CN102159707A

CN102159707A - 木质素所致失活降低的第6家族纤维素酶

Info

Publication number: CN102159707A
Application number: CN2009801370696A
Authority: CN
Inventors: 詹姆斯·拉维涅; 布赖恩·斯克特; 马丁内·惠塞尔; 约翰·托马舍克
Original assignee: Iogen Energy Corp
Current assignee: Iogen Energy Corp
Priority date: 2008-08-01
Filing date: 2009-07-30
Publication date: 2011-08-17
Also published as: WO2010012102A1; AU2009276270A1; CA2732082A1; US8110389B2; EP2318523A4; MX2011001006A; EP2318523A1; BRPI0917395A2; US20100041100A1

Abstract

本发明提供了经修饰的里氏木霉(Trichoderma reesei)第6家族(TrCel6A)纤维素酶，其包含选自SEQ ID NO：1的129、322、363和410位中一个或多个位置处的氨基酸替换。本发明还提供了基因构建物和遗传修饰微生物，其包含编码经修饰TrCel6A纤维素酶的核酸序列。相对于衍生出经修饰TrCel6A的纤维素酶的亲本TrCel6A纤维素酶，本发明的经修饰TrCel6A纤维素酶显示木质素所致失活降低至少15％。此类纤维素酶在多种下述工业应用中具有用途，即要求在木质素存在时的纤维素酶促水解活性，例如，用于生产可发酵糖、糖醇类、燃料酒精的经预处理的木质纤维素原料的水解。

Description

木质素所致失活降低的第6家族纤维素酶

技术领域

本发明涉及经修饰的第6家族纤维素酶(Family 6 cellulase)。更具体地说，本发明涉及木质素所致失活降低的经修饰的里氏木霉(Trichoderma reesei)第6家族(TrCel6A)纤维素酶。本发明还涉及基因构建物，其包含编码经修饰TrCel6A纤维素酶的核苷酸序列，还涉及从宿主菌株中生产经修饰纤维素酶的方法和经修饰TrCel6A纤维素酶在木质纤维素底物水解中的用途。

背景技术

地球上超过一半的有机碳被发现存在于植物的细胞壁中。植物细胞壁包括三种主要的化合物：纤维素、半纤维素和木质素。这些化合物被统称为“木质纤维素”，它们代表了用于发酵制备乙醇或其它高值产品的糖和其它有机分子的潜在来源。

由于纤维素乙醇的环境友好性和可持续性，木质纤维素生物质向乙醇的转化已成为新能源政策的关键特征。目前正在开发若干技术用于纤维素的转化。值得关注的有以下方法，通过将木质纤维素生物质预处理，而提高其对水解酶的敏感性，而后酶促水解成糖，这些糖再被发酵成乙醇或其它高值有机分子(例如丁醇)。常见的预处理方法包括稀酸蒸汽爆破(Dilute acid steam explosion，美国专利编号4,461,648)、氨冷冻爆破(Ammonia freeze explosion，AFEX；Holtzapple et al.，1991)和有机溶剂萃取(Organosolv extraction，美国专利编号4,409,032)。水解和发酵系统可以是独立的(依次水解和发酵(Sequential hydrolysis and fermentation，SHF))，也可以是同时发生的(同时糖化和发酵(Simultaneous saccharification and fermentation，SSF))。在所有情况下，半纤维素和纤维素被分解成可发酵糖，同时木质素被分离出来并且可以用作固体燃料或作为其它有机分子的来源。

对于将经预处理的木质纤维素生物质转化成糖的酶的选择在很大程度上取决于预处理的方法。稀酸蒸汽爆破引起了半纤维素的显著化学水解，因此使得用于将半纤维素转化为糖类的酶与此过程关系不大。相比之下，AFEX和有机溶剂萃取都保留了半纤维素和纤维素的大致完整性。与稀酸蒸汽爆破或AFEX不同，有机溶剂萃取从底物中去除了相当一部分的木质素。在所有情况下，酶促水解的主要目标是纤维素，使用纤维素酶的组合将其转化为糖类。

纤维素酶有两种基本类型：内切葡聚糖酶，其切割纤维素链中间的糖苷键，并且这样做时，产生了新的链末端；纤维二糖水解酶，其从纤维素链的末端切下短的寡糖。葡萄糖苷酶将短的寡糖消化成单糖。因此，这三种酶组分协同作用产生高效的纤维素水解酶系统。大多数纤维素酶具有相似的模块结构，其由催化结构域、连接肽和糖结合模块(Carbohydrate-binding module，CBM)组成。

经修饰的纤维素酶和修饰的方法已有广泛描述。例如，已有报道改善热稳定性的里氏木霉Cel7A和Cel6A的变体(美国专利编号7,375,197；WO 2005/028636，美国专利公开编号2007/0173431；美国专利公开编号2008/167214，WO 2006/074005；美国专利公开编号2006/0205042；美国专利编号7,348,168；WO 2008/025164)。特别是，在里氏木霉Cel6A的第413位使用脯氨酸替代丝氨酸，或在其它的第6家族纤维素酶中使用脯氨酸替代等同于第413位上的氨基酸以赋予增强的热稳定性(WO2008/025164)。已有显示，在里氏木霉Cel6A和其它第6家族纤维素酶的催化结构域中在等同于103、136、186、365和410位的位置上的突变引起葡萄糖所致抑制作用的降低(美国专利公开编号2009/0186381)。已创造出对用于去污剂制剂的蛋白酶和表面活性剂具有抗性的变体，以用于纺织应用(WO99/01544，WO 94/07998和美国专利号码6,114,296)。

木质素对纤维素酶系统的负面影响是证据充分的。从硬木中(白杨)去除木质素显示出增加酶促水解的糖产量(Kong et al.，1992)。同样，从软木中(花旗松(Douglas fir))去除木质素显示出提高纤维素的酶促水解，此作用归因于酶对纤维素的可接近性的提高(Mooney et al.，1998)。其它研究小组已证实，从里氏木霉中纯化的纤维素酶与分离的木质素结合(Chernoglazov et al.，1988)，并已推测了不同结合结构域在酶-木质素相互作用中的功能(Palonen et al.，2004)。当木质素被加回到纯化的纤维素系统中时，已观察到里氏木霉(Trichoderma reesei)纤维素酶与木质素的结合以及失活(Escoffier et al.，1991)。仅有一例报导称，木质素对纤维素酶没有显著影响(Meunier-Goddik and Penner，1999)。其它研究报告表明，一些半纤维素酶可以对木质素和木质素分解产物具有抗性，甚至可被它们激活(Kaya et al.，2000)。因此，一般认为，木质素是纤维素的酶促水解的严重限制因素。

据报道，CBM参与木质素的结合。例如，从木霉属(Trichoderma)Cel7A中去除CBM基本上消除了其与碱提取的木质素的结合，以及其与通过酶促水解制备的残余木质素的结合(Palonen et al.，2004)。

另据报道，催化结构域也参与木质素的结合。不具有CBM的来自腐质霉属(Humicola sp.)的Cel7B与木质素广泛结合(Berlin et al.，2005b)。同样，缺乏CBM的木霉属Cel5A核心不结合酶促木质素(enzymic lignin)，相比于全长蛋白质，只能较小程度地与碱提取的木质素结合(Palonen et al.，2004)。

在将纤维素转化为包括葡萄糖在内的可溶性糖类以用于生产乙醇和其它产品的商业化中，开发保留纤维素结合亲和力和天然纤维素水解活性的抗木质素的纤维素酶是一个重大障碍。已提出了多种方法来减少木质素对纤维素酶系统的负面影响。非特异性结合蛋白(如牛血清白蛋白，BSA)已显示出阻断纤维素酶和木质素表面之间的相互作用(Yang and Wyman，2006；US 24185542 A1；US 26088922 A1；WO 05024037 A2，A3；WO 09429474 A1)。其它化学阻断剂和表面活性剂已显示出具有类似的效果(Tu et al.，2007；US 7,354,743)。虽然已提出要寻找和鉴定纤维素酶的木质素抗性变体(Berlin et al.，2005a)，但在这方面之前尚未有成功工作的记录。

发明内容

本发明涉及经修饰的纤维素酶。更具体地说，本发明涉及木质素所致失活降低的经修饰里氏木霉第6家族(TrCel6A)纤维素酶。本发明还涉及基因构建物，其包含编码经修饰TrCel6A纤维素酶的核苷酸序列，还涉及从宿主菌株中生产经修饰纤维素酶的方法和经修饰TrCel6A纤维素酶在木质纤维素底物的水解中的用途。

本发明的一个目的是提供经修饰TrCel6A纤维素酶，其具有降低的木质素所致失活。

本发明涉及包含一个或多个氨基酸替换的经修饰TrCel6A纤维素酶，其中氨基酸替换选自：

用中性或酸性氨基酸替换129和410位中一个或多个位置处的碱性氨基酸；

用酸性氨基酸替换322和363位中一个或多个位置处的中性氨基酸；以及

用苏氨酸替换186位的氨基酸；

所述经修饰TrCel6A纤维素酶具有显示与SEQ ID NO：1的83-447位氨基酸具有约47％至约99.9％的序列同一性的氨基酸序列。此外，经修饰TrCel6A纤维素酶可包含一个或多个氨基酸替换，其选自：K129E、S186T、A322D、Q363E、R410G和R410Q。经修饰TrCel6A纤维素酶能够使用转化机制水解多糖。

