CN104789543B

CN104789543B - 一种护色纤维素酶及其突变体

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Publication number: CN104789543B
Application number: CN201510206578.7A
Authority: CN
Inventors: 陈志兵; 张青; 刘艳萍; 王华明; 文飞; 鞠志国
Original assignee: SHANGHAI KDN BIOTECH CO Ltd
Current assignee: SHANGHAI KDN BIOTECH CO Ltd
Priority date: 2015-04-25
Filing date: 2015-04-25
Publication date: 2017-11-07
Anticipated expiration: 2035-04-25
Also published as: CN104789543A

Abstract

本发明的目的是提供一种纤维素酶及其突变体，所提供的纤维素酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1；维素酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：3。本发明提供的纤维素酶突变体在碱性条件下的适用范围更加宽泛，耐热性和稳定性更突出。其最适作用pH为6.0，且在pH4.5‑8.0范围内均能保持60％以上的酶活，而野生型在pH4.5‑7.5范围内仅能维持40％左右的酶活，至pH8.0时，酶活降为20％。该纤维素酶突变体在40℃水浴处理30天后，残留酶活高达88％，而野生型残留酶活仅为60％。与野生型相比，本发明所述纤维素酶突变体的护色效果得到显著提升，取得了意料不到的技术效果。所述纤维素酶突变体不仅具有良好的去污作用，还具有使纤维织物清洁、柔顺，且护色效果显著，可广泛应用于洗涤工业领域。

Description

一种护色纤维素酶及其突变体

技术领域

本发明属于功能基因筛选改造技术领域，具体涉及一种护色纤维素酶及其突变体。

背景技术

纤维素是世界上蕴藏量最丰富的天然高分子化合物，绝大多数由绿色植物通过光合作用合成。微生物对纤维素的降解、转化是自然界中碳素转化的主要环节。纤维素酶是降解纤维素生成葡萄糖的多组分酶的总称。目前，纤维素酶产品广泛应用于纺织、洗涤、饲料、酿造、制药、造纸等行业，尤其是在洗涤行业的应用范围目前正在不断扩大。

纤维素酶的来源非常广泛，昆虫、软体动物、原生动物、细菌、放线菌和真菌等都能产生纤维素酶。主要的是：康氏木霉、里氏木霉、黑曲霉、斜卧青霉、芽孢杆菌等。丝状真菌产生的纤维素酶一般在酸性或中性偏酸性条件下水解纤维素底物，而嗜碱细菌产生的纤维素酶在碱性范围内起作用。

碱性纤维酶的研究比较晚，但发展得很快。日本学者对碱性纤维素酶进行了大量的研究。1970年，UNILIVER公司首先发现纤维素酶用于洗涤剂，可以使由于反复洗涤而发黄变硬的棉纤维织品恢复原来的艳丽色彩和柔软，但当时在碱性范围内具有较高活性的纤维素酶还没有实现工业化。1972年horikoshi报道发现了嗜碱芽孢杆菌No.N-1、N-2、N-3和N-4能产生碱性纤维素酶，但酶活性很低。1974年日本东京工业大学研究了奢碱性芽孢杆菌N-1、N-4产的酶为分解代谢阻遏型。一直到1980年，NOVO公司发现了在碱性范围有较高活性的腐植菌，通过液体发酵，成功地生产了洗涤剂用碱性纤维素酶，并很快得到应用。

碱性纤维素酶在洗涤剂中的应用可以说是一项重要的发明。它不但具有优良的去污除垢的能力，而且经多次使用后，仍可使棉织物柔软、增艳，使织物纹理清晰，翻旧如新。织物经多次使用后，侵入棉单纤维结构内部的污垢越来越多，由于被纤维素分子与水形成的凝胶所封闭，这种污垢是很难去除的，从而导致了棉织物的发黄、泛灰和变硬。而碱性纤维素酶能作用于棉纤维内部的非结晶区域，使上述凝胶结构有效地软化，使其中的污垢较容易地分离出来，从而可避免织物的发黄、泛灰和变硬。

目前国内对于碱性纤维素酶的研究还处于起步阶段，已产业化的护色效果显著的碱性纤维素酶种类较少，且在产品性能和生产成本方面与国外同类产品的差距很大，远远不能满足国内日益增长的市场需要。

发明内容

本发明的目的是提供一种纤维素酶及其突变体，本发明通过对来源于特异腐质霉(Humicola insolens)的纤维素酶进行蛋白质工程改造，获得了护色效果显著的突变体蛋白。本发明的纤维素酶在碱性条件下的酶活力得到显著提高，且稳定性更好，不仅具有良好的去污作用，还具有使纤维织物清洁、柔顺，且护色效果显著，可广泛应用于洗涤工业领域。

