CN114657166A - 另外的内切葡聚糖酶变体和方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及新的变体内切葡聚糖酶及其用途。
Description
技术领域
本发明涉及(变体)内切葡聚糖酶、编码(变体)内切葡聚糖酶的多核苷酸、产生(变体)内切葡聚糖酶的方法和使用(变体)内切葡聚糖酶的方法。还描述了本发明的内切葡聚糖酶在纺织物、洗涤剂以及纸浆和造纸业中的用途。本发明还涉及包含本发明的一种或多种(变体)内切葡聚糖酶的组合物。
背景技术
纤维素是高等植物的主要结构组分，并且以几乎纯净的形式天然存在于棉纤维中。它为植物细胞提供了高拉伸强度，帮助它们抵抗机械应力和渗透压。纤维素是通过β-1.4连结连接的葡萄糖残基的线性多糖。
纤维素分解酶水解纤维素，并由极其多种细菌和真菌产生。纤维素酶是工业上重要的酶。在纺织业中，纤维素酶用于粗斜纹棉布整理(denim finishing)中，以在生物石磨(biostoning)过程中在粗斜纹棉布布料中形成时髦的石洗(stone washed)外观，并且它们还用于例如清洁细毛(fuzz)并防止棉衣服的表面上形成球粒(pill)。在洗涤剂业中，纤维素酶用于增亮颜色并防止衣服的泛灰和起球。纤维素酶还用于食品业和动物饲料制造中，并且它们在纸浆和造纸业中具有巨大的潜力，例如在脱墨以从纤维表面释放墨中和改善纸浆排出中。
本发明的内切葡聚糖酶是指分类为E.C.3.2.1.4的酶，并且是纤维素生物转化为葡萄糖通常需要的一类纤维素酶。内切葡聚糖酶切割内部的β-1,4-葡萄糖苷键，而纤维二糖水解酶从纤维素聚合物链的末端切割二糖纤维二糖，并且β-1,4-葡萄糖苷酶将纤维二糖和其他短的纤维糖寡糖水解为葡萄糖。一些天然存在的内切葡聚糖酶具有纤维素结合域，而其他则没有。内切葡聚糖酶也广泛用于纺织、洗涤剂、纸浆和造纸业。例如，如美国专利号7,256,032、美国专利号6,001,639、WO 2004/053039、美国专利号5,958,082、美国专利号5,948,672(其全部在此通过引用以其整体并入)中所述的内切葡聚糖酶。
然而，本领域仍然需要具有增加的总活性、比活性、温度活性、pH活性、总稳定性、温度稳定性和pH耐受性的内切葡聚糖酶变体。本发明满足了这一需求，并提供了与亲本内切葡聚糖酶相比具有改善的特性的内切葡聚糖酶变体。
本发明的目的是提供具有内切葡聚糖酶活性的(变体)内切葡聚糖酶、编码(变体)内切葡聚糖酶的多核苷酸以及在各种过程中使用(变体)内切葡聚糖酶的方法。
发明内容
因此，本发明提供了(变体)内切葡聚糖酶以及产生和使用它们的方法。本发明的氨基酸序列号和核酸序列号列于表1中。
表1.氨基酸序列号和核酸序列号。
一方面，本发明提供了一种组合物，其包含与SEQ ID NO:1相比包含一个或多个氨基酸修饰的变体内切葡聚糖酶，其中所述一个或多个氨基酸修饰发生在对应于选自下组的位置的位置：位置2,17,23,25,29,33,36,38,39,42,43,44,48,51,54,66,67,68,75,77,80,82,90,102,116,121,122,123,132,135,136,141,144,145,153,160,161,164,167,174,180,184,185,190,192,194,195,196,204,205,206,215,216,217,218,219,220,221,222,223,228,229,230,231,232,233,234,235,237,238,239,241,242,243,244,245,246,247,248,249,250,251,258,259,267,268,269,270,271,273,274,275,276,277,278,279,280,281,282,283,284,285,286,287,288,289,290,291,292和293，其中所述变体内切葡聚糖酶与SEQ ID NO:1表现出至少80％的序列同一性；并且其中所述变体内切葡聚糖酶具有内切葡聚糖酶活性。
在另一方面，本发明提供包含变体内切葡聚糖酶的组合物，所述变体内切葡聚糖酶与SEQ ID NO:1相比包含一个或多个氨基酸修饰，其中所述一个或多个氨基酸修饰选自对应于以下的修饰：SEQ ID NO:1的D2E,D2F,D2N,D2Q,D2S,D2T,S17G,A23D,A23N,A23S,S25N,F29Y,R33A,N36Q,I38L,Y39S,G42N,A43E,A43L,A43S,A43T,A43V,K44E,K44Q,E48N,P51E,P51N,P51S,P51T,S54T,Q66N,Q66T,F67L,F67Y,S68A,N75S,A77E,A77Q,N80S,A82S,K90A,V102Q,V102R,V102T,N116D,N116E,N116S,L121I,N122A,N122S,I123M,D132N,T135S,P136S,L141S,E144A,R145Q,S153D,D160A,A161K,A161P,P164S,P164T,Y167Q,L174Q,N180T,E184A,E184K,E184N,E184Q,E184R,E184S,E184T,R185Q,S190A,L192I,A194T,R195S,T196S,G204S,N205S,Y206F,D215*,D215G,S216N,P217G,S218G,S219T,S220G,S221-,A222-,A223T,S228A,T229P,S230G,Q231S,Q232G,P233Q,Q234T,Q235S,T237G,S238G,S239G,S241-,Q242-,A243-,S244-,V245-,P246-,T247-,S248-,N249-,P250-,G251-,W258*,W258R,W258S,A259*,A259D,T267S,G268N,C269R,C269S,T270*,T271E,V273*,V273D,V273G,S274R,G275*,G275A,G275E,G275N,G275T,T276G,T276H,T276P,T276R,T277D,T277E,T277L,C278*,C278A,C278L,T279H,T279P,T279Q,K280Q,K280S,L281*,L281A,L281E,L281G,L281K,L281S,N282E,N282S,D283*,W284*,W284G,W284M,W284R,W284T,W284Y,Y285*,S286A,S286G,Q287H,Q287S,C288*,C288A,T289-,T289K,T289Q,M290-,M290*,I291-,I291A,I291Q,I291S,N292-,N292S,L293G,L293N,L293T和L293V。
在另一方面，本发明提供包含变体内切葡聚糖酶的组合物，所述变体内切葡聚糖酶与本文所述的SEQ ID NO:1相比包含一个或多个氨基酸修饰，其中所述氨基酸取代发生在所述位置中的1个、所述位置中的2个、所述位置中的3个、所述位置中的4个、所述位置中的5个、所述位置中的6个、所述位置中的7个、所述位置中的8个、所述位置中的9个、所述位置中的10个、所述位置中的11个、所述位置中的12个、所述位置中的13个、所述位置中的14个、所述位置中的15个、所述位置中的16个、所述位置中的17个、所述位置中的18个、所述位置中的19个、所述位置中的20个、所述位置中的21个、所述位置中的22个、所述位置中的23个、所述位置中的24个、所述位置中的25个、所述位置中的26个、所述位置中的27个、所述位置中的28个、所述位置中的29个、所述位置中的30个、所述位置中的31个、所述位置中的32个、所述位置中的33个、所述位置中的34个、所述位置中的35个、所述位置中的36个、所述位置中的37个、所述位置中的38个、所述位置中的39个、所述位置中的40个、所述位置中的41个、所述位置中的42个、所述位置中的43个、所述位置中的44个、所述位置中的45个、所述位置中的46个或所述位置中的47个位置处。
在另一方面，本发明提供包含变体内切葡聚糖酶的组合物，所述变体内切葡聚糖酶与如本文所述的SEQ ID NO:1相比包含一个或多个氨基酸修饰，其中所述变体内切葡聚糖酶与SEQ ID NO:1表现出至少85％、90％或95％的序列同一性。
在另一方面，本发明提供包含变体内切葡聚糖酶的组合物，所述变体内切葡聚糖酶与本文所述的SEQ ID NO:1相比包含一个或多个氨基酸修饰，其中所述变体内切葡聚糖酶包含选自下组的所述氨基酸修饰：D215*,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43E/K44E/E48N/S54T/A77Q/N116D/N122S/L141S/L281G,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43E/K44Q/E48N/S54T/N116E/W258S/A259D/G275E/T277D,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43S/K44E/E48N/A77E/N116S/N122A/N180T/W258S/A259D/G275E/T277D/I291S/L293T,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43S/K44E/E48N/S54T/A77E/N122S/P164T/N180T/A259D/S286A/L293T,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43S/K44Q/E48N/A77Q/N116E/L141S/G275E/T277D/W284R,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43S/K44Q/E48N/S54T/N116D/W258S/G275T/L281E/I291Q,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43S/K44Q/E48N/V102Q/W258S/L281E/N282S/I291A,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43S/K44Q/E48N/V102R/W258R/A259D/L281E/N282S,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43T/K44E/E48N/P164T/N180T/A194T/W258S/A259D/G275T/L281G,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43T/K44E/E48N/V102Q/N116D/L281G/N282S,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43T/K44Q/E48N/A77E/V102Q/N116D/W258S/G275T/L281E/I291A,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43T/K44Q/E48N/A77Q/N180T/W258S/G275E/I291Q,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44E/E48N/A77E/N116D/G275T/L281E,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44E/E48N/N122A/N180T/T277D/L281E/N282S,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/A161K/P164T/N180T,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/A77E/A161K/P164T/N180T,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/A77E/N116D/W258S/L281E,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/A77Q/N116S/N180T/G275E/T277E,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/A77Q/N180T,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/F67Y/A77Q/N116S/N180T/W258S/A259D/G275T/T277E/L281K/N282S/I291S/L293N,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/F67Y/A77Q/N122S/L141S/N180T/A194T/W258R/L281K,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/F67Y/N180T,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/L141S,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/N116D/G275T/L281E/N282S/I291A,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/N116D/L281K/N282S/I291S/N292S/L293N,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/N116D/W258S/L281G,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/N180T,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/N180T/A259D/G275T/N282S,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/Q66T/A77Q/N122A/L141S/G275T/W284G/S286A,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/A77E/A161P/W258S/W284M/I291Q,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/A77E/T277E/L281E/S286A,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/A77E/V102Q/G275T/T277D/W284M/I291Q,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/A77E/W258S/T277D/W284M/I291A,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/I291A,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/L281E,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/N116D/A161P/L281E/N282S,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/N116D/A161P/W258S/G275T/L281E/I291A,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/N116D/A161P/W258S/W284M/I291A,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/N116D/D215G/S216N/P217G/S218G/S219T/S220G/S221-/A222-/A223T/S228A/T229P/S230G/Q231S/Q232G/P233Q/Q234T/Q235S/T237G/S238G/S239G/S241-/Q242-/A243-/S244-/V245-/P246-/T247-/S248-/N249-/P250-/G251-/T267S/T279Q/W284Y/T289-/M290-/I291-/N292-,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/N116D/L141S/A161K/N180T/W258R/A259D/G275E/T277D/W284R/I291Q/N292S/L293G,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/N116D/L141S/N180T/G275T/W284R/I291Q/L293N,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/N116D/W258S/G275T/N282S/I291A,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/N116D/W284M/I291Q,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/N116E/L141S/N180T/L281G/N282S,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/N116S/G275E/Y285*,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/Q66T/F67Y/N122S/N180T/L281G/I291S/N292S/L293G,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/V102Q/N116D/A161P/T277D/W284M/I291Q,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/V102Q/N116D/W258S/G275T/I291Q,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/V102Q/N116D/W258S/G275T/T277E,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/V102Q/N116D/W258S/G275T/T277E/L281G,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/V102Q/N116D/W258S/L281G/I291A,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/V102Q/W258S/G275T/T277D/N282S,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/V102Q/W258S/W284M/S286A,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/W258S,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/V102Q/A161P/W258S,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/V102Q/W258S/I291Q,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/V102R/N180T,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/W258S/I291A,A23D/I38L/Y39S/G42N/K44Q/E48N/A77E/N116D/L281E/I291A,A23D/S25N/I38L/Y39S/G42N/A43E/K44E/E48N/V102R/N116S/N122A/L141S/A161K/P164T/A194T/W258R/A259D/L281E,A23D/S25N/I38L/Y39S/G42N/A43E/K44Q/E48N/Q66T/F67Y/L141S/N180T,A23D/S25N/I38L/Y39S/G42N/A43S/K44Q/E48N/S54T/Q66T/L141S/N180T/W258S/A259D/T277D/W284G/Y285*,A23D/S25N/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/A161K/N180T,A23D/S25N/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/A161P,A23D/S25N/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/A77E,A23D/S25N/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/A77E/N180T,A23D/S25N/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/A77E/N180T/A259D/L281K/L293T,A23D/S25N/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/A77E/V102Q/N180T,A23D/S25N/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/A77Q/N180T/A194T/W258S/W284G/S286G,A23D/S25N/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/A77Q/V102Q/N180T/A194T,A23D/S25N/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/A77Q/W258S/G275T/T277D/W284M/I291S/L293T,A23D/S25N/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48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在另一方面，本发明提供包含变体内切葡聚糖酶的组合物，所述变体内切葡聚糖酶与本文所述的SEQ ID NO:1相比包含一个或多个氨基酸修饰，其中所述变体内切葡聚糖酶包含选自下组的所述氨基酸修饰：D215*,I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N,D215G/S216N/P217G/S218G/S219T/S220G/S221-/A222-/A223T/S228A/T229P/S230G/Q231S/Q232G/P233Q/Q234T/Q235S/T237G/S238G/S239G/S241-/Q242-/A243-/S244-/V245-/P246-/T247-/S248-/N249-/P250-/G251-/T267S/T279Q/W284Y/T289-/M290-/I291-/N292-,和T-18S/F-5L/T-4A/V-3A/A23S/S25N/F29Y/R33A/N36Q/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/P51S/Q66N/F67L/S68A/N75S/N80S/A82S/K90A/V102T/N116S/L121I/N122A/I123M/D132N/T135S/P136S/E144A/R145Q/S153D/D160A/A161P/Y167Q/L174Q/N180T/E184Q/R185Q/S190A/L192I/T196S/G204S/N205S/Y206F。
在另一方面，本发明提供包含变体内切葡聚糖酶的组合物，所述变体内切葡聚糖酶与本文所述的SEQ ID NO:1相比包含一个或多个氨基酸修饰，其中所述变体内切葡聚糖酶包含选自下组的所述氨基酸修饰：I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N,D215G/S216N/P217G/S218G/S219T/S220G/S221-/A222-/A223T/S228A/T229P/S230G/Q231S/Q232G/P233Q/Q234T/Q235S/T237G/S238G/S239G/S241-/Q242-/A243-/S244-/V245-/P246-/T247-/S248-/N249-/P250-/G251-/T267S/T279Q/W284Y/T289-/M290-/I291-/N292-,I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/D215G/S216N/P217G/S218G/S219T/S220G/S221-/A222-/A223T/S228A/T229P/S230G/Q231S/Q232G/P233Q/Q234T/Q235S/T237G/S238G/S239G/S241-/Q242-/A243-/S244-/V245-/P246-/T247-/S248-/N249-/P250-/G251-/T267S/T279Q/W284Y/T289-/M290-/I291-/N292-,A23D/S25N/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/A77E,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/N116D/D215G/S216N/P217G/S218G/S219T/S220G/S221-/A222-/A223T/S228A/T229P/S230G/Q231S/Q232G/P233Q/Q234T/Q235S/T237G/S238G/S239G/S241-/Q242-/A243-/S244-/V245-/P246-/T247-/S248-/N249-/P250-/G251-/T267S/T279Q/W284Y/T289-/M290-/I291-/N292-,D215*和A23S/S25N/F29Y/R33A/N36Q/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/P51S/Q66N/F67L/S68A/N75S/N80S/A82S/K90A/V102T/N116S/L121I/N122A/I123M/D132N/T135S/P136S/E144A/R145Q/S153D/D160A/A161P/Y167Q/L174Q/N180T/E184Q/R185Q/S190A/L192I/T196S/G204S/N205S/Y206F。
在另一方面，本发明提供包含变体内切葡聚糖酶的组合物，所述变体内切葡聚糖酶与本文所述的SEQ ID NO:1相比包含一个或多个氨基酸修饰，其中所述变体内切葡聚糖酶包含所述氨基酸修饰I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N。
在另一方面，本发明提供包含变体内切葡聚糖酶的组合物，所述变体内切葡聚糖酶与本文所述的SEQ ID NO:1相比包含一个或多个氨基酸修饰，其中所述变体内切葡聚糖酶包含所述氨基酸修饰D215G/S216N/P217G/S218G/S219T/S220G/S221-/A222-/A223T/S228A/T229P/S230G/Q231S/Q232G/P233Q/Q234T/Q235S/T237G/S238G/S239G/S241-/Q242-/A243-/S244-/V245-/P246-/T247-/S248-/N249-/P250-/G251-/T267S/T279Q/W284Y/T289-/M290-/I291-/N292-。
在另一方面，本发明提供包含变体内切葡聚糖酶的组合物，所述变体内切葡聚糖酶与本文所述的SEQ ID NO:1相比包含一个或多个氨基酸修饰，其中所述变体内切葡聚糖酶包含所述氨基酸修饰I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/D215G/S216N/P217G/S218G/S219T/S220G/S221-/A222-/A223T/S228A/T229P/S230G/Q231S/Q232G/P233Q/Q234T/Q235S/T237G/S238G/S239G/S241-/Q242-/A243-/S244-/V245-/P246-/T247-/S248-/N249-/P250-/G251-/T267S/T279Q/W284Y/T289-/M290-/I291-/N292-。
在另一方面，本发明提供包含变体内切葡聚糖酶的组合物，所述变体内切葡聚糖酶与本文所述的SEQ ID NO:1相比包含一个或多个氨基酸修饰，其中所述变体内切葡聚糖酶包含所述氨基酸修饰A23D/S25N/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/A77E。
在另一方面，本发明提供包含变体内切葡聚糖酶的组合物，所述变体内切葡聚糖酶与本文所述的SEQ ID NO:1相比包含一个或多个氨基酸修饰，其中所述变体内切葡聚糖酶包含所述氨基酸修饰A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/N116D/D215G/S216N/P217G/S218G/S219T/S220G/S221-/A222-/A223T/S228A/T229P/S230G/Q231S/Q232G/P233Q/Q234T/Q235S/T237G/S238G/S239G/S241-/Q242-/A243-/S244-/V245-/P246-/T247-/S248-/N249-/P250-/G251-/T267S/T279Q/W284Y/T289-/M290-/I291-/N292-。
在另一方面，本发明提供包含变体内切葡聚糖酶的组合物，所述变体内切葡聚糖酶与本文所述的SEQ ID NO:1相比包含一个或多个氨基酸修饰，其中所述变体内切葡聚糖酶包含所述氨基酸修饰D215*。
在另一方面，本发明提供包含变体内切葡聚糖酶的组合物，所述变体内切葡聚糖酶与如本文所述的SEQ ID NO:1相比包含一个或多个氨基酸修饰，其中所述变体内切葡聚糖酶包含所述氨基酸修饰A23S/S25N/F29Y/R33A/N36Q/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/P51S/Q66N/F67L/S68A/N75S/N80S/A82S/K90A/V102T/N116S/L121I/N122A/I123M/D132N/T135S/P136S/E144A/R145Q/S153D/D160A/A161P/Y167Q/L174Q/N180T/E184Q/R185Q/S190A/L192I/T196S/G204S/N205S/Y206F。
在进一步的方面，本发明提供包含如本文所述的变体内切葡聚糖酶的组合物，其中所述变体内切葡聚糖酶与选自下组的氨基酸序列表现出至少90％的序列同一性：SEQ IDNO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:25和SEQ IDNO:27。
在另一方面，本发明提供包含如本文所述的变体内切葡聚糖酶的组合物，其中所述变体内切葡聚糖酶与SEQ ID NO:5表现出至少90％的序列同一性。
在另一方面，本发明提供包含如本文所述的变体内切葡聚糖酶的组合物，其中所述变体内切葡聚糖酶与SEQ ID NO:7表现出至少90％的序列同一性。
在另一方面，本发明提供包含如本文所述的变体内切葡聚糖酶的组合物，其中所述变体内切葡聚糖酶与SEQ ID NO:23表现出至少90％的序列同一性。
在另一方面，本发明提供包含如本文所述的变体内切葡聚糖酶的组合物，其中所述变体内切葡聚糖酶与SEQ ID NO:27表现出至少90％的序列同一性。
在另一方面，本发明提供包含如本文所述的变体内切葡聚糖酶的组合物，其中所述变体内切葡聚糖酶具有SEQ ID NO:3。
在另一方面，本发明提供包含如本文所述的变体内切葡聚糖酶的组合物，其中所述变体内切葡聚糖酶具有SEQ ID NO:5。
在另一方面，本发明提供包含如本文所述的变体内切葡聚糖酶的组合物，其中所述变体内切葡聚糖酶具有SEQ ID NO:7。
在另一方面，本发明提供包含如本文所述的变体内切葡聚糖酶的组合物，其中所述变体内切葡聚糖酶具有SEQ ID NO:9。
在另一方面，本发明提供包含如本文所述的变体内切葡聚糖酶的组合物，其中所述变体内切葡聚糖酶具有SEQ ID NO:23。
在另一方面，本发明提供包含如本文所述的变体内切葡聚糖酶的组合物，其中所述变体内切葡聚糖酶具有SEQ ID NO:25。
在另一方面，本发明提供包含如本文所述的变体内切葡聚糖酶的组合物，其中所述变体内切葡聚糖酶具有SEQ ID NO:27。
在另一方面，本发明提供了编码如本文所述的变体内切葡聚糖酶的核酸。
在另一方面，本发明提供如本文所述的核酸，其中所述核酸针对宿主生物体进行密码子优化以在所述生物体中表达变体内切葡聚糖酶。
在另一方面，本发明提供如本文所述的核酸，其中所述核酸包含选自下组的核酸序列：SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:28。
在另一方面，本发明提供了包含本文所述核酸的表达载体。
在另一方面，本发明提供包含如本文所述的任何变体酶的核酸的宿主细胞。
在另一方面，本发明提供了包含如本文所述的表达载体的宿主细胞。
在另一方面，本发明提供如本文所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自细菌细胞、真菌细胞和酵母细胞。
在另一方面，本发明提供了一种制备变体内切葡聚糖酶的方法，包括：a)在表达所述变体内切葡聚糖酶的如本文所述的条件下培养宿主细胞；并且b)回收所述变体内切葡聚糖酶。
在另一方面，本发明提供了编码包含信号肽和成熟蛋白质的前蛋白的核酸，其中所述信号肽是野生型信号肽或与野生型信号肽相比包含一个或多个氨基酸修饰的变体信号肽；并且其中与如本文所述的SEQ ID NO:1相比，所述成熟蛋白质包含所述一个或多个氨基酸修饰。
在另一方面，本发明提供如本文所述的核酸，其中所述信号肽是野生型信号肽。
在另一方面，本发明提供如本文所述的核酸，其中所述野生型信号肽包含氨基酸序列SEQ ID NO:21。
在另一方面，本发明提供如本文所述的核酸，其中所述信号肽是与SEQ ID NO:21相比包含一个或多个氨基酸修饰的变体信号肽，其中所述一个或多个氨基酸变体信号肽中的修饰发生在对应于选自位置-18、-5、-4和-3的位置的位置。
在另一方面，本发明提供如本文所述的核酸，其中所述变体信号肽包含所述一个或多个选自下组的氨基酸修饰：T-18S、F-5L、T-4A和V-3A。
在另一方面，本发明提供如本文所述的核酸，其中所述变体信号肽包含SEQ IDNO:22的氨基酸序列。
在另一方面，本发明提供了如本文所述的核酸，其中前蛋白包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:29、SEQID NO:31和SEQ ID NO:33。
在另一方面，本发明提供了如本文所述的核酸，其包含选自下组的核酸序列：SEQID NO:14、SEQ ID NO:16、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO::20、SEQ ID NO:30、SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:34。
在另一方面，本发明提供了如本文所述的核酸，其中前蛋白与外源构建体序列可操作地连接。
在另一方面，本发明提供如本文所述的核酸，其中外源构建体序列是外源启动子。
在另一方面，本发明提供包含如本文所述的核酸的表达载体。
在另一方面，本发明提供包含如本文所述的核酸的宿主细胞。
在另一方面，本发明提供包含如本文所述的表达载体的宿主细胞。
在另一方面，本发明提供了本文所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自细菌细胞、真菌细胞和酵母细胞。
在另一方面，本发明提供了一种制备变体内切葡聚糖酶的方法，包括：a)在表达所述变体内切葡聚糖酶的条件下培养如本文所述的宿主细胞；并且b)回收所述变体内切葡聚糖酶。
在另一方面，本发明提供了一种生物石磨(biostoning)方法，包括将本文所述的变体内切葡聚糖酶与含棉织物(cotton-containing fabrics)或服装(garments)接触的步骤。
在另一方面，本发明提供了如本文所述的生物石磨方法，其中所述含棉织物或服装是粗斜纹棉布(denim)。
在另一方面，本发明提供了一种生物整理(biofinishing)方法，包括将本文所述的变体内切葡聚糖酶与纺织材料接触的步骤。
在另一方面，本发明提供如本文所述的生物整理方法，其中所述纺织材料选自下组：织物、服装和纱线。
在另一方面，本发明提供了包含本文所述的变体内切葡聚糖酶的洗涤剂组合物。
在另一方面，本发明提供如本文所述的洗涤剂组合物，其进一步包含至少一种表面活性剂和任选的至少一种辅助成分。
在另一方面，本发明提供一种处理含纤维素纤维的纺织材料的方法，包括将所述纺织材料与本文所述的洗涤剂组合物接触。
在另一方面，本发明提供一种处理木材来源的纸浆或纤维的方法，包括将本文所述的变体内切葡聚糖酶与木材来源的机械或化学纸浆或次级纤维(secondary fiber)接触的步骤。
附图说明
图1提供了由黑曲霉(Aspergillus niger)产生的野生型内切葡聚糖酶的相对活性。
图2显示了由黑曲霉产生的Ct.EG野生型(G1P)和顶部Ct.EG变体的活性改善结果。PF：性能因子(Performance Factor)。D215*表示D215突变为终止密码子以截断蛋白质的C端。“+”表示PF＝1.1-1.5倍增加，“++”表示PF＝1.6-2.0倍增加。
