CN102041252B - 高效内切葡聚糖酶RuCelB,其编码基因、制备方法与应用 - Google Patents

高效内切葡聚糖酶RuCelB,其编码基因、制备方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN102041252B
CN102041252B CN200910197704.1A CN200910197704A CN102041252B CN 102041252 B CN102041252 B CN 102041252B CN 200910197704 A CN200910197704 A CN 200910197704A CN 102041252 B CN102041252 B CN 102041252B
Authority
CN
China
Prior art keywords
rucelb
endoglucanase
expression vector
sequence
preparation
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN200910197704.1A
Other languages
English (en)
Other versions
CN102041252A (zh
Inventor
吕红
包蕾
周峻岗
袁汉英
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Fudan University
Original Assignee
Fudan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Fudan University filed Critical Fudan University
Priority to CN200910197704.1A priority Critical patent/CN102041252B/zh
Publication of CN102041252A publication Critical patent/CN102041252A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN102041252B publication Critical patent/CN102041252B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02P—CLIMATE CHANGE MITIGATION TECHNOLOGIES IN THE PRODUCTION OR PROCESSING OF GOODS
    • Y02P20/00—Technologies relating to chemical industry
    • Y02P20/50—Improvements relating to the production of bulk chemicals
    • Y02P20/52—Improvements relating to the production of bulk chemicals using catalysts, e.g. selective catalysts

Abstract

本发明属于生物工程领域，涉及一种新型内切葡聚糖酶RuCelB、其编码基因、制备方法与应用。RuCelB含有SEQ？ID？NO.2的第25-336位的氨基酸残基序列。通过对牦牛瘤胃微生物宏基因组cosmid文库的活性筛选，获得能够水解羧甲基纤维素钠的阳性克隆，进一步通过构建亚克隆、测序、同源比对的方法获得RuCelB的全长cds序列；重组表达获得RuCelB。RuCelB以羧甲基纤维素钠为底物的比活高达158.8U/mg，对滤纸、纤维三糖等底物也具有降解能力。本发明的RuCelB可广泛应用于纤维素的降解，包括纤维素生物转化、化工、纺织、食品、生物能源、饲料添加、医药工业方面应用等领域。

Description

高效内切葡聚糖酶RuCelB,其编码基因、制备方法与应用
技术领域
本发明属于生物工程领域，涉及一种内切葡聚糖酶及其制备方法和应用。本发明还涉及了该内切葡聚糖酶的重组质粒和重组基因工程菌株。
背景技术
纤维素是地球上分布最广，含量最丰富的可再生性碳源化合物。但在植物细胞壁中，纤维素分子聚集成的微纤维，包埋在半纤维素和木质素里，形成网状结构，造成纤维素不容易降解，从而难以被充分转化利用。纤维素分子的水解，至少需要三种纤维素酶的共同作用，分别为内切型葡聚糖酶(即内切纤维素酶)、外切型葡聚糖酶(又称为外切纤维素酶，纤维二糖水解酶)和β-葡萄糖苷酶。内切型葡聚糖酶能在纤维素分子的无定型区随机切断β-1.4-糖苷键，产生大量的小分子纤维素，然后由外切型葡聚糖酶从这些小分子纤维素的末端上两个两个的切下纤维二糖，最后，由β-葡萄糖苷酶将纤维二糖水解为葡萄糖。因此内切型葡聚糖酶承担着为外切型纤维素酶提供开放末端的任务，是纤维素降解过程的第一步，在纤维素降解中具有极其重要的地位。
