DE69735767T2

DE69735767T2 - Cellulasevarianten

Info

Publication number: DE69735767T2
Application number: DE69735767T
Authority: DE
Inventors: Vilbour Kim ANDERSEN; Martin Schülein; Lars Christiansen; Bo Damgaard; Claus Von Der Osten
Original assignee: Novozymes AS
Current assignee: Novozymes AS
Priority date: 1996-09-17
Filing date: 1997-09-17
Publication date: 2007-04-05
Anticipated expiration: 2017-09-18
Also published as: JP3532576B2; US20110250674A1; CN100362100C; EP0937138A1; US20120289450A1; JP2004065255A; ATE324437T1; US20030092097A1; CN101085985B; AU4200797A; BR9711479A; WO1998012307A1; EP0937138B1; DE69735767D1; CA2265914A1; US20080206836A1; US20090170747A1; BR9711479B1; CN101085985A; US20050009166A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft Cellulase-Varianten, d. h. endo-β-1,4-Glucanase-Varianten, die durch Substitution von einer Eltern-Cellulase, d. h. endo-β-1,4-Glucanase, abgeleitet sind, wobei die Varianten veränderte Aniontensidempfindlichkeit aufweisen.
TECHNISCHER HINTERGRUND
Cellulasen oder cellulolytische Enzyme sind Enzyme, die an den Hydrolysen von Cellulose beteiligt sind. Bei der Hydrolyse von nativer Cellulose sind bekanntlich drei Haupttypen von beteiligten Cellulase-Enzymen zugegen, nämlich Cellobiohydrolase (1,4-β-D-Glucancellobiohydrolase, EC 3.2.1.91), endo-β-1,4-Glucanase (endo-1,4-β-D-Glucan-4-glucanohydrolase, EC 3.2.1.4) und β-Glucosidase (EC 3.2.1.21).
Insbesondere die endo-β-1,4-Glucanasen (EC Nr. 3.2.1.4) stellen eine interessante Gruppe von Hydrolasen für die erwähnten industriellen Anwendungen dar. Endoglucanasen katalysieren die endo-Hydrolyse von 1,4-β-D-glycosidischen Verknüpfungen in Cellulose, Cellulosederivaten (wie Carboxymethylcellulose und Hydroxyethylcellulose), Lichenin, β-1,4-Bindungen in β-1,3-Glucan-Gemischen, wie die β-D-Glucane in Getreide oder die Xyloglucane, und in anderen Pflanzenmaterialien, die cellulosische Teile enthalten. Der offizielle Name lautet endo-1,4-β-D-Glucan-4-Glucanohydrolase, allerdings wird bei der vorliegenden Beschreibung der abgekürzte Begriff Endoglucanase verwendet. Verwiesen werden kann auf T.-M. Enveri, "Microbial Cellulases" in W. M. Fogarty, Microbial Enzymes and Biotechnology, Applied Science Publishers, S. 183–224 (1983); Methods in Enzymology, (1988) Bd. 160, S. 200–391 (herausgegeben von Wood, W. A. und Kellogg, S. T.); Béguin, P., "Molecular Biology of Cellulose Degradation", Annu. Rev. Microbiol. (1990), Bd. 44, Ss. 219–248; Béguin, P. und Aubert, J.-P., "The biological degradation of cellulose", FEMS Microbiology Reviews 13 (1994) S. 25–58; Henrissat, B., "Cellulases and their interaction with cellulose", Cellulose (1994), Bd. 1, Ss. 169–196.
Cellulasen werden von einer großen Anzahl von Mikroorganismen, die Fungi, Actinomyceten, Myxobakterien und echte Bakterien umfassen, aber auch von Pflanzen synthetisiert. Insbesondere wurden Endoglucanasen mit einer breiten Vielzahl von Spezifitäten identifiziert.
Eine sehr wichtige industrielle Anwendung von cellulytischen Enzymen ist die Verwendung zur Behandlung von cellulosischem Textilgewebe oder cellulosischem Textilstoff, z.B. als Bestandteile in Waschmittelzusammensetzungen oder Wäsche-Weichspülerzusammensetzungen, zur biologischen Glättung von neuem Textilstoff (Kleiderappretur) und zum Erhalt eines "stone-washed" Aussehens von Cellulose-enthaltendem Textilstoff, insbesondere Denim, und es wurden bereits mehrere Verfahren für eine solche Behandlung vorgeschlagen, z.B. in GB-A-1 368 599, EP-A-0 307 564 und EP-A-0 435 876, WO 91/17243, WO 91/10732, WO 91/17244, PCT/DK95/000108 und PCT/DK95/00132. Eine weitere wichtige industrielle Anwendung von cellulolytischen Enzymen ist die Verwendung zur Behandlung von Papierpulpe, z.B. zur Verbesserung des Abtropfens oder zum Deinking von Recycelingpapier.
Es ist auch bekannt, dass Cellulasen eine Cellulose-Bindungsdomäne (CBD) aufweisen können oder nicht. Die CBD verstärkt das Binden des Enzyms an eine Cellulose-enthaltende Faser und erhöht die Wirksamkeit des katalytisch aktiven Teils des Enzyms.
Fungi und Bakterien produzieren ein Spektrum von cellulolytischen Enzymen (Cellulasen), die, auf der Grundlage von Sequenzähnlichkeiten (hydrophobe Clusteranalyse), in verschiedene Familien von Glycosylhydrolasen klassifiziert werden können [Henrissat B & Bairoch A; Biochem J. 1993 293 781–788]. Die derzeit bekannten Cellulasen gehören den Familien 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 26, 44, 45, 48, 60 und 61 der Glycosylhydrolasen an.
endo-β-1,4-Glucanasen mit großtechnisch guten Leistungen sind in WO 91/17243, WO 91/17244 und WO 91/10732 beschrieben, und spezielle Cellulase-Varianten sind in WO 94/07998 beschrieben.
Eine Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung neuer Varianten von cellulolytischen Enzymen, wobei die Varianten im Vergleich zu dem Elternenzym eine verbesserte Leistung zeigen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
In einem cellulolytischen Enzym, das bei industriellen Verfahren geeignet ist, d. h. eine endo-1,4-Glucanase, wurde eine Anzahl von Aminosäurerest-Positionen, die für die Eigenschaften des Enzyms und daher für dessen Leistung bei diesen Verfahren wichtig sind, identifiziert.
Demnach stellt ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung ein Verfahren zum Erreichen der Aniontensidempfindlichkeit eines cellulolytischen Enzyms durch Aminosäure-Substitution bereit, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

a) Entwerfen eines multiplen Alignments von mindestens zwei Aminosäuresequenzen, von denen bekannt ist, dass sie dreidimensionale Strukturen aufweisen, die der aus dem Protein-Datenbankeintrag 4ENG bekannten Endoglucanase V (EGV) aus Humicola insolens entsprechen;
b) Entwerfen einer homolog aufgebauten dreidimensionalen Struktur für das cellulolytische Enzym auf der Grundlage der Struktur der EGV;
c) Identifizieren der Aminosäurerest-Positionen, die in einem Abstand von dem Substrat-Bindungsspalt von nicht mehr als 5 Å vorhanden sind;
d) Identifizieren der Oberflächen-exponierten Aminosäurereste des Enzyms;
e) Identifizieren sämtlicher geladener oder potentiell geladener Aminosäurerest-Positionen des Enzyms;
f) Wählen von einer oder mehreren Positionen, an denen der Aminosäurerest substituiert werden soll;
g) Durchführen der Substitution unter Anwendung herkömmlicher proteintechnischer Verfahren.

Unter Anwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens ist es nun möglich, erwünschte Eigenschaften durch an sich bekannte proteintechnische Verfahren wirksam von einer Cellulase auf eine andere zu übertragen.
Insbesondere stellt die Erfindung Cellulase-Varianten bereit, die bezüglich einer veränderten (erhöht oder erniedrigt) katalytischen Aktivität verbessert; und/oder veränderten Empfindlichkeit gegenüber anionischen Tensiden verändert (erhöht oder erniedrigt) sind.
Demnach stellt die Erfindung bei einem weiteren Aspekt eine Cellulase-Variante bereit, die durch Substitution von einer Eltern-Cellulase an einer oder mehreren der folgenden Positionen 42, 64, 76, 91, 93, 141, 152, 154, 161, 191 und 192 (Cellulase-Nummerierung) abgeleitet ist.
AUSFÜHRLICHE OFFENBARUNG DER ERFINDUNG
Cellulase-Varianten
Die vorliegende Erfindung stellt neue Cellulase-Varianten bereit, die durch Substitution von einer Eltern-Cellulase abgeleitet sind. Eine erfindungsgemäße Cellulase-Variante ist eine Cellulase-Variante oder eine mutierte Cellulase mit einer in der Natur nicht vorkommenden Aminosäuresequenz. Die erfindungsgemäßen Cellulase-Varianten zeigen verbesserte Leistung, insbesondere bezüglich einer veränderten Empfindlichkeit gegenüber anionischen Tensiden.
Formal kann die erfindungsgemäße Cellulase-Variante oder mutierte Cellulase als funktionelles Derivat einer Eltern-Cellulase (d. h. des nativen oder Wildtyp-Enzyms) betrachtet werden, und sie kann durch Veränderung einer DNA-Nucleotidsequenz des Eltern-Gens oder seiner Derivate, die das Eltern-Enzym codieren, erhalten werden. Die Cellulase-Variante oder mutierte Cellulase kann exprimiert und produziert werden, wenn die DNA-Nucleotidsequenz, die die Cellulase-Variante codiert, in einen geeigneten Vektor in einem geeigneten Wirtsmechanismus inseriert wird. Der Wirtsmechanismus ist nicht notwendigerweise mit dem Organismus identisch, aus dem das Eltern-Gen stammt.
In der Literatur werden Enzymvarianten auch als Mutanten oder Muteine bezeichnet.
Aminosäuren
Im Zusammenhang mit der Erfindung werden die folgenden Symbole und Abkürzungen für Aminosäuren und Aminosäurereste verwendet.

A: = Ala = Alanin
C: = Cys = Cystein
D: = Asp = Aspartansäure
E: = Glu = Glutaminsäure
F: = Phe = Phenylalanin
G: = Gly = Glycin
H: = His = Histidin
I: = Ile = Isoleucin
K: = Lys = Lysin
L: = Leu = Leucin
M: = Met = Methionin
N: = Asn = Asparagin
P: = Pro = Prolin
Q: = Gln = Glutamin
R: = Arg = Arginin
S: = Ser = Serin
T: = Thr = Threonin
V: = Val = Valin
W: = Trp = Tryptophan
Y: = Tyr = Tyrosin
B: = Asx = Asp oder Asn
Z: = Glx = Glu oder Gln
X: = Xaa = beliebige Aminosäure
*: = Deletion oder fehlende Aminosäure

Cellulase-Nummerierung
Im Zusammenhang mit der Erfindung wird für die Aminosäurerest-Position in cellulolytischen Enzymen eine spezielle Nummerierung eingesetzt. Durch Untereinanderschreiben der Aminosäuresequenzen bekannter Cellulasen, wie in Tabelle 1 gezeigt, ist es möglich, jedem Aminosäurerest in einem cellulolytischen Enzym eine Aminosäurepositionsnummer unzweideutig zuzuordnen, wenn seine Aminosäuresequenz bekannt ist.
In Tabelle 1 nachstehend sind 11 ausgewählte Aminosäuresequenzen von Cellulasen verschiedenen mikrobiellen Ursprungs aufgereiht. Diese sind (a) Humicola insolens; (b) Acremonium sp.; (c) Volutella collectotrichoides; (d) Sordaria fimicola; (e) Thielavia terrestris; (f) Fusarium oxysporum; (g) Myceliophthora thermophila; (h) Crinipellis scabella; (i) Macrophomina phaseolina; (j) Pseudomonas fluorescens; (k) Ustilage maydis. Die Cellulasen (a–i) sind in WO 96/29379 beschrieben. (j) ist in GeneBank unter der Zugangsnummer G45498 beschrieben, und (k) ist in GenBank unter der Zugangsnummer 581598 und in Biol. Chem. Hoppe-Seyler 1995 376 (10) 617–625 beschrieben.
Unter Anwendung des Nummerierungssystems, das von der Aminosäuresequenz der Cellulase (endo-β-1,4-Glucanase) abgeleitet ist, die aus dem Stamm Humicola insolens DSM 1800 erhalten wurde, der in WO 91/17243 offenbart ist, deren Sequenz in der ersten Spalte von Tabelle 1 gezeigt und mit der Aminosäuresequenz einer Anzahl von anderen Cellulasen aufgereiht ist, ist es möglich, die Position eines Aminosäurerests in einem cellulolytischen Enzym eindeutig anzugeben.
Beim Beschreiben der verschiedenen erfindungsgemäß hergestellten oder betrachteten Cellulase-Varianten werden zur leichten Bezugnahme die folgenden Nomenklaturen übernommen:
[ursprüngliche Aminosäure; Position; substituierte Aminosäure]
Demnach wird die Substitution von Glutamin durch Histidin in Position 119 als Q119H bezeichnet.
Aminosäurereste, die Insertionen in Relation zu der Aminosäuresequenz der Cellulase aus Humicola insolens darstellen, werden durch Hinzufügen von Buchstaben in alphabetischer Reihenfolge zu der vorangestellten Cellulase-Nummer nummeriert, wie z.B. Position *21aV für das "inserierte" Valin (V), wo kein Aminosäurerest vorhanden ist, zwischen Lysin in Position 21 und Alanin in Position 22 der Aminosäuresequenz der Cellulase aus Humicola insolens, cv Tabelle 1.
Die Deletion eines Prolins (P) an Position 49 in der Aminosäuresequenz der Cellulase aus Humicola insolens wird mit P49* angegeben.
Mehrfach-Mutationen werden durch Querstriche getrennt ("/"), z.B. Q119H/Q146R, und stellen die Mutationen in den Positionen 119 und 146 dar, wobei Glutamin (Q mit Histidin (H) bzw. Glutamin (Q)-Säure mit Arginin (R) ersetzt ist.
Erfolgt eine Substitution durch Mutation in z.B. einer Cellulase, die aus einem Stamm von Humicola insolens stammt, wird das Produkt z.B. als "Humicola insolens/*49P" bezeichnet.
Sämtliche in dieser Anmeldung durch die Cellulase-Nummerierung bezeichneten Positionen beziehen sich auf die vorstehend beschriebenen Cellulasenummern und sind relativ zu der Aminosäuresequenz der von Humicola insolens stammenden Cellulase bestimmt, cf. Tabelle 1(a). Tabelle 1 Aminosäuresequenz-Alignment Cellulase-Nummerierung ausgewählter Cellulasen verschiedenen mikrobiellen Ursprungs (a) Humicola insolens; (b) Acremonium sp.; (c) Volutella collectotrichoides; (d) Sordaria fimicola; (e) Thielavia terrestris; (f) Fusarium oxysporum; (g) Myceliophthora thermophila; (h) Crinipellis scabella; (i) Macrophomina phaseolina; (j) Pseudomonas fluorescens; (k) Ustilago maydis

* Aminosäurerest fehlt in dieser Position

Die erfindungsgemäßen Enzym(endo-β-1,4-Glucanase)-Varianten
Die vorliegende Erfindung betrifft Cellulase-Varianten. Insbesondere stellt die vorliegenden Erfindung eine Cellulase-Variante bereit, die durch Substitution an einer oder mehreren der folgenden Positionen: 42, 64, 76, 91, 93, 141, 152, 154, 161, 191 und 192 von einer Eltern-Cellulase abgeleitet ist.
Die erfindungsgemäße Endoglucanase kann eine Cellulose-Bindungsdomäne (CBD), die als integraler Teil des Enzyms existiert, umfassen, oder in die Endoglucanase kann eine CBD anderen Ursprungs eingebaut und somit ein Enzymhybrid erzeugt werden. In diesem Zusammenhang soll der Begriff "Cellulose-Bindungsdomäne" so verstanden werden, wie von Peter Tomme et al. "Cellulose-Binding Domains: Classification and Properties" in "Enzymatic Degradation of Insoluble Carbohydrates", John N. Saddler und Michael H. Panner (Hrsg.), ACS Symposium Series, Nr. 618, 1996 definiert. Diese Definition klassifiziert mehr als 20 Cellulose-Bindungsdomänen in 10 Familien (I–X) und zeigt, dass die CBDs in verschiedenen Enzymen vorkommen, wie Cellulasen, Xylanasen, Mannanasen, Arabinofuranosidasen, Acetylesterasen und Chitinasen. Die CBDs wurden auch in Algen, z.B. in der Rotalge Porphyra purpurea, als nicht hydrolytisches Polysaccharid-Bindungsprotein festgestellt. Siehe Tomme et al., op. cit. Allerdings stammen die meisten CBDs aus Cellulasen und Xylanasen, und die CBDs werden am N- und C-Terminus der Proteine festgestellt oder sind intern. Die Enzymhybride sind aus der Technik bekannt, siehe z.B. WO 90/00609 und WO 95/16782, und können hergestellt werden durch Transformation in eine Wirtszelle eines DNA-Konstrukts, das mindestens ein DNA-Fragment umfasst, das die Cellulose-bindende Domäne codiert, die, mit oder ohne Linker, an eine DNA-Sequenz ligiert ist, die die Endoglucanase codiert, und Züchten der Wirtszelle unter Expression des Fusionsgens.
Enhymhybride können durch die folgende Formel beschrieben werden:
CBD-MR-X oder X-MR-CBD
wobei CBD die N- oder die C-terminale Region einer Aminosäuresequenz ist, die mindestens der Cellulose-Bindungsdomäne entspricht; MR die mittlere Region (der Linker) ist und eine Bindung oder eine kurze Verknüpfungsgruppe, vorzugsweise von etwa 2 bis etwa 100 Kohlenstoffatomen, stärker bevorzugt von 2 bis 40 Kohlenstoffatomen sein kann; oder es sind vorzugsweise etwa 2 bis etwa 100 Aminosäuren, stärker bevorzugt 2 bis 40 Aminosäuren; und X eine N- oder C-terminale Region des erfindungsgemäßen Enzyms ist.
Das erfindungsgemäße Verfahren
Nach einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zum Erhalt der Aniontensidempfindlichkeit eines cellulolytischen Enzyms durch Aminosäuresubstitution, wobei das Verfahren die Schritte umfasst:

a) Entwerfen eines multiplen Alignments von mindestens zwei Aminosäuresequenzen, von denen bekannt ist, dass sie dreidimensionale Strukturen aufweisen, die der aus dem Protein-Datenbankeintrag 4ENG bekannten Endoglucanase V (EGV) aus Humicola insolens entsprechen;
b) Entwerfen einer homolog aufgebauten dreidimensionalen Struktur für das cellulolytische Enzym auf der Grundlage der Struktur der EGV;
c) Identifizieren der Aminosäurerest-Positionen, die in einem Abstand von dem Substrat-Bindungsspalt von nicht mehr als 5 Å vorhanden sind;
d) Identifizieren der Oberflächen-exponierten Aminosäureresten des Enzyms;
e) Identifizieren von sämtlichen geladenen oder potentiell geladenen Aminosäurerest-Positionen des Enzyms;
f) Wählen von einer oder mehreren Positionen, an denen der Aminosäurerest substituiert werden soll;
g) Durchführen der Substitution unter Verwendung herkömmlicher proteintechnischer Verfahren.

