CN101346464A - 新型酶 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及新型纤维素酶，特别是新型内切葡聚糖酶，包括内切葡聚糖酶融合蛋白，含有这些内切葡聚糖酶和融合蛋白的制品和组合物，用于它们的制备的表达载体、宿主细胞和方法，以及纤维素酶、制品和组合物在纺织、洗涤剂和纸浆和造纸工业中的应用。

Description

新型酶
发明领域
本发明涉及新型纤维素酶、特别是新型内切葡聚糖酶包括内切葡聚糖酶融合蛋白，含有这些内切葡聚糖酶和融合蛋白的制品和组合物，用于它们的制备的表达载体、宿主细胞和方法，以及纤维素酶、制品和组合物在纺织、洗涤剂和纸浆和造纸工业中的应用。
发明背景
纤维素是高等植物的主要结构成分，在天然条件下只在棉花纤维中以几乎纯态存在。它为植物细胞提供了高的抗拉强度，帮助它们抵抗机械应力和渗透压。纤维素是葡萄糖残基通过β-1，4键连接的线性多糖。在自然条件下，纤维素通常与木质素和半纤维素、例如木聚糖和葡甘露聚糖连接在一起。纤维素水解酶水解纤维素，由各种各样的细菌和真菌产生。纤维素酶是工业上重要的酶，目前每年的市值是大约1亿9千万美元。在纺织工业中，纤维素酶被用于粗斜棉布的整理，用于在生物石洗工艺中在粗斜布上产生流行的石洗外观，它们也被用于例如在棉布服的表面清除绒毛和防止起球。在洗涤剂工业中，纤维素酶被用于使颜色发亮并防止衣物变灰和起球。纤维素酶也被用于食品工业和动物饲料制造中，并且它们在纸浆和造纸工业中具有巨大的潜力，例如用于脱墨以从纤维表面释放墨水，以及用于改进纸浆的排水。纤维素酶的广泛的工业用途产生了对含有不同的纤维素酶成分并能在不同的pH和温度范围内发挥最适功能的商业化的纤维素酶产品的需求。
纤维素酶的实际应用受到了已知的纤维素酶组合物的特性的阻碍，它们通常是具有各种不同活性和底物特异性的酶的混合物。因此，已经进行了努力以获得只具有所需活性的纤维素酶。每种纤维素酶的独特性质使得某些酶比其它的酶更适合于某种目的。尽管酶可以有许多方式的不同，但最重要的不同之一是最适pH。中性纤维素酶在6-8的pH范围内、碱性纤维素酶在7.5-10的pH范围内最具活性，而最适pH在pH4.5-5.5的酸性纤维素酶在较高的pH值下显示出非常低的活性水平。中性和酸性纤维素酶在纺织工业中特别有用。在织物处理中，纤维素酶攻击形成棉纤维的纤维素分子的链，从而影响织物的特性。
在纺织工业中，近年来“石洗”外观或磨损外观已经成为粗斜棉布制造商的兴趣所在。传统的使用浮石的石洗降低了织物的强度并增加了洗涤设备的负担。趋势已经朝向酶法粗斜棉布整理工艺，纤维素酶已经代替了浮石或正与浮石一起用于赋予织物所需的“破旧”外观。可控的酶法处理使得对衣物和机器的损伤降低了，并消除了对石头处理的需要。
此外，纺织工业在生物整理工艺中使用纤维素酶，即产生对去起球的永久改善和改善的起球的抗性，通过减少细毛使表面结构光洁，改善织物的手感，例如柔软性、光滑性和更丝般的感觉，改善织物的悬垂性和颜色更亮，以及改善吸水性。
在粗斜棉布处理中使用的纤维素酶通常被分为两个主要的类别：酸性和中性纤维素酶。酸性纤维素酶一般在pH 4.0-5.5下起作用，而中性纤维素酶在pH 6-8下起作用。在生物石洗中使用的酸性纤维素酶主要来自里氏木霉(Trichoderma reesei)(里氏木霉(Hypocrea jecorina)的有性形式)，中性纤维素酶来自各种不同的真菌，包括Melanocarpus属、腐质霉属(Humicola)、毁丝霉属(Myceliophthora)、镰刀霉属(Fusarium)、枝顶孢属(Acremonium)和金孢属(Chrysosporium)(Haakana等2004)。里氏木霉的酶包括例如来自糖苷家族5(内切葡聚糖酶II，EGII)、家族7(纤维二糖水解酶I，CBHI)和家族12(内切葡聚糖酶III，EGIII；Ward等1993)的纤维素酶，而中性纤维素酶，最通常为内切葡聚糖酶，来自家族45和家族7(Henrissat，1991；Henrissat和Bairoch，1993，1996)。
纤维素酶含有表达纤维素酶活性的催化结构域/核心(CD)。除了催化结构域之外，纤维素酶分子可以含有一个或多个纤维素酶结合结构域(CBD)，也被称为碳水化合物结合结构域/模块(CBD/CBM)，它们可以位于催化结构域的N-末端或C-末端。CBD具有碳水化合物结合活性，它们介导纤维素酶与结晶纤维素的结合，但是对酶对可溶性底物的纤维素酶水解活性只有很少的或没有影响。这两个结构域一般通过柔性和高度糖基化的接头区域相连。
主要攻击纤维表面的纤维素酶在用靛蓝染料染色的粗斜棉布的石洗中特别有用，因为染料位于纤维的表面上。在用于处理棉织物时，酸性纤维素酶一般比中性纤维素酶需要的洗涤时间短。酸性纤维素酶在生物整理(去起球)还有粗斜棉布的处理(生物石洗)中特别有用。
与本发明相关的内切葡聚糖酶(EG)是指被分类为E.C.3.2.1.4的酶，并且是纤维素生物转化为葡萄糖所通常需要的三种类型的纤维素酶中的一种。内切葡聚糖酶切开内部的β-1，4-糖苷键，而纤维二糖水解酶从纤维素聚合物链的末端切下二糖纤维二糖，β-1，4-葡萄糖苷酶将纤维二糖和其它短的纤维寡糖水解成葡萄糖。有些天然存在的内切葡聚糖酶具有纤维素结合结构域(CBD)，而其他则没有。
内切葡聚糖酶也广泛用于纺织、洗涤剂、纸浆和造纸工业中。例如，cel45家族的内切葡聚糖酶(EGs fam 45)被描述在例如美国专利No.6,001,639中，其中描述了具有内切葡聚糖酶活性并具有两个保守的氨基酸序列的酶。一般性讨论了在纺织、洗涤剂、纸浆和造纸应用中的用途，并提到了对木质纤维素材料的处理。WO 2004/053039涉及内切葡聚糖酶的洗涤剂应用。美国专利No.5,958,082公开了内切葡聚糖酶、特别是来自太瑞斯梭孢壳霉(Thielavia terrestris)的内切葡聚糖酶在纺织应用中为斜纹牛仔裤提供了石洗或磨损外观的应用。EP0495258涉及含有腐质霉(Humicola)纤维素酶的洗涤剂组合物。美国专利No.5,948,672描述了含有内切葡聚糖酶、特别是来自腐质霉的内切葡聚糖酶的纤维素酶制品，及其在纺织和纸浆应用中的用途。
EG和富含EG的组合物和浓缩物也可以商购。
但是，对于改进的纤维素酶，包括在织物处理和其它传统上使用纤维素酶的领域中更加有效的内切葡聚糖酶，存在着持续的需求。特别是对于改进工艺经济学的更加有效的纤维素酶，存在着持续的需求。
本发明的目的在于满足这样的需求。
发明简述
本发明的目的是提供具有改进的水解性质的新型内切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶融合蛋白，用于纺织工业、特别是在棉布整理工艺例如去起球和石洗粗斜棉布中，并用于洗涤剂组合物以及其它领域中。本发明的新型内切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶融合蛋白的优点是在酸性和中性pH值下具有活性，它们在纺织品生物整理和生物石洗应用以及在洗涤剂应用中具有高度改良的性能。当用于处理含有纤维素的纺织品材料时，新型内切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶融合蛋白为纺织品提供了光滑的感觉、改进的外观和柔软性以及永久的去起球。由于本发明的内切葡聚糖酶的改进的效能，使用这些酶明显更经济。在运销和酶制品的储存方面也获得了其它的优势，因为需要的酶制品的量较小。此外，本发明的新型内切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶融合蛋白因为是酸性的，作用更快，提供了时间和成本上有效的处理过程，节约了设备以及处理设施。
本发明的另一个目的是提供编码本发明的新型内切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶融合蛋白的多核苷酸。
本发明的还一个目的是提供含有这样的多核苷酸的新型表达质粒或载体，用于生产本发明的新型内切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶融合蛋白，以及用所述表达质粒转化的新型宿主。
本发明的还一个目的是提供酶制品，其含有一种或多种具有改进的水解性质的新型内切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶融合蛋白。
本发明的还一个目的是提供使用酶制品和内切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶融合蛋白用于纺织品整理、特别是用于粗斜棉布的生物整理和生物石洗的方法。
本发明的还一个目的是提供将本发明的酶制品用于洗涤剂组合物的手段。
本发明涉及含有具有纤维素分解活性的片段的内切葡聚糖酶多肽，该多肽选自：
a)含有与SEQ ID NO：2具有至少78％的序列同一性的氨基酸序列或与SEQ ID NO：4具有至少68％的序列同一性的氨基酸序列的多肽；
b)含有具有纤维素分解活性的片段的a)的变体；以及
c)具有纤维素分解活性的a)或b)的片段。
本发明还涉及内切葡聚糖酶融合蛋白，其含有具有与SEQ IDNO：2具有至少78％的序列同一性的氨基酸序列的多肽的纤维素分解活性片段，并连接至异源的碳水化合物结合结构域(CBD)。
本发明还涉及内切葡聚糖酶融合蛋白，其含有的氨基酸序列来自含有与SEQ ID NO：4具有至少68％的序列同一性的氨基酸序列的多肽，并连接至碳水化合物结合结构域。融合蛋白还可以含有接头区域。
本发明还涉及编码上面定义的内切葡聚糖酶多肽或融合蛋白的分离的多核苷酸。特别是，本发明涉及选自下列的多肽：
a)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：38的核苷酸序列；
b)a)的互补链；
c)含有至少20个核苷酸的a)或b)的片段；以及
d)作为遗传密码的结果与a)、b)或c)中定义的序列中的任何一个简并的序列。
本发明还涉及了含有上面定义的多核苷酸序列的表达载体。
本发明还涉及了用本发明的载体转化的新型宿主，特别是能够高水平表达本发明的内切葡聚糖酶或内切葡聚糖酶融合蛋白的宿主。
本发明还涉及酶制品，其含有一种或多种本发明的内切葡聚糖酶或内切葡聚糖酶融合蛋白
本发明还涉及使用本发明的酶制品用于纺织品生物整理、特别是去起球的方法。
本发明还涉及使用本发明的酶制品用于纺织品的整理、特别是粗斜棉布的生物石洗的方法。
本发明还涉及在洗涤剂组合物中本发明的酶制品的应用。
本发明还涉及登记号为DSM 17324、DSM 17323、DSM 18813、DSM 18814、DSM 18815、DSM 18816或DSM 18817的大肠埃希氏杆菌(Escherichia coli)菌株。
附图简述
图1显示了用于转化里氏木霉原生质体生产本发明的嗜热枝顶孢霉(Acremonium thermophilum)纤维素酶的表达盒的示意图。重组基因在里氏木霉的cbhl/cel7A启动子(cbhl prom)的控制之下，转录终止通过添加里氏木霉的cbhl终止子(cbhl term)来保证。包括amdS基因(amdS)用于筛选转化体。
图2显示了通过使用CMC作为底物在50℃进行10分钟反应，从培养上清液测定的异源产生的A.thermophilum EG_40和EG_40_样纤维素酶的pH依赖性(A)。EG_40和EG_40_样纤维素酶的最适温度在pH5.5和5被分别测定。使用CMC作为底物的反应进行60分钟。加入BSA(100μg/ml)作为稳定剂(B)。
图3显示了通过测量颜色评估的EG_40纤维素酶在不同温度下的生物石洗中的性能。
图4显示了EGII富集和EG_40浓缩物的混合物与现有工艺中的EGII富集浓缩物的生物石洗效果的比较。
图5显示了一系列显示本发明的内切葡聚糖酶的去起球效果的照片。
发明详述
本发明是基于寻找用于纺织工业的进一步改进的纤维素酶的工作。令人吃惊地发现了从枝顶孢霉种属出发，可以分离到新型内切葡聚糖酶，并且可以产生重组酶，其中内切葡聚糖酶不仅具有可接受的温度图谱，而且显示出了未预料到的有利的去起球性能，其效率至少为商业化的含有EG的制品的4倍。此外，新型内切葡聚糖酶与现有技术的纤维素酶相比，显示出了优异的生物石洗性质。
因此，本发明涉及含有具有纤维素分解活性的片段的内切葡聚糖酶多肽，该多肽选自：
a)含有与SEQ ID NO：2具有至少78％的序列同一性的氨基酸序列或与SEQ ID NO：4具有至少68％的序列同一性的氨基酸序列的多肽；
b)含有具有纤维素分解活性的片段的a)的变体；以及
c)具有纤维素分解活性的a)或b)的片段。
在本发明的一个优选实施方案中，所述氨基酸与SEQ ID NO：2具有至少80％、优选85％、更优选90％、更加优选95％、最优选98％的序列同一性。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述氨基酸与SEQ ID NO：4具有至少70％、优选75％、更优选80％、更加优选85％、更加优选90％、最优选95％的序列同一性。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述氨基酸具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述片段具有SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：19的氨基酸序列。
在本发明的另一个优选实施方案中，多肽可以从枝顶孢霉(Acremonium sp.)获得、优选从嗜热枝顶孢霉获得，或来源于它们。
本发明的内切葡聚糖酶多肽优选为重组多肽。重组多肽可以在异源宿主或遗传修饰的同源宿主中产生。
根据本发明的一个具体实施方案，内切葡聚糖酶多肽是与SEQ IDNO：2具有至少78％序列同一性的多肽的修饰物，其中碳水化合物结合结构域CBD已经被异源的CBD取代。此外接头区域和/或信号序列可以被异源的接头区域和/或信号序列取代。这些修饰的内切葡聚糖酶在本文中也被包含在术语内切葡聚糖酶融合蛋白中。在本发明的一个优选实施方案中，修饰的/融合的内切葡聚糖酶具有SEQ ID NO：39、SEQID NO：40或SEQ ID NO：41。
在本发明的一个具体实施方案中，融合蛋白是内切葡聚糖酶融合蛋白，含有与SEQ ID NO：2具有至少78％的序列同一性的氨基酸序列的多肽的纤维素分解活性片段，以及异源的碳水化合物结合结构域(CBD)，其中异源CBD和任选的接头区域源自于里氏木霉的CBHI、嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)CBHI或枝顶孢霉的木聚糖酶。在本文中使用的“异源”是指内切葡聚糖酶融合蛋白的CBD和可能的接头部分是从另一个生物体获得的，并通过基因修饰连接到内切葡聚糖酶的纤维素分解活性核心上。具体来说，融合蛋白含有与SEQ IDNO：39具有至少71％序列同一性、与SEQ ID NO：40具有至少69％序列同一性的氨基酸序列、或与SEQ ID NO：41具有至少69％序列同一性的氨基酸序列。具体来说，融合蛋白含有与SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40或SEQ ID NO：41具有75、80、85、90、95或98％序列同一性的氨基酸序列。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述融合蛋白含有SEQ IDNO：4的氨基酸序列，该序列连接于源自含有具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列的多肽的CBD。
在本发明的另一个优选实施方案中，所述内切葡聚糖酶融合蛋白具有SEQ ID NO：21。本发明还涉及编码上面定义的内切葡聚糖酶多肽的分离的多核苷酸。
具体来说，在本发明的一个实施方案中，分离的多核苷酸具有选自下列的核苷酸序列：
a)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：38的核苷酸序列；
b)a)的互补链；
c)含有至少20个核苷酸的a)或b)的片段；以及
d)作为遗传密码的结果与在a)、b)或c)中定义的序列中的任何一个简并的序列。
本发明还涉及含有上面定义的多核苷酸序列的表达载体。
本发明还涉及用本发明的载体转化的新型宿主，特别是能够高水平表达本发明的内切葡聚糖酶或内切葡聚糖酶融合蛋白的宿主。根据本发明的优选实施方案，酶从被保藏为CBS 116240的嗜热枝顶孢霉菌株ALKO4245获得。
本发明还涉及酶制品，其含有一种或多种本发明的内切葡聚糖酶或内切葡聚糖酶融合蛋白。
本发明还涉及使用本发明的酶制品用于纺织品生物整理、特别是去起球的方法。
本发明还涉及使用本发明的酶制品用于纺织品整理、特别是粗斜棉布的生物石洗的方法。
本发明还涉及本发明的酶制品在洗涤剂组合物中的应用。
本发明的内切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶融合蛋白制品在纺织和洗涤剂工业中特别有用。它们尤其适用于纺织工业中织物或衣物整理，例如去起球、去细毛、清晰颜色、降低粗糙度、以及产生不同的精整(例如“桃皮”、“破旧”、“砂洗”或“古旧的外观“效果)，以及用于纱线的生物整理，例如降低毛刺性和增加光滑性。其它的应用包括用于洗涤剂组合物中，通过抗起球、抗变灰、清晰颜色和软化来改善织物护理性质，以及改善纺织品清洁效果，例如除垢。其它的应用还包括用于粗斜棉布的生物石洗。
在棉织物中，细毛(微纤维)从表面出现，它们在加工过程中可能缠结，从而形成小球。酶减弱了微纤维在表面的产生，然后用处理的剪切力除去它们(Nierstrasz和Warmoeskerken，2003)。在本文中使用的表述“生物整理”(也被称为去起球、去细毛或生物抛光)是指在纤维素纤维的可控水解中使用酶来修饰织物或纱线的表面，方式是永久地防止起球、改善织物的手感像柔软度和光滑性、通过减少细毛来清洁表面结构，这导致颜色清晰；改善织物的悬垂性，改善吸水性，这也可以改善染色性。纤维素酶被用于处理或精整含有纤维素的纺织材料，例如棉、亚麻、苎麻、黄麻、粘胶、莫代尔(modal)、lyocell和凯普(cupro)，或其混合物。
在本文中使用的表述织物或衣物的“生物石洗”是指使用酶代替浮石或与浮石一起用于织物或衣物、特别是粗斜棉布的处理。
在本文中使用的表述“返染”是指被释放的染料重新沉积在织物纤维的表面上的趋势。
在本文中使用的表述“洗涤剂”是指清洁剂，可以含有表面活性剂(阴离子、非离子、阳离子和两性的表面活性剂)、增洁剂以及其它任选的成分例如抗再沉积和污垢悬浮剂、任选的增亮剂、漂白剂、染料和色素和水解酶。洗涤剂的内含物的适当的列举在美国专利No.3,664,961中给出。
内切葡聚糖酶的生物活性是它的催化活性，和/或它与纤维素材料结合的能力。内切葡聚糖酶的纤维素分解活性是它的水解活性。
本文中使用的表述“枝顶孢霉”特别是指具有菌株CBS 116240特征的丝状真菌属。该菌株目前被分类为嗜热枝顶孢霉。
本文中使用的“多核苷酸”兼指RNA和DNA，它可以是单链的或双链的。多核苷酸也可以是含有至少20个核苷酸、例如至少25、30或40个核苷酸的所述多核苷酸的片段。根据本发明的一个实施方案，它的长度是至少100、200或300个核苷酸。此外，作为遗传密码的结果，多核苷酸可以与上面定义的序列中的任何一个是简并的。这意味着不同的密码子是相同氨基酸编码的密码。
新型多肽也可以是所述多肽的变体。“变体”可以是天然存在的多肽，例如同样的菌株、种或属中的等位基因变体，或者它也可以通过诱变产生。它可以含有氨基酸取代、删除或插入，但是它仍然以与上面定义的酶基本上相同的方式起作用，即它含有具有纤维素分解活性的片段。
表达载体是克隆的质粒或载体，在转化到所需的宿主中之后，能够表达编码本发明的内切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶融合蛋白的DNA。当使用真菌宿主时，所关注的基因优选被提供到真菌宿主中作为整合到真菌染色体中的克隆或表达介质的一部分，或允许所关注的基因整合到宿主染色体中、或作为自主复制的质粒被提供给真菌宿主。作为克隆介质或表达介质的一部分的序列在整合过程中也可以与所述DNA一起整合。此外，在真菌中，表达载体或其部分可以被靶向预定的基因座。
编码本发明的内切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶融合蛋白的DNA还优选被置于载体(整合有所关注的基因)提供的某些控制序列例如启动子序列的控制之下(即与其可操作地连接)。或者，控制序列可以是插入位点处的控制序列。
表达载体的表达控制序列随着载体是被设计成在原核还是在真核宿主中表达特定的基因而变化(例如，穿梭载体可以提供在细菌宿主中选择的基因)。表达控制序列可以含有转录调控元件例如启动子、增强子元件和转录终止序列，和/或翻译调控元件，例如翻译起始和终止位点。
多核苷酸分子，例如DNA，如果它含有的表达控制序列含有转录调控信息、并且这样的序列与编码多肽的核苷酸序列“可操作地连接”，那么它被说成是“能够表达”多肽。
可操作的连接是这样的连接，其中序列与调控序列连接，其方式使得将序列的表达置于调控序列的影响或控制之下。两个DNA序列(例如连接到蛋白编码序列5’-末端的启动子区序列)，如果启动子的功能导致了转录，就被称为是可操作地连接的。
本发明的载体还可以含有其它的可操作地连接的调控元件，例如增强子序列。
在优选实施方案中，构建了遗传稳定的转化体，由此通过用载体转化，将编码本发明的内切葡聚糖酶或内切葡聚糖酶融合蛋白的DNA整合到宿主染色体中，该载体中带有促进所述载体整合到染色体中的序列。
将编码本发明的内切葡聚糖酶或内切葡聚糖酶融合蛋白的DNA稳定整合到其染色体中的细胞，通过还导入一个或多个同源的或异源的标记物来筛选，该标记物允许对在染色体中含有表达载体的宿主细胞进行选择，例如标记物可以提供杀生物剂抗性例如对抗生素或重金属如铜的抗性，或者标记物互补了宿主染色体中的营养缺陷突变，等等。可选择的标记基因可以与要表达的DNA基因序列直接连接，或者通过共转化导入到同样的细胞中。
一旦含有本发明的载体或DNA序列的构建体被制备好用于表达，则可以通过各种不同的适合的手段中的任何一种，包括本领域已知的转化，将DNA构建体导入适合的宿主细胞中。在导入了载体之后，受体细胞在选择培养基中生长，该培养基选择转化细胞的生长。
适合的表达和生产宿主系统是例如为真菌宿主木霉属(EP 244234)开发的生产系统，或曲霉生产系统、例如米曲霉(A.oryzae)或黑曲霉(A.niger)(WO 9708325和WO 9533386，美国专利No.5,843,745，，美国专利No.5,770,418)，或为镰刀菌例如尖镰孢菌(F.oxysporum)开发的生产系统(Malardier等，1989)。适合的为细菌开发的生产系统是为芽孢杆菌例如枯草杆菌(B.subtilis)或为大肠杆菌或为放线菌链霉菌属(actinomycete Streptomyces)开发的生产系统。适合的为酵母开发的生产系统是为酵母菌属、裂殖酵母属或巴斯德毕赤氏酵母开发的系统。在某些其它的微生物或哺乳动物细胞或植物中的生产系统也是可能的。
被克隆的基因序列的表达导致了所需蛋白的生产或该蛋白的片段的生产。这种表达在被转化的细胞中可以以连续的方式发生，或以被控制的方式发生。
片段被理解为多肽或核酸分子的一部分，其长度足够具有所需的酶学性质或为所需的内切葡聚糖酶或内切葡聚糖酶融合蛋白或其生物活性片段编码。术语“简并”意味着核苷酸序列可以变化，只要编码的氨基酸序列是相同的就行。这样是因为编码单一氨基酸的有不止一个核苷酸三联体。
在本文中使用的术语序列“同一性”是指两个氨基酸序列从相应的基因编码的第一个氨基酸到最后一个氨基酸在彼此之间进行比较时的整体同一性。全长序列的同一性通过使用EMBOSS(欧洲分子生物学开放软件套European Molecular Biology Open Software Suite：Rice等，2000)程序包(3.0.0版)的Needleman-Wunsch整体比对程序进行测定，使用下面的参数：EMBLOSUM62，空隙罚分10.0，扩展罚分0.5。该算法在Needleman和Wunsch(1970)中描述。本领域的技术人员将会认识到这样的事实：在使用Needleman-Wunsch算法时，只有在对序列的相应结构域进行比对时，结果才具有可比性。因此不能进行例如包括CBD或信号序列的纤维素酶序列与缺乏这些元件的序列的比较。
用于水解纤维素原料的纤维素水解酶可以从枝顶孢属的菌种、优选为嗜热支顶孢获得或源自于它们。“可以从其获得”或“源自”意味着它们可以从所述物种获得，但是不排除从其它来源获得它们的可能性。换句话说，它们可以源自于任何生物体，包括植物。优选它们源自微生物，例如细菌或真菌。细菌可以来自例如芽孢杆菌(Bacillus)、固氮螺菌(Azospirillum)和链霉菌属。更优选酶源自真菌(包括丝状真菌和酵母)，例如来自选自下列的属：嗜热子囊菌属(Thermoascus)、枝顶孢属(Acremonium)、毛壳属(Chaetomium)、无毛毛壳属(Achaetomium)、曲霉属(Aspergillus)、葡萄孢属(Botrytis)、金孢属(Chrysosporium)、金钱菌属(Collybia)、孔菌属(Fomes)、镰刀霉属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、肉座菌属(Hypocrea)、香菇属(Lentinus)、Melanocarpus、毁丝霉属(Myceliophthora)、Myriococcum、脉孢菌属(Neurospora)、青霉属(Penicillium)、Phanerochaete、海生菌属(Phlebia)、侧耳属(Pleurotus)、柄抱壳菌(Podospora)、多孔菌属(Polyporus)、丝核菌属(Rhizoctonia)、柱顶孢属(Scytalidium)、密孔菌属(Pycnoporus)、栓菌属(Trametes)和木霉属(Trichoderma)。
本文中使用的表述“酶制品”、“纤维素酶制品”和“内切葡聚糖酶制品”是指任何含有至少一种本发明的内切葡聚糖酶或内切葡聚糖酶融合蛋白的酶制品。因此，这样的酶制品可以是含有一种或多种内切葡聚糖酶或内切葡聚糖酶融合蛋白、或一种或多种内切葡聚糖酶或内切葡聚糖酶融合蛋白和其它酶的用过的培养基或滤液，分离的内切葡聚糖酶或内切葡聚糖酶融合蛋白、或一种或多种内切葡聚糖酶或内切葡聚糖酶融合蛋白的混合物、或一种或多种内切葡聚糖酶或内切葡聚糖酶融合蛋白与一种或多种其它酶的混合物。除了内切葡聚糖酶活性之外，这样的制品还可以含有添加剂，例如稳定剂、缓冲剂、防腐剂、表面活性剂和/或培养基成分。优选的添加剂是对于打算使用酶制品的应用来说通常用于酶制品中的那些添加剂。酶制品可以采用液体、粉末或颗粒的形式。
这里的“用过的培养基”是指含有产生的酶的宿主的培养基。优选将宿主细胞在生产之后与所述培养基分离。