图3显示了Ct.EG野生型(G1P)和由黑曲霉产生的几种Ct.EG变体的生物石磨性能。D215*表示D215突变为终止密码子以截断蛋白质的C端。生物石磨性能通过实施例8中所述的目视检查来评估；更多的“+”意味着更好的生物石磨性能，其通过由多名研究人员通过定性目视检查和织物排名评估。
图4A-4N显示了实施例11中描述的Ct.EG G2P变体的活性作为与Ct.EG G2P性能的比较。标志物表示以下活性：+表示与G2P相比PF>1.1-1.5倍改善(积极效果)，++表示PF>1.5-2.0倍改善，+++表示PF>2.0-2.5倍改善，以及++++表示PF>2.5倍改善。序列相对于G1P(野生型)序列显示。*表示对终止密码子的突变以截断蛋白质的C端，而–表示相应氨基酸的缺失。
图5A-5C按位置展示了Ct.EG G2P的特定变体，其与实施例11中所述的G2P相比表现出在其pH 6.5活性中表现出有益的性能。展示了相对于G1P(野生型)序列的突变。*表示在引用位置处的终止密码子突变以截断蛋白质的C端，而–表示相应氨基酸的缺失。负氨基酸位置是指成熟蛋白质起始密码子之前的信号肽位置。
图6显示了Ct.EG野生型(G2P)和由黑曲霉产生的变体的生物石磨性能。生物石磨性能通过实施例13中所述的目视检查来评估；更多的“+”意味着更好的生物石磨性能，其通过由多名研究人员通过定性目视检查和织物排名进行评估。
图7包含如实施例14中所示进行的碱脱起球实验(alkaline depillingexperiment)的结果。在脱起球之后目视检查Ct.EG G2P和由黑曲霉产生的变体并根据实施例14中的程序排序。+的数量表示酶的相对性能，更多个+表示通过由多个研究人员对织物进行定性目视检查和排名评估的优越性能。
图8显示了Ct.EG G2P和由黑曲霉产生的变体在如实施例15中概述的碱性条件下去污能力中的性能。通过实验后的白度(whiteness)差异测量了各种酶的性能并且-表明与对照相比，白度差异<1.05，而+表示与无酶对照相比1.05-1.1倍改善，并且++表示>1.1倍改善。
图9A-B显示了Ct.EG野生型和几种Ct.EG变体的序列比对。信号肽：位置号1-21处的氨基酸；催化域(CD)：位置号22至235处的氨基酸；接头域：位置号236-277处的氨基酸；碳水化合物结合模块(CBM)：位置号278-314处的氨基酸。
图10A-10M。图10A显示了Ct.EG G1P(野生型)蛋白成熟区的氨基酸序列(SEQ IDNO:1)，编码Ct.EG G1P(野生型)蛋白成熟区的核酸序列(SEQ ID NO:2)，Ct.EG G1V1变体蛋白成熟区的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)，以及编码Ct.EG G1V1变体蛋白的成熟区的核酸序列(SEQ ID NO:4)。图10B显示了Ct.EG G1V2变体蛋白成熟区的氨基酸序列(SEQ ID NO:5)，编码Ct.EG G1V2变体蛋白成熟区的核酸序列(SEQ ID NO:6)，以及Ct.EG G1V3变体蛋白成熟区的氨基酸序列(SEQ ID NO:7)。图10C显示了编码Ct.EG G1V3变体蛋白成熟区的核酸序列(SEQ ID NO:8)，Ct.EG G1V4变体蛋白成熟区的氨基酸序列(SEQ ID NO:9)，以及编码Ct.EG G1V4变体蛋白成熟区的核酸序列(SEQ ID NO:10)。图10D显示了包括信号肽和成熟区的Ct.EG G1P(野生型)蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:11)，编码包括信号肽和成熟区的Ct.EG G1P(野生型)蛋白的核酸序列(SEQ ID NO:12)，以及包括信号肽和成熟区的Ct.EGG1V1变体蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:13)。图10E显示了编码包括信号肽和成熟区的Ct.EG G1V1变体蛋白的核酸序列(SEQ ID NO:14)，以及包括信号肽和成熟区的Ct.EG G1V2变体蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:15)。图10F显示了编码包括信号肽和成熟区的Ct.EGG1V2变体蛋白的核酸序列(SEQ ID NO:16)，以及包括信号肽和成熟区的Ct.EG G1V3变体蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:17)。图10G显示了编码包括信号肽和成熟区的Ct.EG G1V3变体蛋白的核酸序列(SEQ ID NO:18)，以及包括信号肽和成熟区的Ct.EG G1V4变体蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:19)。图10H显示了编码包括信号肽和成熟区的Ct.EG G1V4变体蛋白的核酸序列(SEQ ID NO:20)，野生型信号肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:21)，以及变体信号肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:22)。图10I显示了Ct.EG G2V1变体蛋白成熟区的氨基酸序列(SEQ ID NO:23)，编码Ct.EG G2V1成熟区的核酸序列(SEQ ID NO:24)，Ct.EG G2V2变体蛋白成熟区的氨基酸序列(SEQ ID NO:25)，以及编码Ct.EG G2V2成熟区的核酸序列(SEQ IDNO:26)。图10J显示了Ct.EG G2V3变体蛋白成熟区的氨基酸序列(SEQ ID NO:27)，以及编码Ct.EG G2V3成熟区的核酸序列(SEQ ID NO:28)。图10K显示了包括信号肽和成熟区的Ct.EGG2V1变体蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:29)，以及编码包括信号肽和成熟区的Ct.EG G2V1的核酸序列(SEQ ID NO:30)。图10L显示了包括信号肽和成熟区的Ct.EG G2V2变体蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:31)，以及编码包括信号肽和成熟区的Ct.EG G2V2的核酸序列(SEQID NO:32)。图10M显示了包括信号肽和成熟区的Ct.EG G2V3变体蛋白的氨基酸序列(SEQID NO:33)，以及编码包括信号肽和成熟区的Ct.EG G2V3的核酸序列(SEQ ID NO:34)。
具体实施方式
1.导言
在纺织业中，“石洗外观(stonewashed look)”或磨损外观(abraded look)近年来一直是粗斜纹棉布生产商的兴趣所在。传统上，石洗是通过使用将浮石(pumice stone)添加到洗涤滚筒中以磨损服装的过程来局部去除靛蓝染料来实现的。这种在粗斜纹棉布织物上进行的传统“石洗”整理降低织物的强度，增加洗涤机器的负担并造成废水污染。趋势是一种称为“生物石磨”的环境友好工艺，它使用纤维素酶等酶来洗涤/生物石磨粗斜纹棉布，在不损害机器或环境的情况下产生其期望的磨损外观。受控酶处理可节省成本并改善质量，而无需处理石头。
此外，纺织业在生物整理中使用纤维素酶，即产生永久的脱起球改进和改进的起球抗性，通过减少绒毛清除表面结构，改进织物手感，例如柔软度、光滑度和更柔滑的感觉，改进布质性能和更亮的织物颜色和改进吸湿性。
作为一类纤维素酶的内切葡聚糖酶是纤维素向葡萄糖的生物转化通常需要的，并且在纺织、洗涤剂和纸浆和造纸业中具有极其广泛的应用。
然而，许多利用内切葡聚糖酶的工业过程在宽的温度范围，例如20-60℃和宽的pH值范围，例如pH 4-12下运行；因此，本文需要并提供活性、温度和pH稳定的内切葡聚糖酶。
II.定义
本文中的“蛋白质”是指至少两个共价连接的氨基酸，包括蛋白质、多肽、寡肽和肽。肽基通常包含天然存在的氨基酸和肽键。此外，多肽可包括一个或多个侧链或末端的合成衍生化、糖基化、聚乙二醇化、环状置换、环化、与其他分子的接头、与蛋白质或蛋白质域的融合以及肽标签或标记物的添加。
如本文所用，“氨基酸”和“氨基酸身份”是指由DNA和RNA编码的20种天然存在的氨基酸之一。
如本文所用，“位置”是指蛋白质序列中的位置。通常，正位置编号相对于成熟内切葡聚糖酶序列的第一个氨基酸，例如不包括信号肽。例如，野生型内切葡聚糖酶(SEQ IDNO:1)序列的A23代表野生型内切葡聚糖酶从成熟区向前数的第23个氨基酸为丙氨酸。在包含信号肽的前蛋白(preprotein)的情况下，编号从“1”位成熟蛋白的第一个氨基酸开始倒数，信号肽C端的最后一个氨基酸为“-1”。也就是说，使用“X”作为氨基酸的10个氨基酸的信号肽为“X-9/X-8/X-7/X-6/X-5/X-4/X-3/X-2/X-1/X+1(成熟蛋白质的开始)”。例如，包括信号肽和成熟区的野生型内切葡聚糖酶蛋白(SEQ ID NO:11)的F-5表示从信号肽的最后一个氨基酸向后计数的第5个氨基酸(或从成熟区域的第一个氨基酸开始倒数的第六个氨基酸)是苯丙氨酸。在一些情况下，位置编号相对于包括信号肽和成熟区的内切葡聚糖酶序列的第一个氨基酸，例如图4。
术语“成熟多肽”是指在翻译和任何翻译后修饰，例如N-末端加工、C-末端截短、糖基化、磷酸化等之后处于其最终形式的多肽。
短语“成熟多肽编码序列”是指编码具有内切葡聚糖酶活性的成熟多肽的多核苷酸。
如本文所用，“残基”是指蛋白质中的位置及其相关的氨基酸身份。例如，甘氨酸3(也称为Gly3或G3)是野生型内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:1)中第3位的残基。
术语“野生型”内切葡聚糖酶是指内切葡聚糖酶在它存在于天然存在的微生物中，例如自然界中发现的细菌、酵母或丝状真菌时的典型形式的序列。实施例1显示了来自不同来源的多种野生型内切葡聚糖酶。
如本文所用，“亲本多肽”是指随后被修饰以产生变体的起始多肽。亲本多肽可以是天然存在的多肽，或天然存在的多肽的变体或工程化形式。亲本多肽可以指多肽本身、包含亲本多肽的组合物或编码它的氨基酸序列。在本案中，一些实施方案利用野生型内切葡聚糖酶成熟蛋白(SEQ ID NO:1)作为亲本多肽。一些实施方案利用包括信号肽和成熟蛋白的野生型内切葡聚糖酶蛋白(SEQ ID NO:11)作为亲本多肽。
如本文所用，“变体蛋白质”或“蛋白质变体”或“变体”是指由于至少一个氨基酸修饰而不同于亲本蛋白质的蛋白质。蛋白质变体可以指蛋白质本身、包含蛋白质的组合物或编码蛋白质的氨基酸序列。优选地，与亲本蛋白质相比，蛋白质变体具有至少一个氨基酸修饰，例如从约一个到约五十个氨基酸修饰。如下所述，在一些实施方案中，亲本多肽是SEQID NO:1的野生型序列(不包括信号肽)。在一些实施方案中，亲本多肽是SEQ ID NO:11的野生型序列(包括信号肽)。如下文进一步讨论的，本文中的蛋白质变体序列将优选地与亲本蛋白质序列具有至少约80％的同一性，更优选地具有至少约85％的同一性。变体蛋白质可以指变体蛋白质本身、包含蛋白质变体的组合物或编码它的DNA序列。因此，本文中的“变体内切葡聚糖酶”是指与亲本内切葡聚糖酶相比在氨基酸序列中具有至少一个氨基酸修饰的新型内切葡聚糖酶。如本文所讨论的，在一些情况下，亲本内切葡聚糖酶是变体内切葡聚糖酶的第二代或更高代。除非另有说明或根据上下文显而易见，本发明的变体内切葡聚糖酶通常与野生型序列(SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:11)进行比较。此外，除非另有说明，否则本发明的变体内切葡聚糖酶具有酶活性，即，存在有使用以下实施例中描述的内切葡聚糖酶测定法可检测的内切葡聚糖酶活性。
取代是指用不同的氨基酸替换占据位置的氨基酸；缺失是指去除占据位置的氨基酸；插入是指在占据位置的氨基酸附近并紧接其后添加氨基酸。
本文中的“修饰”是指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失，或对与蛋白质化学连接的部分的改变。例如，修饰可以是连接到蛋白质的改变的碳水化合物或PEG结构。“氨基酸修饰”在本文中是指多肽序列中的氨基酸取代、插入和/或缺失。为清楚起见，除非另有说明，氨基酸修饰总是指由DNA编码的氨基酸中的修饰，例如在DNA和RNA中具有密码子的20个氨基酸。
本文中的“氨基酸取代”或“取代”是指用不同的氨基酸替换亲本多肽序列中特定位置的氨基酸。特别地，在一些实施方案中，取代是在特定位置处非天然存在，不在生物体内或在任何生物体中天然存在的氨基酸。例如，取代A23S是指变体多肽，在这种情况下是内切葡聚糖酶，其中第23位的丙氨酸被丝氨酸替换。多个突变由正斜杠(“/”)分隔，例如，“I38L/Y39S/G42N”分别代表第38、39和42位取代(在某些情况下可以使用“+”)。为清楚起见，经过工程化改造以改变核酸编码序列但不改变起始氨基酸(例如，将CGG(编码精氨酸)更换为CGA(仍编码精氨酸)以增加宿主生物体表达水平)的蛋白质不是“氨基酸取代”；也就是说，尽管产生了编码相同蛋白质的新基因，但如果该蛋白质在其起始的特定位置处具有相同的氨基酸，则它不是氨基酸取代。
如本文所用，“氨基酸插入”或“插入”是指在亲本多肽序列中的特定位置处添加氨基酸序列。
如本文所用，“氨基酸缺失”或“缺失”是指去除亲本多肽序列中特定位置处的氨基酸序列。例如，S221-或S221#、S221()或S221del表示第221位丝氨酸的缺失。此外，SAA221-或SAA221#表示从第221位开始的序列SerAlaAla的缺失。“*”表示突变为终止密码子以截断蛋白质的C端。例如，D215*表示D215突变为终止密码子以截断蛋白质的C端。
如本文所用，“非天然存在的修饰”是指在野生型酶中未发现的氨基酸修饰。
术语“内切葡聚糖酶”或称为“1,4-β-D-葡聚糖水解酶”是归类为E.C.3.2.1.4的酶并且是纤维素生物转化为葡萄糖通常需要的一类纤维素酶。内切葡聚糖酶切割内部β-1,4-葡萄糖苷键，而纤维二糖水解酶从纤维素聚合物链的末端切割二糖纤维二糖，而β-1,4-葡萄糖苷酶将纤维二糖和其他短纤维寡糖水解成葡萄糖。一些天然存在的内切葡聚糖酶具有纤维素结合域，而另一些则没有。出于本发明的目的，根据本文实施例中描述的程序确定内切葡聚糖酶活性，例如，实施例3中用于确定内切葡聚糖酶活性的CMC(羧甲基纤维素)测定法。
术语织物或服装的“生物石磨”是指使用酶代替浮石或者在浮石外使用酶处理织物或服装，尤其是粗斜纹棉布，以提供“石洗外观”或磨损外观。“石洗外观”或称为“磨损外观”或“用旧外观(worn look)”是指织物或服装的外观，尤其是经过纤维素酶或石头或两者处理后的粗斜纹棉布，这导致染色区域与已经由于不均匀染料除去的处理而除去染料的区域之间形成对比。在酶石洗或生物石磨中，完全或部分消除了用浮石的磨损，并添加酶以促进靛蓝染料从纤维表面的磨损。本发明的内切葡聚糖酶特别适用于提供磨损的外观并使生物石磨中的回染(backstaining)最小化。术语“回染”是指释放的染料重新沉积在织物纤维表面上的趋势。本发明的内切葡聚糖酶处理可以完全替换传统的浮石处理。然而，当需要产生严重磨损的饰面(finish)时，内切葡聚糖酶处理可以与浮石处理相结合。就本发明而言，“粗斜纹棉布”是指粗斜纹棉布织物，通常是牛仔服装(denim garment)，尤其是牛仔裤。有利地，粗斜纹棉布是靛蓝染色的粗斜纹棉布。粗斜纹棉布也可以用靛蓝、靛蓝衍生物处理或用靛蓝与一些其他染料一起染色粗斜纹棉布，例如，硫底靛蓝染色的粗斜纹棉布。
生物石磨通常在约pH 3.0-8.0下进行，优选在pH 4.0-6.5下进行。反应温度可以在约20℃至70℃的范围内，优选在45-55℃或20-30℃之间。液体比(液体体积与织物重量之比)可以在约3:1至20:1，优选10:1至20:1的范围内。处理时间可以在15分钟到90分钟之间，优选在30分钟到60分钟之间。需要强调的是，酶剂量很大程度上取决于织物的类型、机器、工艺条件(pH、温度、液体比、处理时间、粗斜纹棉布加载、工艺规模)和酶制剂的类型等。
术语“生物整理”(也称为脱起球、脱起毛(defuzzing)或生物抛光(biopolishing))是指在纤维素纤维的受控水解中使用酶，以便以如下的方式修饰织物或纱线表面，所述方式防止永久起球、改善织物手感如柔软性和光滑性，通过减少起毛来清除表面结构，从而使颜色清晰，提高织物的布质性能，改善吸湿性，也可以改善可染色性。
生物整理通常在约pH 4.0-12下进行。反应温度可以在约20℃至70℃的范围内，优选为45-60℃或20-40℃。液体比(每重量织物的液体体积比)可以在约3:1至200:1、优选10:1至15:1、150:1至250:1的范围内。温育时间通常为15至90分钟，优选30至60分钟。酶剂量很大程度上取决于织物的类型、机器、工艺条件(pH、温度、液体比、处理时间、粗斜纹棉布加载、洗衣加载、洗涤剂、工艺规模)和酶制剂的类型等。
术语“脱色”(也称为“去污”或“防污(anti-soiling)”)是指与去污剂和洗涤过程相协调使用酶以去除沉积在织物纤维中的任何类型的染污剂，在脱色过程之后得到的织物更少染污，和/或颜色或白度更亮。
脱色通常在pH 4.0-12下进行，优选在pH 9-12下进行。反应温度范围可以为20℃-60℃，优选在20-40℃下进行。液体比(每重量织物的液体体积比)可以在约3:1至200:1、优选10:1至15:1、150:1至250:1的范围内。温育时间通常为10至90分钟，优选20至40分钟。酶剂量很大程度上取决于织物的类型、机器、工艺条件(pH、温度、液体比、处理时间、粗斜纹棉布加载、工艺规模)和酶制剂的类型等。
术语“编码序列”是指直接指定变体的氨基酸序列的多核苷酸。编码序列的边界通常由开放阅读框决定，所述开放阅读框以起始密码子如ATG、GTG或TTG开始，以终止密码子如TAA、TAG或TGA结束。编码序列可以是基因组DNA、cDNA、合成DNA或其组合。
术语“洗涤剂”是指一种清洁剂，它可以含有表面活性剂(阴离子、非离子、阳离子和两性表面活性剂)和任选的其他辅助成分，例如抗再沉积和污垢悬浮剂、荧光增白剂、漂白剂、染料和颜料以及水解酶。美国专利No.5,433,750(在此通过引用整体并入)中给出了洗涤剂含量的合适列表。美国专利No.3,664,961(在此通过引用整体并入)中给出了合适的表面活性剂列表。
本文核酸序列上下文中的“外源”是指外源元件在自然界中通常不与第二元件相关联，因此是人工或合成构建体。“外源构建体序列”在本文中是指通常不与编码内切葡聚糖酶的核酸相关的构建体序列(无论氨基酸或核酸序列，尽管如使用该术语的背景应当理解，通常指核酸序列)。在许多实施方案中，本发明提供了包含与外源构建体序列如外源启动子连接的内切葡聚糖酶编码序列的核酸构建体。为了清楚起见，通常对“外源”的提及是指内切葡聚糖酶而非宿主细胞。例如，如果宿主细胞是黑曲霉细胞，则与内切葡聚糖酶基因可操作地连接的启动子可以是黑曲霉内源性的但对于内切葡聚糖酶是外源的(例如，来自黑曲霉α-淀粉酶的启动子可以与本发明的内切葡聚糖酶连接)。因此，在一些实施方案中，本发明提供了核酸构建体，其编码与外源构建体核酸序列可操作地连接的内切葡聚糖酶(无论是野生型还是变体)的核酸构建体。“外源构建体序列”在本文中是指通常不与编码内切葡聚糖酶的核酸相关的构建体序列(无论氨基酸或核酸序列，尽管如使用该术语的背景应当理解，通常指核酸序列)。
可包含在染色体外或整合表达载体中的合适构建体序列包括但不限于选择标志物、纯化标签、复制起点和调控序列，包括但不限于启动子(诱导型和组成型)、增强子、核糖体结合位点、起始密码子、终止密码子、Shine-Dalgarno序列等。
本文中的“选择标志物”或“可选择标志物”或“选择蛋白”是指引入宿主细胞的蛋白质，其在宿主细胞生长期间赋予适合于人工选择的性状，使得仅那些含有选择标志物的细胞生长。因此，选择标志物是其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养型等的基因。下面概述了选择标志物的例子。因此，“选择基因”是编码选择蛋白的核酸。
本文中的“染色体外表达载体”(通常也称为“质粒”)是指携带感兴趣的基因的自我复制表达载体(通常为质粒)，其保留在细胞内并且不整合到宿主细胞的基因组内。
本文中的“整合表达载体”是指设计为插入宿主细胞基因组中的载体，有时称为“附加体”。
术语“控制序列”是指表达编码本发明的内切葡聚糖酶的多核苷酸所必需的核酸序列。每个控制序列对于编码变体的多核苷酸可以是天然的(即，来自相同的基因)或外源的(即，来自不同的基因)或者彼此是天然的或外源的。此类控制序列包括但不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、肽原序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。控制序列至少包括启动子、转录和翻译终止信号。控制序列可以与接头一起提供，目的是引入促进控制序列与编码变体的多核苷酸的编码区连接的特定限制性位点。
术语“表达”包括涉及产生本文所述的多肽、蛋白质或前蛋白的任何步骤，包括但不限于转录、转录后修饰、翻译、翻译后修饰和分泌。
术语“前蛋白”是指作为无活性蛋白质或肽并且包含信号肽序列的蛋白质前体。前蛋白可以通过翻译后修饰转化为活性形式的蛋白质，例如切断信号肽。
术语“表达载体”是指线性或环状DNA分子，其包含编码如本文所述的多肽、蛋白质或前蛋白的多核苷酸，并且可操作地连接至提供其表达的控制序列。
术语“片段”是指从成熟多肽的氨基和/或羧基末端缺少一个或多个(例如，几个)氨基酸的多肽。本文中的“内切葡聚糖酶片段”是指保持内切葡聚糖酶活性的本文所述氨基酸序列的一部分。在一方面，内切葡聚糖酶片段含有具有根据本发明的取代中的0个、1个或多个的成熟内切葡聚糖酶多肽的至少50、至少100、至少150、至少200、至少220、至少240、至少260、至少280个氨基酸残基。在一些方面，内切葡聚糖酶片段包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。
术语“宿主细胞”是指易于用含有本发明多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等，并且允许表达酶的任何细胞类型。术语“宿主细胞”包括由于复制期间发生的突变而与亲本细胞不同的亲本细胞的任何后代。在许多实施方案中，本发明的内切葡聚糖酶(包括本文所述的内切葡聚糖酶和变体酶)在内源宿主中不产生。
术语“改善的特性”是指与亲本内切葡聚糖酶相比改善的与本文所述的变体内切葡聚糖酶相关的特征。内切葡聚糖酶的此类改善的特性包括但不限于增加的总活性、增加的比活性(例如催化活性、其结合纤维素材料的能力和/或其纤维素分解/水解活性)、增加的温度活性(例如，在宽的温度范围增加的活性)、增加的pH活性(例如，在宽pH范围的增加的活性)、增加的总稳定性、增加的温度稳定性(例如增加对宽温度范围的稳定性)和增加的pH耐受性(例如，增加的对宽pH范围的稳定性)。进一步改善的特性包括但不限于在织物处理和传统上使用纤维素酶的其他领域中的效率或效果的改善，例如在生物石磨和/或生物整理过程中提高的效率或改善的效果。
术语“分离的”是指在自然界中不存在的形式或环境中的物质。分离物质的非限制性实例包括(1)任何非天然存在的物质，(2)至少部分自一种或多种或所有在自然界中与其相关的天然存在成分取出的任何物质，包括但不限于任何酶、变体、核酸、蛋白质、肽或辅因子；(3)相对于自然界中发现的该物质经人为修饰的任何物质；或(4)通过增加物质相对于与其天然相关的其他成分的量而修饰的任何物质(例如，编码该物质的基因的多个拷贝；使用比与编码物质的基因天然相关的启动子更强的启动子等)。具体参考本发明的分离的内切葡聚糖酶，分离的内切葡聚糖酶通常是：a)从通常与之相关的其他蛋白质中纯化出来；b)当酶处于自然界中未发现的浓度时，或c)当酶在非内源性宿主细胞中产生时。
术语“核酸构建体”是指从天然存在的基因中分离或以一定方式修饰以包含核酸片段并且包含一个或多个控制序列的单链或双链的核酸分子，所述核酸片段在其它情况下不会存在于自然界或是合成的。
术语“可操作地连接”是指如下的构造，其中构建体序列相对于多核苷酸编码序列置于适当位置，使得控制序列指导、允许或促进编码序列的表达。
术语“亲本”或“亲本内切葡聚糖酶”是指进行改变以产生本发明的变体内切葡聚糖酶的内切葡聚糖酶。亲本可以是天然存在的(野生型)多肽或其变体或片段。在一些实施方案中，本发明的亲本多肽是SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，本发明的亲本多肽是SEQID NO:11。
两个氨基酸序列之间或两个核苷酸序列之间的相关性由参数“序列同一性”描述。出于本发明的目的，使用Needleman-Wunsch算法(Needleman and Wunsch,1970,J.Mol.Biol.48:443-453)确定两个氨基酸序列之间的序列同一性，如在EMBOSS包(EMBOSS:The European Molecular Biology Open Software Suite,Rice et al.,2000,TrendsGenet.16:276-277)，优选5.0.0版以上的Needle程序中实施。使用的参数是缺口开放罚分10，缺口扩展罚分0.5，以及EBLOSUM62(BLOSUM62的EMBOSS版本)替换矩阵。标记为“最长同一性”的Needle输出(使用-nobrief选项获得)用作同一性百分比，并且如下计算：
(相同的残基x 100)/(比对的长度-比对中的缺口总数)
术语“子序列”是指在成熟多肽编码序列的5'-和/或3'-末端不存在一个或多个(例如，几个)核苷酸的多核苷酸；其中子序列编码具有内切葡聚糖酶活性的片段。在一些实施方案中，本发明的子序列包含SEQ ID NO:4的核酸序列。在一些实施方案中，本发明的子序列包含SEQ ID NO:8的核酸序列。在一些实施方案中，本发明的子序列包含SEQ ID NO:23的核酸序列。在一些实施方案中，本发明的子序列包含SEQ ID NO:25的核酸序列。
III.本发明的内切葡聚糖酶
本发明提供了用于多种应用(包括纺织、洗涤剂和纸浆和造纸业)的热活性、热稳定和/或pH稳定和活性内切葡聚糖酶。本发明提供了使用包含SEQ ID NO:1的内切葡聚糖酶及其变体的组合物和方法，如下文更充分地描述。
IV.本发明的变体内切葡聚糖酶
因此，本发明提供了具有改善特性的变体内切葡聚糖酶，其可用于多种应用，包括纺织、洗涤剂以及纸浆和造纸业。
一般而言，与如SEQ ID NO:1所示的亲本内切葡聚糖酶相比，本发明的变体内切葡聚糖酶可以在许多生化特性中的一种或多种中具有改善。可在本文中改善的变体内切葡聚糖酶的生化特性包括但不限于总活性、比活性、温度活性、pH活性、总稳定性、温度稳定性、pH耐受性、制剂稳定性(包括液体、固体和团粒)、蛋白酶稳定性、在生物石磨、生物整理等过程中的性能。一般而言，与Ct.EG野生型(G1P)内切葡聚糖酶(如SEQ ID NO:1所示)相比，使用内切葡聚糖酶活性测定和/或生物石磨功效测定测量改善，如下文概述。
本发明的变体内切葡聚糖酶与如SEQ ID NO:1所示的野生型内切葡聚糖酶相比具有一种或多种改善的特性。“改善”在本文中是指至少一种生化特性的期望变化。随着期望特性(例如总活性和pH耐受性)的增加或不希望特性(例如蛋白酶敏感性)的降低，“改善的功能”可以测量为特定活性的百分比增加或减少，或“倍数”变化。即，与野生型内切葡聚糖酶相比，变体内切葡聚糖酶的总活性可增加10％或蛋白酶敏感性降低10％。或者，变体内切葡聚糖酶可具有2倍的pH耐受性增加或3倍的蛋白酶敏感性降低。通常，百分比变化用于描述小于100％的生化活性变化，而倍数变化用于描述与亲本酶相比大于100％的生化活性变化。在本发明中，可以完成至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％和99％的生化活性的百分比变化(通常增加)。在本发明中，与起始酶或亲本酶相比，测量“倍数增加”(或减少)。例如，如图2所示，与Ct.EG野生型(SEQ ID NO:1)相比，G1V1的总活性增加1.6-2.0倍：这是通过[(变体活性)/(亲本活性)]计算的。在许多实施方案中，改进为至少一又十分之一倍(1.1)、一倍半(1.5倍)、2倍、2.5倍或更高。
A.CMC测定以确定总活性
在一些实施方案中，使用CMC测定来确定内切葡聚糖酶总活性，例如实施例3和6中描述的。具体而言，将溶解在100mM磷酸钠、pH 6.5缓冲液(Catalog#C5678)中的1.8mL的1.5％低粘度CMC添加到玻璃试管中。将500μL来自实施例2的稀释酶上清液加入1.5mLEppendorf管中。Eppendorf管和含有CMC的玻璃试管均在50℃水浴中预热5分钟。一旦达到5分钟，将200μL稀释的酶从Eppendorf管转移到具有CMC的玻璃试管中并混合2-3秒。将玻璃试管迅速放入50℃水浴中，开始计时15分钟。到达15分钟后，将3mL DNS溶液转移到玻璃试管中，并将玻璃试管置于沸水浴中5分钟。5分钟后，将玻璃试管转移到室温水浴中，并且向玻璃试管中加入5mL MilliQ水。混合后，将1mL反应溶液从玻璃试管转移到皿中，并且对于活性，读取540nm处的吸光度。图1中的相对CMC活性计算为EG候选物的CMC活性除以显示最低CMC活性的EG-候选物1的CMC活性。
因此，如图2所示，与G1P(如SEQ ID NO:1所示)相比，本发明的许多变体内切葡聚糖酶表现出增加的活性。
B.生物石磨功效测定
在一些实施方案中，采用诸如实施例8中所述的测定法来确定(变体)内切葡聚糖酶的生物石磨功效。具体地，通过将9英寸x7.5英寸的牛仔裤腿放入Foshan YanuoPrecision Machinery Manufacturing Co.,Ltd,China(model number GX-350Z)制造的工业尺寸洗衣机中进行脱浆(de-sized)。连同牛仔裤腿一起加入20升水、15克高浓度防染油(anti-dyeing oil)和15克防染粉(anti-dyeing powder)。温度设置为60℃，并且旋转设置为50rpm，持续15分钟。完成15分钟旋转后，将水排干，加入18L水，继续旋转2分钟，并且此步骤重复2次。完成后，将牛仔裤腿用流水冲洗并在60℃的烘箱中干燥。对于随后的生物石磨，将2条脱浆牛仔裤加入带有18L水的洗衣机中，并将pH调节至pH 6.5。一旦温度达到50℃，加入标准化酶量。以50rpm的转速进行生物石磨50分钟。完成后，将水排干，加入18L水，继续旋转2分钟，此步骤重复2次。接下来，将牛仔裤腿用流水冲洗并在60℃的烘箱中干燥。干燥后，通过目视检查生物石磨的牛仔裤材料上的蓝色和白色对比度来比较生物石磨功效。
因此，如图3所示，与G1P(如SEQ ID NO:1所示)相比，本发明的许多变体内切葡聚糖酶表现出增加的生物石磨功效或改善的生物石磨性能。
C.pH耐受性
在许多实施方案中，与亲本内切葡聚糖酶相比，本发明的变体内切葡聚糖酶具有改变的pH耐受性。“增加的pH耐受性”在本文中是指在相同的攻击条件下，变体酶比亲本内切葡聚糖酶(例如G1P)更稳定，即在相同条件下变体的活性高于G1P的活性。例如，生物石磨或生物整理加工可以在各种pH下进行，具体取决于原始底物和反应条件。
总之，与SEQ ID NO:1相比，本发明的变体内切葡聚糖酶在50℃下持续一段时间可表现出对pH 6.5的耐受性增加，所述时间段通常在约10分钟至3小时的范围内。与亲本内切葡聚糖酶相比，本发明的变体内切葡聚糖酶还可在30℃和/或40℃持续20分钟至30分钟的范围内的时段表现出对pH 10.0、pH10.5和/或pH 11.0增加的耐受性。
D.热稳定性
在许多实施方案中，本发明的变体内切葡聚糖酶具有增加的热稳定性，特别是在用于生物石磨或生物整理加工过程的高温条件下。“热稳定性”在此上下文中是指在相同的热攻击条件下，变体酶比亲本内切葡聚糖酶(例如G1P)更稳定，即在相同条件下(通常使用如本文概述的内切葡聚糖酶测定)，变体活性高于G1P活性。
合适的热稳定性测定如下。将50μl来自裂解液板中的酶加入96孔Biorad PCR板中，并在30-70℃下攻击10分钟。对照反应在室温下放置相同的时间量。在热攻击之后，使用对照反应确定残余活性。在相同条件下将内切葡聚糖酶变体的活性与亲本进行比较以确定热稳定性的改善。
总之，与SEQ ID NO:1相比，本发明的变体内切葡聚糖酶在30℃、40℃、45℃、50℃、55℃、58℃、60℃、65℃、66℃、70℃、75℃、80℃和/或85℃持续一段时间，一般范围为约10分钟到3小时的时段可以表现出增加的热稳定性。
E.比活性测定
在一些实施方案中，与亲本内切葡聚糖酶，特别是G1P相比，本发明的变体内切葡聚糖酶具有增加的比活性。本文中的“比活性”是指每数量(重量)酶的活性，通常通过将样品的酶活性(有时以“内切葡聚糖酶单位”测量)除以内切葡聚糖酶的量来确定，通常如本领域中已知的那样测定。
F.蛋白酶易感性
在一些实施方案中，在相同条件下，本发明的变体内切葡聚糖酶比亲本酶对蛋白酶降解更不易感。在一些情况下，在生产宿主生物中在生产变体内切葡聚糖酶期间由宿主生物体产生的蛋白酶进行的蛋白酶降解可以成问题，从而导致活性酶的产率较低。类似地，根据变体酶的用途，原始底物或可以降解内切葡聚糖酶的组合使用的其他酶中可能存在其他蛋白酶。
这通常如本领域已知的那样确定，例如通过允许蛋白水解降解，然后对所得片段进行N-末端测序以确定切割位点。在某些情况下，根据变体和宿主生产生物体，可能不存在显著的蛋白水解降解。
根据需要，如本领域技术人员将理解的，可以进行的特定突变将取决于宿主生物体产生的内源蛋白酶，并且通常也发生在因此可接近于蛋白酶的表面暴露的环结构或转角中。
V.特定变体内切葡聚糖酶
本发明提供了与SEQ ID NO:1相比包含一个或多个氨基酸修饰的变体内切葡聚糖酶，其中所述一个或多个氨基酸修饰发生在对应于选自下组的位置的位置处：位置2,17,23,25,29,33,36,38,39,42,43,44,48,51,54,66,67,68,75,77,80,82,90,102,116,121,122,123,132,135,136,141,144,145,153,160,161,164,167,174,180,184,185,190,192,194,195,196,204,205,206,215,216,217,218,219,220,221,222,223,228,229,230,231,232,233,234,235,237,238,239,241,242,243,244,245,246,247,248,249,250,251,258,259,267,268,269,270,271,273,274,275,276,277,278,279,280,281,282,283,284,285,286,287,288,289,290,291,292和293，其中所述变体内切葡聚糖酶具有内切葡聚糖酶活性。在一些实施方案中，所述变体内切葡聚糖酶表现出与SEQ ID NO:1至少80％的序列同一性。在一些实施方案中，所述变体内切葡聚糖酶表现出与SEQ ID NO:1至少81％的序列同一性。在一些实施方案中，所述变体内切葡聚糖酶表现出与SEQ ID NO:1至少82％的序列同一性。在一些实施方案中，所述变体内切葡聚糖酶表现出与SEQ ID NO:1至少83％的序列同一性。在一些实施方案中，所述变体内切葡聚糖酶表现出与SEQ ID NO:1至少84％的序列同一性。在一些实施方案中，所述变体内切葡聚糖酶表现出与SEQ ID NO:1至少85％的序列同一性。
