CN101906406B - 具有内切葡聚糖酶/木聚糖酶活性的双功能酶及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明属生物工程技术领域，具体为一种具有内切葡聚糖酶/木聚糖酶活性的双功能酶(RuCelA)及其制备方法与应用。RuCelA来源于中国牦牛瘤胃未培养微生物，RuCelA对磷酸纤维素、滤纸具有一定的活性。RuCelA不仅可以水解多聚糖，也可以水解三糖得到单糖；同时RuCelA与木糖苷酶具有协同降解木聚糖的协同作用；利用RuCelA还可以实现对预处理过的木质纤维素的单酶降解。本发明的双功能酶RuCelA可广泛应用于纤维素的降解，包括纤维素生物转化、化工、纺织、食品、生物能源、饲料添加、医药工业方面应用等。

Description

具有内切葡聚糖酶/木聚糖酶活性的双功能酶及其制备方法与应用

技术领域

本发明属生物工程技术领域，涉及一种新的具有内切葡聚糖酶和木聚糖酶活性的双功能纤维素降解酶RuCelA及其制备方法和应用。

背景技术

随着世界能源日益紧缺，开发可再生的生物能源越来越受到人们的关注。木质纤维素是自然界中储量最丰富的可再生资源，利用纤维素酶及半纤维素酶等能够将植物纤维降解成可发酵的糖，然而自然条件下的木质纤维素难于降解，这与其化学组成和结构有关。木质纤维素由半纤维素(约占20％-30％)、纤维素(约占40％))和木素(约占20％-30％)组成(Wong et al.，Microbiol.Rev，1988，52：305-317)，纤维素分子聚集成的微纤维，包埋在半纤维素和木质素间，形成网状结构，造成纤维素不容易降解，从而难以被充分转化利用。纤维素分解菌可以通过两种途径降解木质纤维素，其一是合成很多种降解木质纤维素的酶，其二是合成具有双功能或多功能性的酶或酶复合体。其中，第二种方法已经越来越多的引起人们的重视。在纤维素的降解过程中，内切纤维素酶作用于纤维素内部的非结晶区，随机水解β-1，4-糖苷键(Sun et al.，Bioresourse Technol，2002，83(1)：1-11)，将长链纤维素分子截短，产生大量非还原性末端的小分子纤维素，因此内切纤维素酶作为纤维素降解过程中发生作用较早的酶，起着至关重要的作用。木聚糖酶是降解木聚糖最主要的酶，它以内切方式作用于木聚糖主链的糖苷键，生成木二糖和木三糖等寡糖，很少生成木糖。因此，一种同时具有木聚糖酶及内切葡聚糖酶活性的双功能酶在木质纤维素的降解过程可发挥更大的作用。

Flint等人第一次发现了具有此双功能的单一酶，他们首次从生黄瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)的DNA片段中发现了一个新型基因XynD(Flint et al.，JBacteriol，1993，175：2943-2951)，它可以编码木聚糖酶/内切葡聚糖酶XYLD，具有两个独立的催化结构域，两个结构域之间由309个氨基酸连接，N端的糖基水解酶11家族结构域、C端的糖基水解酶16家族结构域分别具有木聚糖酶和葡聚糖酶催化活性。Chen等人从真菌黑曲霉(Aspergillus niger)也发现了木聚糖酶/内切葡聚糖酶双功能酶XYNIII(Chen et al，JMicrobiol Biotechnol，2006，16：1132-1138)，这种双功能酶能够水解桦树木聚糖、地衣多糖、大麦葡聚糖等，但不能水解CMC、微晶纤维素及可溶性淀粉，但从酶的最适温度、pH、温度及pH稳定性、金属离子的抑制或激活效应等性质类似，可以推断XYNIII的催化活性是由同一个活性中心催化的。Avalos等从一种产黄纤维单胞菌(Cellulomonas flavigena)也发现此类型的双功能酶(Avalos，et al.，Current Microbio1，2008，57：39-44)，这种酶可以将CMC分解成为纤维二糖、三糖、四糖，也可以将木聚糖水解为木糖、阿拉伯糖及木二糖，与黑曲霉XYNIII不同的是，产黄纤维单胞菌木聚糖酶/内切葡聚糖酶水解这两种底物的最适pH值是不同的。