Schritt f) des Verfahrens wird vorzugsweise durch Auswählen von Positionen durchgeführt, die als Ergebnis des Alignments von Schritt a) den gleichen Aminosäurerest in einer Mehrheit der aufgereihten Sequenzen tragen; stärker bevorzugt in mindestens 63% der aufgereihten Sequenzen; noch stärker bevorzugt in Positionen, die in den aufgereihten Sequenzen verschiedener Aminosäurereste tragen, cf. nachstehend.
Bei wieder einer anderen bevorzugten Ausführungsform kann die Stabilität der Cellulase in Gegenwart eines anionischen Tensids oder einer anionischen Detergentzusammensetzung geändert werden, vorzugsweise durch die Durchführung einer Substitution an Oberflächen-exponierten Aminosäurerest-Positionen des Enzyms, wodurch die elektrostatische Umgebung entweder lokal oder global geändert wird. Es ist bevorzugt, eine Substitution durchzuführen, an der ein geladener oder potentiell geladener Rest beteiligt ist, wobei dieser Rest entweder der ursprüngliche Rest oder der ausgetauschte Rest ist. In dem vorliegenden Zusammenhang sollen geladene oder potentiell geladene Reste folgendes umfassen: Arg, Lys, His, Cys (falls nicht Teil einer Disulfid-Brücke), Tyr, Glu, Asp. Mutationen in Richtung eines stärker negativ geladenen Aminosäurerestes ergeben eine verbesserte Stabilität der Cellulase in Gegenwart eines anionischen Tensids, wohingegen Mutationen in Richtung eines stärker positiv geladenen Aminosäurerestes die Stabilität der Cellulase gegenüber anionischen Tensiden herabsetzt.
Außerdem liegen Cellulase-Varianten, die eine beliebige Kombination von zwei oder mehreren der hier offenbarten Aminosäuresubstitutionen umfassen, ebenfalls im Umfang der Erfindung, z.B. die beispielhaften Varianten.
Multiples Sequenz-Alignment der Cellulasen
Das multiple Sequenz-Alignment wird unter Anwendung des Pileup-Algorithmus, wie in Wisconsin Sequence Analysis, Package version 8.1-UNIX (GCG, Genetics Computer Group, Inc.), implementiert, durchgeführt. Das angewandte Verfahren entspricht dem von Higgens und Sharp beschriebenen Verfahren (CARBIOS 1989 151–153). Angewandt werden eine Gap Creation Penalty von 3,0 und eine Gap Extension Penalty von 0,1 in Verbindung mit einer Scoring-Matrix, wie beschrieben in Nucl. Acids Res. 1986 14 (16) 6745–6763 (Dayhoff table (Schwartz, R. M. und Dayhoff, M. O.; Atlas of Protein Sequence and Structure (Dayhoff, M. O. Hrsg.); National Biomedical Research Foundation, Washington D. C. 1979 353–358), reskaliert durch Division jedes Wertes durch die Summe seiner Zeile und Spalte und normiert auf einen Mittelwert von 0 und Standardabweichung von 0,1. Der Wert für Fγ beträgt (Phe- Tyr) = RW = 1,425. Perfekte Übereinstimmungen werden auf 1,5 eingestellt, und keine Übereinstimmungen in jeder Reihe sind besser als perfekte Übereinstimmungen.
Paarweises Sequenz-Alignment von Cellulasen
Ein paarweises Sequenz-Alignment wird unter Verwendung des von Needleman & Wunsch (J. Mol. Biol. 1970 48 443–453) beschriebenen Verfahrens, wie in der GAP-Routine in der Wisconsin Sequence Analysis Package (GCG) implementiert, durchgeführt. Die für die GAP-Routine eingesetzten Parameter sind die gleichen wie die für die Pileup-Routine, vorstehend, erwähnten.
Paarweises Sequenz-Alignment von Cellulasen mit erzwungener Paarung
Ein paarweises Sequenz-Alignment mit erzwungener Paarung von Resten wird unter Anwendung des von Needleman & Wunsch (J. Mol. Biol. 1970 48 443–453) beschriebenen Algorithmus durchgeführt, wie in der GAP-Routine der Wisconsin Sequence Analysis Package (GCG) implementiert. Die für die GAP-Routine verwendeten Parameter sind die gleichen wie die für die Pileup-Routine, vorstehend, erwähnten, wobei die Scoring-Matrix modifiziert wird, um einen Rest, der X genannt wird, einzubauen, der das Symbol für den zu paarenden Rest ist. Der Diagonalwert für X, gepaart mit X, wird auf 9,0 eingestellt und alle von der Diagonalen abweichenden Werte, die X umfassen, werden auf 0 eingestellt.
Komplex zwischen Humicola insolens-Endoglucanase und Celloheptaose
Auf der Grundlage der Röntgenstruktur der Kerndomäne der inaktiven Humicola insolens-EGV-Endoglucanase-Variante (D10N) im Komplex mit Cellohexaose (Davies et al., Biochemistry 1995 34 16210–12220, PDB-Eintrag unter 4ENG) wird ein Modell der Struktur der nativen Humicola insolens-EGV-Endoglucanase-Kerndomäne im Komplex mit Celloheptaose unter Verwendung der folgenden Schritte konstruiert:

1. Verwenden des Biopolymer-Moduls von Insight II 95.0 (Insight II 95.0 User Guide, October 1995. San Diego: Biosym/MSI, 1995), Ersatz von N10 mit Asparaginsäure.
2. Herstellen einer Kopie der Zuckereinheit-Besetzungssubstelle –3 durch Kopieren des gesamten Moleküls und Deletion der Extra-Atome, manuelle Bewegung der neuen Zuckereinheit, um am besten an die unbesetzte Bindungsstelle –1 zu passen. Erzeugung der Bindungen unter Bindung der neuen Zuckereinheit an die beiden existierenden Cellotriose-Einheiten.
3. Deletieren von überlappenden Kristallwassermolekülen. Diese werden unter Anwendung des Befehls Subset Interface By_Atom 2.5 identifiziert.
4. Aufbauen von Wasserstoffen bei einem pH von 8,0 und Anbringen geladener Enden.
5. Protonieren von D121 unter Anwendung des Befehls Residue Replace <D121 residue name> ASP L.
6. Anwenden des CVFF-Kraftfeld-Templats durch den Befehl Potentials Fix.
7. Fixieren sämtlicher Atome mit Ausnahme der neuen Zuckereinheit.
8. Entspannen der atomaren Position der neuen Zuckereinheit unter Verwendung von 300 Zyklen einfacher Energieminimierung und anschließend von 5000 Schritten von lfs simple molecular dynamics und abschließend mit 300 Zyklen einfacher Energieminimierung, alles unter Verwendung des Programms molecular mechanics Discover 95.0/3.0.1 (Discover 95.0/3.0.0 User Guide, October 1995. San Diego: Biosym/MSI, 1995).

Homologe Konstruktion der Cellulasen
Die Konstruktion eines Strukturmodells für eine Cellulase mit bekannter Aminosäuresequenz auf der Grundlage einer bekannten Röntgenstruktur der Humicola insolens-EGV-Cellulase besteht aus den folgenden Schritten:

1. Definieren des ungefähren Ausmaßes der Kernregion der zu modellierenden Struktur und des Alignments des Cysteins auf der Grundlage des multiplen Sequenz-Alignments zwischen vielen bekannten industriell einsetzbaren Cellulase-Sequenzen.
2. Paarweises Sequenz-Alignment zwischen der neuen Sequenz und der Sequenz mit der bekannten Röntgenstruktur.
3. Definieren von strukturell konservierten Regionen (SCRs) auf der Grundlage des Sequenz-Alignment.
4. Zuordnen von Koordinaten für die Modellstruktur innerhalb der SCRs.
5. Herausfinden von Strukturen für die Schleifen oder variablen Regionen (VRs) zwischen den SCRs durch eine Suche in einer Schleifenstruktur-Datenbank.
6. Zuordnen von Koordinaten für die VRs in der Modellstruktur aus dem Datenbank-Suchergebnis.
7. Erzeugen von Disulfid-Bindungen und Einstellen des Protonierungszustands.
8. Verfeinern der konstruierten Struktur unter Verwendung von molecular mechanics.

Die bekannte Röntgenstruktur der Humicola insolens-EGV-Cellulase wird im Folgenden als Referenzstruktur bezeichnet. Die zu modellierende Struktur wird als Modellstruktur bezeichnet.
Zu 1: Das ungefähre Ausmaß des Kernteils des Enzyms wird durch ein multiples Sequenz-Alignment einschließlich vieler bekannter Cellulase-Sequenzen bestimmt. Da die Referenzstruktur nur die atomaren Koordinaten für den Kernteil des Enzyms enthält, können nur die Reste in der zu modellierenden Sequenz, die sich an den Kernteil der Referenzstruktur einreihen, in der Modell-Konstruktion eingeschlossen sein. Dieses Alignment bestimmt auch das Alignment des Cysteins. Das multiple Sequenz-Alignment wird unter Verwendung des Pileup-Algorithmus durchgeführt, wie vorstehend beschrieben.
Zu 2: Ein paarweises Sequenz-Alignment wird wie vorstehend beschrieben durchgeführt. Falls sich das Cystein in den konservierten Disulfid-Brücken und/oder den Resten der aktiven Stellen (D10 und D121) nicht einreiht, wird eine paarweises Sequenz-Alignment unter Anwendung einer erzwungenen Paarung der Cysteine in den konservierten Disulfid-Brücken und/oder den Resten der aktiven Stellen, wie zuvor beschrieben, durchgeführt. Der Hauptzweck des Sequenz-Alignments besteht darin, die SCRs zu definieren, die zur Modellstruktur-Generierung verwendet werden sollen (siehe unten).
Zu 3: Auf der Grundlage des Sequenz-Alignments werden strukturell konservierte Regionen (SCRs) als kontinuierliche Regionen von überlappender Sequenz ohne Insertionen oder Deletionen definiert.
Zu 4: Unter Verwendung des Computerprogramms Homology 95.0 (Homology User Guide, October 1995. San Diego: Biosym/MSI, 1995) können die atomaren Koordinaten in der Modellstruktur aus den atomaren Koordinaten der Referenzstruktur unter Verwendung des Befehls AssignCoords Sequences generiert werden.
Zu 5: Unter Anwendung des Computerprogramms Homology 95.0 werden mögliche Konformationen für die restlichen Regionen, die variable Regionen (VRs) genannt werden, durch eine Suche in der Schleifenstruktur-Datenbank, einschließlich in Homology 95.0, gefunden. Diese Vorgehensweise wird für jede VR durchgeführt.
Zu 6: Wenn die VR-Länge geringer ist als 6 Reste wird die erste Schleifenstruktur aus dem Datenbank-Suchergebnis zur Koordinaten-Generierung gewählt. In den Fällen, wobei längere Schleifen generiert werden, wird die erste Lösung in der Liste, die keine starke atomare Überlappung aufweist, gewählt. Der Grad der atomaren Überlappung kann unter Verwendung des Befehls Bump Monitor Add Intra in dem Computerprogramm Insight II 95.0 (Insight II 95.0 User Guide, October 1995. San Diego: Biosym/MSI, 1995) analysiert werden. Ein Parameter von 0,25 für den Befehl Bump gibt eine starke Überlappung an. Falls mehr als 10 Bumps zwischen der inserierten Schleifenregion und dem restlichen Teil des Proteins existieren, wird die nächste Lösung getestet. Wenn keine Lösung mit diesen Parametern gefunden wird, wird die Lösung mit den wenigsten Bumps verwendet. Die Koordinaten für die VR-Regionen werden unter Verwendung des Befehls AssignCoords Loops in dem Programm Homology 95.0 generiert.
Zu 7: Die Disulfid-Bindungen werden unter Verwendung des Befehls Bond Create in dem Biopolymer-Modul von Insight II 95.0 erzeugt, und der Protonierungszustand wird so eingestellt, dass er pH 8,0 entspricht, mit geladenen Kappungen unter Verwendung des Befehls Hydrogens. Schließlich wird der aktive Protonendonor (der Rest, der D121 in der Referenzstruktur entspricht) unter Verwendung des Rest-Austauschbefehls <D121 residue name> ASP L protoniert. Zur Terminierung der Daten des Modells wird das entsprechende Kraftfeld-Templat unter Anwendung des CVFF-Kraftfelds durch den Befehl Potentials Fix angewandt.
Zu 8: Schließlich werden mit der modellierten Struktur 500 Zyklen der Energieminimierung unter Anwendung des Programms molecular mechanics Discover 95.0/3.0.1 (Discover 95.0/3.0.0 User Guide, October 1995. San Diego: Biosym/MSI, 1995) durchgeführt. Die Ausgabe aus dem oben beschriebenen Verfahren sind atomare Koordinaten, die ein Strukturmodell für die Kerndomäne einer neuen Cellulase auf der Basis einer Sequenzhomologie mit der Humicola insolens-EGV-Cellulase beschreiben.
Superpositionierung von Cellulasestrukturen
Zur Überlagerung von zwei Cellulasestrukturen wird eine Superpositionierung der Strukturen unter Verwendung des Befehls Structure Alignment von Homology 95.0 (Homology User Guide, October 1995. San Diego: Biosym/MSI, 1995) durchgeführt. Sämtliche Parameter für den Befehl sind als Standardwerte gewählt.
Bestimmung der Reste innerhalb von 3 Å und 5 Å von dem Substrat
Zur Bestimmung der Aminosäurereste innerhalb eines festgelegten Abstands von dem Substrat wird eine gegebenen Cellulasestruktur mit dem Cellulaseteil der Modellstruktur des Komplexes zwischen Humicola insolens-EGV-Endoglucanase und -Celloheptaose, wie vorstehend beschrieben, superpositioniert. Die Reste innerhalb eines festgelegten Abstands von dem Substrat werden sodann unter Verwendung des Befehls Interface Subset6 von Insight II 95.0 (Insight II 95.0 User Guide, October 1995. San Diego: Biosym/MSI, 1995) ermittelt. Der festgelegte Abstand wird als Parameter in das Programm eingespeist.
Die Ergebnisse dieser Bestimmung sind in den Tabellen 2 und 3 nachstehend gezeigt.
Bestimmung der Oberflächen-Zugänglichkeit
Zur Bestimmung der Lösungsmittel-Zugänglichkeit wurde der Befehl Access Surf in Homology 95.0 (Homology User Guide, October 1995; San Diego: Biosym/MSI, 1995) verwendet. Das Programm verwendet die Definition, die von Lee und Richards (Lee, B. & Richards, F. M. "The interpretation of protein structures: Estimation of static accessibility", J. Mol. Biol. 1971 55 379–400) vorgeschlagen wurde. Ein Lösungsmittel-Sondierradius von 1,4 Å wurde verwendet, und nur schwere Atome, d. h. Nichtwasserstoffatome, wurden in die Berechnung einbezogen. Die Reste mit der Zugänglichkeit von 0 werden als beerdigt definiert, sämtliche anderen Reste werden als Lösungsmittel exponiert und auf der Oberfläche der Enzymstruktur definiert.
Übertragungsniveau von spezifischer Aktivität zwischen Cellulasen
Um das Niveau von katalytischer Aktivität zwischen zwei Cellulasen zu übertragen, wird das folgende Protokoll unter Anwendung der vorstehend beschriebenen Verfahren angewandt. Dieses Verfahren legt die Aminosäurereste exakt fest, die für den Unterschied in der spezifischen Aktivität verantwortlich sind, und einer oder mehrere dieser Aminosäurereste muss in einer Sequenz ersetzt werden, um das spezifische Aktivitätsniveau aus der Vergleichscellulase zu übertragen:

1) Durchführung eines multiplen Sequenz-Alignments von allen bekannten industriell geeigneten Cellulasen (ausschließlich der Trichoderma reesei-Cellulasen). Hieraus Identifizierung konservierter Disulfid-Brücken in den beiden betroffenen Sequenzen, die Sequenz der Humicola insolens-EGV-Cellulase wird identifiziert, und die Reste aktiver Stellen (D10 und D121) werden angeordnet;
2) Durchführen eines paarweisen Sequenz-Alignments von jeder Sequenz mit der Humicola insolens-EGV-Cellulase-Kerndomäne (Reste 1–210). Wenn sich die Cysteine in den konservierten Disulfid-Brücken nicht an den gleichen Positionen einreihen und/oder wenn sich die beiden Reste aktiver Stellen (D10 und D121) nicht an den gleichen Positionen einreihen, erfolgt die Anwendung des paarweisen Sequenz-Alignments der Cellulasen mit dem Verfahren der erzwungenen Paarung. Einbezogen werden nur Reste in den Sequenzen, die mit der Kerndomäne (Reste 1–201) der Humicola insolens-EGV-Cellulase überlappen.
3) Erzeugung einer konstruierten Homologiestruktur von jeder Sequenz.
4) Bestimmung der Reste innerhalb von 3 Å von dem Substrat jeweils in den konstruierten Homololgiestrukturen. Die Unterschiede zwischen den Sequenzen in diesen Positionen sind sehr wahrscheinlich für den Unterschied in der spezifischen Aktivität verantwortlich. In dem Falle, wobei Reste in den Inserts in einer der Sequenzen innerhalb des oben erwähnten Abstands festgestellt werden, kann das vollständige Insert für den Unterschied in der spezifischen Aktivität verantwortlich sein, und das komplette Insert muss auf die Sequenz ohne das Insert übertragen werden, oder das komplette Insert muss in der Sequenz mit dem Insert deletiert werden.
5) Wurde nicht die gesamte spezifische Aktivität durch Substitution von Resten innerhalb 3 Å von des Substrats wiederhergestellt, ergibt die Bestimmung von Resten innerhalb von 5 Å von dem Substrat in jeder der homolog konstruierten Strukturen die wahrscheinlichsten Reste, die für den verbleibenden Unterschied in der spezifischen Aktivität verantwortlich sind. In dem Fall, wobei die Reste in den Inserts in jeder der Sequen zen innerhalb des oben erwähnten Abstandes festgestellt werden, kann das vollständige Insert für den Unterschied in der spezifischen Aktivität verantwortlich sein, und das vollständige Insert muss auf die Sequenz ohne das Insert übertragen werden, oder das vollständige Insert muss in der Sequenz mit den Insert deletiert werden.

Übertragung des Stabilitätsniveaus gegenüber anionischen Tensiden zwischen Cellulasen
Um das Stabilitätsniveau gegenüber anionischen Tensiden zwischen 2 Cellulasen zu übertragen, wird das folgende Protokoll unter Anwendung der vorstehend beschriebenen Verfahren angewandt. Dieses Verfahren legt genau die Aminosäurereste fest, die für den Unterschied im Stabilitätsniveau gegenüber anionischen Tensiden verantwortlich sind, und eine oder mehrere dieser Aminosäurereste muss in 1 Sequenz ersetzt werden, um das spezifische Aktivitätsniveau aus der Vergleichscellulase zu übertragen:

1) Durchführen eines multiplen Sequenz-Alignments von sämtlichen bekannten industriell geeigneten Cellulasen (ausschließlich Trichoderma reesei-Cellulasen). Hieraus Identifizierung der konservierten Disulfid-Brücken in den beiden betroffenen Sequenzen, und die Sequenz der Humicola insolens-EGV-Cellulase wird identifiziert und die Reste mit aktiven Stellen (D10 und D121) werden angeordnet;
2) Durchführen eines paarweisen Sequenz-Alignments von jeder Sequenz mit der Humicola insolens-EGV-Cellulase-Kerndomäne (Reste 1 bis 210). Wenn sich die Cysteine in den konservierten Disulfid-Brücken nicht an den gleichen Positionen einreihen und/oder wenn sich die beiden Reste mit aktiven Stellen (D10 und D121) nicht an den gleichen Positionen einreihen, wird das paarweise Sequenz-Alignment von Cellulasen mit dem Verfahren der erzwungenen Paarung angewandt. Einbezogen werden nur Reste in den Sequenzen, die mit der Kerndomäne (Reste 1 bis 201) der Humicola insolens-EGV-Cellulase überlappen.
3) Erzeugung einer konstruierten Homologiestruktur von jeder Sequenz;
4) Bestimmung der Reste, die an der Oberfläche des Enzyms angeordnet sind. Dies erfolgt durch Berechnung der Oberflächen-Zugänglichkeit. Reste mit einer Oberflächen-Zugänglichkeit von größer als 0,0 Å² sind an der Oberfläche exponiert.
5) Jeder an der Oberfläche exponierte Rest, der der folgenden Gruppe von Aminosäuren angehört: D, E, H, K, R und C, sofern er nicht an einer Disulfid-Brücke beteiligt ist, die sich zwischen den beiden Sequenzen unterscheidet, ist mit sehr wahrscheinlich für den Unterschied im Stabilitätsniveau gegenüber anionischen Tensiden verantwortlich. In dem Fall, wobei Reste in den Inserts in jeder der Sequenzen innerhalb der oben erwähnten Gruppe von Aminosäuretypen gefunden werden, kann das vollständige Insert für den Unterschied im Stabilitätsniveau gegenüber anionischen Tensiden verantwortlich sein, und das vollständige Insert muss auf die Sequenz ohne das Insert übertragen werden, oder das vollständige Insert muss in der Sequenz mit dem Insert deletiert werden.