上文定义的一个或多个氨基酸替换的位置可以根据亲本TrCel6A纤维素酶的SEQ ID NO：1中83-447位氨基酸所对应氨基酸与包含如SEQ ID NO：1中所定义的里氏木霉Cel6A催化结构域的的83-447位氨基酸的序列比对来确定。

经修饰TrCel6A纤维素酶可以来自亲本TrCel6A纤维素酶，除了129、186、322、363或410位中的一个或多个位置上天然氨基酸的替换之外，其与经修饰的TrCel6A纤维素酶相同。例如，本发明包括如上所述的经修饰TrCel6A纤维素酶，其进一步包含一个或多个氨基酸替换，其中氨基酸替换选自：Y103H、Y103K、Y103R、Y103A、Y103V、Y103L、Y103P、L136V、L136I和S413P或除129、186、322、363或410位之外的位置上的任何额外突变，只要该酶显示Cel6A纤维素酶活性。

本发明还涉及经修饰TrCel6A纤维素酶，如上所定义，相对于衍生出经修饰TrCel6A纤维素酶的亲本TrCel6A纤维素酶，其显示木质素所致失活程度降低至少15％。

本发明还涉及经修饰的第6家族纤维素酶，其选自：

TrCel6A-K129E-S413P(SEQ ID NO：37)；

TrCel6A-S186T-S413P(SEQ ID NO：38)；

TrCel6A-A322D-S413P(SEQ ID NO：39)；

TrCel6A-Q363E-S413P(SEQ ID NO：40)；

TrCel6A-R410G-S413P(SEQ ID NO：41)；

TrCel6A-R410Q-S413P(SEQ ID NO：42)；

TrCel6A-K129E-S186T-A322D-Q363E-S413P(SEQ ID NO：43)；和

TrCel6A-K129E-S186T-A322D-Q363E-R410Q-S413P(SEQ ID NO：44)。

本发明涉及基因构建物，其包含编码经修饰TrCel6A纤维素酶的核酸序列，其中经修饰TrCel6A纤维素酶包含一个或多个氨基酸替换，其选自：

用苏氨酸替换186位的氨基酸；

所述经修饰TrCel6A纤维素酶具有显示与SEQ ID NO：1的83-447位氨基酸的47％至99.9％同一性的氨基酸序列。该核酸序列可有效连接至调控其表达以及从宿主微生物中分泌的其它核酸序列。调控经修饰TrCel6A纤维素酶表达和分泌的其它核酸序列可以来自于用于表达经修饰TrCel6A纤维素酶的宿主微生物。该宿主微生物可以是酵母，例如酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，或丝状真菌，如里氏木霉(Trichoderma reesei)。

本发明还涉及如上所定义的基因构建物，其中，由该基因构建物编码的经修饰TrCel6A纤维素酶还包含一个或多个氨基酸替换，其选自Y103H、Y103K、Y103R、Y103A、Y103V、Y103L、Y103P、L136V、L136I和S413P，或在除了第129、186、322、363或410位之外的位置上的任何额外突变，只要该酶具有Cel6A纤维素酶活性。

本发明还涉及遗传修饰微生物，其包含编码经修饰TrCel6A纤维素酶基因构建物，并能表达和分泌包含一个或多个氨基酸替换的经修饰TrCel6A纤维素酶，所述氨基酸替换选自：

用酸性氨基酸替换322和363位中一个或多个位置处的中性氨基酸；和

用苏氨酸替换186位的氨基酸；

所述经修饰TrCel6A纤维素酶具有显示与SEQ ID NO：1的83-447位氨基酸的47％至99.9％同一性的氨基酸序列。在一个实施方案中，该遗传修饰微生物能够表达和分泌另外包含一个或多个氨基酸替换的经修饰TrCel6A纤维素酶，所述氨基酸替换选自：Y103H、Y103K、Y103R、Y103A、Y103V、Y103L、Y103P、L136V、L136I和S413P，或除了129、186、322、363或410位之外的位置上的任何额外突变。该遗传修饰微生物可以是酵母或丝状真菌。例如，遗传修饰微生物可以是酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、木霉属(Trichoderma)、肉座菌属(Hypocrea)、曲霉属(Aspergillus)、镰刀菌属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)或脉孢菌属(Neurospora)的物种。

本发明还涉及在木质素存在的条件下用经修饰TrCel6A纤维素酶水解纤维素的方法。

本发明还涉及生产如上所定义的经修饰TrCel6A纤维素酶的方法，其包括使用包含编码经修饰TrCel6A纤维素酶之DNA序列的基因构建物转化酵母或真菌宿主，选择表达经修饰TrCel6A纤维素酶的重组酵母或真菌菌株，在诱导经修饰TrCel6A纤维素酶表达的条件下在深层液体发酵中培养所选重组菌株，以及通过将培养物滤液与宿主微生物分离来回收所生产的经修饰TrCel6A纤维素酶。

本发明人发现，在129、322、363或410位的碱性或中性氨基酸的替换或由苏氨酸替换186位的氨基酸，使得相对于衍生出经修饰TrCel6A纤维素酶的亲本TrCel6A纤维素酶，经修饰TrCel6A纤维素酶的木质素所致失活程度降低。如图8所示，所有这些氨基酸都位于TrCel6A纤维素酶的表面。

相对于衍生出经修饰TrCel6A纤维素酶的亲本TrCel6A纤维素酶，本发明的经修饰TrCel6A纤维素酶可显示出木质素所致失活程度降低至少15％。相对于衍生出经修饰TrCel6A纤维素酶的亲本TrCel6A纤维素酶，该降低的木质素失活有助于在含有经修饰TrCel6A纤维素酶、纤维素和木质素的水解反应中增加纤维素底物水解的活性。

此类TrCel6A纤维素酶在多种下述工业应用中具有用途，即要求在木质素存在时的高纤维素水解活性。例如，如本文所述，经修饰TrCel6A纤维素酶可以用于工业过程，其中木质纤维素底物转化为用于燃料酒精、糖醇类或其它产品生产的可发酵糖。

附图说明

通过参考附图的下述说明，本发明的这些和其它特征将更加明显，所述附图中：

图1显示了来自糖基水解酶第6家族的所选真菌纤维素酶的氨基酸序列与共有的第6家族纤维素酶序列的比对。在比对的序列下显示了在36种真菌第6家族纤维素酶中，氨基酸在共有第6家族纤维素酶的各个位置上出现频率的图示。用箭头表示了TrCel6A中等同175和221位上的催化性天冬氨酸残基。用星号表示了TrCel6A中等同129、186、363、322和410位上的高度保守氨基酸。对于具有纤维素结合结构域的纤维素酶，仅给出了催化核心序列。

图2描述了质粒YEp352/PGK91-1ΔNheI-α_ss-TrCel6A-S413P，其指导重组酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中天然和经修饰TrCel6A的表达和分泌。

图3含有两个散点图。A图是高通量检测1(实施例6)中经BSA处理的木质素(+BSA)存在时的酶活性与未经处理木质素(-BSA)存在时的酶活性的散点图。该数据涉及一个96孔培养板的筛选，其中96孔培养板中含有亲本(TrCel6A-S413P)和经修饰TrCel6A纤维素酶或来自空载体转化体的过滤物(阴性对照)。B图是高通量检测2(实施例7)中在经BSA处理的木质素(+BSA)存在时的酶活性与未经处理木质素(-BSA)存在时的酶活性的散点图。该数据涉及一个96孔培养板的筛选，其中96孔培养板中含有亲本(TrCel6A-S413P)和经修饰TrCel6A纤维素酶或来自空载体转化体的过滤物(阴性对照)。

图4是柱状图，其显示了由高通量检测1(实施例6)所测定的相对于亲本TrCel6A-S413P纤维素酶的±BSA木质素比值进行归一化的经修饰TrCel6A纤维素酶的±BSA木质素比值。

图5含有两个散点图。A图是高通量检测1(实施例6)中经BSA处理的木质素(+BSA)存在时的酶活性与未经处理木质素(-BSA)存在时的酶活性的散点图。该数据涉及经修饰纤维素酶TrCel6A-K129E-S186T-A322D-Q363E-S413P与亲本纤维素酶TrCel6A-S413P的筛选。B图是高通量检测2(实施例7)中经BSA处理的木质素(+BSA)存在时的酶活性与未经处理木质素(-BSA)存在时的酶活性的散点图。该数据涉及经修饰的纤维素酶TrCel6A-K129E-S186T-A322D-Q363E-S413P、TrCel6A-K129E-S186T-A322D-Q363E-R410Q-S413P与亲本纤维素酶TrCel6A-S413P的筛选。

图6显示了TrCel6A-S413P和TrCel6A-K129E-S 186T-A322D-Q363E-R410Q-S413P的木质素失活时间过程结果。如实施例9所述，测量木质素浆液中残余TrCel6A活性相对于时间的函数，并进行分析。

图7是在木质素失活作用时间过程检测中所测定的经修饰TrCel6A纤维素酶和TrCel6A-S413P的相对KL和相对比活性的散点图。

图8使用来自PDB文件1CB2的坐标显示了里氏木霉Cel6A晶体结构的空间填充模型(CPK)。右侧图是左侧图围绕其中心垂直轴旋转180度。

图9显示了用于36种第6家族纤维素酶氨基酸序列中对应于SEQ ID NO：1中83-447位氨基酸的氨基酸之间相互比对的同一性矩阵。

图10显示了纯化的亲本和经修饰TrCel6A酶的10％SDS-PAGE凝胶。通过10％的SDS-PAGE分离纯化的TrCel6A纤维素酶(各5μg)，用考马斯亮蓝R250对凝胶进行染色。在此图中，TrCel6A聚集体1(泳道10)和TrCel6A聚集体2(泳道11)分别指TrCel6A-K129E-S186T-A322D-Q363E-S413P和TrCel6A-K129E-S186T-A322D-Q363E-R410Q-S413P。显示了从木霉中纯化的TrCel6A(泳道2)和分子质量标准品(泳道1)用于参考。