酶制品可以含有一种或多种本发明的内切葡聚糖酶或内切葡聚糖酶融合蛋白，或同时含有其它的纤维素酶与一种或多种本发明的内切葡聚糖酶或内切葡聚糖酶融合蛋白。例如，具有不同性质的内切葡聚糖酶可以被混合，使酶制品更加适用于不同的条件。
为了获得本发明的酶制品，将性质合适的宿主(即，宿主能够表达经济上可行的量的本发明的内切葡聚糖酶或内切葡聚糖酶融合蛋白)在适当的条件下进行培养，所需的酶从宿主分泌到培养基中，从所述培养基中通过本技术领域已知的方法回收酶制品。
除了内切葡聚糖酶或内切葡聚糖酶融合蛋白之外，酶制品还可以含有一种或多种其它酶，它们可以是例如淀粉酶、脂酶、蛋白酶、果胶酶和/或氧化酶，例如漆酶和过氧化物酶。或者，在使用本发明的内切葡聚糖酶或内切葡聚糖酶融合蛋白进行处理之前、之中或之后，可以进行另一种酶处理。酶处理可以包括，例如，一种或多种淀粉酶处理、一种或多种纤维素酶处理和/或一种或多种过氧化物酶和/或漆酶处理。哪些其它的酶被包含在酶制品中或用于酶处理，取决于具体的应用。
酶制品可以是有或没有天然的或转化的宿主细胞的培养基，或者通过使用本技术领域中众所周知的方法从该培养基中回收。但是，因为本发明的内切葡聚糖酶或内切葡聚糖酶融合蛋白被分泌到培养基中并在纤维素水解液的环境条件下显示出活性，因此本发明的优势在于本发明的酶制品可以直接从培养基中使用而不用进一步纯化。如果需要，这样的制品可以被冷冻干燥，或者酶活性以其他方式被浓缩和/或稳定化以用于储存。本发明的酶制品可以被非常经济地提供和使用，因为(1)酶可以以粗品形式使用；从培养基中分离特定的酶不是必需的，以及(2)因为酶被分泌到培养基中，只需要回收培养基来获得所需的酶制品；不需要从宿主中提取酶。优选用于这种生产的宿主是木霉，特别是里氏木霉。
本发明的酶制品可以被提供为液体或固体，例如，干粉或颗粒或液体的形式、特别是无尘颗粒，或稳定化的液体，或者酶制品可以用其他方式浓缩或稳定化以储存或使用。设想含有本发明的一种或多种纤维素酶的酶制品可以被进一步富集，或使具体的酶活性部分或完全缺失，以便满足在各种不同应用例如在纺织工业中的特定应用的需要。在特定的工业应用例如生物整理和生物石洗中，选择被宿主特别是真菌宿主分泌的酶活性的混合物可能是有优势的。
可以对本发明的酶制品进行调整，以满足在纺织、洗涤剂或纸浆和造纸工业中各种不同应用的具体要求的需要。
混合物可以用其它不必都是由同样的宿主产生的大分子(例如，其它的酶，例如内切葡聚糖酶、淀粉酶、脂酶、蛋白酶、果胶酶和/或氧化酶，如漆酶和过氧化物酶)或可以增强所需的酶制品的性能、稳定性或缓冲能力的化学物质来制备。无尘颗粒可以被包被。液体酶制品可以按照已建立的方法，通过加入多元醇例如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸、或氯化钠来稳定。
本发明的酶的受保护形式可以按照EP 238,216中的描述来制备。
本发明的酶制品可以含有表面活性剂，它可以是阴离子、非离子、阳离子、两性的或这些类型的混合物，特别是当用作洗涤剂组合物时。有用的洗涤剂组合物在例如WO 94/07998、美国专利No.5,443,750和美国专利No.3,664,961中有描述。
如果需要，所需的酶可以分离，并按照常规的条件进一步纯化，例如抽提、沉淀、层析、亲和层析、电泳等。在本文中，分离的肽可以仅仅是指细胞和细胞碎片已经从含有多肽的培养基中被除去。通过例如在用过的培养基中加入阴离子和/或阳离子聚合物以增加细胞、细胞碎片和一些具有不想要的负面活性的酶的沉淀，来方便地分离多肽。然后使用无机过滤剂和滤器将培养基过滤以除去形成的沉淀。然后使用半透膜进一步处理滤液以除去过量的盐、糖和代谢产物。
本发明的酶制品在纺织工业、优选是生物整理和生物石洗中或在洗涤剂工业中特别有用。其它适用的领域是纸浆和造纸工业中。
“生物整理”是指在纤维素纤维的可控水解中使用酶来修饰织物或纱线的表面，从而永久地防止起球、改善织物的手感例如柔软度和光滑性、通过减少细毛来清洁表面结构导致颜色的澄净、改善织物的悬垂性、改善吸水性并也可以改善染色性。
酶法去起球可以在织物湿法加工过程中的任何阶段进行，优选在脱浆和漂白后进行。酶法处理需要具有足够剪切力和混合的设备例如喷气绞车或洗衣机(Nierstrasz V.A.和Warmoeskerken M.M.C.G.，2003)。
生物整理一般在大约pH 4.0-6.0下进行。反应的温度范围可以从大约30℃到70℃，优选为50-60℃浴比(单位重量织物的液体体积的比率)可以在从大约3∶1到20∶1的范围内，优选为5∶1到10∶1。孵育时间一般为15到90分钟，优选为30到60分钟。酶剂量主要依赖于织物的类型、机器、加工条件(pH、温度、浴比、处理时间、粗斜棉布载量、加工规模)以及酶制品的类型等。本领域的技术人员能够确定适合的剂量和条件。
本发明的内切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶融合蛋白特别适用于纺织工业中用于织物或衣物的生物整理，例如去起球、去细毛、澄净颜色、降低粗糙度、以及产生不同的精整(例如“桃皮”、“破旧”、“砂洗”或“古旧外观“效果)，以及用于纱线的生物整理(例如降低毛刺度和增加光滑性)。本发明的内切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶融合蛋白可以在酸性和中性条件下用于生物整理。
本发明的内切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶融合蛋白可用于洗涤剂组合物中，通过抗起球、抗变灰、澄净颜色和软化来改善织物护理性质，以及改善纺织品清洁效果，例如除垢。
石洗有三个步骤：脱浆、磨蚀和后处理。第一个步骤，脱浆工艺，一般是牛仔裤的第一个湿法处，是指除去通常施加在经纱上用于在编织过程中防止损坏的淀粉或其它上浆剂。α-淀粉酶被用于除去基于淀粉的浆料以改进和均匀湿法加工。脱浆后，牛仔裤用水漂洗或继续直接进行磨蚀步骤。
第二个步骤磨蚀，可以使用酶或浮石或二者来进行。在所有情况下都需要机械作用来除去染料，处理通常在洗衣机例如滚筒洗衣机中进行。术语“磨蚀的”在本文中是指粗斜棉布织物在被纤维素酶或石头或二者处理时的外观。作为染料被不均匀除去的结果，在染色区域和染料已经被除去的区域之间具有反差。同义的表述是“石洗外观”或“破旧外观”。在酶法石洗或生物石洗中，使用浮石进行磨蚀被完全或部分取消了，并加入纤维素酶以促进靛蓝染料从纤维表面的磨蚀。纤维素酶处理可以使用中性或酸性纤维素酶或二者进行。
磨蚀后通常进行第三个步骤，后处理，包括清洗和漂洗步骤，在此期间可以使用洗涤剂、任选的增亮剂或柔顺剂。在酶法处理后，反应必须终止，以便防止被处理的材料的损坏，可以通过例如温度和/或pH失活，后者包含彻底漂洗和/或洗涤剂洗掉。这确保了纤维的机械强度不被酶的继续存在所进一步损害。
在本发明中“粗斜棉布”是指粗斜棉布织物，通常为粗斜棉布衣物，特别是牛仔裤。粗斜棉布有利的是靛蓝染色的粗斜棉布。粗斜棉布也可以用靛蓝或靛蓝的衍生物处理，或者粗斜棉布用靛蓝以及一些其它的染料一起染色，例如具有硫化染料打底的靛蓝染色的粗斜棉布。
用纤维素酶处理可以完全取代用浮石的处理(例如，1kg商业化酶对100kg石头)。但是，当需要产生重度磨蚀的精整的时候，纤维素酶处理可以与浮石处理相结合。产生细的突出的毛样表层的桃皮效果也是通过用浮石结合中性纤维素酶清洗来达到。本发明的纤维素酶特别适用于在生物石洗中提供磨蚀的外观并最小化返染。
生物石洗一般在大约pH 3.0-8.0下进行，优选pH 4.0-6.0。反应的温度范围可以从大约30℃到70℃，优选为50-60℃。浴比(单位重量织物的液体体积的比率)可以在大约3∶1到20∶1的范围内，优选为5∶1到10∶1。处理时间可以在15分钟到90分钟的范围内，优选为30分钟到60分钟。应该强调的是酶剂量主要依赖于织物的类型、机器、加工条件(pH、温度、浴比、处理时间、粗斜棉布的载量、加工规模)以及酶制品的类型等。如果需要，浮石可以与内切葡聚糖酶或内切葡聚糖酶融合蛋白组合使用。则需要的酶剂量将显著减少。本领域技术人员能够确定适合的剂量和条件。
用本发明的酶制品处理的纺织材料可以由天然的含有纤维素的纤维或人造的含有纤维素的纤维或其混合物制成。天然纤维素的例子是棉、亚麻、大麻、黄麻和苎麻。人造纤维素的例子是粘胶、醋酸纤维素、三乙酸纤维素、人造丝、凯普和lyocell。上述的纤维素也可以作为合成纤维例如聚酯、聚酰胺或丙烯酸纤维的混合物使用。纺织材料可以纱，或通过任何其它的方法编织或纺织或形成。
本发明的内切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶融合蛋白除了特别适用于织物的处理之外，还可普遍用于任何需要纤维素酶活性的领域。
在纸浆和造纸工业中，纤维素酶可以用于例如具有中性或碱性pH的不同的再生纸和纸板的纤维的脱墨或修饰，以改善纤维的质量，或增加造纸中的排水。其它的例子包括在纺织品印染后除去印花浆增稠剂和过量的染料，以及处理动物饲料。例如，如果所需的应用是改进机械纸浆的强度，那么本发明的酶制品可以提供一种或多种这些蛋白以增强或促进纤维素纤维结合在一起的能力。通过同样的方式，在打纸浆的应用中，本发明的内切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶融合蛋白制品可以提供增强或促进这种溶胀水平的一种或多种这些蛋白。
本发明的内切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶融合蛋白在用于纺织工业特别是在生物整理例如去起球和在生物石洗中提供了未曾预料到的优点。本发明的内切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶融合蛋白被认为比现有的纤维素酶更有效。在生物整理中可以使用至少低四倍的剂量。换句话说，使用本发明的内切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶融合蛋白获得了更高的性能。在去起球中，本发明的内切葡聚糖酶和内切葡聚糖酶融合蛋白更加有效并产生了稳定的光滑表面。
本发明在下面的实施例中将被更详细地描述，它不能被解释为缩小了本发明的范围，而仅仅是为了阐述本发明的应用。
实施例1、嗜热枝顶孢霉ALKO4245的培养
嗜热枝顶孢霉菌株ALKO4245在2升生物反应器中(BraunBiostat
Figure A20068004879200261
B，Braun，Melsungen，德国)生长在下列培养基中，单位g/l：Solka Floc纤维素40，玉米浸出粉15，制酒者用过的谷物5，燕麦木聚糖3，刺槐豆胶3，(NH4)2SO45和KH2PO45。pH范围为5.2±0.2(NH3/H2SO4)，通气1vvm，搅拌300-600rpm，用Struktol
Figure A20068004879200271
消泡控制，温度42℃。培养时间4天。培养后通过离心收集细胞和其它固体，回收上清液。
实施例2、从嗜热枝顶孢霉ALKO4245纯化内切葡聚糖酶
按照实施例1中的描述生长的嗜热枝顶孢霉ALKO4245的培养上清液在通过超滤浓缩后在70℃孵育24小时。纯的内切葡聚糖酶通过使用疏水相互作用和阳离子交换层析然后通过凝胶过滤进行连续的纯化来获得。在纯化过程中收集的级份的内切葡聚糖酶活性使用羧甲基纤维素(CMC)作为底物来测定(按照IUPAC，1987的方法)。
将浓缩的培养上清液加到HiPrep 16/10 Butyl FF疏水相互作用柱(GE Healthcare)中，该柱用含有1M(NH4)2SO4的pH 6.0的20mM磷酸钾缓冲液平衡。结合的蛋白用从上述的缓冲液到pH 6.0的5mM磷酸钾缓冲液的线性梯度进行洗脱。收集级份，按照上面的描述测定内切葡聚糖酶活性。洗脱的内切葡聚糖酶活性在120到15mS/cm的宽电导范围内。
将合并的级份加到用pH 4.5的8mM乙酸钠平衡的HiTrap SP XL阳离子交换柱(GE Healthcare)中。结合的蛋白用0到0.25M NaCl的平衡缓冲液的线性梯度洗脱。洗脱的含有内切葡聚糖酶活性的蛋白在3-7mS/cm的电导范围内。重复阳离子交换层析，通过冷冻干燥浓缩蛋白洗脱液。
将溶解的样品加到用含有0.15M NaCl的pH 6.0的20mM磷酸钠缓冲液平衡的Superdex 75HR10/30凝胶过滤柱(Pharmacia)中。从柱上洗脱的主要的蛋白级份具有13.3ml的保留体积。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳判断蛋白洗脱物是纯的，分子量估计为40kDa。纯化的蛋白被命名为嗜热枝顶孢霉EG_40或At EG_40(SEQ ID NO：2)，在50℃下的比活度被测定为450nkat/mg(按照IUPAC，1987，同上，中的方法，使用CMC作为底物)。
在不同温度下测定纯化的内切葡聚糖酶的热稳定性。反应在0.1mg/ml BSA存在下在pH 5.0进行60分钟，使用CMC作为底物。AtEG_40直到80℃都是稳定的。里氏木霉参比酶EGI(Cel7B)和EGII(Cel5A)分别在直到60℃和65℃保持它们100％的活性。
为了进行内部氨基酸测序，首先将纯化的嗜热枝顶孢霉ALKO4245 EG_40蛋白(SEQ ID NO：2)烷基化，并消化为胰蛋白酶的肽。产生的肽通过纳米液相层析(反相)被脱盐和部分分离。通过电喷雾电离结合串联质谱(ESI-MS/MS)，使用Q-TOFl(WatersMicromass
Figure A20068004879200281
)仪器对内部肽进行测序。这样获得的内部肽的序列列于表1中。
表1、从嗜热枝顶孢霉EG_40纤维素酶测定的内部肽序列
  肽   序列   SEQ ID NO：
  肽1   QSCSSFPAPLKPGCQWR   5
  肽2   YALTFNSGPVAGK   6
  肽3   VQCPSELTSR   7
  肽4   NQPVFSCSADWQR   8
  肽5   YWDCCKPSCGWPGK   9
  肽6   PTFT   10
实施例3、嗜热枝顶孢霉(ALKO4245)的cel45A和cel45B基因的克隆
在DNA(质粒、DAN片段)的分离和酶法处理、大肠杆菌的转化等中使用标准的分子生物学方法。使用的基本方法在标准的分子生物学手册中有描述，例如Sambrook，J.等，1989和Sambrook J.与Russell，D.W.，2001。
在Lambda DASH
Figure A20068004879200291
II载体(Stratagene，USA)中按照制造商的说明书构建嗜热枝顶孢霉ALKO4245的基因组文库。通过Raeder和Broda，1985中的方法分离染色体DNA，并用Sau3A部分消化。消化的DNA在琼脂糖凝胶上按大小分级，并分离选定大小(大约5-23kb)的片段，脱磷酸化，连接到BamHI消化的入载体臂中。连接混合物使用Gigapack III Gold包装提取物按照制造商的说明书(Stratagene，USA)进行包装。基因组文库的滴度是3.7x105pfu/ml，扩增的文库的滴度是4.2x108pfu/ml。
按照实施例2中的描述获得的纯化的嗜热枝顶孢霉的EG_40纤维素酶的内部肽序列与糖基水解酶家族45的纤维素酶享有同源性，例如太瑞斯梭孢壳霉的内切葡聚糖酶(GenBank登记号No.CQ827970)和Melanocarpus albomyces Cel45A的纤维素酶(GenBank登记号No.AJ515703)。为了扩增用于从基因组文库筛选嗜热枝顶孢霉EG_40编码基因(cel45A；SEQ ID NO：1)的探针，在表1(实施例2)中列出的肽序列的基础上设计了简并引物。通过与同源的M.albomycesCel45A的序列进行比较，推导出了蛋白序列中肽的次序以及引物相应的有义和反义性质。有义引物(TAYTGGGAYTGYTGYAARCC，SEQ IDNO：11)是基于肽5(SEQ ID NO：9)的1到6位氨基酸，反义引物(RTTRTCNGCRTTYTGRAACCA，SEQ ID NO：12)是基于同源的M.albomyces Cel45A蛋白的肽序列(WFQNADN；SEQ ID NO：13)。PCR反应混合物含有50mM Tris-HCI，pH 9.0、15mM(NH4)2SO4、0.1％Triton X-100、1.5mM MgCl2、0.1mM dNTP、每种引物0.5μg、1个单位Dynazyme EXT DNA聚合酶(Finnzymes，芬兰)，以及大约0.5μg枝顶孢霉基因组DNA。PCR反应的条件如下：起始变性95℃5分钟，然后进行30个循环的95℃1分钟、50-60℃退火1分钟、72℃延伸2分钟，最后在72℃延伸10分钟。延伸的产物在琼脂糖凝胶上检测。
从枝顶孢霉的PCR反应获得了两个PCR产物。从琼脂糖凝胶中分离了大约0.6kb(SEQ ID NO：14)和0.8kb(SEQ ID NO：15)的DNA片段，并克隆到pCR4-TOPO
Figure A20068004879200301
TA载体中(Invitrogen，USA)，分别产生了质粒pALK1710和pALK1711。克隆的PCR产物通过测序和对用几种限制性酶消化的枝顶孢霉基因组DNA进行Southern印迹杂交(如下所述)来表征。在严紧的清洗条件下使用两个片段获得的杂交图形表明可以从枝顶孢霉基因组文库中筛选两个推导的内切葡聚糖酶基因。这两个PCR产物的推导氨基酸序列与几种发表的糖基水解酶家族45的内切葡聚糖酶序列具有同源性(BLAST程序，国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)；Altschul等，1990)。
通过限制性酶消化从质粒pALK1710和pALK1711分离插入片段，并按照制造商的说明书用洋地黄毒苷进行了标记(Roche，德国)。来自扩增的枝顶孢霉基因组文库的大约1-2x105个噬斑转移到硝酸纤维素滤膜上，使用洋地黄毒苷标记的插入片段通过杂交进行筛选。杂交的温度是68℃，滤膜在室温用2xSSC-0.1％SDS清洗2x5分钟，然后在68℃用0.1xSSC-0.1％SDS清洗2x15分钟。获得了几个阳性噬斑，其中在这两个筛选中有5个强烈杂交的噬斑被纯化。分离噬菌体DNA，并通过Southern印迹杂交进行分析。与探针杂交的噬菌体DNA的限制性片段被亚克隆到pBluescript II KS+载体中(Stratagene，USA)，相关的部分被测序。在这两种情况下被亚克隆的噬菌体片段都含有所关注的全长基因。
表2概括了下述信息：用于筛选内切葡聚糖酶基因的探针、从中分离基因的噬菌体克隆、选定的含有带启动子和终止子区的全长基因的限制性片段、含有亚克隆的噬菌体片段的质粒的名称、以及带有这些质粒的大肠杆菌菌株在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH培养物保藏中心(DSM)的保藏号。保藏按照布达佩斯公约进行。
表2、用于克隆内切葡聚糖酶基因的探针、噬菌体克隆和选择的亚克隆、质粒名称以及相应的大肠杆菌菌株的保藏号
基因 基因组文库   用于筛选的探针   噬菌体克降   亚克隆的片段 质粒   大肠杆菌保藏号
At cel45A   嗜热枝顶孢霉ALKO4245 pALK1710 P24 5.5kb SmaI pALK1908 DSM17324
At cel45B   嗜热枝顶孢霉ALKO4245 pALK1711 P41 6.0kb XhoI pALK1904 DSM17323
被命名为At cel45A(SEQ ID NO：1)和At cel45B(SEQ ID NO：3)的两个基因的相关信息被概述在表3中，相应的推导蛋白序列At EG_40(SEQ ID NO：2)和AtEG_40_样(SEQ ID NO：4)的信息概述在表4中。纯化的枝顶孢霉EG_40内切葡聚糖酶的肽序列在相应的克隆基因的推导氨基酸序列中被发现，表明克隆了恰当的基因。
全长At cel45A基因(SEQ ID NO：1)长度为1076bp，被59bp和123bp的两个内含子所隔断，编码297个氨基酸的多肽At EG_40(SEQ ID NO：2)。推导的信号肽切割位点在Ala21之后，成熟蛋白的N-末端从Leu22开始，成熟蛋白(包括CBD)含有SEQ ID NO：2的22到297位氨基酸。EG_40纤维素酶具有C-末端共有序列碳水化合物结合结构域，含有全长多肽的Lys265到Leu297的氨基酸。预测的信号肽切割后的成熟蛋白的分子量和等电点分别为28625Da和4.79(使用在ExPASy服务器上的计算机pI/MW工具进行预测，Gasteiger等，2003)。蛋白具有两个推导的N-糖基化位点N-X-S/T(使用NetNGlyc1.0程序预测，Gupta等，2004)。
相应地，全长At cel45B基因(SEQ ID NO：3)长度为1013bp，被155bp和102bp的两个内含子所隔断，编码At EG_40_样251个氨基酸的多肽(SEQ ID NO：4)。推导的信号肽切割位点在Ala20之后，成熟蛋白的N-末端从Gln21开始，成熟的蛋白含有SEQ ID NO：4的21到251位氨基酸。EG_40_样纤维素酶不具有C-末端共有序列碳水化合物结合结构域。预测的信号肽切割后的成熟蛋白的分子量和等电点分别为23972Da和6.11(使用在ExPASy服务器上的计算机pI/MW工具进行预测，Gasteiger等，2003)。蛋白具有两个推导的N-糖基化位点N-X-S/T(使用NetNGlyc 1.0程序预测，Gupta等，2004)。
表3、从嗜热枝顶孢霉ALKO4245分离的内切葡聚糖酶基因概述
  内切葡聚糖酶基因   包含内含子的长度(bp)(a   编码区(bp)(b   内含子的数量   内含子的长度(bp)   SEQ IDNO：
  At cel45A   1076   891   2   59,123   1
  At cel45B   1013   753   2   155,102   3
(a包含终止密码子
(b不包含终止密码子
Figure A20068004879200331
嗜热枝顶孢霉EG_40和EG_40样纤维素酶的推导氨基酸序列与糖基水解酶家族45的纤维素酶相似(表5)。与EG_40/Cel45A和EG_40_样/Cel45B最接近的序列同源性被发现分别为太瑞斯梭孢壳霉(GenBank登记号No.CQ827970)和嗜热毁丝霉(GenBank登记号No.AR094305)的内切葡聚糖酶序列。使用EMBOSS程序包的Needle程序进行比对。
表5、嗜热枝顶孢霉EG_40和EG_40_样纤维素酶的推导蛋白序列与它们的负体的比较
  生物体、酶和登记号   同一性(％)
  嗜热枝顶孢霉EG_40太瑞斯梭孢壳霉EG45，CQ827970Melanocarpus albomyces Cel45，AJ515703链孢霉，假定的XM_324477灰色腐殖霉嗜热变种(humicola grisea varthermoidea)，EGL3，AB003107特异腐质霉(Humicola insolens)EG5，A23635嗜热毁丝霉家族45，AR094305嗜热枝顶孢霉EG_40_样 77.375.368.967.567.357.953.7
  嗜热枝顶孢霉EG_40_样嗜热毁丝霉家族45，AR094305假定的稻瘟病菌(magnaporthe grisea)70-15，XM_363402太瑞斯梭孢壳霉EG45，CQ827970嗜热枝顶孢霉EG_40Melanocarpus albomyces Cel45，AJ515703 66.961.956.853.752.8
实施例4、嗜热枝顶孢霉EG_40和EG_40_样纤维素酶在里氏木霉中的生产
为了生产重组的嗜热枝顶孢霉EG_40/Cel45A和EG_40_样/Cel45B纤维素酶，构建了表达质粒。通过PCR将这两个基因(cel45A或cel45B)包括它们自己的信号序列准确地与里氏木霉的cbhl(cel7A)启动子融合(表6)。按照Paloheimo等2003，同上，中的描述包括了cbhl启动子、cbhl终止子和amdS标记基因。通过限制性酶消化从载体骨架分离了线性表达盒(图1)，转化到里氏木霉A96中，使用乙酰胺作为唯一氮源筛选转化体。宿主菌株缺少四种主要的内源性纤维素酶：CBHI/Cel7A、CBHII/Cel6A、EGI/Cel7B和EGII/Cel5A。转化按照Penttila等，1987中的方法进行，使用了在Karhunen等，1993中描述的修改。将转化体在选择平板上通过单分生孢子进行纯化，然后将它们在土豆提取物琼脂上形成孢子。
表6、构建用于在里氏木霉中生产嗜热枝顶孢霉EG_40和EG_40_样纤维素酶的表达盒。表达盒的示意结构描述在图1中。
  内切葡聚糖酶   表达质粒   表达盒的大小(a   异源的终止子(b
  At EG_40   pALK1920   10.9kb NotI   156bp(HindIII)
  At EG_40_样   pALK 1921   8.6kb EcoRI   282bp(SspI)
(a用于里氏木霉转化的表达盒通过EcoRI或NotI消化从载体骨架上分离。
(b显示了包含在表达盒中的被克隆的基因的终止密码子之后的核苷酸的数量。用于构建表达盒的基因的3’-区域的限制性位点在括号中标明。
从摇瓶培养(50ml)的培养上清液中分析转化体的内切葡聚糖酶的生产。转化体在复合的纤维素诱导培养基中(Joutsjoki等，1993)生长7天，该培养基用5％KH2PO4缓冲到pH 5.5。重组蛋白的酶活性从测量培养上清液中，作为从羧甲基纤维素(2％CMC)在50℃和pH4.8的50mM柠檬酸缓冲液释放的还原糖来测量，基本上按照Bailey，M.J.和Nevalainen，K.M.H.，1981；Haakana，H.，等，2004中的描述进行。培养上清液中产生的重组蛋白也通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳来检测。EG_40特异性多克隆抗体是在兔子中产生的(芬兰赫尔辛基大学)。EG_40纤维素酶的表达使用抗EG_40抗体通过Western印迹分析来证实，使用了ProtoBlot Western blot AP系统(Promega)。选择的转化体的基因型通过Southern印迹使用表达盒作为探针来分析。
在pH范围为4.0-8.0的通用Mcllvaine′s缓冲液中，使用CMC作为底物测定异源生产的EG_40/Cel45A和EG_40_样/Cel45B纤维素酶的最适pH。如图2A中所示，EG_40/Cel45A纤维素酶的pH范围相对较宽(4.5-6.0)，最适为pH5.5。EG_40_样/Cel45B的最适pH被确定为pH5.0-5.5。EG_40/Cel45A和EG_40_样/Cel45B纤维素酶的酶活性的最适温度分别被测定为75-80℃和60℃(图2B)。异源产生的EG_40/Cel45A纤维素酶的热稳定性与纯化的蛋白相当。
将选择的转化体RF6118(At EG_40)和RF6071(At EG_40_样)在2升生物反应器中培养4天(28℃，pH 4.2)，以获得用于应用试验的材料(参见实施例8到13)。