Bindungsspalt-Substitutionen
Bei einem weiteren Aspekt stellt diese Erfindung eine Cellulase-Variante bereit, die von einer Eltern-Cellulase durch Substitution an einem oder mehreren Aminosäureresten, die in dem Substrat-Bindungsspalt angeordnet sind, abgeleitet ist. Mutationen, die an Substrat-nahen Positionen eingebracht werden, beeinflussen die interaktiven Enzym-Substrat-Bindungen.
Ein geeigneter Weg zur Bestimmung der Reste, die mit einem potentiellen Substrat in einer Struktur wechselwirken, besteht in der Aufteilung der Struktur in "Schalen". Die Schalen sind folgendermaßen definiert: Die erste Schale sind die Reste, die direkt mit dem Substrat wechselwirken, d. h. der engste interatomare Abstand zwischen Substrat und Rest, die beide Wasserstoffatome einschließen, ist kleiner als 2,5 Å, was jede direkte Wechselwirkung über Wasserstoffbrückenbindungen und andere nicht gebundene Wechselwirkungen einschließt. Die nachfolgenden (2., 3., etc.) Schalen sind gleichermaßen als Reste mit interatomaren Abständen von kleiner als 2,5 Å zu dem Substrat oder zu allen zuvor bestimmten Schalen definiert. Auf diese Weise wird das Substrat in Schalen aufgeteilt. Die Routine "Subset zone" im Programm Insight II 95.0 (Insight II 95.0 User Guide, October 1995. San Diego: Biosym/MSI, 1995) kann zur Bestimmung der Schalen angewandt werden.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist der erfindungsgemäß betrachtete Aminosäurerest in dem Substrat-Bindungsspalt in einem Abstand von bis zu 5 Å von dem Substrat angeordnet.
Wenn die aufgereihten Cellulasen dem vorstehend offenbarten Computermodellverfahren unterzogen werden, werden als Ergebnis die folgenden Positionen innerhalb eines Abstands von bis zu 5 Å von dem Substrat angegeben: 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18, 19, 20, 21, 21a, 42, 44, 45, 47, 48, 49, 49a, 49b, 74, 82, 95j, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 116, 119, 121, 123, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 132a, 133, 145, 146, 148, 149, 150b, 178 und/oder 179 (Cellulase-Nummerierung), cf. Tabelle 2.
Demnach stellt bei einer spezielleren Ausführungsform die Erfindung eine Cellulase-Variante bereit, die von einer Eltern-Cellulase durch Substitution an einem oder mehreren dieser Säurereste abgeleitet wurde. Bei einer bestimmten Ausführungsform ist die Cellulase-Variante von einer der in Tabelle 2 identifizierten Cellulasen ((a) Humicola insolens; (b) Acremonium sp.; (c) Volutella collectotrichoides; (d) Sordaria fimicola; (e) Thielavia terrestris; (f) Fusarium oxysporum; (g) Myceliophthora thermophila; (h) Crinipellis scabella; (i) Macrophomina phaseolina; (j) Pseudomonas fluorescens; (k) Ustilago maydis) durch Substitution an einer oder mehreren der in Tabelle 2 für diese Cellulasen identifizierten Positionen abgeleitet.
Tabelle 2
Aminosäurereste mit weniger als 5 Å von dem Substrat
Die Positionen sind durch die Cellulase-Nummerierung benannt:
(a) Humicola insolens; (b) Acremonium sp.; (c) Volutella collectotrichoides; (d) Sordaria fimicola; (e) Thielavia terrestris; (f) Fusarium oxysporum; (g) Myceliophthora thermophila; (h) Crinipellis scabella; (i) Macrophomina phaseolina; (j) Pseudomonas fluorescens; (k) Ustilago maydis
Bei einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist der erfindungsgemäße betrachtete Aminosäurerest in dem Substrat-Bindungsspalt in einem Abstand von bis zu 3 Å von dem Substrat angeordnet.
Bei der Durchführung des vorstehend offenbarten Computermodellverfahrens mit den aufgereihten Cellulasen ergeben sich die folgenden Positionen in einem Abstand von bis zu 3 Å von dem Substrat: 6, 7, 8, 10, 12, 13, 14, 15, 18, 20, 21, 45, 48, 74, 110, 111, 112, 113, 114, 115, 119, 121, 127, 128, 129, 130, 131, 132, 132a, 146, 147, 148, 150b, 178, und/oder 179 (Cellulase-Nummerierung), cf. Tabelle 3.
Bei einer spezielleren Ausführungsform stellt die Erfindung demnach eine Cellulase-Variante bereit, die von einer Eltern-Cellulase durch Substitution an einer oder mehreren von diesen Resten abgeleitet wurde. Bei einer bestimmten Ausführungsform ist die Cellulase-Variante von einer der in Tabelle 3 benannten Cellulasen ((a) Humicola insolens; (b) Acremonium sp.; (c) Volutella collectotrichoides; (d) Sordaria fimicola; (e) Thielavia terrestris; (f) Fusarium oxysporum; (g) Myceliophthora thermophila; (h) Crinipellis scabella; (i) Macrophomina phaseolina; (j) Pseudomonas fluorescens; (k) Ustilago maydis) durch Substitution an einer oder mehreren der in Tabelle 3 für diese Cellulasen benannten Positionen abgeleitet.
Tabelle 3
Aminosäurereste mit weniger als 3 Å von dem Substrat
Die Positionen sind durch die Cellulase-Nummerierung benannte:
((a) Humicola insolens; (b) Acremonium sp.; (c) Volutella collectotrichoides; (d) Sordaria fimicola; (e) Thielavia terrestris; (f) Fusarium oxysporum; (g) Myceliophthora thermophila; (h) Crinipellis scabella; (i) Macrophomina phaseolina; (j) Pseudomonas fluorescens; (k) Ustilago maydis)
Teilweise konservierte Aminosäurereste
Wie hier definiert, ist ein "teilweise konservierter Aminosäurerest" ein nach Tabelle 1 benannter Aminosäurerest in einer Position, an welcher Position zwischen 7 bis 10 Aminosäurereste der 11 für diese Position in Tabelle 1 angegebenen Reste (d. h. mehr als 63%) identisch sind.
Demnach stellt die Erfindung weiterhin eine Cellulase-Variante bereit, in welcher Variante ein Aminosäurerest in einen konservierten Aminosäurerest an einer oder mehreren Positionen nach Tabelle 1 geändert wurde, wobei in der (den) Position(en) zwischen 7 und 10 Aminosäurereste der 11 in Tabelle 1 benannten Reste identisch sind.
Bei einer bevorzugten Ausführungsform stellt die Beschreibung eine Cellulase-Variante bereit, die aus einer Eltern-Cellulase durch Substitution an einer oder mehreren der folgenden Positionen: 13, 14, 15, 20, 21, 22, 24, 28, 32, 34, 45, 48, 50, 53, 54, 62, 63, 64, 65, 66, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 75, 79, 85, 88, 90, 92, 93, 95, 96, 97, 98, 99, 104, 106, 110, 111, 113, 115, 116, 118, 119, 131, 134, 138, 140, 146, 152, 153, 163, 166, 169, 170, 171, 172, 173, 174, 174, 177, 178, 179, 180, 193, 196, und/oder 197 (Cellulase-Nummerierung) abgeleitet wurde.
Bei einer spezielleren Ausführungsform stellt die Beschreibung eine Cellulase-Variante bereit, mit der Substitutionen durchgeführt wurden, so dass sie in den in Tabelle 4, nachstehend, benannten Positionen einen oder mehrere der Aminosäurereste umfasst. Die Positionen in Tabelle 4 geben die "teilweise konservierten Aminosäurerest-Positionen" sowie die nicht konservierten Positionen wieder, die im Bindungsspalt innerhalb von 5 Å von dem Substrat vorhanden sind, die faktisch alle in den in Tabelle 1 aufgereihten Sequenzen vorhanden sind.
Tabelle 4
Ausgewählte Substitutionen, Insertionen und/oder Deletionen
Die Positionen sind durch die Cellulase-Nummerierung benannt
Bei einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform stellt die Beschreibung eine von einer Eltern-Cellulase durch Substitution an einer oder mehreren Aminosäureresten, wie in den Tabellen 5–6 nachstehend angegeben, abgeleitete Cellulase-Variante bereit. Die Cellulase-Variante kann von jeder Eltern-Cellulase abgeleitet werden, die den an der angegebenen Position bestimmten Aminosäurerest hält. Insbesondere kann die Eltern-Cellulase eine Humicola insolens-Cellulase; eine Acremonium sp.-Cellulase; eine Volutella collectotrichoides-Cellulase; eine Sordaria fimicola-Cellulase; eine Thielavia terrestris-Cellulase; eine Fusarium oxysporum-Cellulase; eine Myceliophthora thermophila-Cellulase; eine Crinipellis scabella-Cellulase; eine Macrophomina phaseolina-Cellulase; eine Pseudomonas fluorescens-Cellulase; oder eine Ustilago maydis-Cellulase sein.
Ferner kann die Cellulase-Variante dadurch gekennzeichnet sein, dass sie eine verbesserte Leistung aufweist, insbesondere bezüglich

1. verbesserter Leistung, die als erhöhte katalytische Aktivität definiert ist;
2. geänderter Aniontensidempfindlichkeit; und/oder
3. geändertem pH-Optimum;