本发明提供了与SEQ ID NO:1相比包含一个或多个氨基酸修饰的变体内切葡聚糖酶，其中所述一个或多个氨基酸修饰发生在对应于选自下组的位置处：位置2,17,23,25,29,33,36,38,39,42,43,44,48,51,54,66,67,68,75,77,80,82,90,102,116,121,122,123,132,135,136,141,144,145,153,160,161,164,167,174,180,184,185,190,192,194,195,196,204,205,206,215,216,217,218,219,220,221,222,223,228,229,230,231,232,233,234,235,237,238,239,241,242,243,244,245,246,247,248,249,250,251,258,259,267,268,269,270,271,273,274,275,276,277,278,279,280,281,282,283,284,285,286,287,288,289,290,291,292和293，其中所述变体内切葡聚糖酶与SEQ ID NO:1具有至少80％的序列同一性；并且其中所述变体内切葡聚糖酶具有内切葡聚糖酶活性。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置2处具有天冬氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自D2E、D2F、D2N、D2Q、D2S和D2T。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置17处具有丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是S17G。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置23处具有丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自A23D,A23N和A23S。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置25处具有丝氨酸氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是S25N。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置29处具有苯丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是F29Y。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置33处具有精氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是R33A。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置36处具有天冬酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是N36Q。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置38处具有异亮氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是I38L。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置39处具有酪氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是Y39S。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置42处具有甘氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是G42N。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置43处具有丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自A43E,A43L,A43S,A43T和A43V。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置44处具有赖氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是K44E或K44Q。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置48处具有谷氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是E48N。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置51处具有脯氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自P51E,P51N,P51S和P51T。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置54处具有丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是S54T。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置66处具有谷氨酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是Q66N或Q66T。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置67处具有苯丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是F67L或F67Y。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置68处具有丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是S68A。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置75处具有天冬酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是N75S。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置77处具有丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是A77E或A77Q。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置80处具有天冬酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是N80S。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置82处具有丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是A82S。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置90处具有赖氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是K90A。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置102处具有缬氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自V102Q,V102R和V102T。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置116处具有天冬酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自N116D,N116E和N116S。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置121处具有亮氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是L121I。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置122处具有天冬酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是N122A或N122S。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置123处具有异亮氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是I123M。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置132处具有天冬氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是D132N。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置135处具有苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是T135S。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置136处具有脯氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)。在一些实施方案中，氨基酸取代是P136S。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置141处具有亮氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是L141S。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置144处具有谷氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是E144A。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置145处具有精氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是R145Q。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置153具有丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是S153D。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置160处具有天冬氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是D160A。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置161处具有丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)。在一些实施方案中，氨基酸取代是A161K或A161P。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置164处具有脯氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)。在一些实施方案中，氨基酸取代是P164S或P164T。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置167处具有酪氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是Y167Q。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置174处具有亮氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是L174Q。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置180处具有天冬酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是N180T。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置184处具有谷氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自E184A,E184K,E184N,E184Q,E184R,E184S和E184T。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置185处具有精氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是R185Q。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置190处具有丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是S190A。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置192处具有亮氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是L192I。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置194处具有丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是A194T。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置195处具有精氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是R195S。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置196处具有苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是T196S。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置204处具有甘氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是G204S。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置205处具有天冬酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是N205S。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置206处具有酪氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是Y206F。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置215处具有天冬氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是D215G。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置216处具有丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是S216N。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置217处具有脯氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)。在一些实施方案中，氨基酸取代是P217G。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置218处具有丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是S218G。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置219处具有丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是S219T。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置220处具有丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是S220G。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置223处具有丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是A223T。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置228处具有丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是S228A。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置229处具有苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)。在一些实施方案中，氨基酸取代是T229P。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置230处具有丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是S230G。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置231处具有谷氨酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是Q231S。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置232处具有谷氨酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是Q232G。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置233处具有脯氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)。在一些实施方案中，氨基酸取代是P233Q。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置234处具有谷氨酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是Q234T。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置235具有谷氨酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是Q235S。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置237处具有苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是T237G。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置238处具有丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是S238G。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置239处具有丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是S239G。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置258处具有色氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是W258R或W258S。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置259处具有丙氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是A259D。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置267处具有苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是T267S。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置268处具有甘氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是G268N。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置269处具有半胱氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是C269R或C269S。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在EQ ID NO:1的位置271处具有苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是T271E。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置273处具有缬氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是V273D或V273G。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置274处具有丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是S274R。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置275处具有甘氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自G275A,G275E,G275N和G275T。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置276处具有苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自T276G,T276H,T276P和T276R。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置277处具有苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自T277D,T277E和T277L。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置278处具有半胱氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是C278A或C278L。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置279处具有苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自T279H,T279P和T279Q。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置280处具有赖氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是K280Q或K280S。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置281处具有亮氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自L281A,L281E,L281G,L281K和L281S。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置282处具有天冬酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是N282E或N282S。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置284处具有色氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自W284G,W284M,W284R,W284T和W284Y。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置286处具有丝氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是S286A或S286G。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置287处具有谷氨酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是Q287H或Q287S。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置288处具有半胱氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是C288A。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置289处具有苏氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是T289K或T289Q。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置291处具有异亮氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自I291A,I291Q和I291S。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置292处具有天冬酰胺的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代是N292S。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶在SEQ ID NO:1的位置293处具有亮氨酸的氨基酸取代。在一些实施方案中，用19种天然存在的氨基酸中的任何其他氨基酸进行取代，一些实施方案不利用半胱氨酸(由于可能的二硫化物形成)或脯氨酸(由于空间效应)。在一些实施方案中，氨基酸取代选自L293G,L293N,L293T和L293V。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶与SEQ ID NO:1相比包含一个或多个氨基酸缺失，其中所述一个或多个氨基酸缺失发生在选自下组的位置处：SEQ ID NO:1的位置221,222,241,242,243,244,245,246,247,248,249,250,251,289,290,291和292。在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶与SEQ ID NO:1相比包含一个或多个如本文中公开的氨基酸取代和一个或多个氨基酸缺失，其中氨基酸缺失选自下组：SEQ ID NO:1的S221-,A222-,S241-,Q242-,A243-,S244-,V245-,P246-,T247-,S248-,N249-,P250-,G251-,T289-,M290-,I291-和N292-。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶与SEQ ID NO:1相比包含C端截短，其中所述C端截短发生在选自下组的位置处：SEQ ID NO:1的位置215,258,259,270,273,275,278,281,283,284,285,288和290。在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶与SEQ ID NO:1相比包含一个或多个如本文中公开的氨基酸取代和C端截短，其中C端截短选自下组：SEQ ID NO:1的D215*,W258*,A259*,T270*,V273*,G275*,C278*,L281*,D283*,W284*,Y285*,C288*和M290*。
本发明通过了变体内切葡聚糖酶，其与SEQ ID NO:1相比包含一个或多个氨基酸修饰，其中所述一个或多个氨基酸修饰选自下组：对应于SEQ ID NO:1的D2E,D2F,D2N,D2Q,D2S,D2T,S17G,A23D,A23N,A23S,S25N,F29Y,R33A,N36Q,I38L,Y39S,G42N,A43E,A43L,A43S,A43T,A43V,K44E,K44Q,E48N,P51E,P51N,P51S,P51T,S54T,Q66N,Q66T,F67L,F67Y,S68A,N75S,A77E,A77Q,N80S,A82S,K90A,V102Q,V102R,V102T,N116D,N116E,N116S,L121I,N122A,N122S,I123M,D132N,T135S,P136S,L141S,E144A,R145Q,S153D,D160A,A161K,A161P,P164S,P164T,Y167Q,L174Q,N180T,E184A,E184K,E184N,E184Q,E184R,E184S,E184T,R185Q,S190A,L192I,A194T,R195S,T196S,G204S,N205S,Y206F,D215*,D215G,S216N,P217G,S218G,S219T,S220G,S221-,A222-,A223T,S228A,T229P,S230G,Q231S,Q232G,P233Q,Q234T,Q235S,T237G,S238G,S239G,S241-,Q242-,A243-,S244-,V245-,P246-,T247-,S248-,N249-,P250-,G251-,W258*,W258R,W258S,A259*,A259D,T267S,G268N,C269R,C269S,T270*,T271E,V273*,V273D,V273G,S274R,G275*,G275A,G275E,G275N,G275T,T276G,T276H,T276P,T276R,T277D,T277E,T277L,C278*,C278A,C278L,T279H,T279P,T279Q,K280Q,K280S,L281*,L281A,L281E,L281G,L281K,L281S,N282E,N282S,D283*,W284*,W284G,W284M,W284R,W284T,W284Y,Y285*,S286A,S286G,Q287H,Q287S,C288*,C288A,T289-,T289K,T289Q,M290-,M290*,I291-,I291A,I291Q,I291S,N292-,N292S,L293G,L293N,L293T和L293V的修饰。
本发明提供如本文公开的变体内切葡聚糖酶，其中与SEQ ID NO:1相比的所述一个或多个氨基酸修饰发生在SEQ ID NO:1的所述位置中的1个、所述位置中的2个、所述位置中的3个、所述位置中的4个、所述位置中的5个、所述位置中的6个、所述位置中的7个、所述位置中的8个、所述位置中的9个、所述位置中的10个、所述位置中的11个、所述位置中的12个、所述位置中的13个、所述位置中的14个、所述位置中的15个、所述位置中的16个、所述位置中的17个、所述位置中的18个、所述位置中的19个、所述位置中的20个、所述位置中的21个、所述位置中的22个、所述位置中的23个、所述位置中的24个、所述位置中的25个、所述位置中的26个、所述位置中的27个、所述位置中的28个、所述位置中的29个、所述位置中的30个、所述位置中的31个、所述位置中的32个、所述位置中的33个、所述位置中的34个、所述位置中的35个、所述位置中的36个、所述位置中的37个、所述位置中的38个、所述位置中的39个、所述位置中的40个、所述位置中的41个、所述位置中的42个、所述位置中的43个、所述位置中的44个、所述位置中的45个、所述位置中的46个或所述位置中的47个位置处。
本发明提供如本文公开的变体内切葡聚糖酶，其中所述变体内切葡聚糖酶与SEQID NO:1表现出至少85％、90％或95％的序列同一性。在一些实施方案中，所述变体内切葡聚糖酶表现出与SEQ ID NO:1至少85％的序列同一性。在一些实施方案中，所述变体内切葡聚糖酶表现出与SEQ ID NO:1至少86％的序列同一性。在一些实施方案中，所述变体内切葡聚糖酶表现出与SEQ ID NO:1至少87％的序列同一性。在一些实施方案中，所述变体内切葡聚糖酶表现出与SEQ ID NO:1至少88％的序列同一性。在一些实施方案中，所述变体内切葡聚糖酶表现出与SEQ ID NO:1至少89％的序列同一性。在一些实施方案中，所述变体内切葡聚糖酶表现出与SEQ ID NO:1至少90％的序列同一性。在一些实施方案中，所述变体内切葡聚糖酶表现出与SEQ ID NO:1至少91％的序列同一性。在一些实施方案中，所述变体内切葡聚糖酶表现出与SEQ ID NO:1至少92％的序列同一性。在一些实施方案中，所述变体内切葡聚糖酶表现出与SEQ ID NO:1至少93％的序列同一性。在一些实施方案中，所述变体内切葡聚糖酶表现出与SEQ ID NO:1至少94％的序列同一性。在一些实施方案中，所述变体内切葡聚糖酶表现出与SEQ ID NO:1至少95％的序列同一性。在一些实施方案中，所述变体内切葡聚糖酶表现出与SEQ ID NO:1至少96％的序列同一性。在一些实施方案中，所述变体内切葡聚糖酶表现出与SEQ ID NO:1至少97％的序列同一性。在一些实施方案中，所述变体内切葡聚糖酶表现出与SEQ ID NO:1至少98％的序列同一性。在一些实施方案中，所述变体内切葡聚糖酶表现出与SEQ ID NO:1至少99％的序列同一性。
本发明提供了如本文中公开的变体内切葡聚糖酶，其中所述变体内切葡聚糖酶包含选自下组的所述氨基酸修饰：D215*,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43E/K44E/E48N/S54T/A77Q/N116D/N122S/L141S/L281G,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43E/K44Q/E48N/S54T/N116E/W258S/A259D/G275E/T277D,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43S/K44E/E48N/A77E/N116S/N122A/N180T/W258S/A259D/G275E/T277D/I291S/L293T,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43S/K44E/E48N/S54T/A77E/N122S/P164T/N180T/A259D/S286A/L293T,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43S/K44Q/E48N/A77Q/N116E/L141S/G275E/T277D/W284R,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43S/K44Q/E48N/S54T/N116D/W258S/G275T/L281E/I291Q,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43S/K44Q/E48N/V102Q/W258S/L281E/N282S/I291A,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43S/K44Q/E48N/V102R/W258R/A259D/L281E/N282S,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43T/K44E/E48N/P164T/N180T/A194T/W258S/A259D/G275T/L281G,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43T/K44E/E48N/V102Q/N116D/L281G/N282S,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43T/K44Q/E48N/A77E/V102Q/N116D/W258S/G275T/L281E/I291A,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43T/K44Q/E48N/A77Q/N180T/W258S/G275E/I291Q,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44E/E48N/A77E/N116D/G275T/L281E,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44E/E48N/N122A/N180T/T277D/L281E/N282S,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/A161K/P164T/N180T,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/A77E/A161K/P164T/N180T,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/A77E/N116D/W258S/L281E,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/A77Q/N116S/N180T/G275E/T277E,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/A77Q/N180T,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/F67Y/A77Q/N116S/N180T/W258S/A259D/G275T/T277E/L281K/N282S/I291S/L293N,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/F67Y/A77Q/N122S/L141S/N180T/A194T/W258R/L281K,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/F67Y/N180T,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/L141S,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/N116D/G275T/L281E/N282S/I291A,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/N116D/L281K/N282S/I291S/N292S/L293N,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/N116D/W258S/L281G,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/N180T,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/N180T/A259D/G275T/N282S,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/Q66T/A77Q/N122A/L141S/G275T/W284G/S286A,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/A77E/A161P/W258S/W284M/I291Q,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/A77E/T277E/L281E/S286