宏基因组技术的广泛应用大大拓宽了纤维素酶筛选与克隆的范围，Kim等从土壤宏基因组文库中筛选得到了一种新型双功能木聚糖酶/内切葡聚糖酶CelM2(Kim et al，Biochemical and Biophysical Research Communications，2009，383：183-186)，CelM2可以同时水解大麦葡聚糖及木聚糖，其晶体结构的催化中心分别是N端的β-Sandwich结构域及C端的Tim-like barrel结构域。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种新型高效的双功能内切葡聚糖酶/木聚糖酶RuCelA及其编码基因。

本发明的第二个目的是提供一种制备新型高效的双功能内切葡聚糖酶/木聚糖酶RuCelA的方法。

本发明的第三个目的是提供新型高效内切葡聚糖酶/木聚糖酶RuCelA在纤维素降解中的应用。

本发明所提供的内切葡聚糖酶/木聚糖酶，命名为RuCelA，来源于中国牦牛瘤胃未培养微生物，具有下述氨基酸残基序列特征：

1)序列表中的SEQ ID NO.2的氨基端的第1-551或22-551位氨基酸残基序列，其中第42-341位氨基酸残基经SMART预测为纤维素酶超家族的结构域。

2)将序列表中的SEQ ID NO.2的氨基端的第1-551或22-551位氨基酸残基序列经过一个或若干个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，具有内切葡聚糖酶和/或木聚糖酶活性的蛋白质。

3)与序列表中的SEQ ID NO.2的氨基酸序列的同源性达到90％及以上的蛋白质。

本发明还提供了内切葡聚糖/木聚糖酶RuCelA的编码基因(RuCelA)，具有下述核苷酸序列特征：

1)序列表中SEQ ID NO.1的DNA序列；

2)编码序列表中SEQ ID NO.2蛋白质序列的多核苷酸序列；

本发明的RuCelA核苷酸编码序列也可以根据预测的RuCelA核苷酸编码序列人工合成获得。

本发明提供的制备重组酶RuCelA的方法，是将编码基因RuCelA克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的双功能酶。

所述重组表达RuCelA的表达载体，是指大肠杆菌表达载体、酵母菌表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、丝状真菌表达载体、昆虫表达载体或哺乳动物细胞表达载体等。

重组表达RuCelA的重组菌或转基因细胞系，可以是大肠杆菌(如Escherichia coliBL21、E.coli JM109、E.coli DH5α等)、酵母菌(如Saccharomyces cerevisiae、Pichia pastoris、Kluyveromyces lactis等)、枯草杆菌(如Bacillus subtilis R25、Bacillus subtilis 9920等)、乳酸菌(如Lactic acid bacteria COCC101等)，丝状真菌(如Trichoderma viride，Trichodermareesei，Aspergillus niger等)、昆虫细胞(如Bombyx mori，Antharaea eucalypti)，哺乳动物细胞(如CHO，CHL)等。

本发明的RuCelA来源于中国牦牛瘤胃未培养微生物，通过对瘤胃宏基因组cosmid文库的活性筛选，获得能够水解羧甲基纤维素钠(CMC)的阳性克隆，进一步通过构建亚克隆、测序、同源比对的方法获得内切葡聚糖酶RuCelA的cds序列，该基因编码区长1656bp，编码了551个氨基酸，分子量约60kD，属于纤维素酶超家族。大肠杆菌重组表达获得RuCelA，该酶能够水解CMC底物，具有内切葡聚糖酶活性，且在50℃、pH＝5.0条件下内切葡聚糖酶的活性最高；该酶能够水解木聚糖底物，具有木聚糖酶活性，且在65℃、pH6-9时木聚糖酶活性最高。金属阳离子Co⁺、Co²⁺可以明显提高RuCelA内切葡聚糖酶活性。RuCelA对磷酸溶胀纤维素、滤纸等底物有水解活性，也能水解寡糖底物纤维三糖，产生葡萄糖，此外，利用RuCelA可以实现对碱预处理的木质纤维素的单酶降解。

因此，本发明的双功能酶RuCelA可广泛应用于纤维素的降解，包括纤维素生物转化、化工、纺织、食品、生物能源、饲料添加、医药工业方面应用等。例如在制备生物乙醇、饲料添加剂等多方面有广泛的应用，包括在饲料中添加，洗涤剂添加RuCelA，或者生物燃料如乙醇制备过程中的原料处理等。