具体实施方式

本发明涉及经修饰的纤维素酶。更具体地说，本发明涉及木质素所致失活降低的经修饰里氏木霉第6家族(TrCel6A)纤维素酶。本发明还涉及基因构建物，其包含编码经修饰TrCel6A纤维素酶的核酸序列，还涉及从宿主菌株中生产经修饰纤维素酶的方法和经修饰TrCel6A纤维素酶在木质素存在时的纤维素水解中的用途。

本发明提供了木质素所致失活降低的经修饰TrCel6A纤维素酶，从而在包含经修饰TrCel6A纤维素酶、纤维素和木质素的水解反应中，提供了与等同组成的水解反应中衍生出经修饰TrCel6A纤维素酶的亲本TrCel6A纤维素酶相比，增强的纤维素水解活性。

下面描述了优选实施方案，其仅为举例而不作为对实施本发明所必须的特征组合的限制。

经修饰TrCel6A纤维素酶

如果纤维素酶在它的蛋白质一级、二级和三级结构中与其它第6家族纤维素酶表现出相似性，则将其归为第6家族纤维素酶。例如，所有第6家族纤维素酶包含两个可作为催化残基的天冬氨酸(D)残基。发现这些天冬氨酸残基位于175和221位(见图1；基于TrCel6A，Trichoderma reesei Cel6A，氨基酸编号)。迄今为止，大部分所鉴定的第6家族纤维素酶是嗜中温的，然而，该家族还包括来自嗜热放线菌(Thermobifida fusca)的热稳定性纤维素酶(TfCel6A和TfCel6B)和来自特异腐质霉(Humicola insolens)的嗜碱性纤维素酶(HiCel6A和HiCel6B)。第6家族纤维素酶也共有类似的三维结构：α/β-桶和中央β-桶，其含有通过五个α-螺旋相连的七个平行的β-链。有几种第6家族纤维素酶的三维结构是已知的，如TrCel6A(Rouvinen，J.，et al.，1990)、嗜热放线菌(Thermobifida fusca)内切-β-1，4-葡聚糖酶Cel6A(TfCel6A，Spezio，M.，et al.，1993)、特异腐质霉(Humicola insolens)纤维二糖水解酶Cel6A(HiCe16A，Varrot，A.，et al.，1999)、特异腐质霉内切-β-1，4-葡聚糖酶Cel6B(HiCe16B，Davies，G.J.，et al.，2000)和结核分支杆菌(Mycobacterium tuberculosis)H37Rv Cel6A(MtCeI6A，Varrat，A.，et al.，2005)。

表1：真菌第6家族纤维素酶与TrCel6A的氨基酸序列同一性百分比

如图1所示，在第6家族纤维素酶之间，一级氨基酸序列具有高度保守性。目前已知的真菌来源的36种第6家族纤维素酶氨基酸序列间的多重比对结果显示，大部分天然第6家族纤维素酶表现出与TrCel6A中包含催化结构域的83-447位氨基酸具有约47％至约100％的氨基酸序列同一性(表1)，并且与至少一种其它第6家族纤维素酶具有约70％至100％的氨基酸序列同一性。细菌来源的第6家族纤维素酶与TrCel6A或其它真菌来源的第6家族纤维素酶显示低得多的氨基酸序列同一性。TrCel6A是糖苷水解酶第6家族的成员，其包含通过异头构型的转化来水解β-1，4糖苷键的酶，在此称为“转化机制(Inverting mechanism)”。第6家族糖苷水解酶由作为此类酶标准命名法而接受的CAZy系统定义(见URL：cazy.org)。

“TrCel6A编号”，是指对应于根据TrCel6A的氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的氨基酸位置的编号。如下文所述，从图1显而易见，第6家族纤维素酶表现出了显著的序列相似性。因此，通过比对氨基酸以优化纤维素酶的第6家族催化结构域之间的序列相似性，以及通过使用TrCel6A的氨基酸编号作为编号的基础，可以相对于TrCel6A确定其它第6家族纤维素酶中氨基酸的位置。

比对氨基酸序列的方法是众所周知的，并且本领域的技术人员可获得，其包括适用于比对两个序列的BLAST(Basic Local Alignment Search Tool，基本的局部比对搜索工具，URL：blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.chi；Altschul et al.，1990；使用公开的默认设置)，和用于两个或更多序列比对的CLUSTALW(URL：ebi.cak.ak/Tools/clustalw2/index.html)。

“经修饰TrCel6A纤维素酶”或“经修饰纤维素酶”，是指SEQ ID NO：1的里氏木霉第6家族纤维素酶，其包含一个或多个选自下列的氨基酸替换：

用中性或酸性氨基酸替换129和410位中一个或多个位置的碱性氨基酸；

用酸性氨基酸替换322和363位中一个或多个位置的中性氨基酸；和

用苏氨酸替换186位的氨基酸。

例如(但不应被认为是限制性的)，经修饰TrCel6A纤维素酶可包含一个或多个氨基酸替换，其选自：K129E、S186T、A322D、Q363E、R410G和R410Q。

本文所定义的“碱性氨基酸”是指组氨酸、赖氨酸和精氨酸中的任何一个，“酸性氨基酸”是指天冬氨酸和谷氨酸中的任何一个，以及“中性氨基酸”是指任何不是碱性氨基酸或酸性氨基酸的氨基酸。

可以理解，经修饰TrCel6A纤维素酶可以来自于野生型TrCel6A纤维素酶或来自于已经包含其它氨基酸替换的TrCel6A纤维素酶。

“经修饰TrCel6A纤维素酶”也可定义为能够使用转化机制水解多糖的酶，并且其具有通过基因工程技术引入的一个或多个选自下列的氨基酸替换：

用苏氨酸替换186位的氨基酸；

并且，其特征是具有下述氨基酸序列，即与TrCel6A氨基酸序列(SEQ ID NO：1)的83至447位氨基酸具有约47％至约99.9％的氨基酸序列同一性。例如，经修饰TrCel6A纤维素酶可与SEQ ID NO：1的83至447位氨基酸具有约47％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或99.9％的氨基酸序列同一性。本领域技术人员将会明白，可以通过添加、缺失或替换一个或多个氨基酸来修饰给定TrCel6A纤维素酶的氨基酸序列，并且仍视为经修饰TrCel6A纤维素酶，只要其保留了酶的基本结构和功能。

本发明经修饰TrCel6A纤维素酶由核酸序列编码，所述核酸序列可通过使用针对所需经修饰TrCel6A纤维素酶或相应亲本TrCel6A纤维素酶特定的遗传材料或核酸或氨基酸序列信息产生。如本领域的技术人员所知，使用一种或多种用于改变氨基酸序列的分子生物学技术，可将此类材料或序列信息用于生成编码所需经修饰TrCel6A纤维素酶的核酸序列，其中分子生物学技术包括，但不限于，定点诱变、盒式诱变、随机诱变、合成寡核苷酸构建物、克隆、亚克隆、通过PCR扩增、体外合成和其它基因工程技术(Eijsink VG，et al.，2005)。可以理解，经修饰TrCel6A纤维素酶可来自于任何TrCel6A纤维素酶，即它可以来自于天然或“野生型”的TrCel6A纤维素酶或来自于已经包含其它氨基酸替换的TrCel6A纤维素酶。

在本发明的一个实施方案中，经修饰TrCel6A纤维素酶包含与SEQ ID NO：1的83至447位氨基酸具有约70％至约99.9％同一性的氨基酸序列，并且相对于衍生出经修饰TrCel6A纤维素酶的亲本TrCel6A纤维素酶，显示木质素所致失活程度降低至少15％。所述经修饰TrCel6A纤维素酶能够使用转化机制水解多糖。

在本发明的其它一些实施方案中，经修饰TrCel6A纤维素酶包含与SEQ ID NO：1的83至447位氨基酸具有约90％至约99.9％同一性的氨基酸序列，并且相对于衍生出经修饰TrCel6A纤维素酶的亲本TrCel6A纤维素酶，显示木质素所致失活程度降低至少15％。所述经修饰TrCel6A纤维素酶能够使用转化机制水解多糖。

“野生型”或“天然”TrCel6A纤维素酶，是指不具有任何氨基酸替换的SEQ ID NO：1的纤维素酶。

出于本发明的目的，“亲本TrCel6A纤维素酶”或“亲本纤维素酶”是不包含经修饰TrCel6A纤维素酶中所存在的氨基酸替换的TrCel6A纤维素酶，所述氨基酸替换即选自下列的一个或多个氨基酸替换：

