoxid ethoxylierten geradkettigen oder verzweigten C7-C2i-Alkohole, wie 2-Methylverzweigte C9-C11- Alkohole mit im Durchschnitt 3,5 Mol Ethylenoxid (EO) oder C12-C18-Fettalkohole mit 1 bis 4 EO. Zu den bevorzugten Aniontensiden gehören auch die Salze der Alkylsulfobernsteinsäure, die auch als Sulfosuccinate oder als Sulfobernsteinsäureester bezeichnet werden, und die Monoester und/oder Diester der Sulfobernsteinsäure mit Alkoholen, vorzugsweise Fettalkoholen und insbesondere ethoxylierten Fettalkoholen darstellen. Bevorzugte Sulfosuccinate enthalten C8- bis C18- Fettalkoholreste oder Mischungen aus diesen. Insbesondere bevorzugte Sulfosuccinate enthalten einen Fettalkoholrest, der sich von ethoxylierten Fettalkoholen ableitet, die für sich betrachtet nichtionische Tenside darstellen. Dabei sind wiederum Sulfosuccinate, deren Fettalkohol-Reste sich von ethoxylierten Fettalkoholen mit eingeengter Homologenverteilung ableiten, besonders bevorzugt. Ebenso ist es auch möglich, Alk(en)ylbernsteinsäure mit vorzugsweise 8 bis 18 Kohlenstoffatomen in der Alk(en)ylkette oder deren Salze einzusetzen. Als weitere anionische Tenside kommen Fettsäure-Derivate von Aminosäuren, beispielsweise von N-Methyltaurin (Tauride) und/oder von N-Methylglycin (Sarkoside) in Betracht. Insbesondere bevorzugt sind dabei die Sarkoside beziehungsweise die Sarkosinate und hier vor allem Sarkosinate von höheren und gegebenenfalls einfach oder mehrfach ungesättigten Fettsäuren wie Oleylsarkosinat. Als weitere anionische Tenside kommen insbesondere Seifen in Betracht. Geeignet sind insbesondere gesättigte Fettsäureseifen, wie die Salze der Laurinsäure, Myristinsäure, Palmitinsäure, Stearinsäure, hydrierten Erucasäure und Behensäure sowie insbesondere aus natürlichen Fettsäuren, zum Beispiel Kokos-, Palmkern- oder Taigfettsäuren, abgeleitete Seifengemische. Zusammen mit diesen Seifen oder als Ersatzmittel für Seifen können auch die bekannten Alkenylbernsteinsäuresalze eingesetzt werden. Die anionischen Tenside, einschließlich der Seifen, können in Form ihrer Natrium-, Kalium- oder Ammoniumsalze sowie als lösliche Salze organischer Basen, wie Mono-, Di- oder Triethanolamin, vorliegen. Vorzugsweise liegen die anionischen Tenside in Form ihrer Natrium- oder Kaliumsalze, insbesondere in Form der Natriumsalze vor.
Tenside sind in erfindungsgemäßen Mitteln in Mengenanteilen von vorzugsweise 5 Gew.-% bis 50 Gew.-%, insbesondere von 8 Gew.-% bis 30 Gew.-%, enthalten.
Ein erfindungsgemäßes Mittel enthält vorzugsweise mindestens einen wasserlöslichen und/oder wasserunlöslichen, organischen und/oder anorganischen Builder. Zu den wasserlöslichen organischen Buildersubstanzen gehören Polycarbonsäuren, insbesondere Citronensäure und Zuckersäuren, monomere und polymere Aminopolycarbonsäuren, insbesondere Methylglycin- diessigsäure, Nitrilotriessigsäure und Ethylendiamintetraessigsäure sowie Polyasparaginsäure, Polyphosphonsäuren, insbesondere Aminotris(methylenphosphonsäure), Ethylendiamintetra- kis(methylenphosphonsäure) und 1-Hydroxyethan-1 ,1-diphosphonsäure, polymere Hydroxy- verbindungen wie Dextrin sowie polymere (Poly-)carbonsäuren, insbesondere die durch Oxidation von Polysacchariden beziehungsweise Dextrinen zugänglichen Polycarboxylate, polymere Acryl- säuren, Methacrylsäuren, Maleinsäuren und Mischpolymere aus diesen, die auch geringe Anteile polymerisierbarer Substanzen ohne Carbonsäurefunktionalität einpolymerisiert enthalten können. Die relative Molekülmasse der Homopolymeren ungesättiger Carbonsäuren liegt im allgemeinen zwischen 3 000 und 200 000, die der Copolymeren zwischen 2 000 und 200 000, vorzugsweise 30 000 bis 120 000, jeweils bezogen auf freie Säure. Ein besonders bevorzugtes Acrylsäure- Maleinsäure-Copolymer weist eine relative Molekülmasse von 30 000 bis 100 000 auf. Handelsübliche Produkte sind zum Beispiel Sokalan® CP 5, CP 10 und PA 30 der Firma BASF. Geeignete, wenn auch weniger bevorzugte Verbindungen dieser Klasse sind Copolymere der Acrylsäure oder Methacrylsäure mit Vinylethern, wie Vinylmethylethern, Vinylester, Ethylen, Propy- len und Styrol, in denen der Anteil der Säure mindestens 50 Gew.-% beträgt. Als wasserlösliche organische Buildersubstanzen können auch Terpolymere eingesetzt werden, die als Monomere zwei ungesättigte Säuren und/oder deren Salze sowie als drittes Monomer Vinylalkohol und/oder einem veresterten Vinylalkohol oder ein Kohlenhydrat enthalten. Das erste saure Monomer beziehungsweise dessen Salz leitet sich von einer monoethylenisch ungesättigten C3-C8-Carbonsäure und vorzugsweise von einer C3-C4-Monocarbonsäure, insbesondere von (Meth)-acrylsäure ab. Das zweite saure Monomer beziehungsweise dessen Salz kann ein Derivat einer C4-C8-Dicarbonsäure, wobei Maleinsäure besonders bevorzugt ist, und/oder ein Derivat einer Allylsulfonsäure, die in 2- Stellung mit einem Alkyl- oder Arylrest substituiert ist, sein. Derartige Polymere weisen im Allgemeinen eine relative Molekülmasse zwischen 1 000 und 200 000 auf. Weitere bevorzugte Copolymere sind solche, die als Monomere vorzugsweise Acrolein und Acrylsäure/Acrylsäuresalze beziehungsweise Vinylacetat aufweisen. Die organischen Buildersubstanzen können, insbesonde- re zur Herstellung flüssiger Mittel, in Form wäßriger Lösungen, vorzugsweise in Form 30- bis 50- gewichtsprozentiger wäßriger Lösungen eingesetzt werden. Alle genannten Säuren werden in der Regel in Form ihrer wasserlöslichen Salze, insbesondere ihre Alkalisalze, eingesetzt.
Derartige organische Buildersubstanzen können gewünschtenfalls in Mengen bis zu 40 Gew.-%, insbesondere bis zu 25 Gew.-% und vorzugsweise von 1 Gew.-% bis 8 Gew.-% enthalten sein. Mengen nahe der genannten Obergrenze werden vorzugsweise in pastenförmigen oder flüssigen, insbesondere wasserhaltigen, erfindungsgemäßen Mitteln eingesetzt.