本发明的内切葡聚糖酶/木聚糖酶双功能酶RuCelA，也可与其他纤维素降解酶按照一定比例混合，在纤维素降解中应用。

附图说明

图1.纯化的重组双功能酶RuCelA蛋白SDS-PAGE电泳图。重组表达RuCelA的大肠杆菌细胞经超声破碎收集上清液，结合Ni-NTA柱，用不同浓度的咪唑溶液洗脱纯化。泳道1：100mmol的咪唑洗脱收集液；M：蛋白Marker。

图2.重组双功能酶RuCelA的最适反应pH曲线。RuCelA的最适反应pH值，以羧甲基纤维素钠(CMC)为底物时，RuCelA在pH＝5时的内切葡聚糖酶活性最高，定义为100％，在其他pH下RuCelA的内切葡聚糖酶活性以相对酶活表示；以木聚糖(xylan)为底物时，RuCelA在pH＝7时的木聚糖酶活性最高，定义为100％，RuCelA在其他pH下的木聚糖酶活性以相对酶活表示。

图3.RuCelA的最适反应温度曲线。以CMC为底物时，pH＝5，反应温度50℃时RuCelA的内切葡聚糖酶活性最高，定义为100％，在其他温度下RuCelA内切葡聚糖酶活性以相对酶活表示；以xylan为底物时，pH＝7，反应温度65℃时RuCelA的木聚糖酶活性最高，定义为100％，在其他温度下RuCelA木聚糖酶活性以相对酶活表示。

图4.RuCelA的热稳定性。pH＝5，RuCelA在30℃-70℃下热处理1小时后，以CMC为底物测定RuCelA的残余酶活。RuCelA在30℃热处理1小时后残余的活性定义为100％，其他温度下的残余酶活以相对活性表示。

图5.金属离子对RuCelA活性的影响。以CMC为底物，pH＝5，温度50℃条件下，测定不同金属离子对RuCelA内切葡聚糖酶活性的影响，反应体系中只含有底物及RuCelA时测定的活性设为100％；以xylan为底物时，pH＝7，温度为50℃条件下，测定不同金属离子对RuCelA木聚糖酶活性的影响。反应体系中只含有底物及RuCelA时测定的木聚糖酶活性作为100％。

图6.RuCelA与木糖苷酶Xyl1之间的协同作用。以xylan为底物，pH＝7，温度50℃条件下，分别测定在RuCelA单独存在、以及RuCelA与木糖苷酶Xyl1共同存在时反应体系中还原糖的量。

图7.RuCelA对碱预处理过稻草的单酶降解，以1％NaOH处理过的稻草为底物，在pH＝5，温度45℃条件下，按时取样测定体系内还原糖的浓度。

具体实施方式

实施例1中国牦牛瘤胃微生物宏基因组DNA文库的构建

采集西宁市中国青海牦牛的瘤胃，使用3层纱布过滤，滤液经离心收集瘤胃微生物菌体，冻存于-80℃待用。取100-200μl菌体样品，1ml PBS洗2～3次，加入650μl DNA抽提缓冲液(Tris-HCl，100mM pH8.0；Na₂EDTA 100mM pH8.0；Na₃PO₄ Buffer 100mM pH8.0；NaCl 1.5M；CTAB 1％；pH8.0)，混匀后，置-80℃，然后放置在65℃水浴中融化，重复三次；冷却后加入3-4μL溶菌酶(100mg/L)于摇床中水平振荡(37℃，225rpm)约30min；加入2-3μL蛋白酶K(20mg/mL)后继续振荡约30min；加入50-70μl SDS(20％)，混匀后，65℃保温1-2h，每隔10～20min上下颠倒离心管混匀；12,000rpm室温离心10min，收集上清液，加入400-500μl的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提两次；氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提一次后加入0.6倍体积的异丙醇，室温放置15-20min后，12000rpm离心15min；沉淀用70％乙醇漂洗，干燥后用60-100μL TE(pH8.0)溶解，加入1μLRNAase去除RNA。

构建瘤胃未培养细菌宏基因组文库的方法参照Epicentre公司pWEB::TNC CosmidCloning Kit试剂盒产品说明书。抽提的宏基因组DNA经End-Repair Enzyme Mix末端补平，和试剂盒中的去磷酸化载体pWEB::TNC连接，连接产物用MaxPlax^TM Lambda PackagingExtracts包装后侵染宿主菌E.coli EP I100，侵染产物涂平板，37℃培养12～16h长出菌落，即为该批样品的宏基因组文库。