实施例5、修饰的嗜热枝顶孢霉EG 40纤维素酶的构建和生产
按照实施例3中描述使用标准分子生物学方法。EG_40纤维素酶的信号序列被里氏木霉CHBI的信号序列所取代。预计使用宿主的内源信号序列将改善异源蛋白的生产。为了扩增At cel45A基因的5’片段，设计了两种寡核苷酸。有义引物(ATTAACCGCGGACTGCGCATCATGTATCGGAAGTTGGCCGTCATCTCGGCCTTCTTGGCCACAGCTCGTGCCCTCGACGGAAAGTCGAC，SEQID NO：22)含有里氏木霉cel7A的信号序列，反义引物(TCGACTGCACCACCATGGTC，SEQ ID NO：23)是At cel45A特异性的。全长基因通过将扩增的PCR产物作为SacII-NcoI片段与Atcel45A基因的3’-末端连接而重新构建。
然后，对EG 40/Cel45A的碳水化合物结合结构域进行修饰：制备了三个构建物，含有的EG_40/Cel45A(SEQ ID NO：2的22-234位氨基酸)的催化结构域连接有里氏木霉CBHI/Cel7A(SEQ ID NO：24)、嗜热枝顶孢霉ALKO4245 XYN60/Xyn10A(SEQ ID NO：25)、或嗜热毛壳菌ALKO4265 CBHI/Cel7A(SEQ ID NO：26)的接头区域和CBD。分别使用TTGGATCCGAGTCGCAGCGGC-AACCCTAG-CGGCGGCAAC(SEQID NO：30)+TAATTCTGCAGTTACAGGCACTGAGAGTAG(SEQ IDNO：31)、或TTGGATCCGAGTCGCAGCGGCGGGAACCCACCCCCCGTCAC(SEQID NO：32)+TAATTCTGCAGTCACAGGCACTGAGAGTACCAGT(SEQ ID NO：33)、或TAATTTACGTACCTGGCCTTGACGGCAG(SEQ ID NO：34)+ATTAACTGCAGTTACAGGCACTGTTGAGCA(SEQ ID NO：35)的寡聚核苷酸组合，通过PCR扩增了里氏木霉CBHI/Cel7A编码基因(cel7A，SEQ ID NO：27)、嗜热枝顶孢霉ALKO4245XYN60/Xyn10A编码基因(xyn10A，SEQ ID NO：28)、或嗜热毛壳菌ALKO4265CBHI/Cel7A编码基因(cel7A，SEQ ID NO：29)的接头和CBD区域。扩增的PCR产物被连接到cel45A基因，以产生At cel45A_Tr cel7A接头CBD(SEQ ID NO：36)、At cel45A_At xyn10A接头CBD(SEQ ID NO：37)、或At cel45A_Ct cel7A接头CBD(SEQID NO：38)基因。产生的质粒被命名为pALK2022、pALK2024和pALK2026。相应的大肠杆菌菌株在Deutsche Sammlung vonMikroorganismen und Zellkulturen GmbH培养物保藏中心的保藏号分别为DSM 18815、DSM 18816和DSM 18817。保藏按照布达佩斯公约进行。
构建了用于生产修饰的EG_40/Cel45A蛋白的表达质粒，按照实施例4中的描述在木霉中生产了重组蛋白EG_40_TrCBD(SEQ ID NO：39)、EG_40_AtCBD(SEQ ID NO：40)和EG_40_CtCBD(SEQ ID NO：41)。修饰的EG_40/Cel45A纤维素酶的温度和最适pH与野生型蛋白相似。将选定的转化体RF6828(EG_40_TrCBD)、RF6835(EG_40_AtCBD)和RF6821(EG_40_CtCBD)在2升生物反应器中培养4天(28℃，pH 4.2)，以获得用于应用试验的材料(实施例9和13)。
实施例6、构建和生产缺少碳水化合物结合结构域或碳水化合物结合结构域加上接头区域的嗜热枝顶孢霉ALKO4245 EG_40纤维素酶的
为了产生缺少碳水化合物结合结构域(CBD)的嗜热枝顶孢霉ALKO4245 EG_40纤维素酶At cel45A_无CBD，或缺少CBD与接头区域的纤维素酶At cel45A_无接头CBD，制造了两种cel45A缺失的构建物；第一个缺少了编码CBD的区域，第二个还缺少了催化核心与碳水化合物结合结构域之间的接头区域。
按照实施例3中描述使用标准分子生物学方法。通过PCR扩增了两个不同长度的cel45A基因的3′-片段。反义引物被设计成从产物中除去了CBD或接头+CBD区域。使用引物GCAGCAACCAGTTCGACCTC(SEQ ID NO：42)和TTAACTGCAGTCACTGGGCAGTGCAGCCACCGCCTC(SEQ ID NO：43)扩增的PCR产物作为SacI-PstI片段与另一个使用引物ACTGCTGCAAGCCGTCCTGC(SEQ ID NO：44)和TTAACTGCAGTCAACCGCTAGGCGGGTTGAAGACGGGATAG(SEQID NO：45)扩增的PCR片段作为NcoI-PstI片段和cel45A基因的5′-片段相连接，分别重新构建了全长的基因At cel45A_无CBD(SEQ IDNO：16)和At cel45A_无接头CBD(SEQ ID NO：18)。产生的质粒被命名为pALK2009和pALK2014。对应的大肠杆菌菌株在DeutscheSammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen BmbH培养物保藏中心的保藏号分别为DSM 18813和DSM 18814。保藏按照布达佩斯公约进行。
构建了用于产生无CBD和无接头CBD版本的嗜热枝顶孢霉EG_40/Cel45A纤维素酶的表达质粒，按照实施例4中的描述在木霉中生产了重组蛋白(分别为SEQ ID NO：17和19)。
实施例7、构建和生产重组嗜热枝顶孢霉ALKO4245 EG_40_样+CBD融合蛋白
为了生产重组嗜热枝顶孢霉ALKO4245 EG_40_样+CBD融合蛋白(SEQ ID NO：21)，EG_40/Cel45A纤维素酶的碳水化合物结合结构域(CBD)被连接到EG_40_样纤维素酶中。构建体含有EG_40_样(全长多肽的1-242位氨基酸)的催化结构域，该结构域连接有EG_40纤维素酶的接头区域和CBD(全长多肽的235-297位氨基酸)。
按照实施例3中的描述，使用标准分子生物学方法。首先，通过PCR在EG_40样序列的C-末端附近引入唯一的NruI限制性位点。这使得EG_40样多肽的S242氨基酸之后直接融合任何平端的DNA。通过PCR扩增EG_40编码基因(cel45A)的接头+CBD区域，将其限制性片段连接到cel45B基因中(在S242之后)，产生了At cel45B_cel45A接头CBD(SEQ ID NO：20)。构建了用于生产EG_40_样CBD纤维素酶的表达质粒，并按照实施例4中的描述在木霉中生产了重组蛋白(SEQ ID NO：21)。
实施例8、不同温度下EG_40纤维素酶制品在粗斜棉布整理中的性能
对于来自实施例4中描述的使用里氏木霉作为宿主产生的RF6118菌株的嗜热枝顶孢霉EG_40纤维素酶，测试了在不同温度下在粗斜棉布的生物石洗中产生与浮石提供的相似的磨蚀外观的能力。使用木霉作为宿主产生的在粗斜布整理中有效的商业化的富含EGII的制品(US5,874,293)在50℃下被用于比较。
由靛蓝染色的粗斜棉布制成的牛仔裤在用ECOSTONE
Figure A20068004879200391
A200α-淀粉酶脱浆后被用作试验材料。纤维素酶处理使用Electrolux′sWascator FOM 71 CLS洗衣机脱水机在表7描述的条件下进行。
富含EGII的稳定化的酶浓缩物的用量为织物重量的0.23％，这是制品在工业应用中的典型剂量。从实验性发酵获得的浓缩的和稳定化的EG_40制品的用量为0.18％。当根据蛋白含量进行计算时[作为蛋白]，剂量为每克织物大约0.20mg和0.035mg，使用Bio-Rad蛋白分析染料试剂(BioRad，Hercules，CA，USA)和牛7球蛋白作为标准品。在排水后，通过加入5g NaOH(10分钟，40℃)使pH升高到11以上并漂洗3次来使纤维素酶失活。牛仔裤在转筒中干燥。
通过用Minolta CM 2500分光光度计使用L*a*b*颜色空间坐标(光源D65/2°)，测量颜色作为反射值来评估生物石洗效果/磨蚀水平。在脱浆后(即纤维素酶处理之前)和纤维素酶处理之后测量粗斜棉布的正面和背面的颜色。粗斜棉布正面的每个测量值是大约40个测量值的平均。每个试验中使用两条牛仔裤，最终的结果是它们的平均。结果显示在表8和图3中。
表7、在纤维素酶处理中使用的试验条件/加工参数
  加工参数
  粗斜棉布载量   1.3-1.4公斤
  水   19升
  pH控制(pH5-5.3)   5ml乙酸(80％)
  时间   45分钟
  温度   40、50、60或70℃
  纤维素酶剂量   织物重量的0.18％或0.23％
Figure A20068004879200411
表8和图3中的结果表明EG_40在低的剂量范围下的生物石洗效果非常好。与富含EGII的制品相比，在50℃下使用EG_40制品获得相似的磨蚀水平(亮度L*)的蛋白量低6倍。
实施例9、修饰的EG_40纤维素酶在粗斜棉布整理中的性能
试验了按照实施例5中的描述在里氏木霉中生产的修饰的嗜热枝顶孢霉EG_40纤维素酶在粗斜棉布的生物石洗中产生与浮石提供的相似的磨蚀外观的能力。将重组蛋白EG_40_TrCBD、EG_40_AtCBD和EG_40_CtCBD与野生型EG_40纤维素酶(实施例4)进行了比较。
由不同类型的靛蓝染色的粗斜棉布制成的粗斜棉布裤腿在用ECOSTONE
Figure A20068004879200421
A200α-淀粉酶脱浆后被用作试验材料。纤维素酶处理使用Electrolux′s Wascator FOM 71CLS洗衣机脱水器在表9中描述的条件下进行。
纤维素酶制品的用量基于织物的重量为200nkat/g。内切葡聚糖酶活性按照实施例4测定，只是使用3％的CMC和60℃。在排水后，通过加入4.2g NaOH(10分钟，40℃)使pH升高到11以上并漂洗3次来使纤维素酶失活。粗斜棉布裤腿在转筒中干燥。
按照实施例8，通过测量粗斜棉布的正面颜色来评估生物石洗效果/磨蚀水平。粗斜棉布裤腿正面的每个测量值是大约20个测量值的平均。最终的结果是来自比利时的Ukos Sport的三种不同的粗斜棉布(Intrigue、Atlanta、Nostalgy)的平均值。结果显示在表10中。
表9、在纤维素酶处理中使用的试验条件/加工参数
  加工参数
  粗斜棉布载量   1.1公斤
  水   17升
  pH控制(pH5)   27g Na2HPO42H2O+19g柠檬酸
  时间   55分钟
  温度   60℃
  纤维素酶剂量   200nkat/g织物
表10、用不同的EG_40纤维素酶在60℃和pH5下处理的粗斜棉布正面的颜色测量值
Figure A20068004879200431
a)基于织物的重量
b)L*表示亮度，-b*是蓝色方向，+b*是黄色方向。
表10中的结果显示出修饰的EG_40制品的生物石洗效果与使用含有野生型纤维素酶的EG_40制品获得的效果相当。
实施例10、在粗斜棉布整理中使用EG_40纤维素酶增强富含EGII的酶制品的洗涤性能
在粗斜棉布的生物石洗中试验了EG_40纤维素酶与富含EGII的制品的效果。用于生物石洗的粗斜棉布和试验系统与实施例8中相同，只是温度为50℃。纤维素酶处理的效果也按照实施例8进行评估。酶制品的剂量为3-5克，对于织物的重量来说为0.22-0.38％(表11)。
表11和图4中的结果显示出EG_40也可用于改进富含EGII制品的磨蚀效果。单独使用富含EGII的制品时，即使使用剂量增加，也不能获得与含有70％的富含EGII的浓缩物和30％的EG_40纤维素酶浓缩物的混合物所获得的类似的亮度水平。
Figure A20068004879200451
实施例11、EG_40样纤维素酶制品在粗斜棉布整理中的性能
在粗斜棉布的生物石洗中，对按照实施例4中的描述产生的菌株RF6071的EG_40样发酵液与富含EGII的浓缩物进行比较。用于生物石洗的粗斜棉布和试验系统与实施例8中相同，只是温度为60℃以及粗斜棉布的量增加到1430g，测量中没有包含额外的不同的粗斜棉布片。纤维素酶处理的效果也按照实施例8进行评估。
表12中的结果显示出使用EG_40样获得了磨蚀效果，同时在粗斜棉布的背面返染(靛蓝染料的重新沉积)较少。特别是口袋的亮度更高，它们的蓝色较浅。
实施例12、在生物整理(去起球)中EG_40和用EG_40增强的富含EGII的制品的性能
在棉织品的去起球中，将浓缩的RF6118 EG_40制品的能力和用EG_40增强的富含EGII制品的能力与通常用在生物整理制剂中的商业化的富含EGII的制品进行了比较。纤维素酶处理使用Electrolux′sWascator FOM 71 CLS洗衣机脱水器在表13中描述的条件下进行。
两种低质量的具有细毛表面的蓝色圆高领针织衫片，由100％基于棉针织的织物制成或花纹由95％的棉和5％的莱卡制成，被用作试验材料。填充材料加到合计1公斤。样品首先在60℃用1ml/l表面活性剂/润湿剂(来自Sandos的Sandoclean PCJ和来自Clariant的Imacol CN)预洗10分钟，并漂洗3次。然后将棉针织物用纤维素酶在60℃下在与预洗中使用的相同的织物辅助剂的存在下处理60分钟。按照实施例8中的描述将酶失活，只是在碱性漂洗过程中的温度是60℃，并将针织物片漂洗3次，在滚筒中干燥。
表13、在生物整理处理中使用的试验条件/加工参数
  加工参数
  织物载量   1.0公斤
  水   15升
  Sandoclean PCJ和Imacol CN   1ml/l
  缓冲液/pH控制(pH5-5.3)   大约3ml乙酸(80％)
  时间   60分钟
  温度   60℃
  纤维素酶剂量   织物重量的0.04％到0.63％
纤维素酶处理的效果使用肉眼和放大镜目测评估。不用酶预洗的样品被用作对照。结果显示在表14中，使用大型物镜拍摄的数字相机照片显示在图5中。
EG_40制品和用EG_40增强的富含EGII的制品与商业化的富含EGII的制品相比具有出色的去起球性质，后者在在该酶浓缩物在生物整理应用中典型的剂量范围之内使用。比起用EGII制品获得相似的效果，EG_40制品的剂量至少低8倍、富含EGII的-EG_40混合物的剂量至少低4倍。
在用所用的蛋白测定分析方法进行分析时，使用RF6118菌株时在生物反应器培养上清液中的蛋白水平比富含EGII的制品的木霉生产菌株略低一些。尽管如此，EG_40培养基在生物整理中容积分析上至少更有效4-6倍。
表14、使用EG_40和用EG_40增强的富含EGII的制品与单独的富含EGII的制品进行生物整理处理的结果比较
  样品   剂量g   齐量，％owfa)   去起球效果b)   蛋白mg/g织物
  富含EGII的浓缩物   6.3   0.63   +++++   0.55
  富含EGII的浓缩物   3.2   0.32   +++   0.27
  富含EGII+EG_40混合物70％+13％   3.2   0.32   +++++   0.21
  富含EGII+EG_40混合物70％+13％   1.6   0.16   +++++   0.10
  富含EGII+EG_40混合物70％+13％   0.8   0.08   +++   0.052
  EG_40浓缩物   1.6   0.16   +++++   0.050
  EG_40浓缩物   0.8   0.08   +++++   0.025
  EG_40浓缩物   0.4   0.04   +++   0.012
  仅仅预洗，不加酶   -   -   -   -
a)基于织物的重量
b)+++++非常好的去起球效果，目测表面非常干净；
+++良好的去起球效果，目测表面相对干净；
-密集的表面起毛/和或严重起球。
实施例13、修饰的EG_40纤维素酶在生物整理(去起球)中的性能
测试了按照实施例5中的描述在里氏木霉中生产的修饰的嗜热枝顶孢霉EG_40纤维素酶在棉针织品的去起球中的能力。将重组蛋白EG_40_TrCBD、EG_40_AtCBD和EG_40_CtCBD与野生型EG_40纤维素酶进行比较。纤维素酶处理使用Electrolux′s Wascator FOM 71CLS洗衣机脱水器在实施例12中描述的条件下进行，只是酶的用量为83nkat/g织物。内切葡聚糖酶活性按照实施例9中的描述测量。
三种不同的具有细毛表面的针织品片，由100％棉或95％棉和5％莱卡制成，被用作试验材料。填充材料添加到直至1公斤。样品按照实施例12中的描述进行处理。纤维素酶处理的效果使用肉眼和放大镜目测评估。不用酶预洗的样品被用作对照。结果显示在表15中。
所有的EG_40制品都具有非常好的去起球性质，导致起毛的极大减少并防止了起球。没有用酶处理的对照样品含有密集的表面细毛和严重起球。
在50℃下使用剂量为42nkat/g织物的酶进行30分钟处理的初步试验显示出所有不同的EG_40纤维素酶在使用较低的剂量和/或短的反应时间时，都具有相当好的去起球效果。
表15、使用不同EG_40纤维素酶进行生物整理处理的结果
  样品   剂量，nkat/g织物   去起球效果
  EG_40_TrCBD   83   +++++
  EG_40_AtCBD   83   +++++
  EG_40_CtCBD   83   +++++
  EG_40   83   +++++
  不加酶洗涤   -   -
+++++非常好的去起球效果，目测表面非常干净；
-密集的表面起毛/和或严重起球。
保藏的微生物的名单：
嗜热枝顶孢霉ALKO4245于2004年9月20日保藏于CentralbureauVoor Schimmelcultures，Uppsalalaan 8，3584CT，Utrecht，荷兰(CBS)，保藏号为CBS 116240。
含有质粒pALK1908的大肠杆菌于2005年5月13日保藏于Deutsche Sammlung von Mikroorgamsmen und Zellkulturen GmbH(DSM)，Mascheroder Weg 1b，D-38124Braunschweig，德国，保藏号为DSM 17324。
含有质粒pALK1904的大肠杆菌于2005年5月13日保藏于Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)，Mascheroder Weg 1b，D-38124Braunschweig，德国，保藏号为DSM 17323。
含有质粒pALK2009的大肠杆菌于2006年11月24日保藏于Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，德国，保藏号为DSM 18813。
含有质粒pALK2014的大肠杆菌于2006年11月24日保藏于Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，德国，保藏号为DSM 18814。
含有质粒pALK2022的大肠杆菌于2006年11月24日保藏于Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，德国，保藏号为DSM 18815。
含有质粒pALK2024的大肠杆菌于2006年11月24日保藏于Deutsche Sammlung von Mikroorgamsmen und Zellkulturen GmbH(DSM)，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，德国，保藏号为DSM 18816。
含有质粒pALK2026的大肠杆菌于2006年11月24日保藏于的Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH(DSM)，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，德国，保藏号为DSM 18817。
参考文献
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序列表
<110>生化酶股份有限公司(AB Enzymes Oy)
<120>新型酶(Novel enzymes)
<130>SCT082497-00
<160>45
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>2334
<212>DNA
<213>Acremonium thermophilum
<220>
<221>misc_feature
<222>(13)..(13)
<223>n means a，t，c，or g
<220>
<221>CDS
<222>(715)..(797)
<220>
<221>Intron
<222>(798)..(856)
<220>
<221>CDS
<222>(857)..(1105)
<220>
<221>Intron
<222>(1106)..(1228)
<220>
<221>CDS
<222>(1229)..(1787)
<400>1
tctgtctctt gtntcagaac agatctcctg gcggcctgct  ttgccggtcc gaattgcgat   60
cgatgcaacg tcgattgcat acgagctaag cccgtctcgt gataaccgca aggggtcttc    120
cgagtttctg tctgcgaccc aggcattttc cgatttgtgt gcggggaccc aactgtcttc    180
tggggagtac ctggtgacaa aagcacagat aaacagatgg atgacggtat tgctgtgata    240
tcgccgtggc gctgaatcct ttctcttcgc taccaagata tttattcccc gttgtgaaat    300
cttctattca gcccatccca tccggcaaca cgcatctgct tttcgttccg gcattccgat    360
acctggttcc tggagtgcct accgagcctc gcttcctggg atcgggcgtt gcaccccgcc    420
aaaccctatg ccccaaacgg tacggacaag gatgccggac cccggttttg tccagaaagg    480
ttgcattcct acccacctcg ctggagccac aacatgcaga tcaccgcccg agggaggaca    540
tgtgtggtgc agggacgttg gcaactctgc tgtgtctgaa gtatatgagg ccgatggttc    600
tccttgcaca aagcagagaa tggagtagcc agctcctcct caccagagtc gcctttgcag    660
cgtctcggca ttgcaggctc cccatcgtca gcatttcact tctcagcaac gaac atg      717
                                                            Met
                                                            1
cgc tcc tca ccc ttt ctc cgc gca gct ctg gct gcc gct ctg cct ctg      765
Arg Ser Ser Pro Phe Leu Arg Ala Ala Leu Ala Ala Ala Leu Pro Leu
            5                   10                  15
agc gcc cat gcc ctc gac gga aag tcg acg ag  gtatgccaat cctcgtacct    817
Ser Ala His Ala Leu Asp Gly Lys Ser Thr Arg
        20                  25
ctgccctctg tagaaacaag tgaccgactg caaagacag a tac tgg gac tgc tgc     872
                                             Tyr Trp Asp Cys Cys
                                                 30
aag ccg tcc tgc ggc tgg ccg gga aag gcc tcg gtg aac cag ccc gtc      920
Lys Pro Ser Cys Gly Trp Pro Gly Lys Ala Ser Val Asn Gln Pro Val
    35                  40                  45
ttc tcg tgc tcg gcc gac tgg cag cgc atc agc gac ttc aac gcg aag      968
Phe Ser Cys Ser Ala Asp Trp Gln Arg Ile Ser Asp Phe Asn Ala Lys
50                  55                  60                  65
tcg ggc tgc gac gga ggc tcc gcc tac tcg tgc gcc gac cag acg ccc    1016
Ser Gly Cys Asp Gly Gly Ser Ala Tyr Ser Cys Ala Asp Gln Thr Pro
                70                  75                  80
tgg gcg gtc aac gac aac ttc tcg tac ggc ttc gca gcc acg gcc atc    1064
Trp Ala Val Asn Asp Asn Phe Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Ala Ile
            85                  90                  95
gcc ggc ggc tcc gag tcc agc tgg tgc tgc gcc tgc tat gc             1105
Ala Gly Gly Ser Glu Ser Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Ala