申请人通过对特异腐质霉(Humicola insolens)的纤维素酶进行大量突变的筛选，发现P23G、D67N、A69S、R158S这四个位点的突变，可使该纤维素酶的作用pH和稳定性发生改变，并显著提升其护色效果，从而促成本发明。

本发明一方面提供了一种纤维素酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO：1。

所述纤维素酶的一种编码基因的核酸序列为SEQ ID NO：2。

本发明另一方面提供了一种纤维素酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO：1的纤维素酶第23位氨基酸由Pro变为Gly，第67位氨基酸由Asp变为Asn，第69位氨基酸由Ala变为Ser，第158位氨基酸Arg变为Ser。

上述纤维素酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：3，其一种编码基因的核酸序列为SEQ ID NO：4。

本发明另一方面提供了携带有编码序列为SEQ ID NO：3的纤维素酶突变体基因的质粒。

本发明再一方面提供一种重组里氏木霉，是将上述质粒转入里氏木霉(Trichoderma reesei)中构建的。

本发明还提供了上述纤维素酶突变体在洗涤剂中的应用。

本发明提供的纤维素酶突变体在碱性条件下的适用范围更加宽泛，耐热性和稳定性更突出。所述纤维素酶突变体的最适作用pH为6.0，且在pH4.5-8.0范围内均能保持60％以上的酶活，而野生型在pH4.5-7.5范围内仅能维持40％左右的酶活，至pH8.0时，酶活降为20％。所述纤维素酶突变体在40℃水浴处理30天后，残留酶活高达88％，而野生型的残留酶活仅为60％。与野生型相比，本发明所述纤维素酶突变体的护色效果得到显著提升，取得了意料不到的技术效果。本发明所述纤维素酶突变体不仅具有良好的去污作用，还具有使纤维织物清洁、柔顺，且护色效果显著，可广泛应用于洗涤工业领域。

附图说明

图1为SDS-PAGE电泳图；

其中M所示为蛋白Marker；泳道1为里氏木霉工程菌HIEGV发酵上清液中蛋白表达情况，泳道2所示为里氏木霉工程菌MEGV发酵上清液中蛋白表达情况，箭头所指处为分子量为40KDa的蛋白条带；

图2为纤维素酶突变体与野生型相对酶活-pH曲线图；

图3为纤维素酶突变体与野生型温度稳定性曲线图。

具体实施方式

本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,3nd Ed.(Sambrook,2001)和CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。而且本发明不限定于实施例中记载的具体方法、实验方案和试剂，还包括本领域的技术人员。

下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述。

实施例1：纤维素酶突变体基因的合成

为了提高纤维素酶(野生型氨基酸序列为SEQ ID NO:1，编码核苷酸序列为SEQ IDNO：2，由上海生工生物工程股份有限公司合成)在偏碱性条件下的酶活力，通过定向进化技术对该酶进行了大量突变的筛选，设计PCR引物HIEGV-F和HIEGV-R如下：

HIEGV-F：AAAgaattcTATGCGTTCCTCCCCCCTC

HIEGV-R：AAAgcggccgcCTACAGGCACTGATGGTAC

以SEQ ID NO:2基因为模板，以上述引物用GeneMorph II随机突变PCR试剂盒(Stratagene)进行PCR扩增，胶回收PCR产物，EcoRI、NotI进行酶切处理后与经同样酶切后的pET21a载体连接，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中，涂布于LB+Amp平板，37℃倒置培养，待转化子出现后，用牙签逐个挑至96孔板，每个孔中加入150μL含有0.1mM IPTG的LB+Amp培养基，37℃220rpm培养6h左右，离心弃上清，菌体用缓冲液重悬，反复冻融破壁，获得含有纤维素酶的大肠杆菌细胞裂解液。

分别取出50μL裂解液至两块新的96孔板，分别在pH 6.0和pH 8.0的条件下测定其纤维素酶活，结果发现，有些突变子在碱性条件下的酶活力没有变化，有些突变子的酶活甚至降低了，对在pH 8.0条件下依然保持高活性的突变子进行DNA测序，最终获得了能显著提高纤维素酶在碱性条件下耐受性的突变位点组合P23G、D67N、A69S和R158S。

P23G、D67N、A69S和R158S四点突变的纤维素酶突变体，其氨基酸序列为SEQ IDNO：3，编码核苷酸序列为SEQ ID NO：4。SEQ ID NO：4由上海生工生物工程股份有限公司合成完成，并且在合成序列5’和3’两端分别加上KpnI和MluI两个酶切位点。

实施例2重组菌株的构建和筛选

合成后的质粒用限制性内切酶KpnI和MluI(Fermentas)进行酶切；同时，用限制性内切酶KpnI和MluI对载体pCI1G进行酶切；凝胶回收目的基因片段和载体；并用T4DNA连接酶将上述两片段连接，转化DH5α大肠杆菌，用氨苄青霉素进行筛选。为确保准确，对若干克隆进行测序(Invitrogen)。

