CN105039288B - 一种中性纤维素酶突变体及其应用 - Google Patents

一种中性纤维素酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明的目的是提供一种中性纤维素酶突变体，其氨基酸序列为SEQ ID NO：5。本发明的纤维素酶突变体最适作用温度为60℃，最适作用pH为6.5，且在pH 6.0‑7.0范围内均能保持80％以上的酶活水平，而野生型纤维素酶的最适作用pH为5.5，在pH 5.0‑6.5范围内维持80％以上的酶活。与野生型比较，本发明提供的纤维素酶突变体的pH适用范围更加偏向于中性条件，具有更大的应用空间。此外，纤维素酶突变体的耐热性和稳定性得到显著提高，在42℃条件下存放35天后，仍能保持90％以上的残留活性，而野生型纤维素酶酶活仅残留不足60％。

Description

一种中性纤维素酶突变体及其应用
技术领域
本发明属于功能基因改造技术领域，具体涉及一种中性纤维素酶突变体及其应用。
背景技术
纤维素酶，是一种复合酶，是由多种水解酶组成的一个复杂酶系，习惯上将纤维素酶分成三类：内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶。纤维素酶是在工业中应用最广泛的酶之一，一般应用于纺织工业、去污剂工业、纸浆和造纸工业、饲料和食品工业(包括烘焙)，以及用于木质纤维素材料水解，用于例如生物乙醇生产等。
纤维素酶可以按照其一级序列分类成各种糖基水解酶家族，这得到了家族一些成员的三维结构分析的支持(Henrissat 1991，Henrissat和Bairoch 1993，1996)。例如，糖基水解酶家族5、7、12和45含有内切葡聚糖酶。大多数纺织用酸性纤维素酶属于家族5，而大多数纺织用中性纤维素酶为家族12或45。
中性纤维素酶可广泛应用在纺织领域，特别在棉织物整理上，经过纤维素酶整理后，织物表面的绒毛被除去，处理后织物更光洁，颜色更鲜艳，棉织物的手感和外观获得很大的改善。用于牛仔水洗整理，可解决传统石洗的断砂磨损和酸洗时的日久发黄等许多问题，水洗的牛仔花点大小均匀，蓝白对比鲜明，质地柔软、舒适、美观大方。
但目前市售的中性纤维素酶种类较少，且普遍存在催化效率不高、产品储存期较短、酶活损失快等缺点，因此现在急需开发一款稳定性高，单位蛋白催化效率高且对织物强力损失小的中性纤维素酶，以满足工业生产的需求。
发明内容
本发明的目的是提供一种中性纤维素酶突变体，其热稳定性得到显著提高，且在纺织除毛和水洗的应用中具有更显著的效果，可广泛应用于纺织工业领域。
本发明一方面提供了一种纤维素酶突变体，是氨基酸序列为SEQ ID NO：1的纤维素酶第23位氨基酸由Pro变为Ser，第38位氨基酸由Leu变为Ile，第213-284位氨基酸序列替换成里氏木霉(Trichoderma reesei)来源的纤维素酶的第447-514位氨基酸序列。
上述里氏木霉(Trichoderma reesei)来源的纤维素酶的氨基酸序列为SEQ IDNO：3，其编码基因的核酸序列为SEQ ID NO：4。
上述纤维素酶突变体的氨基酸序列为SEQ ID NO：5，其一种编码基因的核酸序列为SEQ ID NO：6。
本发明另一方面提供了携带有编码序列为SEQ ID NO：6的纤维素酶突变体基因的重组质粒。
本发明还涉及一种工程菌株，其携带有上述重组质粒。
所述工程菌株为里氏木霉(Trichoderma reesei)。
本发明还涉及上述纤维素酶突变体在纺织领域中的应用。