Tabelle 5
Bevorzugte Cellulase-Varianten
Die Positionen sind durch die Cellulase-Nummerierung benannt
Tabelle 6
Bevorzugte Cellulase-Varianten
Die Positionen sind durch die Cellulase-Nummerierung benannt
Geänderte Empfindlichkeit gegenüber
Geänderte Empfindlichkeit gegenüber anionischen Tensiden
Wie vorstehend erwähnt, sind anionische Tenside Produkte, die häufig in Detergentzusammensetzungen eingearbeitet werden. Manchmal sind cellulolytische Enzyme mit erhöhter Stabilität gegenüber anionischen Tensiden erwünscht, und manchmal sind cellulolytische Enzyme mit erhöhter Empfindlichkeit bevorzugt. Bei einem weiteren Aspekt stellt die Erfindung Cellulase-Varianten mit geänderter Anionentensidempfindlichkeit bereit.
Demnach ist eine Cellulase-Variante mit geänderter Anionentensidempfindlichkeit eine Cellulase-Variante, die von einer Eltern-Cellulase durch Substitution an einer oder mehreren der folgenden Positionen: 2, 4, 7, 8, 10, 13, 15, 19, 20, 21, 25, 26, 29, 32, 33, 34, 35, 37, 40, 42, 42a, 43, 44, 48, 53, 54, 55, 58, 59, 63, 64, 65, 66, 67, 70, 72, 76, 79, 80, 82, 84, 86, 88, 90, 91, 93, 95, 95d, 95h, 95j, 97, 100, 101, 102, 103, 113, 114, 117, 119, 121, 133, 136, 137, 138, 139, 140a, 141, 143a, 145, 146, 147, 150e, 150j, 151, 152, 153, 154, 155, 156, 157, 158, 159, 160c, 160e, 160k, 161, 162, 164, 165, 168, 170, 171, 172, 173, 175, 176, 178, 181, 183, 184, 185, 186, 188, 191, 192, 195, 196, 200, und/oder 201 (Cellulase-Nummerierung) abgeleitet wurde. Diese Positionen enthalten in mindestens einer der in Tabelle 1 aufgereihten Cellulase-Sequenzen einen geladenen oder potentiell geladenen Aminsosäurerest.
Bei einer bestimmten Ausführungsform ist die Cellulase-Variante von einer der in Tabelle 7 nachstehend benannten Cellulasen, ((a) Humicola insolens; (b) Acremonium sp.; (c) Volutella collectotrichoides; (d) Sordaria fimicola; (e) Thielavia terrestris; (f) Fusarium oxysporum; (g) Myceliophthora thermophila; (h) Crinipellis scabella; (i) Macrophomina phaseolina; (j) Pseudomonas fluorescens; (k) Ustilago maydis), durch Substitution, Insertion und/oder Deletion an einer oder mehreren der in Tabelle 7 für diese Cellulasen benannten Positionen abgeleitet.
Tabelle 7
Geänderte Empfindlichkeit gegenüber anionischen Tensiden
Die Positionen sind durch die Cellulase-Nummerierung benannt
(a) Humicola insolens; (b) Acremonium sp.; (c) Volutella collectotrichoides; (d) Sordaria fimicola; (e) Thielavia terrestris; (f) Fusarium oxysporum; (g) Myceliophthora thermophila; (h) Crinipellis scabella; (i) Macrophomina phaseolina; (j) Pseudomonas fluorescens; (k) Ustilago maydis
Enzymzusammensetzungen
Bei noch einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung eine Enzymzusammensetzung, die ein Enzym umfasst, das, wie vorstehend beschrieben, cellulolytische Aktivität aufweist.
Die erfindungsgemäße Enzymzusammensetzung kann zusätzlich zu der erfindungsgemäßen Cellulase einen oder mehrere andere Enzymtypen, beispielsweise Hemicellulase, wie Xylanase und Mannase, andere Cellulase-Komponenten, Chitinase, Lipase, Esterase, Pektinase, Cutinase, Phytase, Oxidoreductase, Peroxidase, Laccase, Oxidase, Pectinmethylesterase, Polygalacturonase, Protease oder Amylase umfassen.
Die Enzymzusammensetzung kann durch aus der Technik bekannte Verfahren hergestellt werden und kann in Form einer Flüssigkeit oder einer Trockenzubereitung vorliegen. Beispielsweise kann die Enzymzusammensetzung in Form eines Granulats oder eines Mikrogranulats vorliegen. Das in die Zusammensetzung einzuschließende Enzym kann nach aus der Technik bekannten Verfahren stabilisiert werden. Beispiele für bevorzugte Anwendungsmöglichkeiten der erfindungsgemäßen Enzymzusammensetzung sind nachstehend angegeben. Die Dosierung der erfindungsgemäßen Enzymzusammensetzung und die anderen Bedingungen, unter denen die Zusammensetzung eingesetzt wird, können auf der Grundlage von aus der Technik bekannten Verfahren bestimmt werden.
Die erfindungsgemäße Enzymzusammensetzung kann für mindestens einen der folgenden Zwecke geeignet sein.
Anwendungsmöglichkeiten
Während des Waschens und Tragens blutet in der Regel Farbstoff aus gefärbten Textilien oder Kleidung aus dem Stoff aus, der anschließend verwaschen und abgetragen aussieht. Die Entfernung von oberflächlichen Fasern aus dem Textilstoff stellt die Originalfarben und das Aussehen des Stoffs teilweise wieder her. Der Begriff "Farbklärung", wie hier verwendet, bedeutet die teilweise Wiederherstellung der ursprünglichen Farben des Textilstoffs oder der Kleidung während mehrerer Waschcyclen.
Der Begriff "Depilling" bezeichnet die Entfernung von Knötchen von der Stoffoberfläche.
Der Begriff "Einweichlauge" bezeichnet eine wässrige Flüssigkeit, in die die Wäsche eingetaucht werden kann, bevor sie einem herkömmlichen Waschvorgang unterzogen wird. Die Einweichlauge kann einen oder mehrere Bestandteile enthalten, die herkömmlicherweise bei einem Hand- oder Maschinenwaschvorgang verwendet werden.
Der Begriff "Waschlauge" bezeichnet eine wässrige Flüssigkeit, in der die Wäsche einem Waschvorgang, d. h. im Allgemeinen einer kombinierten chemischen und mechanischen Wirkung entweder manuell oder in einer Waschmaschine unterzogen wird. Herkömmlicherweise ist die Waschlauge eine wässrige Lösung einer Pulver- oder Flüssigwaschmittelzusammensetzung.
Der Begriff "Spüllauge" bezeichnet eine wässrige Flüssigkeit, in die die Wäsche eingetaucht und behandelt wird, herkömmlicherweise unmittelbar nachdem sie einen Waschvorgang durchlaufen hat, um die Wäsche auszuspülen, d. h. um die Waschmittellösung aus der Wäsche im Wesentlichen zu entfernen. Die Spüllauge kann eine Stoffkonditionier- oder Weichspülzusammensetzung enthalten.
Die Wäsche, mit der das erfindungsgemäße Verfahren durchgeführt wird, kann herkömmliche waschbare Wäsche sein. Vorzugsweise ist der Hauptteil der Wäsche vernähter oder unvernähter Textilstoff, einschließlich von Strickstoffen, Geweben, Denimstoffen, Garnstoffen und Handtuchstoffen, die aus Baumwolle, Baumwollgemischen oder natürlichen oder künstlichen Cellulosen (z.B. Cellulosen, die von Xylan-enthaltenden Cellulosefasern stammen, wie Holzpulpe) oder Mischungen davon hergestellt sind. Beispiele für Mischungen sind Mischungen von Baumwolle oder Rayon/Viskose mit einem oder mehreren Begleitmaterialien, wie Wolle, Synthesefasern (Polyamidfasern, Acrylfasern, Polyesterfasern, Polyvinylalkoholfasern, Polyvinylchloridfasern, Polyvinylidenchloridfasern, Polyurethanfasern, Polyharnstofffasern, Aramidfasern) und Cellulose-enthaltenden Fasern (z.B. Rayon/Viskose, Ramie, Flachs/Leinen, Jute, Celluloseacetatfasern, Lyocell).
DETERGENT-OFFENBARUNG UND -BEISPIELE
Tensidsysteme
Die erfindungsgemäßen Waschmittelzusammensetzungen umfassen ein Tensidsystem, wobei das Tensid aus nicht-ionischen und/oder anionischen und/oder kationischen und/oder ampholytischen und/oder zwitterionischen und/oder semipolaren Tensiden ausgewählt sein kann.
Das Tensid ist typischerweise in einer Konzentration von 0,1 bis 60 Gew.-% vorhanden.
Das Tensid ist vorzugsweise so formuliert, dass es mit den in der Zusammensetzung vorhandenen Enzymkomponenten kompatibel ist. In flüssigen Zusammensetzungen oder Gel-Zusammensetzungen ist das Tensid am stärksten bevorzugt so formuliert, dass es die Stabilität eines jeden Enzyms in diesen Zusammensetzungen beschleunigt oder zumindest nicht herabsetzt.
Bevorzugte erfindungsgemäß zu verwendende Systeme umfassen als Tensid eines oder mehrere der nichtionischen und/oder anionischen hier beschriebenen Tenside.
Polyethylen-, Polypropylen- und Polyeutylen-Oxid-Kondensate von Alkylphenolen sind zur Verwendung als nichtionisches Tensid der erfindungsgemäßen Tensidsysteme geeignet, wobei Polyethylenoxid-Kondensate bevorzugt sind. Diese Verbindungen umfassen die Kondensationsprodukte von Alkylphenolen mit einer Alkylgruppe, die etwa 6 bis etwa 14 Kohlenstoffatome, vorzugsweise etwa 8 bis etwa 14 Kohlenstoffatome entweder in einer geradkettigen oder verzweigten Konfiguration mit dem Alkylenoxid enthält. Bei einer bevorzugten Ausführungsform ist das Ethylenoxid in einer Menge entsprechend etwa 2 bis etwa 25 mol, stärker bevorzugt von etwa 3 bis etwa 15 mol Ethylenoxid pro mol Alkylphenol vorhanden. Im Handel erhältliche nichtionische Tenside dieses Typs umfassen Igepal^TM CO-630, das von der Fa. GAF Corporation auf dem Markt ist, und Triton^TM X-45, X-114, X-100 und X-102, die alle von der Fa. Rohm & Haas Company auf dem Markt werden. Diese Tenside werden im Allgemeinen als Alkylphenolalkoxylate (z.B. Alkylphenolethoxylate) bezeichnet.
Die Kondensationsprodukte von primären und sekundären aliphatischen Alkoholen mit etwa 1 bis etwa 25 Molen Ethylenoxid sind zur Verwendung als nichtionisches Tensid der erfindungsgemäßen nichtionischen Tensidsysteme geeignet. Die Alkylkette des aliphatischen Alkohols kann entweder geradkettig oder verzweigt, primär oder sekundär sein und enthält im Allgemeinen etwa 8 bis etwa 22 Kohlenstoffatome. Bevorzugt sind die Kondensationsprodukte von Alkoholen mit einer Alkylgruppe, die etwa 8 bis etwa 20 Kohlenstoffatome, stärker bevorzugt etwa 10 bis etwa 18 Kohlenstoffatome mit etwa 2 bis etwa 10 mol Ethylenoxid pro mol Alkohol enthält. Etwa 2 bis etwa 7 mol Ethylenoxid und besonders bevorzugt 2 bis 5 mol Ethylenoxid pro mol Alkohol sind in den Kondensationsprodukten vorhanden. Beispiele für im Handel erhältliche nichtionische Tenside dieses Typs umfassen Tergitol^TM 15-S-9 (Kondensationsprodukt von linearem C₁₁-C₁₅-Alkoholen mit 9 mol Ethylenoxid), Tergitol^TM 24-L-6 NMW (Kondensationsprodukt von primärem C₁₂-C₁₄-Alkohol mit 6 mol Ethylenoxid mit einer engen Molekulargewichtsverteilung), beide von der Fa. Union Carbide Corporation auf dem Markt; Neodol^TM 45-9 (das Kondensationsprodukt von linearem C₁₄-C₁₅-Alkohol mit 9 mol Ethylenoxid), Neodol^TM 23-3 (Kondensationsprodukt von linearem C₁₂-C₁₃-Alkohol mit 3,0 mol Ethylenoxid), Neodol^TM 45-7 (Kondensationsprodukt von linearem C₁₄-C₁₅-Alkohol mit 7 mol Ethylenoxid), Neodol^TM 45-5 (Kondensationsprodukt von linearem C₁₄-C₁₅- Alkohol mit 5 mol Ethylenoxid), auf dem Markt von der Fa. Shell Chemical Company auf dem Markt, Dyro^TM EOB (Kondensationsprodukt von C₁₃-C₁₅-Alkohol mit 9 mol Ethylenoxid), von der Fa. The Procter & Gamble Company auf dem Markt, und Genapol LA 050 (Kondensationsprodukt von C₁₂-C₁₄-Alkohol mit 5 mol Ethylenoxid), von der Fa. Hoechst auf dem Markt. Ein bevorzugter HLB-Bereich in diesen Produkten beträgt 8–11 und besonders bevorzugt 8–10.
Ebenfalls geeignet als nichtionisches Tensid der erfindungsgemäßen Tensidsysteme sind Alkylpolysaccharide, die in der US 4,565,647 offenbart sind, mit einer hydrophoben Gruppe, die etwa 6 bis etwa 30 Kohlenstoffatome, vorzugsweise etwa 10 bis etwa 16 Kohlenstoffatome enthält, und ein Polysaccharid, z.B. ein Polyglycosid mit einer hydrophilen Gruppe, die etwa 1,3 bis etwa 10, vorzugsweise etwa 1,3 bis etwa 3, besonders bevorzugt etwa 1,3 bis etwa 2,7 Saccharid-Einheiten enthält. Jedes reduzierende Saccharid, das 5 oder 6 Kohlenstoffatome enthält, kann verwendet werden, z.B. können Glucose, Galactose und Galactosyl-Gruppierungen die Glycosyl-Gruppierungen ersetzen (gegebenenfalls ist die hydrophobe Gruppe in 2-, 3-, 4-Position etc. verknüpft und ergibt somit eine Glucose oder Galactose, im Gegensatz zu einem Glucosid oder Galactosid). Die Intersaccharid-Bindungen können beispielsweise zwischen der 1-Position der zusätzlichen Saccharid-Einheiten und der 2-, 3-, 4- und/oder 6-Position an den vorhergehenden Saccharid-Einheiten vorhanden sein.
Die bevorzugten Alkylpolyglycoside besitzen die Formel R₂O(C_nH_2nO)_t(Glycosyl)_x wobei R₂ aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus Alkyl, Alkylphenyl, Hydroxyalkyl, Hydroxyalkylphenyl, und Gemischen davon, wobei die Alkylgruppen etwa 10 bis etwa 18, vorzugsweise etwa 12 bis etwa 14 Kohlenstoffatome enthalten; n 2 oder 3 ist, vorzugsweise 2 ist; t 0 bis etwa 10 ist, vorzugsweise 0; und x etwa 1,3 bis etwa 10, vorzugsweise etwa 1,3 bis etwa 3, besonders bevorzugt etwa 1,3 bis etwa 2,7 ist. Das Glycosyl ist vorzugsweise von Glucose abgeleitet. Zur Herstellung dieser Verbindungen wird zuerst Alkohol oder Alkylpolyethoxyalkohol gebildet und sodann mit Glucose oder einer Glucosequelle unter Bildung des Glucosids (Verknüpfung an der 1-Position) umgesetzt. Sodann können die zusätzlichen Glu cosyl-Einheiten mit ihrer 1-Position mit den vorhergehenden Glucosyl-Einheiten an der 2-, 3-, 4- und/oder 6-Position, vorzugsweise überwiegend mit der 2-Position, verknüpft werden.
Die Kondensationsprodukte von Ethylenoxid mit einer hydrophoben Base, die durch Kondensation von Propylenoxid mit Propylenglycol gebildet werden, sind ebenfalls zur Verwendung als zusätzliche nichtionische erfindungsgemäße Tensidsysteme geeignet. Der hydrophobe Teil dieser Verbindungen besitzt vorzugsweise ein Molekulargewicht von etwa 1500 bis etwa 1800 und zeigt Wasserunlöslichkeit. Die Addition von Polyoxyethylen-Gruppierungen an diesen hydrophoben Teil neigt zur Erhöhung der Wasserlöslichkeit des Moleküls als Ganzes, und der flüssige Charakter des Produkts wird bis zu dem Punkt beibehalten, wobei der Polyoxyethylengehalt etwa 50% des Gesamtgewichts des Kondensationsprodukts beträgt, was einer Kondensation mit bis zu etwa 40 mol Ethylenoxid entspricht. Beispiele für Verbindungen dieses Typs umfassen bestimmte der im Handel erhältlichen Pluronic^TM Tenside, die von der Firma BASF auf dem Markt sind.
Ebenfalls zur Verwendung als nichtionisches Tensid des erfindungsgemäßen nichtionischen Tensidsystems geeignet sind die Kondensationsprodukte von Ethylenoxid mit dem Produkt, das aus der Reaktion von Propylenoxid und Ethylendiamin hervorgeht. Die hydrophobe Gruppierung dieser Produkte besteht aus dem Reaktionsprodukt von Ethylendiamin und überschüssigem Propylenoxid und weist im Allgemeinen ein Molekulargewicht von etwa 2500 bis etwa 3000 auf. Diese hydrophobe Gruppierung wird mit Ethylenoxid in dem Maße kondensiert, dass das Kondensationsprodukt etwa 40 bis etwa 80 Gew.-% Polyoxyethylen enthält und ein Molekulargewicht von etwa 5000 bis etwa 11000 aufweist. Beispiele für diesen Typ von nichtionischem Tensid umfassen bestimmte der im Handel erhältlichen Tetronic^TM-Verbindungen, die von der Fa. BASF auf dem Markt werden.
Bevorzugt zur Verwendung als nichtionisches Tensid der erfindungsgemäßen Tensidsysteme sind Polyethylenoxid-Kondensate von Alkylphenolen, Kondensationsprodukte von primären und sekundären aliphatischen Alkoholen mit etwa 1 bis etwa 25 mol Ethylenoxid, Alkylpolysaccharide und Gemische davon. Besonders bevorzugt sind C₈-C₁₄-Alkylphenolethoxylate mit 3 bis 15 Ethoxygruppen und C₈-C₁₈-Alkoholethoxylate (vorzugsweise im Durchschnitt C10) mit 2 bis 10 Ethoxygruppen und Gemische davon.
Stark bevorzugte nichtionische Tenside sind Polyhydroxyfettsäureamid-Tenside der Formel
wobei R₁ H ist oder R₁ C_1-4-Kohlenwasserstoff 2-Hydroxyethyl, 2-Hydroxypropyl oder ein Gemisch davon ist, R₂ C₅-C₃₁-Kohlenwasserstoff ist und Z Polyhydroxykohlenwasserstoff mit einer linearen Kohlenwasserstoffkette mit mindestens 3 Hydroxylen ist, die direkt mit der Kette verknüpft sind, oder ein alkoxyliertes Derivat davon ist. Vorzugsweise ist R₁ Methyl, R₂ geradkettiges C₁₁-C₁₅-Alkyl oder C₁₆-C₁₈-Alkyl oder eine Alkenylkette, wie Kokosalkyl oder Gemische davon, und Z leitet sich durch eine reduktive Aminierungsreaktion von einem reduzierenden Zucker, wie Glucose, Fructose, Maltose oder Lactose, ab.
Stark bevorzugte anionische Tenside umfassen alkylalkoxylierte Sulfat-Tenside. Beispiele hierfür sind wasserlösliche Salze oder Säuren der Formel RO(A)mSO₃M, wobei R ein unsubstituiertes C₁₀-C₂₄-Alkyl oder eine Hydroxyalkylgruppe mit einer C₁₀-C₂₄-Alkylkomponente, vorzugsweise ein C₁₂-C₂₀-Alkyl oder Hydroxyalkyl, stärker bevorzugt C₁₂-C₁₈-Alkyl oder Hydroxyalkyl ist, A eine Ethoxy- oder Propoxyeinheit ist, m größer als 0 ist, typischerweise zwischen etwa 0,5 und etwa 8, stärker bevorzugt zwischen etwa 0,5 und etwa 3 liegt, und M H oder ein Kation ist, das beispielsweise ein Metallkation (z.B. Natrium, Kalium, Lithium, Calcium, Magnesium, etc.), Ammonium oder ein substituiertes Ammoniumkation sein kann. Ethoxylierte Alkylsulfate sowie propoxylierte Alkylsulfate werden hier betrachtet. Spezielle Beispiele für substituierte Ammoniumkationen umfassen Methyl-, Dimethyl-, Trimethylammoniumkationen und quaternäre Ammoniumkationen, wie Tetramethylammonium- und Dimethylpiperidiniumkationen und diejenigen, die von Alkylaminen abgeleitet sind, wie Ethylamin, Diethylamin, Triethylamin, Gemische davon und dergleichen. Beispielhafte Tenside sind C₁₂-C₁₈-Alkylpolyethoxylat(1.0)sulfat (C₁₂-C₁₈E(1.0)M), C₁₂-C₁₈-Alkylpolyethoxylat(2.25)sulfat (C₁₂-C₁₈(2.25)M), und C₁₂-C₁₈-Alkylpolyethoxylat(3.0)sulfat (C₁₂-C₁₈E(3.0)M), und C₁₂-C₁₈-Alkylpolyethoxylat(4.0)sulfat (C₁₂-C₁₈E(4.0)M), wobei M zweckmäßigerweise aus Natrium und Kalium ausgewählt ist.
Geeignete anionische Tenside, die zu verwenden sind, sind Alkylestersulfonat-Tenside, einschließlich linearer Ester von C₈-C₂₀-Carbonsäuren (d. h. Fettsäuren) die mit gasförmigem SO₃ nach "The Journal of the American Oil Chemists Society", 52 (1975), Ss. 323–329 sulfoniert werden. Geeignete Ausgangsmaterialien umfassen natürliche Fettsubstanzen, wie von Talg, Palmöl, etc. abgeleitet.
Das bevorzugte Alkylestersulfonat-Tensid, insbesondere für Anwendungen zum Wäschewaschen, umfasst Alkylestersulfonat-Tenside der Strukturformel
wobei R₃ ein C₈-C₂₀-Kohlenwasserstoff, vorzugsweise ein Alkyl oder eine Kombination davon ist, R₄ ein C₁-C₆-Kohlenwasserstoff, vorzugsweise ein Alkyl oder eine Kombination davon ist, und M ein Kation ist, das mit dem Alkylestersulfonat ein wasserlösliches Salz bildet. Geeignete salzbildenden Kationen umfassen Metalle, wie Natrium, Kalium und Lithium, und substituierte oder unsubstituierte Ammoniumkationen, wie Monoethanolamin, Diethanolamin, und Triethanolamin. Vorzugsweise ist R₃ C₁₀-C₁₆-Alkyl, und R₄ ist Methyl, Ethyl oder Isopropyl. Besonders bevorzugt sind die Methylestersulfonate, wobei R₃ C₁₀-C₁₆-Alkyl ist.
Weitere geeignete anionische Tenside umfassen die Alkylsulfat-Tenside, die wasserlösliche Salze oder Säuren der Formel ROSO₃M sind, wobei R vorzugsweise ein C₁₀-C₂₄-Kohlenwasserstoff, vorzugsweise ein Alkyl oder Hydroxyalkyl mit einer C₁₀-C₂₀-Alkylkomponente ist, stärker bevorzugt ein C₁₂-C₁₈-Alkyl oder Hydroxyalkyl ist und M H oder ein Kation, z.B. ein Alkalimetallkation (z.B. Natrium, Kalium, Lithium) oder Ammonium oder substituiertes Ammonium (z.B. Methyl-, Dimethyl- und Trimethylammoniumkationen und quaternäre Ammoniumkationen, wie Tetramethylammonium- und Dimethylpiperidiniumkationen und quaternäre Ammoniumkationen, die sich von Alkylaminen ableiten, wie Ethylamin, Diethylamin, Triethylamin, und Gemische davon und dergleichen) ist. Typischerweise sind C₁₂-C₁₆-Alkylketten für niedrigere Waschtemperaturen (z.B. unter etwa 50°C) bevorzugt, und C₁₆-C₁₈-Alkylketten sind für höhere Waschtemperaturen (z.B. über etwa 50°C) bevorzugt.
Weitere anionische Tenside, die für Waschzwecke geeignet sind, können ebenfalls in die erfindungsgemäßen Detergentzusammensetzung zum Wäschewaschen eingeschlossen sein. Diese können umfassen Salze (einschließlich beispielsweise Natrium, Kalium, Ammonium und substituierte Ammoniumsalze, wie Mono-, Di- und Triethanolaminsalze) von Seife, primäre oder sekundäre C₈-C₂₂-Alkansulfonate, C₈-C₂₄-Olefinsulfonate, sulfonierte Polycarbonsäuren, hergestellt durch Sulfonierung des pyrolysierten Produkts von Erdalkalimetallcitraten, z.B. wie in der britischen Patentbeschreibung Nr. 1,082179 beschrieben, C₈-C₂₄-Alkylpolyglycolethersulfate (enthaltend bis zu 10 mol Ethylenoxid); Alkylglycerinsulfonate, Fettsäureacylglycerinsulfonate, Fettsäure-Oleylglycerinsulfate, Alkylphenolethylenoxidethersulfate, Paraffinsulfonate, Alkylphosphate, Isethionate, wie Acylisethionate, N-Acyltaurate, Alkylsuccinamate, und Sulfosuccinate, Monoester von Sulfosuccinaten (insbesondere gesättigte und ungesättigte C₁₂-C₁₈-Monoester) und Diester von Sulfosuccinaten (insbesondere gesättigte und ungesättigte C₆-C₁₂-Diester), Acylsarcosinate, Sulfate von Alkylpolysacchariden, wie die Sulfate von Alkylpolyglucosid (wobei die nichtionischen nicht sulfatierten Verbindungen nachstehend beschrieben sind), verzweigte primäre Alkylsulfate und Alkylpolyethoxycarboxylate, wie diejenigen der Formel RO(CH₂CH₂O)k-CH₂COO^–M⁺, wobei R ein C₈-C₂₂-Alkyl ist, k eine ganze Zahl von 1 bis 10 ist und M ein lösliches salzbildendes Kation ist. Harzsäuren und hydrierte Harzsäuren sind ebenfalls geeignet, wie Kolophonium, hydriertes Kolophonium und Harzsäuren und hydrierte Harzsäuren, die in Tallöl vorhanden sind oder sich davon ableiten.
Alkylbenzolsulfonate sind stark bevorzugt.
Besonders bevorzugt sind lineare (geradkettige) Alkylbenzolsulfonate (LAS), wobei die Alkylgruppe vorzugsweise 10 bis 18 Kohlenstoffatome enthält.
Weitere Beispiele sind in "Surface Active Agents und Detergents" (Bd. I und II von Schwartz, Perry und Berch) beschrieben. Eine Vielzahl solcher Tenside ist auch allgemein in US 3,929,678 (Spalte 23, Zeile 58 bis Spalte 29, Zeile 23) offenbart.
Sofern hier mit umfasst, schließen die erfindungsgemäßen Detergentzusammensetzungen zum Wäschewaschen typischerweise etwa 1 bis etwa 40%, vorzugsweise etwa 3 bis etwa 20 Gew.-% von solchen anionischen Tensiden ein.
Die erfindungsgemäßen Detergentzusammensetzungen zum Wäschewaschen können auch kationische, ampholytische, zwitterionische und semipolare Tenside sowie die nichtionischen und/oder anionischen Tenside, die anders sind als diejenigen, die hier bereits beschrieben sind, enthalten.
Kationische Reinigungstenside, die zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Detergentzusammensetzungen zum Wäschewaschen geeignet sind, sind diejenigen mit 1 langkettigen Kohlenwasserstoffgruppe. Beispiele für solche kationischen Tenside umfassen die Ammoniumtenside, wie Alkyltrimethylammoniumhalogenide, und diejenigen Tenside der Formel [R₂(OR₃)y][R₄(OR₃)y]₂R₅N⁺X^– wobei R₂ eine Alkyl- oder Alkylbenzylgruppe mit etwa 8 bis etwa 18 Kohlenstoffatomen in der Alkylkette ist, R₃ jeweils ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus -CH₂CH₂-, -CH₂CH(CH₃)-, -CH₂CH(CH₂OH)-, -CH₂CH₂CH₂- und Gemischen davon; R₄ jeweils ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus C₁-C₄-Alkyl, C₁-C₄-Hydroxyalkyl, Benzylringstrukturen, die durch Verknüpfen der beiden R₄-Gruppen gebildet werden, -CH₂CHOHCHOHCOR₆CHOHCH₂OH, wobei R₆ jede Hexose oder jedes Hexosepolymer mit einem Molekulargewicht von weniger als etwa 1000 und Wasserstoff, wenn y nicht 0 ist, ist; R₅ gleich R₄ oder eine Alkylkette ist, wobei die Gesamtzahl der Kohlenstoffatome oder R₂ + R₅ nicht mehr als etwa 18 beträgt; y jeweils 0 bis etwa 10 ist, und die Summe der y-Werte 0 bis etwa 15 beträgt; und X jedes kompatible Anion ist.
Stark bevorzugte kationische Tenside sind die wasserlöslichen in der vorliegenden Zusammensetzung geeigneten quaternären Ammoniumverbindungen mit der Formel R₁R₂R₃R₄N⁺X^– (i)wobei R₁ C₈-C₁₆-Alkyl ist, R₂, R₃ und R₄ jeweils unabhängig C₁-C₄-Alkyl, C₁-C₄-Hydroxyalkyl, Benzyl und -(C₂H₄O)_xH, wobei x einen Wert von 2 bis 5 besitzt, sind und x ein Anion ist. Nicht mehr als eines von R₂, R₃ oder R₄ sollte Benzyl sein.
Die bevorzugte Alkylkettenlänge für R₁ ist C₁₂-C₁₅, insbesondere, wobei die Alkylgruppe ein Gemisch von Kettenlängen ist, die von Kokos- oder Palmkernfett abgeleitet sind oder die durch Olefinaufbau oder Oxo-Alkoholsynthese synthetisch abgeleitet wird.
Bevorzugte Gruppen für R₂, R₃ und R₄ sind Methyl- und Hydroxyethylgruppen, und das Anion X kann aus Halogenid-, Methasulfat-, Acetat- und Phosphationen ausgewählt werden.
Beispiele für geeignete quaternäre Ammoniumverbindungen der Formel (i) zur Verwendung hierin sind Kokostrimethylammoniumchlorid oder -bromid;
Kokosmethyldihydroxyethylammoniumchlorid oder -bromid;
Decyltriethylammoniumchlorid;
Decyldimethylhydroxyethylammoniumchlorid oder -bromid;
C_12-15-Dimethylhydroxyethylammoniumchlorid oder -bromid;
Kokosdimethylhydroxyethylammoniumchlorid oder -bromid;
Myristyltrimethylammoniummethylsulphat;
Lauryldimethylbenzylammoniumchlorid oder -bromid;
Lauryldimethyl(ethenoxy)-4-ammoniumchlorid oder -bromid;
Cholinester (Verbindungen der Formel (i), wobei R₁
ist und R₂R₃R₄ Methyl sind);
Dialkylimidazoline [Verbindungen der Formel (i)].
Weitere kationische Tenside, die hier geeignet sind, sind auch in der US 4,228,044 und in der EP 000 224 beschrieben.
Sofern hier mit umfasst, schließen die erfindungsgemäßen Detergentzusammensetzungen zum Wäschewaschen typischerweise 0,2 bis etwa 25, vorzugsweise etwa 1 bis etwa 8 Gew.-% von solchen kationischen Tensiden ein.
Ampholytische Tenside sind ebenfalls zur Verwendung in den erfindungsgemäßen Detergentzusammensetzungen zum Wäschewaschen geeignet. Diese Tenside können grob als aliphatische Derivate von sekundären oder tertiären Aminen, oder als aliphatische Derivate von heterocyclischen sekundären und tertiären Aminen, wobei der aliphatische Rest geradkettig oder verzweigt sein kann, beschrieben werden. Einer der aliphatischen Substituenten enthält mindestens etwa 8 Kohlenstoffatome, typischerweise etwa 8 bis etwa 18 Kohlenstoffatome, und mindestens einer enthält eine anionische Wasser-Solubilisierungsgruppe, z.B. Carboxy, Sulfonat, Sulfat. Siehe US 3,929,678 (Spalte 19, Zeilen 18–35) für Beispiele für ampholytische Tenside.
Sofern hier mit umfasst, schließen die erfindungsgemäßen Detergentzusammensetzungen zum Wäschewaschen typischerweise 0,2 bis etwa 15, vorzugsweise etwa 1 bis etwa 10 Gew.-% von solchen ampholytischen Tensiden ein.
Zwitterionische Tenside sind ebenfalls zur Verwendung in Detergentzusammensetzungen zum Wäschewaschen geeignet. Diese Tenside können weitgehend als Derivate von sekundären und tertiären Aminen, Derivate von heterocyclischen sekundären und tertiären Aminen oder als Derivate von quaternären Ammonium-, quaternären Phosphonium- oder tertiären Sulfoniumverbindungen beschrieben werden. Siehe US 3,929,678 (Spalte 19, Zeile 38 bis Spalte 22, Zeile 48) für Beispiele für zwitterionische Tenside.
Sofern hier mit umfasst, schließen die erfindungsgemäßen Detergentzusammensetzungen zum Wäschewaschen typischerweise 0,2 bis etwa 15, vorzugsweise etwa 1 bis etwa 10 Gew.-% von solchen zwitterionischen Tensiden ein.
Semipolare nichtionische Tenside sind eine spezielle Kategorie von nichtionischen Tensiden, die wasserlösliche Aminoxide einschließen, die eine Alkylgruppierung von etwa 10 bis etwa 18 Kohlenstoffatomen und 2 Gruppierungen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Alkylgruppen und Hydroxyalkylgruppen, die etwa 1 bis etwa 3 Kohlenstoffatome enthalten; wasserlöslichen Phosphinoxiden, die 1 Alkylgruppierung von etwa 10 bis etwa 18 Kohlenstoffatomen und 2 Gruppierungen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Alkyl- und Hydroxyalkylgruppen, die etwa 1 bis etwa 3 Kohlenstoffatome enthalten, enthalten; und wasserlöslichen Sulfoxiden, die eine Alkylgruppierung von etwa 10 bis etwa 18 Kohlenstoffatomen und eine Gruppierung, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus Alkyl- und Hydroxyalkylgruppierungen von etwa 1 bis etwa 3 Kohlenstoffatomen, enthalten.
Semipolare nichtionische Reinigungstenside umfassen die Aminoxid-Tenside der Formel
wobei R₃ eine Alkyl-, Hydroxyalkyl-, oder Alkylphenylgruppe oder Gemische davon, die etwa 8 bis etwa 22 Kohlenstoffatome enthalten, ist. R₄ eine Alkylen- oder Hydroxyalkylengruppe ist, die etwa 2 bis etwa 3 Kohlenstoffatome enthält, oder Gemische davon ist; x 0 bis etwa 3 ist; und R₅ jeweils eine Alkyl- oder Hydroxyalkylgruppe die etwa 1 bis etwa 3 Kohlenstoffatome enthält, oder eine Polyethylenoxidgruppe, die etwa 1 bis etwa 3 Ethylen oxidgruppen enthält, ist. Die R₅-Gruppen können jeweils miteinander, z.B. über ein Sauerstoff- oder Stickstoffatom, unter Bildung einer Ringstruktur, verknüpft sein.
Diese Aminoxid-Tenside umfassen insbesondere C₁₀-C₁₈-Alkyldimethylaminoxide und C₈-C₁₂-Alkoxyethyldihydroxyethylaminoxide.
Sofern hier mit umfasst, schließen die erfindungsgemäßen Detergentzusammensetzungen zum Wäschewaschen typischerweise 0,2 bis etwa 15, vorzugsweise etwa 1 bis etwa 10 Gew.-% von solchen semipolaren nichtionischen Tensiden ein.
Builder-System
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können außerdem ein Builder-System umfassen. Jedes herkömmliche Builder-System ist hier zur Verwendung geeignet und umfasst Aluminosilicat-Materialien, Silicate, Polycarboxylate und Fettsäuren, Materialien, wie Ethylendiamintetraacetat, Metallionen, Sequestrierungsmittel, wie Aminopolyphosphate, insbesondere Ethylendiamin, Tetramethylenphosphonsäure und Diethylentriaminpentamethylenphosphonsäure. Obwohl aus offensichtlichen Umweltschutzgründen weniger bevorzugt, können auch Phosphatbuilder hier verwendet werden.
Geeignete Builder können anorganische Ionenaustauschermaterialien sein, im Allgemeinen ein anorganisches Aluminosilicathydratmaterial, insbesondere ein synthetischer hydratisierter Zeolith wie hydratisierter Zeolith A, X, B, HS oder MAP.
Ein weiteres geeignetes anorganisches Builder-Material ist Schichtsilicat, z.B. SKS-6 (Hoechst). SKS-6 ist ein kristallines Schichtsilicat, das aus Natriumsilicat (Na₂Si₂O₅) besteht.
Geeignete Polycarboxylate, die eine Carboxygruppe enthalten, umfassen Milchsäure, Glycolsäure und Etherderivate davon, wie offenbart in den belgischen Patentschriften Nrn. 831,368, 821,369 und 821,370. Polycarboxylate, die 2 Carboxygruppen enthalten, umfassen die wasserlöslichen Salze von Succinsäure, Malonsäure, (Ethylendioxy)diessigsäure, Maleinsäure, Diglycolsäure, Weinsäure, Tartronsäure und Fumarsäure sowie die Ethercarboxylate, die in der deutschen Offenlegungsschrift 2,446,686 und 2,446,487, US 3,935,257 beschrieben sind, und die Sulfinylcarboxylate, die in der belgischen Patentschrift Nr. 840,623 beschrieben sind. Polycarboxylate, die 3 Carboxygruppen enthalten, umfassen insbesondere wasserlösliche Citrate, Aconitrate und Citraconate sowie Succinatderivate, wie die Carboxymethyloxysuccinate, die in der britischen Patentschrift Nr. 1,379,241 beschrieben sind, Lactoxysuccinate, die in der niederländischen Anmeldung 7205873 beschrieben sind, und die Oxypolycarboxylat-Materialien, wie 2-Oxa-1,1,3-propantricarboxylate, die in der britischen Patentschrift Nr. 1,387,447 beschrieben sind.
Polycarboxylate, die 4 Carboxygruppen enthalten, umfassen Oxydisuccinate, die in der britischen Patentschrift Nr. 1,261,829 offenbart sind, 1,1,2,2,-Ethantetracarboxylate, 1,1,3,3-Propantetracarboxylate, die Sulfo-Substituenten enthalten, umfassen die Sulfosuccinat-Derivate, die in den britischen Patentschriften Nrn. 1,398,721 und 1,398,422 und in der US 3,936,448 offenbart sind, und die sulfonierten pyrolysierten Citrate, die in der britischen Patentschrift Nr. 1,082,179 beschrieben sind, während Polycarboxylate, die Phosphon-Substituenten enthalten, in der britischen Patentschrift Nr. 1,439,000 offenbart sind.
Alicyclische und heterocyclische Polycarboxylate umfassen Cyclopenten-cis,cis,cis-tetracarboxylate, Cyclopentadienidpentacarboxylate, 2,3,4,5-Tetrahydrofuran-cis,cis,cis-tetracarboxylate, 2,5-Tetrahydrofuran-cis-discarboxylate, 2,2,5,5-Tetrahydrofurantetracarboxylate, 1,2,3,4,5,6-Hexan-hexacarboxylate und Carboxymethylderivate von mehrwertigen Alkoholen, wie Sorbit, Mannit und Xylit. Aromatische Polycarboxylate umfassen Mellithsäure, Pyromellithsäure und die in der britischen Patentschrift Nr. 1,425,343 offenbarten Phthalsäurederivate.
Von den obigen sind die bevorzugten Polycarboxylate Hydroxycarboxylate, die bis zu 3 Carboxygruppen pro Molekül enthalten, insbesondere Citrate.
Bevorzugte Builder-Systeme zur Verwendung in den vorliegenden Zusammensetzungen umfassen ein Gemisch von einem wasserunlöslichen Aluminosilicat-Builder, wie Zeolith A oder ein Schichtsilicat (SKS-6), und einen wasserlöslichen Carboxylat-Chelatbildner, wie Citronensäure.
Ein geeigneter Chelatbildner zum Einschluss in die erfindungsgemäßen Detergentzusammensetzungen ist Ethylendiamin-N,N'-disuccinsäure (EDDS) oder die Alkalimetall-, Erdalkalimetall-, Ammonium- oder substituierten Ammoniumsalze davon oder Gemische davon. Bevorzugte EDDS-Verbindungen sind die freie Säureform und das Natrium- oder Magnesiumsalz davon. Beispiele für solche bevorzugten EDDS-Natriumsalze umfassen Na₂EDDS und Na₄EDDS. Beispiele für solche bevorzugten Magnesiumsalze von EDDS umfassen MgEDDS und Mg₂EDDS. Die Magnesiumsalze sind zum Einschluss in die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen besonders bevorzugt.
Bevorzugte Builder-Systeme umfassen ein Gemisch eines wasserunlöslichen Aluminosilicat-Builders, wie Zeolith A, und eines wasserlöslichen Carboxylat-Chelatbildners, wie Citronensäure.
Weitere Builder-Materialien, die Teil des Builder-Systems zur Verwendung in körnigen Zusammensetzungen bilden können, umfassen anorganische Materialien, wie Alkalimetallcarbonate, Bicarbonate, Silicate und organische Materialien, wie die organischen Phosphonate, Aminopolyalkylenphosphonate und Aminopolycarboxylate.
Weitere geeignete wasserlösliche organische Salze sind die homo- oder copolymeren Säuren oder ihre Salze, wobei die Polycarbonsäure mindestens zwei Carboxylreste, die voneinander durch nicht mehr als 2 Kohlenstoffe getrennt sind, umfasst.
Polymere dieses Typs sind in der GB-A-1,596,756 offenbart.
Beispiele für solche Salze sind Polyacrylate mit MW 2000–5000 und ihre Copolymere mit Maleinsäureanhydrid, wie Copolymere mit einem Molekulargewicht von 20000 bis 70000, insbesondere von etwa 40000.
Detergent-Buildersalze sind normalerweise in Mengen von 5 bis 80 Gew.-% der Zusammensetzung eingeschlossen. Bevorzugte Konzentrationen an Builder betragen für flüssige Detergentien 5–30%.
Enzyme
Bevorzugte Detergentzusammensetzungen umfassen zusätzlich zu der erfindungsgemäßen Enzympräparation andere Enzym(e), die Reinigungsleistung und/oder Stoffpflegevorteile bereitstellen.
Solche Enzyme umfassen Proteasen, Lipasen, Cutinasen, Amylasen, Cellulasen, Peroxidasen, Oxidasen (z.B. Laccasen).
Proteasen: Jede Protease, die zur Verwendung in alkalischen Lösungen geeignet ist, kann verwendet werden. Geeignete Proteasen umfassen diejenigen tierischen, pflanzlichen oder mikrobiellen Ursprungs. Der mikrobielle Ursprung ist bevorzugt. Chemisch oder genetisch modifizierte Mutanten sind mit umfasst. Die Protease kann eine Serinprotease, vorzugsweise eine alkalische mirkobielle Protease oder eine trypsinartige Protease sein. Beispiele für alkalische Proteasen sind Subtilisine, insbesondere diejenigen, die sich aus Bacillus ableiten, z.B. Subtilisin Novo, Subtilisin Carlsberg, Subtilisin 309, Subtilisin 147 und Subtilisin 168 (beschrieben in WO 89/06279). Beispiele für trypsinartige Proteasen sind Trypsin (z.B. vom Schwein oder vom Rind) und die Fusarium-Protease, die in der WO 89/06270 beschrieben ist.
Bevorzugte im Handel erhältliche Protease-Enzyme umfassen diejenigen, die unter den Warennamen Alcalase, Savinase, Primase, Durazym und Esperase von Novo Nordisk A/S (Dänemark) im Handel sind, diejenigen, die unter dem Warennamen Maxatase, Maxacal, Maxapem, Properase, Purafect und Purafect OXP von Benencor International im Handel sind, und diejenigen, die unter dem Warennamen Opticlean und Optimase von Solvay Enzymes im Handel sind. Protease-Enzym können in die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen in einer Konzentration von 0,00001 bis 2 Gew.-% Enzymprotein von der Zusammensetzung, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,0001 bis 1 Gew.-% Enzymprotein von der Zusammensetzung, stärker bevorzugt in einer Konzentration von 0,001 bis 0,5 Gew.-% Enzymprote in von der Zusammensetzung, noch stärker bevorzugt in einer Konzentration von 0,01 bis 0,2 Gew.-% Enzymprotein von der Zusammensetzung eingearbeitet werden.
Lipasen: Jede Lipase, die zur Verwendung in alkalischen Lösungen geeignet ist, kann verwendet werden. Geeignete Lipasen umfassen diejenigen aus Bakterien oder Fungi. Chemisch oder genetisch modifizierte Mutanten sind eingeschlossen.
Beispiele für geeignete Lipasen umfassen eine Humicola lanuginosa-Lipase, z.B. wie beschrieben in EP 258 068 und EP 305 216 , eine Rhizomucor miehei-Lipase, z.B wie beschrieben in EP 238 023 , eine Candida-Lipase, wie eine C. antanrctica-Lipase, z.B. C. antarctica-Lipase A oder B, beschrieben in der EP 214 761 , eine Pseudomonas-Lipase, wie P. alcaligenes, und eine P. pseudoalcaligenes-Lipase, z.B. wie in EP 218 272 beschrieben, eine P. cepacia-Lipase, z.B. wie in EP 331 376 beschrieben, eine P. stutzeri-Lipase, z.B. wie in GB 1,372,034 beschrieben, eine P. fluorescens-Lipase, eine Bacillus-Lipase, z.B. eine B. subtilis-Lipase (Dartois et al., (1993), Biochemica und Biophysica acta 1131, 253–260), eine B. stearothermophilus-Lipase (JP 64/744992) und eine B. pumilus-Lipase (WO 91/16422).
Außerdem kann eine Anzahl von klonierten Lipasen geeignet sein, einschließlich der Penicillium camembertii-Lipase, die von Yamaguchi et al., (1991), Gene 103, 61–67 beschrieben ist, Geotricum candidum-Lipase (Schimada, y. et al., (1989), J. Biochem., 106, 383–388) und verschiedener Rhizopus-Lipasen, wie R. delemar-Lipase (Hass, M. J. et al., (1991), Gene 109, 117–113), einer R. niveus-Lipase (Kugimiya et al., (1992), Biosci. Biotech. Biochem. 56, 716–719) und einer R. oryzae-Lipase.
Weitere Typen von lipolytischen Enzymen, wie Cutinasen, können ebenfalls geeignet sein, z.B. eine Cutinase, die sich von Pseudomonas mendocina ableitet, wie in der WO 88/09367 beschrieben, oder eine Cutinase, die von Fusarium solani pisi (z.B. beschrieben in der WO 90/09446) abgeleitet ist.
Besonders geeignete Lipasen sind Lipasen, wie M1 Lipase^TM, Luma fast^TM und Lipomax^TM (Genencor), Lipolase^TM und Lipolase Ultra^TM (Novo Nordisk A/S), und Lipase P "Amano" (Amano Pharmaceutical Co. Ltd.).
Die Lipasen werden normalerweise in die Detergentzusammensetzung in einer Konzentration von 0,00001 bis 2 Gew.-% Enzymprotein von der Zusammensetzung, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,0001 bis 1 Gew.-% Enzymprotein von der Zusammensetzung, stärker bevorzugt in einer Konzentration von 0,001 bis 5 Gew.-% Enzymprotein von der Zusammensetzung, noch stärker bevorzugt in einer Konzentration von 0,1 bis 0,2 Gew.-% Enzymprotein von der Zusammensetzung eingearbeitet.
Amylasen: Jede Amylase (a und/oder b), die zur Verwendung in alkalischen Lösungen geeignet ist, kann verwendet werden. Geeignete Amylasen umfassen diejenigen aus Bakterien oder Fungi. Chemisch oder genetisch modifizierte Mutanten sind eingeschlossen. Amylasen umfassen beispielsweise alpha-Amylasen, die aus einem speziellen Stamm von B. licheniformis erhalten werden und in GB 1,296,839 ausführlicher beschrieben sind. Im Handel erhältliche Amylasen sind Duramyl^TM, Termamyl^TM, Fungamyl^TM und BAN^TM (erhältlich von Novo Nordisk A/S) und Rapidase^TM und Maxamyl P^TM (erhältlich von Genencor).
Die Amylasen werden normalerweise in die Detergentzusammensetzung in einer Konzentration von 0,00001 bis 2 Gew.-% Enzymprotein von der Zusammensetzung, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,0001 bis 1 Gew.-% Enzymprotein von der Zusammensetzung, stärker bevorzugt in einer Konzentration von 0,001 bis 0,5 Gew.-% Enzymprotein von der Zusammensetzung, noch stärker bevorzugt in einer Konzentration von 0,01 bis 0,2 Gew.-% Enzymprotein von der Zusammensetzung eingearbeitet.
Cellulasen: Jede Cellulase, die zur Verwendung in alkalischen Lösungen geeignet ist, kann verwendet werden. Geeignete Cellulasen umfassen diejenigen aus Bakterien oder Fungi. Chemisch oder genetisch modifizierte Mutanten sind eingeschlossen. Geeignete Cellulasen sind in US 4,435,307 offenbart, die Cellulasen aus Fungi offenbart, die von Humicola insolens produziert werden. Besonders geeignete Cellulasen sind die Cellulasen mit Farbpflege vorteilen. Beispiele für solche Cellulasen sind die Cellulasen, die in der europäischen Patentanmeldung Nr. 0 495 257 beschrieben sind, und die erfindungsgemäßen Endoglucanasen.
Im Handel erhältliche Cellulasen umfassen Celluzyme^TM, produziert von einem Stamm von Humicola insolens (Novo Nordisk A/S) und KAC-500 (B)^TM (Kao Corporation).
Die Cellulasen werden normalerweise in die Detergentzusammensetzung in einer Konzentration von 0,00001 bis 2 Gew.-% Enzymprotein von der Zusammensetzung, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,0001 bis 1 Gew.-% Enzymprotein von der Zusammensetzung, stärker bevorzugt in einer Konzentration von 0,001 bis 0,5 Gew.-% Enzymprotein von der Zusammensetzung, noch stärker bevorzugt in einer Konzentration von 0,01 bis 0,2 Gew.-% Enzymprotein von der Zusammensetzung eingearbeitet.
Peroxidasen/Oxidasen: Peroxidase-Enzyme werden in Kombination mit Wasserstoffperoxid oder einer Quelle davon (z.B. einem Percarbonat, Perborat oder Persulfat) verwendet. Oxidase-Enzyme werden in Kombination mit Sauerstoff verwendet. Beide Typen von Enzymen werden zum "Lösungsbleichen", d. h. zur Verhinderung von Übertragung einer Textilfarbe von einem farbigen Textilstoff auf einen anderen Stoff verwendet, wenn die Textilstoffe miteinander in einer Waschlauge, vorzugsweise zusammen mit einem Verstärkungsmittel, wie z.B. in WO 94/12621 und WO 95/01426 beschrieben, gewaschen werden. Geeignete Peroxidasen/Oxidasen umfassen diejenigen, die aus Pflanzen, Bakterien oder Fungi stammen. Chemisch oder genetisch modifizierte Mutanten sind eingeschlossen.
Peroxidase- und/oder Oxidase-Enzyme werden normalerweise in die Detergentzusammensetzung in einer Konzentration von 0,00001 bis 2 Gew.-% Enzymprotein von der Zusammensetzung, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,0001 bis 1 Gew.-% Enzymprotein von der Zusammensetzung, stärker bevorzugt in einer Konzentration von 0,001 bis 0,5 Gew.-% Enzymprotein der Zusammensetzung, noch stärker bevorzugt in einer Konzentration von 0,01 bis 0,2 Gew.-% Enzymprotein von der Zusammensetzung eingearbeitet.
Gemische der oben erwähnten Enzyme sind hier mit umfasst, insbesondere ein Gemisch einer Protease, einer Amylase, einer Lipase, und/oder einer Cellulase.
Das erfindungsgemäße Enzym oder jedes andere Enzym, das in die Detergentzusammensetzung eingearbeitet ist, wird normalerweise in die Detergentzusammensetzung in einer Konzentration von 0,00001 bis 2 Gew.-% Enzymprotein von der Zusammensetzung, vorzugsweise in einer Konzentration von 0,0001 bis 1 Gew.-% Enzymprotein von der Zusammensetzung, stärker bevorzugt in einer Konzentration von 0,001 bis 0,5 Gew.-% Enzymprotein von der Zusammensetzung, noch stärker bevorzugt in einer Konzentration von 0,01 bis 0,2 Gew.-% Enzymprotein von der Zusammensetzung eingearbeitet.
Bleichmittel
Zusätzliche fakultative Detergentbestandteile, die in den erfindungsgemäßen Detergentzusammensetzungen eingeschlossen sind, umfassen Bleichmittel, wie PB1, PB4 und Percarbonat, mit einer Teilchengröße von 400–800 Micron. Diese Bleichmittelkomponenten können ein oder mehrere Sauerstoff-Bleichmittel und in Abhängigkeit von dem gewählten Bleichmittel einen oder mehrere Bleichaktivatoren umfassen. Sofern vorhanden, sind Sauerstoff-Bleichverbindungen typischerweise in Konzentrationen von etwa 1 bis etwa 25% vorhanden. Im Allgemeinen sind die Bleichverbindungen nicht flüssigen Formulierungen, z.B. körnigen Detergentien, fakultativ zugesetzte Verbindungen.
Die Bleichmittel-Komponente zur Verwendung hier kann jedes der Bleichmittel sein, die für Detergentzusammensetzungen geeignet sind, einschließlich von Sauerstoffbleichen sowie anderen aus der Technik bekannten Bleichen.
Das Bleichmittel, das für die vorliegende Erfindung geeignet ist, kann ein aktiviertes oder nicht aktiviertes Bleichmittel sein.
Eine Kategorie von Sauerstoff-Bleichmitteln, die verwendet werden können, umfasst Percarbonsäure-Bleichmittel und Salze davon. Geeignete Beispiele dieser Klasse von Mittel umfassen Magnesium, Monoperoxyphthalathexahydrat, das Magnesiumsalz von Metachlorperben zosäure, 4-Nonylamino-4-oxoperoxybuttersäure und Diperoxydodecandicarbonsäure. Solche Bleichmittel sind in US 4,483,781 , US 740,446 , EP 0 133 354 und US 4,412,934 offenbart. Stark bevorzugte Bleichmittel umfassen auch 6-Nonylamino-6-oxoperoxycapronsäure, wie beschrieben in US 4,634,551 .
Eine weitere Kategorie von Bleichmitteln, die verwendet werden kann, umfasst die Halogenbleichmittel. Beispiele für Hypohalogenit-Bleichmittel umfassen beispielsweise Trichlorisocyanursäure und die Natrium- und Kaliumdichlorisocyanurate und N-Chlor- und N-Brom-Alkansulfonamide. Solche Materialien werden normalerweise von 0,5 bis 10 Gew.-% des fertigen Produktes, vorzugsweise von 1 bis 5 Gew.-% zugesetzt.
Die Wasserstoffperoxid-freisetzenden Mittel können in Kombination mit Bleichaktivatoren verwendet werden, wie Tetraacetylethylendiamin (TAED), Nonanoyloxybenzolsulfonat (NOBS, beschrieben in US 4,412,934 ), 3,5-Trimethylhexanoloxybenzolsulfonat (ISONOBS, beschrieben in EP 120 591 ) oder Pentaacetylglucose (PAG), die unter Bildung einer Persäure als aktive Bleichspezies perhydrolysiert werden und zu einer verbesserten Bleichwirkung führen. Zusätzlich sind die Bleichaktivatoren C8(6-Octanamidocaproyl)oxybenzolsulfonat, C9(6-Nonanamidocaproyl)oxybenzolsulfonat und C10(6-Decanamidocaproyl)oxybenzolsulfonat oder Gemische davon sehr geeignet. Ebenfalls geeignete Aktivatoren sind acetylierte Citratester, wie in der europäischen Patentanmeldung Nr. 91870207.7 offenbart.
Zur Verwendung in erfindungsgemäßen Reinigungszusammensetzungen geeignete Bleichmittel, einschließlich von Peroxysäuren und Bleichsystemen, die Bleichaktivatoren und Persauerstoff-Bleichverbindungen umfassen, sind in der Anmeldung USSN 08/136,626 beschrieben.
Das Wasserstoffperoxid kann auch durch Zugabe eines Enzymsystems (d. h. ein Enzym und ein Substrat dafür), das zur Erzeugung von Wasserstoffperoxid zu Beginn oder während des Waschens- und/oder Spülvorgangs in der Lage ist, vorhanden sein. Solche Enzymsysteme sind in der europäischen Patentanmeldung EP 0537381 offenbart.
Bleichmittel, die anders sind als Sauerstoff-Bleichmittel sind ebenfalls aus der Technik bekannt und können hier verwendet werden. Ein Typ von Nichtsauerstoff-Bleichmittel von besonderem Interesse umfasst Licht-aktivierte Bleichmittel, wie sulfonierte Zink- und/oder Aluminium-Phthalocyanine. Diese Materialien können während des Waschvorganges auf dem Substrat abgelagert werden. Bei Bestrahlung mit Licht in Gegenwart von Sauerstoff, wie durch Aufhängen der Kleider zum Trocknen im Freien im Tageslicht, wird das sulfonierte Zinkphthalocyanin aktiviert, und folglich wird das Substrat gebleicht. Bevorzugte Zinkphthalocyanine und ein Licht-aktiviertes Bleichverfahren sind in US 4,033,718 beschrieben. Typischerweise enthält die Detergentzusammensetzung etwa 0,025 bis etwa 1,25 Gew.-% sulfoniertes Zinkphthalocyanin.
Bleichmittel können auch einen Mangan-Katalysator umfassen. Der Mangan-Katalysator kann z.B. eine der Verbindungen sein, die in "Efficient manganese catalysts for low-temperature bleaching", Nature 369, 1994, Ss. 637–639, beschrieben sind.
Schaumunterdrücker
Ein weiterer fakultativer Bestandteil ist ein Schaumunterdrücker, beispielsweise Silikone und Silicimdidoxid-Silikon-Gemische. Silikone können im Allgemeinen durch alkylierte Polysiloxan-Materialien dargestellt werden, während Siliciumdixid normalerweise in fein zerteilten Formen, beispielsweise Kieselaerogele und Xerogele und hydrophobe Siliciumdioxide verschiedener Typen eingesetzt wird. Diese Materialien können als teilchenförmige Materialien eingearbeitet werden, wobei der Schaumunterdrücker zweckmäßigerweise in einem wasserlöslichen oder wasserdispergierbaren im wesentlichen nicht oberflächenaktiven Detergent-undurchlässigen Träger freisetzbar eingearbeitet ist. Alternativ kann der Schaumunterdrücker in einem flüssigen Träger gelöst oder dispergiert und durch Aufsprühen auf eine oder mehrere der anderen Komponenten aufgebracht werden.
Ein bevorzugtes Silikon-Schaumkontrollmittel ist in US 3,933,672 offenbart. Weitere besonders geeignete Schaumunterdrücker sind selbstemulgierende Silikon-Schaumunterdrücker, die in der deutschen Patentanmeldung DTOS 2,646,126 beschrieben sind. Ein Beispiel für eine solche Verbindung ist DC-544, das von Dow Corning im Handel erhältlich ist, das ein Siloxan-Glycol-Copolymer ist. Besonders bevorzugte Schaum-Kontrollmittel sind die Schaumunterdrücker-Systeme, die ein Gemisch von Silikonölen und 2-Alkylalkanolen umfassen. Geeignete 2-Alkanylalkanole sind 2-Butyloctanol, die unter dem Warennamen Isofol 12 R im Handel erhältlich sind.
Solche Schaumunterdrückersysteme sind in der europäischen Patentanmeldung EP 0 593 841 beschrieben.
Besonders bevorzugte Silikon-Schaumkontrollmittel sind in der europäischen Patentanmeldung Nr. 92201649.8 beschrieben. Die Zusammensetzungen können ein Silikon/Siliciumdioxid-Gemisch in Kombination mit nichtporösem Quarzstaub, wie AerosilR, umfassen.
Die vorstehend beschriebenen Schaumunterdrücker werden normalerweise in Konzentrationen von 0,001 bis 2 Gew.-% der Zusammensetzung, vorzugsweise von 0,01 bis 1 Gew.-% verwendet.
Weitere Komponenten
Weitere in den Detergentzusammensetzungen verwendete Komponenten, wie Schmutzsuspendierende Mittel, Soil-release-Mittel, optische Aufheller, Scheuermittel, Bakterizide, Vergrauungsinhibitoren, Farbmittel und/oder verkapselte oder nicht verkapselte Duftstoffe, können eingesetzt werden.
Besonders geeignete Verkapselungsmaterialien sind wasserlösliche Kapseln, die aus einer Matrix von Polysaccharid- und Polyhydroxy-Verbindungen besteht, wie in GB 1,464,616 beschrieben.
Weitere geeignete wasserlösliche Verkapselungsmaterialien umfassen Dextrine, die sich von ungelierten Stärkesäureestern oder substituierten Dicarbonsäuren ableiten, wie in US 3,455,838 beschrieben. Diese Säureester-Dextrine werden vorzugsweise aus solchen Stärken, wie wachsartiger Mais, wachsartige Hirse, Sago, Tapioca und Kartoffel, hergestellt. Geeigne te Beispiele für die Verkapselungs-Materialien umfassen N-Lok, hergestellt von National Starch. Das N-Lok-Verkapselungsmaterial besteht aus einer modifizierten Maisstärke und Glucose. Die Stärke wird durch Addition von monofunktionellen substituierten Gruppen, wie Octenylsuccinsäureanhydrid, modifiziert.
Die hier geeigneten Ablagerungsverhinderungsmittel und Schmutz-Suspensionsmittel umfassen Cellulosederivate, wie Methylcellulose, Carboxymethylcellulose und Hydroxyethylcellulose und Homo- oder Copolymere-polycarbonsäuren oder ihre Salze. Polymere dieses Typs umfassen die Polyacrylate und Maleinsäureanhydrid-Acrylsäurecopolymere, die zuvor als Builder erwähnt wurden, sowie Copolymere von Maleinsäureanhydrid mit Ethylen, Methylvinylether oder Methacrylsäure, wobei das Maleinsäureanhydrid mindestens 20 Mol-% des Copolymers ausmacht. Diese Materialien werden normalerweise in Konzentrationen von 0,5 bis 10 Gew.-%, stärker bevorzugt von 0,75 bis 8 Gew.-%, besonders bevorzugt von 1 bis 6 Gew.-% der Zusammensetzung verwendet.
Bevorzugte optische Aufheller sind anionischen Charakters, wofür Beispiele Dinatrium-4,4'-bis(2-diethanolamino-4-anilino-s-triazin-6-yl-amino)stilben-2:2'-disulphonat, Dinatrium-4,4'-bis(2-morpholino-4-anilino-s-triazin-6-yl-amino-stilben-2,2'-disulphonat, Dinatrium-4,4'-bis(2,4-dianilino-s-triazin-6-yl-amino)stilben-2,2'-disulphonat, Mononatrium-4',4''-bis(2,4-dianilino-s-triazin-6-yl-amino)stilben-2-sulphonat, Dinatrium-4,4'-bis(2-anilino-4-(N-methyl-N-2-hydroxyethylamino)-s-triazin-6-yl-amino)stilben-2,2'-disulphonat, Dinatrium-4,4'-bis(4-phenyl-2,1,3-triazol-2-yl)-stilben-2,2'-disulphonat, Dinatrium-4,4'-bis(2-anilino-4-(1-methyl-2-hydroxyethylamino)-s-triazin-6-yl-amino)stilben-2,2'-disulphonat, Natrium-2(stilbyl-4''-(naphtho-1',2',4,5)-1,2,3,-triazol-2''-sulphonat und 4,4'-bis(2-sulphostyryl)biphenyl sind.
Weitere geeignete polymere Materialien sind die Polyethylenglycole, insbesondere diejenigen eines Molekulargewichts von 1000 bis 10000, insbesondere von 2000 bis 8000 und besonders bevorzugt von etwa 4000. Diese werden in Konzentrationen von 0,20 bis 5, stärker bevorzugt von 0,25 bis 2,5 Gew.-% verwendet. Diese Polymere und die zuvor erwähnten homo- oder copolymeren Polycarboxylatsalze sind zur verbesserten Weiße-Aufrechterhaltung, Asche- Ablagerung des Stoffs und Reinigungsleistung für Ton, proteinartigen und oxidierbaren Schmutz in Gegenwart von Übergangsmetallverunreinigungen wertvoll.
Soil-release-Mittel, die in den erfindungsgemäßen Zusammensetzungen geeignet sind, sind üblicherweise Copolymere oder Terpolymere von Terephthalsäure mit Ethylenglycol- und/oder Propylenglycoleinheiten in verschiedenen Anordnungen. Beispiele für solche Polymere sind in der US 4,116,885 und 4,711,730 und EP 0 272 033 offenbart. Gemäß EP 0 272 033 besitzt ein besonders bevorzugtes Polymer die Formel: (CH₃(PEG)₄₃)_0.75(POH)_0.25[T-PO)_2.8(T-PEG)_0.4]T(POH)_0.25((PEG)₄₃CH₃)_0.75 wobei PEG -(OC₂H₄)O- ist, PO (OC₃H₆O) ist und T (pOOC₆H₄CO) ist.
Ebenfalls sehr geeignet sind modifizierte Polyester, wie statistische Copolymere von Dimethylterephthalat, Dimethylsulfoisopththalat, Ethylenglycol und 1,2-Propandiol, wobei die Endgruppen primär aus Sulfobenzoat und sekundär aus Monoestern von Ethylenglycol und/oder 1,2-Propandiol bestehen. Das Ziel besteht darin, ein Polymer zu erhalten, das an beiden Enden "primär" mit Sulfobenzoatgruppen gekappt ist, im vorliegenden Zusammenhang sind die meisten der Copolymere hier an den Enden mit Sulfobenzoatgruppen gekappt, allerdings sind einige Polymere nicht ganz vollständig gekappt, und darum können ihre Endgruppen aus Monoester von Ethylenglycol und/oder 1,2-Propandiol bestehen und bestehen "sekundär" aus solchen Spezies.
Die hier gewählten Polyester enthalten etwa 46 Gew.-% Dimethylterephthalsäure, etwa 16 Gew.-% 1,2-Propandiol, etwa 10 Gew.-% Ethylenglycol, etwa 13 Gew.-% Dimethylsulfobenzoesäure und etwa 15 Gew.-% Sulfoisophthalsäure und weisen ein Molekulargewicht von etwa 3000 auf. Die Polyester und ihr Herstellungsverfahren sind ausführlich in EP 311 342 beschrieben.
Weichmachende Mittel
Stoffweichmachende Mittel können ebenfalls in die erfindungsgemäßen Detergentzusammensetzungen zum Wäschewaschen eingearbeitet werden. Diese Mittel können vom Typ her anorganisch oder organisch sein. Anorganische weichmachende Mittel sind beispielsweise die smektischen Tone, die in GB-A-1 400898 und in US 5,019,292 offenbart sind. Organische stoffweichmachende Mittel umfassen die wasserunlöslichen tertiären Amine, wie in GB-A1 514 276 und EP 0 011 340 offenbart, und ihre Kombination mit quaternären C₁₂-C₁₄-Monoammoniumsalzen ist in EP-B-0 026 528 offenbart, und langkettige Diamine, wie in EP 0 242 919 offenbart. Weitere geeignete organische Bestandteile für Textilstoff-weichmachende Systeme umfassen hochmolekulare Polyethylenoxid-Materialien, wie in EP 0 299 575 und 0 313 146 offenbart.
Die Konzentrationen von smektischem Ton liegen normalerweise im Bereich von 5 bis 15, stärker bevorzugt von 8 bis 12 Gew.-%, wobei das Material dem Rest der Formulierung als trockenes Komponentengemisch zugesetzt wird. Organische stoffweichmachende Mittel, wie die wasserunlöslichen tertiären Amine oder langkettige Diamid-Materialien, werden in Konzentrationen von 0,5 bis 5 Gew.-%, normalerweise von 1 bis 3 Gew.-% eingearbeitet, während die hochmolekularen Polyethylenoxidmaterialien und die wasserlöslichen kationischen Materialien in Konzentrationen von 0,1 bis 2, normalerweise von 0,15 bis 1,5 Gew.-% zugesetzt werden. Diese Materialien werden normalerweise dem sprühgetrockneten Teil der Zusammensetzung zugesetzt, obwohl es in einigen Fällen zweckmäßiger sein kann, sie als teilchenförmiges Trockengemisch zuzusetzen oder sie als geschmolzene Flüssigkeit auf die anderen Feststoffkomponenten der Zusammensetzung aufzusprühen.
Polymere Farbübertragungsverhinderungsmittel
Die erfindungsgemäßen Detergentzusammensetzungen können auch 0,001 bis 10, vorzugsweise 0,01 bis 2, stärker bevorzugt 0,05 bis 1 Gew.-% polymere Farbübertragungsverhinderungsmittel umfassen. Die polymeren Farbübertragungsverhinderungsmittel werden normalerweise in die Detergentzusammensetzungen eingearbeitet, um die Übertragung von Farben aus gefärbten Textilien auf Textilstoffe, die damit gewaschen werden, zu hemmen. Diese Polymere besitzen die Fähigkeit, die aus gefärbten Stoffen herausgewaschenen flüchtigen Far ben zu komplexieren oder zu adsorbieren, bevor die Farben Gelegenheit haben, sich an andere Gegenstände in der Wäsche anzuheften.
Besonders geeignete polymere Farbübertragungsverhinderungsmittel sind Polyamin-N-oxidpolymere, Copolymere von N-Vinylpyrrolidon und N-Vinylimidazol, Polyvinylpyrrolidonpolymere, Polyvinyloxazolidone und Polyvinylimidazole oder Gemische davon.
Die Zugabe von solchen Polymeren verstärkt auch die Leistung der erfindungsgemäßen Enzyme.
Die erfindungsgemäße Detergentzusammensetzung kann in flüssiger, pastöser, Gel-, Stab- oder Körnchenform vorliegen.
Nicht staubende Granulate können beispielsweise wie in US 4,106,991 und 4,661,452 (beide von Novo Industrie A/S) offenbart hergestellt und gegebenenfalls durch aus der Technik bekannte Verfahren überzogen werden. Beispiele für wachsartige Überzugsmaterialien sind Poly(ethylenoxid)-Produkte (Polyethylenglycol, PEG) mit mittleren Molekulargewichten von 1000 bis 20000; ethoxylierte Nonylphenole mit 16 bis 50 Ethylenoxid-Einheiten; ethoxylierte Fettsäurealkohole, wobei der Alkohol 12 bis 20 Kohlenstoffatome enthält und wobei 15 bis 80 Ethylenoxid-Einheiten vorhanden sind; Fettalkohole; Fettsäuren; und Mono- und Di- und Triglyceride von Fettsäuren. Beispiele für filmbildende Überzugsmaterialien, die zur Anwendung durch die Fluidbett-Techniken geeignet sind, sind in GB 1483591 angegeben.
Körnige erfindungsgemäße Zusammensetzungen können auch in "kompakter Form" vorliegen, d. h. sie können eine relativ höhere Dichte als die herkömmlichen körnigen Detergentien aufweisen, d. h. von 550 bis 950 g/l; in einem solchen Fall enthalten die erfindungsgemäßen körnigen Detergentzusammensetzungen im Vergleich zu den herkömmlichen körnigen Detergentien eine geringere Menge an "anorganischem Füllsalz"; typische Füllsalze sind Erdalkalimetallsalze von Sulfaten und Chloriden, typischerweise Natriumsulfat; ein "kompaktes" Detergent umfasst typischerweise nicht mehr als 10% Füllsalz. Die erfindungsgemäßen flüssigen Zusammensetzungen können auch in "konzentrierter Form" vorliegen, in einem solchen Fall enthalten die flüssigen erfindungsgemäßen Detergentzusammensetzungen eine im Vergleich zu den herkömmlichen flüssigen Detergentien geringere Menge an Wasser. Typischerweise beträgt der Wassergehalt des konzentrierten flüssigen Detergents weniger als 30%, stärker bevorzugt weniger als 20, am stärksten bevorzugt weniger als 10 Gew.-% der Detergentzusammensetzungen.
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können beispielsweise als Hand- und Maschinen-Waschmittelzusammensetzungen formuliert sein, einschließlich von Wasch-Hilfsstoffzusammensetzungen und Zusammensetzungen, die zur Verwendung bei der Vorbehandlung von verschmutzten Textilien, als Stoffweichspülerzusammensetzungen und Zusammensetzungen zur Verwendung bei Allgemeinen harten Oberflächen-Reinigungsvorgängen im Haushalt und für Geschirrspülvorgänge geeignet sind.
Die folgenden Beispiele sollen die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen erläutern, allerdings soll sie nicht notwendigerweise eine Einschränkung oder eine anderweitige Definition des Umfangs der Erfindung bedeuten.
In den Detergentzusammensetzungen besitzen die abgekürzten Komponenten der Zeichnungen die folgenden Bedeutungen:

LAS:: lineares C₁₂-Alkylnatriumbenzolsulfonat
TAS:: Natrium-Talg-Alkylsulfat
XYAS:: C_1X-C_1Y-Natriumalkylsulfat
SS:: sekundäres Seifentensid der Formel 2-Butyloctansäure
25EY:: ein überwiegend linearer primärer C₁₂-C₁₅-Alkohol, kondensiert mit einem Durchschnitt von Y Molen von Ethylenoxid
45EY:: ein überwiegend linearer primärer C₁₄-C₁₅-Alkohol, kondensiert mit einem Durchschnitt von Y mol Ethylenoxid
XYEZS:: Natrium-C_1X-C_1Y-alkylsulfat, kondensiert mit im Durchschnitt Z mol Ethylenoxid pro mol
nichtionisch:: ethoxyliertes/propoxyliertes C₁₃-C₁₅-Fettalkoholgemisch mit einem durchschnittlichen Ethoxylierungsgrad von 3,8 und einem mittleren Propoxylierungsgrad von 4,5, verkauft unter dem Warennamen Plurafax LF404 von BASF GmbH
CFAA:: C₁₂-C₁₄-Alkyl-N-methylglucamid
TFAA:: C₁₆-C₁₈-Alkyl-N-methylglucamid
Silicat:: amorphes Natriumsilicat (SiO₂:Na₂O-Verhältnis = 2,0)
NaSKS-6:: kristallines Schichtsilicat der Formel d-Na₂Si₂O₅
Carbonat:: wasserfreies Natriumcarbonat
Phosphat:: Natriumtripolyphosphat
MA/AA:: Copolymer von 1:4 Maleinsäure/Acrylsäure, mittleres Molekulargewicht etwa 80000
Polyacrylat:: Polyacrylathomopolymer mit einem mittleren Molekulargewicht von 8000, verkauft unter dem Warennamen PA30 von BASF GmbH
Zeolith A:: Natriumaluminosilicathydrat der Formel Na₁₂(AlO₂SiO₂)_12.27·H₂O mit einer primären Teilchengröße im Bereich von 1 bis 10 mikrometer.
Citrat:: Trinatriumcitratdihydrat
Citro:: Citronensäure
Perborat:: wasserfreie Natriumperboratmonohydrat-Bleiche, empirische Formel NaBO₂·H₂O₂
PB4:: wasserfreies Natriumperborattetrahydrat
Percarbonat:: wasserfreie Natriumpercarbonat-Bleiche mit der empirischen Formel: 2Na₂CO₃·3H₂O₂
TAED:: Tetraacetylethylendiamin
CMC:: Natriumcarboxymethylcellulose
DETPMP:: Diethylentriaminpenta(methylenphosphonsäure), auf dem Markt von Monsanto unter dem Warennamen Dequest 2060
PVP:: Polyvinylpyrrolidon-Polymer
EDDS:: Ethylendiamin-N,N'-disuccinsäure, [S,S]-Isomer in Form des Natriumsalzes
Schaumunterdrücker:: 25% Paraffinwachs, Fp. 50°C, 17% hydrophobes Siliciumdioxid, 58% Paraffinöl
körniger Schaumopterdrücker:: 12% Silicon/Siliciumdioxid, 18% Stearylalkohol, 70% Stärke in körniger Form
Sulfat:: wasserfreies Natriumsulfat
HMWPEO:: hochmolekulares Polyethylenoxid
TAE 25:: Talg-Alkoholethoxylat (25)

