DE4013142C2

DE4013142C2 - Verfahren zur gezielten Veränderung der Eigenschaften von Enzymen durch chemische Modifizierung und chemisch modifizierte Enzyme

Info

Publication number: DE4013142C2
Application number: DE4013142A
Authority: DE
Inventors: Hans-Ulrich Dr Geyer; Gerhard Konieczny-Janda
Original assignee: Solvay Enzymes GmbH and Co KG
Current assignee: Danisco US Inc
Priority date: 1990-04-25
Filing date: 1990-04-25
Publication date: 1998-08-27
Anticipated expiration: 2010-04-26
Also published as: DE4013142A1; WO1991016424A1

Description

Die Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur ge zielten Veränderung der Eigenschaften von Enzymen durch chemische Modifizierung derselben, auf die Herstellung chemisch modifizierter Enzyme sowie auf die chemisch modi fizierten Enzyme und deren Verwendung.

Im Stand der Technik ist es bereits bekannt, zur Ver änderung und zur Verbesserung der pharmakologischen Eigen schaften von Enzymen - wie z. B. Adenosindeaminase, Aspara ginase, Urikase, Superoxiddismutase, Katalase - diese durch Umsetzung mit Polyethylenglykol zu modifizieren. Die europäische Patentanmeldung 154 316 beschreibt weiterhin die Umsetzung von Lymphokinin mit Monoalkylenglykolalde hyden. Aus der europäischen Patentanmeldung 128 975 ist es bekannt, wasserlösliche biologisch aktive Konjugate durch Kupplung von Proteinen, z. B. Enzymen, mit Alkylenglykol estern einer Polyuronsäure unter alkalischen Bedingungen herzustellen. Hiebei ist die Polyuronsäure durch Amidbin dungen an das Protein und durch Esterbindungen an den Alkylenglykolrest gebunden. Aus der deutschen Offenle gungsschrift 29 19 622 sind wasserlösliche stabilisierte Enzymderivate, insbesondere Proteasederivate, bekannt, die durch Umsetzung des Enzyms mit Aldehydgruppen-haltigen Polysaccharidderivaten, z. B. Dialdehydstärke oder Dialde hydcellulose, zu einem immobilisierten, d. h. unlöslichen Enzymprodukt und nachfolgende Reduktion des immobili sierten Enzymproduktes mit komplexen Hydriden erhalten wurden. Hierbei müssen mindestens zwei der verfügbaren Aminogruppen des Enzymanteils sowie mindestens zwei der verfügbaren Aldehydgruppen des Polysaccharidanteils mit einander vernetzt und das derart erhaltene Produkt zusätz lich hydriert werden.

Ferner wurde im Stand der Technik bereits Subtilisin nitriert, carbamyliert, glutaryliert und succinyliert, um die Effekte dieser chemischen Modifizierungen auf die enzymatische Aktivität zu untersuchen. Auch α-Amylasen wurden bereits mit organischen Säureanhydriden - wie z. B. Essigsäure-, Propionsäure-, Buttersäureanhydrid etc. - zur korrespondierenden acylderivatisierten α-Amylase modifi ziert. Chymotrypsinogen wurde ebenfalls mit Säureanhydri den, wie z. B. Essigsäure- oder Succinsäureanhydrid, in acylierte Derivate und beispielsweise mit Ethylendiamin auch in amidierte Derivate überführt. Weiterhin ist die Umsetzung von Glucoseisomerase bzw. D-Xyloseisomerase mit Diethylpyrocarbonat sowie von Glucoseisomerase mit 2,4,6- Trinitrobenzolsulfonsäure bekannt.

Die im Stand der Technik bekannten Verfahren zur chemischen Modifizierung von Enzymen beschränken sich in ihrer Anwendbarkeit jeweils nur auf spezielle Enzyme und Arten der chemischen Modifizierung bezüglich der in das Enzym einführbaren Reste. Darüber hinaus lassen die be kannten Verfahren nur einen geringen Spielraum hinsicht lich der Art und Weise, sowie hinsichtlich einer abgestuf ten Durchführbarkeit der chemischen Modifizierung von Enzymen zu. Die zur Modifizierung der Enzyme im Stand der Technik eingesetzten Reagenzien (z. B. für die Nitrierung) sind oft zu aggressiv oder die in diesen Reagenzien ent haltenen funktionellen Gruppen (wie z. B. Aldehydgruppen oder Säureanhydridgruppen) die zur Anbindung der Modifi zierungsreagenzien an das Enzym dienen, sind chemisch zu reaktiv und erschweren dadurch die gezielte Steuerung des Modifizierungsgrades. Oder sie sind sogar an sich mit den Enzymen schlecht verträglich. Die chemische Modifizierung von Enzymen ist im Stand der Technik nach Art und Grad der Modifizierung somit schwer steuerbar. Die gebildeten Bin dungstypen zwischen Enzym und Modifizierungsreagenz können sich darüber hinaus (wie z. B. Imin-, Ester- oder Amidbin dungen) als zu wenig hydrolysestabil erweisen und dadurch die Anwendung der modifizierten Enzyme einschränken.

Es bestand daher die Aufgabe, ein einfaches, mildes und zugleich vielseitiges Verfahren zur gezielten Verände rung der Eigenschaften von Enzymen durch Derivatisierung und zur chemischen Modifizierung von Enzymen zur Verfügung zu stellen, welches auf eine Vielzahl von Enzymen anwend bar ist. Dieses Verfahren sollte hinsichtlich Art und Grad der Modifizierung der Enzyme leicht steuerbar sein und so mit ein maßgeschneidertes Anpassen von Enzymen für be stimmte Anforderungen ermöglichen. Eine weitere Aufgabe bestand in der Bereitstellung neuer, wertvoller, durch chemische Modifizierung optimierter Enzymderivate für ver schiedene Anwendungszwecke.

Die Aufgaben werden gelöst durch die erfindungsge mäßen Verfahren bzw. die erfindungsgemäß chemisch modi fizierten Enzyme (Enzymderivate).

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur gezielten Veränderung der Eigenschaften eines Enzyms durch chemische Modifizierung, welches sich dadurch auszeichnet, daß man das Enzym durch Umsetzung mit einer endständigen Epoxid- oder Halogenhydrinverbindung, die einen die biochemischen und anwendungstechnischen Eigenschaften des Enzyms gezielt verändernden, kationischen, amphiphilen, anionischen und/oder lipophilen bzw. hydrophoben organischen Rest enthält, bei Temperaturen bis maximal 35°C in ein wasserlösliches bzw. nicht wasserunlösliches, chemisch modifiziertes Enzym (Enzymderivat) überführt.

Die erfindungsgemäß zur chemischen Modifizierung von Enzymen eingesetzten Modifizierungsreagenzien enthalten als reaktive Gruppe eine endständige Epoxid- oder als deren Vorstufe eine Halogenhydringruppe. Diese Epoxid- bzw. Halogenhydringruppe ist eine milde, chemisch reaktive Gruppe, die bevorzugt mit freien basischen Gruppen des zu modifizierenden Enzyms reagiert. Solche basischen Gruppen im zu modifizierenden Enzym sind bevorzugt freie, primäre Aminogruppen von polyfunktionellen Aminosäuren, die in der das Enzym aufbauenden Polypeptidkette enthalten und durch ihre Lage an der Enzymoberfläche für das Reagenz zugäng lich sind. Es handelt sich dabei insbesondere z. B. um die ε-Aminogruppe der Aminosäure Lysin oder gegebenenfalls auch um die Aminofunktion in der Guanidiniumgruppe der Aminosäure Arginin. Die Basizität bzw. Nukleophilie dieser Aminogruppen ist günstig auf die Reaktivität der einge setzten Epoxid- bzw. Halogenhydrin-Verbindungen abgestimmt und der Modifizierungsgrad läßt sich daher leicht durch Einstellung der Reaktionsparameter pH-Wert, Temperatur und Reaktionszeit steuern. Darüber hinaus sind die erfindungs gemäß eingesetzten Epoxide bzw. Halogenhydrine billig und in großen Mengen technisch herstellbar und somit gut ver fügbar. Eine Vielzahl dieser Epoxide ist auch kommerziell erhältlich. Neben der für die Anbindung an das Enzym erfindungsgemäß wichtigen endständigen Epoxid- bzw. Halogen hydringruppe können die Epoxide ihrer Art nach eine Viel zahl von Resten tragen, die durch ihre jeweiligen spezi fischen Eigenschaften die Eigenschaften der erhaltenen Enzymderivate modifizieren und dadurch die gezielte Varia tion der biochemischen und anwendungstechnischen Eigen schaften dieser Enzymderivate ermöglichen.