本发明所述纤维素酶突变体最适作用温度为60℃，最适作用pH为6.5，且在pH6.0-7.0范围内均能保持80％以上的酶活水平，而野生型纤维素酶的最适作用pH为5.5，在pH 5.0-6.5范围内维持80％以上的酶活。与野生型比较，本发明提供的纤维素酶突变体的pH适用范围更加偏向于中性条件，具有更大的应用空间。此外，纤维素酶突变体的耐热性和稳定性得到显著提高，在42℃条件下存放35天后，仍能保持90％以上的残留活性，而野生型纤维素酶酶活仅残留不足60％。
本发明提供的纤维素酶突变体可广泛应用于纺织加工领域，在pH 4.0-8.5范围内应用，效果良好；除毛干净，对织物强力损失小；牛仔水洗，起花小，花点较小，批差稳定；且相同蛋白含量的纤维素酶突变体的应用效果显著优于野生型，能大大节约生产成本，提高经济效益。
附图说明
图1为纤维素酶突变体与野生型相对酶活-pH曲线图；
图2为纤维素酶突变体与野生型残留酶活-时间曲线图。
具体实施方式
本发明用到了遗传工程和分子生物学领域使用的常规技术和方法，例如MOLECULAR CLONING:A LABORATORY MANUAL,3nd Ed.(Sambrook,2001)和CURRENTPROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY(Ausubel,2003)中所记载的方法。这些一般性参考文献提供了本领域技术人员已知的定义和方法。但是，这并不意味着将本发明限定于所述的任何具体方法、实验方案和试剂，因为它们可以改变。
下面结合具体实施方式对本发明进行详细描述。
实施例1：纤维素酶突变体的获得
为了提高野生型纤维素酶NCE4(氨基酸序列为SEQ ID NO:1，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO:2)对温度的耐受性和稳定性，申请人对该酶的氨基酸位点进行了大量的点突变筛选，并对该酶原有的CBD结合域序列进行了大量替换筛选。在筛选过程中，申请人发现：有些突变对纤维素酶的耐热性没有影响，而有些突变甚至会导致其耐热性更差了，还有些突变虽然能显著提高纤维素酶的耐热性，但酶活水平很低，不适用于工业生产。最终，申请人筛选到一种既能使纤维素酶耐热性和热稳定性显著提高、又不影响其酶活水平的突变位点和CBD结合域序列的组合：野生型纤维素酶NCE4的第23位氨基酸由Pro变为Ser，第38位氨基酸由Leu变为Ile，第213-284位氨基酸序列替换为里氏木霉(Trichoderma reesei)来源的纤维素酶的第447-514位氨基酸序列。
所述里氏木霉(Trichoderma reesei)来源的纤维素酶的氨基酸序列为SEQ IDNO：3，其一种编码基因的核酸序列为SEQ ID NO：4。
申请人将包含上述突变位点的纤维素酶突变体命名为NCE4-D，其氨基酸序列为SEQ ID NO:5，编码核苷酸序列为SEQ ID NO:6。
申请人依照里氏木霉的密码偏爱性对纤维素酶突变体的基因进行优化合成，并且在合成序列5’和3’两端分别加上KpnI和XbaI两个酶切位点。上述基因合成工作由上海生工生物工程股份有限公司完成。
同时，采用同样的方法合成得到野生型纤维素酶NCE4的基因片段SEQ ID NO:2。
实施例2纤维素酶突变体的表达
2.1表达载体的构建
将合成后的纤维素酶突变体基因序列和pTG载体分别用限制性内切酶KpnI和XbaI(Fermentas)进行酶切，使用凝胶纯化试剂盒将酶切产物纯化，并用T4DNA连接酶(Fermentas)将上述两个酶切产物连接并转化大肠杆菌Trans5α(Transgen)，用氨苄青霉素进行选择，并对克隆进行测序(Invitrogen)。测序正确后，即得到含有纤维素酶突变体基因的重组载体pTG-NCE4-D。
采用上述同样方法构建得到含有野生型纤维素酶NCE4基因的重组载体pTG-NCE4。
2.2重组菌株的构建及筛选
(1)原生质体制备