使用质粒中量制备试剂盒(Axygen)从测序结果正确的大肠杆菌克隆中纯化质粒，将纤维素酶重组表达质粒命名为pCIG-MEGV。

2.1原生质体制备

取纤维素酶基因缺陷型的宿主菌里氏木霉(Trichoderma reesei)孢子悬液，接种于PDA平板上生长6天；切取直径约3cm的菌落置于约60mlYEG(0.5％酵母粉、1％葡萄糖)的液体培养基中，30℃、200rpm振荡培养过夜；多层纱布过滤收集菌丝；将菌丝置于盛有10-20ml裂解酶液(Sigma L1412)酶解2-3小时；取出酶解液，加入0.7M NaCl溶液，轻轻摇晃，倒于三层灭菌擦镜纸过滤，收集滤液，3000rpm，离心10min；弃上清，加10-20ml STC液(20％蔗糖，50mM Tris-Cl，50mM CaCl₂)悬浮，3000rpm，离心10min；加适量STC悬浮分装(150μl/管，10⁸个/ml)。

2.2转化与验证

取2μg pCI1G::MEGV加入到150μl原生质体中，接着加入500μl 25％PEG轻轻混匀，室温静置25min；然后分2-3次再加1ml 25％PEG，轻轻混匀，室温静置25min，把原生质体加到50ml左右熔化后冷却至45-55℃的上层半固体培养基(0.1％MgSO₄,1％KH₂PO₄,0.6％(NH₄)₂SO₄,1％葡萄糖,18.3％山梨醇,0.35％琼脂糖)，轻轻混匀后倒入含100μg/ml潮霉素下层基础培养基平板(2％葡萄糖，0.5％(NH₄)₂SO₄,1.5％KH₂PO₄,0.06％MgSO₄,0.06％CaCl₂，1.5％琼脂)，28℃黑暗培养数天至转化子长出。

利用实施例1所述引物HIEGV-F和HIEGV-R进行PCR扩增目的基因。PCR扩增条件为95℃4min；94℃30S；59℃40S，72℃1min 30个循环；72℃7min。利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物并进行测序分析，构建得到了含纤维素酶突变体基因的里氏木霉工程菌，将其命名为里氏木霉MEGV(Trichoderma reesei MEGV)。

采用上述同样的方法构建得到重组表达野生型纤维素酶的里氏木霉工程菌，命名为里氏木霉HIEGV(Trichoderma reesei HIEGV)。

实施例3纤维素酶突变体发酵验证

将上述里氏木霉工程菌MEGV与里氏木霉工程菌HIEGV接种于PDA平板，30℃培养6d，待孢子丰富后，取两块直径1cm的菌丝块接种于含有50mL发酵培养基的250mL三角瓶中(1.5％葡萄糖，1.7％乳糖，2.5％玉米浆，0.44％(NH4)2SO4，0.09％MgSO4，2％KH2PO4，0.04％CaCl2，0.018％吐温-80，0.018％微量元素)，30℃培养48小时，然后25℃培养48小时，将发酵液离心，取上清液进行SDS-PAGE电泳检测。结果如图1所示，泳道1，2分别为HIEGV和MEGV发酵上清液，由图可见：在40KDa处均有一明显蛋白条带，与本发明重组表达的纤维素酶的理论分子量大小一致。

(1)酶活测定方法

在50℃、pH值为4.8(中性为pH6.0)的条件下，每分钟从浓度为5mg/ml的羟甲基纤维素钠溶液中降解释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U，还原糖以葡萄糖等量。

取三支试管各加入0.5mL CMC底物，与待测酶液一起50℃水浴预热5min。在第一、二试管中各加入0.5mL待测液，并计时，50℃水浴中反应15min。反应完后在三支试管中各加入1.5mLDNS试剂，并在第三支试管总补加0.5mL的待测酶液。取出并摇匀三支试管后，在沸水浴中反应5min。迅速冷却至室温，用水定到5.0mL。以第三支试管试液为对照在540nm波长条件下测第一、二试管试液的吸光度，吸光度在0.25-0.35之间为宜。待测酶液反应液的吸光度与水平控制酶液反应液吸光度之差的绝对值不超过0.015。

酶活X＝(葡萄糖等量值/180/15/0.5)×n

其中：X——酶活力单位，IU/g(mL)；

180——葡萄糖从微克换算成微摩尔；

15——待测液与底物的反应时间；

0.5——加入反应的待测酶液量；

n——稀释倍数；

(2)酶活测定结果

采用上述方法检测上述发酵上清液的酶活，结果显示：纤维素酶基因缺陷型宿主菌里氏木霉(Trichoderma reesei)发酵上清液中几乎检测不出纤维素酶酶活，重组表达野生型纤维素酶的里氏木霉工程菌HIEGV发酵上清液酶活为123U/mL(pH6.0)，而重组表达纤维素酶突变体的里氏木霉工程菌MEGV发酵上清液酶活为169U/mL(pH6.0)。