实施例2cosmid文库内切葡聚糖酶的筛选

文库的扩增及细胞裂解液的制备：将96孔板格式化保存的文库影印接种于含200μlLB-Amp培养基/孔的96孔板，37℃培养12h后离心收集细胞。加入20μl磷酸-柠檬酸缓冲液(pH4.8)/孔悬浮细胞，放置-80℃中15min，然后将细胞放置37℃水浴中融化，重复三次。

内切葡聚糖酶的筛选采用羧甲基纤维素钠(CMC)-刚果红染色脱色法(Teather et al.，Appl Environ Microbiol，1982，43(4)：777-780)，取10μl上述制备的细胞裂解液点在含0.5％CMC的琼脂糖平板上，37℃放置1h后用ddH₂O洗涤平板以除去残留的菌液，用1％的刚果红溶液染色10min，然后用1MNaCl溶液脱色，在打点处出现水解透明圈的文库克隆中即含有降解葡聚糖的酶基因。

实施例3RuCelA基因的克隆及其序列分析

采用亚克隆的方法将上述含有内切葡聚糖酶的基因克隆至pGEMllz载体上：将此阳性克隆的cosmid质粒用Sau3A I部分酶切为2-5kb片段，连接入经BamH I酶切并去磷的pGEMllz载体中，转化大肠杆菌DH5α，以实施例2中描述的方法对亚克隆文库进行功能筛选，得到的亚克隆以T7和SP6通用引物测序，通过同源比对确定该内切葡聚糖酶基因的编码区序列，其基因核苷酸序列如SEQ ID NO 1所示，并命名为RuCelA。

该基因cds编码551个氨基酸，ORF序列如SEQ ID NO 2所示，理论分子量约为60kD。用SMART分析结构域，显示N端开始21个氨基酸是信号肽序列，属于纤维素酶超家族。通过NCBI的blast分析，内切葡聚糖酶RuCelA基因与来源于奶牛瘤胃(cow rumen)未培养微生物的糖基水解酶家族5(GenBank：EU282863.1)同源性达79％。

实施例4 RuCelA在大肠杆菌中的重组表达

利用合成的特异寡聚核苷酸引物来构建重组表达质粒，其中正向引物RuCelAF：(GAATTCATGTGTATGAAGAAAACTCTACTTT)，反向引物RuCelAR：(CTCGAGTTTGGCAATGTGCGTTTTACCGTCT)，下划线标注的是限制性内酶序列，通过PCR反应扩增出RuCelA基因片段，经过胶回收后用EcoR I和Xho I双酶切，回收片段后，与同样用EcoR I和Xho I酶切的pET-21a载体连接，连接产物转化大肠杆菌Top10，得到的转化子利用上述引物进行PCR鉴定，将含有1.6kb扩增片段的转化子进行测序测定，测序正确的重组载体命名为pET21a-RuCelA，将其接入3ml LB-Amp培养液中，37℃，220rpm培养过夜，次日，取1ml过夜菌至50ml LB-Amp培养液中，37℃，220rpm培养至菌液OD600为0.4-0.6左右在终浓度为1mmol/L的IPTG溶液中于30℃诱导表达，用破菌缓冲液(20mMTris-HCl，50mMNaCl)悬浮收集的菌体，超声破碎细胞后收集上清液，过Ni-NTA柱而后用不同浓度的咪唑溶液洗脱，用SDS-PAGE检测纯化蛋白结果如图1所示，可以看出RuCelA的分子量约为60kD。

实施例5RuCelA的最适pH分析

以羧甲基纤维素钠(CMC)或木聚糖(xylan)为底物测定该酶的活性，以每分钟催化1％CMC或木聚糖生成1μmol还原糖定义为一个酶活单位(U)，参照Miller的方法来测定还原糖的浓度(Miller et al，Anal.Chem，1959，31：426-428)。为测定RuCelA的最适pH，在40℃下反应15min，pH处于3.5-8时所用的缓冲液为磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，pH处于8.5-10时所用的缓冲液为甘氨酸-氢氧化钠缓冲液，反应体系为：50μl 1％羧甲基纤维素钠(CMC)或木聚糖(xylan)，45μl上述不同pH缓冲液，5μl的酶液，以CMC为底物时，以酶活最高者为100％计，在其他pH下RuCelA的内切葡聚糖酶活性以相对酶活表示，pH在处于3.5-5时酶活随pH的升高而增大，在pH＞5时，酶活随pH的升高而减小，在pH＝9时酶活降至最低；以xylan为底物时，以酶活最高者为100％计，在其他pH下RuCelA的木聚糖酶活性以相对酶活表示，pH在处于3.5-6时酶活随pH的升高而增大，在pH处于6-9时，酶活均达到稳定峰值，在pH＝7时最高，在pH＞9时酶活随pH的升高而急剧减小，在pH＝10时酶活降至最低。因此，RuCelA内切葡聚糖酶活性的最适pH＝5，RuCelA木聚糖酶活性的最适pH＝7，结果如图2。