已经得到的内切纤维素酶为数众多，主要来源于细菌和真菌，也有少数来源于原生动物和高等动物，其中真菌来源，尤其是丝状真菌来源的内切纤维素酶活性较高，通过固态发酵等方式，已经大规模用于工业生产，粗酶主要用于饲料添加剂行业。细菌来源的内切纤维素酶活性较低，但由于他们一般的最适pH在中性至碱性环境中，主要用于纺织洗涤工业中。但总体而言，内切纤维素酶的酶活是比较低的，最高活性的内切纤维素酶也只有428U/mg，远远低于其他生物多聚物水解酶(比如木聚糖酶)的活性，因此成了木质纤维素降解过程中的限制酶。
由于内切纤维素酶在生产生物能源过程中的重要作用，各种新型内切纤维素酶不断被探索出来，如S.Voget等报道了从土壤来源的内切葡聚糖酶Cel5A(JournalofBiotehnology，126：26-36，2006)；Soo-JinKim等报道了从土壤来源的内切葡聚糖酶CelM2(FEMSMicrobiolLett，282：44-51，2008)；YiFeng等报道了从家兔盲肠中来源的内切葡聚糖酶Cel5G(ApplMicrobiolBiotechnol，75：319-328，2007)；HaoPang等报道了从堆肥来源的内切葡聚糖酶Cel9B等等。虽然内切纤维素酶在降解纤维素方面非常重要，但它的酶活相对于它所承担的作用来说往往是比较低的，而且普遍使用可溶性底物来筛选和评价酶活，但是使用可溶性底物测的比活数据并不能真正代表在水解木质纤维素时的活性，因为真正对不溶性底物，尤其是结晶态的不溶性底物有活性的内切纤维素酶比较少，而且对不溶性底物的酶活即便有也往往是非常低的，这种克隆策略和实际应用需求的矛盾造成了大部分的内切纤维素酶鲜有实际应用价值。
发明内容
本发明的第一个目的是提供一种新型的高效的内切葡聚糖酶RuCelB及其编码基因。
本发明的第二个目的是提供一种制备这种新型高效内切葡聚糖酶RuCelB的方法。
本发明的第三个目的是提供这种新型高效内切葡聚糖酶RuCelB在纤维素降解中的应用。
本发明提供了一种具有内切葡聚糖酶活性的多肽，该多肽含有SEQIDNO.2的第25-336位的氨基酸残基序列。简称为RuCelB。
例如，该多肽序列如SEQIDNO.2所示。
SEQIDNO.2中，1-24位为信号肽，25-336位为有活性的内切葡聚糖酶RuCelB氨基酸，第35-310位氨基酸残基为纤维素酶超家族的结构域。
相应的，内切葡聚糖酶RuCelB其核苷酸编码序列可以含有SEQIDNO.1中第72-1008位的DNA序列所示。也可以是SEQIDNO.1所示的序列。
本发明所提供的内切葡聚糖酶RuCelB，来源于牦牛瘤胃未培养微生物，其氨基酸残基序列包括：
1)序列表中的SEQIDNO.2的氨基端的第1-336或25-336位氨基酸残基序列；其中，1-24位为信号肽，25-336位为有活性的内切葡聚糖酶RuCelB氨基酸，第35-310位氨基酸残基为纤维素酶超家族的结构域。
2)将序列表中的SEQIDNO.2的氨基端的第1-336或第25-336位氨基酸残基序列经过一个或若干个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质。
3)与序列表中的SEQIDNO.2的氨基酸序列的同源性达到90％及以上且具有内切葡聚糖酶活性的蛋白质。
本发明还提供了内切葡聚糖酶RuCelB的编码基因(RuCelB)，该核苷酸序列包括：
1)序列表中SEQIDNO.1的第1-1008或73-1008位DNA序列，分别对应于氨基端的第1-336或25-336位氨基酸残基序列；
2)编码序列表中SEQIDNO.2蛋白质序列的多核苷酸序列。
由于保守性变异也能够具备本发明所述的内切葡聚糖酶活性，因此与内切葡聚糖酶氨基酸序列相比，被性质相似或相近的、多至10个氨基酸残基替换而形成多肽也具有相同功能。本发明也包括这些保守性变异多肽的核苷酸编码序列。
内切型葡聚糖酶，能在纤维素分子的无定型区随机切断β-1.4-糖苷键，产生大量的小分子纤维素，然后由外切型葡聚糖酶从这些小分子纤维素的末端上两个两个的切下纤维二糖，最后，由β-葡萄糖苷酶将纤维二糖水解为葡萄糖。
本发明还提供了内切葡聚糖酶RuCelB的制备方法，可以按照SEQIDNO.2的第25-336位的氨基酸残基序列人工合成。
也可以，取青海牦牛的瘤胃内容物，构建瘤胃未培养细菌宏基因组文库；筛选能够水解羧甲基纤维素钠的阳性克隆；进一步通过构建亚克隆、测序、同源比对的方法获得内切葡聚糖酶RuCelB的全长cds序列；将内切葡聚糖酶编码基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的内切葡聚糖酶。
本发明还提供了内切葡聚糖酶RuCelB的重组质粒，即把内切葡聚糖酶RuCelB的核苷酸编码基因序列克隆入大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、丝状真菌表达载体、昆虫表达载体或者哺乳动物细胞表达载体所得的重组质粒。
所述的重组表达载体可以是大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、丝状真菌表达载体、昆虫表达载体或者哺乳动物细胞表达载体等。
所述的宿主细胞可以是大肠杆菌(如EscherichiacoliBL21、E.coliJM109、E.coliDH5α等)、酵母菌(如Saccharomycescerevisiae、Pichiapastoris、Kluyveromyceslactis等)、枯草杆菌(如BacillussubtilisR25、Bacillussubtilis9920等)、乳酸菌(如LacticacidbacteriaCOCC101等)，丝状真菌(如Trichodermaviride，Trichodermareesei，Aspergillusniger等)、昆虫细胞(如Bombyxmori，如tharaeaeucalypti)，哺乳动物细胞(如CHO，CHL等)等。