Detergent-Beispiel I
Eine erfindungsgemäße körnige Textilstoff-Reinigungszusammensetzung kann wie folgt hergestellt werden:

lineares Natrium-C₁₂-alkylbenzolsulfonat 6,5

Natriumsulfat 15,0

Zeolith A 26,0

Natriumnitrilotriacetat 5,0

erfindungsgemäßes Enzym 0,1

PVP 0,5

TAED 3,0

Borsäure 4,0

Perborat 18,0

Phenolsulfonat 0,1

Nebenbestandteile bis auf 100%
Detergent-Beispiel II

Ein erfindungsgemäße kompakte körnige Textilstoff-Reinigungszusammensetzung (Dichte 800 g/l) kann wie folgt hergestellt werden:

45AS	8,0
25E3S	2,0
25E5	3,0
25E3	3,0
TFAA	2,5
Zeolith A	17,0
NaSKS-6	12,0
Citronensäure	3,0
Carbonat	7,0
MA/AA	5,0
CMC	0,4
erfindungsgemäßes Enzym	0,1
TAED	6,0
Percarbonat	22,0
EDDS	0,3
körniger Schaumunterdrücker	3,5
Wasser/Nebenbestandteile	bis auf 100%

Detergent-Beispiel III
Erfindungsgemäße körnige Textilstoff-Reinigungszusammensetzungen, die besonders beim Waschen von farbigen Textilien geeignet sind, wurden wie folgt hergestellt:
Detergent-Beispiel IV
Erfindungsgemäße körnige Textilstoff-Reinigungszusammensetzungen, die die Fähigkeit "Weichmachen beim Waschen" bereitstellen, können wie folgt hergestellt werden:
Detergent-Beispiel V
Erfindungsgemäße, leistungsstarke Textilstoff-Reinigungszusammensetzungen können wie folgt hergestellt werden:
Textile Anwendungsmöglichkeiten
Bei einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Endoglucanase bei einem biologischen Glättungsverfahren. Die biologische Glättung ist eine spezielle Behandlung der Garnoberfläche, die die Stoffqualität bezüglich Handhabung und Aussehen ohne Verlust der Stoff-Netzfähigkeit verbessert. Die besonders wichtigen Wirkungen des biologischen Glättens können durch eine geringere Struppigkeit und weniger Pilling, erhöhten Glanz/Luster, verbesserte Stoffhandhabung, erhöhte dauerhafte Weichheit und geändertes Wasseraufnahmevermögen gekennzeichnet werden. Die biologische Glättung erfolgt im Allgemeinen bei der Nassverarbeitung bei der Herstellung von gestrickten und gewebten Stoffen. Die Nassverarbeitung umfasst solche Schritte, wie Entschlichten, Spülen, Bleichen, Waschen, Färben/Drucken und Veredeln. Während eines jeden von diesen Schritten wird der Stoff mehr oder weniger einer mechanischen Einwirkung unterzogen. Im Allgemeinen wird mit dem Stoff nach dem Stricken oder Weben der Textilien ein Entschlichtungsschritt und anschließend ein Spülschritt etc. durchgeführt. Das Entschlichten ist die Wirkung der Entfernung der Schlichte aus den Textilien. Vor dem Weben auf mechanischen Webstühlen werden die Kettgarne oft mit einer Schlichte/Stärke oder mit Stärkederivaten überzogen, um ihre Zugfestigkeit zu erhöhen. Nach dem Weben muss der Schlichte-Überzug vor der Weiterverarbeitung des Textilstoffs entfernt werden, um ein homogenes und waschfestes Ergebnis zu gewährleisten. Es ist bekannt, dass zum Erzielen der Wirkungen des biologischen Glättens eine Kombination von cellulloytischer und mechanischer Wirkung erforderlich ist. Es ist auch bekannt, dass eine "Superweichheit" erreichbar ist, wenn die Behandlung mit einer Cellulase mit einer herkömmlichen Behandlung mit Weichspülmitteln kombiniert wird. Es wird davon ausgegangen, dass die Verwendung der erfindungsgemäßen Endoglucanase zur biologischen Glättung von cellulosischen Textilien vorteilhaft ist, z.B. dass eine sorgfältigere Glättung erreicht werden kann. Das biologische Glätten kann durch Anwenden des z.B. in WO 93/20278 beschriebenen Verfahrens erhalten werden.
Stone-Washing
Es ist bekannt, ein "stone-washed" Aussehen (lokaler Farbabrieb) in gefärbtem Stoff, insbesondere in Denimstoff oder Jeans, entweder durch Waschen des Denimstoffs oder der aus solchem Stoff hergestellten Jeans in Gegenwart von Bimssteinen zur Bereitstellung der gewünschten lokalen Aufhellung der Farbe des Stoffs oder durch enzymatische Behandlung des Stoffs, insbesondere mit cellulytischen Enzymen, bereitzustellen. Die Behandlung mit einer erfindungsgemäßen Endoglucanase kann entweder allein, wie in der US 4,832,864 offenbart, zusammen mit einer kleineren Menge von Bimsstein als bei dem traditionellen Verfahren erforderlich oder zusammen mit Perlit, wie in Wo 95/09225 offenbart, durchgeführt werden.
Pulpe- und Papieranwendungen
In der papierherstellenden Pulpeindustrie kann die erfindungsgemäße Endoglucanase zweckmäßigerweise z.B. wie folgt eingesetzt werden:

– Zum Entrinden: die Vorbehandlung mit der Endoglucanase kann die Kambiumschicht vor dem Entrinden in mechanischen Fässern abbauen, was zu vorteilhaften Energieeinsparungen führt.
– Zur Zerfaserung: Die Behandlung eines Materials, das cellulosische Fasern enthält, mit der Endoglucanase vor dem Raffinieren oder Mahlen kann zur Herabsetzung des Energieverbrauchs auf Grund der hydrolysierenden Wirkung der Cellulase auf die Zwischenfaser-Oberflächen führen. Die Verwendung der Endoglucanase kann zu verbesserten Energieeinsparungen im Vergleich zu der Verwendung bekannter Enzyme führen, da angenommen wird, dass die erfindungsgemäße Enzymzusammensetzung eine höhere Fähigkeit zur Durchdringung der Faserwände besitzen kann.
– Zur Fasermodifizierung, d. h. Verbesserung von Fasereigenschaften, wo eine teilweise Hydrolyse durch die Faserwand benötigt wird, was ein tieferes Eindringen der Enzyme erfordert (z.B. um grobe Fasern biegsamer zu machen). Die Tiefenbehandlung von Fasern war bisher für ergiebige Pulpen, z.B. mechanische Pulpen oder Gemische recycelter Pulpen, nicht möglich. Dies wurde der Natur der Faserwandstruktur zugeschrieben, die den Durchtritt der Enzymmoleküle auf Grund von physikalischer Begrenzung der Porenmatrix der Faserwand verhindert. Es wird davon ausgegangen, dass die vorliegende Endoglucanase in der Lage ist, in die Faserwand einzudringen.
– Zur Abtropfverbesserung: die Abtropffähigkeit von Pulpen zur Papierherstellung kann durch Behandlung der Pulpe mit hydrolysierenden Enzymen, z.B. Cellulasen, verbessert werden. Die Verwendung der vorliegenden Endoglucanase kann wirksamer sein, z.B. führt sie zu einem höheren Verlustgrad an Bündeln stark hydratisierter Mikrofibrillen in der Feinteilchenfraktion (bestehend aus Faserabfall), was die Abtropfgeschwindigkeit durch Blockieren von Hohlräumen zwischen Fasern und im Drahtgitter der Papiermaschine einschränkt. Die kanadische Standardfreiheit (CSF) erhöht sich, und der Schopper-Riegler-Abtropfindex vermindert sich, wenn Pulpe der Cellulase-Behandlung unterzogen wird. Siehe z.B. US-Patentschrift 4,923,565; TAPPI T227, SCAN C19:65.ence.
– Zur Interfaserbindung: hydrolytische Enzyme werden bei der Herstellung von Pulpen zur Papierherstellung zur Verbesserung der Interfaserbindung angewandt. Die Enzyme spülen die Faseroberflächen von Verunreinigungen, z.B. cellulosischem Abfall, frei und erhöhen somit die Fläche an exponierter Cellulose mit Bindung an die Faserwand und verbessern somit die Faser-zu-Faser-Wasserstoffbindungsvermögen. Dieses Verfahren wird auch als Enthornung bezeichnet. Papier und Pappe, die mit einer Cellulase-enthaltenden Enzymzubereitung hergestellt werden, können eine verbessern Festigkeit oder ein verringertes Quadratmetergewicht, eine glattere Oberfläche und eine verbesserte Bedruckbarkeit aufweisen.
– Zum enzymatischen Deinking: die teilweise Hydrolyse von recyceltem Papier während oder beim Holzaufschluss unter Verwendung von hydrolysierenden Enzymen, wie Cellulasen, erleichtert bekanntlich die Entfernung und Agglomeration von Druckfarbenteilchen. Die Verwendung der vorliegenden Endoglucanase kann ein wirksameres Loslösen der Druckfarbe aus der Oberflächenstruktur auf Grund eines besseren Eindringens der Enzymmoleküle in die fibrilläre Matrix der Faserwand ergeben und somit die Oberfläche weich machen, wodurch die Druckfarbenteilchen wirksam gelöst werden. Die Agglomeration der gelösten Druckfarbenteilchen wird auch durch eine wirksamere Hydrolyse von cellulosischen Fragmenten, von denen festgestellt wurde, dass sie an die aus den Fasern stammenden Druckfarbenteilchen binden, verbessert.