使用苏氨酸替换186位的氨基酸；

但在其它方面与经修饰TrCel6A纤维素酶一致。因此，亲本TrCel6A纤维素酶可以是在其它位置上含有通过基因工程技术或其它技术引入的氨基酸替换并且能够使用转化机制水解多糖的TrCel6A纤维素酶。例如，与129和410位的碱性氨基酸替换为中性或酸性氨基酸的经修饰TrCel6A纤维素酶相对应的亲本纤维素酶是在这两个位置不具有中性或酸性氨基酸的TrCel6A纤维素酶，但在其它方面与经修饰TrCel6A相同。然而，亲本纤维素酶和经修饰TrCel6A可含有其它位置的氨基酸替换，只要这些氨基酸替换在经修饰的和亲本纤维素酶中均存在即可。亲本纤维素酶也可以是野生型酶。通过将经修饰TrCel6A纤维素酶的活性与亲本纤维素酶的活性进行比较，其中亲本纤维素酶除了根据本发明引入的氨基酸替换之外与经修饰纤维素酶相同，可使用下述测定对这些氨基酸替换对木质素存在时酶活性的影响进行定量。

或者，在下述经修饰TrCel6A纤维素酶产生之后，随后，可进一步修饰所述经修饰TrCel6A纤维素酶，以含有其它的氨基酸替换。所述经修饰TrCel6A纤维素酶包含一个或多个选自下列的氨基酸替换：

使用中性或酸性氨基酸替换129和410位中一个或多个位置的碱性氨基酸；

使用酸性氨基酸替换322和363位中一个或多个位置的中性氨基酸；和

使用苏氨酸替换186位的氨基酸；

所述经修饰TrCel6A纤维素酶能够使用转化机制水解多糖。

针对可在何处在给定TrCel6A纤维素酶中引入其它氨基酸替换(除129、186、322、363和410位之外)以产生活性酶，为了协助本领域的技术人员，图1提供了真菌来源的36种第6家族纤维素酶的比对，还提供了一个图表，其显示了每个位置处共有序列上每个氨基酸的出现频率。使用图1提供的信息，本领域的技术人员将识别出第6家族纤维素酶的低序列保守性区域，并可以在这些区域引入其它氨基酸，只要所述酶显示Cel6A纤维素酶活性。

降低木质素所致的TrCel6A纤维素酶失活

通过在有或没有木质素存在时测量纤维素或其它合适纤维素酶底物(如β-葡聚糖)的降解，然后获得有木质素存在时的活性与没有木质素存在时活性的比值，来确定木质素所致的经修饰TrCel6A纤维素酶失活的降低。该纤维素水解反应中存在的木质素可以是不溶性底物的一部分，如经预处理的木质纤维素中的，或以可溶性或不溶性形式分离的。如果木质素是分离的或纯化的，则通过测量等同水解反应中的纤维素酶活性来确定木质素所致的经修饰或亲本TrCel6A纤维素酶的失活，其中一个反应含有足够量的木质素以降低纤维素酶的活性。或者，可在对照反应中加入与未处理木质素等量的下述分离木质素，即通过使用非特异性的蛋白质如牛血清白蛋白(BSA)、表面活性剂或其它化学物质包被而处理成失活性降低的分离木质素。如果木质素是不溶性底物的一部分，则通过获取纤维素酶对漂白底物(从其中已去除木质素，例如，使用氧化剂如二氧化氯)的活性与纤维素酶对未漂白含木质素底物的活性之间的比值来确定木质素所致的经修饰或亲本TrCel6A纤维素酶的失活。木质素所致失活降低的经修饰TrCel6A纤维素酶显示比亲本TrCel6A纤维素酶更高的活性比(+未经处理的分离的木质素：没有木质素或经处理的木质素)。

有一些本领域技术人员已知的用于测量经修饰的和亲本TrCel6A纤维素酶活性的检测方法。然而，应该理解，本发明的实施不应受到用于评估经修饰TrCel6A纤维素酶活性的方法的限制。

例如，通过测量还原糖的酶依赖性释放来监测纤维素的水解，其在本领域技术人员已知的随后化学或化学酶检测中定量，其包括与二硝基水杨酸(dinitrosalisylic acid，DNS)反应。也可通过色谱法监测多糖的水解，所述色谱法分离并定量由酶活性所释放的可溶性单糖、二糖和寡糖。此外，可将可溶性比色底物掺于琼脂培养基中，在其上培养表达和分泌亲本或经修饰第6家族纤维素酶的宿主微生物。在该琼脂平板检测法中，纤维素酶的活性根据表达和分泌活性纤维素酶的微生物菌落周围的有色或无色的环来检测。

在分离的未处理的木质素(-BSA)和经处理的木质素(+BSA)存在的条件下，通过亲本TrCel6A-S413P和经修饰TrCel6A纤维素酶的相对纤维素水解活性的比较研究来确定129、186、322、363和410位的氨基酸替换对木质素所致亲本TrCel6A纤维素酶失活的影响，如实施例6所述。对于每种蛋白质，将两个活性的比值以亲本TrCel6A-S413P归一化为1.0。结果显示在图4中。所有经修饰的第6家族纤维素酶显示比值至少提高15％，所述比值为与未处理木质素预孵育后的活性：与BSA处理的木质素预孵育后的活性。

在一个优选的实施方案中，如在实施例6和7中所述的检测中所测量的，相对于亲本纤维素酶，经修饰TrCel6A纤维素酶显示出木质素所致失活降低至少15％。例如，相对于亲本纤维素酶，经修饰TrCel6A纤维素酶可显示出木质素所致失活降低约15％至约400％，或它们之间的任意数量。相对于亲本纤维素酶，经修饰TrCel6A纤维素酶可显示木质素所致失活降低15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、75％、100％、150％、200％、250％、300％、350％或400％。

编码经修饰的TrCel6A纤维素酶的基因构建物

本发明还涉及基因构建物，其包含编码经修饰TrCel6A纤维素酶的核酸序列。经修饰纤维素酶的编码核酸序列可有效连接至指导经修饰TrCel6A纤维素酶从宿主微生物中表达和分泌的调控核酸序列。所谓“调控DNA序列”是指启动子和编码分泌信号肽的DNA序列。优选地，该调控DNA序列在真菌宿主内是功能性的。调控DNA序列可来源于在工业发酵条件下在宿主微生物中高度表达和分泌的核酸序列。在一个优选的实施方案中，调控序列来源于一种或多种编码里氏木霉(Trichoderma reesei)纤维素酶或半纤维素酶的核酸序列。

如本领域技术人员公知的，所述基因构建物可另外包含编码选择标记的核酸序列以便能够分离经该构建物转化的遗传修饰微生物。选择标记可赋予遗传修饰微生物对抗生素的抗性或在缺乏对宿主有机体来说特定营养物的培养基上生长的能力，否则其不能在这些条件下生长。然而，本发明不受选择标记或编码选择标记之核酸序列的选择的限制，并且本领域技术人员可轻易地确定合适的标记。在一个优选的实施方案中，选择标记可赋予宿主微生物对潮霉素、腐草霉素、卡那霉素、遗传霉素或G418的抗性，回补宿主微生物在trp、arg、leu、pyr4、pyr、ura3、ura5、his或ade基因之一的缺陷或者赋予其在作为唯一氮源的乙酰胺上生长的能力。

所述基因构建物可另外包含其它核酸序列，例如，转录终止子、编码肽标签的核酸序列、连接多个核酸序列的合成序列、复制起点，等等。但是，应该认识到，本发明的实施不受存在这些其它核酸序列中任何一种或多种的限制。

产生经修饰TrCel6A纤维素酶的遗传修饰微生物

经修饰TrCel6A纤维素酶可以从遗传修饰微生物中表达和分泌，其中所述遗传修饰微生物通过使用编码经修饰TrCel6A纤维素酶的基因构建物转化宿主微生物而产生。宿主微生物可以是酵母或丝状真菌，特别是那些子囊菌门(Ascomycota)的成员。可用作表达本发明经修饰TrCel6A纤维素酶之宿主微生物的酵母属包括酵母属(Saccharomyces)、毕赤酵母属(Pichia)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、耶罗威亚酵母属(Yarrowia)、二形酵母属(Arxula)。可用作表达本发明经修饰TrCel3A β-葡萄糖苷酶之宿主微生物的真菌属包括木霉属(Trichoderma)、肉座菌属(Hypocrea)、曲霉属(Aspergillus)、镰刀菌属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、脉孢菌属(Neurospora)和青霉菌属(Penicillium)。通常，宿主微生物是一种缺失编码任何或所有第6家族纤维素酶之基因的微生物。在一个最优选的实施方案中，宿主微生物是里氏木霉(Trichoderma reesei)的工业菌株。

可以通过微生物转化领域技术人员已知的许多方法将基因构建物引入宿主微生物，其包括但不限于，使用氯化钙处理细胞、电穿孔、生物射弹轰击、聚乙二醇介导的原生质体融合(例如White et al.，WO2005/093072)。在选定表达经修饰TrCel6A纤维素酶的重组真菌菌株后，可以在诱导经修饰TrCel6A纤维素酶表达的条件下，在深层液体发酵中对其进行培养。优选地，在深层液体培养发酵中产生所述经修饰TrCel6A纤维素酶，并且在发酵结束时与细胞分离。可通过过滤、离心或其它本领域技术人员熟悉的程序分离细胞。然后在使用前浓缩(例如，通过超滤)、保存和/或稳定无细胞的含纤维素酶级分。

因此本发明还提供了用于生产经修饰TrCel6A纤维素酶的方法。该方法包括在诱导经修饰TrCel6A纤维素酶表达和分泌的条件下，在培养基中培养遗传修饰微生物，其中所述遗传修饰微生物包含编码经修饰TrCel6A纤维素酶的核苷酸序列，以及从培养基中回收经修饰TrCel6A纤维素酶。所述经修饰TrCel6A纤维素酶包含选自下列的一个或多个氨基酸替换：