CHO是指Chinesehamsterovarycell，中国仓鼠卵巢细胞。CHL是中国仓鼠肺细胞。
本发明的RuCelB来源于中国牦牛瘤胃微生物，通过对瘤胃宏基因组cosmid文库的活性筛选，获得能够水解羧甲基纤维素钠(CMC)的阳性克隆，进一步通过构建亚克隆、测序、同源比对的方法获得内切葡聚糖酶RuCelB的全长cds序列，该基因编码区长1011bp，编码了336个氨基酸，分子量38.4kD，属于纤维素酶超家族。在大肠杆菌中重组表达获得内切葡聚糖酶RuCelR，经酶学特性分析发现该酶的最适反应温度60℃，最适反应pH6.5，以羧甲基纤维素钠为底物的比活高达158.8U/mg。RuCelB对β-1，4吡喃葡萄糖苷键具较专一的高活性，能水解CMC(carboxylmethylcellulose)，4-甲基伞形酮β-D-1，4-葡萄糖苷(Mu-G2)，WhatmanNO.1filterpaper，但是不能水解β-(1，3)，β-(1，6)糖苷键。
本发明的内切葡聚糖酶RuCelB可广泛应用于纤维素的降解。例如，用于三糖底物MU-纤维二糖的降解。本发明的内切葡聚糖酶RuCelB在制备生物燃料、饲料添加剂等多方面有广泛的应用。
本发明提供了一种新型的高效的内切葡聚糖酶RuCelB。从BRENDA数据库上可以看到，内切纤维素酶的酶活大部分是几十个单位/mg，而根据BRENDA上已登记的酶活数据排序，本发明的RuCelB的酶活(158.8U/mg)排在第八位，属于相当高活性的内切纤维素酶了，而且该酶能够对滤纸也有降解能力，同时又具有较好的热稳定性，具有良好的工业应用的价值。本发明的内切葡聚糖酶RuCelB可广泛应用于纤维素的降解，包括纤维素生物转化、化工、纺织、食品、生物能源、饲料添加、医药工业方面应用等领域。
附图说明
图1：重组内切葡聚糖酶RuCelB表达、纯化的蛋白SDS-PAGE电泳图。各泳道加入的样品分别是：泳道1：150mmol的咪唑洗脱收集液，上样量1ul，泳道2：同泳道1，上样量3ul，泳道3：BL21(DE3)/pET21a-RuCelB重组菌破壁后上清；泳道4：BL21(DE3)/pET21a-RuCelB重组菌破碎后上清经镍柱纯化的流出液；M：蛋白marker，条带自上至下大小为116kD，66.2kD，45kD，35kD，25kD，18.4kD，14.4kD。
图2：内切葡聚糖酶RuCelB的最适反应温度曲线。
图3：内切葡聚糖酶RuCelB的最适反应pH值曲线。
图4：内切葡聚糖酶RuCelB的耐温性曲线。“50”、“55”和“60”分别表示50、55、60这三种温度(摄氏度)。从图中可以看到，在50℃，55℃温浴1h后酶活基本不变，在60℃中开始缓慢丧失活性。
图5：内切葡聚糖酶RuCelB的圆二色曲线。其中，ellipticity是椭圆率，boltzmannfit指伯尔兹曼拟合。
图6：内切葡聚糖酶RuCelB降解纤维二糖及MU-纤维二糖的TLC分析图。其中，11：葡萄糖；12：纤维二糖；13：纤维二糖+RuCelB；14：MU-纤维二糖；15：MU-纤维二糖+RuCelB。
具体实施方式
实施例1中国牦牛瘤胃微生物宏基因组DNA文库的构建
于西宁市的一个屠宰场采集2头中国青海牦牛的瘤胃内容物，使用3层纱布过滤，滤液经离心收集瘤胃微生物菌体，冻存于-80℃待用。取100-200ul菌体样品，1mlPBS洗2～3次，加入650uLDNA抽提缓冲液(Tris-HCl，100mMpH8.0；Na2EDTA100mMpH8.0；Na3PO4Buffer100mMpH8.0；NaCl1.5M；CTAB1％；pH8.0)，混匀后，置-80℃中，然后放置在65℃水浴中融化，重复三次；冷却后加入3-4μL溶菌酶(100mg/L)于摇床中水平振荡(37℃，225rpm)约30min；加入2-3μL蛋白酶K(20mg/mL)后继续振荡约30min；加入50-70uLSDS(20％)，混匀后，65℃保温1-2h，每隔10～20min上下颠倒离心管混匀；12，000rpm室温离心10min，收集上清液，加入400-500ul的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)抽提两次；氯仿∶异戊醇(24∶1)抽提一次后加入0.6倍体积的异丙醇，室温放置15-20min后，12000rpm离心15min；沉淀用70％乙醇漂洗，干燥后用60-100μLTE(pH8.0)溶解，加入1μLRNAase去除RNA。抽提的瘤胃宏基因组大小在30～40kb左右，符合构建宏基因组cosmid文库要求。
构建瘤胃未培养细菌宏基因组文库的方法参照Epicentre公司pWEB::TNCCosmidCloningKit试剂盒产品说明书。抽提的宏基因组DNA经End-RepairEnzymeMix末端补平，和试剂盒中的去磷酸化载体pWEB::TNC连接，连接产物用MaxPlaxTMLambdaPackagingExtracts包装后、侵染宿主菌E.coliEPI100，侵染产物涂平板，37℃培养12～16h长出菌落，即为该批样品的宏基因组文库。