A,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/A77E/V102Q/G275T/T277D/W284M/I291Q,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/A77E/W258S/T277D/W284M/I291A,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/I291A,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/L281E,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/N116D/A161P/L281E/N282S,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/N116D/A161P/W258S/G275T/L281E/I291A,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/N116D/A161P/W258S/W284M/I291A,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/N116D/D215G/S216N/P217G/S218G/S219T/S220G/S221-/A222-/A223T/S228A/T229P/S230G/Q231S/Q232G/P233Q/Q234T/Q235S/T237G/S238G/S239G/S241-/Q242-/A243-/S244-/V245-/P246-/T247-/S248-/N249-/P250-/G251-/T267S/T279Q/W284Y/T289-/M290-/I291-/N292-,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/N116D/L141S/A161K/N180T/W258R/A259D/G275E/T277D/W284R/I291Q/N292S/L293G,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/N116D/L141S/N180T/G275T/W284R/I291Q/L293N,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/N116D/W258S/G275T/N282S/I291A,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/N116D/W284M/I291Q,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/N116E/L141S/N180T/L281G/N282S,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/N116S/G275E/Y285*,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/Q66T/F67Y/N122S/N180T/L281G/I291S/N292S/L293G,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/V102Q/N116D/A161P/T277D/W284M/I291Q,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/V102Q/N116D/W258S/G275T/I291Q,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/V102Q/N116D/W258S/G275T/T277E,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/V102Q/N116D/W258S/G275T/T277E/L281G,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/V102Q/N116D/W258S/L281G/I291A,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/V102Q/W258S/G275T/T277D/N282S,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/V102Q/W258S/W284M/S286A,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/W258S,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/V102Q/A161P/W258S,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/V102Q/W258S/I291Q,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/V102R/N180T,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/W258S/I291A,A23D/I38L/Y39S/G42N/K44Q/E48N/A77E/N116D/L281E/I291A,A23D/S25N/I38L/Y39S/G42N/A43E/K44E/E48N/V102R/N116S/N122A/L141S/A161K/P164T/A194T/W258R/A259D/L281E,A23D/S25N/I38L/Y39S/G42N/A43E/K44Q/E48N/Q66T/F67Y/L141S/N180T,A23D/S25N/I38L/Y39S/G42N/A43S/K44Q/E48N/S54T/Q66T/L141S/N180T/W258S/A259D/T277D/W284G/Y285*,A23D/S25N/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/A161K/N180T,A23D/S25N/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/A161P,A23D/S25N/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/A77E,A23D/S25N/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/A77E/N180T,A23D/S25N/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/A77E/N180T/A259D/L281K/L293T,A23D/S25N/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/A77E/V102Q/N180T,A23D/S25N/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/A77Q/N180T/A194T/W258S/W284G/S286G,A23D/S25N/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/A77Q/V102Q/N180T/A194T,A23D/S25N/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/A77Q/W258S/G275T/T277D/W284M/I291S/L293T,A23D/S25N/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/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本发明提供了如本文中公开的变体内切葡聚糖酶，其中所述氨基酸修饰选自下组：D215*,I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N,D215G/S216N/P217G/S218G/S219T/S220G/S221-/A222-/A223T/S228A/T229P/S230G/Q231S/Q232G/P233Q/Q234T/Q235S/T237G/S238G/S239G/S241-/Q242-/A243-/S244-/V245-/P246-/T247-/S248-/N249-/P250-/G251-/T267S/T279Q/W284Y/T289-/M290-/I291-/N292-和T-18S/F-5L/T-4A/V-3A/A23S/S25N/F29Y/R33A/N36Q/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/P51S/Q66N/F67L/S68A/N75S/N80S/A82S/K90A/V102T/N116S/L121I/N122A/I123M/D132N/T135S/P136S/E144A/R145Q/S153D/D160A/A161P/Y167Q/L174Q/N180T/E184Q/R185Q/S190A/L192I/T196S/G204S/N205S/Y206F。
本发明提供了如本文中公开的变体内切葡聚糖酶，其中所述变体内切葡聚糖酶包含选自下组的所述氨基酸修饰：I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N,D215G/S216N/P217G/S218G/S219T/S220G/S221-/A222-/A223T/S228A/T229P/S230G/Q231S/Q232G/P233Q/Q234T/Q235S/T237G/S238G/S239G/S241-/Q242-/A243-/S244-/V245-/P246-/T247-/S248-/N249-/P250-/G251-/T267S/T279Q/W284Y/T289-/M290-/I291-/N292-,I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/D215G/S216N/P217G/S218G/S219T/S220G/S221-/A222-/A223T/S228A/T229P/S230G/Q231S/Q232G/P233Q/Q234T/Q235S/T237G/S238G/S239G/S241-/Q242-/A243-/S244-/V245-/P246-/T247-/S248-/N249-/P250-/G251-/T267S/T279Q/W284Y/T289-/M290-/I291-/N292-,A23D/S25N/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/A77E,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/N116D/D215G/S216N/P217G/S218G/S219T/S220G/S221-/A222-/A223T/S228A/T229P/S230G/Q231S/Q232G/P233Q/Q234T/Q235S/T237G/S238G/S239G/S241-/Q242-/A243-/S244-/V245-/P246-/T247-/S248-/N249-/P250-/G251-/T267S/T279Q/W284Y/T289-/M290-/I291-/N292-,D215*和A23S/S25N/F29Y/R33A/N36Q/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/P51S/Q66N/F67L/S68A/N75S/N80S/A82S/K90A/V102T/N116S/L121I/N122A/I123M/D132N/T135S/P136S/E144A/R145Q/S153D/D160A/A161P/Y167Q/L174Q/N180T/E184Q/R185Q/S190A/L192I/T196S/G204S/N205S/Y206F。
本发明提供了如本文中公开的变体内切葡聚糖酶，其中所述变体内切葡聚糖酶包含所述氨基酸修饰I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N。
本发明提供了如本文中公开的变体内切葡聚糖酶，其中所述变体内切葡聚糖酶包含所述氨基酸修饰D215G/S216N/P217G/S218G/S219T/S220G/S221-/A222-/A223T/S228A/T229P/S230G/Q231S/Q232G/P233Q/Q234T/Q235S/T237G/S238G/S239G/S241-/Q242-/A243-/S244-/V245-/P246-/T247-/S248-/N249-/P250-/G251-/T267S/T279Q/W284Y/T289-/M290-/I291-/N292-。
本发明提供了如本文中公开的变体内切葡聚糖酶，其中所述变体内切葡聚糖酶包含所述氨基酸修饰I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/D215G/S216N/P217G/S218G/S219T/S220G/S221-/A222-/A223T/S228A/T229P/S230G/Q231S/Q232G/P233Q/Q234T/Q235S/T237G/S238G/S239G/S241-/Q242-/A243-/S244-/V245-/P246-/T247-/S248-/N249-/P250-/G251-/T267S/T279Q/W284Y/T289-/M290-/I291-/N292-。
本发明提供了如本文中公开的变体内切葡聚糖酶，其中所述变体内切葡聚糖酶包含所述氨基酸修饰A23D/S25N/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/A77E。
本发明提供了如本文中公开的变体内切葡聚糖酶，其中所述变体内切葡聚糖酶包含所述氨基酸修饰A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/N116D/D215G/S216N/P217G/S218G/S219T/S220G/S221-/A222-/A223T/S228A/T229P/S230G/Q231S/Q232G/P233Q/Q234T/Q235S/T237G/S238G/S239G/S241-/Q242-/A243-/S244-/V245-/P246-/T247-/S248-/N249-/P250-/G251-/T267S/T279Q/W284Y/T289-/M290-/I291-/N292-。
本发明提供了如本文中公开的变体内切葡聚糖酶，其中所述变体内切葡聚糖酶包含所述氨基酸修饰D215*。
本发明提供了如本文中公开的变体内切葡聚糖酶，其中所述变体内切葡聚糖酶包含所述氨基酸修饰A23S/S25N/F29Y/R33A/N36Q/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/P51S/Q66N/F67L/S68A/N75S/N80S/A82S/K90A/V102T/N116S/L121I/N122A/I123M/D132N/T135S/P136S/E144A/R145Q/S153D/D160A/A161P/Y167Q/L174Q/N180T/E184Q/R185Q/S190A/L192I/T196S/G204S/N205S/Y206F。
本发明提供了如本文中公开的变体内切葡聚糖酶，其中所述变体内切葡聚糖酶与选自下组的氨基酸序列表现出至少90％序列同一性：SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ IDNO:7,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:27。
本发明提供了如本文中公开的变体内切葡聚糖酶，其中所述变体内切葡聚糖酶与SEQ ID NO:5表现出至少90％序列同一性。
本发明提供了如本文中公开的变体内切葡聚糖酶，其中所述变体内切葡聚糖酶与SEQ ID NO:7表现出至少90％序列同一性。
本发明提供了如本文中公开的变体内切葡聚糖酶，其中所述变体内切葡聚糖酶与SEQ ID NO:23表现出至少90％序列同一性。
本发明提供了如本文中公开的变体内切葡聚糖酶，其中所述变体内切葡聚糖酶与SEQ ID NO:27表现出至少90％序列同一性。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶包含氨基酸序列SEQ ID NO:3。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶包含氨基酸序列SEQ ID NO:5。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶包含氨基酸序列SEQ ID NO:7。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶包含氨基酸序列SEQ ID NO:9。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶包含氨基酸序列SEQ ID NO:23。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶包含氨基酸序列SEQ ID NO:25。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶包含氨基酸序列SEQ ID NO:27。
在一些实施方案中，变体酶包含一种或多种选自图2、图3、图4或图6所示的那些内切葡聚糖酶变体的变体。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶是分离的变体内切葡聚糖酶。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶与亲本内切葡聚糖酶相比具有改善的活性。在一些实施方案中，与野生型G1P内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:1)相比，变体内切葡聚糖酶的活性增加了至少1.1倍。在一些实施方案中，与野生型G1P内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:1)相比，变体内切葡聚糖酶的活性增加了至少1.5倍。在一些实施方案中，与野生型G1P内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:1)相比，变体内切葡聚糖酶的活性增加了至少2.0倍。在一些实施方案中，与野生型G1P内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:1)相比，变体内切葡聚糖酶的活性增加了至少2.5倍。实施例6和11、图2和图4显示，与野生型G1P内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:1)相比和/或与G2P(即，如以SEQ ID NO:5所示的变体G1V2)相比，多种变体内切葡聚糖酶表现出增加的活性。
在一些实施方案中，与亲本内切葡聚糖酶相比，变体内切葡聚糖酶具有改善的生物石磨功效或性能。在一些实施方案中，与野生型G1P内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:1)相比，变体内切葡聚糖酶的生物石磨功效增加了至少1.1倍。在一些实施方案中，与野生型G1P内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:1)相比，变体内切葡聚糖酶的生物石磨功效增加了至少1.5倍。在一些实施方案中，与野生型G1P内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:1)相比，变体内切葡聚糖酶具有至少2.0倍的生物石磨功效增加。在一些实施方案中，与野生型G1P内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:1)相比，变体内切葡聚糖酶的生物石磨功效增加了至少2.5倍。实施例8和13以及图3和6显示，与野生型G1P内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:1)相比和/或与G2P(即如SEQ ID NO:5中所示的变体G1V2)相比，多种变体内切葡聚糖酶表现出改善的生物石磨性能。
在一些实施方案中，与亲本内切葡聚糖酶相比，变体内切葡聚糖酶具有改善的碱(去污剂)脱起球功效或性能。在一些实施方案中，与野生型G1P内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:1)相比，变体内切葡聚糖酶具有至少1.1倍的碱(去污剂)脱起球功效增加。在一些实施方案中，与野生型G1P内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:1)相比，变体内切葡聚糖酶具有至少1.5倍的碱(去污剂)脱起球功效增加。在一些实施方案中，与野生型G1P内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:1)相比，变体内切葡聚糖酶具有至少2.0倍的碱(去污剂)脱起球功效增加。在一些实施方案中，与野生型G1P内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:1)相比，变体内切葡聚糖酶具有至少2.5倍的碱(去污剂)脱起球功效增加。实施例14和图7显示，与G2P(即如SEQ ID NO:5所示的变体G1V2)相比，多种变体内切葡聚糖酶表现出改善的碱(去污剂)脱起球性能。
在一些实施方案中，与亲本内切葡聚糖酶相比，变体内切葡聚糖酶具有改善的碱(去污剂)脱色活性/碱(去污剂)去污性能。在一些实施方案中，与野生型G1P内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:1)相比，变体内切葡聚糖酶具有至少1.1倍的碱性(去污剂)去污能力增加。在一些实施方案中，与野生型G1P内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:1)相比，变体内切葡聚糖酶具有至少1.5倍的碱性(去污剂)去污能力增加。在一些实施方案中，与野生型G1P内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:1)相比，变体内切葡聚糖酶具有至少2.0倍的碱性(去污剂)去污能力增加。在一些实施方案中，与野生型G1P内切葡聚糖酶(SEQ ID NO:1)相比，变体内切葡聚糖酶具有至少2.5倍的碱性(去污剂)去污能力增加。
在一个实施方案中，当暴露于20℃,25℃,30℃,40℃,45℃,50℃,52℃,55℃,56℃,58℃,60℃,65℃,66℃,70℃,75℃,80℃和/或85℃的温度一段时间时，变体内切葡聚糖酶比亲本内切葡聚糖酶更稳定，所述时间段一般范围为约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10分钟或更长，取决于使用变体内切葡聚糖酶的最终条件，一些实施方案利用5分钟至10分钟、5分钟至15分钟、5分钟至60分钟、10分钟至180分钟的热攻击时间，都可用于本发明。在一些实施方案中，与亲本内切葡聚糖酶，特别是G1P相比，变体内切葡聚糖酶在50℃下至少180分钟具有增加的总活性。在其他实施方案中，在30℃和/或40℃下至少30分钟，变体内切葡聚糖酶与亲本内切葡聚糖酶相比具有增加的活性。
此外，对pH 6.5、pH 7.0、pH 7.5、pH 8.0、pH 8.5、pH 9.0、pH 9.5、pH10.0、pH10.5、pH 11.0和/或pH 11.5的耐受性也可以是改善的考虑因素。因此，在一些实施方案中，与亲本内切葡聚糖酶相比，变体内切葡聚糖酶对pH6.5具有增加的耐受性。在一些实施方案中，与亲本内切葡聚糖酶相比，变体内切葡聚糖酶在50℃下至少3小时对pH 6.5的耐受性增加。在其他实施方案中，在pH 10.0、pH 10.5和pH 11.0下至少30分钟，变体内切葡聚糖酶与亲本内切葡聚糖酶相比具有增加的活性和/或耐受性。
除了本文所述的特定取代之外可能存在的氨基酸变化可以是次要性质的，即不显著影响蛋白质折叠和/或活性的保守氨基酸取代或插入；小的缺失，通常为1至约30个氨基酸；小的氨基或羧基末端延伸，例如氨基末端甲硫氨酸残基；多达约20至约25个残基的小接头肽；或通过改变净电荷或其他功能促进纯化的小延伸，例如多组氨酸束、抗原表位或结合域。
保守取代的实例在碱性氨基酸(精氨酸、赖氨酸和组氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、极性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和缬氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)的组内。通常不改变比活性的氨基酸取代是本领域已知的，并且描述于例如H.Neurath and R.L.Hill,1979,In,The Proteins,Academic Press,New York。常见的取代是Ala/Ser,Val/Ile,Asp/Glu,Thr/Ser,Ala/Gly,Ala/Thr,Ser/Asn,Ala/Val,Ser/Gly,Tyr/Phe,Ala/Pro,Lys/Arg,Asp/Asn,Leu/Ile,LeuA al,Ala/Glu和Asp/Gly。
A.亲本内切葡聚糖酶
在本发明的大多数实施方案中，亲本内切葡聚糖酶是具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)(Ct.EG)野生型内切葡聚糖酶(G1P)。在一些实施方案中，亲本内切葡聚糖酶与SEQ ID NO:1的多肽具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，并且具有内切葡聚糖酶活性。在一些实施方案中，亲本内切葡聚糖酶是具有SEQ ID NO:5的氨基酸序列的G2P。在一些实施方案中，亲本内切葡聚糖酶与SEQ ID NO:5的多肽具有至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或100％的序列同一性，并且具有内切葡聚糖酶活性。
B.核酸组合物
本发明还提供包含本发明的变体内切葡聚糖酶编码核酸的组合物。此类变体内切葡聚糖酶多肽编码核酸可以编码本申请中列举的任何变体内切葡聚糖酶，包括上文“本发明的变体内切葡聚糖酶”部分下的。在一些实施方案中，组合物包含选自由SEQ ID NO:2至20的偶数编号序列组成的组的核酸。
在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:2的核酸。在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:4的核酸。在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:6的核酸。在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:8的核酸。在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:10的核酸。在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:12的核酸。在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:14的核酸。在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:16的核酸。在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:18的核酸。在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:20的核酸。在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:24的核酸。在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:26的核酸。在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:28的核酸。在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:30的核酸。在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:32的核酸。在一些实施方案中，组合物包含SEQ ID NO:34的核酸。
在一些实施方案中，变体内切葡聚糖酶编码核酸包含SEQ ID NO:2至20和SEQ IDNO:24至34的任何偶数编号序列的密码子优化形式或变体。
在一些实施方案中，本发明提供编码如本文所述的变体内切葡聚糖酶的核酸，其中所述核酸是针对宿主生物体进行密码子优化的，以在所述生物体中表达变体内切葡聚糖酶。
在一些实施方案中，本发明提供一种核酸，其包含选自下组：SEQ ID NO:4,SEQ IDNO:6,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:18,SEQ IDNO:20,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:32和SEQID NO:34。
在一些实施方案中，本发明提供一种核酸，其包含选自下组：SEQ ID NO:4,SEQ IDNO:6,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:28。
在一些实施方案中，本发明提供一种核酸，其包含选自下组:SEQ ID NO:14,SEQID NO:16,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:34。
在一些实施方案中，本发明提供了一种核酸构建体，其包含与外源构建体序列可操作地连接的编码SEQ ID NO:1的核酸。
在一些实施方案中，本发明提供如本文所述的核酸构建体，其中外源构建体序列是外源启动子。
本文中的“密码子优化”是针对特定宿主生物体及其通常优选的氨基酸密码子进行的；即宿主生产生物体，例如曲霉属(Aspergillus)物种与酵母生产生物体相比可以使用曲霉属优选密码子产生更高的翻译和/或分泌。
在一些实施方案中，组合物富含本发明的此类变体内切葡聚糖酶编码核酸。术语“富集的”表示能够从组合物获得的内切葡聚糖酶活性已经增加，例如富集因子至少为1。在一些实施方案中，配制组合物以提供期望的特性，例如低颜色、低气味和可接受的贮存稳定性。
1.变体的制备
一般可以使用公知的技术通过编码蛋白质序列的构建基因制备变体，所述公知技术包括亲本基因的定点诱变和合成基因构建。
i.调节序列
本发明还涉及包含编码本发明变体的多核苷酸的核酸构建体，所述多核苷酸与一个或多个控制序列可操作地连接，所述控制序列在与控制序列相容的条件下指导编码序列在合适的宿主细胞中的表达。控制序列可以包括启动子，即为了表达多核苷酸而被宿主细胞识别的多核苷酸。启动子含有介导变体表达的转录控制序列。启动子可以是在宿主细胞中显示转录活性的任何多核苷酸，包括突变体启动子、截短的启动子和杂合启动子，并且可以从编码与宿主细胞同源或异源的胞外或胞内多肽的基因获得。
用于指导本发明的核酸构建体在丝状真菌宿主细胞中转录的合适启动子的实例是从以下获得的启动子：曲霉物种基因，如本领域中已知的，包括构巢曲霉(A.nidulans)、黑曲霉和米曲霉(A.oryzae)及根毛霉(Rhizomucor)物种基因，如米黑根毛霉(R.miehei)，木霉(Trichoderma)物种基因，包括里氏木霉(T.reesei)，镰孢(Fusarium)物种基因，包括镰孢霉(F.venenatum)。包含启动子的酵母控制序列也是从酿酒酵母公知的。
来自这些物种的合适的启动子序列(以及其他控制序列)包括如本领域已知的来自淀粉酶(特别是α-淀粉酶)、葡糖淀粉酶、蛋白酶、磷酸酶、内切葡聚糖酶、纤维素酶等的启动子。另外，对于密码子优化，可能期望使用对宿主生产菌株内源的启动子(和其他控制序列)，其与编码内切葡聚糖酶变体的核酸可操作地连接。在许多实施方案中，可操作地附接至编码序列的启动子不是天然的启动子序列。
控制序列也可以是转录终止子，其被宿主细胞识别以终止转录。终止子序列与编码变体的多核苷酸的3’端可操作地连接。可以使用在宿主细胞中有功能的任何终止子。
在一些实施方案中，丝状真菌宿主细胞的终止子(和其他控制序列如启动子)获自构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)胰蛋白酶样蛋白酶的基因。
在一些实施方案中，用于酵母宿主细胞的终止子从酿酒酵母烯醇化酶、酿酒酵母细胞色素C(CYC1)和酿酒酵母甘油醛-3-磷酸脱氢酶的基因获得。
控制序列也可以是增加基因表达的启动子下游且基因编码序列上游的mRNA稳定区。
合适的mRNA稳定区的实例从苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)crylllA基因(WO 94/25612)和枯草芽孢杆菌SP82基因(Hue et al.,1995,Journal ofBacteriology 177:3465-3471)获得。
控制序列也可以是前导物，即对于由宿主细胞的翻译重要的mRNA的非翻译区。前导物序列与编码变体的多核苷酸的5’端可操作地连接。可以使用在宿主细胞中有功能的任何前导物。
在一些实施方案中，丝状真菌宿主细胞的前导物是从米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸异构酶的基因获得的。
在一些实施方案中，从酿酒酵母烯醇化酶(ENO-1)、酿酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、酿酒酵母α-因子和酿酒酵母醇脱氢酶/甘油醛-3-磷酸脱氢酶(ADH2/GAP)的基因获得酵母宿主细胞的合适前导物。
控制序列也可以是多腺苷酸化序列，即与变体编码序列的3’端可操作地连接的序列，并且当转录时由宿主细胞识别为将聚腺苷残基添加到转录的mRNA的信号。可以使用在宿主细胞中有功能的任何聚腺苷酸化序列。
在一些实施方案中，用于丝状真菌宿主细胞的聚腺苷酸化序列从构巢曲霉邻氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-葡糖苷酶、米曲霉TAKA淀粉酶和尖孢镰孢胰蛋白酶样蛋白酶的基因获得。
控制序列还可以是信号肽编码区，其编码与变体的N端连接并指导表达的内切葡聚糖酶变体进入细胞的分泌途径的信号肽。在一些情况中，信号序列是图4或图5中描述的信号序列，即野生型信号肽序列(SEQ ID NO:21)或变体信号肽(SEQ ID NO:22)。
用于丝状真菌宿主细胞的有效信号肽编码序列是从黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、特异腐质霉(Humicola insolens)纤维素酶、特异腐质霉内切葡聚糖酶V、柔毛腐质霉(Humicola lanuginosa)脂肪酶、和米黑根毛霉(Rhizomucormiehei)天冬氨酸蛋白酶。
用于酵母宿主细胞的有用信号肽从酿酒酵母α-因子和酿酒酵母转化酶的基因获得。Romanos等,1992，同上描述了其他有用的信号肽编码序列。
在存在信号肽和前肽序列两者的情况下，前肽序列位于变体的N端附近，并且信号肽序列位于前肽序列的N端附近。
还可以期望添加相对于宿主细胞生长调节变体表达的调节序列。调节系统的实例是引起基因表达响应化学或物理刺激(包括调节化合物的存在)而开启或关闭的那些系统。原核系统中的调节系统包括lac、tac和trp操作基因系统。在酵母中，可以使用ADH2系统或GAL1系统。在丝状真菌中，可以使用子囊菌门(Ascomycota)如曲霉菌属(Aspergillus)的Gpd(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)，黑曲霉葡糖淀粉酶启动子、米曲霉TAKA α-淀粉酶启动子和米曲霉葡糖淀粉酶启动子。调节序列的其他实例是允许基因扩增的那些。在真核系统中，这些调节序列包括在甲氨蝶呤存在下扩增的二氢叶酸还原酶基因，以及用重金属扩增的金属硫蛋白基因。在这些情况下，编码变体的多核苷酸将与调节序列可操作地连接。
在一些实施方案中，本发明提供了编码包含信号肽和成熟蛋白质的前蛋白的核酸，其中成熟蛋白质可以是如本文所述的任何内切葡聚糖酶变体，并且其中信号肽可以是内源的或外源的。在一些实施方案中，本发明提供了编码包含信号肽和成熟蛋白质的前蛋白的核酸，其中成熟蛋白质是如本文所述的内切葡聚糖酶变体，并且与内源或外源构建体序列可操作地连接。
在一些实施方案中，本发明提供了编码包含信号肽和成熟蛋白质的前蛋白的核酸，其中所述信号肽是野生型信号肽或与野生型信号肽相比包含一个或多个氨基酸修饰的变体信号肽；并且其中与本文公开的SEQ ID NO:1相比，所述成熟蛋白质包含一个或多个氨基酸修饰。在一些实施方案中，信号肽是野生型信号肽。在一些实施方案中，所述野生型信号肽包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。在一些实施方案中，信号肽是与SEQ ID NO:21相比包含一个或多个氨基酸修饰的变体信号肽，并且变体信号肽中的所述一个或多个氨基酸修饰发生在对应于选自下组的位置的位置处：位置-18、-5、-4和-3。在一些实施方案中，变体信号肽包含所述一个或多个选自T-18S、F-5L、T-4A和V-3A的氨基酸修饰。在一些实施方案中，变体信号肽包含氨基酸修饰T-18S/F-5L/T-4A/V-3A。在一些实施方案中，变体信号肽包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。在一些实施方案中，变体信号肽由SEQ ID NO:22的氨基酸序列组成。