接种里氏木霉(Trichoderma reesei)SCHD4菌丝于PDA平板上，30℃培养6天；待其产孢丰富后，切取约1cm×1cm的菌落置于含120mL YEG+U(0.5％酵母粉、1％葡萄糖、0.1％尿苷)的液体培养基中，30℃，220rpm振荡培养14～16h；
多层纱布过滤收集菌丝，并用无菌水清洗一次；将菌丝体置于含有20mL10mg/mL裂解酶液(Sigma L1412)的三角瓶中，30℃，90rpm作用1-2h；用显微镜观察检测原生质体转化进展；
将预冷的20mL 1.2M山梨醇(1.2M山梨醇，50mM Tris-Cl，50mM CaCl2)加入上述三角瓶中，轻轻摇匀，用无菌Miracloth滤布过滤收集滤液，3000rpm，4℃离心10min；弃上清，加入预冷的5mL 1.2M山梨醇溶液悬浮菌体，3000rpm，4℃离心10min；弃上清，加入适量预冷的1.2M山梨醇悬浮分装(200μL/管，原生质体浓度为108个/mL)。
(2)PEG介导的原生质体转化与菌株验证
以下操作均在冰上进行，将10μg重组质粒加入到200μL上述原生质体溶液中，接着加入50μL25％PEG轻轻混匀，温和混匀后在冰上放置20min，然后加入1mL25％PEG，轻轻混匀，室温静置5min，然后加入2mL25％PEG溶液和4mL1.2M山梨醇溶液，温和混匀各管，把混合物轻轻加到50mL左右且熔化后冷却至45-55℃的转化上层培养基中(0.1％MgSO4，1％KH2PO4，0.6％(NH4)2SO4，1％葡萄糖，18.3％山梨醇，0.35％琼脂糖，0.1％微量元素(微量元素：在250mL dlH2O中加入1g FeSO4·7H2O，8.8g ZnSO4·7H2O，0.4g CuSO4·5H2O，0.15gMnSO4·4H2O，0.1g Na2B4O7·10H2O，50mg(NH4)6Mo7O24·4H2O，0.2mL浓HCl，完全溶解后用dlH2O定容至1L))，轻轻混匀后倒入转化下层培养基平板(2％葡萄糖，0.5％(NH4)2SO4,1.5％KH2PO4,0.06％MgSO4,0.06％CaCl2，1.5％琼脂，0.1％微量元素)，30℃培养5～7d至转化子长出。
挑取转化子至下层培养基平板，30℃培养2d；取适量菌丝体置于2mL离心管中，加入100mg无菌石英砂和400μL抽提缓冲液(100mM Tris-HCl,100mM EDTA,250mM NaCl,1％SDS)；用珠打仪剧烈振荡2min；65℃水浴20min后，加入200μL 10M NH4AC，冰浴10min；13000rpm离心10min；取上清，加入2倍体积的无水乙醇，-20℃放置30min；13000rpm离心10min，弃上清；用70％乙醇洗涤2次；晾干，加水溶解，于-20℃保存。
以上述提取转化子基因组DNA为模板，利用引物NCE4D-F和NCE4D-R进行PCR扩增目的基因进行验证。
NCE4D-F：ATGCGTTCCTCCCCCCTC
NCE4D-R：CTACAGGCACTGATGATACCAG；
PCR扩增条件为94℃4min；94℃40s；58℃40s，72℃1min，30个循环；72℃7min，16℃；利用凝胶回收试剂盒回收PCR扩增产物，并进行测序分析。测序结果正确的阳性转化子即为含纤维素酶突变体基因NCE4-D的里氏木霉工程菌。申请人将其中一个阳性转化子命名为里氏木霉NCE4-D(Trichoderma reesei NCE4-D)。
采用上述同样的方法构建得到含有野生型纤维素酶基因的里氏木霉工程菌，命名为里氏木霉NCE4(Trichoderma reesei NCE4)。
实施例3发酵验证和酶活测定