用苏氨酸替换186位的氨基酸；

其中，经修饰TrCel6A纤维素酶的83-447位氨基酸与SEQ ID NO：1的83-447位氨基酸具有约47％至约99.9％的同一性。

经修饰TrCel6A纤维素酶的生产

可使用遗传修饰微生物以发酵方法产生本发明的经修饰TrCel6A纤维素酶，例如用深层液体培养物发酵，该遗传修饰微生物包含编码经修饰TrCel6A纤维素酶的基因构建物。

微生物(包括木霉(Trichoderma)及相关丝状真菌)的深层液体发酵，一般是以分批、补料-分批或连续培养的方法进行。在分批法中，除了好氧过程的氧气之外，在操作开始时将所有必要的材料置于反应器中，使发酵进行直到完成，此时收获产物。用于产生本发明经修饰TrCel6A纤维素酶的分批法可以在摇瓶或生物反应器中进行。

在补料-分批方法中，向培养物连续或不连续地补加一种或多种培养基组分而并不取出培养物。在连续培养的方法中，连续地补加新鲜培养基，并且连续地以等体积速率取出培养液，从而将培养物维持在稳定的生长速率上。

本领域技术人员知道，所述发酵培养基包括碳源、氮源以及可添加到发酵培养基以提高宿主细胞生长和酶生产的其它营养成分、维生素和矿物质。这些其它培养基组分可在接种宿主细胞之前，同时或之后添加。

对于生产本发明经修饰TrCel6A纤维素酶的方法，碳源可包括碳水化合物，其将诱导遗传修饰微生物中的基因构建物表达经修饰TrCel6A纤维素酶。例如，如果遗传修饰微生物是木霉(Trichoderma)菌株，碳源可包括纤维素、纤维二糖、槐糖(Sophorose)和已知在木霉中诱导纤维素酶和β-葡萄糖苷酶表达的相关寡糖或多糖中的一种或多种。

在分批发酵的情形中，碳源可以在接种之前或同时添加到发酵培养基。在补料-分批或连续培养的情形中，也可以在发酵过程中连续或间歇地提供碳源。例如，当遗传修饰微生物是木霉(Trichoderma)菌株，碳源的补给速率为0.2至2.5g碳/升培养物/小时，或其中的任何数量。

生产本发明的经修饰TrCel6A纤维素酶的方法可以在约20℃至约40℃或介于其间的任何温度下实施，例如，约25℃至约37℃或介于其间的任何温度，或在20、22、25、26、27、28、29、30、32、35、37、40℃或介于其间的任何温度。

生产本发明的经修饰TrCel6A纤维素酶的方法可以在约3.0到6.5的pH值或介于其间的任何pH下实施，例如，pH 3.5至pH 5.5，或介于其间的任何pH值，例如，pH值约为3.0、3.2、3.4、3.5、3.7、3.8、4.0、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5.0、5.2、5.4、5.5、5.7、5.8、6.0、6.2、6.5或介于其间的任何pH值。

发酵之后，可直接使用含有经修饰TrCel6A纤维素酶的发酵液，或者可将经修饰TrCel6A纤维素酶与真菌细胞分离，例如通过过滤或离心。可通过超滤除去发酵培养基中的低分子量溶质例如未消耗组分。可通过例如，蒸发、沉淀、沉降或过滤来浓缩所述经修饰的第6家族纤维素酶。可加入如甘油、蔗糖、山梨醇等化学物质以稳定纤维素酶。可向纤维素酶添加其它化学物质，如苯甲酸钠或山梨酸钾，以防止微生物污染的生长。

使用经修饰TrCel6A纤维素酶的纤维素水解方法

本发明的经修饰TrCel6A纤维素酶用于在另外包含木质素的水解反应中纤维素的酶促水解。例如，本发明的经修饰TrCel6A纤维素酶用于经预处理的木质纤维素底物的酶促水解。本发明的经修饰TrCel6A纤维素酶可用于工业过程，例如可发酵糖、糖醇类或燃料酒精的生产。

本发明的经修饰TrCel6A纤维素酶可用于“经预处理的木质纤维素底物”的酶促水解。经预处理的木质纤维素底物是植物来源的材料，在预处理之前，其至少包含20％的纤维素(干重)，更优选地含大于约30％的纤维素，更优选地含大于40％的纤维素，例如20、22、24、26、28、30、32、34、36、38、40、42、44、46、48、50、55、60、65、70、75、80、85、90％或任何其之间的百分比，且至少含10％的木质素(干重)，更典型地为至少12％(干重)，并已经过物理和/或化学处理，使纤维更容易获得和/或接受纤维素酶的作用。

预处理之后，木质纤维原料可能含有更高水平的纤维素。例如，如果采用酸预处理，则半纤维素组分水解，从而增加了纤维素的相对水平。在这种情况下，预处理原料可能含有大于约20％的纤维素和大于约12％的木质素。在一个实施方案中，经预处理的木质纤维原料包含大于20％的纤维素和大于约10％的木质素。

可用于本发明的木质纤维素原料包括但不限于农业残余物例如玉米秸秆、小麦秸秆、大麦秸秆、稻秸秆、燕麦秸秆、油菜秸秆和大豆秸秆；纤维工艺过程的残余物例如玉米纤维、甜菜浆、纸浆厂细屑和废渣或者甘蔗渣；林业残余物例如杨木、其它硬木、软木和木屑；草例如柳枝稷(Swith grass)、芒草(Miscanthus)、网茅草(Cord grass)和草芦(Reed canary grass)；或消费后的废弃纸制品。

首先通过下述方法减小木质纤维原料的尺寸，所述方法包括但不仅限于：碾、磨、搅拌、切碎、压缩/拉伸，或其它类型的机械作用。通过机械作用减小尺寸可通过适于此目的的任何类型设备进行，例如，但不限于，锤式粉碎机。

预处理过程的非限制性实例包括使用下列物质对木质纤维原料的化学处理，即硫酸或亚硫酸或其它酸；氨、石灰、氢氧化铵、或其它碱；乙醇、丁醇、或其它有机溶剂；或加压水(见美国专利编号4,461,648、5,916,780、6,090,595、6,043,392、4,600,590，Weil et al.，(1997))。

可进行预处理以水解存在于木质纤维素原料中的半纤维素，或其一部份，使其成为单糖，例如木糖、阿拉伯糖、甘露糖、半乳糖或它们的组合。优选地，进行预处理，使得半纤维素几乎完全水解且发生少量的纤维素向葡萄糖的转化。在预处理期间，通常用浆液中约0.02％(w/w)到约2％左右(w/w)或介于其间的任何数量的酸浓度进行木质纤维素原料的处理。酸可以是，但不仅限于，盐酸、硝酸或硫酸。例如，在预处理中使用的酸是硫酸。

对原料实施酸预处理的一个方法是使用美国专利编号为4,461,648陈述的处理条件进行蒸汽爆破(steam explosion)。另一种预处理原料浆液的方法包括连续预处理，意为连续泵动木质纤维原料通过反应器。连续酸预处理是本领域技术人员所熟悉的；参见，例如，美国专利编号5,536,325；WO 2006/128304；和美国专利编号4,237,226。根据需要，可使用其它本领域已知的技术，例如在美国专利编号4,556,430披露的工艺。

如上所述，可用碱进行预处理。与酸处理相反，碱预处理不水解原料中的半纤维素成分，而是碱与存在于半纤维素中的酸性基团反应从而打开底物的表面。碱的加入也可以改变纤维素的晶体结构，使之更易于水解。可用于预处理的碱的例子包括氨、氢氧化铵、氢氧化钾和氢氧化钠。优选地，不用不溶于水的碱进行预处理，例如石灰和氢氧化镁。

合适的碱预处理的一个例子具有多个名称：氨冷冻爆炸法(Ammonia freeze explosion)、氨纤维爆炸(Ammonia fiber explosion)或氨纤维膨胀(Ammonia fiber expansion)(“AFEX”法)，包括将木质纤维素原料与氨或氢氧化铵在压力容器中接触足以使得氨或氢氧化铵改变纤维素纤维晶体结构的时间。然后将压力迅速降低，这使得氨闪爆或沸腾并使纤维素纤维结构爆炸。(参见美国专利编号5,171,592、5,037,663、4,600,590、6,106,888、4,356,196、5,939,544、6,176,176、5,037,663和5,171,592)。然后闪爆的氨可以根据已知程序加以回收。

在预处理后酶促水解前，可通过多个步骤中的任意步骤处理经预处理的木质纤维素原料，所述步骤例如用水稀释、用水冲洗、缓冲、过滤或离心，或这些工艺的组合，如本领域的技术人员所熟悉的那样。

然后，对经预处理的木质纤维原料进行酶促水解。术语“酶促水解”是指通过纤维素酶作用于纤维素而将其全部或部分转换为可溶性糖的过程。可溶性糖意在包括水溶性己糖单体和最多六个单体单元的低聚物，其来源于经预处理的木质纤维素原料的纤维素部分。可溶性糖的例子包括但不限于，葡萄糖、纤维二糖、纤维糊精(Cellodextrins)或它们的混合物。可溶性糖可主要是纤维二糖和葡萄糖。可溶性糖可主要是葡萄糖。