内切葡聚糖酶的活性筛选采用1％CMC平板+刚果红染色的方法。将宏基因组文库在96孔板中扩增培养后，冻融法破细胞，点样于1％CMC平板上，37℃反应60分钟后加入1％刚果红染色15min，用1MNaCl脱色，能产生透明圈的即为具有内切葡聚糖酶活性的阳性克隆。含有RuCelB基因的cosmid克隆6C6即是以此法在该文库中筛到的。
实施例2瘤胃微生物来源的RuCelB基因的克隆及其序列分析
采用亚克隆的方法将6C6上的内切葡聚糖酶基因克隆至pGEM11z载体上：将筛选到的阳性克隆6C6的cosmid质粒用Sau3AI部分酶切为2-5kb片段，连接入经BamHI酶切并去磷的pGEM11z载体中，转化DH5α，以实施例1中描述的方法对亚克隆文库进行功能筛选，得到的亚克隆以T7和SP6通用引物测序，通过同源比对确定该内切葡聚糖酶基因的编码区序列，其基因核苷酸序列如SEQIDNO1所示，并命名为RuCelB。
该基因cds编码336个氨基酸，ORF序列如SEQIDNO2所示，理论分子量为38.4kD。用SMART分析结构域，显示N端开始24个氨基酸是信号肽序列，第35-310位氨基酸为纤维素酶超家族功能域。通过NCBI的blastp分析，RuCelB与水牛宏基因组来源的内切纤维素酶同源性最高，氨基酸序列一致性(identity)为83％。
实施例3RuCelB基因在大肠杆菌中的重组表达
为了将RuCelB基因序列克隆入大肠杆菌表达载体pET-21a进行重组表达，设计了一对引物：其中正向引物加入了6个His密码子，跳过信号肽，从蛋白的25位开始扩增，序列为RuCelBF：ATAGAATTCCATCATCACCATCATCACGGCAACGGCTGGGTC，反向引物为RuCelBR：TGTAAGCTTACCCGCCTGTCCCTG，下划线标注的是限制性内酶序列。通过PCR反应扩增出RuCelB基因片段，经过胶回收后用EcoRI和HindIII双酶切，回收片段后，与同样是EcoRI和HindIII双酶切的pET-21a载体连接，连接产物转化大肠杆菌Top10菌株，得到的转化子利用上述引物进行煮菌PCR鉴定，将含有1kb扩增片段的转化子检测酶活和测序鉴定，将正确的转化子命名为Top10/pET21a-RuCelB。随后提取该转化子的质粒，转化大肠杆菌表达菌株E.coiiBL21(DE3)进行重组表达。
该重组表达的思路也同样适用于其他各种通用表达载体和表达菌株。可以是大肠杆菌(如EscherichiacoliBL21、E.coliJM109、E.coliDH5α等)、酵母菌(如Saccharomycescerevisiae、Pichiapastoris、Kluyveromyceslactis等)、枯草杆菌(如BacillussubtilisR25、Bacillussubtilis9920等)、乳酸菌(如LacticacidbacteriaCOCC101等)，丝状真菌(如Trichodermaviride，Trichodermareesei，Aspergillusniger等)、昆虫细胞(如Bombyxmori，Antharaeaeucalypti)，哺乳动物细胞(如CHO，CHL等)等。
表达后的蛋白经破壁后，使用Ni-NTA柱进行纯化，纯化的蛋白SDS-PAGE电泳图如图1所示。
实施例4RuCelB的酶学活性分析
以CMC为底物测定该酶的活性，以每分钟催化CMC生成1umol还原糖定义为一个酶活单位(U)。为测定RuCelB酶的最适反应条件，以CMC为底物，在不同温度(25℃-80℃)下检测其相对活性，结果显示RuCelB的最适反应温度为60℃(如图2)。在最适温度下，测定最适pH，所用的缓冲液范围为：pH3.5-6.5用50mmol柠檬酸缓冲液，pH6.0-8.0用50mmol磷酸钠缓冲液，pH8.0-9.0用50mMTris·HCl缓冲液，结果显示RuCelB的最适反应pH为6.5(如图3)。
为测定RuCelB的比活，在最适温度和最适pH下检测酶活，结果表明重组RuCelB对CMC的比活为158.8U/mg蛋白。
为检测RuCelB的底物特异性，还使用了下列的底物：barleyglucan(β-1-＞3/4糖苷键)，Laminarin(β-1-＞3/6糖苷键)，Avicel，xylan，WhatmanNO.1filterpaper，荧光底物4-甲基伞形酮β-D-1，4-纤维二糖糖(Mu-G2)，pNPG，分析RuCelB对这些底物的水解能力。结果显示，RuCelB能使滤纸水解出还原糖，能使Mu-G2显示荧光，但是不能水解barleyglucan，Avicel，Laminarin，xylan和pNPG，这说明RuCelB对β-1，4吡喃葡萄糖苷键具较专一的高活性，但还是不能水解结晶状态的纤维素，对β-(1，3)，β-(1，6)糖苷键则完全没有活性。
实施例5RuCelB的耐热性分析
将纯化的RuCelB稀释於最适pH的缓冲液中，分别置于50℃，55℃，60℃，分别保温10、20、30、40、50、60min，以置于4℃不温育的稀释酶液为对照(100％)酶活，测试残余活性，结果如图4所示，在50℃，55℃温浴1h后酶活基本不变，在60℃中开始缓慢丧失活性。同时，用圆二色仪测定RuCelB在35℃-90℃的CD值，选取220nm处的OD值处理数据，所得图形如图5所示，计算得它的Tm值为60℃。