Durch die Erfindung wird auch ein Verfahren zur Her stellung wasserlöslicher bzw. nicht wasserunlöslicher, chemisch modifizierter Enzyme (Enzymderivate) bereit ge stellt, welches sich dadurch auszeichnet, daß man durch unter basischen Bedingungen und bei Temperaturen bis maximal 35°C erfolgende Umsetzung wenig stens einer der nicht im Aktivitätszentrum befindlichen, freien primären Aminogruppen eines Enzyms mit

a) Epoxiden der Formel I
worin
R für einen kationischen, amphiphilen, anionischen oder lipophilen bzw. hydrophoben organischen Rest steht,
oder mit
b) Halogenhydrinen der Formel II
worin
X für Halogen, vorzugsweise Chlor oder Brom, steht und
R die obige Bedeutung besitzt,
das Enzym in ein wasserlösliches bzw. nicht wasserunlös liches, chemisch modifiziertes Enzym (Enzymderivat) über führt, worin eine oder mehrere der genannten freien Amino gruppen des Enzyms mit einem Rest der Formel A
worin R die obige Bedeutung besitzt,

substituiert sind.

Durch das erfindungsgemäße Verfahren zur chemischen Modifizierung von Enzymen wird die Molekülgröße der einge setzten Enzyme kaum verändert. Die Wasserlöslichkeit, die hier insbesondere als die Löslichkeit in einem Wasser ent haltenden Anwendungsmedium angesehen wird, der einge setzten Enzyme wird daher durch die erfindungsgemäße chemische Modifizierung kaum beeinträchtigt. Es werden somit wasserlösliche bzw. nicht wasserunlösliche, d. h. insbesondere in Wasser enthaltenden Anwendungsmedien lös liche bzw. nicht unlösliche, chemisch modifizierte Enzym derivate erhalten, deren Wasserlöslichkeit im wesentlichen derjenigen der zugrundeliegenden Enzyme entspricht bzw. demgegenüber gegebenenfalls allenfalls soweit vermindert ist, daß sie nicht vollständig wasserunlöslich sind. Die Begriffe "wasserlöslich" bzw. "Wasserlöslichkeit" umfaßt hier auch feine Dispersionen, wie insbesondere Emulsionen.

Bei der Durchführung des vorstehend genannten Ver fahrens zur Herstellung chemisch modifizierter Enzymderi vate kann von in beliebiger Form vorliegenden Enzymen aus gegangen werden. Das Verfahren ist unabhängig von der Vor geschichte, z. B. den Fermentations- und Isolierungsbedin gungen, des Enzyms. Es kann sowohl von festen sprühge trockneten, kristallisierten, granulierten Enzymen oder auch von Enzymlösungen bzw. -konzentraten beliebiger Kon zentration ausgegangen werden. Hierbei erweist es sich als vorteilhaft, daß auch von Zwischenstufen, d. h. von Lösun gen oder Konzentraten von Enzymen, einer normalen Enzym produktion ausgegangen werden kann.

Die Umsetzung wird gewöhnlich in Lösung, vorzugsweise in einer wäßrigen Lösung, durchgeführt. Die Reaktionslö sungen können gegebenenfalls enzymverträgliche organische Lösungsmittel, z. B. Alkohole, Diole etc., oder Enzymstabi lisatoren enthalten. Feste Enzym-Ausgangsstoffe werden daher in der gewünschten Konzentration in Wasser oder im Wasser/Lösungsmittelgemisch gelöst. Geht man direkt von Enzymlösungen aus einer normalen Enzymproduktion aus, so können diese in der anfallenden Konzentration oder nach Konzentrierung auf jeweils gewünschte Konzentrationen ein gesetzt werden. In einer bevorzugten Ausgestaltung des er findungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung chemisch modi fizierter Enzymderivate werden jedoch wäßrige Enzymkonzen trate eingesetzt, die 10 bis 35 Gew.-% Trockensubstanzge halt aufweisen. In einer weiteren Ausgestaltung des erfin dungsgemäßen Verfahrens kann es sich als zweckmäßig erwei sen, die Umsetzung in Gegenwart von Enzymstabilisatoren und/oder Lösungsvermittlern durchzuführen. Vorzugsweise wird die Reaktion dann in Gegenwart von Propandiol ausge führt, welches dabei durchaus in Mengen bis zu etwa 84 Gew.-% (bezogen auf das gesamte Reaktionsgemisch) an wesend sein kann.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung chemisch modifizierter Enzyme (Enzymderivate) wird unter basischen Bedingungen ausgeführt. Hierunter wird verstan den, daß die Umsetzung bei pH-Werten von oberhalb 7 durch geführt wird. In einer bevorzugten Ausgestaltung des er findungsgemäßen Herstellverfahrens wird die Umsetzung bei pH-Werten von 9 bis 11 durchgeführt. Die Reaktion kann dabei sowohl bei einem hohen Anfangs-pH-Wert begonnen werden, der sich im Laufe der Reaktion allmählich zu klei neren alkalischen pH-Werten (bis maximal hinab zu pH 7) verschiebt oder durch laufende Nachregulation des pH- Wertes auf einem konstanten alkalischen pH-Wert gehalten werden. Die pH-Wert-Einstellung kann hierbei durch alle an sich mit Enzymen verträglichen anorganischen Basen, wie z. B. insbesondere Alkalioxiden oder -hydroxiden, vorge nommen werden. Bevorzugt wird Natriumhydroxid, insbeson dere in Form von wäßriger Lösung (Natronlauge) zur pH- Wert-Einstellung verwendet.

Die Temperatur des Verfahrens wird nur durch die Temperaturstabilität der eingesetzten Enzyme nach oben hin begrenzt. Die Umsetzung erfolgt daher bei Temperaturen bis maximal 35°C. Vorzugsweise wird die Um setzung aber bei Temperaturen von bis zu maximal 30°C durchgeführt. Nach unten hin wird die Reaktionstemperatur in der Regel durch Umgebungstemperaturen von etwa 25°C begrenzt, da unterhalb dieser Temperaturen keine bzw. nur unzureichende Umsetzungen zu beobachten sind.

Die Reaktionszeit kann je nach Art des modifizierenden Enzyms und je nach Art des gewählten Modifizierungsrea genzes und des gewünschten Modifizierungsgrades von weni gen Stunden bis hin zu einem ganzen Tag betragen. In der Regel werden in zweckmäßigen Ausgestaltungen des erfin dungsgemäßen Herstellverfahrens Reaktionszeiten von 1 bis 8 Stunden gewählt. Der Modifizierungsgrad der erhaltenen erfindungsgemäßen Enzymderivate kann hierbei in einem weiten Bereich von gering, über mittel und mittelstark bis hin zu stark eingestellt werden. Anstelle länger an dauernder Reaktionszeiten kann es gegebenenfalls je nach eingesetzten Enzym auch zweckmäßig sein, die Reaktionszeit durch Einsatz eines Überschusses an Modifizierungsreagenz zu verkürzen, was nicht nur aus verfahrenstechnischer Sicht, sondern auch aus wirtschaftlicher Sicht von Vorteil ist (höherer Wert der Enzyme; billige und in großer Menge gut verfügbare Modifizierungsreagenzien). In zweckmäßigen Ausgestaltungen des erfindungsgemäßen Herstellverfahrens wird daher in der Regel mit einem 5- bis 10-fachen Überschuß an Modifizierungsreagenz (bezogen auf die im zu modifizierenden Enzym enthaltenen freien, substituierbaren Aminogruppen) gearbeitet. Gewünschtenfalls kann es zur Erzielung höherer Modifizierungsgrade auch erwünscht sein, mit noch einem höheren Überschuß an Modifizierungsreagenz zu arbeiten. Die Zugabe des Modifizierungsreagenzes zur Lösung des zu modifizierenden Enzyms kann sowohl kontinu ierlich als auch in mehreren Dosen über die Reaktionszeit verteilt werden oder auch nur einmalig zu Beginn der Um setzung des zu modifizierenden Enzyms vorgenommen werden. Die einmalige Zugabe zu Beginn der Reaktion führt hierbei zu höheren Reaktionsgeschwindigkeiten und auch zu höheren Modifizierungsgraden und ist somit insbesondere dann zweckmäßig wenn kurze Reaktionszeiten oder insgesamt höhere Modifizierungsgrade erzielt werden sollen.

Zur Beendigung der Reaktion wird das Reaktionsgemisch im allgemeinen auf 20°C abgekühlt und mit einer wäßrigen Lösung einer enzymverträglichen anorganischen und/oder or ganischen Säure auf einen pH-Wert von 7 eingestellt. Bei spielhaft sei hierfür eine wäßrige Lösung von Zitronen säure genannt. Die erhaltenen Reaktionsgemische können entweder als solche einer weiteren Verwendung zugeführt werden oder aber in an sich üblicher Weise, wie bei einer normalen Enzym-Herstellung/-Konfektionierung, üblichen Maßnahmen unterworfen werden. So können die das erfin dungsgemäße Enzymderivat enthaltenden Gemische mit an sich üblichen Enzymstabilisatoren versetzt, zu Konzentraten aufgearbeitet oder in an sich üblicher Weise, z. B. durch Sprühtrocknung, in ein festes Produkt überführt und auch granuliert werden.