优选地，酶促水解过程将约80％至约100％或介于其间的任何范围的纤维素转化为可溶性糖。更优选地，酶促水解过程将约90％至约100％或介于其间的任何范围的纤维素转化为可溶性糖。在一个最优选的实施方案中，酶促水解过程将约98％至约100％的纤维素转化为可溶性糖，或介于其间的任何范围。酶促水解过程可以是分批水解、连续水解或其组合。水解过程可以是搅动的、未加混合的或其组合。

优选地，酶促水解过程在约45℃至约75℃的温度下进行，或介于其间的任何温度，例如，45、50、55、60、65、70、75℃，或介于其间的任何温度，其pH值为约3.5至约7.5，或介于其间的任何pH值，例如3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，或介于其间的任何pH值。水解开始前，水解反应器中纤维素的初始浓度优选地为约4％(w/w)到约15％(w/w)，或介于其间的任何数量，例如4、6、8、10、12、14、15％或介于其间的任何数量。所有主要纤维素酶的联合用量可以是约1至约100mg蛋白质/克纤维素，或介于其间的任何数量，例如1、5、10、15、20、25、30、40、50、60、70、80、90、100mg蛋白质/克纤维素或介于其间的任何质量。所述水解可进行约12小时至约200小时，或介于其间的任何时间，例如，水解可进行15小时至100小时，或介于其间的任何时间，或者可进行12、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、120、140、160、180、200小时或介于其间的任何时间。值得指出的是，所述反应条件并不意味着以任何方式限制本发明，本领域的技术人员可根据需要对其进行调整。

酶促水解过程通常在水解反应器中进行。在将经预处理的木质纤维素原料(也称为“底物”)加入到水解反应器之前、之中或之后，将纤维素酶添加到底物中。

所述纤维素酶可以是纤维素酶混合物，其包含由一个或多个深层液体发酵培养产生的经修饰TrCel6A纤维素酶和其它纤维素酶。可通过过滤、离心或其它本领域技术人员熟悉的方法，在发酵结束时，将由此产生的经修饰TrCel6A纤维素酶和其它纤维素酶与细胞分离。然后，在使用前，可浓缩(例如通过超滤)、保存和/或稳定无细胞的含纤维素酶的组份。或者，经修饰的TrCel6A纤维素酶和其它纤维素酶不与细胞分离，而与细胞一起添加至酶促水解中。

实施例

接下来在下面实施例中进一步阐述本发明。然而，可以理解的是，这些实施例仅作说明用途，而不应被用来以任何方式限制本发明的范围。

实施例1描述了在后续实施例中所使用的菌株和载体。实施例2描述了TrCel6A-S413P基因的克隆及在酵母中的转化。实施例3总结了TrCel6A-S413P的易错PCR(Error-prone PCR)文库的制备。实施例4描述了来自微量培养的经修饰TrCel6A纤维素酶的表达。实施例5描述了木质素的分离和制备。实施例6和7描述了高通量筛选检测，以鉴定木质素所致失活降低的经修饰TrCel6A纤维素酶。实施例8描述了经修饰TrCel6A纤维素酶聚集体的制备。实施例9描述了亲本和经修饰TrCel6A纤维素酶的表达和纯化。实施例10总结了在高通量检测1和检测2中对纯化的亲本和经修饰TrCel6A纤维素酶的测试。最后，实施例11描述了在木质素失活时间过程实验中对纯化的亲本和经修饰TrCel6A纤维素酶的测试。

实施例1：菌株和载体

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)菌株YDR483W BY4742[14317](MATα his3Δ1 leu2Δ0 lys2Δ0 ura3Δ0Δkre2)购自ATCC(#4014317)。YEp352/PGK91-1载体从美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)获得。YEpFLAGΔKpn10-S413P载体由美国专利申请60/841,507所描述。YEpFLAG-1载体购自Sigma公司，其为酵母氨基末端FLAG标签表达试剂盒(Amino-Terminal Yeast FLAG Expression Kit)的一部分。

实施例2：将TrCel6A-S413P基因克隆到YEp352/PGK91-1载体中和酵母转化

为了方便使用NheI和KpnI限制性内切酶进行克隆，用DNA聚合酶I大片段(Klenow)将位于YEp352/PGK91-1载体1936位的唯一NheI位点平端化，产生YEp352/PGK91-1ΔNheI。通过PCR使用引物5′NheCel6A和3′BglKpnCel6A从YEpFLAGΔKpn10-S413P载体(美国专利临时编号60/841,507)扩增TrCel6A-S413P基因。同时，通过PCR使用引物(5′BglAlphaSS和3′NheAlphaSS)从YEpFLAG-1载体(Sigma)扩增酵母α-因子前导序列，从而在扩增子的5′端引BglII以及在3′端引入NheI位点。

通过BglII/NheI消化分离酵母α-因子前导序列，并将其与TrCel6A-S413P基因(由NheI/BglII消化而分离)和YEp352/PGK91-1ΔNheI载体(由BglII消化而分离)进行三片段连接。使用Gietz，R.D.和Woods，R.A.(2002)描述的方法，用所得载体YEp352/PGK91-1ΔNheI-alpha_ss-TrCel6A-S413P(图2)转化酵母菌株BY4742。

引物序列如下：

5’BglAlphaSS：5’ACC AAA AGA TCT ATG AGA TTT CCT TCA ATT(SEQ ID NO：46)

3’NheAlphaSS：5’TGA GCA GCT AGC CCT TTT ATC CAA AGA TAC(SEQ ID NO：47)

5’NheCel6A： 5’AAA AGG GCT AGC TGC TCA AGC GTC TGG GGC(SEQ ID NO：48)

3’BglKpnCel6A：5’GAG CTC AGA TCT GGT ACC TTA CAG GAA CGA TGG GTT(SEQ ID NO：49)

实施例3：制作易错PCR文库

使用Mutazyme

II DNA聚合酶的方法生成随机诱变文库。对于Mutazyme

II DNA聚合酶方法，使用10、20、30、40ng的YEp352/PGK91-1ΔNheI-α_ss-TrCel6A-S413P载体和Mutazyme

II DNA聚合酶以及YalphaN21和3′PGK-term引物，进行了一系列四个独立PCR。该扩增进行25个循环。合并四个PCR产物并稀释到10ng/μL。第二个PCR诱变步骤采用30ng合并的PCR产物和Mutazyme

II DNA聚合酶以及相同的引物进行30个循环的扩增。将YEp352/PGK91-1ΔNheI-α_ss-TrCel6A-S413P载体用NheI和KpnI消化，并分离空载体片段。同时转化该线性片段和最终扩增子并通过体内重组克隆至酵母菌株BY4742(Butler et al.，2003)。

YalphaN21：5’AGC ACA AAT AAC GGG TTA TTG(SEQ ID NO：45)

3’PGK-term：5’GCA ACA CCT GGC AAT TCC TTA CC(SEQ ID NO：56)

实施例4：从微孔板培养中表达和分离亲本及经修饰TrCel6A纤维素酶

本实施例描述了在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中选择和表达TrCel6A-S413P和经修饰TrCel6A纤维素酶，以用于高通量筛选试验(实施例6和7)。

将实施例3中的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)转化子在含有合成完全(Synthetic complete，SC)培养基(SC：2％琼脂w/v，0.17％酵母氮源w/v，0.078％缺Ura添加剂(-Ura drop-out supplement)w/v，2％葡萄糖w/v，2％水解酪蛋白氨基酸w/v，0.5％硫酸铵w/v，pH 5.5)和0.12％偶氮-大麦-β-葡聚糖(Azo-barley-beta-glucan，Megazyme)的平板上在30℃下培养4天。

经过45℃过夜培养后，用牙签挑选呈现出清晰可见晕环的克隆接种到96孔微孔板中的0.15mL合成完全培养基(SC：0.17％酵母氮源w/v，0.078％缺Ura添加剂w/v，2％葡萄糖w/v，2％水解酪蛋白氨基酸w/v，0.5％硫酸铵w/v)中进行液体培养基预培养。使用轨道振荡将预培养物在30℃培养过夜(16-18小时)至稳定期。对于表达培养物接种，使用25μL预培养物接种深孔微孔板中含有一个玻璃珠的1mL SC培养基。伴随着轨道振荡和湿度控制，将表达培养物在30℃培养3天。以710×g将平板离心5分钟以沉淀细胞，吸取上清液用于筛选实验(实施例6和7)。对于剩下的预培养物，通过添加甘油至15％的终浓度来制备保存物，并保存于-80℃。

实施例5：木质素的制备

采用US 4,461,648描述的方法对小麦秸秆进行预处理。预处理之后，加入浓度为0.5％的苯甲酸钠作为防腐剂。然后，使用布氏漏斗和滤纸，用6倍体积的温自来水(～35℃)冲洗预处理的材料。

在1升三角瓶中向625mL的82％硫酸中边搅拌边加入经预处理的小麦秸秆样品(167g湿重，30％的固体，60％的纤维素)，然后用塞子塞住并在50℃振荡孵育4小时。使用布氏漏斗和玻璃纤维滤纸过滤剩余固体获得潮湿物，将其在1L水中重悬并用NaOH调整pH值至4.5。过滤该固体并用～8L水冲洗。该固体在本文称为“木质素”。

木质素的牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)处理是通过将等量(w/w)的木质素和BSA以30g/L的浓度在含0.1％苯甲酸钠的50mM柠檬酸缓冲液(pH 5)中在50℃下振荡孵育5天进行的。