实施例6金属离子对RuCelB活性的影响
在pH6.5，60℃条件下，测定二价金属阳离对RuCelB水解CMC的影响。反应体系为：300uL1％CMC，5mmol或10mmol的金属离子，1uL的酶液，60℃反应5分钟后加入1倍体积的DNS煮沸，570nm分光光度法测定还原糖生成量，结果如表1所示，对照为不加任何二价金属阳离子时RuCelB的活性，将其定为100％，在添加金属离子后RuCelB的活性，以相对活性表示。结果显示金属离子对RuCelB均有不同程度的抑制效应。
表一：金属离子对RuCelB活性的影响
实施例7RuCelB水解寡糖的TLC分析
RuCelB的β-1-4-葡萄糖苷酶的性质分析利用纤维二糖和4-甲基伞形酮β-D-1，4-纤维二糖为底物，用薄层层析(TLC)分析产物。薄层层析使用烟台江友硅胶开发有限公司HSGF254型号的硅胶板，展层剂为正丁醇∶乙酸∶水(2∶1∶1)；展开时间1.5小时*2，显色方法：碘熏。结果如图6所示，RuCelB能够降解三糖底物MU-纤维二糖产生纤维二糖，但不能降解二糖底物纤维二糖使之产生葡萄糖。
序列表
<210>1
<211>1008
<212>DNA
<213>牦牛
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(1008)
<223>
<400>1
atgcgtaaaattagcctttctgccatcgccctcgcggcgtccgccctc48
MetArgLysIleSerLeuSerAlaIleAlaLeuAlaAlaSerAlaLeu
151015
attcttttatcatcctgttcggccggcaacggctgggtcaaggtcaaa96
IleLeuLeuSerSerCysSerAlaGlyAsnGlyTrpValLysValLys
202530
ggaaacaaatttgtcgacccgcagggccaggagatcattttccgcggc144
GlyAsnLysPheValAspProGlnGlyGlnGluIleIlePheArgGly
354045
ctctgcttctcggatccggtcaagctggtccgggacgggcagtggaac192
LeuCysPheSerAspProValLysLeuValArgAspGlyGlnTrpAsn
505560
gaacgctatttcgcggctgcggccgactggggcgccaacatcgtgcgc240
GluArgTyrPheAlaAlaAlaAlaAspTrpGlyAlaAsnIleValArg
65707580
ttcgccgtccatccgaccaacctcaatgccatgggctgggaggagacc288
PheAlaValHisProThrAsnLeuAsnAlaMetGlyTrpGluGluThr
859095
ttcgcggccatggaccagggcatcgagtgggccaggcagcacgggatg336
PheAlaAlaMetAspGlnGlyIleGluTrpAlaArgGlnHisGlyMet
100105110
tacgtcatcatggactggcacacgatcggcaacctcaaggacgagctg384
TyrValIleMetAspTrpHisThrIleGlyAsnLeuLysAspGluLeu
115120125
tacacgtccccgatgtacaacaccaccaaggaggagaccttcaagttc432
TyrThrSerProMetTyrAsnThrThrLysGluGluThrPheLysPhe
130135140
tggcgcaccgtggcccagcgctacaaggacgagccgacggttgcgctc480
TrpArgThrValAlaGlnArgTyrLysAspGluProThrValAlaLeu
145150155160
tatgagctgtacaacgagccgacggtgacgggcccggggatggggtcc528
TyrGluLeuTyrAsnGluProThrValThrGlyProGlyMetGlySer
165170175
tgcagctggaccgaatggcgcgagctgcaggagcagatcatcgacacg576
CysSerTrpThrGluTrpArgGluLeuGlnGluGlnIleIleAspThr
180185190
gtccgcacctacaatcccaacgccctctgcctgtgcgccggcttcaac624
ValArgThrTyrAsnProAsnAlaLeuCysLeuCysAlaGlyPheAsn
195200205
tgggcctacgacctcacgcctgtggcgcaggagcccatccggcgcccg672
TrpAlaTyrAspLeuThrProValAlaGlnGluProIleArgArgPro
210215220
aacgtggcctatgtctcacatccgtacccgatgaagcgttccgagccg720
AsnValAlaTyrValSerHisProTyrProMetLysArgSerGluPro
225230235240
tgggaagagcagtgggagcaggatttcggcttcgtggccgacacctat768