将上述构建得到的里氏木霉工程菌NCE4-D(Trichoderma reesei NCE4-D)与里氏木霉工程菌NCE4(Trichoderma reesei NCE4)分别接种于MM发酵培养基(1.5％葡萄糖，1.7％乳糖，2.5％玉米浆，0.44％(NH4)2SO4，0.09％MgSO4，2％KH2PO4，0.04％CaCl2，0.018％吐温-80，0.018％微量元素，0.018％聚丙二醇-2000)，28℃培养48小时，然后25℃培养48小时，离心取上清液。分别测定其酶活。
(1)酶活测定方法
在50℃、pH值为4.8(中性为pH6.0)的条件下，每分钟从浓度为5mg/ml的羟甲基纤维素钠溶液中降解释放1μmol还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U，还原糖以葡萄糖等量。
取三支试管各加入0.5mL CMC底物，与待测酶液一起50℃水浴预热5min。在第一、二试管中各加入0.5mL待测液，并计时，50℃水浴中反应15min。反应完后在三支试管中各加入1.5mLDNS试剂，并在第三支试管总补加0.5mL的待测酶液。取出并摇匀三支试管后，在沸水浴中反应5min。迅速冷却至室温，用水定到5.0mL。以第三支试管试液为对照在540nm波长条件下测第一、二试管试液的吸光度，吸光度在0.25-0.35之间为宜。待测酶液反应液的吸光度与水平控制酶液反应液吸光度之差的绝对值不超过0.015。
酶活X＝(葡萄糖等量值/180/15/0.5)×n
其中:X——酶活力单位,IU/g(mL)；
180——葡萄糖从微克换算成微摩尔；
15——待测液与底物的反应时间；
0.5——加入反应的待测酶液量；
n——稀释倍数；
(2)酶活测定结果
采用上述方法检测上述发酵上清液的酶活，结果显示：宿主菌里氏木霉发酵上清液中几乎检测不出纤维素酶酶活，而里氏木霉工程菌NCE4发酵上清液酶活为250U/mL，里氏木霉工程菌NCE4-D发酵上清液酶活高达409U/mL。酶活检测结果进一步证实，本发明所选用的宿主菌本身不产纤维素酶，从而说明本发明构建的里氏木霉工程菌NCE4和NCE4-D能分别高效重组表达野生型纤维素酶NCE4和突变体NCE4-D。
实施例4纤维素酶突变体酶学性质分析
4.1最适反应pH分析
分别用pH值为3.0、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的缓冲液稀释实施例3所述里氏木霉工程菌NCE4和氏木霉工程菌NCE4-D发酵上清液，在50℃条件下测定其酶活，以最高酶活为100％，计算相对酶活，做pH-相对酶活曲线。结果如图1所示，纤维素酶突变体的最适作用pH为6.5，且在pH6.0-7.0范围内均能保持80％以上的酶活水平，而野生型纤维素酶最适pH为5.5，在pH5.0-6.5范围内维持80％以上的酶活。与野生型相比，本发明提供的纤维素酶突变体的pH适用范围更加偏向中性条件，具有更大的应用空间。
4.2最适反应温度分析
分别在30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃、75℃，pH 6.0条件下，测定实施例3所述里氏木霉工程菌NCE4和氏木霉工程菌NCE4-D发酵上清液的纤维素酶酶活，以最高酶活为100％，计算相对酶活，做温度-相对酶活曲线。结果显示：与野生型相比，本发明提供的纤维素酶突变体的最适作用温度没有发生改变，最适温度均为60℃。
4.3耐热性和稳定性分析
将实施例3所述里氏木霉工程菌NCE4和里氏木霉工程菌NCE4-D发酵上清液在42℃条件下存放35天，分别在第1d、第5d、第10d、第15d、第20d、第25d、第30d、第35d取样，在pH6.0条件下分别测定发酵上清液的纤维素酶酶活，以最高酶活为100％，计算残留酶活，做时间-残留酶活曲线。结果如图2：在42℃条件下存放35天后，本发明提供的纤维素酶突变体仍能保持90％以上的残留酶活；而野生型纤维素酶的酶活残留不足60％。