在一些实施方案中，本发明提供了编码包含信号肽和成熟蛋白的前蛋白的核酸，其中所述信号肽包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列并且其中所述成熟蛋白包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:23、SEQID NO:25和SEQ ID NO:27。在一些实施方案中，所述信号肽包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列并且所述成熟蛋白包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述信号肽包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列并且所述成熟蛋白包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述信号肽包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列并且所述成熟蛋白包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述信号肽包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列并且所述成熟蛋白包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述信号肽包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列并且所述成熟蛋白包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述信号肽包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列并且所述成熟蛋白包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述信号肽包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列并且所述成熟蛋白包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供了编码包含信号肽和成熟蛋白的前蛋白的核酸，其中所述信号肽包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列并且其中所述成熟蛋白包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:23、SEQID NO:25和SEQ ID NO:27。在一些实施方案中，所述信号肽包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列并且所述成熟蛋白包含SEQ ID NO:3的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述信号肽包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列并且所述成熟蛋白包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述信号肽包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列并且所述成熟蛋白包含SEQ ID NO:7的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述信号肽包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列并且所述成熟蛋白包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述信号肽包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列并且所述成熟蛋白包含SEQ ID NO:23的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述信号肽包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列并且所述成熟蛋白包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述信号肽包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列并且所述成熟蛋白包含SEQ ID NO:27的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供如本文所述的核酸，其中所述成熟蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO:3。
在一些实施方案中，本发明提供如本文所述的核酸，其中所述成熟蛋白质包含SEQID NO:5的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供如本文所述的核酸，其中所述成熟蛋白质包含SEQID NO:7的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供如本文所述的核酸，其中所述成熟蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO:9。
在一些实施方案中，本发明提供如本文所述的核酸，其中所述成熟蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO:23。
在一些实施方案中，本发明提供如本文所述的核酸，其中所述成熟蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO:25。
在一些实施方案中，本发明提供如本文所述的核酸，其中所述成熟蛋白包含氨基酸序列SEQ ID NO:27。
在一些实施方案中，本发明提供包含SEQ ID NO:14的核酸序列的核酸。
在一些实施方案中，本发明提供包含SEQ ID NO:16的核酸序列的核酸。
在一些实施方案中，本发明提供包含SEQ ID NO:18的核酸序列的核酸。
在一些实施方案中，本发明提供包含SEQ ID NO:20的核酸序列的核酸。
在一些实施方案中，本发明提供包含SEQ ID NO:30的核酸序列的核酸。
在一些实施方案中，本发明提供包含SEQ ID NO:32的核酸序列的核酸。
在一些实施方案中，本发明提供包含SEQ ID NO:34的核酸序列的核酸。
在一些实施方案中，本发明提供了编码包含信号肽和成熟蛋白的前蛋白的核酸，其中所述前蛋白包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:13,SEQ ID NO:15,SEQ ID NO:17,SEQ ID NO:19,SEQ ID NO:29,SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:33。
在一些实施方案中，本发明提供了编码包含信号肽和成熟蛋白的前蛋白的核酸，其中所述前蛋白包含对应于SEQ ID NO:11的T-18S/F-5L/T-4A/V-3A/A23S/S25N/F29Y/R33A/N36Q/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/P51S/Q66N/F67L/S68A/N75S/N80S/A82S/K90A/V102T/N116S/L121I/N122A/I123M/D132N/T135S/P136S/E144A/R145Q/S153D/D160A/A161P/Y167Q/L174Q/N180T/E184Q/R185Q/S190A/L192I/T196S/G204S/N205S/Y206F的氨基酸修饰。
在一些实施方案中，本发明提供了编码包含信号肽和成熟蛋白的前蛋白的核酸，其中前蛋白与外源启动子可操作地连接。在一些实施方案中，成熟蛋白质包含SEQ ID NO:1。在一些实施方案中，成熟蛋白质具有如本文公开的任何变体内切葡聚糖酶的氨基酸序列。在一些实施方案中，外源构建体序列是外源启动子。
在一些实施方案中，本发明提供如本文所述的核酸，其中信号肽包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列或如本文公开的任何变体信号肽。在一些实施方案中，本发明提供如本文所述的核酸，其中信号肽包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本发明提供如本文所述的核酸，其中信号肽是外源的。
2.表达载体
2.表达载体
本发明还涉及重组表达载体，其包含编码本发明变体的多核苷酸、启动子和转录和翻译终止信号。各种核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组表达载体，其可以包括一个或多个方便的限制性位点以允许在此类位点处插入或取代编码变体的多核苷酸。或者，可以通过将多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体插入用于表达的合适载体中来表达多核苷酸。在创建表达载体时，编码序列位于载体中，使得编码序列与适合于表达的控制序列可操作地连接。
重组表达载体可以是任何载体(例如，质粒或病毒)，其可以方便地进行重组DNA规程并且可以导致多核苷酸的表达。载体的选择通常取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是线性或闭合环状质粒。
载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制不依赖于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可以包含任何用于确保自我复制的手段。或者，载体可以是当被引入宿主细胞时整合到基因组中并且与已经整合有它的染色体一起复制的载体。此外，可以使用单载体或质粒或一起含有待引入宿主细胞基因组中的总DNA的两种或更多种载体或质粒，或转座子。涵盖用于本发明方法的载体包括整合载体和非整合载体两者。
在一些实施方案中，载体含有一个或多个允许容易选择经转化的、经转染的、经转导的或类似细胞的可选择标志物。可选择标志物是其产物提供杀生物剂或病毒抗性、对重金属的抗性、对营养缺陷型的原养型等的基因。
用于酵母宿主细胞的合适标志物包括但不限于ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。用于丝状真菌宿主细胞的可选择标志物包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨甲酰基转移酶)、bar(膦丝菌素乙酰转移酶)、hph(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清苷-5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸腺苷转移酶)和trpC(邻氨基苯甲酸合酶)以及其等同物。对于在曲霉细胞中使用优选的是构巢曲霉或米曲霉amdS和pyrG基因以及吸水链霉菌(Streptomyces hygroscopicus)bar基因。
在一些实施方案中，载体含有允许载体整合到宿主细胞基因组中或载体在细胞中不依赖于基因组的方式自主复制的元件。
为了整合到宿主细胞基因组中，载体可以依赖于编码变体的多核苷酸序列或载体的任何其他元件以通过同源或非同源重组整合到基因组中。或者，载体可以含有额外的多核苷酸，用于指导通过同源重组在染色体中的精确位置处整合到宿主细胞基因组中。为了增加在精确位置处整合的可能性，整合元件应当含有足够数目的核酸，例如100至10,000个碱基对、400至10,000个碱基对、和800至10,000个碱基对，其与相应的靶序列具有高度的序列同一性以增强同源重组的可能性。整合元件可以是与宿主细胞基因组中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非编码或编码多核苷酸。另一方面，可以通过非同源重组将载体整合到宿主细胞的基因组中。
对于自主复制，载体可以进一步包含使载体能够在所讨论的宿主细胞中自主复制的复制起点。复制起点可以是任何介导在细胞中发挥功能的自主复制的质粒复制子。术语“复制起点”或“质粒复制子”是指使质粒或载体能够在体内复制的多核苷酸。
用于酵母宿主细胞的复制起点的实例是2微米复制起点、ARS1、ARS4、ARS1和CEN3的组合、以及ARS4和CEN6的组合。
在丝状真菌细胞中有用的复制起点的实例是AMA1和ANSI(Gems et al.,1991,Gene 98:61-67；Cullen et al.,1987,Nucleic Acids Res.15:9163-9175；WO 00/24883)。可以根据WO 00/24883中公开的方法完成AMA1基因的分离和包含该基因的质粒或载体的构建。
可以将超过一个拷贝的本发明的多核苷酸插入宿主细胞中以增加变体的产生，包括在载体中使用编码内切葡聚糖酶变体的多个基因，将多个载体转化到细胞中，或者将载体对基因组中的多次整合。可以通过如下获得多核苷酸的拷贝数的增加：将至少一个额外的序列拷贝整合到宿主细胞基因组中或与多核苷酸一起纳入可扩增可选择标志物基因，其中含有扩增拷贝的可选择标志物基因和因此多核苷酸的额外拷贝的细胞可以通过在合适的选择剂存在下培养细胞来选择。
用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的方法是本领域技术人员公知的(参见例如Sambrook等，1989，同上)。
在一些实施方案中，本发明提供包含如本文所述的核酸的表达载体。
在一些实施方案中，本发明提供包含如本文所述的核酸构建体的表达载体。
C.特定构建体
为了在真菌中表达，一个实施方案利用如实施例1中公开的黑曲霉菌株。
1.密码子优化
1.密码子优化
密码子优化可以与本发明的任何内切葡聚糖酶变体一起使用，以优化使用的宿主细胞中的表达。此类方法在本领域中是公知的，并且记载于例如WO 2007/142954。在异源表达系统中，优化步骤可以改善宿主产生期望内切葡聚糖酶变体的能力。蛋白质表达受许多因子控制，包括影响转录、mRNA加工和稳定性以及翻译起始的因子。多核苷酸优化步骤可以包括改善宿主产生外源蛋白质的能力的步骤以及协助研究人员有效设计表达构建体的步骤。优化策略可以包括例如翻译起始区域的修饰、mRNA结构元件的改变、以及使用不同的密码子偏倚。
在一些实施方案中，通过干扰二级结构发生减少的异源蛋白质表达。二级结构可以隔离RBS序列或起始密码子并且与蛋白质表达的降低相关。茎环结构也可以参与转录暂停和减弱。优化的多核苷酸序列可以含有核苷酸序列的RBS和基因编码区中的最小的二级结构以允许改善的转录和翻译。
在一些实施方案中，限制性位点可以影响异源蛋白质表达。通过修饰可以干扰转录单元随后亚克隆到宿主表达载体中的限制性位点，可以优化多核苷酸序列。
在一些实施方案中，经优化的核酸序列可以以下述水平表达本发明的内切葡聚糖酶变体，所述水平是尚未优化的核酸序列表达的水平的至少110％、150％、200％、500％、1,000％、5,000％或甚至10,000％。
D.宿主细胞和生产菌株
如本领域技术人员将理解的，存在用于重组生产本发明的内切葡聚糖酶变体的极其多种生产宿主生物体，包括但不限于细菌细胞和包括酵母的真菌细胞。
本发明还涉及包含编码本发明的内切葡聚糖酶变体的多核苷酸的重组宿主细胞，所述多核苷酸与指导本发明变体的产生的一个或多个控制序列可操作地连接。将包含多核苷酸的构建体或载体引入宿主细胞中，使得构建体或载体作为染色体整合体或作为自身复制的染色体外载体维持，如前所述。宿主细胞的选择在很大程度上取决于编码变体的基因及宿主生产生物体产生高蛋白质滴度的表达和/或分泌蛋白的能力。在一些实施方案中，宿主细胞展现内切葡聚糖酶变体的瞬时表达。在一些实施方案中，宿主细胞是稳定转染的宿主或稳定(即永久)表达内切葡聚糖酶变体的宿主细胞。在一些实施方案中，宿主细胞是生产宿主细胞。用包含本发明的内切葡聚糖酶变体的编码区的表达载体对宿主细胞进行转化和/或转染是如本领域中所公知的(参见Sambrook,同上)。
宿主细胞可以是用于重组生产变体的任何细胞，例如原核生物或真核生物。此类宿主细胞包括但不限于细菌、真菌和酵母细胞。宿主细胞也可以是真核生物，如哺乳动物、昆虫、植物或真菌细胞。
宿主细胞可以是真菌细胞。如本文所用，“真菌”包括子囊菌门(Ascomycota)，担子菌门(Basidiomycota)，壶菌门(Chytridiomycota)和接合菌门(Zygomycota)以及卵菌门(Oomycota)和所有丝分孢子真菌(mitosporic fungi)(如Hawksworth et al.,于Ainsworth and Bisby's Dictionary of The Fungi,第8版,1995,CAB International,University Press,Cambridge,UK所定义)。在许多情况下，宿主细胞包括曲霉物种，包括构巢曲霉、黑曲霉和米曲霉，以及根毛霉物种如米黑根毛霉、木霉物种，包括里氏木霉和镰孢物种基因，包括镰孢霉。
丝状真菌宿主细胞可以是丝状真菌宿主细胞可以是支顶孢属(Acremonium)、曲霉菌属(Aspergillus)、短梗霉属(Aureobasidium)、烟管菌属(Bjerkandera)、拟蜡菌属(Ceriporiopsis)、金孢子菌属(Chrysosporium)、鬼伞属(Coprinus)、革盖菌属(Coriolus)、隐球酵母属(Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、稻温病菌(Magnaporthe)、毛霉菌属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、新美鞭菌属(Neocallimastix)、脉孢菌属(Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、原毛平革菌属(Phanerochaete)、射脉革菌属(Phlebia)、梨囊鞭菌属(Piromyces)、侧耳属(Pleurotus)、裂褶菌属(Schizophyllum)、篮状菌属(Talaromyces)、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、弯颈霉属(Tolypocladium)、栓孔菌属(Trametes)或木霉属(Trichoderma)细胞。例如，丝状真菌宿主细胞可以是泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、烟曲霉(Aspergillusfumigatus)、日本曲霉(Aspergillus japonicus)、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉、烟管菌(Bjerkandera adusta)、干拟蜡菌(Ceriporiopsis aneirina)、卡内基拟蜡菌(Ceriporiopsis caregiea)、浅黄拟蜡菌(Ceriporiopsis gilvescens)、潘诺希塔拟蜡菌(Ceriporiopsis pannocinta)、环带拟蜡菌(Ceriporiopsis rivulosa)、微红拟蜡菌(Ceriporiopsis subrufa)、虫拟蜡菌(Ceriporiopsis subvermispora)、狭边金孢子菌(Chrysosporium inops)、嗜角质金孢子菌(Chrysosporium keratinophilum)、卢克诺文思金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)、粪状金孢子菌(Chrysosporium merdarium)、租金孢子菌(Chrysosporium pannicola)、昆士兰金孢子菌(Chrysosporiumqueenslandicum)、热带金孢子菌(Chrysosporium tropicum)、褐薄金孢子菌(Chrysosporium zonatum)、灰盖鬼伞(Coprinus cinereus)、毛革盖菌(Coriolushirsutus)、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、谷类镰孢(Fusarium cerealis)、库威镰孢(Fusariumcrookwellense)、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾谷镰孢(Fusariumgraminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖孢镰孢(Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusariumreticulatum)、粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、硫色镰孢(Fusarium sulphureum)、圆镰孢(Fusarium torulosum)、拟丝孢镰孢(Fusariumtrichothecioides)、镶片镰孢(Fusarium venenatum)、特异腐质霉、柔毛腐质霉(Humicolalanuginosa)、米黑毛霉(Mucor miehei)、嗜热毁丝霉(Myceliophthora thermophila)、粗糙链孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉菌(Penicillium purpurogenum)、黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium)、辐射状射脉革菌(Phlebia radiata)、刺芹侧耳(Pleurotus eryngii)、土生梭孢壳(Thielavia terrestris)、长柔毛栓孔菌(Trametesvillosa)、变色栓菌(Trametes versicolor)、哈茨木霉(Trichoderma harzianum)、康宁木霉(Trichoderma koningii)、长枝木霉(Trichoderma longibrachiatum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)或绿色木霉(Trichoderma viride)细胞。
在一些实施方案中，真菌宿主细胞可以是酵母细胞。如本文所用，“酵母”包括产子囊酵母(ascosporogenous yeast)(内孢霉目(Endomycetales))、产担子酵母(basidiosporogenous yeast)和属于半知真菌(Fungi Imperfecti)(芽生菌目(Blastomycetes))的酵母。酵母宿主细胞是假丝酵母属(Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属(Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或亚罗酵母属(Yarrowia)细胞如乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis)、卡氏酵母(Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、道格拉氏酵母(Saccharomyces douglasii)、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或卵形酵母(Saccharomyces oviformis)或解脂亚罗酵母(Yarrowia lipolytica)细胞。
在一些实施方案中，本发明提供包含如本文所述的核酸的宿主细胞。
在一些实施方案中，本发明提供包含如本文所述的核酸构建体的宿主细胞。
在一些实施方案中，本发明提供包含如本文所述的表达载体的宿主细胞。
在一些实施方案中，本发明提供如本文所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自细菌细胞、真菌细胞和酵母细胞。
E.蛋白质组合物
本发明还提供了包含本发明的内切葡聚糖酶变体的组合物。在一些实施方案中，组合物包含载体和/或赋形剂。在一些实施方案中，组合物富含本发明的此类内切葡聚糖酶变体。术语“富含”表示组合物的内切葡聚糖酶活性已经增加，例如富集因子至少为1。在一些实施方案中，配制组合物以提供期望的特征，例如低色、低臭和可接受的储存稳定。
在一些实施方案中，组合物包含本发明的内切葡聚糖酶变体作为主要酶组分，例如单组分组合物。
在一些实施方案中，根据最终用途，组合物可以包含一种或多种另外的酶，包括但不限于氨肽酶、α-淀粉酶、β-淀粉酶、内切葡聚糖酶、异淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、卤素过氧化物酶(haloperoxidase)、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、氧化酶、果胶分解酶、肽谷氨酰胺酶、过氧化物酶、多酚氧化酶、支链淀粉酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶和/或木聚糖酶。
在一些实施方案中，组合物包含本发明的(变体)内切葡聚糖酶，并且进一步包含其他纤维素酶，如酸和/或中性纤维素酶。在一些实施方案中，组合物包含本发明的(变体)内切葡聚糖酶，并且进一步包含酸性、中性和/或碱性蛋白酶。在另一个实施方案中，组合物包含根据本发明的内切葡聚糖酶变体和酶混合物，所述酶混合物包括α-淀粉酶、蛋白酶、肽酶、脂肪酶、纤维素、胰酶等。
在一些实施方案中，组合物包含本发明的(变体)内切葡聚糖酶，并且进一步包含不一定全部由相同宿主产生的其他大分子(例如，其他酶如内切葡聚糖酶、淀粉酶、脂肪酶、蛋白酶、果胶酶和/或氧化酶，如漆酶和过氧化物酶)或可以增强所期望的酶组合物的性能、稳定性或缓冲性的化学物。
在一些实施方案中，包含本发明的(变体)内切葡聚糖酶的组合物进一步包含表面活性剂，其可以是阴离子、非离子、阳离子、两性或这些类型的混合物，特别是当用作洗涤剂组合物时。有用的洗涤剂组合物描述于，例如WO94/07998、美国专利号5,443,750和美国专利号3,664,961中，其全部通过引用以其整体并入。
在一些实施方案中，可以根据常规条件，如提取、沉淀、色谱、亲和色谱、电泳等，进一步纯化期望的酶。
F.内切葡聚糖酶变体的配制剂
在一些实施方案中，可以根据本领域已知的方法制备组合物，并且可以是液体或干燥组合物的形式。例如，组合物可以是颗粒或微粒的形式。在一些实施方案中，可以将无尘颗粒包衣。可以根据本领域已知的方法来稳定本发明的(变体)内切葡聚糖酶，例如，可以根据已建立的方法通过添加多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸，或氯化钠来稳定液体酶组合物。(参见美国专利号7,256,032，通过引用以其整体并入)。可以如EP 238,216中所述制备酶组合物的保护形式，其通过引用以其整体并入。
在一些实施方案中，本发明的酶组合物(即多肽组合物)可以为任何适合于使用的形式，如例如，除去或未除去细胞的粗发酵液、具有或没有细胞碎片的细胞裂解液、半纯化或纯化的酶组合物或宿主细胞作为酶的来源。
在一些实施方案中，酶组合物可以是干粉或颗粒、无尘颗粒、液体、稳定液体或稳定的受保护的酶。例如，液体酶组合物可以根据已建立的方法通过添加稳定剂如糖、糖醇或其他多元醇和/或乳酸或另一种有机酸来稳定。
在一些实施方案中，本发明的多肽组合物的剂量和使用该组合物的其他条件可以基于本领域已知的方法确定。
G.生产方法
本发明还涉及制备内切葡聚糖酶变体的方法，其包括：a)在表达内切葡聚糖酶变体多肽的条件下培养如本文描述的宿主细胞；并且b)任选地回收所述内切葡聚糖酶变体多肽。
使用本领域已知的方法在适于产生内切葡聚糖酶变体多肽的营养培养基中培养宿主细胞。例如，可以通过摇瓶培养，或在合适的培养基中和在允许变体表达和/或分离的条件下进行的实验室或工业发酵罐中小规模或大规模发酵(包括连续、分批、补料分批或固态发酵)培养细胞。使用本领域已知的规程在含有碳源和氮源和无机盐的合适的营养培养基中发生培养。合适的培养基可从商业供应商获得，或者可以根据公开的组成(例如，在美国典型培养物保藏中心的目录中)制备。若将内切葡聚糖酶变体多肽分泌到营养培养基中，则可以直接从培养基中回收内切葡聚糖酶变体多肽。若不分泌变体，则可以从细胞裂解物中回收它。
可以使用本领域已知的对变体特异的方法来检测内切葡聚糖酶变体。这些检测方法包括但不限于特异性抗体的使用、酶产物的形成或酶底物的消失。例如，可以使用酶测定法来测定内切葡聚糖酶变体多肽的活性。
可以使用本领域已知的方法回收内切葡聚糖酶变体多肽。例如，可以通过包括但不限于收集、离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀的常规规程从营养培养基中回收内切葡聚糖酶变体多肽。
可以通过本领域已知的多种规程纯化变体，所述规程包括但不限于层析(例如离子交换、亲和、疏水、色谱聚焦和尺寸排阻)、电泳规程(例如制备性等电聚焦)、差异溶解度(例如硫酸铵沉淀)、SDS-PAGE、或提取(参见例如Protein Purification，Janson和Ryden编，VCH Publishers，New York，1989)以获得基本上纯的变体。
H.使用内切葡聚糖酶变体的方法
本发明的内切葡聚糖酶具有有价值的特性，允许用于多种工业应用，如在纺织、洗涤剂以及纸浆和造纸工业中。本发明的新的(变体)内切葡聚糖酶具有在酸性和中性pH值下具有活性的优点，它们在纺织品生物石磨和生物整理应用以及洗涤剂和其他应用中具有高度改善的性能。
随着本发明的内切葡聚糖酶效率的改善，酶的使用明显更经济。当需要较少量的酶产品时，在酶产品的物流和储存方面也获得了其他优势。此外，本发明的新的内切葡聚糖酶作用更快，提供了时间和成本有效的处理规程并节省了设备和处理设施。
在一些实施方案中，可以基于本领域已知的方法来确定本发明的多肽组合物的剂量和使用该组合物的其他条件。
1.纺织工业中
本发明的(变体)内切葡聚糖酶具有广泛的纺织品应用。例如，用粗斜纹棉布制成的织物或衣服(如牛仔裤)是世界上最受欢迎的服装之一。传统上，石洗外观”是通过使用将浮石添加到洗涤桶中以磨损衣服的过程局部去除靛蓝染料而实现的。粗斜纹棉布上这种传统的“石洗”整理实际上损坏了机器，并造成了废水污染。称为生物石磨的新的环保工艺使用酶来对粗斜纹棉布进行洗涤/生物石磨，产生受损外观，而不损害机器或环境。粗斜纹棉布的生物石磨可以节省成本并改善质量，并且被许多粗斜纹棉布制造商所使用(请参阅Agrawal et al.,Current Trends in Biomedical Engineering&Biosciences.2017.3(3):1-3，在此通过引用以其整体并入)。
本发明的(变体)内切葡聚糖酶在产生“石洗外观”或“磨损外观”方面表现出高效率，并且在含纤维素的纺织材料，特别是粗斜纹棉布的生物石磨处理中使回染最小化。在一些实施方案中，本发明提供了生物石磨的方法，其包括使如本文所述的(变体)内切葡聚糖酶与含棉的织物或衣服。在一些实施方案中，如本文描述的含棉织物是粗斜纹棉布。
在棉织物中，细毛(微纤维)从表面出现，在加工期间可能缠结，从而形成球粒。酶削弱从表面上升的微纤维和处理的剪切力，然后将其去除(美国专利号7,256,032，在此通过引用以其整体并入)。本发明的(变体)内切葡聚糖酶特别在纺织工业中用于织物或衣服的生物整理，例如去球粒、去细毛、澄清颜色、降低粗糙度、产生不同的饰面(例如桃皮(peach skin)、破旧、砂洗(sand washed)或水洗或仿古(antique look)效果)和用于纱线的生物整理，例如减少毛羽并改善光滑度和/或柔软度。
在一些实施方案中，本发明的(变体)内切葡聚糖酶在生物整理过程中表现出高效率以使纺织材料去球粒、去细毛或降低粗糙度。在一些实施方案中，本发明提供了生物整理的方法，其包括使如本文所述的(变体)内切葡聚糖酶与纺织材料接触的步骤。在一些实施方案中，如本文中描述的纺织材料选自织物、衣服和纱线。
2.在洗涤剂业中
本发明的(变体)内切葡聚糖酶的另外的用途包括其在洗涤剂组合物中的用途，以通过抗起球、抗泛灰、颜色澄清和软化来改善织物护理特性，并改善织物的清洁效果，例如去除污垢。在一些实施方案中，本发明的(变体)内切葡聚糖酶可以用于在洗涤剂工业中增亮颜色并防止泛灰和起球。
在一些实施方案中，本发明提供了包含如本文所述的(变体)内切葡聚糖酶的洗涤剂组合物。在另外的实施方案中，本发明提供了包含本文所述的(变体)内切葡聚糖酶的洗涤剂组合物，并且其进一步包含至少一种表面活性剂和任选地至少一种辅助成分。表面活性剂包括但不限于阴离子、非离子、阳离子和两性表面活性剂。其他辅助成分包括但不限于助洗剂、抗再沉积和污垢悬浮剂、荧光增白剂、漂白剂、染料和颜料以及水解酶。在美国专利号5,433,750(在此通过引用以其整体并入)中给出了合适的洗涤剂的含量的列表。在美国专利号3,664,961(在此通过引用以其整体并入)中给出了合适的表面活性剂的列表。有用的洗涤剂组合物描述于，例如WO94/07998、美国专利号5,443,750和美国专利号3,664,961中，其全部通过引用以其整体并入。
在一些实施方案中，本发明提供了处理含纤维素纤维的纺织材料的方法，其包括使所述纺织材料与包含如本文所述的变体内切葡聚糖酶的洗涤剂组合物或如SEQ ID NO:1所示的野生型内切葡聚糖酶接触。
3.在纸浆和造纸业中
在纸浆和造纸业中，本发明的(变体)内切葡聚糖酶可以用于例如使具有中性或碱性pH的不同再生纸和纸板的纤维脱墨或改性，以改善纤维质量或增加纸张制造的排水。如本文所述的(变体)内切葡聚糖酶的用途的其他实例包括在纺织品印花之后去除印花浆料增稠剂和过量的染料，以及作为动物饲料的处理。例如，如果意图的应用是改善机械纸浆的强度，则本发明的(变体)内切葡聚糖酶可以提供一种或多种这些蛋白质以增强或促进纤维素纤维结合在一起的能力。以类似的方式，在纸浆精制的应用中，本发明的(变体)内切葡聚糖酶可以增强或促进此类溶胀的水平提供一种或多种这些蛋白质。
在一些实施方案中，本发明的(变体)内切葡聚糖酶用于脱墨以从纤维表面释放墨并且用于改善纸浆和造纸工业中的纸浆排出。
在一些实施方案中，本发明提供了处理木材衍生的纸浆或纤维的方法，其包括使如本文所述的(变体)内切葡聚糖酶与木材衍生的机械或化学纸浆或次级纤维接触的步骤。
VI.实施例
实施例1：野生型基因选择、合成、克隆和整合
基于序列和结构分析，从UniProt知识库(参见万维网于uniprot.org/)中选择来自不同来源的多种野生型内切葡聚糖酶。
编码野生型内切葡聚糖酶的所有基因均由GeneWiz合成(参见万维网，genewiz.com/)。将合成的基因整合到专有的真菌表达质粒中。表达质粒的部分通过PCR扩增，然后整合到专有的黑曲霉菌株中。
实施例2：在2L发酵罐中制备由黑曲霉产生的野生型内切葡聚糖酶
在2L发酵罐中评估含有重组内切葡聚糖酶编码基因的来自实施例1的黑曲霉菌株。为了制备烧瓶种子培养物，将来自琼脂平板的每种菌株的约20个菌落接种到1000mL含有200mL的专有烧瓶培养基的带挡板的烧瓶中作为主要的烧瓶种子培养物。在32℃、200rpm下振荡4天后，将20％(v/v)的初级种子培养物接种到1000mL包含200mL专有烧瓶培养基的带挡板的烧瓶中，并在32℃、200rpm下振荡2天作为用于2L发酵罐接种的二级烧瓶种子培养物。
对于2L发酵罐评估，将150mL二次烧瓶种子培养物接种到850mL专有发酵培养基中。使用以下发酵条件：搅拌、通气速率和温度分别设置为1200rpm、2vvm和33℃；通过自动加入14％氢化铵，将pH控制于4.7；通过连续补料专有成分将发酵过程中的残留糖浓度保持于5至25g/L之间。在约200小时的发酵时间收集发酵液上清液并储存于-20℃以进行活性测定。
实施例3：用于评估黑曲霉产生的野生型内切葡聚糖酶活性的CMC测定
将溶解于100mM磷酸钠、pH 6.5缓冲液(目录#C5678)中的1.8mL1.5％低粘度CMC添加到玻璃试管中。将来自实施例2的500μL稀释的酶上清液加入1.5mL Eppendorf管中。Eppendorf管和含有CMC的玻璃试管均在50℃水浴中预热5分钟。一旦达到5分钟，将200μL稀释的酶从Eppendorf管转移到装有CMC的玻璃试管中并混合2-3秒。将玻璃试管迅速放入50℃水浴中，开始计时15分钟。达到15分钟后，将3mL DNS溶液转移到玻璃试管中，并将玻璃试管置于沸水浴中5分钟。5分钟后，将玻璃试管转移到室温水浴中，并且将5mL MilliQ水加入玻璃试管中。混合后，将1mL反应溶液从玻璃试管中转移到皿中，并且对于活性，读取540nm处的吸光度。
8种野生型内切葡聚糖酶(EG)的活性比较在图1中显示。相对CMC活性计算为EG候选物的CMC活性除以显示最低CMC活性的EG-候选物1的CMC活性。具有UniProt知识库登录号G0S9D9的来自嗜热毛壳菌的内切葡聚糖酶(Ct.EG)显示出最高的活性和潜力。因此选择野生型Ct.EG作为G1P以进一步活性改善。
实施例4：Ct.EG变体设计、合成、克隆和整合
为了改善Ct.EG的活性，基于序列和结构分析设计了多个Ct.EG变体。按照与实施例1中所示相同的程序，合成所有编码Ct.EG变体的基因，克隆，并整合到专有的黑曲霉菌株中。
实施例5：在微量滴定板中制备由黑曲霉产生的Ct.EG变体
将来自实施例4的含有来自单菌落的重组内切葡糖酶编码基因的黑曲霉菌株接种到含有2000μl具有1.5％酵母提取物和另外20g/L葡萄糖的马铃薯葡萄糖肉汤的24孔板的各个孔中。在30℃、200rpm和85％湿度下将培养物培养72小时。在72小时收集上清液并于-20℃贮存。
实施例6：用于评估黑曲霉产生的Ct.EG变体的活性的CMC测定
Ct.EG野生型(G1P)和来自实施例5的变体的CMC活性使用与实施例3中所示相同的程序进行评估。最佳变体的活性改善结果显示在图2中。PF(性能因子，PerformanceFactor)计算为变体的CMC活性除以G1P的CMC活性。
实施例7：在2L发酵罐中制备由黑曲霉产生的Ct.EG变体
在2L发酵罐中发酵来自实施例4的含有重组内切葡聚糖酶编码基因的黑曲霉菌株。烧瓶种子培养物的制备和发酵条件遵循与实施例2中所示相同的程序。在约200小时的发酵时间收集发酵液上清液，并在4℃下贮存用于生物石磨测试。