TrpGluGluGlnTrpGluGlnAspPheGlyPheValAlaAspThrTyr
245250255
ccggtcatctgcacggagatcggattctgcctcgcggacgagccgggg816
ProValIleCysThrGluIleGlyPheCysLeuAlaAspGluProGly
260265270
gcccatatccccgtgatgtccaccgatgtctacggcgagcacatcacc864
AlaHisIleProValMetSerThrAspValTyrGlyGluHisIleThr
275280285
aaatacttcgagcagaaggggatttccttcaccgtgtggtgcttcgac912
LysTyrPheGluGlnLysGlyIleSerPheThrValTrpCysPheAsp
290295300
gtcaactggtccccgatgctcatcagcgactgggacttcacgcccacc960
ValAsnTrpSerProMetLeuIleSerAspTrpAspPheThrProThr
305310315320
acgcagggccgcttcttcaaggcctatctgcagggacaggcgggtaaa1008
ThrGlnGlyArgPhePheLysAlaTyrLeuGlnGlyGlnAlaGlyLys
325330335
<210>2
<211>336
<212>PRT
<213>牦牛
<400>2
MetArgLysIleSerLeuSerAlaIleAlaLeuAlaAlaSerAlaLeu
151015
IleLeuLeuSerSerCysSerAlaGlyAsnGlyTrpValLysValLys
202530
GlyAsnLysPheValAspProGlnGlyGlnGluIleIlePheArgGly
354045
LeuCysPheSerAspProValLysLeuValArgAspGlyGlnTrpAsn
505560
GluArgTyrPheAlaAlaAlaAlaAspTrpGlyAlaAsnIleValArg
65707580
PheAlaValHisProThrAsnLeuAsnAlaMetGlyTrpGluGluThr
859095
PheAlaAlaMetAspGlnGlyIleGluTrpAlaArgGlnHisGlyMet
100105110
TyrValIleMetAspTrpHisThrIleGlyAsnLeuLysAspGluLeu
115120125
TyrThrSerProMetTyrAsnThrThrLysGluGluThrPheLysPhe
130135140
TrpArgThrValAlaGlnArgTyrLysAspGluProThrValAlaLeu
145150155160
TyrGluLeuTyrAsnGluProThrValThrGlyProGlyMetGlySer
165170175
CysSerTrpThrGluTrpArgGluLeuGlnGluGlnIleIleAspThr
180185190
ValArgThrTyrAsnProAsnAlaLeuCysLeuCysAlaGlyPheAsn
195200205
TrpAlaTyrAspLeuThrProValAlaGlnGluProIleArgArgPro
210215220
AsnValAlaTyrValSerHisProTyrProMetLysArgSerGluPro
225230235240
TrpGluGluGlnTrpGluGlnAspPheGlyPheValAlaAspThrTyr
245250255
ProValIleCysThrGluIleGlyPheCysLeuAlaAspGluProGly
260265270
AlaHisIleProValMetSerThrAspValTyrGlyGluHisIleThr
275280285
LysTyrPheGluGlnLysGlyIleSerPheThrValTrpCysPheAsp
290295300
ValAsnTrpSerProMetLeuIleSerAspTrpAspPheThrProThr
305310315320
ThrGlnGlyArgPhePheLysAlaTyrLeuGlnGlyGlnAlaGlyLys
325330335

Claims (6)

1.一种具有内切葡聚糖酶活性的多肽，其特征在于，该多肽的序列是SEQIDNO.2的第25-336位的氨基酸残基序列。
2.如权利要求1所述的多肽的编码基因，其特征在于，其核苷酸编码序列是SEQIDNO.1中第73-1008位的DNA序列。
3.权利要求1所述的多肽的制备方法，其特征在于，将SEQIDNO.1所示的内切葡聚糖酶编码基因克隆入重组表达载体，导入宿主细胞，获得重组表达的内切葡聚糖酶。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的重组表达载体是大肠杆菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、丝状真菌表达载体、昆虫表达载体或者哺乳动物细胞表达载体中的任意一种。