Als wasserlösliche anorganische Buildermaterialien kommen insbesondere Alkalisilikate, Alkalicarbonate und Alkaliphosphate, die in Form ihrer alkalischen, neutralen oder sauren Natriumoder Kaliumsalze vorliegen können, in Betracht. Beispiele hierfür sind Trinatriumphosphat, Tetra- natriumdiphosphat, Dinatriumdihydrogendiphosphat, Pentanatriumtriphosphat, sogenanntes Natriumhexametaphosphat, oligomeres Trinatriumphosphat mit Oligomerisierungsgraden von 5 bis 1000, insbesondere 5 bis 50, sowie die entsprechenden Kaliumsalze beziehungsweise Gemische aus Natrium- und Kaliumsalzen. Als wasserunlösliche, wasserdispergierbare anorganische Buildermaterialien werden insbesondere kristalline oder amorphe Alkalialumosilikate, in Mengen von bis zu 50 Gew.-%, vorzugsweise nicht über 40 Gew.-% und in flüssigen Mitteln insbesondere von 1 Gew.-% bis 5 Gew.-%, eingesetzt. Unter diesen sind die kristallinen Natriumalumosilikate in Waschmittelqualität, insbesondere Zeolith A, P und gegebenenfalls X, allein oder in Mischungen, beispielsweise in Form eines Co-Kristallisats aus den Zeolithen A und X (Vegobond® AX, ein Handelsprodukt der Condea Augusta S.p.A.), bevorzugt. Mengen nahe der genannten Obergrenze werden vorzugsweise in festen, teilchenförmigen Mitteln eingesetzt. Geeignete Alumosilikate weisen insbesondere keine Teilchen mit einer Korngröße über 30 μm auf und bestehen vorzugsweise zu wenigstens 80 Gew.-% aus Teilchen mit einer Größe unter 10 μm. Ihr Calcium- bindevermögen, das nach den Angaben der deutschen Patentschrift DE 24 12 837 bestimmt werden kann, liegt in der Regel im Bereich von 100 bis 200 mg CaO pro Gramm.
Geeignete Substitute beziehungsweise Teilsubstitute für das genannte Alumosilikat sind kristalline Alkalisilikate, die allein oder im Gemisch mit amorphen Silikaten vorliegen können. Die in den erfindungsgemäßen Mitteln als Gerüststoffe brauchbaren Alkalisilikate weisen vorzugsweise ein molares Verhältnis von Alkalioxid zu SiO2 unter 0,95, insbesondere von 1 :1 ,1 bis 1 :12 auf und können amorph oder kristallin vorliegen. Bevorzugte Alkalisilikate sind die Natriumsilikate, insbesondere die amorphen Natriumsilikate, mit einem molaren Verhältnis Na2O:SiO2 von 1 :2 bis 1 :2,8. Als kristalline Silikate, die allein oder im Gemisch mit amorphen Silikaten vorliegen können, werden vorzugsweise kristalline Schichtsilikate der allgemeinen Formel Na2SixO2x+I y H2O eingesetzt, in der x, das sogenannte Modul, eine Zahl von 1 ,9 bis 22, insbesondere 1 ,9 bis 4 und y eine Zahl von 0 bis 33 ist und bevorzugte Werte für x 2, 3 oder 4 sind. Bevorzugte kristalline Schichtsi- likate sind solche, bei denen x in der genannten allgemeinen Formel die Werte 2 oder 3 annimmt. Insbesondere sind sowohl ß- als auch δ-Natriumdisilikate (Na2Si2O5 y H2O) bevorzugt. Auch aus amorphen Alkalisilikaten hergestellte, praktisch wasserfreie kristalline Alkalisilikate der obengenannten allgemeinen Formel, in der x eine Zahl von 1 ,9 bis 2,1 bedeutet, können in erfindungsgemäßen Mitteln eingesetzt werden. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfindungsgemäßer Mittel wird ein kristallines Natriumschichtsilikat mit einem Modul von 2 bis 3 eingesetzt, wie es aus Sand und Soda hergestellt werden kann. Kristalline Natriumsilikate mit einem Modul im Bereich von 1 ,9 bis 3,5 werden in einer weiteren bevorzugten Ausführungsform erfindungsgemäßer Mittel eingesetzt. Kristalline schichtförmige Silikate der oben angegebenen Formel (I) werden von der Fa. Clariant GmbH unter dem Handelsnamen Na-SKS vertrieben, z.B. Na-SKS-1 (Na2Si22O45XH2O, Kenyait), Na-SKS-2 (Na2Si14O29XH2O, Magadiit), Na-SKS-3 (Na2Si8O17XH2O) oder Na-SKS-4 (Na2Si4O9XH2O, Makatit). Von diesen eignen sich vor allem Na- SKS-5 (OC-Na2Si2O5), Na-SKS-7 (ß-Na2Si205, Natrosilit), Na-SKS-9 (NaHSi2O53H2O), Na-SKS-10 (NaHSi2O53H2O, Kanemit), Na-SKS-11 (t-Na2Si205) und Na-SKS-13 (NaHSi2O5), insbesondere aber Na-SKS-6 (5-Na2Si2O5). In einer bevorzugten Ausgestaltung erfindungsgemäßer Mittel setzt man ein granuläres Compound aus kristallinem Schichtsilikat und Citrat, aus kristallinem Schichtsilikat und oben genannter (co-)polymerer Polycarbonsäure, oder aus Alkalisilikat und Alkalicarbonat ein, wie es beispielsweise unter dem Namen Nabion® 15 im Handel erhältlich ist.
Buildersubstanzen sind in den erfindungsgemäßen Mitteln vorzugsweise in Mengen bis zu 75 Gew.-%, insbesondere 5 Gew.-% bis 50 enthalten.
Als für den Einsatz in erfindungsgemäßen Mitteln geeignete Persauerstoffverbindungen kommen insbesondere organische Persäuren beziehungsweise persaure Salze organischer Säuren, wie Phthalimidopercapronsäure, Perbenzoesäure oder Salze der Diperdodecandisäure, Wasserstoffperoxid und unter den Waschbedingungen Wasserstoffperoxid abgebende anorganische Salze, zu denen Perborat, Percarbonat, Persilikat und/oder Persulfat wie Caroat gehören, in Betracht. Sofern feste Persauerstoffverbindungen eingesetzt werden sollen, können diese in Form von Pulvern oder Granulaten verwendet werden, die auch in im Prinzip bekannter Weise umhüllt sein können. Falls ein erfindungsgemäßes Mittel Persauerstoffverbindungen enthält, sind diese in Mengen von vorzugsweise bis zu 50 Gew.-%, insbesondere von 5 Gew.-% bis 30 Gew.-%, vorhanden. Der Zusatz geringer Mengen bekannter Bleichmittelstabilisatoren wie beispielsweise von Phosphonaten, Boraten beziehungsweise Metaboraten und Metasilikaten sowie Magnesiumsalzen wie Magnesiumsulfat kann zweckdienlich sein.