Durch die Erfindung wird ein chemisch sehr mildes und enzymschonendes Verfahren zur gezielten chemischen Verän derung der Eigenschaften eines Enzyms mittels chemischer Modifizierung bereitgestellt, welches sich hervorragend zur Herstellung von chemisch modifizierten Enzymen eignet. Die durch das Verfahren erhaltenen erfindungsgemäßen Enzymderivate können chemisch modifizierte Enzyme sein, deren zugrundeliegenden Enzyme durch Substitution mit unterschiedlichsten Arten von organischen Resten in ihren Eigenschaften chemisch modifiziert sein können. So können die mit dem Epoxid der Formel I oder dem Halogenhydrin der Formel II in das Enzym eingeführten organischen Reste R kationisch, amphiphil, anionisch oder hydrophob sein. Hierdurch lassen sich die Eigenschaften eines Enzyms ziel gerichtet in vielfältigster Weise verändern. Z.B. können die isoelektrischen Punkte, die pH-Optima, die Ober flächeneigenschaften (Ladung, Hydrophobie), die Grenz flächenaktivität etc. gezielt beeinflußt werden.

In einer Variante des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Herstellung von wasserlöslichen, chemisch modifizier ten Enzymen werden zur chemischen Modifizierung des zu grundeliegenden Enzyms Epoxide der Formel I oder Halogen hydrine der Formel II eingesetzt, in denen R für einen kationischen organischen Rest der Formel -(CH₂)_n-N⁺R¹R²R³ steht, worin R¹, R² und/oder R¹ für einen Niedrigalkyl rest mit 1 bis 2 C-Atomen, vorzugsweise für Methyl, stehen und n eine ganze Zahl von 1 bis 3 bedeutet. Man erhält so chemisch modifizierte Enzymderivate, die aufgrund der kat ionischen Reste R eine erhöhte positive Oberflächenladung besitzen. In dieser Variante des erfindungsgemäßen Her stellverfahrens sind die Reste R dann z. B. Trimethyl ammoniummethylen-, Trimethylammoniumethylen-, Trimethyl ammoniumtrimethylen-Gruppen, wobei die Trimethylammonium methylen-Gruppe ganz besonders bevorzugt ist. Ein Beispiel für ein in dieser Variante eingesetztes Modifizierungsrea genz ist z. B. das 2,3-Epoxypropyltrimethylammoniumchlorid.

In einer anderen Variante des erfindungsgemäßen Ver fahrens zur Herstellung von wasserlöslichen, chemisch modifizierten Enzymen werden zur chemischen Modifizierung des zugrundeliegenden Enzyms Epoxide der Formel I oder Halogenhydrine der Formel II eingesetzt, in denen R für einen amphiphilen organischen Rest der Formel -(CH₂)_n-N⁺R¹R²R⁴ steht, worin R¹ und/oder R² für einen Niedrigalkylrest mit 1 bis 2 C-Atomen, vorzugsweise für Methyl, stehen, R⁴ für einen geradkettigen C10- bis C18-Alkylrest steht und n eine ganze Zahl von 1 bis 3 bedeutet. Man erhält so chemisch modifizierte Enzyme, deren amphiphilen Reste R neben der positiven Ammonium gruppe auch einen hydrophoben substituierten R⁴ enthalten. Beispiele für in dieser Variante eingesetzte Modifizie rungsreagenzien sind z. B. 3-Chloro-2-hydroxypropyl-di methyllaurylammoniumchlorid und 3-Chloro-2-hydroxypropyl dimethylcoco(C12-C16)ammoniumchlorid.

In einer weiteren Variante des erfindungsgemäßen Ver fahrens zur Herstellung von wasserlöslichen, chemisch modifizierten Enzymderivaten werden zur chemischen Modifi zierung des zugrundeliegenden Enzyms Epoxide der Formel I oder Halogenhydrine der Formel II eingesetzt, in denen R für einen anionischen organischen Rest der Formel -(CH₂)_n-SO₃- steht, worin n eine ganze Zahl von 1 bis 3 bedeutet. Man erhält so chemisch modifizierte Enzyme, die aufgrund der anionischen Reste R eine erhöhte negative Oberflächenladung besitzen. Als chemische Modifizierungs reagenzien werden in dieser Variante des erfindungsgemäßen Herstellverfahrens dann beispielsweise 2-Chloro-1-hydroxy ethyl-alkylensulfonate, vorzugsweise in Form des Natrium salzes, eingesetzt. Für diese Variante ganz besonders be vorzugte chemische Modifizierungsreagenzien sind z. B. die 3-Chloro-2-hydroxypropylsulfonate, insbesondere das Natriumsalz.

In einer weiteren anderen Variante des erfindungsge mäßen Verfahrens zur Herstellung von wasserlöslichen, chemisch modifizierten Enzymen werden zur chemischen Modifizierung des zugrundeliegenden Enzyms Epoxide der Formel I oder Halogenhydrine der Formel II eingesetzt, in denen R für einen hydrophoben organischen Rest der Formel -(CH₂)_n-CH₃ steht, worin n eine ganze Zahl von 1 bis 17 bedeutet. Man erhält so chemisch modifizierte Enzyme, die aufgrund der hydrophoben Reste R eine erhöhte Hydrophobie besitzen. In einer zweckmäßigen Ausgestaltung dieser Vari ante des erfindungsgemäßen Herstellverfahrens wird die Reaktion unter Einsatz von Enzymkonzentraten, insbesondere mit sehr hohen Enzymkonzentrationen, und unter Verwendung von Lösungsvermittlern, vorzugsweise von Propandiol, durchgeführt. Als chemische Modifizierungsreagenzien lassen sich in dieser Variante des erfindungsgemäßen Ver fahrens insbesondere die Epoxide von 1-Alkenen einsetzen. Beispiele hierfür sind z. B. α-Epoxide wie Hexen-1-oxid, Octen-1-oxid, Decen-1-oxid, Dodecen-1-oxid, Tetradecen- 1-oxid, Hexadecen-1-oxid, Oktadecen-1-oxid.

In dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von wasserlöslichen, chemisch modifizierten Enzymderivaten können an sich beliebige Enzyme, insbesondere solche mit großtechnischer Bedeutung für verschiedene Anwendungen wie z. B. Waschmittelenzyme, Enzyme zur Stärkeverzuckerung und andere Anwendungen, eingesetzt werden. In einer bevorzug ten Ausgestaltung des erfindungsgemäßen Herstellverfahrens werden als Enzyme insbesondere Proteasen, Amylasen, Glucoseisomerasen oder Lipasen eingesetzt. Es können aber auch andere Enzyme wie z. B. Pectinasen, Cellulasen oder Hemicellulasen etc. verwendet werden.

Das erfindungsgemäße Verfahren zur Herstellung von wasserlöslichen, chemisch modifizierten Enzymderivaten erlaubt ein gezieltes, chemisch sehr mildes Maßschneidern von Enzymderivaten mit an den jeweiligen Anwendungszweck in gewünschter Weise angepaßten Eigenschaften. So ermög licht das erfindungsgemäße Verfahren in einfacher Weise, z. B. die Oberflächeneigenschaften hinsichtlich Ladung und Hydrophobie in gewünschter Weise zu variieren. Enzymeigen schaften wie z. B. pH-Optimum, pH-Stabilität, Temperatur optimum, Temperaturstabilität, Oxidationsstabilität oder Kompatibilität mit anderen Enzymen (z. B. Stabilität gegen Verdauung durch gegebenenfalls anwesende Protease), Grenz flächenaktivität etc. lassen sich so leicht verändern und auf das jeweilige technische Einsatzgebiet der Enzyme in gewünschter Weise einstellen.

Die Erfindung betrifft daher auch solche wasserlös lichen bzw. nicht wasserunlöslichen, chemisch modifizier ten Enzyme (Enzymderivate), die bezogen auf ihre jeweili gen technischen Einsatzgebiete, in ihren biochemischen und anwendungstechnischen Eigenschaften verbessert sind, wobei sich diese chemisch modifizierten Enzyme dadurch auszeich nen, daß sie an wenigstens einer der nicht im Aktivitäts zentrum befindlichen, freien primären Aminogruppen des zugrundeliegenden Enzyms mit einem Rest der Formel A

worin R für einen kationischen, amphiphilen, anionischen oder hydrophoben organischen Rest steht, substituiert sind. Zweckmäßige erfindungsgemäße Enzymderivate zeichnen sich dadurch aus, daß das zugrundeliegende Enzym eine Protease, Amylase, Glucoseisomerase oder Lipase ist. Das zugrundeliegende Enzym kann aber auch ein anderes, z. B. eine Pectinase, Cellulase oder Hemicellulase etc. sein.

In einer Variante der erfindungsgemäß chemisch modi fizierten Enzyme zeichnen sich diese dadurch aus, daß sie mit einem Rest der Formel A substituiert sind, in denen R für einen kationischen Rest der Formel -(CH₂)n-N⁺R¹R²R³ steht, worin R¹, R² und/oder R³ für einen Niedrigalkylrest mit 1 bis 2 C-Atomen, vorzugsweise für Methyl, stehen und n eine ganze Zahl von 1 bis 3 bedeutet. Bei bevorzugten chemisch modifizierten Enzymen dieser Variante der Erfin dung sind die zugrundeliegenden Enzyme Proteasen, wie sie insbesondere für Wasch- und Reinigungszusammensetzungen verwendet werden. Besonders bevorzugt sind aber solche wasserlöslichen, chemisch modifizierten Proteasen (Prote asederivate), deren zugrundeliegende Protease eine alka lische oder hochalkalische Protease ist. Diese alkalischen oder hochalkalischen Proteasen können beispielsweise durch Kultivierung von Bacillus-Stämmen, wie z. B. Bacillus sub tilis, Bacillus alcalophilus, Bacillus amyloliquefaciens oder Bacillus licheniformis etc., gewonnen werden. In der bevorzugten Ausgestaltung dieser Variante der Erfindung liegen daher Enzymderivate vor, die sich dadurch auszeich nen, daß sie wasserlösliche bzw. nicht wasserunlösliche, chemisch modifizierte Proteasen sind, die an wenigstens einer der nicht im Aktivitätszentrum befindlichen, freien primären Aminogruppen der zugrundeliegenden Protease mit einem kationischen organischen Rest der Formel B

worin R¹, R² und/oder R³ für einen Niedrigalkylrest mit 1 bis 2 C-Atomen, vorzugsweise für einen Methylrest, stehen und n eine ganze Zahl von 1 bis 3 bedeutet, substituiert sind. Durch diese kationische Modifizierung von Proteasen werden Proteasederivate erhalten, bei denen die positiv geladenen ε-Aminogruppen des Lysins durch quartäre Ammoniumgruppen ersetzt sind. Der pK-Wert (und auch der isoelektrische Punkt) ist hierdurch erhöht. Insbesondere stark kationisch modifizierte Proteasen (Anteil von Mehr fachmodifizierung) zeigen eine etwas erhöhte Temperatur stabilität. Ferner ist beispielsweise die Waschwirkung der modifizierten hochalkalischen Proteasen nicht so stark von der Waschmitteldosierung abhängig wie die zugrundeliegen den nichtmodifizierten Proteasen. Solche chemisch modifi zierten Proteasen sind insbesondere für die gewerbliche Wäscherei vorteilhaft verwendbar, wo häufig sehr hohe Waschflotten-pH-Werte vorliegen. Unter solchen Bedingungen sind kationisch modifizierte hochalkalische Proteasen den zugrundeliegenden nichtmodifizierten Proteasen deutlich überlegen. Kationisch modifizierte Proteasen zeigen auch bessere Abbaubarkeit von Eiproteinen in Flecken.

In einer anderen Variante der erfindungsgemäßen Enzymderivate zeichnen sich diese dadurch aus, daß sie mit einem Rest der Formel A substituiert sind, in dem R für einen amphiphilen Rest der Formel -(CH₂)_n-N⁺R¹R²R⁴ steht, worin R¹ und/oder R² für einen Niedrigalkylrest mit 1 bis 2 C-Atomen, vorzugsweise für einen Methylrest, stehen, R⁴ für einen geradkettigen C10- bis C18-Alkylrest steht und n eine ganze Zahl von 1 bis 3 bedeutet. Es liegen chemisch modifizierte Enzyme mit amphiphilem Charakter vor.

In einer weiteren Variante der erfindungsgemäß chemisch modifizierten Enzyme zeichnen sich diese dadurch aus, daß sie mit einem Rest der Formel A substituiert sind, in dem R für einen anionischen Rest der Formel -(CH₂)_n-SO₃ steht, worin n eine ganze Zahl von 1 bis 3 bedeutet. Bei einer Gruppe zweckmäßiger, chemisch modifi zierter Enzyme dieser Variante der Erfindung sind die zu grundeliegenden Enzyme Proteasen, insbesondere alkalische oder hochalkalische Proteasen für Wasch- und Reinigungs zusammensetzungen, wie sie weiter oben bereits näher be schrieben worden sind. In einer bevorzugten Ausgestaltung dieser Variante der Erfindung liegen daher wasserlösliche bzw. nicht wasserunlösliche, chemisch modifizierte Enzyme vor, die sich dadurch auszeichnen, daß sie chemisch modi fizierte Proteasen, insbesondere chemisch modifizierte alkalische oder hochalkalische Proteasen, sind, die an wenigstens einer der nicht im Aktivitätszentrum befind lichen, freien primären Aminogruppen der zugrundeliegen den Protease mit einem anionischen organischen Rest der Formel C

worin n eine ganze Zahl von 1 bis 3 bedeutet, substituiert sind. In einer anderen Gruppe zweckmäßiger, chemisch modi fizierter Enzyme der Erfindungsvariante mit anionischer Modifizierung des zugrundeliegenden Enzyms ist das zu grundeliegende Enzym eine α-Amylase. Die zugrundeliegenden α-Amylasen sind hierbei insbesondere solche, wie sie für Wasch- und Reinigungszusammensetzungen bzw. andererseits z. B. auch für die Stärkeverzuckerung eingesetzt werden. Besonders bevorzugt ist hierbei thermostabile α-Amylase, wie sie z. B. aus Bacillus licheniformis gewonnen werden kann. In einer weiteren bevorzugten Ausgestaltung der Er findungsvariante mit anionischer Modifizierung von Enzymen liegen daher wasserlösliche bzw. nicht wasserunlösliche, chemisch modifizierte Enzymderivate vor, die sich dadurch auszeichnen, daß sie chemisch modifizierte α-Amylasen, vorzugsweise chemisch modifizierte thermostabile α-Amy lasen, sind, die an wenigstens einer der nicht im Aktivi tätszentrum befindlichen freien primären Aminogruppen der zugrundeliegenden Amylase mit einem anionischen Rest der Formel C

worin n eine ganze Zahl von 1 bis 3 bedeutet, substituiert sind.

Die vorstehend beschriebenen, anionisch modifizierten Enzyme eignen sich insbesondere für Niedrig-pH-Wasch mittelsysteme wie Flüssigvollwaschmittel und bestimmte Feinwaschmittel. Hier sind insbesondere die Enzymderivate aus milden alkalischen Proteasen (z. B. aus Bacillus licheniformis oder Bacillus subtilis) von Vorteil, insbe sondere für bleichmittelfreie und weitgehend builderfreie Flüssigvollwaschmittel. Ferner erweist es sich hierbei als überaus vorteilhaft, daß die anionisch modifizierten Enzyme eine erhöhte Stabilität gegenüber üblichen Flüssig waschmittelbestandteilen wie lineare Alkylsulfonate, Seifen, Paraffinsulfonaten, Fettsäureethoxysulfaten etc. aufweisen und auch in konzentrierten Flüssigwaschmitteln, insbesondere solchen mit hohen Wassergehalt und höheren pH-Werten, günstige Lagerstabilitäten aufweisen. Das pH- Optimum der anionisch modifizierten Enzyme ist im allge meinen um 0,5 bis 1 pH-Einheit gegenüber dem zugrundelie genden nichtmodifizierten Enzym zum sauren Bereich hin verschoben. Ein weiterer Effekt der anionischen Modifizie rung ist die stark verbesserte Trubstabilität in Flüssig waschmittelformulierungen (d. h. die Tendenz des im Flüs sigwaschmittel gelösten Enzyms oder anderer darin gelöster Bestandteile der Enzympräparation während der Lagerung auszuflocken ist vermindert). Die vorstehend beschriebenen anionisch modifizierten Enzyme, insbesondere auch anio nische α-Amylasen, sind auch für den Einsatz in umwelt freundlichen enzymhaltigen Geschirrspülmitteln geeignet. Darüber hinaus besitzen z. B. anionisch modifizierte α-Amy lasederivate im tiefen pH-Bereich von 5,0 bis 6,0 bei höheren Temperaturen (70°C) eine erhöhte Stabilität im Vergleich zu den zugrundeliegenden nichtmodifizierten α-Amylasen.

Eine weitere Variante der erfindungsgemäß chemisch modifizieren Enzyme zeichnet sich dadurch aus, daß das zugrundeliegende Enzym mit einem Rest der Formel A substi tuiert ist, in dem R für einen hydrophoben organischen Rest der Formel -(CH₂)_n-CH₃ worin n eine ganze Zahl von 1 bis 17 bedeutet, substituiert sind. Es liegen modifizierte Enzyme mit hydrophobem Charakter vor.

Die nachfolgenden Beispiele sollen die Erfindung weiter erläutern, ohne sie jedoch in ihrem Umfang zu be schränken.

Beispiel 1

In einem Vorlagebehälter wurde zunächst manuell eine Ge samtmenge von 40 kg eines wäßrigen Enzymkonzentrates der folgenden Zusammensetzung

Enzym: Hochalkalische Protease aus
Bacillus alcalophilus
Protein (Biuret): 15,1 Gew.-%
Trockensubstanz: 32,2 Gew.-%
Wasser: 67,8 Gew.-%
Aktivität (DU/g)*: 600.000

(*1.000 Delft Units (DU) ist die proteolytische Aktivi tät, die bei einem Volumen von 1 ml einer 2 gew.-%igen Enzymlösung nach Abbau von Casein eine Extinktions differenz von 0,400 ergibt; 1 cm Lichtweg, 275 nm; Be stimmung gegen Blindprobentest)

mit Natronlauge auf einen pH 10 eingestellt und bei Umge bungstemperatur (ca. 20°C) mit etwa 2 kg (= 3,5 Gew.-% Aktivsubstanz bezogen auf das im eingesetzten Enzymflüs sigkonzentrat enthaltene Enzym) einer 70 bis 71 gew.-%igen wäßrigen Lösung von 2,3-Epoxypropyl-trimethylammonium chlorid (kommerziell verfügbares Flüssigpräparat) ver mischt. Die erhaltene Mischung wurde mittels einer Pumpe in einen 50 l Rührreaktor überführt und durch Platten wärmetauscher auf eine Eingangstemperatur von 30°C er wärmt.

Der Reaktionsverlauf wurde zur Quantifizierung und Detektion der chemisch modifizierten Proteasen durch Kat ionenaustauschchromatographie (Ultropak TSK CM-2-SW 250 × 4,6 mm = Kationenaustauscher auf Carboxymethylbasis der Firma Pharmacia LKB GmbH, Freiburg) verfolgt. Als Start eluens wurde 0,05 molarer Natriumacetatpuffer mit pH 6,0 verwendet. Eluiert wurde durch Zugabe eines 0,4 molaren Natriumacetatpuffers mit ebenfalls pH 6,0. Die Ergebnisse des Reaktionsverlaufes sind nachfolgend in Abhängigkeit von der Reaktionszeit zusammengestellt. Der Modifizie rungsgrad bezieht sich hierbei auf die zugrundeliegende Protease (native Protease), wobei Mehrfachsubstitutionen unberücksichtigt blieben, und ist als das relative Ver hältnis der Konzentration der Enzymderivate zu der Summe der Konzentrationen des nativen Enzyms und der Enzymderi vate definiert. Der Modifizierungsgrad wird in Prozent angegeben und ein Modifizierungsgrad von 100% ist somit gleichbedeutend mit der Abwesenheit von nativem Enzym. Die in % angegebene Aktivität ist volumenkorrigiert und bezie ht sich auf die eingesetzte Aktivität (Delft Units) des nativen Enzyms.

Die Reaktion verlief exotherm, wodurch sich die ein gangs eingestellte Temperatur von 30°C auf ca. 33 bis 35°C erhöhte. Nach 4 h wurde die Reaktion durch Abkühlung des Reaktionsgemisches auf 20°C (Plattenwärmetauscher) und durch Zugabe wäßriger 20 gew.-%iger Zitronensäure unter Einstellung eines pH-Wertes von 7 gestoppt.

Die Isolierung der wasserlöslichen, chemisch modifi zierten Protease erfolgte nach an sich für die Isolierung von Enzymen bekannten Methoden, wie Ionenaustauschchroma tographie.

Das erhaltene Produkt konnte ohne Schwierigkeiten durch an sich bekannte Maßnahmen, wie Extrusion oder Sprühtrocknung, in ein Enzymgranulat überführt werden.

Man erhielt 80 kg einer chemisch durch Substitution mit 3-Trimethylammonium-2-hydroxypropyl-Resten modifizier ten hochalkalischen Bacillus alcalophilus-Protease in Granulatform. Die Eigenschaften des erhaltenen Protease derivatgranulates sind nachfolgend zusammengestellt.

Gehalt an unmodifizierter Protease < 5 Gew.-%
Mehrfachsubstitution gering.

Das Temperaturprofil der chemisch modifizierten Pro tease (d. h. die Aktivität in % in Abhängigkeit von der Temperatur) zeigte im wesentlichen denselben Verlauf wie das Temperaturprofil für die native Protease (jeweils 20 Minuten, pH 8, Substrat = Acetylcasein, Temperaturbereich 40 bis 70°C). Die Ergebnisse zeigen daß das aktive Zen trum der chemisch modifizierten hochalkalischen Protease aus Bacillus alcalophilus nicht durch das milde chemische Modifizierungsverfahren beeinträchtigt worden ist.

Analoge Modifizierungen mit weiteren Konzentraten der hochalkalischen Protease aus Bacillus alcalophilus zeigten, daß gegebenenfalls bei der Konzentratherstellung auftretende Schwankungen in der Zusammensetzung praktisch keinen Einfluß auf die Modifizierungsrate, die Modifizie rungsgeschwindigkeit und die Produktidentität ausübten. Die Proteaseeigenschaften wurden durch die milde chemische Modifizierung nicht negativ beeinflußt. Die Auswirkungen der stärkeren Kationisierung der chemisch modifizierten Proteasederivate gegenüber der nativen Protease zeigen sich über Sekundäreffekte in den weiter unten beschrie benen anwendungstechnisch zu beobachtenden Phänomenen.

Beispiel 2

Analog zu Beispiel 1 wurde ein wäßriges Enzymkonzentrat der folgenden Zusammensetzung

Enzym: Alkalische Protease aus Bacillus licheniformis
Trockensubstanz: 22,4 Gew.-%
Wasser: 77,6 Gew.-%
Aktivität (DU/g): 921.000

mit Natronlauge auf einen pH 10 eingestellt und bei Umge bungstemperatur (ca. 20°C) mit einer solchen Menge einer 70 bis 71 gew.-%igen wäßrigen Lösung von 2,3-Epoxypropyl trimethylammoniumchlorid vermischt, die einer Menge von 5 Gew.-% Aktivsubstanz (=Modifizierungsreagenz) bezogen auf die eingesetzte Enzymmenge entsprach. Die Reagenzzu gabe erfolgte innerhalb von 5 Minuten. Das Gemisch wurde auf 25°C erwärmt und der Reaktionsverlauf analog zu Bei spiel 1 durch Kationenaustauschchromatographie verfolgt. Die Ergebnisse des Reaktionsverlaufes sind nachfolgend in Abhängigkeit von der Reaktionszeit zusammengestellt. Der Modifizierungsgrad ist hierbei wie in Beispiel 1 defi niert, die Aktivität in Prozent (analog Beispiel 1) eben falls volumenkorrigiert und bezieht sich auf die einge setzte Aktivität (Delft Units) der nativen Protease.

Nach 4 Stunden wurde das Reaktionsgemisch abgekühlt und durch Zugabe wäßriger 20 gew.-%iger Zitronensäure unter Einstellung eines pH = 7 gestoppt.

Der leichte Aktivitätsabfall der chemisch modifizier ten Protease im Vergleich zur nativen Protease ist hier auf eine höhere Alkalilabilität der eingesetzten alka lischen Bacillus licheniformis-Protease zurückzuführen. Analoge Modifizierungen mit weiteren Bacillus lichenifor mis-Protease-Konzentraten zeigten, daß sich dieser Aktivi tätsabfall bei Verwendung von Propandiol-haltigen Pro tease-Konzentraten vermeiden läßt. Propandiol-stabili sierte Protease-Konzentrate lassen sich nahezu verlustfrei modifizieren. Das flüssige Endprodukt dieses Beispiels wurde direkt für weitere Versuche verwendet.

Beispiel 3

Analog zu den vorhergehenden Beispielen wurde ein wäßriges Enzymkonzentrat der in Beispiel 1 angegebenen Zusammen setzung (hochalkalische Protease aus Bacillus alcalophi lus) mit 3-Chloro-2-hydroxydimethylcoco(C12-C16 )ammonium chlorid umgesetzt und der Reaktionsverlauf analog zu Bei spiel 1 durch Kationenaustauschchromatographie verfolgt. Die Konzentration der Protease war so eingestellt, daß eine Aktivität von 200 kDU/ml im Reaktionsgemisch vorlag. Das als chemisches Modifizierungsreagenz verwendete Chlor hydrin wurde in Form der verdünnten, kommerziell verfüg baren Lösung (Firma Degussa) verwendet und in einer Menge eingesetzt, daß 2 Gew.-% Aktivsubstanz bezogen auf das eingesetzte Enzym vorlagen. Die Umsetzung wurde bei 30°C durchgeführt und der pH-Wert zur Aktivierung und überfüh rung des Chlorhydrins in das Epoxid konstant auf pH 11 eingestellt (Abfangen des freigesetzten Chlorwasserstof fes). Nachfolgend ist der erreichte Modifizierungsgrad in Abhängigkeit von der Reaktionszeit zusammengestellt.

Beispiel 4

Es wurden jeweils 0,8 kg wäßriges Enzymkonzentrat der hochalkalischen Protease aus Bacillus alcalophilus mit einem Propandiol-Gehalt von 40 Gew.-% und folgender weiterer Zusammensetzung

Protein (Biuret): 6 Gew.-%
Anorganische Salze: 3 Gew.-% (z. B. CaCl₂)
Nichtenzymbestandteile: 1 Gew.-%
Wasser: 50 Gew.-%

unter Einstellung eines Anfangs-pH-Wertes von 12 bei 30°C unter verschiedenen, weiter unten angegebenen Reaktionsbe dingungen mit Natrium-3-Chloro-2-hydroxypropylsulfonat (festes Reagenz der Firma Shell Chemie) umgesetzt.

Der Anfangs-pH-Wert fiel nach Reaktionsbeginn auf Grund der Aktivierung des eingesetzten Chlorhydrins zum Epoxid unter gleichzeitiger Bildung von Chlorwasserstoff innerhalb kurzer Zeit auf pH 11 und wurde durch kontinu ierliche Zugabe von 4 N Natronlauge auf den jeweils ge wünschten pH-Wert von 11 bis 12 eingestellt. Die Bildung des aktiven Reagenzes (d. h. des Epoxides) - und damit auch der Reaktionsverlauf - konnte leicht anhand des Verbrauchs an Natronlauge verfolgt werden. Der Reaktionsverlauf unter Bildung von schwach bis mittelstark anionisch modifizier ten Enzymderivaten (d. h. bei Umsetzungen mit bis zu 5 Gew.-% Reagenz bezogen auf eingesetztes Enzym) konnte auch analog zu Beispiel 1 mittels Kationenaustauschchroma tographie (Ultropak TSK-2-CM 250 × 4,6 mm, pH = 6) ver folgt werden. Durch höhere Reagenzkonzentrationen von 5 bis 10 Gew.-% (bezogen auf das eingesetzte Enzym) war es möglich, die eingesetzte hochalkalische Protease aus Bacillus alcalophilus auch mehrfach zu modifizieren (d. h. die Zahl der in ein Proteasemolekül eingeführten Substi tuenten war < 1).

Zur Beendigung der Reaktion wurde das jeweilige Reaktionsgemisch auf 20°C abgekühlt und mit wäßriger 20 gew.-%iger Zitronensäure auf pH 7 neutralisiert.

Die Isolierung/Aufkonzentrierung der chemisch modifi zierten Proteasen erfolgte nach an sich für die Isolierung von Enzymen bekannten Methoden, wie Ionenaustauschchroma tographie.

Hierbei wurden je nach den eingestellten Bedingungen wasserlösliche, chemisch modifizierte Enzymderivate mit mittelstarkem bis starkem Modifizierungsgrad erhalten.

Für die anwendungstechnischen Versuche wurden die an ionisch modifizierten Enzyme in Form einer mit 40 Gew.-% Propandiol stabilisierten Lösung verwendet.

Beispiel 5

Analog zu Beispiel 4 wurden alkalische Proteasen aus Bacillus licheniformis in unterschiedlicher, Form - Pro pandiol-haltiges Verdampferkonzentrat zur Herstellung der alkalischen Protease (P1), reguläre Produktlösung der alkalischen Protease (P2) bzw. Konzentrat der alkalischen Protease mit einer Aktivität von 750.000 DU/g - mit Natrium-3-Chloro-2-hydroxypropylsulfonat unter den folgend angegebenen Reaktionsbedingungen umgesetzt. Hierbei wurden je nach den eingestellten Reaktionsbedingungen chemisch modifizierte Enzymderivate mit mittlerem bis starkem Modi fizierungsgrad erhalten.

Die erhaltenen modifizierten Proteasen dieses Bei spiels weisen Aktivitäten von über 90% der Ausgangsakti vität (Aktivität der eingesetzten Protease) auf.

Beispiel 6

Analog zu Beispiel 4 wurde eine Bacillus subtilis-Protease mit Natrium-3-Chloro-2-hydroxyproylsulfonat unter folgen den Bedingungen umgesetzt.

Enzym: 38 g Protease-Pulver
Propandiol: 220 g
Wasser: 180 g
Aktivität: 71.000 DU/g (nach Verdünnung der Pro tease mit Propandiol und Wasser gemäß den vorstehenden Angaben)
Reagenz: 8 g
pH-Wert: 11
Temperatur: 30°C
Reaktionszeit: 4 h

Der Reaktionsverlauf wurde mittels Kationenaustauschchro matographie (Ultropak TSK-2-CM, pH = 5,2) verfolgt. Der Abbruch der Reaktion erfolgte wie im Beispiel 4 angegeben durch Abkühlung auf 20°C und Zugabe von 20 gew.-%iger Zitronensäure zur Einstellung des pH-Wertes auf 7.

Man erhielt wasserlösliche, anionisch modifizierte Proteasen mit mittlerem Modifizierungsgrad, deren Aktivi tät über 93% der Ausgangsaktivität (Aktivität der einge setzten Protease) lag.

Beispiel 7

Ein wäßriges Enzymkonzentrat aus hochalkalischer Protease aus Bacillus alcalophilus wurde unter intensivem Rühren und unter Zusatz einer stabilisierenden und lösungsver mittelnden Menge von Propandiol unter nachfolgenden Bedin gungen mit Decen-1-oxid (Firma Peroxid-Chemie) umgesetzt.

Proteasekonzentrat: 15 Gew.-%
Propandiol: 81 Gew.-%
Reagenz: 2 Gew.-% zu Beginn der Reaktion (0 h)
2 Gew.-% nach 3 h
pH-Wert: 11
Temperatur: 30°C

Der Reaktionsverlauf konnte durch Kationenaustausch chromatographie (Ultropak TSK-CM-2SW 250 × 4,6 mm) ver folgt werden. Die Reaktion wurde nach 22 h wie üblich durch Abkühlen und pH-Wert-Einstellung mittels 20 gew.-%iger Zitronensäure auf pH 7 gestoppt und das gebildete Produkt mit deutlichem Anteil an hydrophoben Proteasederivaten mit mittlerem Modifizierungsgrad durch Gelfiltration (G 25-Medium; PD 10-Säulen der Firma Pharmacia LKB GmbH, Freiburg) gereinigt und durch Umkehr- Chromatographie (reversed phase) wie folgt analysiert.

Säule: Waters Nova Pak C18 (150 × 4,6 mm; Firma Milli pore GmbH, Eschborn)
Solvent A: 0,1 gew.-%ige wäßrige Tri fluoressigsäure-Lösung
Solvent B: 0,1 gew.-%ige wäßrige Tri fluoressigsäure-Lösung/Ace tonitril im Volumenverhält nis 40/60
Gradient: von 5 bis 55 min., von 0% auf 100% Solvent B
Detektion: UV-Licht bei 280 nm

Beispiel 8

Analog zu Beispiel 2 wurde ein wäßriges Standardamylase konzentrat der folgenden Zusammensetzung

Enzym: Thermostabile α-Amylase aus Bacillus licheniformis
Protein (Biuret): 5 Gew.-%
Anorganische Salze: 3 Gew.-% (z. B. CaCl₂)
Dextrine: 5 Gew.-%
Wasser: 87 Gew.-%
Aktivität (MWU/g)*: 820.000

(*1 Modifizierte Wohlgemuth Einheit (MWU) ist die Enzymmenge, welche 1 mg lösliche Stärke in 30 Minuten zu einem Dextrin definierter Größe abbaut; 40°C; die Größe des gebildeten Dextrins wird durch die Farbe eines Dextrin-Jod-Komplexes angezeigt.)

mit Natronlauge auf einen pH 10 eingestellt und bei Umge bungstemperatur (20°C) mit einer solchen Menge einer 70 bis 71 gew.-%igen wäßrigen Lösung von 2,3-Epoxypropyl trimethylammoniumchlorid vermischt, die einer Menge von 5 Gew.-% Aktivsubstanz bezogen auf die eingesetzte Enzym menge entsprach. Das Gemisch wurde auf 26°C erwärmt und der Reaktionsverlauf analog zu Beispiel 1 durch Kationen austauschromatographie (Ultropak TSK-CM-2SW 250 × 4,6 mm; pH 5,2) verfolgt.

Die Reaktion konnte nach 1 Stunde durch Abkühlung auf 20°C und Zugabe von wäßriger 20 gew.-%iger Zitronen säure unter Einstellung eines pH-Wertes von 7 gestoppt werden. Das auf pH 7 korrigierte und mit Propandiol (Menge 50 Gew.-% bezogen auf die fertige Formulierung) stabili sierte, flüssige Endprodukt wurde direkt für weitere Ver suche verwendet.

Das Temperatur- und das pH-Aktivitätsprofil des Pro duktes unterschied sich bei Verwendung unlöslicher Sub strate (Phadebas = blaugefärbtes Stärkepolymer der Firma Pharmacia LKB GmbH, Freiburg) zur Aktivitätsbestimmung nur unwesentlich vom Temperatur- bzw. pH-Aktivitätsprofil der zugrundeliegenden, nichtmodifizierten α-Amylase; diese Ergebnisse zeigen, daß durch das milde chemische Modifi zierungsverfahren diese beiden wesentlichen und im zu grundeliegenden, nichtmodifizierten Enzym bereits hervor ragenden Charakteristika kaum beeinträchtigt worden sind.

Beispiel 9

Analog zum Beispiel 5 wurde ein wäßriges Enzymkonzentrat der thermostabilen α-Amylase aus Bacillus licheniformis unter Zusatz einer stabilisierenden Menge von 50 Gew.-% Propandiol zum Enzymkonzentrat (bezogen auf den Gesamt ansatz) und unter kontinuierlicher Zugabe von 10 gew.-%iger Natronlauge bei einem konstanten pH-Wert von 11 mit Natrium-3-Chloro-2-hydroxypropylsulfonat (2,5 Gew.-% Aktivsubstanz bezogen auf die eingesetzte Enzymmenge) bei 30°C umgesetzt. Nach 2 Stunden hatten 84% und nach 4 Stunden 97% der eingesetzten Amylase reagiert. Zum Ab bruch der Reaktion wurde auf 20°C abgekühlt und mit wäß riger 20 gew.-%iger Zitronensäure auf einen pH-Wert von 7 eingestellt. Das flüssige Produkt der anionisch modifi zierten Amylase wurde direkt für weitere Versuche verwen det.

Das pH-Aktivitätsprofil der wasserlöslichen, anio nisch modifizierten Amylase wurde im Vergleich zum pH-Ak tivitätsprofil der nativen Amylase durch das milde chemische Modifizierungsverfahren nicht beeinträchtigt bzw. es zeigt sogar einen leicht erhöhten Aktivitätsver lauf im pH-Bereich von 4 bis 5 (40°C, Substrat = lösliche Stärke, Aktivität in MWU). Bei höheren Temperaturen (70°C) weist das anionisch modifizierte Amylasederivat bei pH-Werten im Bereich von 5,2 bis 5,6 deutlich erhöhte Stabilität im Vergleich zur nativen Amylase auf.

Beispiel 10

Reine Glucoseisomerase wurde mit 2,3-Epoxypropyl-trime thylammoniumchlorid chemisch modifiziert. Hierzu wurden Glucoseisomerase-Kristalle in Propandiol/Wasser gelöst und mit dem Reagenz (70 bis 71 gew.-%ige wäßrige Lösung von 2,3-Epoxypropyl-trimethylammoniumchlorid) unter nachfol genden Bedingungen umgesetzt.

Enzym: 160 g (38,4 Gew.-%-Protein und 95 GIU/mg*)
Propandiol: 400 g
Wasser: 240 g
Reagenz: 5 Gew.-% bezogen auf Gesamtansatz
Temperatur: 25°C
Reaktionszeit: 6 h
pH-Wert: 10 bei 0 bis 5 h (1 N Natronlauge)
11 bei 5 bis 6 h

(*1 Glucoseisomerase Einheit (GIU) ist definiert als die Enzymmenge, die unter den folgenden Inkubations bedingungen 1 mg Fructose bildet; Inkubationsbedin gungen: 65°C, 1 h, Substrat aus 0,1 m Glucose in 0,05 m Phosphatpuffer, pH 8,0 mit 0,0004 m MgSO₄.)

Der Reaktionsverlauf konnte durch Anionenaustausch chromatographie (Ultropak DEAE-3-SW 150 × 4,6 mm, pH 5,8 = Säulenmaterial auf Diethylaminoethyl-Basis der Firma Pharmacia LKB GmbH, Freiburg; Starteluens 0,05 m NaH₂PO₄; Eluens 0,05 m NaH₂PO₄/0,8 m Natriumchlorid) ver folgt werden.

Zur Beendigung der Reaktion wurde auf einen pH-Wert von 7,0 eingestellt. Im Verlaufe der Reaktion wurde kein Aktivitätsverlust gegenüber der eingesetzten Aktivität des nichtmodifizierten Enzyms beobachtet. Dieses zeigt wiederum, daß das milde chemische Modifizierungsverfahren für die eingesetzten Glucoseisomerasen sehr gut verträg lich ist.

Beispiel 11

Analog zu Beispiel 10 wurde reine Glucoseisomerase mit Natrium-3-chloro-2-hydroxypropylsulfonat umgesetzt, wobei jedoch der pH-Wert konstant auf pH 11 gehalten wurde. Auch hier wurde kein Aktivitätsverlust für die chemisch modi fizierte Glucoseisomerase gegenüber der nativen Glucose isomerase beobachtet. Dieses zeigt, daß auch die milde anionische Modifizierung für die native Glucoseisomerase sehr gut verträglich ist. Das nach Abbruch der Reaktion auf pH 7 neutralisierte flüssige Endprodukt konnte direkt für weitere Versuche verwendet werden.

Beispiel 12

Zur Demonstration des Verhaltens der chemisch modifizier ten Enzyme im Waschprozeß wurde die Waschleistung durch Waschversuche an Testgeweben in Laborwaschmaschinen (Typ: Linitest) bestimmt. Hierzu wurde Testgewebe mit standar disierten Waschmittelformulierungen gewaschen, die die zu testenden chemisch modifizierten Enzyme (Enzymderivate) bzw. in Vergleichsversuchen die nativen Enzyme enthielten. Die Versuche wurden bei den angegebenen pH-Werten und mit Wasser von 15°dH im jeweils angegebenen Temperaturbereich von 15 bis 60°C ausgeführt. Die Waschleistung wurde durch Messung der Aufhellung von angeschmutzten Testgeweben als Remissionsdifferenz (Remission des trockenen Testgewebes nach dem Waschversuch abzüglich der Remission des Testge webes vor dem Waschversuch) ermittelt. Die größere Remissionsdifferenz gibt hierbei die bessere Waschleistung an. Die Durchführung der Waschversuche war wie folgt: Die enzymhaltige Waschmittellösung wirkte im rotierenden Probenbehälter auf das Testgewebe ein. Nach Beendigung des Waschvorganges wurde das Testgewebe zweimal mit Leitungs wasser gespült und nach Bügeln die Aufhellung des Gewebes über die Remissionsmessung erfaßt.

a) Bedingungen: 6 g/l Waschmittel, 15-60°C, 45 Minuten, 15°dH. Testgewebe: EMPA 116 = Baumwolle, verschmutzt mit Blut, Milch und Tusche.Waschmittel: Handelsübliches Europäisches Pulvervoll waschmittel I, enthaltend 25 Gew.-% Zeolith, 10 Gew.-% Natriumcarbonat, 6,5 Gew.-% lineare Alkylsulfonate, 4,5 Gew.-% Seife, 2 Gew.-% Carboxymethyl cellulose, 0,5 Gew.-% Phosphonate, 2,0 Gew.-% Magnesiumsilikat, 25 Gew.-% Natriumperborat, 1,5 Gew.-% Tetraacetyl ethylendiamin und Natriumsulfat ad 100 Gew.-%.

Die Ergebnisse dieses Waschversuches sind in der nachfolgenden Tabelle wiedergegeben.

b) Bedingungen: Europäisches handelsübliches Vollwasch mittel II, Eigen-PH-Wert, 15-60°C, 1 kDU/100 ml, 45 Minuten.

Testgewebe: EMPA 117 = Baumwolle/Polyester-Mischge webe, verschmutzt mit Blut, Milch und Tusche.

Es wurden die nachfolgenden Ergebnisse erhalten.

Dieses Beispiel zeigt die geringe Abhängigkeit der kationisch modifizierten Protease aus Beispiel 1 von der Waschmitteldosierung. Demgegenüber wirkt sich die Wasch mitteldosierung auf die native Protease wesentlich stärker aus.

c) Bedingungen: 6 g/l Waschmittel, pH = 11,5, 15°dH, 15-60°C, 45 Minuten. Testgewebe: EMPA 117 = Baumwolle/Polyester-Misch gewebe, verschmutzt mit Blut, Milch und Tusche.

Waschmittel: Zusammensetzung siehe unter a) dieses Beispiels.

Es wurden die nachfolgenden Ergebnisse erhalten.

Das in diesem Beispiel eingesetzte chemisch modifi zierte Proteasederivat zeigt hervorragende Waschwirksam keit bei sehr hohen Waschflotten-pH-Werten. Dieses chemisch modifizierte Enzymderivat eignet sich daher ins besondere für die gewerbliche Wäscherei. Durch dieses kat ionisch modifizierte Proteasederivat werden insbesondere Proteine wie Eiproteine sehr gut abgebaut.

d) Bedingungen: 2 g/l Flüssigvollwaschmittel, 30°C, 30 Minuten, 15°dH, 0,5 kDU/100ml. Testgewebe: ox. EMPA 117 = Baumwolle/Polyester- Mischgewebe, verschmutzt mit Blut, Milch und Tusche; das Mischgewebe wurde vor dem Waschvorgang mit Perborat (2 g/l) bei pH 10 ohne Waschmittelzusatz vorbehandelt und danach einem Intensiv-Spülgang unter worfen; man erhielt so Testgewebe mit gealterten Verschmutzungen, die wesentlich empfindlicher auf Aktivitätsunterschiede der Enzyme und Enzymderivate in der Wasch flotte reagieren.

Waschmittel: Europäisches Flüssigvollwaschmittel, ent haltend 10,5 Gew.-% lineare Alkylsulfo nate, 13 Gew.-% Natrium-Fettsäuresalz, 5 Gew.-% Alkylsulfat, 10,3 Gew.-% Fett alkoholethoxylat, 10 Gew.-% Triethanol amin; 47 Gew.-% flüchtige Anteile (Wasser, Propandiol).

Die Ergebnisse dieses Waschversuches sind in der nachfol genden Tabelle zusammengefaßt.

Dieses Beispiel zeigt deutlich die Verschiebung des pH-Optimums um ca. 0,5-1 pH-Einheit für das chemisch, anionisch modifizierte Proteasederivat im Vergleich zur nativen Protease. Die anionische Modifizierung führt darüber hinaus zu einer stark verbesserten Trubstabilität in Flüssigvollwaschmittelformulierungen.

Beispiel 13

Analog zur allgemeinen Arbeitsweise des Beispiels 12 wur den die anionisch modifizierten Enzymderivate auf ihre Stabilität gegenüber einzelnen Flüssigwaschmittelbestand teilen und gegenüber einer vollständigen Flüssigwaschmit telformulierung sowie auf ihre Lagerstabilität getestet.

a) Die Stabilität der anionisch modifizierten Enzymderi vate gegenüber verschiedenen üblichen Bestandteilen von Flüssigwaschmitteln, wie lineare Alkylsulfonate (LAS), Seifen, Paraffinsulfonaten und Fettsäureethoxysulfaten (FAES), wurde unter folgenden Bedingungen bestimmt:
2,5 g/l des jeweiligen Flüssigwaschmittelbestandteiles, 40°C, Enzymderivat-Konzentration 4 kDU/ml, Zusatz von 100 ppm Calcium. Die hier gewählten Konzentrationen entsprechen in etwa denjenigen, wie sie in der Wasch flotte vorliegen. Die anionisch modifizierten Enzym derivate zeigen hierbei im Vergleich zu den nativen Enzymen deutlich höhere Stabilitäten in Gegenwart der Flüssigwaschmittelbestandteile. Während es z. B. bei den nativen Proteasen zu einem rapiden Aktivitätsabfall in Gegenwart von anionischen Tensiden kommt, zeigen die mittelstark anionisch modifizierte Protease aus Bei spiel 4b bzw. die stark anionisch modifizierte Protease aus Beispiel 4c erheblich bessere Stabilitäten gegen über üblichen anionischen Tensiden. Anionisch modifi zierte Enzymderivate eignen sich aufgrund ihrer höheren Stabilität gegenüber Flüssigwaschmittelbestandteilen somit sehr gut für den Einsatz in solchen Flüssigwasch mitteln. Die Ergebnisse der Stabilitätsuntersuchungen sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt.
b) Die Stabilität anionisch modifizierter Enzymderivate gegenüber den Inhaltsstoffen einer üblichen, vollstän digen Flüssigwaschmittelformulierung mit folgender analytischer Zusammensetzung
Alkylbenzolsulfonat-Natrium 4,5 Gew.-%
Fettsäure/-salz: 35,3 Gew.-%
Fettalkoholethoxylat: 9 Gew.-%
Triethanolamin: 11,5 Gew.-%
Wasser: 31 Gew.-%
(flüchtige Anteile insgesamt 38 Gew.-%; Alkohole, Wasser)
wurde unter folgenden Bedingungen getestet: 6 g/l Flüssigwaschmittelformulierung, pH = 9,5, 40°C, Enzym konzentration 4 kDU/ml, 100 ppm Calcium-Gehalt. Die er haltenen Ergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengestellt.

Dieses Beispiel zeigt deutlich die höhere Stabilität der chemisch modifizierten Proteasen in Flüssigwaschmit telformulierungen.

c) Die Lagerstabilität einiger anionisch modifizierter Enzymderivate in konzentrierten Flüssigwaschmittelfor mulierungen wurden unter nachfolgenden Bedingungen ge testet.

Flüssigwaschmittelformulierung mit einem Gehalt an:

- 10 Gew.-% lineare Alkylsulfonate
- 10 Gew.-% nichtionische Tenside
- 5 Gew.-% Ethanol
- 5 Gew.-% Propandiol
- 70 Gew.-% Wasser
- 100 ppm Calcium-Gehalt
- pH = 9,5
Lagertemperatur: 37°C

Es wurden die in der nachfolgenden Tabelle zusammenge stellten Ergebnisse erhalten.

Dieses Beispiel zeigt die gute Stabilität anionisch modifizierter Proteasen in konzentrierten Flüssigwasch mitteln definierter Zusammensetzung und mit hohen Wasser gehalten. Ähnlich gute Lagerstabilitäten waren auch mit der anionisch modifizierten Protease aus Beispiel 6 zu be obachten. Waschergebnisse mit den gelagerten Proben be stätigten die oben durch Aktivitätsmessungen gefundenen Unterschiede in den Lagerstabilitäten. Bei den nativen Enzymen war nach 50 Tagen Lagerung im Gegensatz zu den anionisch modifizierten Proteasen praktisch keine Wasch wirkung mehr vorhanden.

Claims

1. Verfahren zur gezielten Veränderung der Eigenschaften ei nes Enzyms durch chemische Modifizierung, dadurch gekennzeich net, daß man das Enzym durch Umsetzung mit einer endständigen Epoxid- oder Halogenhydrinverbindung, die einen die biochemi schen und anwendungstechnischen Eigenschaften gezielt verän dernden, kationischen, amphiphilen, anionischen und/oder lipo philen bzw. hydrophoben organischen Rest enthält, bei Tempera turen bis maximal 35°C in ein wasserlösliches bzw. nicht wasse runlösliches, chemisch modifiziertes Enzym (Enzymderivat) über führt.

2. Verfahren zur Herstellung wasserlöslicher bzw. nicht was serunlöslicher, chemisch modifizierter Enzyme (Enzymderivate), dadurch gekennzeichnet, daß man durch unter basischen Bedingun gen und bei Temperaturen bis maximal 35°C erfolgende Umsetzung wenigstens einer der nicht im Aktivitätszentrum befindlichen freien primären Aminogruppen eines Enzyms mit

a) Epoxiden der Formel I
worin
R für einen kationischen, amphiphilen, anionischen oder lipo philen bzw. hydrophoben organischen Rest steht,
oder mit
b) Halogenhydrinen der Formel II
worin
X für Halogen, vorzugsweise Chlor oder Brom, steht und R die obige Bedeutung besitzt,
das Enzym in ein wasserlösliches bzw. nicht wasserunlösliches, chemisch modifiziertes Enzym (Enzymderivat) überführt, worin eine oder mehrere der genannten freien Aminogruppen des Enzyms mit einem Rest der Formel A
worin R die obige Bedeutung besitzt,

substituiert sind.

3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß wäßrige Enzymkonzentrate mit 10 bis 35 Gew.-% Trockensubstanz gehalt eingesetzt werden.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 3, dadurch ge kennzeichnet, daß die Umsetzung in Gegenwart von Enzymstabili satoren und/oder Lösungsvermittlern, vorzugsweise in Gegenwart von Propandiol, durchgeführt wird.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 4, dadurch ge kennzeichnet, daß die Umsetzung bei pH-Werten von 9 bis 11 durchgeführt wird.

6. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 5, dadurch ge kennzeichnet, daß die Umsetzung bei Temperaturen bis maximal 30°C durchgeführt wird.

7. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch ge kennzeichnet, daß Epoxide der Formel I oder Halogenhydrine der Formel II eingesetzt werden, in denen R für einen kationischen organischen Rest der Formel -(CH₂)_n-N⁺R¹R²R³ steht, worin R¹, R² und/oder R³ für einen Niedrigalkylrest mit 1 bis 2 C-Atomen, vorzugsweise für Methyl, stehen und n eine ganze Zahl von 1 bis 3 bedeutet.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch ge kennzeichnet, daß Epoxide der Formel I oder Halogenhydrine der Formel II eingesetzt werden, in denen R für einen amphiphilen organischen Rest der Formel -(CH₂)_n-N⁺R¹R²R⁴ steht, wobei R¹ und/oder R² für einen Niedrigalkylrest mit 1 bis 2 C-Atomen, vorzugsweise für Methyl, stehen, R⁴ für einen geradkettigen C₁₀- bis C₁₈-Alkylrest steht und n eine ganze Zahl von 1 bis 3 be deutet.

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch ge kennzeichnet, daß Epoxide der Formel I oder Halogenhydrine der Formel II eingesetzt werden, in denen R für einen anionischen organischen Rest der Formel -(CH₂)_n-SO₃⁻ steht, worin n eine ganze Zahl von 1 bis 3 bedeutet.

10. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 6, dadurch ge kennzeichnet, daß Epoxide der Formel I oder Halogenhydrine der Formel II eingesetzt werden, in denen R für einen organischen Rest der Formel -(CH₂)_n-CH₂, steht, worin n eine ganze Zahl von 1 bis 17 bedeutet.

11. Verfahren nach einem der Ansprüche 2 bis 10, dadurch ge kennzeichnet, daß als Enzyme Proteasen, Amylasen, Glucoseisome rasen oder Lipasen eingesetzt werden.

12. Wasserlösliche bzw. nicht wasserunlösliche, chemisch modifizierte Enzyme (Enzymderivate) erhältlich nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11.