        100                 105                 110
gtgagttctc tgcaagccgc ttcccacccc cgctttctgt gcaggccgct tcccccctac  1165
ccacccactt cccccccccc gcctctgtga tcgggcatcc gagctaagtt gcgtgtcgtc  1225
cag a ctc acc ttc aac tcg ggc ccc gtc gcg ggc aag acc atg gtg gtg  1274
      Leu Thr Phe Asn Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Thr Met Val Val
                  115                 120                 125
cag tcg acc agc acc ggc ggc gac ctg ggc agc aac cag ttc gac ctc    1322
Gln Ser Thr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Gly Ser Asn Gln Phe Asp Leu
            130                 135                 140
gcc atc ccc ggc ggc ggc gtg ggc atc ttc aac ggc tgc gcc tcc cag    1370
Ala Ile Pro Gly Gly Gly Val Gly Ile Phe Asn Gly Cys Ala Ser Gln
        145                 150                 155
ttc ggc ggc ctc ccc ggc gcc cag tac ggc ggc atc agc gac cgc agc    1418
Phe Gly Gly Leu Pro Gly Ala Gln Tyr Gly Gly Ile Ser Asp Arg Ser
    160                 165                 170
cag tgc tcg tcc ttc ccc gcg ccg ctc cag ccg ggc tgc cag tgg cgc    1466
Gln Cys Ser Ser Phe Pro Ala Pro Leu Gln Pro Gly Cys Gln Trp Arg
175                 180                 185                 190
ttc gac tgg ttc cag aac gcc gac aac ccc acc ttc acc ttc cag cgc    1514
Phe Asp Trp Phe Gln Asn Ala Asp Asn Pro Thr Phe Thr Phe Gln Arg
                195                 200                 205
gtg cag tgc ccg tcc gag ctc acg tcc cgc acg ggc tgt aag cgc gac    1562
Val Gln Cys Pro Ser Glu Leu Thr Ser Arg Thr Gly Cys Lys Arg Asp
            210                 215                 220
gac gac gcc agc tat ccc gtc ttc aac ccg cct agc ggt ggc tcc ccc    1610
Asp Asp Ala Ser Tyr Pro Val Phe Asn Pro Pro Ser Gly Gly Ser Pro
        225                 230                 235
agc acc acc agc acc acc acc agc tcc ccg tcc ggt ccc acg ggc aac    1658
Ser Thr Thr Ser Thr Thr Thr Ser Ser Pro Ser Gly Pro Thr Gly Asn
    240                 245                 250
cct cct gga ggc ggt ggc tgc act gcc cag aag tgg gcc cag tgc ggc    1706
Pro Pro Gly Gly Gly Gly Cys Thr Ala Gln Lys Trp Ala Gln Cys Gly
255                 260                 265                 270
ggc act ggc ttc acg ggc tgc acc acc tgc gtc tcg ggc acc acc tgc    1754
Gly Thr Gly Phe Thr Gly Cys Thr Thr Cys Val Ser Gly Thr Thr Cys
                275                 280                 285
cag gtg cag aac cag tgg tat tcc cag tgt ctg tgagcgggag ggttgttggg  1807
Gln Val Gln Asn Gln Trp Tyr Ser Gln Cys Leu
            290                 295
gtccgtttcc ctagggctga ggctgacgtg aactgggtcc tcttgtccgc cccatcacgg  1867
gttcgtattc gcgcgcttag ggagaggagg atgcagtttg agggggccac attttgaggg  1927
ggacgcagtc tggggtcgaa gcttgtcggt tagggctgcc gtgacgtggt agagcagatg  1987
ggaccaagtg cggagctagg caggtgggtg gttgtggtgg tggcttacct tctgtaacgc  2047
aatggcatct catctcactc gcctgctccc tgattggtgg ctctgttcgg cctggcgctt  2107
tttgggaccg ctggctggaa tggattgctc cggaacgcca ggttgagctg ggctggcgcg  2167
agtagattgg ccgctccgag ctgcaaccat aataaaattt tcggaccctg taagccgcac  2227
ccgaccaggt ctccattggc ggacatgcac gacgtccttc gcaggcacgg cctgcccgcc  2287
tctgatcacc cgcagttttc gtaccgtcag accagataca agccccg                2334
<210>2
<211>297
<212>PRT
<213>Acremonium thermophilum
<400>2
Met Arg Ser Ser Pro Phe Leu Arg Ala Ala Leu Ala Ala Ala Leu Pro
1               5                   10                  15
Leu Ser Ala His Ala Leu Asp Gly Lys Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys
            20                  25                  30
Cys Lys Pro Ser Cys Gly Trp Pro Gly Lys Ala Ser Val Asn Gln Pro
        35                  40                  45
Val Phe Ser Cys Ser Ala Asp Trp Gln Arg Ile Ser Asp Phe Asn Ala
    50                  55                  60
Lys Ser Gly Cys Asp Gly Gly Ser Ala Tyr Ser Cys Ala Asp Gln Thr
65                  70                  75                  80
Pro Trp Ala Val Asn Asp Asn Phe Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Ala
                85                  90                  95
Ile Ala Gly Gly Ser Glu Ser Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Ala Leu
            100                 105                 110
Thr Phe Asn Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Thr Met Val Val Gln Ser
        115                 120                 125
Thr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Gly Ser Asn Gln Phe Asp Leu Ala Ile
    130                 135                 140
Pro Gly Gly Gly Val Gly Ile Phe Asn Gly Cys Ala Ser Gln Phe Gly
145                 150                 155                 160
Gly Leu Pro Gly Ala Gln Tyr Gly Gly Ile Ser Asp Arg Ser Gln Cys
                165                 170                 175
Ser Ser Phe Pro Ala Pro Leu Gln Pro Gly Cys Gln Trp Arg Phe Asp
            180                 185                 190
Trp Phe Gln Asn Ala Asp Asn Pro Thr Phe Thr Phe Gln Arg Val Gln
        195                 200                 205
Cys Pro Ser Glu Leu Thr Ser Arg Thr Gly Cys Lys Arg Asp Asp Asp
    210                 215                 220
Ala Ser Tyr Pro Val Phe Asn Pro Pro Ser Gly Gly Ser Pro Ser Thr
225                 230                 235                 240
Thr Ser Thr Thr Thr Ser Ser Pro Ser Gly Pro Thr Gly Asn Pro Pro
                245                 250                 255
Gly Gly Gly Gly Cys Thr Ala Gln Lys Trp Ala Gln Cys Gly Gly Thr
            260                 265                 270
Gly Phe Thr Gly Cys Thr Thr Cys Val Ser Gly Thr Thr Cys Gln Val
        275                 280                 285
Gln Asn Gln Trp Tyr Ser Gln Cys Leu
    290                 295
<210>3
<211>2033
<212>DNA
<213>Acremonium thermophilum
<220>
<221>CDS
<222>(259)..(702)
<220>
<221>Intron
<222>(703)..(857)
<220>
<221>CDS
<222>(858)..(888)
<220>
<221>Intron
<222>(889)..(990)
<220>
<221>CDS
<222>(991)..(1268)
<400>3
ctcgaggaga ggaaccgagt ttgaaagatg ctatatatcg atagactacc ggcgtcgcct    60
cgccctgtcc gctctcttgc attccccctg ttgatgagac gagacaaaat tcctggttag    120
aaaagatccg tcgccgagat ttcaccagtg gtaagtcccg agaattggtc attcgacgtt    180
caatatgagt gtcaaagcta tgggtcctaa caaagaagga agcaagagct ttaaagagac    240
agaataacag cagcaaag atg cgt ctc cca cta ccg act ctg ctc gcc ctc      291
                    Met Arg Leu Pro Leu Pro Thr Leu Leu Ala Leu
                    1               5                   10
ttg ccc tac tac ctc gaa gtg tcc gct cag ggg gca tcc gga acc ggc      339
Leu Pro Tyr Tyr Leu Glu Val Ser Ala Gln Gly Ala Ser Gly Thr Gly
            15                  20                  25
acg aca aca cgt tac tgg gat tgc tgc aag ccg agc tgc gcg tgg cct      387
Thr Thr Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys Ala Trp Pro
        30                  35                  40
ctg aag ggc aat tcg ccc agc ccg gtg cag act tgc gac aag aat gac      435
Leu Lys Gly Asn Ser Pro Ser Pro Val Gln Thr Cys Asp Lys Asn Asp
    45                  50                  55
agg ccg ctg aac gat ggg gga aac acc aag tcc ggc tgc gac aac ggt      483
Arg Pro Leu Asn Asp Gly Gly Asn Thr Lys Ser Gly Cys Asp Asn Gly
60                  65                  70                  75
ggc ggg gcc ttc atg tgc tca tcc cag agt ccc tgg gcc gtc aat gag    531
Gly Gly Ala Phe Met Cys Ser Ser Gln Ser Pro Trp Ala Val Asn Glu
                80                  85                  90
acc acc agc tac ggc tgg gca gcc gtt cgt atc gcc ggc agt acc gag    579
Thr Thr Ser Tyr Gly Trp Ala Ala Val Arg Ile Ala Gly Ser Thr Glu
            95                  100                 105
tcg gcc tgg tgc tgt gcc tgc tac gag ctc acc ttc acc agt ggg ccc    627
Ser Ala Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Glu Leu Thr Phe Thr Ser Gly Pro
        110                 115                 120
gtc agt gga aag aag ctc ata gtc cag gcc acg aac act ggt gga gac    675
Val Ser Gly Lys Lys Leu Ile Val Gln Ala Thr Asn Thr Gly Gly Asp
    125                 130                 135
ctt ggg agc aac cac ttt gac ctt gcg gtatgtgggg tttttctttc          722
Leu Gly Ser Asn His Phe Asp Leu Ala
140                 145
ttcatcatcg ctctcaccat ggattcctcg gcgcaaggac caagattgag aagcgtcaat  782
gccgggttgg acacgggagc cgggatagga acacagaggc cgtttaagac cgtcagctga  842
cagcagagca attag att ccc gga ggt ggt gtt ggt cag tcc aat g         888
                 Ile Pro Gly Gly Gly Val Gly Gln Ser Asn
                     150                 155
gtaggttcct tccctgaagt accggcaaca gcctgtgcgt tgctgtatac cccttttaat  948
catagcatct tcctgctgga tacaagccaa cccattttct ag ct  tgc acg aac     1001
                                               Ala Cys Thr Asn
                                                   160
cag tat ggt gcg ccc ccg aac ggc tgg ggc gac agg tat ggt ggc gtg    1049
Gln Tyr Gly Ala Pro Pro Asn Gly Trp Gly Asp Arg Tyr Gly Gly Val
        165                 170                 175
cac tcg cgg agc gac tgc gac agc ttc ccc gcg gcg ctc aag gcc ggc    1097
His Ser Arg Ser Asp Cys Asp Ser Phe Pro Ala Ala Leu Lys Ala Gly
    180                 185                 190
tgc tac tgg cga ttc gac tgg ttc cag ggc gcc gac aac ccg tcc gtg    1145
Cys Tyr Trp Arg Phe Asp Trp Phe Gln Gly Ala Asp Asn Pro Ser Val
195                 200                 205                 210
agc ttc aaa cag gta gcc tgc ccg gca gcc atc aca gct aag agc ggc    1193
Ser Phe Lys Gln Val Ala Cys Pro Ala Ala Ile Thr Ala Lys Ser Gly
                215                 220                 225
tgt act cgc cag aac gat gcc atc aac gag act ccg act ggg ccc agc    1241
Cys Thr Arg Gln Asn Asp Ala Ile Asn Glu Thr Pro Thr Gly Pro Ser
            230                 235                 240
act gtg cct acc tac acc gcg tca ggc tgaaagtcgg ctggggcacc          1288
Thr Val Pro Thr Tyr Thr Ala Ser Gly
        245                 250
attgcccagg tgatggttgg gcatgtgtta gtctcactca ccagggacat ttgtcgcgac  1348
ctgatcatag gcgccagggg agttgaaagg ggttgccgta cgagaagaca ttttgtcgcc  1408
gtcttactcc cagccacttc tgtacatatt caatgacatt acatagcccg caaatatgtt  1468
catatatcgt ggccgcccaa accgccccgg tttgcttagg ctggagctga agtggctcgc  1528
cgatggctgt caaaggcagt cggaatattc ctcgttgctt cggcaacacg gtagctgctt  1588
gaaccgtacc cagcattaga acaccccccg ccgagggctt gctacgtcaa tggcggggtc  1648
tccaacccct gcgcggcaca aaaccaacca cgccctcgtc ttttatgatg tcctcgctca  1708
aacgtcccgt gacgacactc cgctcatggt ctggtcctct gatgtagaag gggtaggtca  1768
gccgatggtc gtcaccgtcg tcaatgcttc cctcaagctt cttgcggcct ttatcctcca  1828
actcttccca catgagaact ccatctttcc gccttttcac aaagccactg ccctccttgt  1888
caagggccaa aaaccaacgc cgctgatgaa tgcttccgat cgtgtttgac gcgcccgggg  1948
tatgcatttg gttcggcgca cttttttcgt cctccagctc ccttaactcc cgttccatct  2008
gagagggtga ctcgtctact cgact                                        2033
<210>4
<211>251
<212>PRT
<213>Acremonium thermophilum
<400>4
Met Arg Leu Pro Leu Pro Thr Leu Leu Ala Leu Leu Pro Tyr Tyr Leu
1               5                   10                  15
Glu Val Ser Ala Gln Gly Ala Ser Gly Thr Gly Thr Thr Thr Arg Tyr
            20                  25                  30
Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys Ala Trp Pro Leu Lys Gly Asn Ser
        35                  40                  45
Pro Ser Pro Val Gln Thr Cys Asp Lys Asn Asp Arg Pro Leu Asn Asp
    50                  55                  60
Gly Gly Asn Thr Lys Ser Gly Cys Asp Asn Gly Gly Gly Ala Phe Met
65                  70                  75                  80
Cys Ser Ser Gln Ser Pro Trp Ala Val Asn Glu Thr Thr Ser Tyr Gly
                85                  90                  95
Trp Ala Ala Val Arg Ile Ala Gly Ser Thr Glu Ser Ala Trp Cys Cys
            100                 105                 110
Ala Cys Tyr Glu Leu Thr Phe Thr Ser Gly Pro Val Ser Gly Lys Lys
        115                 120                 125
Leu Ile Val Gln Ala Thr Asn Thr Gly Gly Asp Leu Gly Ser Asn His