实施例6：用于鉴定具有木质素抗性的经修饰第6家族纤维素酶的里氏木霉(Trichoderma reesei)Cel6A基因文库的高通量筛选—检测1

本实施例描述了经修饰TrCel6A纤维素酶的筛选，以鉴定与已克隆到酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中的亲本TrCel6A-S413P相比对木质素所致失活具有抗性的纤维素酶。

酵母表达的TrCel6A-S413P与纤维素的预结合。将如实施例4中所述的含有经修饰TrCel6A纤维素酶的培养上清等分试样(0.175mL)加至两个分开的微孔板的板中，所述孔含有0.05mL浓度为0.167％w/v的纤维素，接着将其在4℃下轨道振荡孵育90分钟。然后，将微孔板以2800×g离心3分钟并去除0.175mL上清液。向同一微孔板的孔中再加入另外的来自每种经修饰TrCel6A的上清等分试样(0.175mL)并以相同的条件再孵育90分钟。将微孔板再次以2800×g离心3分钟并去除0.175mL上清。向所有孔添加体积为0.175mL的50mM柠檬酸缓冲液(pH 5)，并立即将微孔板以2800×g离心3分钟。去除上清(0.175mL)。

纤维素水解。将每种经修饰TrCel6A纤维素酶分别与2.68％(w/v)的木质素和BSA处理的木质素(0.10mL)在50℃下轨道振荡孵育2小时。此后，加入里氏木霉(Trichoderma reesei)Cel7B和Cel5A(40mg蛋白质/g纤维素)和125IU/g纤维素的黑曲霉(A.niger)β-葡萄糖苷酶，再孵育3小时。将微孔板以2800离心3分钟，取上清等分试样用于葡萄糖测定。通过使用标准的葡萄糖氧化酶/过氧化物酶偶联反应实验(Trinder，1969)对葡萄糖的检测来测定酶活性。图3的A部分显示了来自一个筛选平板的数据样本。

每个96孔微孔板包含6个亲本TrCel6A-S413P对照用于比较。对于所有经修饰TrCel6A纤维素酶和亲本TrCel6A-S413P纤维素酶，将未处理木质素存在时的纤维素酶活性除以经BSA处理的木质素存在时的纤维素酶活性，计算得到±BSA处理的木质素比值。将每个经修饰TrCel6A纤维素酶的活性比值与特定微孔板上6个亲本TrCel6A-S413P对照的平均值进行比较，使用t-检验在95％置信水平选取阳性克隆(比值增加的那些)。再次在微量培养物中产生所有阳性纤维素酶，再次筛选以减少假阳性的数量。从在实施例4中制备的甘油保存物培养而来的酵母培养物中分离包含编码木质素所致失活降低的经修饰纤维素酶基因的质粒DNA分离。对经修饰TrCel6A纤维素酶基因进行DNA测序，以鉴定导致底物特异性改变的突变。

实施例7：用于鉴定具有木质素抗性的经修饰第6家族纤维素酶的里氏木霉(Trichoderma reesei)Cel6A基因文库的高通量筛选——检测2

本实施例描述了使用另一个高通量检测对经修饰TrCel6A纤维素酶的筛选，以鉴定具有木质素抗性的那些纤维素酶。

在0.25mL的柠檬酸缓冲的(50mM；pH 5)反应体系中，将如实施例4所描述的酵母上清等分试样(0.15mL)与木质素(1.6％w/v)预孵育。另外，将取自每种经修饰纤维素酶的等量的上清等分试样与经过BSA预处理的木质素(1.6％w/v)预孵育。预孵育在含有一个玻璃珠的96孔微孔板中于50℃轨道振荡(NB Innova 44)条件下进行5.5小时。每个96孔微孔板包含六个亲本TrCel6A-S413P对照用于比较。预孵育后，将微孔板以2800×g离心5分钟，吸取上清用于残余活性测定。

在100μL的柠檬酸缓冲的(50mM；pH 5)反应体系中，将上清(0.05mL)与0.5％β-葡聚糖孵育。在PCR平板中50℃下如下所述进行残余活性分析：对于使用木质素预孵育的样品进行16小时，对于使用经BSA处理的木质素预孵育的样品进行3小时。葡萄糖标准曲线被安排在了PCR板的第一列，其范围是3至0.05mg/mL。孵育之后，向所有的孔加入0.08mL的DNS试剂，并将平板煮沸10分钟。将等分试样(0.15mL)转移到微孔板中并测定560nm的吸光度。通过使用葡萄糖标准曲线将A₅₆₀值转换为降低当量来确定残余的酶活性。图3的B部分显示了来自于一个筛选平板的数据样本。通过用未经处理木质素存在时的残余酶活性除以经BSA处理木质素存在时的残余酶活性，计算得到所有经修饰TrCel6A纤维素酶与亲本TrCel6A-S413P对照的活性比值。将每个经修饰TrCel6A纤维素酶的活性比值与相应微孔板上6个亲本TrCel6A-S413P对照的平均值进行比较，使用t-检验在95％置信水平选取阳性克隆(那些比值增加的)。在微量培养物中再次产生所有阳性经修饰TrCel6A纤维素酶，再次筛选以减少假阳性的数量。

DNS试剂包含：

实施例8：制备聚集的经修饰TrCel6A纤维素酶

将抗木质素突变合并到两种聚集的经修饰TrCel6A纤维素酶中。表2显示了生成聚集的经修饰TrCel6A纤维素酶TrCel6A-K129E-S186T-A322D-Q363E-S413P和TrCel6A-K129E-S186T-A322D-Q363E-R410Q-S413P所实施的步骤。

PSP4-C 5′-GGCCACTGCTGCAGCAGCTGTCGCAGAAGTTCCCTCTTTTATGTGGC-3′(SEQ ID NO：50)

PSP5-C 5′-GCCACATAAAAGAGGGAACTTCTGCGACAGCTGCTGCAGCAGTGGCC-3′(SEQ ID NO：51)

PSP6-B 5′-GCCCTTGCCTCGAATGGCGAATACACTATTGCCGATGGTGGCGTCGCC-3′(SEQ ID NO：52)

PSP7-B 5′-GGCGACGCCACCATCGGCAATAGTGTATTCGCCATTCGAGGCAAGGGC-3′(SEQ ID NO：53)

PSP8 5′-TACACGCAAGGCAACGATGTCTACAACGAGAAG-3′(SEQ ID NO：54)

PSP9 5′-CTTCTCGTTGTAGACATCGTTGCCTTGCGTGTA-3′(SEQ ID NO：55)

DK091 5′-GACAGCAGTGCGCCACAGTTTGACCCCCACTGT-3′(SEQ ID NO：57)

DK092 5′-ACAGTGGGGGTCAAACTGTGGCGCACTGCTGTC-3′(SEQ ID NO：58)

为了实施缺口修复，将载体YEp352/PGK91-1-α_ss-NKE用NheI和KpnI消化，并使用凝胶纯化。利用Gietz，R.D.and Woods，R.A.，(2002)描述的方法，将消化的YEp352/PGK91-1-α_ss-NKE载体和扩增子转化进酵母(Saccharomyces cerevisiae菌株BY4742)中。

表2：利用PCR产生经修饰的TrCel6A纤维素酶

实施例9：大规模培养中表达和纯化TrCel6A-S413P和经修饰TrCel6A纤维素酶

用从琼脂平板上新鲜挑取的细胞所培养的10ml经转化的酿酒酵母过夜培养物接种500mL无菌YPD培养基(10g/L酵母提取物，20g/L蛋白胨和20g/L葡萄糖)。然后，将500mL培养物在30℃下轨道振荡孵育96小时。

孵育后，将每个培养物的培养液以16,700×g离心10分钟，弃去沉淀(含酵母细胞)。将上清的pH值调整到5.0，然后让其在4℃冷却1小时。冷却后，加入625g(NH₄)₂SO₄使酵母上清至93％饱和度。在4℃不断搅拌的条件下，让其进行时间为2小时的沉淀。以16,700×g离心15分钟后，弃去上清。

用移液器将沉淀在20mL的50mM柠檬酸缓冲液(pH 5.0)中重悬。一旦沉淀悬浮，加入80mL pH 5.0的0.1M醋酸钠、200mM葡萄糖和1mM葡萄糖酸内酯(Gluconic acid lactone)。然后，将样品在4℃轻轻搅拌孵育30分钟。将每个样品以710×g离心3分钟，以沉淀任何不溶性物质。用移液器将上清液小心地移出，以防止沉淀颗粒破裂，并保留沉淀。通过APTC亲和色谱纯化每个样本中的TrCel6A纤维素酶，如Piyachomkwan et al.，1997所描述。对纯化的TrCel6A纤维素酶进行缓冲液更换，更换为50mM柠檬酸缓冲液(pH 5.0)，使用带有5kDa NMWL聚醚砜(Polyethersulfone)膜的Centricon(Millipore)离心浓缩器进行浓缩。根据紫外吸收(280nm)测定蛋白质浓度，其使用消光系数ε_280nm＝2.062mL·mg^-1·cm。

实施例10：在高通量检测1和2中测试纯化的聚集经修饰TrCel6A纤维素酶

TrCel6A-S413P、TrCel6A-K129E-S186T-A322D-Q363E-S413P和TrCel6A-K129E-S186T-A322D-Q363E-R410Q-S413P的表达和纯化如实施例10中所述。如实施例6和7中所描述的在高通量检测1和2中测试TrCel6A纤维素酶。TrCel6A的浓度为0.02mg/mL。对于聚集的经修饰TrCel6A纤维素酶，将其±BSA-木质素的比值相对于TrCel6A-S413P进行归一化并计算P值(图5和表3)。