5.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，所述的宿主细胞是EscherichiacoliBL21、E.coliJM109、E.coliDH5a、Saccharomycescerevisiae、Pichiapastoris、Kluyveromyceslactis、BacillussubtilisR25、Bacillussubtilis9920、LacticacidbacteriaCOCC101、Trichodermaviride，Trichodermareesei、Aspergillusniger、Bombyxmori、Antharaeaeucalypti、CHO或者CHL细胞中的任意一种。
6.权利要求1所述的多肽的应用，其特征在于，将其用于降解含有β-1，4吡喃葡萄糖苷键的纤维素。
CN200910197704.1A 2009-10-26 2009-10-26 高效内切葡聚糖酶RuCelB,其编码基因、制备方法与应用 Active CN102041252B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN200910197704.1A CN102041252B (zh) 2009-10-26 2009-10-26 高效内切葡聚糖酶RuCelB,其编码基因、制备方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN200910197704.1A CN102041252B (zh) 2009-10-26 2009-10-26 高效内切葡聚糖酶RuCelB,其编码基因、制备方法与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN102041252A CN102041252A (zh) 2011-05-04
CN102041252B true CN102041252B (zh) 2015-12-02

Family

ID=43907800

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN200910197704.1A Active CN102041252B (zh) 2009-10-26 2009-10-26 高效内切葡聚糖酶RuCelB,其编码基因、制备方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN102041252B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10738292B2 (en) * 2015-11-12 2020-08-11 Council Of Scientific & Industrial Research Cellulase derived from metagenomics
CN106755012B (zh) * 2015-11-25 2020-06-30 中国科学院大连化学物理研究所 一种内切β-1,3-葡聚糖酶编码基因及其酶和制备方法与应用
CN107988186A (zh) * 2017-12-06 2018-05-04 南京林业大学 一种冷适应性内切β-1,4-葡聚糖酶及其表达基因和应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5712142A (en) * 1989-09-26 1998-01-27 Midwest Research Institute Method for increasing thermostability in cellulase ennzymes
CA2606475A1 (en) * 2005-04-27 2006-11-02 Novozymes, Inc. Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
CN101182527A (zh) * 2007-10-10 2008-05-21 邢苗 一种碱性内切葡聚糖酶基因及其重组酶和应用
EP2069491A2 (en) * 2007-05-10 2009-06-17 Novozymes Inc. Compositions and methods for enhancing the degradation or conversion of cellulose-containing material
WO2009105141A2 (en) * 2007-12-05 2009-08-27 Novozymes A/S Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5712142A (en) * 1989-09-26 1998-01-27 Midwest Research Institute Method for increasing thermostability in cellulase ennzymes
CA2606475A1 (en) * 2005-04-27 2006-11-02 Novozymes, Inc. Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