    130                 135                 140
Phe Asp Leu Ala Ile Pro Gly Gly Gly Val Gly Gln Ser Asn Ala Cys
145                 150                 155                 160
Thr Asn Gln Tyr Gly Ala Pro Pro Asn Gly Trp Gly Asp Arg Tyr Gly
                165                 170                 175
Gly Val His Ser Arg Ser Asp Cys Asp Ser Phe Pro Ala Ala Leu Lys
            180                 185                 190
Ala Gly Cys Tyr Trp Arg Phe Asp Trp Phe Gln Gly Ala Asp Asn Pro
        195                 200                 205
Ser Val Ser Phe Lys Gln Val Ala Cys Pro Ala Ala Ile Thr Ala Lys
    210                 215                 220
Ser Gly Cys Thr Arg Gln Asn Asp Ala Ile Asn Glu Thr Pro Thr Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Thr Val Pro Thr Tyr Thr Ala Ser Gly
                245                 250
<210>5
<211>17
<212>PRT
<213>Acremonium thermophilum
<400>5
Gln Ser Cys Ser Ser Phe Pro Ala Pro Leu Lys Pro Gly Cys Gln Trp
1               5                   10                  15
Arg
<210>6
<211>13
<212>PRT
<213>Acremonium thermophilum
<400>6
Tyr Ala Leu Thr Phe Asn Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys
1               5                   10
<210>7
<211>10
<212>PRT
<213>Acremonium thermophilum
<400>7
Val Gln Cys Pro Ser Glu Leu Thr Ser Arg
1               5                   10
<210>8
<211>13
<212>PRT
<213>Acremonium thermophilum
<400>8
Asn Gln Pro Val Phe Ser Cys Ser Ala Asp Trp Gln Arg
1               5                   10
<210>9
<211>14
<212>PRT
<213>Acremonium thermophilum
<400>9
Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys Gly Trp Pro Gly Lys
1               5                   10
<210>10
<211>4
<212>PRT
<213>Acremonium thermophilum
<400>10
Pro Thr Phe Thr
1
<210>11
<211>20
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>primer
<220>
<221>misc_feature
<222>(3)..(3)
<223>y means c or t
<220>
<221>misc_feature
<222>(9)..(9)
<223>y means c or t
<220>
<221>misc_feature
<222>(12)..(12)
<223>y means c or t
<220>
<221>misc_feature
<222>(15)..(15)
<223>r means a or g
<400>11
taytgggayt gytgyaarcc    20
<210>12
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial Sequence
<220>
<223>primer
<220>
<221>misc_feature
<222>(1)..(1)
<223>r means a or g
<220>
<221>misc_feature
<222>(4)..(4)
<223>r means a or g
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)..(7)
<223>n means a，t，c or g
<220>
<221>misc_feature
<222>(10)..(10)
<223>r means a or g
<220>
<221>misc_feature
<222>(13)..(13)
<223>y means c or t
<220>
<221>misc_feature
<222>(16)..(16)
<223>r means a or g
<400>12
rttrtcngcr ttytgraacc a    21
<210>13
<211>7
<212>PRT
<213>Melanocarpus albomyces
<400>13
Trp Phe Gln Asn Ala Asp Asn
1               5
<210>14
<211>636
<212>DNA
<213>Acremonium thermophilum
<400>14
tactgggatt gttgcaagcc gtcctgcggc tggccgggaa aggcctcggt gaaccagccc    60
gtcttctcgt gctcggccga ctggcagcgc atcagcgact tcaacgcgaa gtcgggctgc    120
gacggaggct ccgcctactc gtgcgccgac cagacgccct gggcggtcaa cgacaacttc    180
tcgtacggct tcgcagccac ggccatcgcc ggcggctccg agtccagctg gtgctgcgcc    240
tgctatgcgt gagttctctg caagccgctt cccacccccg ctttctgtgc aggccgcttc    300
ccccctaccc acccacttcc ccccccccgc ctctgtgatc gggcatccga gctaagttgc    360
gtgtcgtcca gactcacctt caactcgggc cccgtcgcgg gcaagaccat ggtggtgcag    420
tcgaccagca ccggcggcga cctgggcagc aaccagttcg acctcgccat ccccggcggc    480
ggcgtgggca tcttcaacgg ctgcgcctcc cagttcggcg gcctccccgg cgcccagtac    540
ggcggcatca gcgaccgcag ccagtgctcg tccttccccg cgccgctcca gccgggctgc    600
cagtggcgct tcgactggtt ccagaacgcg gataat                              636
<210>15
<211>786
<212>DNA
<213>Acremonium thermophilum
<400>15
tactgggatt gttgcaagcc gagctgcgcg tggcctctga agggcaattc gcccagcccg    60
gtgcagactt gcgacaagaa tgacaggccg ctgaacgatg ggggaaacac caagtccggc    120
tgcgacaacg gtggcggggc cttcatgtgc tcatcccaga gtccctgggc cgtcaatgag    180
accaccagct acggctgggc agccgttcgt atcgccggca gtaccgagtc ggcctggtgc    240
tgtgcctgct acgagctcac cttcaccagt gggcccgtca gtggaaagaa gctcatagtc    300
caggccacga acactggtgg agaccttggg agcaaccact ttgaccttgc ggtatgtggg    360
gtttttcttt cttcatcatc gctctcacca tggattcctc ggcgcaagga ccaagattga    420
gaagcgtcaa tgccgggttg gacacgggag ccgggatagg aacacagagg ccgtttaaga    480
ccgtcagctg acagcaggag caattagatt cccggaggtg gtgttggtca gttcaatggt    540
aggttccttc cctgaagtac cggcaacagc ctgtgcgttg ctgtataccc cttttaatca    600
tagcatcttc ctgctggata caagccaacc cattttctag cttgcacgaa ccagtatggt    660
gcgcccccga acggctgggg cgacaggtat ggtggcgtgc actcgcggag cgactgcgac    720
agcttccccg cggcgctcaa ggccggctgc tactggcgat tcgactggtt tcaaaacgcc    780
gacaac                                                               786
<210>16
<211>994
<212>DNA
<213>Acremonium thermophilum
<220>
<221>CDS
<222>(13)..(95)
<220>
<221>Intron
<222>(96)..(154)
<220>
<221>CDS
<222>(155)..(403)
<220>
<221>Intron
<222>(404)..(526)
<220>
<221>CDS
<222>(527)..(986)
<400>16
ggactgcgca tc atg cgc tcc tca ccc ttt ctc cgc gca gct ctg gct gcc    51
              Met Arg Ser Ser Pro Phe Leu Arg Ala Ala Leu Ala Ala
              1               5                   10
gct ctg cct ctg agc gcc cat gcc ctc gac gga aag tcg acg ag           95
Ala Leu Pro Leu Ser Ala His Ala Leu Asp Gly Lys Ser Thr Arg
    15                  20                  25
gtatgccaat cctcgtacct ctgccctctg tagaaacaag tgaccgactg caaagacag    154
a tac tgg gac tgc tgc aag ccg tcc tgc ggc tgg gcc gga aag gcc tcg   203
  Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys Gly Trp Ala Gly Lys Ala Ser
      30                  35                  40
gtg aac cag ccc gtc ttc tcg tgc tcg gcc gac tgg cag cgc atc agc     251
Val Asn Gln Pro Val Phe Ser Cys Ser Ala Asp Trp Gln Arg Ile Ser
45                  50                  55                  60
gac ttc aac gcg aag tcg ggc tgc gac gga ggc tcc gcc tac tcg tgc     299
Asp Phe Asn Ala Lys Ser Gly Cys Asp Gly Gly Ser Ala Tyr Ser Cys
                65                  70                  75
gcc gac cag acg ccc tgg gcg gtc aac gac aac ttc tcg tac ggc ttc     347
Ala Asp Gln Thr Pro Trp Ala Val Asn Asp Asn Phe Ser Tyr Gly Phe
            80                  85                  90
gca gcc acg gcc atc gcc ggc ggc tcc gag tcc agc tgg tgc tgc gcc     395
Ala Ala Thr Ala Ile Ala Gly Gly Ser Glu Ser Ser Trp Cys Cys Ala
        95                  100                 105
tgc tat gc  gtgagttctc tgcaagccgc ttcccacccc cgctttctgt             443
Cys Tyr Ala
    110
gcaggccgct tcccccctac ccacccactt cccccccccc gcctctgtga tcgggcatcc  503
gagctaagtt gcgtgtcgtc cag a ctc acc ttc aac tcg ggc ccc gtc gcg    554
                            Leu Thr Phe Asn Ser Gly Pro Val Ala
                                        115                 120
ggc aag acc atg gtg gtg cag tcg acc agc acc ggc ggc gac ctg ggc    602
Gly Lys Thr Met Val Val Gln Ser Thr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Gly
                125                 130                 135
agc aac cag ttc gac ctc gcc atc ccc ggc ggc ggc gtg ggc atc ttc    650
Ser Asn Gln Phe Asp Leu Ala Ile Pro Gly Gly Gly Val Gly Ile Phe
            140                 145                 150
aac ggc tgc gcc tcc cag ttc ggc ggc ctc ccc ggc gcc cag tac ggc    698
Asn Gly Cys Ala Ser Gln Phe Gly Gly Leu Pro Gly Ala Gln Tyr Gly
        155                 160                 165
ggc atc agc gac cgc agc cag tgc tcg tcc ttc ccc gcg ccg ctc cag    746
Gly Ile Ser Asp Arg Ser Gln Cys Ser Ser Phe Pro Ala Pro Leu Gln
    170                 175                 180
ccg ggc tgc cag tgg cgc ttc gac tgg ttc cag aac gcc gac aac ccc    794
Pro Gly Cys Gln Trp Arg Phe Asp Trp Phe Gln Asn Ala Asp Asn Pro
185                 190                 195                 200
acc ttc acc ttc cag cgc gtg cag tgc ccg tcc gag ctc acg tcc cgc    842
Thr Phe Thr Phe Gln Arg Val Gln Cys Pro Ser Glu Leu Thr Ser Arg
                205                 210                 215
acg ggc tgt aag cgc gac gac gac gcc agc tat ccc gtc ttc aac ccg    890
Thr Gly Cys Lys Arg Asp Asp Asp Ala Ser Tyr Pro Val Phe Asn Pro
            220                 225                 230
cct agc ggt ggc tcc ccc agc acc acc agc acc acc acc agc tcc ccg    938
Pro Ser Gly Gly Ser Pro Ser Thr Thr Ser Thr Thr Thr Ser Ser Pro
        235                 240                 245
tcc ggt ccc acg ggc aac cct cct gga ggc ggt ggc tgc act gcc cag    986
Ser Gly Pro Thr Gly Asn Pro Pro Gly Gly Gly Gly Cys Thr Ala Gln
    250                 255                 260
tgactgca                                                           994
<210>17
<211>264
<212>PRT
<213>Acremonium thermophilum
<400>17
Met Arg Ser Ser Pro Phe Leu Arg Ala Ala Leu Ala Ala Ala Leu Pro
1               5                   10                  15
Leu Ser Ala His Ala Leu Asp Gly Lys Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys
            20                  25                  30
Cys Lys Pro Ser Cys Gly Trp Ala Gly Lys Ala Ser Val Asn Gln Pro
        35                  40                  45
Val Phe Ser Cys Ser Ala Asp Trp Gln Arg Ile Ser Asp Phe Asn Ala
    50                  55                  60
Lys Ser Gly Cys Asp Gly Gly Ser Ala Tyr Ser Cys Ala Asp Gln Thr
65                  70                  75                  80
Pro Trp Ala Val Asn Asp Asn Phe Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Ala
                85                  90                  95
Ile Ala Gly Gly Ser Glu Ser Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Ala Leu
            100                 105                 110
Thr Phe Asn Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Thr Met Val Val Gln Ser
        115                 120                 125
Thr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Gly Ser Asn Gln Phe Asp Leu Ala Ile
    130                 135                 140
Pro Gly Gly Gly Val Gly Ile Phe Asn Gly Cys Ala Ser Gln Phe Gly
145                 150                 155                 160
Gly Leu Pro Gly Ala Gln Tyr Gly Gly Ile Ser Asp Arg Ser Gln Cys
                165                 170                 175
Ser Ser Phe Pro Ala Pro Leu Gln Pro Gly Cys Gln Trp Arg Phe Asp
            180                 185                 190
Trp Phe Gln Asn Ala Asp Asn Pro Thr Phe Thr Phe Gln Arg Val Gln
        195                 200                 205
Cys Pro Ser Glu Leu Thr Ser Arg Thr Gly Cys Lys Arg Asp Asp Asp
    210                 215                 220
Ala Ser Tyr Pro Val Phe Asn Pro Pro Ser Gly Gly Ser Pro Ser Thr
225                 230                 235                 240
Thr Ser Thr Thr Thr Ser Ser Pro Ser Gly Pro Thr Gly Asn Pro Pro
                245                 250                 255
Gly Gly Gly Gly Cys Thr Ala Gln
            260
<210>18
<211>907
<212>DNA
<213>Acremonium thermophilum
<220>
<221>CDS
<222>(13)..(95)
<220>
<221>Intron
<222>(96)..(154)
<220>
<221>CDS
<222>(155)..(403)
<220>
<221>Intron
<222>(404)..(526)
<220>
<221>CDS
<222>(527)..(899)
<400>18
ggactgcgca tc atg cgc tcc tca ccc ttt ctc cgc gca gct ctg gct gcc    51
              Met Arg Ser Ser Pro Phe Leu Arg Ala Ala Leu Ala Ala
              1               5                   10
gct ctg cct ctg agc gcc cat gcc ctc gac gga aag tcg acg ag           95
Ala Leu Pro Leu Ser Ala His Ala Leu Asp Gly Lys Ser Thr Arg
    15                  20                  25
gtatgccaat cctcgtacct ctgccctctg tagaaacaag tgaccgactg caaagacag     154
a tac tgg gac tgc tgc aag ccg tcc tgc ggc tgg gcc gga aag gcc tcg    203
  Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys Gly Trp Ala Gly Lys Ala Ser
      30                  35                  40
gtg aac cag ccc gtc ttc tcg tgc tcg gcc gac tgg cag cgc atc agc      251
Val Asn Gln Pro Val Phe Ser Cys Ser Ala Asp Trp Gln Arg Ile Ser