实施例8：在2L发酵罐中由黑曲霉产生的Ct.EG野生型和变体的生物石磨
如下评估来自实施例2和实施例7的黑曲霉菌株的生物石磨效率。通过将9英寸x7.5英寸的牛仔裤腿放入Foshan Yanuo Precision Machinery Manufacturing Co.,Ltd,China(model number GX-350Z)制造的工业尺寸洗衣机中进行脱浆(de-sized)。连同牛仔裤腿一起加入20升水、15克高浓度防染油(anti-dyeing oil)和15克防染粉(anti-dyeingpowder)。温度设置为60℃，并且旋转设置为50rpm，持续15分钟。完成15分钟旋转后，将水排干，加入18L水，继续旋转2分钟，并且此步骤重复2次。完成后，将牛仔裤腿用流水冲洗并在60℃的烘箱中干燥。对于随后的生物石磨，将2条脱浆牛仔裤加入带有18L水的洗衣机中，并将pH调节至pH 6.5。一旦温度达到50℃，加入标准化酶量。以50rpm的转速进行生物石磨50分钟。完成后，将水排干，加入18L水，继续旋转2分钟，此步骤重复2次。接下来，将牛仔裤腿用流水冲洗并在60℃的烘箱中干燥。干燥后，通过目视检查生物石磨的牛仔裤材料上的蓝色和白色对比度来比较生物石磨功效。产生更好生物石磨效果的酶样品具有更多个+，如图3所示。选择最佳的变体之一G1V2作为G2P，并通过在酿酒酵母中的定向进化进行进一步改善。
实施例9:酿酒酵母中Ct.EG G2集合的设计和构建
为了进一步改善G2P(G1V2)的活性，基于序列和结构分析设计了多个变体集合。该设计包括每个变体的一到多个特定突变。随后使用标准定点诱变方法构建变体集合，随后将其克隆到pESC-URA载体(Agilent Technologies:catalogue#217454)中。
实施例10：在HTP中制备由酿酒酵母产生的Ct.EG G2P和G2变体。
将来自酿酒酵母INVSc1菌株(ThermoFisher Scientific,USA:Catalogue#V8251-20)的单菌落的重组Ct.EG编码基因接种到96孔板中的350μL含有2％葡萄糖且不添加尿嘧啶的合成基本培养基中。接种后，将板以200rpm摇动在30℃、85％湿度下温育过夜。测定过夜培养物的OD600，并将所有培养物以0.4的最终OD600稀释到新的96孔板中，该板含有补充有2％半乳糖和1％棉子糖的SC选择性培养基，总体积为300μL。将诱导板以200rpm摇动在30℃、85％湿度下温育72小时，然后通过以4000rpm离心15分钟在冷却至4℃的情况下使板细胞沉淀。将上清液转移到新的96孔板中，盖上盖子，在-20℃贮存直至进一步使用。
实施例11：确定在HTP中酿酒酵母产生的Ct.EG G2P和G2变体于50℃的pH6.5活性的酶促测定。
将含有根据实施例10生产的Ct.EG的G2P和/或G2变体的板解冻。将上清液以2倍稀释到0.1M磷酸钠缓冲液(pH 6.5)中。通过将1.60g CMC(钠盐，Sigma)溶解在80mL pH 6.5、0.1M磷酸钠缓冲液中，然后搅拌直至CMC完全溶解，制备1.6％CMC溶液。使用pH 6.5、0.1M磷酸钠缓冲液将体积调节至100mL。
将1.6％CMC溶液加入96孔圆底板(100μL/孔)。通过加入20μL稀释的酶开始反应。然后将板密封，在50℃以650rpm振荡温育3小时。温育后，将反应溶液(60μL)转移到96孔PCR板，并通过添加90μL DNS(二硝基水杨酸)试剂淬灭。
将添加DNS试剂后的板密封，以1000rpm离心30秒，使用热循环仪加热至95℃达5分钟，冷却至4℃达2分钟，颠倒混合5-6次，然后以1000rpm离心30s。将测定板开封，并且将每个孔的100μL转移到含有100μL水的新透明底板中，并彻底混合。在540nm处测量每个孔的吸光度，并且吸光度值表示每个孔中的酶活性。与G2P相比酶活性改善的G2变体如图4和图5所示鉴定。PF(性能因子)计算为变体的CMC活性除以G2P的CMC活性。
实施例12:Ct.EG G2变体克隆和整合到黑曲霉菌株中以及在2L发酵罐中生产变体
为了测试从实施例9-11鉴定的Gt.EG G2变体(G2V3)和从实施例4-11鉴定的合理设计的变体G2V1和G2V2，将编码这些变体的基因克隆并整合到专有真菌表达质粒中。表达质粒的部分通过PCR扩增，然后整合到专有的黑曲霉菌株中。
在2L发酵罐中发酵含有重组内切葡聚糖酶编码(Ct.EG G2P和G2变体)基因的这些黑曲霉菌株。烧瓶种子培养物的制备和发酵条件遵循与实施例2中所示相同的程序。在约200小时的发酵时间收集发酵液上清液并贮存于4℃下用于进一步测试。
实施例13：在2L发酵罐中制备由黑曲霉产生的Ct.EG G2P和G2变体的生物石磨
如实施例8中概述，评估来自实施例12的黑曲霉菌株的生物石磨效率。目视检查每个样品的生物石磨效果的结果并且结果显示在图6中。结果表明G2P和G2V3具有最佳的生物石磨活性，接着是G2V1和G2V2。
实施例14：在2L发酵罐中由黑曲霉产生的Ct.EG G2P和G2变体的碱脱起球活性
测试产生Ct.EG G2P或酶变体的黑曲霉菌株在碱性洗涤剂条件下使预起球的测试织物脱起球的有效性。使用具有6个样品室的洗衣房测试仪(RHLQ-III立式去污机，中国日用化工研究院(China Daily Use Chemical Industry Academy))测试菌株的脱起球活性。对于每种条件，将1g失活洗涤剂(立白集团，在150℃失活4h)和1mg市售蛋白酶加入洗衣机的容器中的500mL硬水(1.5mmol氯化钙，1mmol硫酸镁)中，得到pH介于pH 10至pH 11之间的溶液。将该溶液在搅拌下加热至40℃。一旦达到去污的温度，将高剂量或低剂量的EG酶(通过CMC活性标准化，U通过pH 6.5、50℃下的CMC活性计算)和2.5g预起球测试织物条(Swissatest,项目#253)添加到容器中并使用洗衣工具搅拌30分钟。完成后收集织物片并用自来水冲洗3次。然后将织物片在55℃干燥过夜。织物干燥后，根据存在的起球量和颜色的整体亮度，对所有片彼此进行视觉比较。结果总结在图7中。结果表明G2V3在低剂量下保持与G2P相当的碱脱起球活性，而G2V1和G2V2在较高剂量下优于G2P，而在较低剂量下维持相似的性能。
实施例15：在2L发酵罐中由黑曲霉产生的Ct.EG G2P和G2变体的碱去污剂脱色活性
制备四个6x 6cm织物片，其从三种污渍类型：(国家表面活性剂洗涤剂标准化中心，National Standardization Center for Surfactant Detergents)炭黑、皮脂和蛋白质污渍(总共12片/条件)预染色。各片用油基记号笔编号，切成期望的尺寸，用白度计(YQ-Z-48A，CNBM Intelligent Automation Research Institute Co,Ltd.)测量每片的白度。为了测量每片，记录每片的4个总读数，从织物的每面记录2个。
对于每种条件，将2g失活洗涤剂(立白基团，在150℃下失活4小时)和2mg市售蛋白酶加入洗衣机的容器中的1L硬水(1.5mmol氯化钙，1mmol硫酸镁)，产生pH值在pH 10到pH11之间的溶液(RHLQ-III立式去污机，中国日用化工研究院)。在搅拌下将该溶液加热至30℃。一旦达到去污的温度，将1μL待测发酵上清液和12片织物(来自每种污渍类型4片)加入容器中，并在30℃搅拌20分钟。完成后，取出织物片并用自来水冲洗两次。然后将织物悬挂并在室温下干燥过夜。
一旦干燥，就如上文针对预洗测量所述测量织物片的白度。计算每片的之前和之后的白度差异，并在每种污渍类型上取平均值，并进一步与未添加EG的对照进行比较。关于Ct.EG G2P和G2变体的相对性能，参见图8。结果表明在皮脂和炭黑污渍的情况下，G2V1保持与G2P相当的碱去污活性。在炭黑污渍的情况下，G2V2保持与G2P相似的去污活性，当使用蛋白质污渍进行测试时，G2V3保持与G2P相似的活性。
提供上述实施例以向本领域普通技术人员提供如何制作和使用本发明的组合物、系统和方法的实施方案的完整公开和描述，并且不旨在限制发明人视为其发明的范围。对本领域技术人员明显的用于实施本发明的上述模式的修改旨在落入所附权利要求书的范围内。说明书中提到的所有专利和出版物都表明了本发明所属领域技术人员的技术水平。本公开中引用的所有参考文献以相同的程度通过引用并入，就像每个参考文献已单独通过引用整体并入一样。
所有标题和章节名称仅用于清楚和参考目的，不应被视为以任何方式进行限制。例如，本领域技术人员将理解根据本文描述的本发明的精神和范围适当地组合来自不同标题和章节的各个方面的有用性。
本文中引用的所有参考文献均通过引用整体并入本文，并且出于所有目的，其程度与每个单独的出版物或专利或专利申请都被明确地和单独地指示为出于所有目的通过引用整体并入本文一样。
在不脱离本申请的精神和范围的情况下，可以对本申请进行许多修改和变化，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。本文描述的具体实施方案和实施例仅作为示例提供。
序列表
<110> Fornia BioSolutions, Inc.
<120> 另外的内切葡聚糖酶变体和方法
<130> 114095-5011
<160> 34
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 293
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_Ct.EG G1P (野生型) 蛋白: 成熟
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<212> PRT
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成熟
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<223> 合成序列_Ct.EG G1V2 变体蛋白: 成熟
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<220>
<223> 合成序列_Ct.EG G1V3 变体蛋白: 成熟
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165 170 175
Asp Asn Pro Thr Phe Thr Phe Gln Gln Val Gln Cys Pro Ala Glu Ile
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Val Ser Gly Thr Thr Cys Thr Lys Leu Asn Asp Trp Tyr Ser Gln Cys
275 280 285
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290
<210> 10
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<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_N.A. ，编码Ct.EG G1V4 变体蛋白:
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<400> 10
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aacgacgact ccagcttccc cgtcttcacc cccccaagcg gtgacagccc cagcagcagc 660
agcgctgctc ctacctccac ctcgacttcg cagcagccgc agcagccgac ctccagcagc 720
tcgcaggctt ctgtgccgac tagcaaccct ggtggctgca cctctcaaaa gtgggctcag 780
tgcggcggca ttggcttcac tggctgcact acctgcgtct cgggcaccac ttgcaccaag 840
ctgaatgact ggtactcgca gtgcacaatg atcaacctgt aa 882
<210> 11
<211> 314
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_Ct.EG G1P (野生型) 蛋白: SP + 成熟
<400> 11
Met Arg Ser Thr Pro Val Leu Arg Thr Ala Leu Ala Ala Ala Leu Pro
1 5 10 15
Phe Thr Val Leu Ala Ala Asp Gly Lys Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys
20 25 30
Cys Lys Pro Ser Cys Ser Trp Pro Gly Lys Ala Ala Val Ser Gln Pro
35 40 45
Val Phe Ala Cys Asp Arg Asn Phe Asn Arg Ile Tyr Asp Phe Gly Ala
50 55 60
Lys Ser Gly Cys Glu Gly Gly Pro Ala Tyr Ser Cys Ala Asp Gln Thr
65 70 75 80
Pro Trp Ala Val Asn Asp Gln Phe Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Asn
85 90 95
Ile Ala Gly Gly Asn Glu Ala Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Lys Leu
100 105 110
Thr Phe Thr Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Val Met Val Val Gln Ser
115 120 125
Thr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Gly Asn Asn His Phe Asp Leu Asn Ile
130 135 140
Pro Gly Gly Gly Val Gly Ile Phe Asp Gly Cys Thr Pro Gln Phe Gly
145 150 155 160
Gly Leu Pro Gly Glu Arg Tyr Gly Gly Ile Ser Ser Arg Ser Gln Cys
165 170 175
Asp Ser Phe Pro Asp Ala Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp Arg Phe Asp
180 185 190
Trp Phe Leu Asn Ala Asp Asn Pro Asn Phe Thr Phe Glu Arg Val Gln
195 200 205
Cys Pro Ser Glu Leu Val Ala Arg Thr Gly Cys Lys Arg Asn Asp Asp
210 215 220
Gly Asn Tyr Pro Val Phe Thr Pro Pro Ser Gly Asp Ser Pro Ser Ser
225 230 235 240
Ser Ser Ala Ala Pro Thr Ser Thr Ser Thr Ser Gln Gln Pro Gln Gln
245 250 255
Pro Thr Ser Ser Ser Ser Gln Ala Ser Val Pro Thr Ser Asn Pro Gly
260 265 270
Gly Cys Thr Ser Gln Lys Trp Ala Gln Cys Gly Gly Ile Gly Phe Thr
275 280 285
Gly Cys Thr Thr Cys Val Ser Gly Thr Thr Cys Thr Lys Leu Asn Asp
290 295 300
Trp Tyr Ser Gln Cys Thr Met Ile Asn Leu
305 310
<210> 12
<211> 945
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_N.A. ，编码Ct.EG G1P (野生型) 蛋白:
SP + 成熟
<400> 12
atgcggtcga ctcctgttct ccgtaccgcc cttgcggctg ctctcccctt cactgtcctg 60
gctgccgacg gcaagtccac taggtactgg gactgctgca agccttcttg ctcgtggccc 120
ggcaaggctg ctgtgagcca acccgtcttc gcctgtgacc gcaacttcaa ccgcatctat 180
gacttcggtg ccaagtctgg ctgcgagggc ggtccggcct attcttgcgc cgaccagacc 240
ccgtgggctg tcaacgacca attctcgtac ggcttcgctg ccaccaacat tgccggcggt 300
aacgaggctt catggtgctg cgcttgctac aagctcacct tcacctcggg acccgtggcc 360
ggcaaggtca tggttgtcca gtcgaccagc acgggcggtg accttggcaa caaccatttc 420
gacctgaaca tcccaggtgg aggcgttggt atcttcgatg gttgcacgcc ccagttcggc 480
ggtctgcccg gcgagcggta cggcgggatc tcgtcgcgca gccagtgcga cagcttcccg 540
gatgccctca agcctggctg ctactggcgc ttcgactggt tcctgaacgc tgacaacccg 600
aacttcacct tcgagcgcgt ccagtgtcct tccgagcttg ttgcccgcac cggctgcaag 660
cgcaatgacg acggcaacta ccccgtcttc actcctcctt cgggagacag ccccagcagc 720
agcagcgctg ctcctacctc cacctcgact tcgcagcagc cgcagcagcc gacctccagc 780
agctcgcagg cttctgtgcc gactagcaac cctggtggct gcacctctca aaagtgggct 840
cagtgcggcg gcattggctt cactggctgc actacctgcg tctcgggcac cacttgcacc 900
aagctgaatg actggtactc gcagtgcaca atgatcaacc tgtaa 945
<210> 13
<211> 235
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_Ct.EG G1V1 变体蛋白: SP + 成熟
<400> 13
Met Arg Ser Thr Pro Val Leu Arg Thr Ala Leu Ala Ala Ala Leu Pro
1 5 10 15
Phe Thr Val Leu Ala Ala Asp Gly Lys Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys
20 25 30
Cys Lys Pro Ser Cys Ser Trp Pro Gly Lys Ala Ala Val Ser Gln Pro
35 40 45
Val Phe Ala Cys Asp Arg Asn Phe Asn Arg Ile Tyr Asp Phe Gly Ala
50 55 60
Lys Ser Gly Cys Glu Gly Gly Pro Ala Tyr Ser Cys Ala Asp Gln Thr
65 70 75 80
Pro Trp Ala Val Asn Asp Gln Phe Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Asn
85 90 95
Ile Ala Gly Gly Asn Glu Ala Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Lys Leu
100 105 110
Thr Phe Thr Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Val Met Val Val Gln Ser
115 120 125
Thr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Gly Asn Asn His Phe Asp Leu Asn Ile
130 135 140
Pro Gly Gly Gly Val Gly Ile Phe Asp Gly Cys Thr Pro Gln Phe Gly
145 150 155 160
Gly Leu Pro Gly Glu Arg Tyr Gly Gly Ile Ser Ser Arg Ser Gln Cys
165 170 175
Asp Ser Phe Pro Asp Ala Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp Arg Phe Asp
180 185 190
Trp Phe Leu Asn Ala Asp Asn Pro Asn Phe Thr Phe Glu Arg Val Gln
195 200 205
Cys Pro Ser Glu Leu Val Ala Arg Thr Gly Cys Lys Arg Asn Asp Asp
210 215 220
Gly Asn Tyr Pro Val Phe Thr Pro Pro Ser Gly
225 230 235
<210> 14
<211> 708
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_N.A. ，编码Ct.EG G1V1 变体蛋白: SP +
成熟
<400> 14
atgcggtcga ctcctgttct ccgtaccgcc cttgcggctg ctctcccctt cactgtcctg 60
gctgccgacg gcaagtccac taggtactgg gactgctgca agccttcttg ctcgtggccc 120
ggcaaggctg ctgtgagcca acccgtcttc gcctgtgacc gcaacttcaa ccgcatctat 180
gacttcggtg ccaagtctgg ctgcgagggc ggtccggcct attcttgcgc cgaccagacc 240
ccgtgggctg tcaacgacca attctcgtac ggcttcgctg ccaccaacat tgccggcggt 300
aacgaggctt catggtgctg cgcttgctac aagctcacct tcacctcggg acccgtggcc 360
ggcaaggtca tggttgtcca gtcgaccagc acgggcggtg accttggcaa caaccatttc 420
gacctgaaca tcccaggtgg aggcgttggt atcttcgatg gttgcacgcc ccagttcggc 480
ggtctgcccg gcgagcggta cggcgggatc tcgtcgcgca gccagtgcga cagcttcccg 540
gatgccctca agcctggctg ctactggcgc ttcgactggt tcctgaacgc tgacaacccg 600
aacttcacct tcgagcgcgt ccagtgtcct tccgagcttg ttgcccgcac cggctgcaag 660
cgcaatgacg acggcaacta ccccgtcttc actcctcctt cgggataa 708
<210> 15
<211> 314
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_Ct.EG G1V2 变体蛋白: SP + 成熟
<400> 15
Met Arg Ser Thr Pro Val Leu Arg Thr Ala Leu Ala Ala Ala Leu Pro
1 5 10 15
Phe Thr Val Leu Ala Ala Asp Gly Lys Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys
20 25 30
Cys Lys Pro Ser Cys Ser Trp Pro Gly Lys Ala Ala Val Ser Gln Pro
35 40 45
Val Phe Ala Cys Asp Arg Asn Phe Asn Arg Leu Ser Asp Phe Asn Val
50 55 60
Gln Ser Gly Cys Asn Gly Gly Pro Ala Tyr Ser Cys Ala Asp Gln Thr
65 70 75 80
Pro Trp Ala Val Asn Asp Gln Phe Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Asn
85 90 95
Ile Ala Gly Gly Asn Glu Ala Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Lys Leu
100 105 110
Thr Phe Thr Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Val Met Val Val Gln Ser
115 120 125
Thr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Gly Asn Asn His Phe Asp Leu Asn Ile
130 135 140
Pro Gly Gly Gly Val Gly Ile Phe Asp Gly Cys Thr Pro Gln Phe Gly
145 150 155 160
Gly Leu Pro Gly Glu Arg Tyr Gly Gly Ile Ser Ser Arg Ser Gln Cys
165 170 175
Asp Ser Phe Pro Asp Ala Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp Arg Phe Asp
180 185 190
Trp Phe Leu Asn Ala Asp Asn Pro Asn Phe Thr Phe Glu Arg Val Gln
195 200 205
Cys Pro Ser Glu Leu Val Ala Arg Thr Gly Cys Lys Arg Asn Asp Asp
210 215 220
Gly Asn Tyr Pro Val Phe Thr Pro Pro Ser Gly Asp Ser Pro Ser Ser
225 230 235 240
Ser Ser Ala Ala Pro Thr Ser Thr Ser Thr Ser Gln Gln Pro Gln Gln
245 250 255
Pro Thr Ser Ser Ser Ser Gln Ala Ser Val Pro Thr Ser Asn Pro Gly
260 265 270
Gly Cys Thr Ser Gln Lys Trp Ala Gln Cys Gly Gly Ile Gly Phe Thr
275 280 285
Gly Cys Thr Thr Cys Val Ser Gly Thr Thr Cys Thr Lys Leu Asn Asp
290 295 300
Trp Tyr Ser Gln Cys Thr Met Ile Asn Leu
305 310
<210> 16
<211> 945
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_N.A. ，编码Ct.EG G1V2 变体蛋白: SP +
成熟
<400> 16
atgcggtcga ctcctgttct ccgtaccgcc cttgcggctg ctctcccctt cactgtcctg 60
gctgccgacg gcaagtccac taggtactgg gactgctgca agccttcttg ctcgtggccc 120
ggcaaggctg ctgtgagcca acccgtcttc gcctgtgacc gcaacttcaa ccgcctgtcc 180
gacttcaatg tccagtctgg ctgcaacggc ggtccggcct attcttgcgc cgaccagacc 240
ccgtgggctg tcaacgacca attctcgtac ggcttcgctg ccaccaacat tgccggcggt 300
aacgaggctt catggtgctg cgcttgctac aagctcacct tcacctcggg acccgtggcc 360
ggcaaggtca tggttgtcca gtcgaccagc acgggcggtg accttggcaa caaccatttc 420
gacctgaaca tcccaggtgg aggcgttggt atcttcgatg gttgcacgcc ccagttcggc 480
ggtctgcccg gcgagcggta cggcgggatc tcgtcgcgca gccagtgcga cagcttcccg 540
gatgccctca agcctggctg ctactggcgc ttcgactggt tcctgaacgc tgacaacccg 600
aacttcacct tcgagcgcgt ccagtgtcct tccgagcttg ttgcccgcac cggctgcaag 660
cgcaatgacg acggcaacta ccccgtcttc actcctcctt cgggagacag ccccagcagc 720
agcagcgctg ctcctacctc cacctcgact tcgcagcagc cgcagcagcc gacctccagc 780
agctcgcagg cttctgtgcc gactagcaac cctggtggct gcacctctca aaagtgggct 840
cagtgcggcg gcattggctt cactggctgc actacctgcg tctcgggcac cacttgcacc 900
aagctgaatg actggtactc gcagtgcaca atgatcaacc tgtaa 945
<210> 17
<211> 297
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_Ct.EG G1V3 变体蛋白: SP + 成熟
<400> 17
Met Arg Ser Thr Pro Val Leu Arg Thr Ala Leu Ala Ala Ala Leu Pro
1 5 10 15
Phe Thr Val Leu Ala Ala Asp Gly Lys Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys
20 25 30
Cys Lys Pro Ser Cys Ser Trp Pro Gly Lys Ala Ala Val Ser Gln Pro
35 40 45
Val Phe Ala Cys Asp Arg Asn Phe Asn Arg Ile Tyr Asp Phe Gly Ala
50 55 60
Lys Ser Gly Cys Glu Gly Gly Pro Ala Tyr Ser Cys Ala Asp Gln Thr
65 70 75 80
Pro Trp Ala Val Asn Asp Gln Phe Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Asn
85 90 95
Ile Ala Gly Gly Asn Glu Ala Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Lys Leu
100 105 110
Thr Phe Thr Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Val Met Val Val Gln Ser
115 120 125
Thr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Gly Asn Asn His Phe Asp Leu Asn Ile
130 135 140
Pro Gly Gly Gly Val Gly Ile Phe Asp Gly Cys Thr Pro Gln Phe Gly
145 150 155 160
Gly Leu Pro Gly Glu Arg Tyr Gly Gly Ile Ser Ser Arg Ser Gln Cys
165 170 175
Asp Ser Phe Pro Asp Ala Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp Arg Phe Asp
180 185 190
Trp Phe Leu Asn Ala Asp Asn Pro Asn Phe Thr Phe Glu Arg Val Gln
195 200 205
Cys Pro Ser Glu Leu Val Ala Arg Thr Gly Cys Lys Arg Asn Asp Asp
210 215 220
Gly Asn Tyr Pro Val Phe Thr Pro Pro Ser Gly Gly Asn Gly Gly Thr
225 230 235 240
Gly Thr Pro Thr Ser Thr Ala Pro Gly Ser Gly Gln Thr Ser Pro Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Gly Cys Thr Ser Gln Lys Trp Ala Gln Cys Gly Gly Ile
260 265 270
Gly Phe Ser Gly Cys Thr Thr Cys Val Ser Gly Thr Thr Cys Gln Lys
275 280 285
Leu Asn Asp Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu
290 295
<210> 18
<211> 894
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_N.A. ，编码Ct.EG G1V3 变体蛋白: SP +
成熟
<400> 18
atgcggtcga ctcctgttct ccgtaccgcc cttgcggctg ctctcccctt cactgtcctg 60
gctgccgacg gcaagtccac taggtactgg gactgctgca agccttcttg ctcgtggccc 120
ggcaaggctg ctgtgagcca acccgtcttc gcctgtgacc gcaacttcaa ccgcatctat 180
gacttcggtg ccaagtctgg ctgcgagggc ggtccggcct attcttgcgc cgaccagacc 240
ccgtgggctg tcaacgacca attctcgtac ggcttcgctg ccaccaacat tgccggcggt 300
aacgaggctt catggtgctg cgcttgctac aagctcacct tcacctcggg acccgtggcc 360
ggcaaggtca tggttgtcca gtcgaccagc acgggcggtg accttggcaa caaccatttc 420
gacctgaaca tcccaggtgg aggcgttggt atcttcgatg gttgcacgcc ccagttcggc 480
ggtctgcccg gcgagcggta cggcgggatc tcgtcgcgca gccagtgcga cagcttcccg 540
gatgccctca agcctggctg ctactggcgc ttcgactggt tcctgaacgc tgacaacccg 600
aacttcacct tcgagcgcgt ccagtgtcct tccgagcttg ttgcccgcac cggctgcaag 660
cgcaatgacg acggcaacta ccccgtcttc actcctcctt cgggaggcaa cggtggcacc 720
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gtctccggca ccacttgcca gaagctgaac gactactact cccagtgtct gtaa 894
<210> 19
<211> 314
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_Ct.EG G1V4 变体蛋白: SP + 成熟
<400> 19
Met Arg Ser Ser Pro Val Leu Arg Thr Ala Leu Ala Ala Ala Leu Pro
1 5 10 15
Leu Ala Ala Leu Ala Ala Asp Gly Lys Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys
20 25 30
Cys Lys Pro Ser Cys Ser Trp Pro Gly Lys Ala Ser Val Asn Gln Pro
35 40 45
Val Tyr Ala Cys Asp Ala Asn Phe Gln Arg Leu Ser Asp Phe Asn Val
50 55 60
Gln Ser Gly Cys Asn Gly Gly Ser Ala Tyr Ser Cys Ala Asp Gln Thr
65 70 75 80
Pro Trp Ala Val Asn Asp Asn Leu Ala Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Ser