Die Behandlung lignocellulosischer Pulpe kann z.B. durchgeführt werden wie in WO 91/14819, WO 91/14822, WO 92/17573 und WO 92/18688 beschrieben.
Abbau von Pflanzenmaterial
Bei wieder einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung der erfindungsgemäßen Endoglucanase und/oder der erfindungsgemäßen Enzympräparation zum Abbau von Pflanzenmaterial, z.B. Zellwände.
Es wird davon ausgegangen, dass die neue erfindungsgemäße Endoglucanase und/oder die neue erfindungsgemäße Enzympräparation bei der Herstellung von Wein, Fruchtsaft oder Gemüsesaft zur Ausbeuteerhöhung geeignet ist. Die erfindungsgemäßen Endoglucanasen können auch zur enzymatischen Hydrolyse verschiedener pflanzlicher, aus Zellwand stammender Materialien oder Abfallmaterialien, z.B. Rückstände von Feldfrüchten, wie Weizenstreu, gedroschene Maiskolben, ganze Kornpflanzen, Nussschalen, Gras, Gemüseschalen, Bohnenschoten, Getreidespelzen, Zuckkerrübenpulpe und dergleichen, eingesetzt werden. Das Pflanzenmaterial kann abgebaut werden, um die verschiedenen Arten der Verarbeitung zu verbessern, die Reinigung oder die Extraktion von anderen Komponenten zu erleichtern, wie die Reinigung von Betaglucan oder Betaglucan-Oligomeren aus Cerealien, den Futterwert zu verbessern, das Wasserbindungsvermögen herabzusetzen, die Abbaufähigkeit in Kläranlagen zu verbessern, die Umwandlung von z.B. Gras und Mais zu Silagefutter zu verbessern, etc.
BEISPIELE
Die Erfindung wird weiterhin in den folgenden Beispielen erläutert, die für den Umfang der Erfindung, wie beansprucht, keinesfalls einschränkend sein sollen.
MATERIALIEN UND METHODEN
Cellulolytische Aktivität
Die erfindungsgemäßen Cellulase-Varianten zeigen eine verbesserte Leistung. Einige der Varianten können eine verbesserte Leistung bezüglich erhöhter katalytischer Aktivität zeigen.
Im Zusammenhang mit der Erfindung kann die Cellulase-Aktivität in S-CEVU ausgedrückt werden. Cellulolytische Enzyme hydrolysieren CMC und erhöhen dadurch die Viskosität des Inkubationsgemisches. Die resultierende Herabsetzung in der Viskosität kann durch ein Vibrationsviskosimeter (z.B. MIVI 3000 von Sofraser, Frankreich) bestimmt werden.
Die Bestimmung der cellulolytischen Aktivität, gemessen als S-CEVU, kann nach dem folgenden Analyseverfahren (Test) bestimmt werden: der S-CEVU-Test quantifiziert die Menge an katalytischer Aktivität, die in der Probe vorhanden ist, durch Messen der Fähigkeit der Probe zur Herabsetzung der Viskosität einer Lösung von Carboxymethylcellulose (CMC). Der Test wird bei 40°C; pH 7,5; 0,1 M Phosphatpuffer; Zeit 30 min; unter Verwendung eines relativen Enzymstandards zur Herabsetzung der Viskosität des CMC(Carboxymethylcellulose Hercules 7LFD)-Substrats; Enzymkonzentration ca. 0,15 S-CEVU/ml durchgeführt. Der ARCH-Standard wird auf 8200 S-CEVU/g festgelegt.
BEISPIEL 1
Herstellung Cellulase-Varianten
Auf der Grundlage des offenbarten Sequenz-Alignments (Tabelle 1) und des Computermodellverfahrens wurde die Position 119 als besonderer Punkt von Interesse zur Herstellung von Cellulase-Varianten identifiziert. Die Position 119 (Cellulase-Nummerierung) ist innerhalb 3 Å von dem Substrat angeordnet. In Position 119 hält die Wildtyp-Humicola insolens-Cellulase einen Histidinrest (H), wohingegen die Wildtyp-Thielavia terrestris-Cellulase einen Glutaminrest (Q) hält.
Bei diesem Experiment wurde in der Thielavia terrestris-Cellulase Glutamin durch Histidin ersetzt (dadurch wurde die Cellulase-Variante Thielavia terrestris/Q119H) erhalten. Die erhaltene Variante wurde auf die spezifische Aktivität getestet.
Sämtliche Humicola insolens-Varianten werden, sofern nicht anderweitig angegeben, durch Anwendung des doppelsträngigen, ortsgerichteten Chameleon^TM-Mutagenese-Kit von Stratagene konstruiert. Das folgende synthetische Oligonucleotid
wurde als Selektionsprimer verwendet.
S/M ersetzt die ScaI-Stelle in dem beta-Lactamase-Gen des Plasmids mit einer MluI-Stelle, und M/S wirkt umgekehrt. Letzteres wird zur Einbringung sekundärer Mutationen in Varianten verwendet, die von dem ersten Selektionsprimer erzeugt werden.
Zur Kontruktion von Thielavia terrestris-Cellulase-Varianten wurde die Thielavia terrestris-EGV-Cellulase-cDNA, die aus dem Plasmid erhältlich ist, das als DSM 10811 hinterlegt ist, verwendet. DSM 10811 wurde in der Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen am 30. Juni 1965 nach dem Budapester Vertrag hinterlegt. Das Plasmid wurde mit den Restriktionsendonucleasen BamHI und NotHI abgebaut, der 4153 bp-Vektorteil und das 1211 bp-BamHI-NotI-Fragment wurden isoliert. Gleiche Portionen des 1211 bp-Fragments wurden mit HgiAI bzw. EcoRV abgebaut, und die 487 bp-BamHI-HgiAI- und 690 bp-EcoRV-NotI-Fragmente wurden isoliert.
Diese Fragmente und der Vektorteil wurden in Gegenwart eines fünffachen molaren Überschusses eines synthetischen DNA-Fragments ligiert, das aus der Anellierung von zwei einzelsträngigen DNA-Oligomeren hervorgeht:
Das Ligationsgemisch wurde in E. coli, Stamm XL1, transformiert, und aus den resultierenden Transformanten wurde Thielavia terrestris/Q119H isoliert und durch DNA-Sequenzierung verifiziert.
Sämtliche Cellulase-Varianten wurden durch Klonieren des Gens und Transformieren des Gens in Aspergillus oryzae unter Verwendung eines Plasmids produziert, wobei das Gen zwischen dem Amylasepromotor und dem AMG-Terminator aus dem Pilz A. niger inseriert war. [Christensen, T. Wöldike, H. Boel, E., Mortensen. S. B., Hjortshøj, K., Thim, L. und Hansen, M. T. (1988) Biotechnology 6: 1419–1422].
Die Cellulasen mit einer Cellulose-Bindungsdomäne CBD wurden durch Ausnutzen ihres Bindens an Avicel gereinigt. Das klonierte Produkt wurde nach Fermentation durch Abtrennung des extrazellulären Fluids von dem Produktionsorganismus gewonnen. Anschließend wurde die Cellulase durch Affinitätschromatographie unter Verwendung von 150 g Avicel in einer Aufschlämmung mit 20 mM Natriumphosphat pH 7,5 hoch aufgereinigt. Die Avicel-Aufschlämmung wurde mit der Fermentationsrohlösung vermischt, die insgesamt etwa 1 g Protein enthält. Nach Mischen bei 4°C für 20 min wird das Avicel-gebundene Enzym in eine Säule mit der Abmessung von 50 × 200 mm, etwa 400 ml insgesamt, gepackt.
Die Säule wird mit 200 ml Puffer, anschließend mit 0,5 M NaCl im gleichen Puffer gewaschen, bis kein Protein mehr eluiert, und mit 500 ml Puffer (20 mm Tris pH 8,5) gewaschen. Schließlich wird das reine Volllängenenzym mit 1% Triethylamin, pH 11,8, eluiert. Die elu ierte Enzymlösung wird auf pH 8 eingestellt und unter Verwendung einer Amicon-Zelleneinheit mit einer DOW GR61PP-Membran (Polypropylen mit einer Ausschlussgrenze von 20 KD) auf 5 mg Protein pro ml konzentriert. Die Enzyme wurden alle gereinigt und ergaben auf SDS-PAGE eine einzige Bande.
Cellulasen, denen von Natur aus die CBD fehlt oder bei denen der Linker proteolytisch abgespalten oder die CBD durch Einfügen eines Stoppcodons nach der katalytischen Domäne entfernt wurde, können unter Verwendung von Avicel nicht gereinigt werden. Die extrazellulären Proteine werden frei aus dem Produktionsorganismus gewonnen. Die Kerncellulasen wurden durch Kationen-Austauscherchromatographie frei von Aspergillus-Proteinen aufgereinigt. Die Fermentationslösung wurde auf pH 3,5 eingestellt und zur Entfernung der ausgefällten Proteine filtriert. Anschließend wurden die Proteine auf einer DOW GR81PP-Membran mit einer Ausschlussgrenze von 6 KD ultrafiltriert (konzentriert und mit Wasser gewaschen), bis die Leitfähigkeit des Eluats unter 1000 mS/cm liegt. Schließlich wurde die Probe auf eine S-Sepharose-Säule aufgegeben, die mit einem 20 mM Citratpuffer, pH 3,5, äquilibriert war.
Das Enzym bindet bei diesem niedrigen pH an die S-Sepharose, und es wird unter Verwendung eines NaCl-Gradienten von 0 bis 500 mM als einziger Peak eluiert. Das eluierte reine Enzym wurde auf einer Amicon-Zelle mit der DOW GR81PP-Membran konzentriert. Sämtliche gereinigten Cellulasen ergaben in SDS-PAGE eine einzige Bande.
Die spezifischen Aktivitätsdaten sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst:
Aus diesem Experiment geht hervor, dass durch Einbringen der Mutation Q119H in die Thielavia terrestris-Cellulase die spezifische Aktivität der resultierenden Cellulase-Varianten auf das Niveau desjenigen der homologen Humicola insolens-Cellulase erhöht wurde.
BEISPIEL 2
Thielavia terrestris-Variante mit verbessertem alkalischem Leistungsprofil
Bei diesem Experiment wurde die Thielavia terrestris/Q119D wie in Beispiel 1 beschrieben konstruiert, allerdings unter Anwendung der folgenden Konstruktion: Zum leichteren Kassettentausch und zur Verwendung von Standardprimer wurde die CT1-codierende DNA mit einer C-terminalen Xba1-Stelle geliefert und in den Vektor pCaHj418 subkloniert, wie nachstehend beschrieben. PCT1 wurde als Templat in einer Pwo-Polymerase-PCR, 94°C2'-3 × (94°C, 30''-72°C, 1')-25 × (94°C, 30''-55°C, 30''-72°C, 1')-72°C, 5', unter Verwendung der beiden Primer
verwendet.
Das resultierende 718 bp-PCR-Produkt wurde mit SalI und XbaI abgebaut, und das 165 bp-Fragment wurde isoliert. Dieses Fragment wurde zusammen mit dem 833 bp-BamHI-SalI-Fragment aus pCT1–2 in das 4,1 kb-Xba1-BamHi-Vektorfragment von pCaHj418 ligiert.
Aus dieser Ligation wurde pCT1418 aus E. coli-Transformanten isoliert.
PCT2 wurde durch das doppelsträngige ortsgerichtete Chameleon^TM-Mutagenese-Kit (von Stratagene), wie vorstehend beschrieben, mit pCT1418 als Templat, dem S/M-Primer als Selektionsprimer und dem folgenden mutagenen Primer
konstruiert. Es wurde ein erfolgreich mutiertes Plasmid pCT2 isoliert, durch DNA-Sequenzierung verifiziert und in den Aspergillus oryzae-Stamm JaL228 transformiert.
Die Thielavia terrestris-Cellulase und die Thielavia terrestris/Q119D-Variante wurden, wie in Beispiel 9 beschrieben, auf die Aktivität gegenüber PASC bei pH 7,0 und pH 10,0 getestet.
Die Ergebnisse sind in der Tabelle nachstehend angegeben, die die Aktivität bei pH 10 im Vergleich zu der Aktivität bei pH 7 zeigt. Dies zeigt, dass die Thielavia terrestris/Q119D-Variante im Vergleich zu der Eltern-Thielavia terrestris relativ mehr alkalische Aktivität zeigt.
BEISPIEL 3
Konstruktion einer Cellulase-Hybridvariante
Das Plasmid pCT3 umfasst DNA, die das Thielavia terrestris-Endoglucanase-Kernenzym codiert, gefolgt von der Linker-CBD von Humicola grisea.
pCT3 wurde mittels sequenzüberlappender Extensions-PCR unter Anwendung von PWO-Polymerase konstruiert.
Aus einem cDNA-Klon von Humicola grisea wurde ein 415 bp-Fragment durch die folgenden Primer generiert:
Aus pCT1418 (offenbart in Beispiel 2) wurde ein 876 bp-PCR-Fragment durch die folgenden Primer generiert:
Für beide Reaktionen wurde die folgenden Einstellung verwendet: 96°C, 1'-3 × (94°C, 30''-50°C, 1'-72°C, 1')-25 × (94°C, 30''-61°C, 30''-72°C, 1')-72°C, 7'.
Die isolierten PCR-Fragmente wurden als Templat in einer PCR-Zusammenfügungsreaktion mit den Primern 101621 und 107819 angewandt:
94°C, 1'-3 × (94°C, 30''-70°C, 1'-72°C, 2')-20 × (94°C, 30''-61°C, 30''-72°C, 1,5'')-72°C, 7'. Das resultierende 1261 bp-PCR-Produkt wurde isoliert, durch die Restriktionsenzyme BamH1 und Xba1 geschnitten, und das resultierende 1172 bp-DNA-Fragment wurde isoliert und in das 4,1 kb-Vektorfragment von BamH1-Xba1-abgebautem pCaHj418 ligiert.
Die richtigen Klone wurden isoliert und durch DNA-Sequenzierung von Plasmiden verifiziert, die aus E. coli XL1-Tranformanten isoliert wurden, die aus der obigen Ligationsreaktion hervorgingen.
cDNA-Sequenz von Humicola grisea:
BEISPIEL 4
Konstruktion von Varianten einer Hybrid-Cellulase
Das Plasmid pPsF45 umfasst DNA, die das Pseudomonas cellolytica-Endoglucanase-Kernenzym codiert, der das H. insolens-EGV-Endoglucanase-Signalpeptid vorausgeht und die Linker-CBD des gleichen Enzyms folgt.
Zwei Varianten dieses Hybrid-Enzyms, PsF45/H15S und PsF45/Q119H (Cellulase-Nummerierung), wurden mittels des oben erwähnten Chameleon^®-Kit von Stratagene durch Anwendung der folgenden mutagenen Primer konstruiert:
Abweichungen von der Templatsequenz sind fett gedruckt angegeben.
Der Selektionsprimer wandelte die einzigartige Sca1-Schnittstelle in dem Lactamase-Gen des Plasmids in eine Mlu1-Schnittstelle um:
Die beiden Varianten wurden durch DNA-Sequenzierung verifiziert, und von jeder Variante wurde eine korrekte Version identifiziert.
Die beiden Plasmide, die die Sequenzvarianten pPsF45H15S und pPsF45Q119H umfassen, wurden zur Transformation des A. oryzae-Stamms JaL142 zusammen mit dem AMDS-Selektionsplasmid pToC202 verwendet.
Aus den resultierenden Transformanten wurden LaC2829 und LaC2830 nach 3 Isolierschritten über Sporen isoliert.
BEISPIEL 5
Entfernung von Disulfid-Brücken
Disulfid-Brücken stabilisieren bekanntlich Proteinstrukturen. Die Entfernung von Disulfid-Brücken in einer Cellulase destabilisiert das Enzym (Thermostabilität), während eine nenneswerte Aktivität beibehalten wird. Dies kann bei Anwendungen geeignet sein, wobei eine schnelle Inaktivierung des Enzyms bevorzugt ist, z.B. bei Denim- oder Textilstoff-Anwendungen oder für Niedertemperaturverfahren.
Bei diesem Beispiel wurden Humicola insolens-EGV-Cellulase und 5 Varianten von Humicola insolens-Cellulase konstruiert, wobei einer oder beide an einer Disulfid-Brücke beteiligten Reste mutiert wurden. Die spezifische Aktivität wurde gemessen wie unter Materialien und Methoden offenbart. Die Schmelztemperatur der Enzyme wurde unter Verwendung der Differential Scanning Calometry, DSC, gemessen. DSC erfolgte bei neutralem pH (7,0) unter Verwendung eines MikroCalc Inc. MC Kalorimeters mit einer konstanten Abtastgeschwindigkeit und unter Erhöhung der Temperatur von 20°C bis 90°C mit einer Geschwindigkeit von 90°C pro h.
Die Ergebnisse sind in der Tabelle nachstehend dargelegt, die zeigt, dass die Entfernung einer Disulfid-Brücke eine Variante mit einem wesentlich geringeren Schmelzpunkt, allerdings unter Beibehalten einer nennenswerten Aktivität, ergibt.
BEISPIEL 6
Mutation von in einem Bindungsspalt von < 5 Å vom Substrat konservierten Resten
Beim Vergleich der Positionen in einem Abstand von 5 Å von dem Substrat mit dem Sequenz-Alignment in Tabelle 1 wird der Typ von Aminosäurerest an diesen Positionen in den aufgereihten Cellulasen für die folgenden Positionen konserviert: 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 18, 45, 112, 114, 121, 127, 128, 130, 132, 147, 148, 149. Normalerweise wird angenommen, dass die konservierten Reste für die Aktivität äußerst wichtig sind, jedoch haben die Erfinder festgestellt, dass eine bestimmte Variabilität unter Beibehaltung einer nennenswerten Aktivität erlaubt ist. Nur die beiden Reste D10 und D121 (Cellulase-Nummerierung) sind zur Aufrechterhaltung einer angemessenen Aktivität notwendig.
Varianten der Humicola insolens-EGV-Cellulase wurden hergestellt, und die spezifische Aktivität wurde wie unter Materialien und Methoden offenbart gemessen.
Der Typ von Mutationen und die variantenspezifische Aktivität sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst:
Aus diesem Experiment ist ersichtlich, dass das Mutieren konservierter Reste in dem Bindungsspalt unter Beibehaltung einer nennenswerten Aktivität der Cellulase-Variante durchgeführt werden kann.
BEISPIEL 7
Mutation nicht-konservierter Reste in dem Bindungsspalt (< 5 Å) vom Substrat
Auf der Grundlage des Sequenz-Alignments in Tabelle 1 und des offenbarten Computermodellverfahrens wurden die folgenden Reste, die in einem Abstand von 5 Å von dem Substrat angeordnet und nicht konserviert waren, unter den aufgereihten Sequenzen als Punkte von Interesse zur Herstellung von Cellulase-Varianten benannt.
Bei diesem Experiment wurden nicht konservierte Reste, die nicht mehr als 5 Å von dem Substrat angeordnet waren, in der Humicola insolens-EGV-Cellulase modifiziert, und die spezifische Aktivität wurde gemessen wie unter Materialien und Methoden beschrieben.
Der Typ von Mutationen und die Varianten-spezifische Aktivität sind in der folgenden Tabelle zusammengefasst:
Aus diesem Experiment ist ersichtlich, dass die meisten der nicht konservierten Reste in dem Bindungsspalt unter Beibehaltung der gesamten oder des größten Teils der Aktivität der Cellulase mutiert werden können.
BEISPIEL 8
Resistenz gegenüber anionischen Tensiden im Detergent
A. Erfindungsgemäße Varianten können bezüglich einer geänderten Empfindlichkeit gegenüber anionischen Tensiden eine verbesserte Leistung zeigen. Anionische Tenside sind Produkte, die häufig in Detergentzusammensetzungen eingearbeitet werden. Das Auffalten der bisher getesteten Cellulasen geht mit einem Abfall in der natürlichen Fluoreszenz der Proteine einher. Die natürliche Fluoreszenz stammt von den Trp-Seitenketten (und zu einem geringeren Ausmaß von den Tyr-Seitenketten) und ist gegenüber der Hydrophobie der Seitenketten-Umgebung empfindlich. Das Auffalten führt zu einer hydrophileren Umgebung, da die Seitenketten gegenüber dem Lösungsmittel stärker exponiert werden, und dies quencht die Fluoreszenz.
Die Fluoreszenz wird auf einem Perkin/Elmer^TM LS50-Luminiszenzspektrometer verfolgt. In der Praxis wird die größte Änderung in der Fluoreszenz beim Auffalten durch Anregung bei 280 nm und Emission bei 345 nm erhalten. Die Schlitzbreiten (die die Signalgröße regulieren) betragen im Allgemeinen 5 nm sowohl für die Emission als auch die Anregung bei einer Proteinkonzentration von 5 μg/ml. Die Fluoreszenz wird in 2-ml-Quarzkuvetten gemessen, die mit einem zirkulierenden Wasserbad thermostatisiert und mit einem kleinen Magneten gerührt wurden. Der Magnetrührer ist in das Spektrometer eingebaut.
Das Auffalten kann in Realzeit unter Anwendung der verfügbaren Software verfolgt werden. Ein schnelles Auffalten (abgeschlossen innerhalb weniger als 5 bis 10 min) wird mit der Option TimeDrive aufgezeichnet, wobei die Fluoreszenz alle paar (2–5) Sekunden gemessen wird. Für ein langsameres Auffalten können 4 Küvetten gleichzeitig in dem Küvettenhalter unter Anwendung der Option Wavelength Program gemessen werden, wobei die Fluoreszenz einer jeden Küvette alle 30 sek. gemessen wird. In allen Fällen wird das Auffalten durch Zugabe eines kleinen Volumens (typischerweise 50 ml) konzentrierter Enzymlösung zu der ther mostatisierten Küvettenlösung, wo das Mischen innerhalb einiger Sekunden durch das schnelle Drehen des Magneten abgeschlossen ist, ausgelöst.
Die Daten werden mit dem Softwareprogramm GraphPad Prism gemessen. Das Auffalten stimmt in sämtlichen Fällen mit einer einfachen Exponentialfunktion überein, aus der eine einzige Halbwertszeit für das Auffalten (oder eine Auffaltgeschwindigkeitskonstante) erhalten werden kann.
Typische Auffaltungsbedingungen sind:

a. 10 mM CAPS pH 10, 1000 ppm LAS, 40°C
b. 10 mM HEPES pH 10, 200 ppm LAS, 25°C

In beiden Fällen beträgt die Proteinkonzentration 5 bis 10 μg/ml (die Proteinkonzentration ist nicht kritisch, da LAS im Überschuss vorliegt). Unter diesen Bedingungen kann das Auffalten von Humicola insolens-Cellulase mit anderen Enzymen verglichen werden (Tabelle 1). Dies ermöglicht es uns, die folgende Rangordnung der Stabilität gegenüber anionischem Tensid aufzuzeichnen:
Thielavia terrestris/Q119H ≅ Thielavia terrestris >> Humicola insolens ≅ Humicola insolens/H119Q.

a. Das Auffalten ist doppelt exponentiell. Die t_1/2 der langsameren Phase beträgt etwa 120 s.

B. Die Veränderung der Oberflächen-Elektrostatik eines Enzyms beeinflusst die Empfindlichkeit gegenüber anionischen Tensiden, wie LAS (lineares Alkylbenzolsulfonat). Insbesondere Varianten, wobei positiv geladene Reste entfernt und/oder negativ geladene Reste eingebaut worden sind, erhöhen die Beständigkeit gegenüber LAS, wohingegen das Gegenteil, d. h. Einbringen von positiv geladenen Resten und/oder Entfernen negativ geladener Reste die Beständigkeit gegenüber LAS herabsetzt. Die Reste Arg (R), Lys (K) und His (H) werden als positiv oder potentiell positiv geladene Rest betrachtet, und die Reste Asp (D), Glu (E) und Cys (C), sofern nicht in eine Disulfid-Brücke eingeschlossen, werden als negativ oder potentiell negativ geladene Reste angesehen. Positionen, die bereits einen dieser Reste enthalten, sind das primäre Ziel der Mutagenese, sekundäre Ziele sind Positionen, die einen dieser Reste an einer entsprechenden Position in einer anderen Cellulase aufweisen, und tertiäre Ziele sind jeder Oberflächen-exponierte Rest. Bei diesem Experiment wird Wildtyp-Humicola insolens-Cellulase mit Humicola insolens-Cellulase-Varianten, die allen 3 obigen Gruppen angehören, verglichen, wobei die Stabilität gegenüber LAS im Detergent verglichen wird.
Die Cellulase-Beständigkeit gegenüber anionischen Tensiden wurde als Aktivität auf PASC (Phosphorsäure-gequollene Cellulose) in Gegenwart eines anionischen Tensids vs. Aktivität auf PASC in Abwesenheit von anionischem Tensid gemessen.
Das Reaktionsmedium enthielt 5,0 g/l eines handelsüblichen regulären Waschpulvers vom Waschmittelhersteller NOPA, Dänemark. Das Waschmittel wurde für dieses Experiment ohne Tenside formuliert und der pH auf 7,0 eingestellt. Außerdem umfasste das Reaktionsmedium 0,5 g/l PASC, mit und ohne 1 g/l LAS (lineares Alkylbenzolsulfonat), was ein anionisches Tensid ist, und die Reaktion lief bei der Temperatur 30°C 30 min ab. Die Cellulase wurde mit 0,20 S-CEVU/l dosiert. Nach den 30 min der Inkubation wurde die Reaktion mit 2 N NaOH gestoppt, und die Menge der reduzierenden Zuckerenden durch Reduktion von p-Hydroxybenzoesäurehydrazid bestimmt. Die Abnahme in der Absorption von reduziertem p-Hydroxybenzoesäurehydrazid steht mit der Cellulase-Aktivität in Beziehung.
Der Typ von Mutation und die Beständigkeit gegenüber LAS für Varianten mit erhöhter LAS-Beständigkeit ist in der folgenden Tabelle zusammengefasst:
Aus dieser Tabelle ist ersichtlich, dass Mutationen von Resten, die zur Entfernung eines positiv geladenen Rests und/oder zum Einbau eines negativ geladenen Restes führen, die Beständigkeit gegenüber LAS erhöhen.
Wie vorstehend beschrieben, ist der obige Typ von Mutation und die Beständigkeit gegenüber LAS für Varianten mit verminderter LAS-Beständigkeit in der folgenden Tabelle zusammengefasst:
Aus dieser Tabelle ist ersichtlich, dass Mutationen von Resten, die zum Einbau eines positiv geladenen Rests und/oder zur Entfernung eines negativ geladenen Rests führen, die Beständigkeit gegenüber LAS herabsetzen.
BEISPIEL 9
Veränderung des pH-Aktivitätsprofils
Das pH-Aktivitätsprofil einer Cellulase wird von dem pH-abhängigen Verhalten spezifischer titrierbarer Gruppen, typischerweise den Säureresten, an der aktiven Stelle gesteuert. Das pH-Profil kann durch Ändern der elektrostatischen Umgebung dieser Reste entweder durch Substitution von Resten, die geladene oder potentiell geladene Gruppen einschließen, wie Arg (R), Lys (K), Tyr (Y), His (H), Glu (E), Asp (D) oder Cys (C), sofern nicht an einer Disulfid-Brücke beteiligt, oder durch Änderungen in der Oberflächenzugänglichkeit dieser speziellen titrierbaren Gruppen durch Mutationen im Bindungsspalt innerhalb von 5 Å vom Substrat geändert werden.
Bei diesem Beispiel wurden Humicola insolens-Cellulase und Varianten von Humicola insolens-Cellulase, die Substitution von geladenen oder potentiell geladenen Resten einschlossen, bei pH 7 bzw. pH 10 auf die Aktivität gegenüber PASC getestet.
Um das pH-Optimum für die Cellulasen zu bestimmen, haben wir organische Puffer gewählt, da es allgemein bekannt ist, dass z.B. Borat kovalente Komplexe mit Mono- und Oligosacchariden bildet und Phosphat mit Ca-Ionen ausfallen kann. In DATA FOR BIOCHEMICAL RESEARCH, Dritte Ausgabe, OXFORD SCIENCE PUBLIKATIONS, Seite 233–241, wurden geeignete organische Puffer gefunden. Bezüglich ihrer pKa-Werte entschlossen wir uns zur Verwendung von Natriumacetat im Bereich von 4 bis 5,5, MES bei 6,0, von MOPS im Bereich von 6,5–7,5, von Na-Barbiturat 8,0–8,5 und von Glycin im Bereich von 9,0 bis 10,5.
Verfahren:
Das Verfahren ist der enzymatische Abbau von Carboxymethylcellulose bei verschiednen pH-Werten. Die Puffer werden im Bereich von 4,0 bis 10,0 mit Intervallen von 0,5 pH-Einheiten hergestellt. Die Analyse beruht auf der Bildung von neuen reduzierenden Enden in Carboxymethylcellulose, diese werden durch Reaktion mit PHBAH in stark alkalischer Umgebung sichtbar gemacht, wo sie eine gelbe Verbindung mit einem Absorptionsmaximum bei 410 nm bilden.
Experimentelles Protokoll:
Pufferherstellung: 0,2 mol einer jeden Puffersubstanz werden abgewogen und in 1 l Milli Q-Wasser gelöst. 250 ml 0,2 M Pufferlösung und 200 ml Milli Q-Wasser werden gemischt. Die pH-Werte werden unter Verwendung eines Radiometer PHM92 Labmeters, kalibriert unter Verwendung von Standardpufferlösungen von Radiometer, gemessen. Der pH der Puffer wird auf den tatsächlichen pH-Wert unter Verwendung von 4 M NaOH oder 4 M HCl eingestellt und mit Wasser auf insgesamt 500 ml eingestellt. Beim Einstellen von Na-Barbiturat auf pH 8,0 kann es zu etwas Niederschlag kommen, dieser kann durch Erwärmen auf 50°C wieder aufgelöst werden.
Essigsäure 100% 0,2 mol = 12,01 g.
MES 0,2 mol = 39,04 g.
MOPS 0,2 mol = 41,86 g.
Na-Barbiturat 0,2 mol = 41,24 g.
Glycin 0,2 mol = 15,01 g.
Puffer:

pH: 4,0, 4,5, 5,0 & 5,5 Na-Acetat 0,1 M
pH: 6,0 Na-MES 0,1 M
pH: 6,5, 7,0 & 7,5 Na-MOPS 0,1 M
pH: 8,0 & 8,5 Na-Barbiturat 0,1 M
pH: 9,0, 9,5, 10,0 & 10,5 Na·Glycin 0,1 M

Der tatsächliche pH-Wert wird in einer Serie gemessen, die als Hauptwerte behandelt wird, der pH-Wert wird, allerdings ohne Stop-Reagens, nach 20 min Inkubation bei 40°C gemessen.
Substratherstellung:
2,0 g CMC in einem 250-ml-Erlenmeierkolben mit einem Magnetrührer werden mit 2,5 ml 96% Ethanol angefeuchtet. 100 ml Milli Q-Wasser werden zugesetzt und sodann bis zur Transparenz auf einem magnetischen Heizrührer erhitzt. Etwa 2 min Erhitzen. Abkühlen auf Raumtemperatur auf dem Magnetrührer.
Stop-Reagens:

1,5 g PHBAH und 5 g K-Na-Tartrat, gelöst in 2% NaOH.

Verfahren:
3 Hauptwerte und 2 Kontrollwerte werden unter Verwendung von 5-ml-Reagenzgläschen hergestellt. (1 Hauptwert zur pH-Bestimmung).
Mischen auf einem Heidolph REAX 2000-Mischer unter konstantem Mischen und mit maximaler Geschwindigkeit (9). Kein Rühren während der Inkubation auf dem Wasserbad mit Temperaturkontrolle. Unmittelbar nach Zugabe des PHBAH-Reagens und Mischen werden die Proben 10 min gekocht. 5 min Abkühlen unter kaltem Leitungswasser. Die Extinktion wird bei 410 nm gelesen.
Aktivitätsbestimmung
Die Extinktion bei 410 nm aus den 2 Hauptwerten wird addiert und durch 2 dividiert, und die 2 Kontrollwerte werden addiert und durch 2 dividiert, die 2 Mittelwerte werden subtrahiert. Die Prozentangaben werden unter Verwendung des höchsten Wertes als 100% berechnet.
Der gemessene pH-Wert wird gegen die relative Aktivität aufgetragen.
Pufferreagentien:

Essigsäure 100% von MERCK Kat. Nr. 1,00063, Chargen-Nr. K20928263422, pKa 4,76, MW 60,05;
MES (2[N-Morpholino]ethansulfonsäure) von SIGMA Kat. Nr. M-8250, Chargen-Nr. 68F-5625, pKa 6,09, MW 195,2;
MOPS (3-[N-Morpholino]propansulfonsäure) von SIGMA Kat. Nr. M-1254, Chargen-Nr. 115F-5629, pKa 7,15, MW 209,3;
Na-Barbiturat (5,5-Diethylbarbitursäurenatriumsalz) von MERCK Kat. Nr. 6318, Chargen-Nr. K20238018 404, pKa 7,98, MW 206,2;
Glycin von MERCK Kat. Nr. 4201, Chargen-Nr. K205535601 405, pKa 9,78, MW 75,07;
PHBAH (p-Hydroxybenzoesäurehydrazid) von SIGMA Kat. Nr. H-9882, Chargen Nr. 53H7704;
K-Na-Tartrat (Kaliumnatriumtartrattetrahydrat) von MERCK Kat. Nr. 8087, Chargen-Nr. A653387 304;
NaOH (Natriumhydroxid) von MERCK Kat. Nr. 1.06498, Chargen-Nr. C294798 404;
CMC (Carboxymethylcellulose) geliefert von Hercules (FMC)7LF (November 1989).

Die Cellulase-Beständigkeit gegenüber anionischen Tensiden wurde als Aktivität auf PASC (Phosphorsäure gequollene Cellulose) bei neutralem pH (pH 7,0) vs. Aktivität auf PASC bei alkalischem pH (pH 10,0) gemessen.
Das Reaktionsmedium enthielt 5,0 g/l eines handelsüblichen regulären Waschpulvers vom Waschmittelhersteller NOPA, Dänemark. Der pH-Wert wurde auf 7,0 bzw. 10,0 eingestellt. Weiterhin umfasste das Reaktionsmedium 0,5 g/l PASC, und die Reaktion lief bei einer Temperatur von 30°C 30 min ab. Die Cellulase wurde bei 0,20 S-CEVU/l dosiert. Nach den 30 min der Inkubation wurde die Reaktion mit 2 N NaOH gestoppt und die Menge an reduzierenden Zuckerenden durch Reduktion von p-Hydroxybenzoesäurehydrazid bestimmt. Die Abnahme in der Absorption von reduziertem p-Hydroxybenzoesäurehydrazid steht mit der Cellulase-Aktivität in Beziehung.
Ergebnisse:
Die Ergebnisse sind in der Tabelle nachstehend dargestellt, die Aktivität bei pH 10 relativ zu pH 7 wird mit derjenigen von Wildtyp-Humicola insolens-Cellulase verglichen.
Aus der obigen Tabelle ist ersichtlich, dass die relative alkalische Aktivität durch Erzeugung von Varianten, die potentiell geladene Reste umfassen, und/oder durch Änderung der Reste in dem Bindungsspalt von weniger als 5 Å von dem Substrat erhöht werden kann.
Gleichermaßen zeigt die folgende Tabelle, dass die relative Säureaktivität durch andere Mutationen, die potentiell geladene Reste umfassen, und/oder durch Änderung von Resten im Bindungsspalt von weniger als 5 Å von dem Substrat erhöht werden kann.
Demnach zeigt dieses Beispiel, dass das relative pH-Aktivitätsprofil gegenüber saurem oder alkalischem pH durch Erzeugung von Varianten, die potentiell geladene Reste umfassen, und/oder durch Ändern von Resten in den Bindungsspalt von weniger als 5 Å von dem Substrat geändert werden kann.
BEISPIEL 10
Waschleistung von Cellulasen, die gegenüber anionischen Tensiden resistent gemacht wurden
Die Anwendungswirkung einer gegenüber anionischen Tensiden resistent gemachten Cellulase vs. Anwendungswirkung der nativen Cellulase wurde als "Farbklärung" auf abgetragenen schwarzen Baumwolltuchstreifen gemessen, die mit Cellulase in einem 1 l Mini-Terg-o-Meter gewaschen wurden. Das Waschen erfolgte in variierenden Konzentrationen von anionischem Tensid.
Das Reaktionsmedium enthielt Phosphatpuffer, pH 7,0, und im Bereich von 0,2 bis 1,0 g/l variierende Konzentrationen von LAS. Zwei Tuchstreifen wurden bei 40°C 30 min gewaschen, gespült und sodann getrocknet. Der Waschzyklus wurde viermal wiederholt. Sämtliche Enzyme wurden bei jeder LAS-Konzentration getestet.
Schließlich wurden die schwarzen Baumwollstoffstreifen gegen einen Standard von ähnlichen Streifen bewertet, der mit verschiedenen Dosen der nativen Cellulase, der ca. 43 kD-Fungi-endo-β-1,4-Glucanase aus Humicola insolens, DSM 1800 (im Handel erhältlich unter dem Warenzeichen Carezyme^®), gewaschen wurde, verglichen, und die Wirkung wurde in PSU (Panel Bewertungseinheiten) ausgedrückt.

Claims

Cellulase-Variante mit geänderter Aniontensidempfindlichkeit im Vergleich zu einer Eltern-Cellulase, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Cellulasen aus Tabelle 1, welche Variante von der Eltern-Cellulase durch Substitution an einer oder mehreren der folgenden Positionen: 42, 64, 76, 91, 93, 141, 152, 154, 161, 191 und 192 (Cellulase-Nummerierung) abgeleitet ist.
Cellulase-Variante nach Anspruch 1, welche Variante von der Eltern-Cellulase durch Substitution an einer oder mehreren der folgenden Positionen: D42, E91, D161 und E 192 abgeleitet ist.
Cellulase-Variante mit geänderter Aniontensidempfindlichkeit im Vergleich zu einer Eltern-Cellulase, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus den Cellulasen aus Tabelle 1, welche Variante von der Eltern-Cellulase abgeleitet ist, und wobei die Variante eine oder mehrere der folgenden Modifikationen umfasst: Q119H R158E R158E, A162P R158G S152D R158E, R196E R158E, D161P, A162P R4H, R158E, D161P, A162P Y8F, W62E, R252L, Y280F R252L, Y280F A57C, A162C N154D R4H, D161P, A162P, E196E Y147H E192P D161P, A162P D67T Q367, D67T V64R T93R Q36T, D67T, A83T E91Q A191K D42W S117K R4H, A63R, N65R, D67R D133N T136D, G141R Y147K Y147R D161P D66P D66A, D67T D67T, *143NGT Q36T, D67T, *143NGT N65R, D67R, S76K W62R S117R, F120S
Cellulase-Variante nach Anspruch 3, welche Variante ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: Thielavia terrestris/Q119H Humicola insolens/R158E Humicola insolens/R158E, A162P Humicola insolens/R158G Humicola insolens/S152D Humicola insolens/R158E/R196E Humicola insolens/R158E, D161P, A162P Humicola insolens/R4H, R158E, D161P, A162P Humicola insolens/Y8F, W62E, R252L, Y280F Humicola insolens/R252L, Y280F Humicola insolens/A57C, A162C Humicola insolens/N154D Humicola insolens/R4H, D161P, A162P, R196E Humicola insolens/Y147H Humicola insolens/E192P Humicola insolens/D161P, A162P Humicola insolens/D67T Humicola insolens/Q36T, D67T Humicola insolens/V64R Humicola insolens/T93R Humicola insolens/Q36T, D67T, A83T Humicola insolens/E91Q Humicola insolens/A191K Humicola insolens/D42W Humicola insolens/S11K Humicola insolens/R4H, A63R, N65R, D67R Humicola insolens/D133N Humicola insolens/T136D, G141R Humicola insolens/Y147K Humicola insolens/Y147R Humicola insolens/D161P Humicola insolens/D66P Humicola insolens/D66A, D67T Humicola insolens/D67T, *143NGT Humicola insolens/Q36T, D67T, *143NGT Humicola insolens/W62R Humicola insolens/S117R, F120S
Cellulase-Variante nach einem beliebigen der Ansprüche 1 bis 4, welche Cellulase weiterhin eine CBD umfasst.
Verfahren zum Ändern der Stabilität einer natürlich vorkommenden Eltern-Cellulase in der Gegenwart eines anionischen Tensids oder anionischen Detergentbestandteils durch Ändern der elektrostatischen Umgebung des Enzyms durch Durchführen einer Substitution an einer oder mehreren der Oberfläche ausgesetzten Aminosäurerestpositionen des Enzyms, dadurch gekennzeichnet, dass die Eltern-Cellulase ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus den Cellulasen aus Tabelle 1, und dass der eine oder die mehreren der Oberfläche ausgesetzten Aminosäurereste ausgewählt sind aus der Gruppe, bestehend aus den folgenden Positionen: 42, 64, 76, 91, 93, 141, 152, 154, 161, 191 und 192 (Cellulase-Nummerierung).