表3：聚集的经修饰TrCel6A纤维素酶的归一化±BSA-木质素比值和P值。

实施例11：用木质素失活时间过程检测对纯化的经修饰TrCel6A纤维素酶进行测试

将纯化的TrCel6A纤维素酶(0.06mg)在盖好盖子的玻璃烧瓶中与未经处理的木质素(1.04mg)孵育，所述烧瓶盛有总体积为2mL的50mM柠檬酸缓冲液(pH 5.0)。孵育在50℃轨道振荡的条件下进行。分别在0、0.5、1、2、3、4、6、14和24小时时从每个烧瓶中收集0.2mL样品。将所有样品离心以分离木质素，在4℃下保存。

时间过程完成后，稍混合每个样品以重悬沉淀，然后将0.05mL含有可溶性和不溶性物质的浆液添加到每孔含3个玻璃珠的微孔板。向每孔加入0.02mL的稀释的缺乏纤维二糖水解酶活性的木霉(Trichoderma)纤维素酶制备物(1μg总蛋白)和纯化木霉(Trichoderma)Cel3A(1.4μg)，以补回TrCel6A水解活性。最后向每孔加入0.2mL脱木质素的纤维素浆液(0.25％纤维素)。将测试微孔板于50℃轨道振荡孵育2小时。将该微孔板以710×g离心2分钟，如实施例6所述测量葡萄糖的浓度。

将葡萄糖的浓度转化为TrCel6A的活性，以mg葡萄糖生产/小时/mgTrCel6A蛋白表示。在未与木质素孵育时，即t＝0hr时测得的活性是酶比活性。用整个时间过程测定的活性除以在t＝0时测得的活性，计算得到TrCel6A的相对残余活性。为了分析结果，相对残余活性的测量视为代表了相对的残余活性TrCel6A的浓度。标准曲线用于证明TrCel6A浓度和活性的变化与本测定中使用的酶和底物的浓度具有线性关系。

使用公式1对残余TrCel6A相对于时间变化的数据进行建模。在此公式中，E代表酶，L代表木质素，EL代表可逆的酶-木质素复合物，EL^*代表不可逆转的酶-木质素复合物。K_L表示处于稳定状态时的[E][L]/[EL]，而k_L是一个速率常数，它描述了可逆的酶-木质素复合物向不可逆转的酶-木质素复合物的转化速率。对于每种经修饰TrCel6A纤维素酶，产生至少两个重复数据组。

对于TrCel6A-S413P和TrCel6A-K129E-S186T-A322D-Q363E-R410Q-S413P，样品木质素失活时间过程结果在图6中显示。在与木质素孵育的24小时过程中的每一个时间点处，TrCel6A-K129E-S186T-A322D-Q363E-R410Q-S413P的残余活性比TrCel6A-S413P更大，这表明了在每个时间点处大部分经修饰的TrCel6A仍具有活性。作为对照，将TrCel6A-S413P和TrCel6A-K129E-S186T-A322D-Q363E-R410Q-S413P在无木质素而其它实验条件相同的状态下孵育。这些对照表明，在所述测试过程中，两种TrCel6A纤维素酶在不含木质素的溶液中是稳定的。因此，相对于TrCel6A-S413P，在存在木质素的条件下，经修饰TrCel6A纤维素酶相对残余活性的增加是因为木质素的存在所致失活的速率降低，而不是经修饰TrCel6A热稳定性任何可能的改善。

建模是用Microsoft Excel中的四阶Runger-Kutta电子表格进行的。为了模拟在给定的实验中残余TrCel6A随时间变化的结果，通过改变K_L和k_L来拟合TrCel6A-S413P的结果。使用本领域技术人员熟知的最小二乘方法进行误差最小化。为了对经修饰TrCel6A纤维素建模，将k_L值固定为在相同实验中对TrCel6A-S413P所测定的值，改变K_L。使用模型比较法(Motulsky，H.，和A.Christopoulos(2004))确定模型中由至少一式两份的数据组拟合的标准误。将每种经修饰TrCel6A纤维素酶所确定的K_L除以针对TrCel6A-S413P所确定的K_L，从而计算得到相对K_L。同样，将每种经修饰TrCel6A纤维素酶的比活性除以TrCel6A-S413P的比活性，从而计算得到相对比活性。其K_L显著高于(P＜0.05，Student t-检验)TrCel6A-S413P的经修饰TrCel6A纤维素酶见表4。关于每种抗木质素的经修饰TrCel6A纤维素酶和TrCel6A-S413P的相对K_L和相对比活性的散点图显示于图7。

公式1

表4：经修饰TrCel6A纤维素酶的木质素失活常数(K_L)

该测定证明六种经修饰的TrCel6A纤维素酶具有显著更高的K_L值，因而与TrCel6A-S413P相比其对木质素失活的抗性更强。

纯化的亲本和经修饰TrCel6A酶经过10％的SDS-PAGE分离并通过考马斯亮蓝染色而可视化(图10)。该凝胶证明了经修饰TrCel6A酶(泳道4-11)的相对纯度与TrCel6A-S413P(泳道3)相似。所观察到的经修饰和亲本TrCel6A酶的主要条带具有约60kDa的表观分子量。在此图中，TrCel6A聚集体1(泳道10)和TrCel6A聚集体2(泳道11)分别指TrCel6A-K129E-S186T-A322D-Q363E-S413P和TrCel6A-K129E-S186T-A322D-Q363E-R410Q-S413P。从木霉纤维素酶纯化的TrCel6A(泳道2)和分子量标准品(泳道1)作为参照显示。

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Claims

1.经修饰的里氏木霉(Trichoderma reesei)第6家族(TrCel6A)纤维素酶，其包含一个或多个选自下列的氨基酸替换：

用苏氨酸替换186位的氨基酸；

其中，所述经修饰TrCel6A的83-447位氨基酸与SEQ ID NO：1的83-447位氨基酸具有约47％至约99.9％的同一性。

2.权利要求1的经修饰TrCel6A纤维素酶，其中所述经修饰TrCel6A纤维素酶的83-447位氨基酸与SEQ ID NO：1的83-447位氨基酸具有约70％至约99.9％的同一性，并且其中与亲本TrCel6A纤维素酶相比，所述经修饰TrCel6A纤维素酶显示出木质素所致失活程度减少至少15％。

3.权利要求2的经修饰TrCel6A纤维素酶，其中所述经修饰TrCel6A纤维素酶的83-447位氨基酸与SEQ ID NO：1的83-447位氨基酸具有约90％至约99.9％的同一性。

4.权利要求1至3任何一项的经修饰TrCel6A纤维素酶，其中所述氨基酸替换选自：K129E、S186T、A322D、Q363E、R410G和R410Q。

5.权利要求1至4任何一项的经修饰TrCel6A纤维素酶，其还包含选自下列的一个或多个氨基酸替换：Y103H、Y103K、Y103R、Y103A、Y103V、Y103L、Y103P、L136V、L136I和S413P。

6.分离的基因构建物，其包含编码权利要求1至5任何一项所述经修饰TrCel6A纤维素酶的核酸序列。

7.分离的遗传修饰微生物，其含有权利要求6的基因构建物。

8.权利要求7的分离的遗传修饰微生物，其中所述微生物是酵母或丝状真菌的物种。

9.权利要求8的分离的遗传修饰微生物，其中所述微生物是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或里氏木霉(Trichoderma reesei)。

10.生产经修饰TrCel6A纤维素酶的方法，其包括下列步骤：在诱导经修饰TrCel6A纤维素酶表达和分泌的条件下，在培养基中培养权利要求7的遗传修饰微生物，以及从所述培养基中回收经修饰TrCel6A纤维素酶。

11.水解纤维素底物的方法，其包括在木质素存在下将底物与权利要求1至5任何一项的经修饰TrCel6A纤维素酶相接触。

12.权利要求11的方法，其中所述纤维素底物是经预处理的木质纤维素原料，其中酶促水解产生可发酵的糖。

13.权利要求12的方法，其中所述经预处理的木质纤维素原料选自：玉米秸秆、小麦秸秆、大麦秸秆、稻秸秆、燕麦秸秆、油菜秸秆、大豆秸秆、玉米纤维、甜菜浆、纸浆厂细屑和废渣、甘蔗渣、硬木、软木、木屑、柳枝稷、芒草、网茅草和草芦。

14.生产经修饰TrCel6A纤维素酶的方法，其包括以下步骤：(i)用权利要求6定义的基因构建物转化真菌宿主细胞以产生重组真菌菌株；(ii)选择表达经修饰TrCel6A纤维素酶的重组真菌菌株；以及(iii)在诱导经修饰TrCel6A纤维素酶表达的条件下在深层液体发酵中来培养步骤(ii)中选择的重组真菌菌株。

15.经修饰的第6家族糖苷酶，其选自下列：

TrCel6A-K129E-S413P(SEQ ID NO：37)；

TrCel6A-S186T-S413P(SEQ ID NO：38)；

TrCel6A-A322D-S413P(SEQ ID NO：39)；

TrCel6A-Q363E-S413P(SEQ ID NO：40)；

TrCel6A-R410G-S413P(SEQ ID NO：41)；

TrCel6A-R410Q-S413P(SEQ ID NO：42)；

TrCel6A-K129E-S186T-A322D-Q363E-S413P(SEQ ID NO：43)；和

TrCel6A-K129E-S186T-A322D-Q363E-R410Q-S413P(SEQ ID NO：44)。