综上，与野生型纤维素酶相比，本发明提供的纤维素酶突变体具有更好的耐热性和稳定性，更适合长期储存并在纺织领域应用中保持效力的延续性，节约成本，降低能耗。
实施例6纤维素酶突变体在纺织加工领域中的应用
1、针织面料、梭织面料的除毛工艺
应用温度为35-60℃；
处理时间为30-150分钟；
pH范围为4.0-8.5；
适用的浴比范围为1:5-1:30，使用的设备类型为溢流染色机，卷染机，水洗机等，本发明纤维素酶突变体NCE4-D和野生型NCE4的用量为3-12g/L。其灭活条件为添加纯碱至pH值到10，或升温到70℃以上并保持10分钟。
将处理后的织物，采用弹子顶破仪测试其强度，结果见表1。
表1 纤维素酶突变体和野生型处理织物后强度测试
名 称 顶破强力 顶破强度 扩张度
NCE4-D 6g 495.7 31.17924 19.62
NCE4 9g 476.4 29.96383 19.17
从表1的数据可以看出，本发明提供的纤维素酶突变体除毛干净，对织物强力损失小；而要达到相同的除毛应用效果，所需要野生型纤维素酶的用量为突变体的1.5倍。
2、牛仔面料的起花及除毛应用
应用温度为35-60℃；
处理时间为10-60分钟；
pH范围为4.0-8.5；
上述工艺条件可应用于退浆及单独石磨洗条件下的除毛、起花工艺；适用的浴比范围为1:5-1:30，使用的设备类型为工业水洗机等，纤维素酶突变体和野生型的用量为3-12g/L。其灭活条件为添加纯碱至pH值到10，或升温到70℃以上并保持10分钟。
结果显示，利用本发明提供的纤维素酶突变体处理牛仔面料，除毛干净，起花均匀，花点较小，对织物强力损失小。
综上，本发明提供的纤维素酶突变体可广泛应用于纺织加工领域，在pH4.0-8.5范围内应用，效果良好；除毛干净，对织物强力损失小；牛仔水洗，起花小，花点较小，批差稳定；且相同蛋白含量的纤维素酶突变体的应用效果显著优于野生型，能大大节约生产成本，提高经济效益。

Claims (8)

1.一种纤维素酶突变体，其特征在于，所述的纤维素酶突变体是氨基酸序列为SEQ IDNO：1的纤维素酶第23位氨基酸由Pro变为Ser，第38位氨基酸由Leu变为Ile，第213-284位氨基酸序列替换成里氏木霉(Trichoderma reesei)来源的纤维素酶的第447-514位氨基酸序列；所述的里氏木霉(Trichoderma reesei)来源的纤维素酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO：3。
2.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的纤维素酶突变体。
3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的核酸序列为SEQ ID NO：6。
4.一种重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒携带有权利要求3所述的基因。
5.一种重组工程菌株，其特征在于，所述的重组工程菌株带有权利要求4所述的重组质粒。
6.权利要求5所述的重组工程菌株，其特征在于，所述的重组工程菌株为里氏木霉(Trichoderma reesei)。
7.权利要求1所述的纤维素酶突变体在纺织领域中的应用。
8.权利要求5所述的重组工程菌株在纺织领域中的应用。
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"49P(del)点突变提高中性纤维素内切酶 EGV 热稳定性的初步研究";方芳等;《现代生物医学进展》;20090730;第9卷(第14期);全文 *

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