45                  50                  55                  60
gac ttc aac gcg aag tcg ggc tgc gac gga ggc tcc gcc tac tcg tgc      299
Asp Phe Asn Ala Lys Ser Gly Cys Asp Gly Gly Ser Ala Tyr Ser Cys
                65                  70                  75
gcc gac cag acg ccc tgg gcg gtc aac gac aac ttc tcg tac ggc ttc      347
Ala Asp Gln Thr Pro Trp Ala Val Asn Asp Asn Phe Ser Tyr Gly Phe
            80                  85                  90
gca gcc acg gcc atc gcc ggc ggc tcc gag tcc agc tgg tgc tgc gcc      395
Ala Ala Thr Ala Ile Ala Gly Gly Ser Glu Ser Ser Trp Cys Cys Ala
        95                  100                 105
tgc tat gc  gtgagttctc tgcaagccgc ttcccacccc cgctttctgt              443
Cys Tyr Ala
    110
gcaggccgct tcccccctac ccacccactt cccccccccc gcctctgtga tcgggcatcc    503
gagctaagtt gcgtgtcgtc cag a ctc acc ttc aac tcg ggc ccc gtc gcg      554
                            Leu Thr Phe Asn Ser Gly Pro Val Ala
                                        115                 120
ggc aag acc atg gtg gtg cag tcg acc agc acc ggc ggc gac ctg ggc      602
Gly Lys Thr Met Val Val Gln Ser Thr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Gly
                125                 130                 135
agc aac cag ttc gac ctc gcc atc ccc ggc ggc ggc gtg ggc atc ttc      650
Ser Asn Gln Phe Asp Leu Ala Ile Pro Gly Gly Gly Val Gly Ile Phe
            140                 145                 150
aac ggc tgc gcc tcc cag ttc ggc ggc ctc ccc ggc gcc cag tac ggc      698
Asn Gly Cys Ala Ser Gln Phe Gly Gly Leu Pro Gly Ala Gln Tyr Gly
        155                 160                 165
ggc atc agc gac cgc agc cag tgc tcg tcc ttc ccc gcg ccg ctc cag      746
Gly Ile Ser Asp Arg Ser Gln Cys Ser Ser Phe Pro Ala Pro Leu Gln
    170                 175                 180
ccg ggc tgc cag tgg cgc ttc gac tgg ttc cag aac gcc gac aac ccc      794
Pro Gly Cys Gln Trp Arg Phe Asp Trp Phe Gln Asn Ala Asp Asn Pro
185                 190                 195                 200
acc ttc acc ttc cag cgc gtg cag tgc ccg tcc gag ctc acg tcc cgc      842
Thr Phe Thr Phe Gln Arg Val Gln Cys Pro Ser Glu Leu Thr Ser Arg
                205                 210                 215
acg ggc tgt aag cgc gac gac gac gcc agc tat ccc gtc ttc aac ccg      890
Thr Gly Cys Lys Arg Asp Asp Asp Ala Ser Tyr Pro Val Phe Asn Pro
            220                 225                 230
cct agc ggt tgactgca                                                 907
Pro Ser Gly
        235
<210>19
<211>235
<212>PRT
<213>Acremonium thermophilum
<400>19
Met Arg Ser Ser Pro Phe Leu Arg Ala Ala Leu Ala Ala Ala Leu Pro
1               5                   10                  15
Leu Ser Ala His Ala Leu Asp Gly Lys Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys
            20                  25                  30
Cys Lys Pro Ser Cys Gly Trp Ala Gly Lys Ala Ser Val Asn Gln Pro
        35                  40                  45
Val Phe Ser Cys Ser Ala Asp Trp Gln Arg Ile Ser Asp Phe Asn Ala
    50                  55                  60
Lys Ser Gly Cys Asp Gly Gly Ser Ala Tyr Ser Cys Ala Asp Gln Thr
65                  70                  75                  80
Pro Trp Ala Val Asn Asp Asn Phe Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Ala
                85                  90                  95
Ile Ala Gly Gly Ser Glu Ser Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Ala Leu
            100                 105                 110
Thr Phe Asn Ser Gly Pro Val Ala Gly Lys Thr Met Val Val Gln Ser
        115                 120                 125
Thr Ser Thr Gly Gly Asp Leu Gly Ser Asn Gln Phe Asp Leu Ala Ile
    130                 135                 140
Pro Gly Gly Gly Val Gly Ile Phe Asn Gly Cys Ala Ser Gln Phe Gly
145                 150                 155                 160
Gly Leu Pro Gly Ala Gln Tyr Gly Gly Ile Ser Asp Arg Ser Gln Cys
                165                 170                 175
Ser Ser Phe Pro Ala Pro Leu Gln Pro Gly Cys Gln Trp Arg Phe Asp
            180                 185                 190
Trp Phe Gln Asn Ala Asp Asn Pro Thr Phe Thr Phe Gln Arg Val Gln
        195                 200                 205
Cys Pro Ser Glu Leu Thr Ser Arg Thr Gly Cys Lys Arg Asp Asp Asp
    210                 215                 220
Ala Ser Tyr Pro Val Phe Asn Pro Pro Ser Gly
225                 230                 235
<210>20
<211>1175
<212>DNA
<213>Acremonium thermophilum
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(444)
<220>
<221>Intron
<222>(445)..(599)
<220>
<221>CDS
<222>(600)..(630)
<220>
<221>Intron
<222>(631)..(732)
<220>
<22l>CDS
<222>(733)..(1172)
<400>20
atg cgt ctc cca cta ccg act ctg ctc gcc ctc ttg ccc tac tac ctc    48
Met Arg Leu Pro Leu Pro Thr Leu Leu Ala Leu Leu Pro Tyr Tyr Leu
1               5                   10                  15
gaa gtg tcc gct cag ggg gca tcc gga acc ggc acg aca aca cgt tac    96
Glu Val Ser Ala Gln Gly Ala Ser Gly Thr Gly Thr Thr Thr Arg Tyr
            20                  25                  30
tgg gat tgc tgc aag ccg agc tgc gcg tgg cct ctg aag ggc aat tcg    144
Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys Ala Trp Pro Leu Lys Gly Asn Ser
        35                  40                  45
ccc agc ccg gtg cag act tgc gac aag aat gac agg ccg ctg aac gat    192
Pro Ser Pro Val Gln Thr Cys Asp Lys Asn Asp Arg Pro Leu Asn Asp
    50                  55                  60
ggg gga aac acc aag tcc ggc tgc gac aac ggt ggc ggg gcc ttc atg    240
Gly Gly Asn Thr Lys Ser Gly Cys Asp Asn Gly Gly Gly Ala Phe Met
65                  70                  75                  80
tgc tca tcc cag agt ccc tgg gcc gtc aat gag acc acc agc tac ggc    288
Cys Ser Ser Gln Ser Pro Trp Ala Val Asn Glu Thr Thr Ser Tyr Gly
                85                  90                  95
tgg gca gcc gtt cgt atc gcc ggc agt acc gag tcg gcc tgg tgc tgt    336
Trp Ala Ala Val Arg Ile Ala Gly Ser Thr Glu Ser Ala Trp Cys Cys
            100                 105                 110
gcc tgc tac gag ctc acc ttc acc agt ggg ccc gtc agt gga aag aag    384
Ala Cys Tyr Glu Leu Thr Phe Thr Ser Gly Pro Val Ser Gly Lys Lys
        115                 120                 125
ctc ata gtc cag gcc acg aac act ggt gga gac ctt ggg agc aac cac    432
Leu Ile Val Gln Ala Thr Asn Thr Gly Gly Asp Leu Gly Ser Asn His
    130                 135                 140
ttt gac ctt gcg gtatgtgggg tttttctttc ttcatcatcg ctctcaccat        484
Phe Asp Leu Ala
145
ggattcctcg gcgcaaggac caagattgag aagcgtcaat gccgggttgg acacgggagc    544
cgggatagga acacagaggc cgtttaagac cgtcagctga cagcagagca attag att     602
                                                             Ile
ccc gga ggt ggt gtt ggt cag tcc aat g gtaggttcct  tccctgaagt         650
Pro Gly Gly Gly Val Gly Gln Ser Asn
150                 155
accggcaaca gcctgtgcgt tgctgtatac cccttttaat catagcatct tcctgctgga    710
tacaagccaa cccattttct ag ct  tgc acg aac cag tat ggt gcg ccc ccg     761
                         Ala Cys Thr Asn Gln Tyr Gly Ala Pro Pro
                             160                 165
aac ggc tgg ggc gac agg tat ggt ggc gtg cac tcg cgg agc gac tgc      809
Asn Gly Trp Gly Asp Arg Tyr Gly Gly Val His Ser Arg Ser Asp Cys
    170                 175                 180
gac agc ttc ccc gcg gcg ctc aag gcc ggc tgc tac tgg cga ttc gac      857
Asp Ser Phe Pro Ala Ala Leu Lys Ala Gly Cys Tyr Trp Arg Phe Asp
185                 190                 195                 200
tgg ttc cag ggc gcc gac aac ccg tcc gtg agc ttc aaa cag gta gcc      905
Trp Phe Gln Gly Ala Asp Asn Pro Ser Val Ser Phe Lys Gln Val Ala
                205                 210                 215
tgc ccg gca gcc atc aca gct aag agc ggc tgt act cgc cag aac gat      953
Cys Pro Ala Ala Ile Thr Ala Lys Ser Gly Cys Thr Arg Gln Asn Asp
            220                 225                 230
gcc atc aac gag act ccg act ggg ccc agc ggt ggc tcc ccc agc acc      1001
Ala Ile Asn Glu Thr Pro Thr Gly Pro Ser Gly Gly Ser Pro Ser Thr
        235                 240                 245
acc agc acc acc acc agc tcc ccg tcc ggt ccc acg ggc aac cct cct      1049
Thr Ser Thr Thr Thr Ser Ser Pro Ser Gly Pro Thr Gly Asn Pro Pro
    250                 255                 260
gga ggc ggt ggc tgc act gcc cag aag tgg gcc cag tgc ggc ggc act      1097
Gly Gly Gly Gly Cys Thr Ala Gln Lys Trp Ala Gln Cys Gly Gly Thr
265                 270                 275                 280
ggc ttc acg ggc tgc acc acc tgc gtc tcg ggc acc acc tgc cag gtg    1145
Gly Phe Thr Gly Cys Thr Thr Cys Val Ser Gly Thr Thr Cys Gln Val
                285                 290                 295
cag aac cag tgg tat tcc cag tgt ctg tga                            1175
Gln Asn Gln Trp Tyr Ser Gln Cys Leu
            300                 305
<210>21
<211>305
<212>PRT
<213>Acremonium thermophilum
<400>21
Met Arg Leu Pro Leu Pro Thr Leu Leu Ala Leu Leu Pro Tyr Tyr Leu
1               5                   10                  15
Glu Val Ser Ala Gln Gly Ala Ser Gly Thr Gly Thr Thr Thr Arg Tyr
            20                  25                  30
Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser Cys Ala Trp Pro Leu Lys Gly Asn Ser
        35                  40                  45
Pro Ser Pro Val Gln Thr Cys Asp Lys Asn Asp Arg Pro Leu Asn Asp
    50                  55                  60
Gly Gly Asn Thr Lys Ser Gly Cys Asp Asn Gly Gly Gly Ala Phe Met
65                  70                  75                  80
Cys Ser Ser Gln Ser Pro Trp Ala Val Asn Glu Thr Thr Ser Tyr Gly
                85                  90                  95
Trp Ala Ala Val Arg Ile Ala Gly Ser Thr Glu Ser Ala Trp Cys Cys
            100                 105                 110
Ala Cys Tyr Glu Leu Thr Phe Thr Ser Gly Pro Val Ser Gly Lys Lys
        115                 120                 125
Leu Ile Val Gln Ala Thr Asn Thr Gly Gly Asp Leu Gly Ser Asn His
    130                 135                 140
Phe Asp Leu Ala Ile Pro Gly Gly Gly Val Gly Gln Ser Asn Ala Cys
145                 150                 155                 160
Thr Asn Gln Tyr Gly Ala Pro Pro Asn Gly Trp Gly Asp Arg Tyr Gly
                165                 170                 175
Gly Val His Ser Arg Ser Asp Cys Asp Ser Phe Pro Ala Ala Leu Lys
            180                 185                 190
Ala Gly Cys Tyr Trp Arg Phe Asp Trp Phe Gln Gly Ala Asp Asn Pro
        195                 200                 205
Ser Val Ser Phe Lys Gln Val Ala Cys Pro Ala Ala Ile Thr Ala Lys
    210                 215                 220
Ser Gly Cys Thr Arg Gln Asn Asp Ala Ile Asn Glu Thr Pro Thr Gly
225                 230                 235                 240
Pro Ser Gly Gly Ser Pro Ser Thr Thr Ser Thr Thr Thr Ser Ser Pro
                245                 250                 255
Ser Gly Pro Thr Gly Asn Pro Pro Gly Gly Gly Gly Cys Thr Ala Gln
            260                 265                 270
Lys Trp Ala Gln Cys Gly Gly Thr Gly Phe Thr Gly Cys Thr Thr Cys
        275                 280                 285
Val Ser Gly Thr Thr Cys Gln Val Gln Asn Gln Trp Tyr Ser Gln Cys
    290                 295                 300
Leu
305
<210>22
<211>89
<212>DNA
<213>Acremonium thermophilum
<400>22
attaaccgcg gactgcgcat catgtatcgg aagttggccg tcatctcggc cttcttggcc    60
acagctcgtg ccctcgacgg aaagtcgac                                      89
<210>23
<211>20
<212>DNA
<213>Acremonium thermophilum
<400>23
tcgactgcac  caccatggtc    20
<210>24
<211>68
<212>PRT
<213>Trichoderma reesei
<400>24
Gly Asn Pro Ser Gly Gly Asn Pro Pro Gly Gly Asn Pro Pro Gly Thr
1               5                   10                  15
Thr Thr Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr Thr Gly Ser Ser Pro Gly Pro