Als Bleichaktivatoren können Verbindungen, die unter Perhydrolysebedingungen aliphatische Peroxocarbonsäuren mit vorzugsweise 1 bis 10 C-Atomen, insbesondere 2 bis 4 C-Atomen, und/oder gegebenenfalls substituierte Perbenzoesäure ergeben, eingesetzt werden. Geeignet sind Substanzen, die O- und/oder N-Acylgruppen der genannten C-Atomzahl und/oder gegebenenfalls substituierte Benzoylgruppen tragen. Bevorzugt sind mehrfach acylierte Alkylendiamine, insbesondere Tetraacetylethylendiamin (TAED), acylierte Triazinderivate, insbesondere 1 ,5- Diacetyl-2,4-dioxohexahydro-1 ,3,5-triazin (DADHT), acylierte Glykolurile, insbesondere Tetraacetylglykoluril (TAGU), N-Acylimide, insbesondere N-Nonanoylsuccinimid (NOSI), acylierte Phenolsulfonate, insbesondere n-Nonanoyl- oder Isononanoyloxybenzolsulfonat (n- bzw. iso- NOBS), Carbonsäureanhydride, insbesondere Phthalsäureanhydrid, acylierte mehrwertige Alkohole, insbesondere Triacetin, Ethylenglykoldiacetat, 2,5-Diacetoxy-2,5-dihydrofuran und Enolester sowie acetyliertes Sorbitol und Mannitol beziehungsweise deren beschriebene Mischungen (SORMAN), acylierte Zuckerderivate, insbesondere Pentaacetylglukose (PAG), Pentaacetylfruktose, Tetraacetylxylose und Octaacetyllactose sowie acetyliertes, gegebenenfalls N-alkyliertes Glucamin und Gluconolacton, und/oder N-acylierte Lactame, beispielsweise N- Benzoylcaprolactam. Die hydrophil substituierten Acylacetale und die Acyllactame werden ebenfalls bevorzugt eingesetzt. Auch Kombinationen konventioneller Bleichaktivatoren können eingesetzt werden. Derartige Bleichaktivatoren können, insbesondere bei Anwesenheit obengenannter Wasserstoffperoxid-Iiefernder Bleichmittel, im üblichen Mengenbereich, vorzugsweise in Mengen von 0,5 Gew.-% bis 10 Gew.-%, insbesondere 1 Gew.-% bis 8 Gew.-%, bezogen auf gesamtes Mittel, enthalten sein, fehlen bei Einsatz von Percarbonsäure als alleinigem Bleichmittel jedoch vorzugsweise ganz.
Zusätzlich zu den konventionellen Bleichaktivatoren oder an deren Stelle können auch Sulfonimine und/oder bleichverstärkende Übergangsmetallsalze beziehungsweise Übergangsmetallkomplexe als sogenannte Bleichkatalysatoren enthalten sein.
Zu den in den erfindungsgemäßen Mitteln, insbesondere wenn sie in flüssiger oder pastöser Form vorliegen, neben Wasser verwendbaren organischen Lösungsmitteln gehören Alkohole mit 1 bis 4 C-Atomen, insbesondere Methanol, Ethanol, Isopropanol und tert.-Butanol, Diole mit 2 bis 4 C-Ato- men, insbesondere Ethylenglykol und Propylenglykol, sowie deren Gemische und die aus den genannten Verbindungsklassen ableitbaren Ether. Derartige wassermischbare Lösungsmittel sind in den erfindungsgemäßen Mitteln vorzugsweise in Mengen nicht über 30 Gew.-%, insbesondere von 6 Gew.-% bis 20 Gew.-%, vorhanden.
Zur Einstellung eines gewünschten, sich durch die Mischung der übrigen Komponenten nicht von selbst ergebenden pH-Werts können die erfindungsgemäßen Mittel System- und umweltverträgliche Säuren, insbesondere Citronensäure, Essigsäure, Weinsäure, Äpfelsäure, Milchsäure, Glykolsäure, Bernsteinsäure, Glutarsäure und/oder Adipinsäure, aber auch Mineralsäuren, insbesondere Schwefelsäure, oder Basen, insbesondere Ammonium- oder Alkalihydroxide, enthalten. Derartige pH-Regulatoren sind in den erfindungsgemäßen Mitteln in Mengen von vorzugsweise nicht über 20 Gew.-%, insbesondere von 1 ,2 Gew.-% bis 17 Gew.-%, enthalten.
Vergrauungsinhibitoren haben die Aufgabe, den von der Textilfaser abgelösten Schmutz in der Flotte suspendiert zu halten. Hierzu sind wasserlösliche Kolloide meist organischer Natur geeignet, beispielsweise Stärke, Leim, Gelatine, Salze von Ethercarbonsäuren oder Ethersulfonsäuren der Stärke oder der Cellulose oder Salze von sauren Schwefelsäureestern der Cellulose oder der Stärke. Auch wasserlösliche, saure Gruppen enthaltende Polyamide sind für diesen Zweck geeignet. Weiterhin lassen sich andere als die obengenannten Stärkederivate verwenden, zum Beispiel Aldehydstärken. Bevorzugt werden Celluloseether, wie Carboxymethylcellulose (Na-SaIz), Methylcellulose, Hydroxyalkylcellulose und Mischether, wie Methylhydroxyethylcellulose, Methyl- hydroxypropylcellulose, Methylcarboxymethylcellulose und deren Gemische, beispielsweise in Mengen von 0,1 bis 5 Gew.-%, bezogen auf die Mittel, eingesetzt.
Erfindungsgemäße Textilwaschmittel können als optische Aufheller beispielsweise Derivate der Diaminostilbendisulfonsäure beziehungsweise deren Alkalimetallsalze enthalten, obgleich sie für den Einsatz als Colorwaschmittel vorzugsweise frei von optischen Aufhellern sind. Geeignet sind zum Beispiel Salze der 4,4'-Bis(2-anilino-4-morpholino-1 ,3,5-triazinyl-6-amino)stilben-2,2'- disulfonsäure oder gleichartig aufgebaute Verbindungen, die anstelle der Morpholino-Gruppe eine Diethanolaminogruppe, eine Methylaminogruppe, eine Anilinogruppe oder eine 2- Methoxyethylaminogruppe tragen. Weiterhin können Aufheller vom Typ der substituierten Diphenylstyryle anwesend sein, zum Beispiel die Alkalisalze des 4,4'-Bis(2-sulfostyryl)-diphenyls, 4,4'-Bis(4-chlor-3-sulfostyryl)-diphenyls, oder 4-(4-Chlorstyryl)-4'-(2-sulfostyryl)-diphenyls. Auch Gemische der vorgenannten optischen Aufheller können verwendet werden.
Insbesondere beim Einsatz in maschinellen Verfahren kann es von Vorteil sein, den Mitteln übliche Schauminhibitoren zuzusetzen. Als Schauminhibitoren eignen sich beispielsweise Seifen natürlicher oder synthetischer Herkunft, die einen hohen Anteil an C18-C24-Fettsäuren aufweisen. Geeignete nichttensidartige Schauminhibitoren sind beispielsweise Organopolysiloxane und deren Gemische mit mikrofeiner, gegebenenfalls silanierter Kieselsäure sowie Paraffine, Wachse, Mikrokristallinwachse und deren Gemische mit silanierter Kieselsäure oder Bisfettsäurealkylen- diamiden. Mit Vorteilen werden auch Gemische aus verschiedenen Schauminhibitoren verwendet, zum Beispiel solche aus Silikonen, Paraffinen oder Wachsen. Vorzugsweise sind die Schauminhibitoren, insbesondere Silikon- und/oder Paraffin-haltige Schauminhibitoren, an eine granuläre, in Wasser lösliche beziehungsweise dispergierbare Trägersubstanz gebunden. Insbesondere sind dabei Mischungen aus Paraffinen und Bistearylethylendiamid bevorzugt. Die zu wählenden Inhaltsstoffe wie auch die Bedingungen, unter denen das Mittel eingesetzt wird, wie beispielsweise Temperatur, pH-Wert, lonenstärke, Redox-Verhältnisse oder mechanische Einflüsse, sollten für das jeweilige Reinigungsproblem optimiert sein. So liegen übliche Temperaturen für Wasch- und Reinigungsmittel in Bereichen von 1O0C bei manuellen Mitteln über 4O0C und 6O0C bis hin zu 95° bei maschinellen Mitteln oder bei technischen Anwendungen. Da bei modernen Wasch- und Spülmaschinen die Temperatur meist stufenlos einstellbar ist, sind auch alle Zwischenstufen der Temperatur eingeschlossen. Vorzugsweise werden die Inhaltsstoffe der betreffenden Mittel aufeinander abgestimmt. Bevorzugt sind Synergien hinsichtlich der Reinigungsleistung. Besonders bevorzugt diesbezüglich sind Synergien, die in einem Temperaturbereich zwischen 2O0C und 6O0C vorhanden sind, da auch die in den erfindungsgemäßen Mitteln enthaltene Protease in diesem Temperaturbereich katalytisch aktiv ist.