实施例4酶学性质分析

1、最适作用pH值

分别用pH值为3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的缓冲液稀释里氏木霉工程菌HIEGV和里氏木霉工程菌MEGV的发酵上清液，在50℃条件下测定其酶活，以最高酶活为100％，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线。结果如图2所示，纤维素酶突变体的最适作用pH为6.6，在pH4.5-8.0范围内，均能保持60％以上的酶活水平；而野生型纤维素酶的最适作用pH为5.5，仅在pH4.5-7.5范围内能维持40％以上的酶活，且在pH6.0-8.0范围内，酶活下降明显，至pH8.0时，酶活仅剩20％。与野生型相比，本发明所述纤维素酶突变体在碱性条件下的适用范围更加宽泛。

2、加速稳定性实验

分别将里氏木霉工程菌HIEGV和里氏木霉工程菌MEGV的发酵上清液，加入3‰苯甲酸钠和3‰山梨酸钾后放置在40℃水浴中，测定不同时间、pH6.0条件下测定酶活，以最高酶活为100％，计算相对酶活，做时间-相对酶活曲线。结果如图3所示，本发明所述纤维素酶突变体40℃水浴30天仍能保持88％的酶活，而野生型在同样条件下30天后酶活仅剩60％左右，且在15天后酶活降低显著。与野生型相比，本发明所述纤维素酶突变体具有更高的耐热性。

综上所述，与野生型相比，本发明所述纤维素酶突变体在碱性条件下的适用范围更加宽泛，且具有更高的耐热性和稳定性。

实施例5纤维素酶突变体应用于洗涤剂中的护色效果验证实验

1、实验材料：

1)纤维素酶样品：市售国外纤维素酶产品：酶活500U/ml；

本发明所述纤维素酶突变体：酶活500U/ml；

本发明所述野生型纤维素酶：酶活500U/ml。

2)白猫浓缩粉

3)循环洗涤实验污布：白棉布(GB/T7568.2-2008)

2、循环洗涤实验条件：

将上述纤维素酶样品分别按比例添加到白猫浓缩粉中，通过循环洗涤的方法(GB/T 13174-2008)确定纤维素酶对布料的护色效果。

3、以白色棉布为例，实验结果如下：

表1不同纤维素酶循环洗涤白色棉布洗后与洗前白度差值(⊿Wr)

备注：1、在循环洗涤实验中每次每只去污缸中都会加入5ml碳黑油污液来模拟实际污垢，洗涤过程中碳黑油污液或多或少会吸附或沉积在织物纤维上，所以洗后与洗前的原布相比，颜色会发暗(排除增白剂的影响)。

2、当⊿Wr为负值时，│⊿Wr│绝对值越小，表明洗后与洗前的白度差值越小，护色纤维素酶的增白效果越明显。

从表1的数据可以看出，循环洗涤10次和15次后，添加纤维素酶样品的实验组1-4白色棉布洗后与洗前白度差值绝对值均小于对照组，说明纤维素酶确实具有一定的护色效果。其中，添加纤维素酶突变体的实验组3和4的白度差值绝对值均明显小于添加野生型纤维素酶和国外纤维素酶产品的实验组1和2。从而说明，与野生型相比，本发明所述纤维素酶突变体的护色效果得到显著提升，取得了意料不到的技术效果。

本发明所述纤维素酶突变体在碱性条件下的酶活力得到显著提高，且稳定性更好，不仅具有良好的去污作用，还具有使纤维织物清洁、柔顺，且护色效果显著，可广泛应用于洗涤工业领域。

Claims

1.一种纤维素酶突变体，其特征在于，所述的纤维素酶突变体是氨基酸序列为SEQ IDNO：1的纤维素酶的第23位氨基酸由Pro变为Gly，第67位氨基酸由Asp变为Asn，第69位氨基酸由Ala变为Ser，第158位氨基酸Arg变为Ser。

2.如权利要求1所述的纤维素酶突变体，其特征在于，所述的纤维素酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：3。

3.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的纤维素酶突变体。

4.如权利要求3所述的基因，其特征在于，所述的基因的核酸序列为SEQ ID NO：4。

5.一种质粒，其特征在于，所述的质粒携带有权利要求3所述的基因。

6.一种重组里氏木霉，其特征在于，所述的重组里氏木霉是将权利要求5所述的质粒转入里氏木霉(Trichoderma reesei)中构建的。

7.权利要求1所述的纤维素酶突变体在制备洗涤剂中的应用。