            20                  25                  30
Thr Gln Ser His Tyr Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Tyr Ser Gly Pro
        35                  40                  45
Thr Val Cys Ala Ser Gly Thr Thr Cys Gln Val Leu Asn Pro Tyr Tyr
    50                  55                  60
Ser Gln Cys Leu
65
<210>25
<211>70
<212>PRT
<213>Acremonium thermophilum
<400>25
Gly Gly Asn Pro Pro Pro Val Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr
1               5                   10                  15
Ser Lys Pro Ser Gln Pro Thr Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ser Pro Gln
            20                  25                  30
Gly Pro Gln Gln Thr His Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Trp Thr
        35                  40                  45
Gly Pro Gln Ser Cys Gln Ser Pro Trp Thr Cys Gln Lys Gln Asn Asp
    50                  55                  60
Trp Tyr Ser Gln Cys Leu
65                  70
<210>26
<211>81
<212>PRT
<213>Chaetomium thermophilum
<400>26
Val Pro Gly Leu Asp Gly Ser Asn Pro Gly Asn Pro Thr Thr Thr Val
1               5                   10                  15
Val Pro Pro Ala Ser Thr Ser Thr Ser Arg Pro Thr Ser Ser Thr Ser
            20                  25                  30
Ser Pro Val Ser Thr Pro Thr Gly Gln Pro Gly Gly Cys Thr Thr Gln
        35                  40                  45
Lys Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Tyr Thr Gly Cys Thr Asn Cys
    50                  55                  60
Val Ala Gly Thr Thr Cys Thr Gln Leu Asn Pro Trp Tyr Ser Gln Cys
65                  70                  75                  80
Leu
<210>27
<211>1675
<212>DNA
<213>Trichoderma reesei
<220>
<221>Intron
<222>(462)..(528)
<220>
<221>Intron
<222>(1226)..(1288)
<400>27
atgtatcgga agttggccgt catctcggcc ttcttggcca cagctcgtgc tcagtcggcc    60
tgcactctcc aatcggagac tcacccgcct ctgacatggc agaaatgctc gtctggtggc    120
acttgcactc aacagacagg ctccgtggtc atcgacgcca actggcgctg gactcacgct    180
acgaacagca gcacgaactg ctacgatggc aacacttgga gctcgaccct atgtcctgac    240
aacgagacct gcgcgaagaa ctgctgtctg gacggtgccg cctacgcgtc cacgtacgga    300
gttaccacga gcggtaacag cctctccatt ggctttgtca cccagtctgc gcagaagaac    360
gttggcgctc gcctttacct tatgggcagc gacacgacct accaggaatt caccctgctt    420
ggcaacgagt tctctttcga tgttgatgtt tcgcagctgc cgtaagtgac ttaccatgaa    480
cccctgacgt atcttcttgt gggctcccag ctgactggcc aatttaaggt gcggcttgaa    540
cggagctctc tacttcgtgt ccatggacgc ggatggtggc gtgagcaagt atcccaccaa    600
caccgctggc gccaagtacg gcacggggta ctgtgacagc cagtgtcccc gcgatctgaa    660
gttcatcaat ggccaggcca acgttgaggg ctgggagccg tcatccaaca acgcaaacac    720
gggcattgga ggacacggaa gctgctgctc tgagatggat atctgggagg ccaactccat    780
ctccgaggct cttacccccc acccttgcac gactgtcggc caggagatct gcgagggtga    840
tgggtgcggc ggaacttact ccgataacag atatggcggc acttgcgatc ccgatggctg    900
cgactggaac ccataccgcc tgggcaacac cagcttctac ggccctggct caagctttac    960
cctcgatacc accaagaaat tgaccgttgt cacccagtcc gagacgtcgg gtgccatcaa    1020
ccgatactat gtccagaatg gcgtcacttt ccagcagccc aacgccgagc ttggtagtta    1080
ctctggcaac gagctcaacg atgattactg cacagctgag gaggcagaat tcggcggatc    1140
ctctttctca gacaagggcg gcctgactca gttcaagaag gctacctctg gcggcatggt    1200
tctggtcatg agtctgtggg atgatgtgag tttgatggac aaacatgcgc gttgacaaag    1260
agtcaagcag ctgactgaga tgttacagta ctacgccaac atgctgtggc tggactccac    1320
ctacccgaca aacgagacct cctccacacc cggtgccgtg cgcggaagct gctccaccag    1380
ctccggtgtc cctgctcagg tcgaatctca gtctcccaac gccaaggtca ccttctccaa    1440
catcaagttc ggacccattg gcagcaccgg caaccctagc ggcggcaacc ctcccggcgg    1500
aaacccgcct ggcaccacca ccacccgccg cccagccact accactggaa gctctcccgg    1560
acctacccag tctcactacg gccagtgcgg cggtattggc tacagcggcc ccacggtctg    1620
cgccagcggc acaacttgcc aggtcctgaa cccttactac tctcagtgcc tgtaa         1675
<210>28
<211>1471
<212>DNA
<213>Acremonium thermophilum
<220>
<221>Intron
<222>(338)..(472)
<220>
<221>Intron
<222>(699)..(783)
<400>28
atgcgcgcca agcaactcct ggcggccggc ctgctggccc ccgcgtccgt ctcggcccag    60
ctcaacagcc tcgccgtggc ggctggcctc aagtacttcg gcacggccgt gcgggaggcc    120
aacgtcaacg gcgacgccac ctacatgtcg tacgtcaaca acaagtccga gttcggccag    180
gtgacgcccg agaacggcca gaagtgggat tccaccgagc ccagccaggg ccagttcagc    240
tacagccagg gcgacatcgt ccccggcgtc gcgaagaaga acggccaggt gctgcgctgc    300
cacaccctgg tgtggtacag ccagctcccc agctggggtc agtgactctc tctttctctc    360
tgtctttctc tttgtctttc tctctttctc tctctctctc tctctctctc tctctctctc    420
tctcccatcc agcatcgact gctgatcttg ctgaccagaa gctcgtgtgc agtgtcatcc    480
ggaagttgga cccgcgcgac gcttcagtcc gtcatcgaga cgcacatctc gaacgtgatg    540
ggccactaca agggccagtg ctacgcctgg gacgtggtca acgaggccat caacgacgac    600
ggcacgtggc ggaccagcgt cttctacaac accttcaaca ccgactacct ggccattgcc    660
ttcaacgccg cgaagaaggc cgatgcgggc gcgaagctgt aggtgtcggc ctttacgttg    720
ccgcagcgca cctccgcgac atgagcccca gagcgcgtgg ctaatagttc ctcacgcacg    780
caggtactac aacgactaca atctcgagta caacggcgcc aagaccaaca cggccgtgca    840
gctggtgcag atcgtgcagc aggccggcgc gcccatcgac ggggtgggct tccagggcca    900
cctgatcgtg gggtcaacgc cgtcgcgcag ctccctggcc acggcgctga agcgcttcac    960
ggcgcttggc ctggaggtgg cgtacacgga gctggacatc cggcactcga gcctgccgcc    1020
gtcgtcggcg gcgctggcga cgcagggcaa cgacttcgcc agcgtggtgg gctcgtgcct    1080
cgacgtggcg ggctgcgtgg gcatcaccat ctgggggttc acggacaagt acagctgggt    1140
gcccgacacg ttccccggct cgggcgcggc gctgctgtac gacgcgaact acagcaagaa    1200
gccggcgtgg acgtcggtct cgtcggtgct ggcggccaag gcgacgaacc cgcccggcgg    1260
cgggaaccca ccccccgtca ccaccacgac cacgaccacg accacgtcga agccgtcgca    1320
gcccaccacc acgaccacga ccaccagccc gcagggtccg cagcagacgc actggggcca    1380
gtgcggcggg atcggctgga cggggccgca gtcgtgccag agcccgtgga cgtgccagaa    1440
gcagaacgac tggtactctc agtgcctgtg a                                   1471
<210>29
<211>1663
<212>DNA
<213>Chaetomium thermophilum
<220>
<221>Intron
<222>(1591)..(1654)
<400>29
atgatgtata agaagttcgc cgctctcgcc gccctcgtgg ctggcgcctc cgcccagcag    60
gcttgctccc tcaccgctga gaaccaccct agcctcacct ggaagcgctg cacctctggc    120
ggcagctgct cgaccgtgaa cggcgccgtc accatcgatg ccaactggcg ctggactcac    180
accgtctccg gctcgaccaa ctgctacacc ggcaaccagt gggatacctc cctctgcact    240
gatggcaaga gctgcgccca gacctgctgc gtcgatggcg ctgactactc ttcgacctat    300
ggtatcacca ccagcggtga ctccctgaac ctcaagttcg tcaccaagca ccagtacggc    360
accaacgtcg gctcccgtgt ctatctgatg gagaacgaca ccaagtacca gatgttcgag    420
ctcctcggca acgagttcac cttcgatgtc gatgtctcca acctgggctg cggtctcaac    480
ggcgccctct acttcgtttc catggatgct gatggtggca tgagcaaata ctctggcaac    540
aaggctggcg ccaagtacgg taccggctac tgcgatgctc agtgcccgcg cgacctcaag    600
ttcatcaacg gcgaggccaa cgttgggaac tggaccccct cgaccaacga tgccaacgcc    660
ggcttcggcc gctatggcag ctgctgctct gagatggatg tctgggaggc caacaacatg    720
gctactgcct tcactcctca cccttgcacc accgttggcc agagccgctg cgaggccgac    780
acctgcggtg gcacctacag ctctgaccgc tatgctggtg tttgcgaccc tgatggctgc    840
gacttcaacg cctaccgcca aggcgacaag accttctacg gcaagggcat gactgtcgac    900
accaacaaga agatgaccgt cgtcacccag ttccacaaga actcggctgg cgtcctcagc    960
gagatcaagc gcttctacgt ccaggacggc aagatcattg ccaacgctga gtccaagatc    1020
cccggcaacc ccggaaactc cattacccag gagtattgcg atgcccagaa ggtcgccttc    1080
agtaacaccg atgacttcaa ccgcaagggc ggtatggctc agatgagcaa ggccctcgca    1140
ggccccatgg tcctggtcat gtccgtctgg gatgaccact acgccaacat gctctggctc    1200
gactcgacct accccatcga ccaggccggc gcccccggcg ccgagcgcgg tgcttgcccg    1260
accacctccg gtgtccctgc cgagatcgag gcccaggtcc ccaacagcaa cgtcatcttc    1320
tccaacatcc gtttcggccc catcggctcg accgtccctg gccttgacgg cagcaacccc    1380
ggcaacccga ccaccaccgt cgttcctccc gcttctacct ccacctcccg tccgaccagc    1440
agcactagct ctcccgtttc gaccccgact ggccagcccg gcggctgcac cacccagaag    1500
tggggccagt gcggcggtat cggctacacc ggctgcacta actgcgttgc tggcaccacc    1560
tgcactcagc tcaacccctg gtacagccag gtatgtttct cttccccctt ctagactcgc    1620
ttggatttga cagttgctaa catctgctca acagtgcctg taa                      1663
<210>30
<211>39
<212>DNA
<213>Trichoderma reesei
<400>30
ttggatccga gtcgcagcgg caaccctagc ggcggcaac    39
<210>31
<211>30
<212>DNA
<213>Trichoderma reesei
<400>31
taattctgca gttacaggca ctgagagtag    30
<210>32
<211>41
<212>DNA
<213>Acremonium thermophilum
<400>32
ttggatccga gtcgcagcgg cgggaaccca ccccccgtca c    41
<210>33
<211>34
<212>DNA
<213>Acremonium thermophilum
<400>33
taattctgca gtcacaggca ctgagagtac cagt    34
<210>34
<211>28
<212>DNA
<213>Chaetomium thermophilum
<400>34
taatttacgt acctggcctt gacggcag    28
<210>35
<211>30
<212>DNA
<213>Chaetomium thermophilum
<400>35
attaactgca gttacaggca ctgttgagca    30
<210>36
<211>1096
<212>DNA
<213>Acremonium thermophilum
<220>
<221>gene
<222>(13)..(1091)
<220>
<221>Intron
<222>(84)..(142)
<220>
<221>Intron
<222>(392)..(514)
<400>36
ggactgcgca tcatgtatcg gaagttggcc gtcatctcgg ccttcttggc cacagctcgt    60
gccctcgacg gaaagtcgac gaggtatgcc aatcctcgta cctctgccct ctgtagaaac    120
aagtgaccga ctgcaaagac agatactggg actgctgcaa gccgtcctgc ggctgggccg    180
gaaaggcctc ggtgaaccag cccgtcttct cgtgctcggc cgactggcag cgcatcagcg    240
acttcaacgc gaagtcgggc tgcgacggag gctccgccta ctcgtgcgcc gaccagacgc    300
cctgggcggt caacgacaac ttctcgtacg gcttcgcagc cacggccatc gccggcggct    360
ccgagtccag ctggtgctgc gcctgctatg cgtgagttct ctgcaagccg cttcccaccc    420
ccgctttctg tgcaggccgc ttccccccta cccacccact tccccccccc cgcctctgtg    480
atcgggcatc cgagctaagt tgcgtgtcgt ccagactcac cttcaactcg ggccccgtcg    540
cgggcaagac catggtggtg cagtcgacca gcaccggcgg cgacctgggc agcaaccagt    600
tcgacctcgc catccccggc ggcggcgtgg gcatcttcaa cggctgcgcc tcccagttcg    660
gcggcctccc cggcgcccag tacggcggca tcagcgaccg cagccagtgc tcgtccttcc    720
ccgcgccgct ccagccgggc tgccagtggc gcttcgactg gttccagaac gccgacaacc    780
ccaccttcac cttccagcgc gtgcagtgcc cgtccgagct cacgtcccgc acgggctgta    840
agcgcgacga cgacgccagc tatcccgtct tcaacccgcc ttcgggcaac cctagcggcg    900
gcaaccctcc cggcggaaac ccgcctggca ccaccaccac ccgccgccca gccactacca    960
ctggaagctc tcccggacct acccagtctc actacggcca gtgcggcggt attggctaca    1020
gcggccccac ggtctgcgcc agcggcacaa cttgccaggt cctgaaccct tactactctc    1080
agtgcctgta actgca                                                    1096
<210>37
<211>1102
<212>DNA
<213>Acremonium thermophilum
<220>
<221>gene
<222>(13)..(1097)
<220>
<221>Intron
<222>(84)..(142)
<220>
<221>Intron
<222>(392)..(514)
<400>37
ggactgcgca tcatgtatcg gaagttggcc gtcatctcgg ccttcttggc cacagctcgt    60
gccctcgacg gaaagtcgac gaggtatgcc aatcctcgta cctctgccct ctgtagaaac    120
aagtgaccga ctgcaaagac agatactggg actgctgcaa gccgtcctgc ggctgggccg    180
gaaaggcctc ggtgaaccag cccgtcttct cgtgctcggc cgactggcag cgcatcagcg    240
acttcaacgc gaagtcgggc tgcgacggag gctccgccta ctcgtgcgcc gaccagacgc    300
cctgggcggt caacgacaac ttctcgtacg gcttcgcagc cacggccatc gccggcggct    360
ccgagtccag ctggtgctgc gcctgctatg cgtgagttct ctgcaagccg cttcccaccc    420
ccgctttctg tgcaggccgc ttccccccta cccacccact tccccccccc cgcctctgtg    480
atcgggcatc cgagctaagt tgcgtgtcgt ccagactcac cttcaactcg ggccccgtcg    540
cgggcaagac catggtggtg cagtcgacca gcaccggcgg cgacctgggc agcaaccagt    600
tcgacctcgc catccccggc ggcggcgtgg gcatcttcaa cggctgcgcc tcccagttcg    660
gcggcctccc cggcgcccag tacggcggca tcagcgaccg cagccagtgc tcgtccttcc    720
ccgcgccgct ccagccgggc tgccagtggc gcttcgactg gttccagaac gccgacaacc    780
ccaccttcac cttccagcgc gtgcagtgcc cgtccgagct cacgtcccgc acgggctgta    840
agcgcgacga cgacgccagc tatcccgtct tcaacccgcc ttcgggcggg aacccacccc    900
ccgtcaccac cacgaccacg accacgacca cgtcgaagcc gtcgcagccc accaccacga    960
ccacgaccac cagcccgcag ggtccgcagc agacgcactg gggccagtgc ggcgggatcg    1020
gctggacggg gccgcagtcg tgccagagcc cgtggacgtg ccagaagcag aacgactggt    1080
actctcagtg cctgtgactg ca                                             1102
<210>38