In einer weiteren Ausführungsform umfasst ein erfindungsgemäßes Mittel, insbesondere ein Wasch- oder Reinigungsmittel, ferner
- 5 Gew.-% bis 70 Gew.-%, insbesondere 5 Gew.-% bis 30 Gew.-% Tenside und/oder
- 10 Gew.-% bis 65 Gew.-%, insbesondere 12 Gew.-% bis 60 Gew. -% wasserlösliches oder wasserdispergierbares anorganisches Buildermaterial und/oder
- 0,5 Gew.-% bis 10 Gew.-%, insbesondere 1 Gew.-% bis 8 Gew.-%, wasserlösliche organische Buildersubstanzen und/oder
- 0,01 bis 15 Gew.-% feste anorganische und/oder organische Säuren beziehungsweise saure Salze und/oder
- 0,01 bis 5 Gew.-% Komplexbildner für Schwermetalle und/oder
- 0,01 bis 5 Gew.-% Vergrauungsinhibitor und/oder
- 0,01 bis 5 Gew. -% Farbübertragungsinhibitor und/oder
- 0,01 bis 5 Gew.-% Schauminhibitor.
Optional kann das Mittel ferner optische Aufheller umfassen, bevorzugt von 0,01 bis 5 Gew-%.
Die Herstellung erfindungsgemäßer fester Mittel bietet keine Schwierigkeiten und kann auf bekannte Weise, zum Beispiel durch Sprühtrocknen oder Granulation, erfolgen, wobei Enzyme und eventuelle weitere thermisch empfindliche Inhaltsstoffe wie zum Beispiel Bleichmittel gegebenenfalls später separat zugesetzt werden. Zur Herstellung erfindungsgemäßer Mittel mit erhöhtem Schüttgewicht, insbesondere im Bereich von 650 g/l bis 950 g/l, ist ein einen Extrusionschritt aufweisendes Verfahren bevorzugt.
Zur Herstellung von erfindungsgemäßen Mitteln in Tablettenform, die einphasig oder mehrphasig, einfarbig oder mehrfarbig und insbesondere aus einer Schicht oder aus mehreren, insbesondere aus zwei Schichten bestehen können, geht man vorzugsweise derart vor, dass man alle Bestandteile - gegebenenfalls je einer Schicht - in einem Mischer miteinander vermischt und das Gemisch mittels herkömmlicher Tablettenpressen, beispielsweise Exzenterpressen oder Rundläuferpressen, mit Preßkräften im Bereich von etwa 50 bis 100 kN, vorzugsweise bei 60 bis 70 kN verpreßt. Insbesondere bei mehrschichtigen Tabletten kann es von Vorteil sein, wenn mindestens eine Schicht vorverpreßt wird. Dies wird vorzugsweise bei Preßkräften zwischen 5 und 20 kN, insbesondere bei 10 bis 15 kN durchgeführt. Man erhält so problemlos bruchfeste und dennoch unter Anwendungsbedingungen ausreichend schnell lösliche Tabletten mit Bruch- und Biegefestigkeiten von normalerweise 100 bis 200 N, bevorzugt jedoch über 150 N. Vorzugsweise weist eine derart hergestellte Tablette ein Gewicht von 10 g bis 50 g, insbesondere von 15 g bis 40 g auf. Die Raumform der Tabletten ist beliebig und kann rund, oval oder eckig sein, wobei auch Zwischenformen möglich sind. Ecken und Kanten sind vorteilhafterweise abgerundet. Runde Tabletten weisen vorzugsweise einen Durchmesser von 30 mm bis 40 mm auf. Insbesondere die Größe von eckig oder quaderförmig gestalteten Tabletten, welche überwiegend über die Dosiervorrichtung beispielsweise der Geschirrspülmaschine eingebracht werden, ist abhängig von der Geometrie und dem Volumen dieser Dosiervorrichtung. Beispielhaft bevorzugte Ausführungsformen weisen eine Grundfläche von (20 bis 30 mm) x (34 bis 40 mm), insbesondere von 26x36 mm oder von 24x38 mm auf.
Flüssige beziehungsweise pastöse erfindungsgemäße Mittel in Form von übliche Lösungsmittel enthaltenden Lösungen werden in der Regel durch einfaches Mischen der Inhaltsstoffe, die in Substanz oder als Lösung in einen automatischen Mischer gegeben werden können, hergestellt.
Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen somit alle derartigen festen, pulverförmigen, flüssigen, gelförmigen oder pastösen Darreichungsformen der Mittel, die gegebenenfalls auch aus mehreren Phasen bestehen können sowie in komprimierter oder nicht komprimierter Form vorliegen können. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung stellen daher Mittel dar, die dadurch gekennzeichnet sind, dass sie als Einkomponentensystem vorliegen. Solche Mittel bestehen bevorzugt aus einer Phase. Selbstverständlich können erfindungsgemäße Mittel aber auch aus mehreren Phasen bestehen. In einer weiteren Ausführungsform der Erfindung ist das Wasch- oder Reinigungsmittel daher dadurch gekennzeichnet sind, dass es in mehrere Komponenten aufgeteilt ist.
Zu den erfindungsgemäßen festen Darreichungsformen zählen ferner Extrudate, Granulate, Tabletten oder Pouches, die sowohl in Großgebinden als auch portionsweise abgepackt vorliegen können. Alternativ liegt das Mittel als rieselfähiges Pulver vor, insbesondere mit einem Schüttgewicht von 300 g/l bis 1200 g/l, insbesondere 500 g/l bis 900 g/l oder 600 g/l bis 850 g/l.
Ferner können erfindungsgemäße Mittel auch flüssig, gelförmig oder pastös sein. Eine weitere Ausführungsform der Erfindung ist daher dadurch gekennzeichnet, dass das Wasch- oder Reinigungsmittel in flüssiger, gelförmiger oder pastöser Form vorliegt, insbesondere in Form eines nicht-wäßrigen Flüssigwaschmittels oder einer nicht-wäßrigen Paste oder in Form eines wäßrigen Flüssigwaschmittels oder einer wasserhaltigen Paste.
Bevorzugt ist ein erfindungsgemäßes Mittel dadurch gekennzeichnet, dass es die Protease in einer Menge von 2 μg bis 20 mg, vorzugsweise von 5 μg bis 17,5 mg, besonders bevorzugt von 20 μg bis 15 mg und ganz besonders bevorzugt von 50 μg bis 10 mg pro g des Mittels enthält.
Das erfindungsgemäße Wasch- oder Reinigungsmittel kann in einem Behältnis, vorzugsweise einem luftdurchlässigen Behältnis, verpackt sein, aus dem es kurz vor Gebrauch oder während des Waschvorgangs freigesetzt wird. Insbesondere kann ferner die in dem Mittel enthaltene Protease und/oder weitere Inhaltsstoffe des Mittels mit einer bei Raumtemperatur oder bei Abwesenheit von Wasser für das Enzym undurchlässigen Substanz umhüllt sein, welche unter Anwendungsbedingungen des Mittels durchlässig für das Enzym wird. Eine solche Ausführungsform der Erfindung ist somit dadurch gekennzeichnet, dass die Protease mit einer bei Raumtemperatur oder bei Abwesenheit von Wasser für die Protease undurchlässigen Substanz umhüllt ist.