85 90 95
Ile Ala Gly Gly Ser Glu Ser Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Ala Leu
100 105 110
Thr Phe Thr Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Thr Met Val Val Gln Ser
115 120 125
Thr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Gly Ser Asn His Phe Asp Ile Ala Met
130 135 140
Pro Gly Gly Gly Val Gly Ile Phe Asn Gly Cys Ser Ser Gln Phe Gly
145 150 155 160
Gly Leu Pro Gly Ala Gln Tyr Gly Gly Ile Ser Ser Arg Asp Gln Cys
165 170 175
Asp Ser Phe Pro Ala Pro Leu Lys Pro Gly Cys Gln Trp Arg Phe Asp
180 185 190
Trp Phe Gln Asn Ala Asp Asn Pro Thr Phe Thr Phe Gln Gln Val Gln
195 200 205
Cys Pro Ala Glu Ile Val Ala Arg Ser Gly Cys Lys Arg Asn Asp Asp
210 215 220
Ser Ser Phe Pro Val Phe Thr Pro Pro Ser Gly Asp Ser Pro Ser Ser
225 230 235 240
Ser Ser Ala Ala Pro Thr Ser Thr Ser Thr Ser Gln Gln Pro Gln Gln
245 250 255
Pro Thr Ser Ser Ser Ser Gln Ala Ser Val Pro Thr Ser Asn Pro Gly
260 265 270
Gly Cys Thr Ser Gln Lys Trp Ala Gln Cys Gly Gly Ile Gly Phe Thr
275 280 285
Gly Cys Thr Thr Cys Val Ser Gly Thr Thr Cys Thr Lys Leu Asn Asp
290 295 300
Trp Tyr Ser Gln Cys Thr Met Ile Asn Leu
305 310
<210> 20
<211> 945
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_N.A. ，编码Ct.EG G1V4 变体蛋白: SP +
成熟
<400> 20
atgcgttcct cccccgtcct ccgcacggcc ctggccgctg ccctccccct ggccgccctc 60
gctgccgatg gcaagtcgac ccgctactgg gactgttgca agccgtcgtg ctcgtggccc 120
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gacttcaatg tccagtcggg ctgcaacggc ggctcggcct actcctgcgc cgaccagact 240
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tccgaatcct cgtggtgctg cgcctgctac gcgctcacct tcacttccgg tcccgtcgcc 360
ggcaagacaa tggtggtgca gtcaacgagc actggcggcg acctgggaag taaccatttc 420
gatatcgcca tgcccggcgg cggcgtgggc atcttcaacg gctgcagctc gcagttcggc 480
ggcctccccg gcgctcaata cggcggcatt tcgtcgcgcg accagtgcga ttccttcccc 540
gcgccgctca agcccggctg ccagtggcgg tttgactggt tccagaacgc cgacaacccg 600
acgttcacgt tccagcaggt gcagtgcccc gccgagatcg ttgcccgctc cggctgcaag 660
cgcaacgacg actccagctt ccccgtcttc acccccccaa gcggtgacag ccccagcagc 720
agcagcgctg ctcctacctc cacctcgact tcgcagcagc cgcagcagcc gacctccagc 780
agctcgcagg cttctgtgcc gactagcaac cctggtggct gcacctctca aaagtgggct 840
cagtgcggcg gcattggctt cactggctgc actacctgcg tctcgggcac cacttgcacc 900
aagctgaatg actggtactc gcagtgcaca atgatcaacc tgtaa 945
<210> 21
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_信号肽(野生型)
<400> 21
Met Arg Ser Thr Pro Val Leu Arg Thr Ala Leu Ala Ala Ala Leu Pro
1 5 10 15
Phe Thr Val Leu Ala
20
<210> 22
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_变体信号肽
<400> 22
Met Arg Ser Ser Pro Val Leu Arg Thr Ala Leu Ala Ala Ala Leu Pro
1 5 10 15
Leu Ala Ala Leu Ala
20
<210> 23
<211> 276
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_Ct.EG G2V1 蛋白: 成熟
<400> 23
Ala Asp Gly Lys Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys
1 5 10 15
Ser Trp Pro Gly Lys Ala Ala Val Ser Gln Pro Val Phe Ala Cys Asp
20 25 30
Arg Asn Phe Asn Arg Leu Ser Asp Phe Asn Val Gln Ser Gly Cys Asn
35 40 45
Gly Gly Pro Ala Tyr Ser Cys Ala Asp Gln Thr Pro Trp Ala Val Asn
50 55 60
Asp Gln Phe Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Asn Ile Ala Gly Gly Asn
65 70 75 80
Glu Ala Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Lys Leu Thr Phe Thr Ser Gly
85 90 95
Pro Val Ala Gly Lys Val Met Val Val Gln Ser Thr Ser Thr Gly Gly
100 105 110
Asp Leu Gly Asn Asn His Phe Asp Leu Asn Ile Pro Gly Gly Gly Val
115 120 125
Gly Ile Phe Asp Gly Cys Thr Pro Gln Phe Gly Gly Leu Pro Gly Glu
130 135 140
Arg Tyr Gly Gly Ile Ser Ser Arg Ser Gln Cys Asp Ser Phe Pro Asp
145 150 155 160
Ala Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp Arg Phe Asp Trp Phe Leu Asn Ala
165 170 175
Asp Asn Pro Asn Phe Thr Phe Glu Arg Val Gln Cys Pro Ser Glu Leu
180 185 190
Val Ala Arg Thr Gly Cys Lys Arg Asn Asp Asp Gly Asn Tyr Pro Val
195 200 205
Phe Thr Pro Pro Ser Gly Gly Asn Gly Gly Thr Gly Thr Pro Thr Ser
210 215 220
Thr Ala Pro Gly Ser Gly Gln Thr Ser Pro Gly Gly Gly Ser Gly Cys
225 230 235 240
Thr Ser Gln Lys Trp Ala Gln Cys Gly Gly Ile Gly Phe Ser Gly Cys
245 250 255
Thr Thr Cys Val Ser Gly Thr Thr Cys Gln Lys Leu Asn Asp Tyr Tyr
260 265 270
Ser Gln Cys Leu
275
<210> 24
<211> 831
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_N.A. ，编码Ct.EG G2V1 蛋白: 成熟
<400> 24
gccgacggca agtccactag gtactgggac tgctgcaagc cttcttgctc gtggcccggc 60
aaggctgctg tgagccaacc cgtcttcgcc tgtgaccgca acttcaaccg cctgtccgac 120
ttcaatgtcc agtctggctg caacggcggt ccggcctatt cttgcgccga ccagaccccg 180
tgggctgtca acgaccaatt ctcgtacggc ttcgctgcca ccaacattgc cggcggtaac 240
gaggcttcat ggtgctgcgc ttgctacaag ctcaccttca cctcgggacc cgtggccggc 300
aaggtcatgg ttgtccagtc gaccagcacg ggcggtgacc ttggcaacaa ccatttcgac 360
ctgaacatcc caggtggagg cgttggtatc ttcgatggtt gcacgcccca gttcggcggt 420
ctgcccggcg agcggtacgg cgggatctcg tcgcgcagcc agtgcgacag cttcccggat 480
gccctcaagc ctggctgcta ctggcgcttc gactggttcc tgaacgctga caacccgaac 540
ttcaccttcg agcgcgtcca gtgtccttcc gagcttgttg cccgcaccgg ctgcaagcgc 600
aatgacgacg gcaactaccc cgtcttcact cctccttcgg gaggcaacgg tggcaccggg 660
acgcccacgt cgactgcgcc tgggtcgggc cagacgtctc ccggcggcgg cagtggctgc 720
acctctcaaa agtgggctca gtgcggcggc attggcttca gcggctgcac tacctgcgtc 780
tcgggcacca cttgccagaa gctgaatgac tactactcgc agtgcctgta a 831
<210> 25
<211> 276
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_Ct.EG G2V2 变体蛋白: 成熟
<400> 25
Ala Asp Gly Lys Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys
1 5 10 15
Ser Trp Pro Gly Lys Ala Ala Val Ser Gln Pro Val Phe Ala Cys Asp
20 25 30
Arg Asn Phe Asn Arg Leu Ser Asp Phe Asn Val Gln Ser Gly Cys Asn
35 40 45
Gly Gly Pro Ala Tyr Ser Cys Ala Asp Gln Thr Pro Trp Ala Val Asn
50 55 60
Asp Gln Phe Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Asn Ile Ala Gly Gly Asn
65 70 75 80
Glu Ala Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Lys Leu Thr Phe Thr Ser Gly
85 90 95
Pro Val Ala Gly Lys Val Met Val Val Gln Ser Thr Ser Thr Gly Gly
100 105 110
Asp Leu Gly Asn Asn His Phe Asp Leu Asn Ile Pro Gly Gly Gly Val
115 120 125
Gly Ile Phe Asp Gly Cys Thr Pro Gln Phe Gly Gly Leu Pro Gly Glu
130 135 140
Arg Tyr Gly Gly Ile Ser Ser Arg Ser Gln Cys Asp Ser Phe Pro Asp
145 150 155 160
Ala Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp Arg Phe Asp Trp Phe Leu Asn Ala
165 170 175
Asp Asn Pro Asn Phe Thr Phe Glu Arg Val Gln Cys Pro Ser Glu Leu
180 185 190
Val Ala Arg Thr Gly Cys Lys Arg Asn Asp Asp Gly Asn Tyr Pro Val
195 200 205
Phe Thr Pro Pro Ser Gly Gly Asn Gly Gly Thr Gly Thr Pro Thr Ser
210 215 220
Thr Ala Pro Gly Ser Gly Gln Thr Ser Pro Gly Gly Gly Ser Gly Cys
225 230 235 240
Thr Ser Gln Lys Trp Ala Gln Cys Gly Gly Ile Gly Phe Ser Gly Cys
245 250 255
Thr Thr Cys Val Ser Gly Thr Thr Cys Gln Lys Leu Asn Asp Tyr Tyr
260 265 270
Ser Gln Cys Leu
275
<210> 26
<211> 831
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_N.A. ，编码Ct.EG G2V2 蛋白: 成熟
<400> 26
gccgacggca agtccactag gtactgggac tgctgcaagc cttcttgctc gtggcccggc 60
aaggctgatg tgagccaacc cgtcttcgcc tgtgaccgca acttcaaccg cctgtccgac 120
ttcaatgtcc agtctggctg caacggcggt ccggcctata cttgcgccga ccagaccccg 180
tgggctgtca acgaccaatt ctcgtacggc ttcgctgcca ccaacattgc cggcggtaac 240
gaggcttcat ggtgctgcgc ttgctacaag ctcaccttca cctcgggacc cgtggccggc 300
aaggtcatgg ttgtccagtc gaccagcacg ggcggtgacc ttggcgacaa ccatttcgac 360
ctgaacatcc caggtggagg cgttggtatc ttcgatggtt gcacgcccca gttcggcggt 420
ctgcccggcg agcggtacgg cgggatctcg tcgcgcagcc agtgcgacag cttcccggat 480
gccctcaagc ctggctgcta ctggcgcttc gactggttcc tgaacgctga caacccgaac 540
ttcaccttcg agcgcgtcca gtgtccttcc gagcttgttg cccgcaccgg ctgcaagcgc 600
aatgacgacg gcaactaccc cgtcttcact cctccttcgg gaggcaacgg tggcaccggg 660
acgcccacgt cgactgcgcc tgggtcgggc cagacgtctc ccggcggcgg cagtggctgc 720
acctctcaaa agtgggctca gtgcggcggc attggcttca gcggctgcac tacctgcgtc 780
tcgggcacca cttgccagaa gctgaatgac tactactcgc agtgcctgta a 831
<210> 27
<211> 293
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_Ct.EG G2V3 蛋白: 成熟
<400> 27
Ala Asp Gly Lys Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys
1 5 10 15
Ser Trp Pro Gly Lys Ala Asp Val Asn Gln Pro Val Phe Ala Cys Asp
20 25 30
Arg Asn Phe Asn Arg Leu Ser Asp Phe Asn Val Gln Ser Gly Cys Asn
35 40 45
Gly Gly Pro Ala Tyr Ser Cys Ala Asp Gln Thr Pro Trp Ala Val Asn
50 55 60
Asp Gln Phe Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Asn Ile Glu Gly Gly Asn
65 70 75 80
Glu Ala Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Lys Leu Thr Phe Thr Ser Gly
85 90 95
Pro Val Ala Gly Lys Val Met Val Val Gln Ser Thr Ser Thr Gly Gly
100 105 110
Asp Leu Gly Asn Asn His Phe Asp Leu Asn Ile Pro Gly Gly Gly Val
115 120 125
Gly Ile Phe Asp Gly Cys Thr Pro Gln Phe Gly Gly Leu Pro Gly Glu
130 135 140
Arg Tyr Gly Gly Ile Ser Ser Arg Ser Gln Cys Asp Ser Phe Pro Asp
145 150 155 160
Ala Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp Arg Phe Asp Trp Phe Leu Asn Ala
165 170 175
Asp Asn Pro Asn Phe Thr Phe Glu Arg Val Gln Cys Pro Ser Glu Leu
180 185 190
Val Ala Arg Thr Gly Cys Lys Arg Asn Asp Asp Gly Asn Tyr Pro Val
195 200 205
Phe Thr Pro Pro Ser Gly Asp Ser Pro Ser Ser Ser Ser Ala Ala Pro
210 215 220
Thr Ser Thr Ser Thr Ser Gln Gln Pro Gln Gln Pro Thr Ser Ser Ser
225 230 235 240
Ser Gln Ala Ser Val Pro Thr Ser Asn Pro Gly Gly Cys Thr Ser Gln
245 250 255
Lys Trp Ala Gln Cys Gly Gly Ile Gly Phe Thr Gly Cys Thr Thr Cys
260 265 270
Val Ser Gly Thr Thr Cys Thr Lys Leu Asn Asp Trp Tyr Ser Gln Cys
275 280 285
Thr Met Ile Asn Leu
290
<210> 28
<211> 882
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_N.A. ，编码Ct.EG G2V3 蛋白: 成熟
<400> 28
gccgacggca agtccactag gtactgggac tgctgcaagc cttcttgctc gtggcccggc 60
aaggctgatg tgaaccaacc cgtcttcgcc tgtgaccgca acttcaaccg cctgtccgac 120
ttcaatgtcc agtctggctg caacggcggt ccggcctatt cttgcgccga ccagaccccg 180
tgggctgtca acgaccaatt ctcgtacggc ttcgctgcca ccaacattga aggcggtaac 240
gaggcttcat ggtgctgcgc ttgctacaag ctcaccttca cctcgggacc cgtggccggc 300
aaggtcatgg ttgtccagtc gaccagcacg ggcggtgacc ttggcaacaa ccatttcgac 360
ctgaacatcc caggtggagg cgttggtatc ttcgatggtt gcacgcccca gttcggcggt 420
ctgcccggcg agcggtacgg cgggatctcg tcgcgcagcc agtgcgacag cttcccggat 480
gccctcaagc ctggctgcta ctggcgcttc gactggttcc tgaacgctga caacccgaac 540
ttcaccttcg agcgcgtcca gtgtccttcc gagcttgttg cccgcaccgg ctgcaagcgc 600
aatgacgacg gcaactaccc cgtcttcact cctccttcgg gagacagccc cagcagcagc 660
agcgctgctc ctacctccac ctcgacttcg cagcagccgc agcagccgac ctccagcagc 720
tcgcaggctt ctgtgccgac tagcaaccct ggtggctgca cctctcaaaa gtgggctcag 780
tgcggcggca ttggcttcac tggctgcact acctgcgtct cgggcaccac ttgcaccaag 840
ctgaatgact ggtactcgca gtgcacaatg atcaacctgt aa 882
<210> 29
<211> 297
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_Ct.EG G2V1 蛋白: SP + 成熟
<400> 29
Met Arg Ser Thr Pro Val Leu Arg Thr Ala Leu Ala Ala Ala Leu Pro
1 5 10 15
Phe Thr Val Leu Ala Ala Asp Gly Lys Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys
20 25 30
Cys Lys Pro Ser Cys Ser Trp Pro Gly Lys Ala Ala Val Ser Gln Pro
35 40 45
Val Phe Ala Cys Asp Arg Asn Phe Asn Arg Leu Ser Asp Phe Asn Val
50 55 60
Gln Ser Gly Cys Asn Gly Gly Pro Ala Tyr Ser Cys Ala Asp Gln Thr
65 70 75 80
Pro Trp Ala Val Asn Asp Gln Phe Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Asn
85 90 95
Ile Ala Gly Gly Asn Glu Ala Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Lys Leu
100 105 110
Thr Phe Thr Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Val Met Val Val Gln Ser
115 120 125
Thr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Gly Asn Asn His Phe Asp Leu Asn Ile
130 135 140
Pro Gly Gly Gly Val Gly Ile Phe Asp Gly Cys Thr Pro Gln Phe Gly
145 150 155 160
Gly Leu Pro Gly Glu Arg Tyr Gly Gly Ile Ser Ser Arg Ser Gln Cys
165 170 175
Asp Ser Phe Pro Asp Ala Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp Arg Phe Asp
180 185 190
Trp Phe Leu Asn Ala Asp Asn Pro Asn Phe Thr Phe Glu Arg Val Gln
195 200 205
Cys Pro Ser Glu Leu Val Ala Arg Thr Gly Cys Lys Arg Asn Asp Asp
210 215 220
Gly Asn Tyr Pro Val Phe Thr Pro Pro Ser Gly Gly Asn Gly Gly Thr
225 230 235 240
Gly Thr Pro Thr Ser Thr Ala Pro Gly Ser Gly Gln Thr Ser Pro Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Gly Cys Thr Ser Gln Lys Trp Ala Gln Cys Gly Gly Ile
260 265 270
Gly Phe Ser Gly Cys Thr Thr Cys Val Ser Gly Thr Thr Cys Gln Lys
275 280 285
Leu Asn Asp Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu
290 295
<210> 30
<211> 894
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_N.A. ，编码Ct.EG G2V1 蛋白: SP + 成熟
<400> 30
atgcggtcga ctcctgttct ccgtaccgcc cttgcggctg ctctcccctt cactgtcctg 60
gctgccgacg gcaagtccac taggtactgg gactgctgca agccttcttg ctcgtggccc 120
ggcaaggctg ctgtgagcca acccgtcttc gcctgtgacc gcaacttcaa ccgcctgtcc 180
gacttcaatg tccagtctgg ctgcaacggc ggtccggcct attcttgcgc cgaccagacc 240
ccgtgggctg tcaacgacca attctcgtac ggcttcgctg ccaccaacat tgccggcggt 300
aacgaggctt catggtgctg cgcttgctac aagctcacct tcacctcggg acccgtggcc 360
ggcaaggtca tggttgtcca gtcgaccagc acgggcggtg accttggcaa caaccatttc 420
gacctgaaca tcccaggtgg aggcgttggt atcttcgatg gttgcacgcc ccagttcggc 480
ggtctgcccg gcgagcggta cggcgggatc tcgtcgcgca gccagtgcga cagcttcccg 540
gatgccctca agcctggctg ctactggcgc ttcgactggt tcctgaacgc tgacaacccg 600
aacttcacct tcgagcgcgt ccagtgtcct tccgagcttg ttgcccgcac cggctgcaag 660
cgcaatgacg acggcaacta ccccgtcttc actcctcctt cgggaggcaa cggtggcacc 720
gggacgccca cgtcgactgc gcctgggtcg ggccagacgt ctcccggcgg cggcagtggc 780
tgcacctctc aaaagtgggc tcagtgcggc ggcattggct tcagcggctg cactacctgc 840
gtctcgggca ccacttgcca gaagctgaat gactactact cgcagtgcct gtaa 894
<210> 31
<211> 297
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_Ct.EG G2V2 变体蛋白: SP + 成熟
<400> 31
Met Arg Ser Thr Pro Val Leu Arg Thr Ala Leu Ala Ala Ala Leu Pro
1 5 10 15
Phe Thr Val Leu Ala Ala Asp Gly Lys Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys
20 25 30
Cys Lys Pro Ser Cys Ser Trp Pro Gly Lys Ala Ala Val Ser Gln Pro
35 40 45
Val Phe Ala Cys Asp Arg Asn Phe Asn Arg Leu Ser Asp Phe Asn Val
50 55 60
Gln Ser Gly Cys Asn Gly Gly Pro Ala Tyr Ser Cys Ala Asp Gln Thr
65 70 75 80
Pro Trp Ala Val Asn Asp Gln Phe Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Asn
85 90 95
Ile Ala Gly Gly Asn Glu Ala Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Lys Leu
100 105 110
Thr Phe Thr Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Val Met Val Val Gln Ser
115 120 125
Thr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Gly Asn Asn His Phe Asp Leu Asn Ile
130 135 140
Pro Gly Gly Gly Val Gly Ile Phe Asp Gly Cys Thr Pro Gln Phe Gly
145 150 155 160
Gly Leu Pro Gly Glu Arg Tyr Gly Gly Ile Ser Ser Arg Ser Gln Cys
165 170 175
Asp Ser Phe Pro Asp Ala Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp Arg Phe Asp
180 185 190
Trp Phe Leu Asn Ala Asp Asn Pro Asn Phe Thr Phe Glu Arg Val Gln
195 200 205
Cys Pro Ser Glu Leu Val Ala Arg Thr Gly Cys Lys Arg Asn Asp Asp
210 215 220
Gly Asn Tyr Pro Val Phe Thr Pro Pro Ser Gly Gly Asn Gly Gly Thr
225 230 235 240
Gly Thr Pro Thr Ser Thr Ala Pro Gly Ser Gly Gln Thr Ser Pro Gly
245 250 255
Gly Gly Ser Gly Cys Thr Ser Gln Lys Trp Ala Gln Cys Gly Gly Ile
260 265 270
Gly Phe Ser Gly Cys Thr Thr Cys Val Ser Gly Thr Thr Cys Gln Lys
275 280 285
Leu Asn Asp Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu
290 295
<210> 32
<211> 894
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_N.A. ，编码Ct.EG G2V2 蛋白: SP + 成熟
<400> 32
atgcggtcga ctcctgttct ccgtaccgcc cttgcggctg ctctcccctt cactgtcctg 60
gctgccgacg gcaagtccac taggtactgg gactgctgca agccttcttg ctcgtggccc 120
ggcaaggctg atgtgagcca acccgtcttc gcctgtgacc gcaacttcaa ccgcctgtcc 180
gacttcaatg tccagtctgg ctgcaacggc ggtccggcct atacttgcgc cgaccagacc 240
ccgtgggctg tcaacgacca attctcgtac ggcttcgctg ccaccaacat tgccggcggt 300
aacgaggctt catggtgctg cgcttgctac aagctcacct tcacctcggg acccgtggcc 360
ggcaaggtca tggttgtcca gtcgaccagc acgggcggtg accttggcga caaccatttc 420
gacctgaaca tcccaggtgg aggcgttggt atcttcgatg gttgcacgcc ccagttcggc 480
ggtctgcccg gcgagcggta cggcgggatc tcgtcgcgca gccagtgcga cagcttcccg 540
gatgccctca agcctggctg ctactggcgc ttcgactggt tcctgaacgc tgacaacccg 600
aacttcacct tcgagcgcgt ccagtgtcct tccgagcttg ttgcccgcac cggctgcaag 660
cgcaatgacg acggcaacta ccccgtcttc actcctcctt cgggaggcaa cggtggcacc 720
gggacgccca cgtcgactgc gcctgggtcg ggccagacgt ctcccggcgg cggcagtggc 780
tgcacctctc aaaagtgggc tcagtgcggc ggcattggct tcagcggctg cactacctgc 840
gtctcgggca ccacttgcca gaagctgaat gactactact cgcagtgcct gtaa 894
<210> 33
<211> 314
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_Ct.EG G2V3 蛋白: SP + 成熟
<400> 33
Met Arg Ser Thr Pro Val Leu Arg Thr Ala Leu Ala Ala Ala Leu Pro
1 5 10 15
Phe Thr Val Leu Ala Ala Asp Gly Lys Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys
20 25 30
Cys Lys Pro Ser Cys Ser Trp Pro Gly Lys Ala Asp Val Asn Gln Pro
35 40 45
Val Phe Ala Cys Asp Arg Asn Phe Asn Arg Leu Ser Asp Phe Asn Val
50 55 60
Gln Ser Gly Cys Asn Gly Gly Pro Ala Tyr Ser Cys Ala Asp Gln Thr
65 70 75 80
Pro Trp Ala Val Asn Asp Gln Phe Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Asn
85 90 95