<211>1199
<212>DNA
<213>Acremonium thermophilum
<220>
<221>gene
<222>(13)..(1194)
<220>
<221>Intron
<222>(84)..(142)
<220>
<221>Intron
<222>(392)..(514)
<220>
<221>Intron
<222>(1122)..(1185)
<400>38
ggactgcgca tcatgtatcg gaagttggcc gtcatctcgg ccttcttggc cacagctcgt    60
gccctcgacg gaaagtcgac gaggtatgcc aatcctcgta cctctgccct ctgtagaaac    120
aagtgaccga ctgcaaagac agatactggg actgctgcaa gccgtcctgc ggctgggccg    180
gaaaggcctc ggtgaaccag cccgtcttct cgtgctcggc cgactggcag cgcatcagcg    240
acttcaacgc gaagtcgggc tgcgacggag gctccgccta ctcgtgcgcc gaccagacgc    300
cctgggcggt caacgacaac ttctcgtacg gcttcgcagc cacggccatc gccggcggct    360
ccgagtccag ctggtgctgc gcctgctatg cgtgagttct ctgcaagccg cttcccaccc    420
ccgctttctg tgcaggccgc ttccccccta cccacccact tccccccccc cgcctctgtg    480
atcgggcatc cgagctaagt tgcgtgtcgt ccagactcac cttcaactcg ggccccgtcg    540
cgggcaagac catggtggtg cagtcgacca gcaccggcgg cgacctgggc agcaaccagt    600
tcgacctcgc catccccggc ggcggcgtgg gcatcttcaa cggctgcgcc tcccagttcg    660
gcggcctccc cggcgcccag tacggcggca tcagcgaccg cagccagtgc tcgtccttcc    720
ccgcgccgct ccagccgggc tgccagtggc gcttcgactg gttccagaac gccgacaacc    780
ccaccttcac cttccagcgc gtgcagtgcc cgtccgagct cacgtcccgc acgggctgta    840
agcgcgacga cgacgccagc tatcccgtct tcaacccgcc ttcggtacct ggccttgacg    900
gcagcaaccc cggcaacccg accaccaccg tcgttcctcc cgcttctacc tccacctccc    960
gtccgaccag cagcactagc tctcccgttt cgaccccgac tggccagccc ggcggctgca    1020
ccacccagaa gtggggccag tgcggcggta tcggctacac cggctgcact aactgcgttg    1080
ctggcaccac ctgcactcag ctcaacccct ggtacagcca ggtatgtttc tcttccccct    1140
tctagactcg cttggatttg acagttgcta acatctgctc aacagtgcct gtaactgca     1199
<210>39
<211>298
<212>PRT
<213>Acremonium thermophilum
<400>39
Met Tyr Arg Lys Leu Ala Val Ile Ser Ala Phe Leu Ala Thr Ala Arg
1               5                   10                  15
Ala Leu Asp Gly Lys Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser
            20                  25                  30
Cys Gly Trp Ala Gly Lys Ala Ser Val Asn Gln Pro Val Phe Ser Cys
        35                  40                  45
Ser Ala Asp Trp Gln Arg Ile Ser Asp Phe Asn Ala Lys Ser Gly Cys
    50                  55                  60
Asp Gly Gly Ser Ala Tyr Ser Cys Ala Asp Gln Thr Pro Trp Ala Val
65                  70                  75                  80
Asn Asp Asn Phe Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Ala Ile Ala Gly Gly
                85                  90                  95
Ser Glu Ser Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Ala Leu Thr Phe Asn Ser
            100                 105                 110
Gly Pro Val Ala Gly Lys Thr Met Val Val Gln Ser Thr Ser Thr Gly
        115                 120                 125
Gly Asp Leu Gly Ser Asn Gln Phe Asp Leu Ala Ile Pro Gly Gly Gly
    130                 135                 140
Val Gly Ile Phe Asn Gly Cys Ala Ser Gln Phe Gly Gly Leu Pro Gly
145                 150                 155                 160
Ala Gln Tyr Gly Gly Ile Ser Asp Arg Ser Gln Cys Ser Ser Phe Pro
                165                 170                 175
Ala Pro Leu Gln Pro Gly Cys Gln Trp Arg Phe Asp Trp Phe Gln Asn
            180                 185                 190
Ala Asp Asn Pro Thr Phe Thr Phe Gln Arg Val Gln Cys Pro Ser Glu
        195                 200                 205
Leu Thr Ser Arg Thr Gly Cys Lys Arg Asp Asp Asp Ala Ser Tyr Pro
    210                 215                 220
Val Phe Asn Pro Pro Ser Gly Asn Pro Ser Gly Gly Asn Pro Pro Gly
225                 230                 235                 240
Gly Asn Pro Pro Gly Thr Thr Thr Thr Arg Arg Pro Ala Thr Thr Thr
                245                 250                 255
Gly Ser Ser Pro Gly Pro Thr Gln Ser His Tyr Gly Gln Cys Gly Gly
            260                 265                 270
Ile Gly Tyr Ser Gly Pro Thr Val Cys Ala Ser Gly Thr Thr Cys Gln
        275                 280                 285
Val Leu Asn Pro Tyr Tyr Ser Gln Cys Leu
    290                 295
<210>40
<211>300
<212>PRT
<213>Acremonium thermophilum
<400>40
Met Tyr Arg Lys Leu Ala Val Ile Ser Ala Phe Leu Ala Thr Ala Arg
1               5                   10                  15
Ala Leu Asp Gly Lys Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser
            20                  25                  30
Cys Gly Trp Ala Gly Lys Ala Ser Val Asn Gln Pro Val Phe Ser Cys
        35                  40                  45
Ser Ala Asp Trp Gln Arg Ile Ser Asp Phe Asn Ala Lys Ser Gly Cys
    50                  55                  60
Asp Gly Gly Ser Ala Tyr Ser Cys Ala Asp Gln Thr Pro Trp Ala Val
65                  70                  75                  80
Asn Asp Asn Phe Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Ala Ile Ala Gly Gly
                85                  90                  95
Ser Glu Ser Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Ala Leu Thr Phe Asn Ser
            100                 105                 110
Gly Pro Val Ala Gly Lys Thr Met Val Val Gln Ser Thr Ser Thr Gly
        115                 120                 125
Gly Asp Leu Gly Ser Asn Gln Phe Asp Leu Ala Ile Pro Gly Gly Gly
    130                 135                 140
Val Gly Ile Phe Asn Gly Cys Ala Ser Gln Phe Gly Gly Leu Pro Gly
145                 150                 155                 160
Ala Gln Tyr Gly Gly Ile Ser Asp Arg Ser Gln Cys Ser Ser Phe Pro
                165                 170                 175
Ala Pro Leu Gln Pro Gly Cys Gln Trp Arg Phe Asp Trp Phe Gln Asn
            180                 185                 190
Ala Asp Asn Pro Thr Phe Thr Phe Gln Arg Val Gln Cys Pro Ser Glu
        195                 200                 205
Leu Thr Ser Arg Thr Gly Cys Lys Arg Asp Asp Asp Ala Ser Tyr Pro
    210                 215                 220
Val Phe Asn Pro Pro Ser Gly Gly Asn Pro Pro Pro Val Thr Thr Thr
225                 230                 235                 240
Thr Thr Thr Thr Thr Thr Ser Lys Pro Ser Gln Pro Thr Thr Thr Thr
                245                 250                 255
Thr Thr Thr Ser Pro Gln Gly Pro Gln Gln Thr His Trp Gly Gln Cys
            260                 265                 270
Gly Gly Ile Gly Trp Thr Gly Pro Gln Ser Cys Gln Ser Pro Trp Thr
        275                 280                 285
Cys Gln Lys Gln Asn Asp Trp Tyr Ser Gln Cys Leu
    290                 295                 300
<210>41
<211>311
<212>PRT
<213>Acremonium thermophilum
<400>41
Met Tyr Arg Lys Leu Ala Val Ile Ser Ala Phe Leu Ala Thr Ala Arg
1               5                   10                  15
Ala Leu Asp Gly Lys Ser Thr Arg Tyr Trp Asp Cys Cys Lys Pro Ser
            20                  25                  30
Cys Gly Trp Ala Gly Lys Ala Ser Val Asn Gln Pro Val Phe Ser Cys
        35                  40                  45
Ser Ala Asp Trp Gln Arg Ile Ser Asp Phe Asn Ala Lys Ser Gly Cys
    50                  55                  60
Asp Gly Gly Ser Ala Tyr Ser Cys Ala Asp Gln Thr Pro Trp Ala Val
65                  70                  75                  80
Asn Asp Asn Phe Ser Tyr Gly Phe Ala Ala Thr Ala Ile Ala Gly Gly
                85                  90                  95
Ser Glu Ser Ser Trp Cys Cys Ala Cys Tyr Ala Leu Thr Phe Asn Ser
            100                 105                 110
Gly Pro Val Ala Gly Lys Thr Met Val Val Gln Ser Thr Ser Thr Gly
        115                 120                 125
Gly Asp Leu Gly Ser Asn Gln Phe Asp Leu Ala Ile Pro Gly Gly Gly
    130                 135                 140
Val Gly Ile Phe Asn Gly Cys Ala Ser Gln Phe Gly Gly Leu Pro Gly
145                 150                 155                 160
Ala Gln Tyr Gly Gly Ile Ser Asp Arg Ser Gln Cys Ser Ser Phe Pro
                165                 170                 175
Ala Pro Leu Gln Pro Gly Cys Gln Trp Arg Phe Asp Trp Phe Gln Asn
            180                 185                 190
Ala Asp Asn Pro Thr Phe Thr Phe Gln Arg Val Gln Cys Pro Ser Glu
        195                 200                 205
Leu Thr Ser Arg Thr Gly Cys Lys Arg Asp Asp Asp Ala Ser Tyr Pro
    210                 215                 220
Val Phe Asn Pro Pro Ser Val Pro Gly Leu Asp Gly Ser Asn Pro Gly
225                 230                 235                 240
Asn Pro Thr Thr Thr Val Val Pro Pro Ala Ser Thr Ser Thr Ser Arg
                245                 250                 255
Pro Thr Ser Ser Thr Ser Ser Pro Val Ser Thr Pro Thr Gly Gln Pro
            260                 265                 270
Gly Gly Cys Thr Thr Gln Lys Trp Gly Gln Cys Gly Gly Ile Gly Tyr
        275                 280                 285
Thr Gly Cys Thr Asn Cys Val Ala Gly Thr Thr Cys Thr Gln Leu Asn
    290                 295                 300
Pro Trp Tyr Ser Gln Cys Leu
305                 310
<210>42
<211>20
<212>DNA
<213>Acremonium thermophilum
<400>42
gcagcaacca gttcgacctc    20
<210>43
<211>36
<212>DNA
<213>Acremonium thermophilum
<400>43
ttaactgcag tcactgggca gtgcagccac cgcctc    36
<210>44
<211>20
<212>DNA
<213>Acremonium thermophilum
<400>44
actgctgcaa gccgtcctgc    20
<210>45
<211>41
<212>DNA
<213>Acremonium thermophilum
<400>45
ttaactgcag tcaaccgcta ggcgggttga agacgggata g    41

Claims (31)

1.包含具有纤维素分解活性的片段的内切葡聚糖酶多肽，所述多肽选自：
a)包含与SEQ ID NO：2具有至少78％序列同一性的氨基酸序列或与SEQ ID NO：4具有至少68％序列同一性的氨基酸序列的多肽；
b)包含具有纤维素分解活性的片段的a)的变体；以及
c)具有纤维素分解活性的a)或b)的片段。
2.权利要求1的内切葡聚糖酶多肽，其中所述氨基酸序列与SEQID NO：2具有至少80％、优选85％、更优选90％、更加优选95％、最优选98％的序列同一性。
3.权利要求1的内切葡聚糖酶多肽，其中所述氨基酸序列与SEQID NO：4具有至少70％、优选75％、更优选80％、更加优选85％、更加优选90％、最优选95％的序列同一性。
4.权利要求1的内切葡聚糖酶多肽，其中所述氨基酸序列具有SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4。
5.权利要求1的内切葡聚糖酶多肽，其中所述片段具有SEQ IDNO：17或SEQ ID NO：19的氨基酸序列。
6.权利要求1的内切葡聚糖酶多肽，可以从枝顶孢霉(Acremonium sp.)、优选从嗜热枝顶孢霉(Acremonium.thermophilum)获得或源自于它们。
7.权利要求1的内切葡聚糖酶多肽，其中的枝顶孢霉为CBS116240。
8.包含多肽的纤维素分解活性片段的内切葡聚糖酶融合蛋白，所述多肽具有与SEQ ID NO：2具有至少78％序列同一性的氨基酸序列，所述多肽与异源的碳水化合物结合结构域(CBD)连接。
9.权利要求8的内切葡聚糖酶融合蛋白，还包含异源的接头区。
10.权利要求8或9的内切葡聚糖酶融合蛋白，其中所述CBD和任选的接头区源自里氏木霉(Trichoderma reesei)CBHI、嗜热毛壳菌(Chaetomium thermophilum)CBHI或枝顶孢霉的木聚糖酶。
11.权利要求10的内切葡聚糖酶融合蛋白，其中融合蛋白具有选自如下的氨基酸序列：与SEQ ID NO：39具有至少71％序列同一性、与SEQ ID NO：40具有至少69％序列同一性、和与SEQ ID NO：41具有至少69％序列同一性的氨基酸序列。
12.权利要求10的内切葡聚糖酶融合蛋白，其中所述融合蛋白具有选自SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：40和SEQ ID NO：41的氨基酸序列。
13.内切葡聚糖酶融合蛋白，包含源自多肽的氨基酸序列，所述多肽包括与SEQ ID NO：4具有至少68％的序列同一性并与碳水化合物结合结构域(CBD)连接。
14.权利要求13的内切葡聚糖酶融合蛋白，还包含接头区。
15.权利要求13的内切葡聚糖酶融合蛋白，包含SEQ ID NO：4的氨基酸序列，所述序列与CBD连接，所述CBD源于包含具有SEQ IDNO：2的氨基酸序列的多肽。
16.权利要求13的内切葡聚糖酶融合蛋白，其中所述内切葡聚糖酶融合蛋白具有SEQ ID NO：21。
17.分离的多核苷酸，编码权利要求1到7任一项的内切葡聚糖酶多肽或权利要求8到16任一项的内切葡聚糖酶融合蛋白。
18.权利要求17的分离的多核苷酸，具有选自如下的核苷酸序列：
a)SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：37或SEQ ID NO：38的核苷酸序列；
b)a)的互补链；
c)包含至少20个核苷酸的a)或b)的片段；以及
d)作为遗传密码的结果与a)、b)或c)中定义的序列中的任一项简并的序列。
19.表达载体，包含编码权利要求1到7任一项中的内切葡聚糖酶多肽或权利要求8到16任一项中的内切葡聚糖酶融合蛋白的多核苷酸序列。
20.包含权利要求19的表达载体的宿主细胞。
21.权利要求20的宿主细胞，是真菌来源的宿主细胞。
22.权利要求21的宿主细胞，是里氏木霉。
23.用于生产权利要求1到7任一项的内切葡聚糖酶多肽或权利要求8到16任一项的内切葡聚糖酶融合蛋白的方法，包括培养权利要求20到22任一项的宿主细胞的步骤。
24.酶制品，包含权利要求1到7任一项的内切葡聚糖酶多肽或权利要求8到16任一项的内切葡聚糖酶融合蛋白。
25.生物石洗的方法，包括向含织物或衣物例如粗斜棉布中加入权利要求1到7任一项的内切葡聚糖酶多肽或权利要求8到16任一项的内切葡聚糖酶融合蛋白或权利要求24的制品的步骤。
26.生物整理的方法，包括向纺织品材料例如织物或衣物或纱中加入权利要求1到7任一项的内切葡聚糖酶多肽或权利要求8到16任一项的内切葡聚糖酶融合蛋白或权利要求24的制品的步骤。
27.洗涤剂组合物，含有权利要求1到7任一项的内切葡聚糖酶多肽或权利要求8到16任一项的内切葡聚糖酶融合蛋白或权利要求24的制品，以及辅助剂例如表面活性剂(surface active agents)、表面活性剂(surfactants)、漂白剂或增效剂。
28.处理含有纤维素纤维的纺织品材料的方法，其中所述方法包括将所述纺织品材料与权利要求27中的洗涤剂组合物相接触。
29.处理木质来源的纸浆或纤维的方法，包括向木质来源的机械或化学纸浆或二次纤维中加入权利要求1到7任一项的内切葡聚糖酶多肽或权利要求8到16任一项的内切葡聚糖酶融合蛋白或权利要求24的制品的步骤。
30.改善动物饲料的质量的方法，包括用权利要求1到7任一项的内切葡聚糖酶多肽或权利要求8到16任一项的内切葡聚糖酶融合蛋白或权利要求24的制品处理植物材料。
31.登记号为DSM 17324、DSM 17323、DSM 18813、DSM 18814、DSM 18815、DSM 18816或DSM 18817的大肠杆菌(Escherichia coli)菌株。
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