Erfindungsgemäße Mittel können ausschließlich eine Protease enthalten. Alternativ können sie auch weitere Proteasen oder andere Enzyme in einer für die Wirksamkeit des Mittels zweckmäßigen Konzentration enthalten. Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellen somit Mittel dar, die ferner eines oder mehrere weitere Enzyme umfassen, wobei prinzipiell alle im Stand der Technik für diese Zwecke etablierten Enzyme einsetzbar sind. Als weitere Enzyme bevorzugt einsetzbar sind alle Enzyme, die in dem erfindungsgemäßen Mittel eine katalytische Aktivität entfalten können, insbesondere Proteasen, Amylasen, Cellulasen, Hemicellulasen, Mannanasen, Tannasen, Xylanasen, Xanthanasen, ß-Glucosidasen, Carrageenasen, Oxidasen, Oxidoreduktasen oder Lipasen, sowie vorzugsweise deren Gemische. Diese Enzyme sind im Prinzip natürlichen Ursprungs; ausgehend von den natürlichen Molekülen stehen für den Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln verbesserte Varianten zur Verfügung, die entsprechend bevorzugt eingesetzt werden. Erfindungsgemäße Mittel enthalten Enzyme vorzugsweise in Gesamtmengen von 1 x 10~8 bis 5 Gewichts-Prozent bezogen auf aktives Protein. Bevorzugt sind die Enzyme von 0,001 bis 5 Gew.-%, weiter bevorzugt von 0,01 bis 5 Gew.-%, noch weiter bevorzugt von 0,05 bis 4 Gew.-% und besonders bevorzugt von 0,075 bis 3,5 Gew.-% in erfindungsgemäßen Mitteln enthalten, wobei jedes enthaltene Enzym in den genannten Mengenverhältnissen vorliegen kann.
Die Proteinkonzentration kann mit Hilfe bekannter Methoden, zum Beispiel dem BCA-Verfahren (Bicinchoninsäure; 2,2'-Bichinolyl-4,4'-dicarbonsäure) oder dem Biuret-Verfahren (A. G. Gornall, C. S. Bardawill und M. M. David, J. Biol. Chem., 177 (1948), S. 751-766) bestimmt werden. Besonders bevorzugt unterstützen die weiteren Enzyme die Wirkung des Mittels, beispielsweise die Reinigungsleistung eines Wasch- oder Reinigungsmittels, hinsichtlich bestimmter Anschmutzungen oder Flecken. Besonders bevorzugt zeigen die Enzyme synergistische Effekte hinsichtlich ihrer Wirkung gegenüber bestimmter Anschmutzungen oder Flecken, d.h. die in der Mittelzusammensetzung enthaltenen Enzyme unterstützen sich in ihrer Reinigungsleistung gegenseitig. Synergistische Effekte können nicht nur zwischen verschiedenen Enzymen, sondern auch zwischen einem oder mehreren Enzymen und weiteren Inhaltsstoffen des erfindungsgemäßen Mittels auftreten. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Erfindung ist das erfindungsgemäße Mittel somit dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens ein weiteres Enzym enthält, welches eine Protease, Amylase, Cellulase, Hemicellulase, Mannanase, Tannase, Xylanase, Xanthanase, ß-Glucosidase, Carrageenase, Oxidase, Oxidoreduktase oder eine Lipase ist.
Die in erfindungsgemäßen Mitteln eingesetzten Enzyme stammen entweder ursprünglich aus Mikroorganismen, etwa der Gattungen Bacillus, Streptomyces, Humicola, oder Pseudomonas, und/oder werden nach an sich bekannten biotechnologischen Verfahren durch geeignete Mikroorganismen produziert, beispielsweise durch transgene Expressionswirte der Gattungen Bacillus oder durch filamentöse Fungi.
Die Proteaseaktivität in derartigen Mitteln kann nach der in Tenside, Band 7 (1970), S. 125-132 beschriebenen Methode ermittelt werden. Sie wird in PE (Protease-Einheiten) angegeben.
Bei dem Vergleich der Leistungen zweier Waschmittelenzyme muss zwischen proteingleichem und aktivitätsgleichem Einsatz unterschieden werden. Insbesondere bei gentechnisch erhaltenen, weitgehend nebenaktivitätsfreien Präparationen ist der proteingleiche Einsatz angebracht. Denn damit ist eine Aussage darüber möglich, ob dieselben Proteinmengen - als Maß für den Ertrag der fermentativen Produktion - zu vergleichbaren Ergebnissen führen. Klaffen die jeweiligen Verhältnisse von Aktivsubstanz zu Gesamtprotein (die Werte der spezifischen Aktivität) auseinander, so ist ein aktivitätsgleicher Vergleich zu empfehlen, weil hierüber die jeweiligen enzymatischen Eigenschaften verglichen werden. Generell gilt, daß eine niedrige spezifische Aktivität durch Zugabe einer größeren Proteinmenge ausgeglichen werden kann. Hierbei handelt es sich letztlich um eine ökonomische Erwägung.
Einen eigenen Erfindungsgegenstand stellt die Verwendung eines oben beschriebenen erfindungsgemäßen Mittels zur Entfernung von protease-sensitiven Anschmutzungen auf Textilien oder harten Oberflächen, d.h. zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen, dar.
Denn erfindungsgemäße Mittel können, insbesondere entsprechend den oben beschriebenen Eigenschaften, dazu verwendet werden, um von Textilien oder von harten Oberflächen proteinhaltige Verunreinigungen zu beseitigen. Ausführungsformen stellen beispielsweise die Handwäsche, die manuelle Entfernung von Flecken von Textilien oder von harten Oberflächen oder die Verwendung im Zusammenhang mit einem maschinellen Verfahren dar.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Verwendung werden die betreffenden erfindungsgemäßen Mittel, vorzugsweise Wasch- beziehungsweise Reinigungsmittel, nach einer der oben ausgeführten Ausführungsform bereitgestellt.
Einen weiteren Erfindungsgegenstand stellen Verfahren zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen dar, bei denen wenigstens in einem der Verfahrensschritte ein erfindungsgemäßes Mittel verwendet wird. Das Verfahren zur Reinigung von Textilien oder harten Oberflächen ist demnach dadurch gekennzeichnet, dass in mindestens einem Verfahrensschritt ein erfindungsgemäßes Mittel angewendet ist.
Hierunter fallen sowohl manuelle als auch maschinelle Verfahren, wobei maschinelle Verfahren aufgrund ihrer präziseren Steuerbarkeit, was beispielsweise die eingesetzten Mengen und Einwirkzeiten angeht, bevorzugt sind.
Verfahren zur Reinigung von Textilien zeichnen sich im allgemeinen dadurch aus, dass in mehreren Verfahrensschritten verschiedene reinigungsaktive Substanzen auf das Reinigungsgut aufgebracht und nach der Einwirkzeit abgewaschen werden, oder dass das Reinigungsgut in sonstiger Weise mit einem Waschmittel oder einer Lösung dieses Mittels behandelt wird. Entsprechendes gilt für Verfahren zur Reinigung von allen anderen Materialien als Textilien, welche unter dem Begriff harte Oberflächen zusammengefasst werden. Alle denkbaren Waschoder Reinigungsverfahren können in wenigstens einem der Verfahrensschritte um ein erfindungsgemäßes Mittel bereichert werden, und stellen dann Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar.
Da bevorzugte erfindungsgemäße Enzyme natürlicherweise bereits eine proteinauflösende Aktivität besitzen und diese auch in Medien entfalten, die sonst keine Reinigungskraft besitzen, wie beispielsweise in bloßem Puffer, kann ein einzelner Teilschritt eines solchen Verfahrens zur maschinellen Reinigung von Textilien darin bestehen, daß gewünschtenfalls neben stabilisierenden Verbindungen, Salzen oder Puffersubstanzen als einzige reinigungsaktive Komponente ein erfindungsgemäßes Enzym aufgebracht wird. Dies stellt eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung dar.
Einen weiteren Gegenstand der Erfindung stellen Verfahren zur Reinigung von Textilien oder harten Oberflächen dar, die dadurch gekennzeichnet sind, dass in mindestens einem Verfahrensschritt eine erfindungsgemäße Protease proteolytisch aktiv ist, insbesondere derart, dass die Protease in einer Menge von 40 μg bis 4 g, vorzugsweise von 50 μg bis 3 g, besonders bevorzugt von 100 μg bis 2 g und ganz besonders bevorzugt von 200 μg bis 1 g pro Anwendung eingesetzt ist.
Alternative Ausführungsformen dieses Erfindungsgegenstandes stellen auch Verfahren zur Behandlung von Textilrohstoffen oder zur Textilpflege dar, bei denen in wenigstens einem der Verfahrensschritte eine erfindungsgemäße Protease aktiv wird.
Hierunter sind Verfahren für Textilrohstoffe, Fasern oder Textilien mit natürlichen Bestandteilen bevorzugt, und ganz besonders für solche mit Wolle oder Seide.
Es kann sich dabei beispielsweise um Verfahren handeln, in denen Materialien zur Verarbeitung in Textilien vorbereitet werden, etwa zur Antifilzausrüstung, oder beispielsweise um Verfahren, welche die Reinigung getragener Textilien um eine pflegende Komponente bereichern. Wegen der oben beschriebenen Wirkung von Proteasen auf natürliche, proteinhaltige Rohstoffe handelt es sich in bevorzugten Ausführungsformen um Verfahren zur Behandlung von Textilrohstoffen, Fasern oder Textilien mit natürlichen Bestandteilen, insbesondere mit Wolle oder Seide.
Erfindungsgemäße Enzyme sind entsprechend der vorstehenden Ausführungen vorteilhaft in erfindungsgemäßen Mitteln, insbesondere Wasch- und Reinigungsmitteln, und Verfahren, insbesondere Wasch- und Reinigungsverfahren, einsetzbar. Sie können dazu verwendet werden, um von Textilien oder von harten Oberflächen proteinhaltige Verunreinigungen zu beseitigen. Ausführungsformen stellen beispielsweise die Handwäsche, die manuelle Entfernung von Flecken von Textilien oder von harten Oberflächen oder die Verwendung im Zusammenhang mit einem maschinellen Verfahren dar.
Einen weiteren Gegenstand der Erfindung bildet daher die Verwendung einer erfindungsgemäßen Protease, wie sie vorstehend beschreiben wurde zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen. Bevorzugt wird die Protease in einer Menge von 40 μg bis 4 g, vorzugsweise von 50 μg bis 3 g, besonders bevorzugt von 100 μg bis 2 g und ganz besonders bevorzugt von 200 μg bis 1 g pro Anwendung eingesetzt.
In einer bevorzugten Ausführungsform dieser Verwendung werden die betreffenden erfindungsgemäßen Enzyme im Rahmen eines erfindungsgemäßen Mittels, vorzugsweise eines erfindungsgemäßen Wasch- beziehungsweise Reinigungsmittels, bereitgestellt. Eine weitere Ausführungsform dieses Erfindungsgegenstands stellt die Verwendung einer erfindungsgemäßen Protease zur Aktivierung oder Deaktivierung von Inhaltsstoffen von Waschoder Reinigungsmitteln dar.
Denn Protein-Bestandteile von Wasch- oder Reinigungsmitteln können durch das Einwirken einer Protease inaktiviert werden. Diesen ansonsten eher unerwünschten Effekt gezielt einzusetzen, ist ebenfalls ein Aspekt der vorliegenden Erfindung. Ebenso ist es wie oben beschrieben möglich, daß durch Proteolyse eine andere Komponente erst aktiviert wird, etwa, wenn sie ein Hybridprotein aus dem eigentlichen Enzym und dem dazu passenden Inhibitor darstellt. Ein anderes Beispiel für eine solche Regulation ist die, bei der eine aktive Komponente zum Schutz oder zur Kontrolle ihrer Aktivität in einem Material verkapselt vorliegt, das durch Proteolyse angegriffen wird. Erfindungsgemäße Proteasen können somit zu Inaktivierungs-, Aktivierungs- oder Freisetzungsreaktionen verwendet werden, insbesondere in mehrphasigen Mitteln.
Entsprechend dem oben Gesagten stellen auch folgende Verwendungen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung dar:
- Die Verwendung einer erfindungsgemäßen Protease zur Gewinnung oder Behandlung von Rohmaterialien oder Zwischenprodukten in der Textilherstellung, insbesondere zum Entfernen von Schutzschichten auf Geweben;
- die Verwendung einer erfindungsgemäßen Protease zur Behandlung von Textilrohstoffen oder zur Textilpflege und hierunter bevorzugt
- die entsprechende Verwendung für Textilrohstoffe, Fasern oder Textilien mit natürlichen Bestandteilen und ganz besonders für solche mit Wolle oder Seide.
Die vorliegende Erfindung wird auch in Form von solchen eine erfindungsgemäße Protease enthaltenden Mitteln verwirklicht, bei denen es sich um Kosmetika handelt. Hierunter werden alle Arten von reinigenden und pflegenden Mitteln für menschliche Haut oder Haar verstanden, insbesondere reinigende Mittel.
Denn Proteasen spielen auch im Zellerneuerungsprozeß der menschlichen Haut (Desquamation) eine entscheidende Rolle. Dementsprechend werden Proteasen auch als bioaktive Komponenten in Hautpflegemitteln verwendet, um den Abbau der in trockener Haut vermehrten Desmosomenstrukturen zu unterstützen. Wie vorstehend ausführlich erläutert können erfindungsgemäße Proteasen weiterentwickelt werden, beispielsweise über Aminosäuresubstitutionen und/oder Punktmutationen. Somit eignen sich auch erfindungsgemäße Proteasen, insbesondere solche, die etwa nach Mutagenese oder durch Zugabe entsprechender, mit ihnen wechselwirkender Stoffe in ihrer Aktivität kontrolliert sind, als aktive Komponenten in Haut- oder Haar-Reinigungs- oder Pflegemitteln. Besonders bevorzugt sind solche Präparationen dieser Enzyme, die wie oben beschrieben, beispielsweise durch Kopplung an makromolekulare Träger stabilisiert und/oder durch Punktmutationen an hochallergenen Positionen derivatisiert sind, so daß sie für den Menschen eine höhere Hautverträglichkeit aufweisen.
Dementsprechend werden auch entsprechende kosmetische Reinigungs- und Pflegeverfahren und die Verwendung derartiger proteolytischer Enzyme zu kosmetischen Zwecken in diesen Erfindungsgegenstand einbezogen, insbesondere in entsprechenden Mitteln, wie beispielsweise Shampoos, Seifen oder Waschlotionen, oder in Pflegemitteln, die beispielsweise in Form von Cremes angeboten werden. Auch die Verwendung in einem schälenden Arzneimittel, beziehungsweise zu dessen Herstellung ist eingeschlossen.
Neben dem Einsatz in Wasch- und Reinigungsmitteln und Kosmetika sind im Stand der Technik zahlreiche Anwendungsmöglichkeiten von Proteasaen, insbesondere Subtilasen etabliert. Einen Überblick hierüber bietet beispielsweise das Handbuch „Industrial enyzmes and their applications" von H. Uhlig, Wiley-Verlag, New York, 1998. All diese Techniken können durch erfindungsgemäße Proteasen bereichert werden. Hierzu gehören insbesondere folgende Einsatzgebiete:
- die Verwendung einer erfindungsgemäßen Alkalischen Proteasen zur biochemischen Analyse oder zur Synthese von niedermolekularen Verbindungen oder von Proteinen;
- darunter bevorzugt die Verwendung zur Endgruppenbestimmung im Rahmen einer Peptid- Sequenzanalyse;
- die Verwendung einer erfindungsgemäßen Alkalischen Proteasen zur Präparation, Reinigung oder Synthese von Naturstoffen oder biologischen Wertstoffen, vorzugsweise im Rahmen entsprechender Mittel oder Verfahren;
- die Verwendung einer erfindungsgemäßen Alkalischen Proteasen zur Synthese von Proteinen oder anderen niedermolekularen chemischen Verbindungen;
- die Verwendung einer erfindungsgemäßen Alkalischen Proteasen zur Behandlung von natürlichen Rohstoffen, insbesondere zur Oberflächenbehandlung, ganz besonders in einem Verfahren zur Behandlung von Leder, vorzugsweise im Rahmen entsprechender Mittel oder Verfahren;
- die Verwendung einer erfindungsgemäßen Alkalischen Proteasen zur Behandlung von photographischen Filmen, insbesondere zur Entfernung von gelatinhaltigen oder ähnlichen Schutzschichten; und
- die Verwendung einer erfindungsgemäßen Alkalischen Proteasen zur Herstellung von Lebensmitteln oder von Futtermitteln.
Grundsätzlich wird der Einsatz erfindungsgemäßer Proteasen in allen weiteren Technikgebieten in den Schutzbereich der vorliegenden Anmeldung eingeschlossen, für die es sich als geeignet herausstellt. Die nachfolgenden Beispiele erläutern die Erfindung weiter, ohne sie jedoch darauf einzuschränken.
Beispiele
Alle molekularbiologischen Arbeitsschritte folgen Standardmethoden, wie sie beispielsweise in dem Handbuch von Fritsch, Sambrook und Maniatis „Molecular cloning: a laboratory manual", CoId Spring Harbour Laboratory Press, New York, 1989, oder vergleichbaren einschlägigen Werken angegeben sind. Enzyme und Baukästen (Kits) wurden nach den Angaben der jeweiligen Hersteller eingesetzt.
Beispiel 1
Isolierung und Identifizierung des proteolytisch aktiven Bakterienstamms DSM ID 01-189 0,1g einer Bodenprobe wurden in 1 ml sterilen 0,9%iger NaCI-Lösung suspendiert und auf milchpulverhaltigen Agarplatten (1 ,5% Agar, 0,5% NaCI, 0,1 % K2HPO4, 0,1 % Hefeextrakt, 2% Pepton, 1 % Milchpulver, pH10) ausplattiert. Anhand eines Klärungshofes wurde ein proteolytisch aktives Bakterium isoliert und anhand der bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) verfügbaren Stamminformationen als Bacillus sp. identifiziert und unter der Hinterlegungsnummer DSM ID 01-189 bei der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ) hinterlegt.
Beispiel 2
Isolierung und Klonierug der neuen Serinprotease aus dem Boden
Das proteolytisch aktive Bakterium Bacillus sp. DSM ID 01-189 wurde in Horikoshi-Medium pH9
(0,1 % K2HPO4, 0,5% Hefeextrakt, 1 % Pepton, 0,02% MgSO4, 0,3% Na2CO3) 72 h bei 370C und
200 rpm kultiviert. Die chromosomale DNA dieses Bakteriums wurde nach Standardmethoden präpariert, mit dem Restriktionsenzym Sau 3A behandelt und die erhaltenen Fragmente in den
Vektor pAWA22 kloniert. Dabei handelt es sich um einen von pBC16 abgeleiteten
Expressionsvektor für den Einsatz in Bacillus-Spezies (Bernhard et al. (1978), J. Bacteriol.,
Band 133 (2), S. 897 ff.). Dieser Vektor wurde in den Protease-negativen Wirtsstamm Bacillus subtilis DB 104 (Kawamura und Doi (1984), J. Bacteriol., Band 160 (1 ), S. 442-444) transformiert.
Die Transformanten wurden zunächst auf DM3-Medium regeneriert und dann auf milchpulverhaltigen Agarplatten (TBY-Skimmilk-Platten; siehe Beispiel 1 ) überimpft. Proteolytisch aktive Klone wurden anhand ihrer Lysehöfe identifiziert. Aus den erhaltenen proteolytisch aktiven Klonen wurde einer ausgewählt, dessen Plasmid (Vektor) isoliert und das in diesem Vektor enthaltene Genfragment (Insert) nach Standardmethoden sequenziert. Das ca. 2kb große Insert enthält einen offenen Leserahmen von etwa 1 kb, dessen Nukleinsäuresequenz (DNA-Sequenz) für eine Protease des Typs hochalkalischer Subtilisine kodiert (SEQ ID NO. 1 ). Die Sequenz wurde mittels PCR amplifiziert, in der E. coli Vektor pUC19 kloniert und gemäß dem Budapester Vertrag bei der DSMZ-Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Inhoffenstraße 7B, D-38124 Braunschweig) unter der Nummer DSM 19494 hinterlegt.
Beispiel 3
Bestimmung der Ähnlichkeiten der Aminosäuresequenz der reifen Protease (SEQ ID NO. 3) Es wurde ein Homologievergleich mit den bisher bekannten Proteasen in der "Non-redundant Genbank" (Altschul, Stephan F., Thomas L. Madden, Alejandro A. Schaffer, Jinghui Zhang, Hheng Zhang, Webb Miller, and David J. Lipman (1997): "Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs"; Nucleic Acids Res., 25, S.3389-3402.) durchgeführt. Die angegebenen Identitätswerte wurden mit dem Computer-Programm Vector NTI® Suite 7.0 (erhältlich von der Firma InforMax, Inc., Bethesda, USA) mit den vorgegebenen Default- Parametern ermittelt. Die Ergebnisse sind in folgender Tabelle 1 zusammengestellt.
Tabelle 1 :
Figure imgf000046_0001
Wie vorstehend bereits beschrieben, wurde als nächstähnliches Enzym die Protease identifiziert, die als SEQ ID NO.1 in der US-Patentanmeldung US 2004/0209343 offenbart ist. Die ermittelte Identität auf Aminosäureebene beträgt 94,1 % bezogen auf das reife (mature) Enzym gemäß SEQ ID NO.3. Weitere Identitätswerte zu Aminosäuresequenzen nachfolgender Datenbankeinträge, die in dem Homologievergleich niedrigere Identitätswerte ergaben, sind in der vorstehenden Tabelle 1 ebenfalls angegeben. Beschreibung der Figuren
Figur 1 : Alignment der erfindungsgemäßen reifen Protease (SEQ ID NO. 3) mit Proteasen aus dem Stand der Technik, errechnet mit dem Programm Vector NTI Suite Ver.7 (Fa. InforMax, Inc. Bethesda, USA) unter Standardparametern.
Darin bedeuten:
SEQ ID NO.3: Erfindungsgemäße Alkalische Protease gemäß SEQ ID NO. 3 (reifes Enzym)
US 2004/0209343 (SEQ ID NO.1 ): Protease gemäß SEQ ID NO.1 der US- Patentanmeldung US 2004/0209343
Blap WT: Alkalische Protease aus Bacillus lentus DSM 5483 (WO 92/21760 A1 )

Claims

Patentansprüche
1. Protease umfassend eine Aminosäuresequenz, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
a) Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 3 angegebenen Aminosäuresequenz zu mindestens 94,2% identisch ist
b) Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz zu mindestens 59% identisch ist,
insbesondere eine, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
a) Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 3 angegebenen Aminosäuresequenz zunehmend bevorzugt zu mindestens 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist
b) Aminosäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 2 angegebenen Aminosäuresequenz zu mindestens 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 94,5%, 95%, 95,5%, 96%, 96,5%, 97%, 97,5%, 98%, 98,5%, 99%, 99,5% und ganz besonders bevorzugt zu 100% identisch ist.