实施例6RuCelA的最适温度分析

以CMC为底物时，反应15min，反应体系为：50μl 1％CMC，45μl pH＝5磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，5μl酶液，以酶活最高者为100％计，在其他温度下RuCelA的内切葡聚糖酶活性以相对酶活表示，温度处于30℃-50℃时酶活随温度的升高而增大，在温度高于50℃时，酶活随温度的升高而减小；以xylan为底物时，反应10min，反应体系为：50μl 1％xylan，45μl pH＝7磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，5μl酶液，以酶活最高者为100％计，在其他温度下RuCelA的木聚糖酶活性以相对酶活表示，温度在处于40℃-65℃时酶活随温度的升高而增大，在温度高于65℃时，酶活随温度的升高而减小。因此，RuCelA内切葡聚糖酶活性的最适温度为50℃，RuCelA木聚糖酶活性的最适温度为65℃，结果如图3。

实施例7RuCelA的热稳定性分析

在pH＝5时，RuCelA在30℃-70℃下热处理1小时后，恢复到室温，在最适条件下(pH＝5，50℃)反应15min，反应体系为：50μl 1％CMC，45μlpH＝5磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，5μl热处理后的酶液，以CMC为底物测定RuCelA的残余酶活，将RuCelA在最适条件下未热处理的酶活定义为100％，其他温度下的残余酶活以相对活性表示，结果表明RuCelA在低于50℃具有较好的热稳定性，温度高于50℃时酶的热稳定性随温度的升高而下降(如图4)。

实施例8RuCelA的比活分析

以CMC为底物时，体系pH＝5，反应15min，在50℃下测定RuCelA的比活，结果表明重组RuCelA对CMC的比活为54.3U/mg；以xylan为底物时，体系pH＝7，反应10min，在65℃下测定RuCelA的比活，结果表明对RuCelA对xylan的比活为264.1U/mg，在已报道的纤维素酶及半纤维素酶中均属于比较高的比活。

实施例9RuCelA的底物特异性分析

为分析RuCelA的底物特异性，利用了下列的底物：羧甲基纤维素钠CMC(β-1，4糖苷键)，大麦葡聚糖barley glucan(β-1，3/4糖苷键)，海藻多糖Laminarin(β-1，3/6糖苷键)，地衣多糖lichenen(β-1，3/4糖苷键)，羟乙基纤维素(β-1，4糖苷键)，微晶纤维素Avicel(β-1，4糖苷键)，木聚糖xylan(β-1，4糖苷键)，Whatman NO.1滤纸，荧光底物4-甲基伞形酮β-D-1，4-纤维二糖，对硝基酚β-D-1，4-木糖苷(pNPX)。反应体系为：50μl 1％底物，45μlpH＝5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，5μl酶液，在50℃下反应，对CMC、xylan、大麦葡聚糖、海藻多糖、地衣多糖、羟乙基纤维素反应时间为10min，对滤纸、微晶纤维素、荧光底物4-甲基伞形酮β-D-1，4-纤维二糖、对硝基酚β-D-1，4-木糖苷反应时间为24h，以RuCelA对CMC的活性为100％计，RuCelA对其他底物的活性以相对酶活表示。结果表明，RuCelA能水解滤纸产生还原糖，同样也能水解4-甲基伞形酮β-D-1，4-纤维二糖，而且对barleyglucan、lichenen的水解活性优于对CMC、xylan的水解活性，但对Laminarin、Avicel、对硝基酚β-D-1，4-木糖苷等底物没有活性，这说明RuCelA对含有β-1，3/β-1，4糖苷键的底物比单独含有β-1，4糖苷键的底物有更好的水解能力，但不能水解不含β-1，4糖苷键的底物，如Laminarin，结果见表一。