Ile Glu Gly Gly Asn Glu Ala Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Lys Leu
100 105 110
Thr Phe Thr Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Val Met Val Val Gln Ser
115 120 125
Thr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Gly Asn Asn His Phe Asp Leu Asn Ile
130 135 140
Pro Gly Gly Gly Val Gly Ile Phe Asp Gly Cys Thr Pro Gln Phe Gly
145 150 155 160
Gly Leu Pro Gly Glu Arg Tyr Gly Gly Ile Ser Ser Arg Ser Gln Cys
165 170 175
Asp Ser Phe Pro Asp Ala Leu Lys Pro Gly Cys Tyr Trp Arg Phe Asp
180 185 190
Trp Phe Leu Asn Ala Asp Asn Pro Asn Phe Thr Phe Glu Arg Val Gln
195 200 205
Cys Pro Ser Glu Leu Val Ala Arg Thr Gly Cys Lys Arg Asn Asp Asp
210 215 220
Gly Asn Tyr Pro Val Phe Thr Pro Pro Ser Gly Asp Ser Pro Ser Ser
225 230 235 240
Ser Ser Ala Ala Pro Thr Ser Thr Ser Thr Ser Gln Gln Pro Gln Gln
245 250 255
Pro Thr Ser Ser Ser Ser Gln Ala Ser Val Pro Thr Ser Asn Pro Gly
260 265 270
Gly Cys Thr Ser Gln Lys Trp Ala Gln Cys Gly Gly Ile Gly Phe Thr
275 280 285
Gly Cys Thr Thr Cys Val Ser Gly Thr Thr Cys Thr Lys Leu Asn Asp
290 295 300
Trp Tyr Ser Gln Cys Thr Met Ile Asn Leu
305 310
<210> 34
<211> 945
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成序列_N.A. ，编码Ct.EG G2V3 蛋白: SP + 成熟
<400> 34
atgcggtcga ctcctgttct ccgtaccgcc cttgcggctg ctctcccctt cactgtcctg 60
gctgccgacg gcaagtccac taggtactgg gactgctgca agccttcttg ctcgtggccc 120
ggcaaggctg atgtgaacca acccgtcttc gcctgtgacc gcaacttcaa ccgcctgtcc 180
gacttcaatg tccagtctgg ctgcaacggc ggtccggcct attcttgcgc cgaccagacc 240
ccgtgggctg tcaacgacca attctcgtac ggcttcgctg ccaccaacat tgaaggcggt 300
aacgaggctt catggtgctg cgcttgctac aagctcacct tcacctcggg acccgtggcc 360
ggcaaggtca tggttgtcca gtcgaccagc acgggcggtg accttggcaa caaccatttc 420
gacctgaaca tcccaggtgg aggcgttggt atcttcgatg gttgcacgcc ccagttcggc 480
ggtctgcccg gcgagcggta cggcgggatc tcgtcgcgca gccagtgcga cagcttcccg 540
gatgccctca agcctggctg ctactggcgc ttcgactggt tcctgaacgc tgacaacccg 600
aacttcacct tcgagcgcgt ccagtgtcct tccgagcttg ttgcccgcac cggctgcaag 660
cgcaatgacg acggcaacta ccccgtcttc actcctcctt cgggagacag ccccagcagc 720
agcagcgctg ctcctacctc cacctcgact tcgcagcagc cgcagcagcc gacctccagc 780
agctcgcagg cttctgtgcc gactagcaac cctggtggct gcacctctca aaagtgggct 840
cagtgcggcg gcattggctt cactggctgc actacctgcg tctcgggcac cacttgcacc 900
aagctgaatg actggtactc gcagtgcaca atgatcaacc tgtaa 945
Claims (57)
1.一种包含变体内切葡聚糖酶的组合物，所述变体内切葡聚糖酶与SEQ ID NO:1相比包含一个或多个氨基酸修饰，其中所述一个或多个氨基酸修饰发生在对应于选自下组的位置的位置处：位置2,17,23,25,29,33,36,38,39,42,43,44,48,51,54,66,67,68,75,77,80,82,90,102,116,121,122,123,132,135,136,141,144,145,153,160,161,164,167,174,180,184,185,190,192,194,195,196,204,205,206,215,216,217,218,219,220,221,222,223,228,229,230,231,232,233,234,235,237,238,239,241,242,243,244,245,246,247,248,249,250,251,258,259,267,268,269,270,271,273,274,275,276,277,278,279,280,281,282,283,284,285,286,287,288,289,290,291,292和293，其中所述变体内切葡聚糖酶与SEQ ID NO:1表现出至少80％的序列同一性；并且其中所述变体内切葡聚糖酶具有内切葡聚糖酶活性。
2.权利要求1的组合物，其中所述一个或多个氨基酸修饰选自下组：对应于SEQ ID NO:1的D2E,D2F,D2N,D2Q,D2S,D2T,S17G,A23D,A23N,A23S,S25N,F29Y,R33A,N36Q,I38L,Y39S,G42N,A43E,A43L,A43S,A43T,A43V,K44E,K44Q,E48N,P51E,P51N,P51S,P51T,S54T,Q66N,Q66T,F67L,F67Y,S68A,N75S,A77E,A77Q,N80S,A82S,K90A,V102Q,V102R,V102T,N116D,N116E,N116S,L121I,N122A,N122S,I123M,D132N,T135S,P136S,L141S,E144A,R145Q,S153D,D160A,A161K,A161P,P164S,P164T,Y167Q,L174Q,N180T,E184A,E184K,E184N,E184Q,E184R,E184S,E184T,R185Q,S190A,L192I,A194T,R195S,T196S,G204S,N205S,Y206F,D215*,D215G,S216N,P217G,S218G,S219T,S220G,S221-,A222-,A223T,S228A,T229P,S230G,Q231S,Q232G,P233Q,Q234T,Q235S,T237G,S238G,S239G,S241-,Q242-,A243-,S244-,V245-,P246-,T247-,S248-,N249-,P250-,G251-,W258*,W258R,W258S,A259*,A259D,T267S,G268N,C269R,C269S,T270*,T271E,V273*,V273D,V273G,S274R,G275*,G275A,G275E,G275N,G275T,T276G,T276H,T276P,T276R,T277D,T277E,T277L,C278*,C278A,C278L,T279H,T279P,T279Q,K280Q,K280S,L281*,L281A,L281E,L281G,L281K,L281S,N282E,N282S,D283*,W284*,W284G,W284M,W284R,W284T,W284Y,Y285*,S286A,S286G,Q287H,Q287S,C288*,C288A,T289-,T289K,T289Q,M290-,M290*,I291-,I291A,I291Q,I291S,N292-,N292S,L293G,L293N,L293T和L293V的修饰。
3.权利要求1或权利要求2的组合物，其中SEQ ID NO:1的所述一个或多个氨基酸修饰发生在SEQ ID NO:1所述位置中的1个、所述位置中的2个、所述位置中的3个、所述位置中的4个、所述位置中的5个、所述位置中的6个、所述位置中的7个、所述位置中的8个、所述位置中的9个、所述位置中的10个、所述位置中的11个、所述位置中的12个、所述位置中的13个、所述位置中的14个、所述位置中的15个、所述位置中的16个、所述位置中的17个、所述位置中的18个、所述位置中的19个、所述位置中的20个、所述位置中的21个、所述位置中的22个、所述位置中的23个、所述位置中的24个、所述位置中的25个、所述位置中的26个、所述位置中的27个、所述位置中的28个、所述位置中的29个、所述位置中的30个、所述位置中的31个、所述位置中的32个、所述位置中的33个、所述位置中的34个、所述位置中的35个、所述位置中的36个、所述位置中的37个、所述位置中的38个、所述位置中的39个、所述位置中的40个、所述位置中的41个、所述位置中的42个、所述位置中的43个、所述位置中的44个、所述位置中的45个、所述位置中的46个或所述位置中的47个位置处。
4.权利要求1或权利要求2的组合物，其中所述变体内切葡聚糖酶与SEQ ID NO:1具有至少85％、90％或95％的序列同一性。
5.权利要求1或权利要求2的组合物，其中所述变体内切葡聚糖酶包含选自下组的所述氨基酸修饰：D215*,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43E/K44E/E48N/S54T/A77Q/N116D/N122S/L141S/L281G,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43E/K44Q/E48N/S54T/N116E/W258S/A259D/G275E/T277D,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43S/K44E/E48N/A77E/N116S/N122A/N180T/W258S/A259D/G275E/T277D/I291S/L293T,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43S/K44E/E48N/S54T/A77E/N122S/P164T/N180T/A259D/S286A/L293T,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43S/K44Q/E48N/A77Q/N116E/L141S/G275E/T277D/W284R,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43S/K44Q/E48N/S54T/N116D/W258S/G275T/L281E/I291Q,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43S/K44Q/E48N/V102Q/W258S/L281E/N282S/I291A,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43S/K44Q/E48N/V102R/W258R/A259D/L281E/N282S,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43T/K44E/E48N/P164T/N180T/A194T/W258S/A259D/G275T/L281G,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43T/K44E/E48N/V102Q/N116D/L281G/N282S,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43T/K44Q/E48N/A77E/V102Q/N116D/W258S/G275T/L281E/I291A,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43T/K44Q/E48N/A77Q/N180T/W258S/G275E/I291Q,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44E/E48N/A77E/N116D/G275T/L281E,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44E/E48N/N122A/N180T/T277D/L281E/N282S,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/A161K/P164T/N180T,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/A77E/A161K/P164T/N180T,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/A77E/N116D/W258S/L281E,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/A77Q/N116S/N180T/G275E/T277E,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/A77Q/N180T,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/F67Y/A77Q/N116S/N180T/W258S/A259D/G275T/T277E/L281K/N282S/I291S/L293N,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/F67Y/A77Q/N122S/L141S/N180T/A194T/W258R/L281K,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/F67Y/N180T,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/L141S,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/N116D/G275T/L281E/N282S/I291A,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/N116D/L281K/N282S/I291S/N292S/L293N,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/N116D/W258S/L281G,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/N180T,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/N180T/A259D/G275T/N282S,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/Q66T/A77Q/N122A/L141S/G275T/W284G/S286A,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/A77E/A161P/W258S/W284M/I291Q,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/A77E/T277E/L281E/S286A,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/A77E/V102Q/G275T/T277D/W284M/I291Q,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/A77E/W258S/T277D/W284M/I291A,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/I291A,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/L281E,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/N116D/A161P/L281E/N282S,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/N116D/A161P/W258S/G275T/L281E/I291A,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/N116D/A161P/W258S/W284M/I291A,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/N116D/D215G/S216N/P217G/S218G/S219T/S220G/S221-/A222-/A223T/S228A/T229P/S230G/Q231S/Q232G/P233Q/Q234T/Q235S/T237G/S238G/S239G/S241-/Q242-/A243-/S244-/V245-/P246-/T247-/S248-/N249-/P250-/G251-/T267S/T279Q/W284Y/T289-/M290-/I291-/N292-,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/N116D/L141S/A161K/N180T/W258R/A259D/G275E/T277D/W284R/I291Q/N292S/L293G,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/N116D/L141S/N180T/G275T/W284R/I291Q/L293N,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/N116D/W258S/G275T/N282S/I291A,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/N116D/W284M/I291Q,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/N116E/L141S/N180T/L281G/N282S,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/N116S/G275E/Y285*,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/Q66T/F67Y/N122S/N180T/L281G/I291S/N292S/L293G,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/V102Q/N116D/A161P/T277D/W284M/I291Q,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/V102Q/N116D/W258S/G275T/I291Q,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/V102Q/N116D/W258S/G275T/T277E,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/V102Q/N116D/W258S/G275T/T277E/L281G,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/V102Q/N116D/W258S/L281G/I291A,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/V102Q/W258S/G275T/T277D/N282S,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/V102Q/W258S/W284M/S286A,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/W258S,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/V102Q/A161P/W258S,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/V102Q/W258S/I291Q,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/V102R/N180T,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/W258S/I291A,A23D/I38L/Y39S/G42N/K44Q/E48N/A77E/N116D/L281E/I291A,A23D/S25N/I38L/Y39S/G42N/A43E/K44E/E48N/V102R/N116S/N122A/L141S/A161K/P164T/A194T/W258R/A259D/L281E,A23D/S25N/I38L/Y39S/G42N/A43E/K44Q/E48N/Q66T/F67Y/L141S/N180T,A23D/S25N/I38L/Y39S/G42N/A43S/K44Q/E48N/S54T/Q66T/L141S/N180T/W258S/A259D/T277D/W284G/Y285*,A23D/S25N/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/A161K/N180T,A23D/S25N/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/A161P,A23D/S25N/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/A77E,A23D/S25N/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/A77E/N180T,A23D/S25N/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/A77E/N180T/A259D/L281K/L293T,A23D/S25N/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/A77E/V102Q/N180T,A23D/S25N/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/A77Q/N180T/A194T/W258S/W284G/S286G,A23D/S25N/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/A77Q/V102Q/N180T/A194T,A23D/S25N/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/A77Q/W258S/G275T/T277D/W284M/I291S/L293T,A23D/S25N/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N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6.权利要求5的组合物，其中所述变体内切葡聚糖酶包含选自下组的所述氨基酸修饰：D215*,I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N,D215G/S216N/P217G/S218G/S219T/S220G/S221-/A222-/A223T/S228A/T229P/S230G/Q231S/Q232G/P233Q/Q234T/Q235S/T237G/S238G/S239G/S241-/Q242-/A243-/S244-/V245-/P246-/T247-/S248-/N249-/P250-/G251-/T267S/T279Q/W284Y/T289-/M290-/I291-/N292-,和T-18S/F-5L/T-4A/V-3A/A23S/S25N/F29Y/R33A/N36Q/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/P51S/Q66N/F67L/S68A/N75S/N80S/A82S/K90A/V102T/N116S/L121I/N122A/I123M/D132N/T135S/P136S/E144A/R145Q/S153D/D160A/A161P/Y167Q/L174Q/N180T/E184Q/R185Q/S190A/L192I/T196S/G204S/N205S/Y206F。
7.权利要求5的组合物，其中所述变体内切葡聚糖酶包含选自下组的所述氨基酸修饰：I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N,D215G/S216N/P217G/S218G/S219T/S220G/S221-/A222-/A223T/S228A/T229P/S230G/Q231S/Q232G/P233Q/Q234T/Q235S/T237G/S238G/S239G/S241-/Q242-/A243-/S244-/V245-/P246-/T247-/S248-/N249-/P250-/G251-/T267S/T279Q/W284Y/T289-/M290-/I291-/N292-,I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/D215G/S216N/P217G/S218G/S219T/S220G/S221-/A222-/A223T/S228A/T229P/S230G/Q231S/Q232G/P233Q/Q234T/Q235S/T237G/S238G/S239G/S241-/Q242-/A243-/S244-/V245-/P246-/T247-/S248-/N249-/P250-/G251-/T267S/T279Q/W284Y/T289-/M290-/I291-/N292-,A23D/S25N/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/A77E,A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/N116D/D215G/S216N/P217G/S218G/S219T/S220G/S221-/A222-/A223T/S228A/T229P/S230G/Q231S/Q232G/P233Q/Q234T/Q235S/T237G/S238G/S239G/S241-/Q242-/A243-/S244-/V245-/P246-/T247-/S248-/N249-/P250-/G251-/T267S/T279Q/W284Y/T289-/M290-/I291-/N292-,D215*和A23S/S25N/F29Y/R33A/N36Q/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/P51S/Q66N/F67L/S68A/N75S/N80S/A82S/K90A/V102T/N116S/L121I/N122A/I123M/D132N/T135S/P136S/E144A/R145Q/S153D/D160A/A161P/Y167Q/L174Q/N180T/E184Q/R185Q/S190A/L192I/T196S/G204S/N205S/Y206F。
8.权利要求7的组合物，其中所述变体内切葡聚糖酶包含所述氨基酸修饰I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N。
9.权利要求7的组合物，其中所述变体内切葡聚糖酶包含所述氨基酸修饰D215G/S216N/P217G/S218G/S219T/S220G/S221-/A222-/A223T/S228A/T229P/S230G/Q231S/Q232G/P233Q/Q234T/Q235S/T237G/S238G/S239G/S241-/Q242-/A243-/S244-/V245-/P246-/T247-/S248-/N249-/P250-/G251-/T267S/T279Q/W284Y/T289-/M290-/I291-/N292-。
10.权利要求7的组合物，其中所述变体内切葡聚糖酶包含所述氨基酸修饰I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/D215G/S216N/P217G/S218G/S219T/S220G/S221-/A222-/A223T/S228A/T229P/S230G/Q231S/Q232G/P233Q/Q234T/Q235S/T237G/S238G/S239G/S241-/Q242-/A243-/S244-/V245-/P246-/T247-/S248-/N249-/P250-/G251-/T267S/T279Q/W284Y/T289-/M290-/I291-/N292-。
11.权利要求7的组合物，其中所述变体内切葡聚糖酶包含所述氨基酸修饰A23D/S25N/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/A77E。
12.权利要求7的组合物，其中所述变体内切葡聚糖酶包含所述氨基酸修饰A23D/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/S54T/N116D/D215G/S216N/P217G/S218G/S219T/S220G/S221-/A222-/A223T/S228A/T229P/S230G/Q231S/Q232G/P233Q/Q234T/Q235S/T237G/S238G/S239G/S241-/Q242-/A243-/S244-/V245-/P246-/T247-/S248-/N249-/P250-/G251-/T267S/T279Q/W284Y/T289-/M290-/I291-/N292-。
13.权利要求7的组合物，其中所述变体内切葡聚糖酶包含所述氨基酸修饰D215*。
14.权利要求7的组合物，其中所述变体内切葡聚糖酶包含所述氨基酸修饰A23S/S25N/F29Y/R33A/N36Q/I38L/Y39S/G42N/A43V/K44Q/E48N/P51S/Q66N/F67L/S68A/N75S/N80S/A82S/K90A/V102T/N116S/L121I/N122A/I123M/D132N/T135S/P136S/E144A/R145Q/S153D/D160A/A161P/Y167Q/L174Q/N180T/E184Q/R185Q/S190A/L192I/T196S/G204S/N205S/Y206F。
15.权利要求1或权利要求2的组合物，其中所述变体内切葡聚糖酶与选自下组的氨基酸序列表现出至少90％序列同一性：SEQ ID NO:3,SEQ ID NO:5,SEQ ID NO:7,SEQ ID NO:9,SEQ ID NO:23,SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:27。
16.权利要求15的组合物，其中所述变体内切葡聚糖酶与SEQ ID NO:5表现出至少90％的序列同一性。
17.权利要求15的组合物，其中所述变体内切葡聚糖酶与SEQ ID NO:7表现出至少90％的序列同一性。
18.权利要求15的组合物，其中所述变体内切葡聚糖酶与SEQ ID NO:23表现出至少90％的序列同一性。
19.权利要求15的组合物，其中所述变体内切葡聚糖酶与SEQ ID NO:27表现出至少90％的序列同一性。
20.权利要求15的组合物，其中所述变体内切葡聚糖酶具有SEQ ID NO:3。
21.权利要求15的组合物，其中所述变体内切葡聚糖酶具有SEQ ID NO:5。
22.权利要求15的组合物，其中所述变体内切葡聚糖酶具有SEQ ID NO:7。
23.权利要求15的组合物，其中所述变体内切葡聚糖酶具有SEQ ID NO:9。
24.权利要求15的组合物，其中所述变体内切葡聚糖酶具有SEQ ID NO:23。
25.权利要求15的组合物，其中所述变体内切葡聚糖酶具有SEQ ID NO:25。
26.权利要求15的组合物，其中所述变体内切葡聚糖酶具有SEQ ID NO:27。
27.核酸，其编码权利要求1-26中任一项的变体内切葡聚糖酶。
28.权利要求27的核酸，其中所述核酸针对宿主生物体进行密码子优化以在所述生物体中表达所述变体内切葡聚糖酶。
29.权利要求27或权利要求28的核酸，其包含选自由下组的核酸序列：SEQ ID NO:4,SEQ ID NO:6,SEQ ID NO:8,SEQ ID NO:10,SEQ ID NO:24,SEQ ID NO:26和SEQ ID NO:28。
30.表达载体，其包含权利要求27-29中任一项的核酸。
31.宿主细胞，其包含权利要求27-29中任一项的核酸。
32.宿主细胞，其包含权利要求30的表达载体。
33.权利要求31或权利要求32的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自下组：细菌细胞、真菌细胞和酵母细胞。
34.制备变体内切葡聚糖酶的方法，包括：a)在表达所述变体内切葡聚糖酶的条件下培养权利要求31-33中任一项的宿主细胞；并且b)回收所述变体内切葡聚糖酶。
35.核酸，其编码包含信号肽和成熟蛋白质的前蛋白，其中所述信号肽是野生型信号肽或与野生型信号肽相比包含一个或多个氨基酸修饰的变体信号肽；并且其中与权利要求1-26中任一项的SEQ ID NO:1相比，所述成熟蛋白质包含所述一个或多个氨基酸修饰。
36.权利要求35的核酸，其中所述信号肽是野生型信号肽。
37.权利要求36的核酸，其中所述野生型信号肽包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列。
38.权利要求35的核酸，其中所述信号肽是与SEQ ID NO:21相比包含一个或多个氨基酸修饰的变体信号肽，其中所述变体信号肽中的所述一个或多个氨基酸修饰发生在位置对应于选自下组的位置处：位置-18、-5、-4和-3。
39.权利要求38的核酸，其中所述变体信号肽包含所述一个或多个选自下组的氨基酸修饰：T-18S、F-5L、T-4A和V-3A。
40.权利要求39的核酸，其中所述变体信号肽包含SEQ ID NO:22的氨基酸序列。
41.权利要求35的核酸，其中所述前蛋白包含选自下组的氨基酸序列：SEQ ID NO:13、SEQ ID NO:15、SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:31和SEQ ID NO:33。
42.权利要求35的核酸，其包含选自下组的核酸序列：SEQ ID NO:14,SEQ ID NO:16,SEQ ID NO:18,SEQ ID NO:20,SEQ ID NO:30,SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:34。
43.权利要求35-42中任一项的核酸，其中所述前蛋白与外源构建体序列可操作连接。
44.权利要求43的核酸，其中所述外源构建体序列是外源启动子。
45.表达载体，其包含权利要求35-44中任一项的核酸。
46.宿主细胞，其包含权利要求35-44中任一项的核酸。
47.宿主细胞，其包含权利要求45的表达载体。
48.权利要求46或权利要求47的宿主细胞，其中所述宿主细胞选自下组：细菌细胞、真菌细胞和酵母细胞。
49.制备变体内切葡聚糖酶的方法，包括：a)在表达所述变体内切葡聚糖酶的条件下培养权利要求46-48中任一项的宿主细胞；并且b)回收所述变体内切葡聚糖酶。
50.生物石磨的方法，其包括将权利要求1-26中任一项的变体内切葡聚糖酶与含棉织物或服装接触的步骤。
51.根据权利要求50的生物石磨的方法，其中所述含棉织物或服装是粗斜纹棉布(denim)。
52.生物整理的方法，其包括将权利要求1-26中任一项所述的变体内切葡聚糖酶与纺织材料接触的步骤。
53.根据权利要求52的生物整理的方法，其中所述纺织材料选自下组：织物、服装和纱线。
54.洗涤剂组合物，包含权利要求1-26中任一项的变体内切葡聚糖酶。
55.权利要求54的洗涤剂组合物，其还包含至少一种表面活性剂和任选地至少一种辅助成分。
56.处理含有纤维素纤维的纺织材料的方法，其包括使所述纺织材料与权利要求54或权利要求55的洗涤剂组合物接触。
57.处理木材来源的纸浆或纤维的方法，其包括将权利要求1-26中任一项的变体内切葡聚糖酶与木材来源的机械或化学纸浆或次级纤维接触的步骤。
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