2. Protease nach Anspruch 1 , die natürlicherweise in einem Organismus vorhanden ist, der aus einem natürlichen Habitat isolierbar ist, insbesondere in einem Mikroorganismus, vorzugsweise einem Pilz, einem gramnegativen oder einem grampositiven Bakterium, hierunter besonders bevorzugt einem der Gattung Bacillus, insbesondere einem Bakterienstamm Bacillus sp. DSM ID 01-189.
3. Protease, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einer Protease nach einem der Ansprüche 1 oder 2 als Ausgangsmolekül erhaltbar ist durch Fragmentierung, Deletions-, Insertions- oder Substitutionsmutagenese und eine Aminosäuresequenz umfasst, die über eine Länge von mindestens 300 und zunehmend bevorzugt mindestens 290, 280, 270, 260, 250, 240, 230, 220, 210, 200, 190, 180, 170, 160, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 70, 60 und 50 zusammenhängenden Aminosäurepositionen mit dem Ausgangsmolekül übereinstimmt.
4. Protease, dadurch gekennzeichnet, dass sie aus einer Protease nach einem der Ansprüche 1 bis 3 als Ausgangsmolekül erhaltbar ist und einen oder mehrere Aminosäureaustausche in Positionen aufweist, die den Positionen 3, 4, 36, 42, 47, 56, 61 , 69, 87, 96, 99, 101 , 102, 104, 114, 118, 120, 130, 139, 141 , 142, 154, 157, 188, 193, 199, 205, 211 , 224, 229, 236, 237, 242, 243, 255 und 268 der Alkalischen Protease aus Bacillus lentus gemäß SEQ ID NO. 4 in einem Alignment zugeordnet sind.
5. Nukleinsäuremolekül, kodierend für eine Protease nach einem der Ansprüche 1 bis 4, insbesondere eines, das eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus
a) Nukleinsäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleinsäuresequenz in einem Teilstück von mindestens 300 zusammenhängenden Nukleotiden mindestens zu 59% identisch ist
b) Nukleinsäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleinsäuresequenz in den Positionen 343 bis 1269 mindestens zu 59% identisch ist
c) Nukleinsäuresequenz, die zu der in SEQ ID NO. 1 angegebenen Nukleinsäuresequenz mindestens zu 59% identisch ist.
6. Vektor enthaltend ein Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 5, insbesondere ein Klonierungsvektor oder ein Expressionsvektor.
7. Nicht menschliche Wirtszelle, die eine Protease nach einem der Ansprüche 1 bis 4 oder ein Fragment derselben beinhaltet oder die zu deren Herstellung angeregt werden kann, vorzugsweise unter Einsatz eines Vektors gemäß Anspruch 6, insbesondere eine, die die Protease oder ein Fragment derselben in das die Wirtszelle umgebende Medium sezerniert.
8. Wirtszelle nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie einen Zellkern besitzt.
9. Wirtszelle nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass sie ein Bakterium ist, bevorzugt eines, das ausgewählt ist aus der Gruppe der Gattungen von Escherichia, Klebsiella, Bacillus, Staphylococcus, Corynebakterium, Arthrobacter, Streptomyces, Stenotrophomonas und Pseudomonas, weiter bevorzugt eines, das ausgewählt ist aus der Gruppe von Escherichia coli, Klebsiella planticola, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus subtilis, Bacillus alcalophilus, Bacillus globigii, Bacillus gibsonii, Bacillus pumilus, Staphylococcus carnosus, Corynebacterium glutamicum, Arthrobacter oxidans, Streptomyces lividans, Streptomyces coelicolor und Stenotrophomonas maltophilia.
10. Verfahren zur Herstellung einer Protease gemäß einem der Ansprüche 1 bis 4, insbesondere unter Einsatz eines Nukleinsäuremoleküls nach Anspruch 5, vorzugsweise unter Einsatz eines Vektors nach Anspruch 6, besonders bevorzugt unter Einsatz einer Wirtszelle nach einem der Ansprüche 7 bis 9.
11. Mittel, dadurch gekennzeichnet, dass es mindestens eine Protease nach einem der Ansprüche 1 bis 4 enthält, insbesondere ein Waschmittel, Handwaschmittel, Spülmittel, Handgeschirrspülmittel, Maschinengeschirrspülmittel, Reinigungsmittel, Zahnprothesen- oder Kontaktlinsenpflegemittel, Nachspülmittel, Desinfektionsmittel, kosmetisches Mittel, pharmazeutisches Mittel oder ein Mittel zur Behandlung von Filtermedien, Textilien, Pelzen, Papier, Fellen oder Leder, ist, insbesondere ein Wäschewaschmittel oder ein Geschirrspülmittel.
12. Mittel nach Anspruch 11 , dadurch gekennzeichnet, dass es als Einkomponentensystem vorliegt oder dass es in mehrere Komponenten aufgeteilt ist, und insbesondere eines, das die Protease in einer Menge von 2 μg bis 20 mg, vorzugsweise von 5 μg bis 17,5 mg, besonders bevorzugt von 20 μg bis 15 mg und ganz besonders bevorzugt von 50 μg bis 10 mg pro g des Mittels enthält.
13. Mittel nach einem der Ansprüche 11 oder 12, dadurch gekennzeichnet, dass es in fester Form vorliegt, insbesondere als rieselfähiges Pulver mit einem Schüttgewicht von 300 g/l bis 1200 g/l, insbesondere 500 g/l bis 900 g/l, oder dass es in pastöser oder in flüssiger Form vorliegt.
14. Mittel nach einem der Ansprüche 11 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Protease mit einer bei Raumtemperatur oder bei Abwesenheit von Wasser für die Protease undurchlässigen Substanz umhüllt ist.
15. Mittel nach einem der Ansprüche 1 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, dass es eines oder mehrere weitere Enzyme umfasst, insbesondere eine Protease, Amylase, Cellulase, Hemicellulase, Mannanase, Tannase, Xylanase, Xanthanase, ß-Glucosidase, Carrageenase, Oxidase, Oxidoreduktase oder eine Lipase.
16. Verwendung eines Mittels nach einem der Ansprüche 11 bis 15 zur Entfernung von protease- sensitiven Anschmutzungen auf Textilien oder harten Oberflächen.
17. Verfahren zur Reinigung von Textilien oder harten Oberflächen, dadurch gekennzeichnet, dass in mindestens einem Verfahrensschritt ein Mittel nach einem der Ansprüche 11 bis 15 angewendet ist.
18. Verfahren zur Reinigung von Textilien oder harten Oberflächen, dadurch gekennzeichnet, dass in mindestens einem Verfahrensschritt eine Protease nach einem der Ansprüche 1 bis 4 proteolytisch aktiv ist, insbesondere derart, dass die Protease in einer Menge von 40 μg bis 4 g, vorzugsweise von 50 μg bis 3 g, besonders bevorzugt von 100 μg bis 2 g und ganz besonders bevorzugt von 200 μg bis 1 g pro Anwendung eingesetzt ist.
19. Verwendung einer Protease nach einem der Ansprüche 1 bis 4 zur Reinigung von Textilien oder von harten Oberflächen, insbesondere derart, dass die Protease in einer Menge von 40 μg bis 4 g, vorzugsweise von 50 μg bis 3 g, besonders bevorzugt von 100 μg bis 2 g und ganz besonders bevorzugt von 200 μg bis 1 g pro Anwendung eingesetzt ist.
PCT/EP2008/059844 2007-08-03 2008-07-28 Neue proteasen und wasch- und reinigungsmittel, enthaltend diese neuen proteasen WO2009019157A1 (de)

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