表一、RuCelA的底物特异性

实施例10金属离子对RuCelA活性的影响

以CMC为底物时，温度为50℃，反应15min，反应体系为：50μl 1％CMC，45μlpH＝5磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，10mmol/L的金属离子1μl，4μl酶液，反应体系中只含有底物及RuCelA时测定的内切葡聚糖酶活性作为100％，测定不同金属离子对内切葡聚糖酶活性的影响；以xylan为底物时，温度为50℃，反应10min，反应体系中只含有底物及RuCelA时测定的木聚糖酶活性作为100％，测定不同金属离子对RuCelA木聚糖酶活性的影响。反应体系为：50μl 1％xylan，45μlpH＝7磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，10mmol/L的金属离子1μl，4μl酶液，结果显示Co²⁺、Co⁺、Ca²⁺可以提高内切葡聚糖酶活性，Co²⁺可以提高约60％的内切葡聚糖酶活性，而Cu²⁺、Mg²⁺、Zn²⁺则对内切葡聚糖酶活性有一定的抑制作用；几乎所有的金属离子对木聚糖酶活性都有一定的抑制作用，Co⁺对木聚糖酶活性的抑制作用最显著，使RuCelA的酶活仅为不含Co⁺时的20％左右，结果如图5所示。

实施例11RuCelA与木糖苷酶Xyl1的协同作用

本实施例研究了RuCelA与木糖苷酶Xyl1间的协同作用，其中木糖苷酶Xyl1同样来源于中国牦牛瘤胃未培养微生物，Gene bank序列号为GU573895，反应体系为：50μl 1％xylan，45μlpH＝7.0磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，5μl RuCelA与Xyl1的混合酶液，混合酶液中RuCelA与Xyl1的酶活单位比为1∶1，在45℃下反应，以xylan为底物，每10min取一次样，分别测定在RuCelA单独存在、以及RuCelA与木糖苷酶Xyl1共同存在时反应体系中还原糖的量。结果表明，两种酶之间的协同作用明显，两种酶同时作用得到的还原糖量在不同时间段均高于RuCelA单独作用所产生的还原糖量，在20min左右时两种酶同时作用得到的还原糖量大约为RuCelA单独作用所产生的还原糖量的2倍，结果见图6。

实施例12RuCelA对碱预处理过稻草的单酶降解

木质纤维素的降解通常涉及到一系列的酶参与反应，而在我们的研究中，单独利用RuCelA进行预处理过稻草的酶解反应被证明是可行且有效的。稻草的预处理参照Badal的方法(Badal et al，New biotechnology，2009，27(1)：10-16)，稻草的秸秆在搅拌机内混匀粉碎后，在121℃时利用1％(w/v)的NaOH溶液预处理1h后离心，弃掉上清，蒸馏水洗三遍后烘干待用。称取0.5g稻草预处理后的样品，加入一定体积RuCelA后用pH＝5的磷酸-柠檬酸缓冲液定容至5ml，在45℃反应2周，按时取样测定体系内还原糖的浓度。反应体系中RuCelA在体系中的酶的用量如下：内切葡聚糖酶活性为1.9U/g干物质，木聚糖酶活性为4.1U/g干物质，两种酶活均在该反应条件下测定。结果显示，在0-6天内体系内还原糖浓度随时间延长而逐渐增大，而在8-14天内体系内还原糖浓度增速放缓而逐渐保持不变，结果如图7。

Claims (6)

1.一种具有内切葡聚糖酶/木聚糖酶活性的双功能酶，命名为RuCelA，其特征在于来源于瘤胃未培养微生物，其氨基酸序列为SEQ ID NO.2的氨基端的第1-551或22-551位氨基酸残基序列。

2.一种权利要求1所述的具有内切葡聚糖酶/木聚糖酶活性的双功能酶的编码基因，其特征在于DNA序列为SEQ ID NO.1，并编码SEQ ID NO.2蛋白质序列。

3.一种如权利要求1所述的具有内切葡聚糖酶/木聚糖酶活性的双功能酶的制备方法，其特征在于将权利要求2所述的内切葡聚糖酶/木聚糖酶双功能酶RuCelA编码基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的双功能酶RuCelA。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述的重组表达载体为大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、丝状真菌表达载体、昆虫表达载体或哺乳动物细胞表达载体。

5.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于所述的重组表达基因的重组菌或转基因细胞系为大肠杆菌宿主细胞、酵母菌宿主细胞、枯草杆菌宿主细胞、乳酸菌宿主细胞、丝状真菌宿主细胞、昆虫细胞或哺乳动物细胞。

6.如权利要求1所述的具有内切葡聚糖酶/木聚糖酶活性的双功能酶在纤维素降解中的应用。

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