EP2069491A2 (en) * 2007-05-10 2009-06-17 Novozymes Inc. Compositions and methods for enhancing the degradation or conversion of cellulose-containing material
CN101182527A (zh) * 2007-10-10 2008-05-21 邢苗 一种碱性内切葡聚糖酶基因及其重组酶和应用
WO2009105141A2 (en) * 2007-12-05 2009-08-27 Novozymes A/S Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
C.-J. Duan et al..Isolation and partial characterization of novel genes encoding acidic cellulases from metagenomes of buffalo rumens.《Journal of Applied Microbiology》.2009,第107卷(第1期),245-256. *
赵广存.牛瘤胃未培养微生物纤维素酶基因的克隆、鉴定及表达.《广西大学硕士学位论文》.2005, *

Also Published As

Publication number Publication date
CN102041252A (zh) 2011-05-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wyman et al. Hydrolysis of cellulose and hemicellulose
CN102041251B (zh) 葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素降解酶RuBGX2及其编码基因和应用
CN100575484C (zh) 一种β-葡萄糖苷酶及其编码基因与应用
CN104011214B (zh) C.bescii耐热酶
CN109182360B (zh) 一种小分子纤维素内切酶基因及其蛋白和应用
US20160186156A1 (en) Artificial cellulosomes comprising multiple scaffolds and uses thereof in biomass degradation
CN103409393A (zh) 一种α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶，编码基因及其制备方法与应用
CN102884184B (zh) 葡糖苷酶的制造方法、酶组合物和生物量的水解方法
CN102041252B (zh) 高效内切葡聚糖酶RuCelB,其编码基因、制备方法与应用
CN102051350B (zh) 一种适冷木糖苷酶/阿拉伯糖苷酶、其制备方法及应用
CN105331596B (zh) 属于GH3家族的耐热性β-木糖苷酶
JP2012039999A (ja) 酵素の再利用方法
CN101338307B (zh) 一种纤维素酶和它的编码基因与应用
CN101870966B (zh) 葡萄糖苷酶/木糖苷酶双功能纤维素降解酶及其制备方法和应用
CN102888417B (zh) 编码糖基水解酶家族5的内切葡聚糖酶基因Cel5A及其应用
KR101190632B1 (ko) 소의 반추위 메타게놈에서 유래된 신규 베타-글루코시다아제 유전자
Momeni Structural insights into the catalytic mechanism, protein dynamics, inhibition and thermostability of GH7 cellobiohydrolases
CN105754973B (zh) 一种β-葡萄糖苷酶的突变体W233D及其应用
JP5777128B2 (ja) 新規なセルラーゼ
CN102888418B (zh) 链霉菌的内切葡聚糖酶基因Cel5B及其应用
CN101906406A (zh) 具有内切葡聚糖酶/木聚糖酶活性的双功能酶及其制备方法与应用
Masingi Production and characteristics of a b-glucosidase from a thermophilic bacterium and investigation of its potential as part of a cellulase cocktail for conversion of lignocellulosic biomass to fermentable sugars
CN102899340B (zh) 编码糖基水解酶家族6的内切葡聚糖酶基因Cel6及其应用
Matlala A proteomic approach for discovery of microbial cellulolytic enzymes
Auta Purification and characterisation of novel recombinant β-glucosidases from aspergillus with application in biofuel production

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant