JP5777128B2 - 新規なセルラーゼ - Google Patents
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Description
グルコースの製造方法が提供される。
生成したグルコースを醗酵させてアルコールを生産する工程を含む、
アルコールの製造方法が提供される。
本発明のセルラーゼは、結晶性セルロースおよび非結晶性セルロースの両方に作用して、主生成物としてグルコースを生成し、かつ、副生成物としてセロビオースを生成するエキソセルラーゼ活性を有する。
(1)カイコウオオソコエビ(Hirondellea gigas)の捕獲
4個の餌付き仕掛けを取り付けた11,000m級のカメラシステム(ASHURA)を用意し、2.5時間、マリアナ海溝(緯度11°22.11’N、経度142°25.86’E、深さ:10,897m)の最深部へ到達するように該餌付き仕掛けを投下した(図4aおよび4bを参照)。端脚類動物(カイコウオオソコエビ)の185個体のみが捕獲された。カイコウオオソコエビを−80℃の急速冷凍庫に保管するか、または、4℃のメタノール:クロロホルム混合液(1:1)中に浸漬した。
100mM リン酸ナトリウム/5mM EDTA緩衝液(pH 8.0)を用いて2gの乾燥堆積物から全炭素(TC)を測定し、TCと総無機体炭素との差からTOCを計算した。TCおよびTOCはISO8245(ISO8245:1999,American National Standards Institute(2007)を参照、該文献の記載はここに開示として援用される)に従って、燃焼酸化赤外分光光度法によって測定した。
5個体のカイコウオオソコエビを凍結乾燥した後に破砕し、次いで1mlの蒸留水を用いて破砕したカイコウオオソコエビを3度抽出した。遠心分離(15,000rpm、4℃、10分)して不溶性微粒子を除去した後に、抽出物を10KDaカット・オフのミクロコン遠心濾過デバイス(ミリポア社、ビレリカ、MA)を用いて遠心分離し、酵素その他の高分子量成分を除去した。次いで、得られた上清中のグルコース含有量をグルコースCIIキット(和光純薬株式会社)により測定した。マルトース含有量は、1Uのα−グルコシダーゼ(オリエンタル酵母株式会社)と37℃で16時間反応させた後に、グルコースの増加量から算出した。セロビオース含有量もまた、1Uのβ−グルコシダーゼ(オリエンタル酵母株式会社)と37℃で16時間反応させた後に、グルコースの増加量から算出した。
破砕したカイコウオオソコエビを、0.5mlの蒸留水を用いて3度抽出した。酵素活性はすべて30℃で測定した。プロテアーゼ活性は改良アンソンアッセイにより測定した。該アッセイでは、1ユニットの活性は、ハンメルシュタイン・カゼインを加水分解して、pH 5.6で1分あたりに1μモルのチロシンと等価の発色を生じるのに必要とされる抽出物の量と定義した(M.L.Anson,J.Gen.Physiol.22,79−89(1938)を参照、該文献の記載はここに開示として援用される)。
可溶性澱粉(1.0%(w/v))とカイコウオオソコエビ抽出物とを50mM 酢酸ナトリウム緩衝液(pH 5.6)に加え、40℃にてインキュベートした。間隔をあけて得た試料を5分間沸騰させた。生成物を、ブタノール/酢酸/水(2:1:1(v/v/v))溶媒を用いたTLCにより分析した。「S」はマルトオリゴ糖またはセロオリゴ糖を表す(図2)。
安達製材工場(Adachi Sawmill)から購入したライブ・オークのおがくずを水で2度洗浄し、121℃で15分間オートクレーブし、DDWで2度洗浄した後に、室温にて空気中で乾燥した。乾燥おがくずを5%(w/v)の濃度で酢酸ナトリウム緩衝液(pH 5.6)中に懸濁し、次いで35℃にて酵素調製物とともにインキュベートした。おがくずの分解率は、反応混合物の水相中にあるグルコース濃度およびセロビオース濃度を測定することにより算出した。なお、カルボキシメチルセルロースおよびおがくずのいずれを基質とした場合においても同一の酵素量を用いて実験した。
50mlチューブに加えたカイコウオオソコエビの10個体を破砕せずに、200μLのプロテアーゼ阻害剤カクテル(ナカライ社)を含む20mlのDDWに加え、4℃にて14時間、緩やかに震盪させながらインキュベートした。
端脚類動物(カイコウオオソコエビ)を回収してクロロホルムに浸漬した。DNAをDNイージー・血液&組織キット(キアゲン社)を使用して、製造業者の指示に従って、1gの該端脚類動物から抽出した。細菌および古細菌の16S rDNAは、共通プライマー対「Bac27f(5’−AGAGTTTGATCCTGGCTCAG−3’)(配列番号1)」および「Bac1492r(5’−GGTTACCTTGTTACGACTT−3’)(配列番号2)」、または「Arch21F(5’−TTCCGGTTGATCCYGCCGGA−3’)(配列番号3)」および「Arch958R(5’−YCCGGCGTTGAMTCCAATT−3’)(配列番号4)」の組み合わせを使用することにより、PCRに供した。PCR増幅(25μlの反応系)を、スピードスター−HS DNAポリメラーゼ(タカラバイオ株式会社)を用いてジーン・アンプ PCRシステム9700(アプライド・バイオシステムズ社)を使用して実施し、緩衝液を酵素とともに供給した。
端脚類動物(カイコウオオソコエビ)の10個体に由来するHGcelを部分的に精製した(上記のとおりに、60% 硫酸アンモニウム沈澱、およびその後のDEAEトーヨーパール陰イオン交換クロマトグラフィー)。セルラーゼ含有画分を回収およびプールし、次いで脱塩および濃縮した。セルラーゼ調製物をSDS−PAGEに供し、クマシー・ブリリアント・ブルー R−250(シグマ・オールドリッチ社)でゲルを染色することにより視覚化した。観察された単一の59kDaのバンドをゲルから切り出し、トリプシン処理した。処理後のペプチドを、LC−MS/MSシステム(HPLC:パラダイムMS2、ミクローム・バイオリソース社;MS:Q−Tof2、ウォータース・マイクロマス)を使用して解析した。MS(質量分析)のデータはすべて、マスコット・サーバー(マトリックス・サイエンス株式会社)を使用して解析した。
コピー用紙片 3.8mgに0.28UのHGCelを含む酵素調製液を滴下した後、風乾した。室温(25℃)にて15時間反応させた後、グルコースCIIキット試薬(和光純薬工業株式会社)を用いてグルコースの生成量を測定した。
(1)カイコウオオソコエビの捕獲
カイコウオオソコエビの海洋最深部での生育態様を観察するために、チャレンジャー海淵内にカメラ・システム「アシュラ(ASHURA)」を用いて10,000m級の自由落下−堆積物試料採取器を下降させ、カイコウオオソコエビを観察した。また、餌付き仕掛けを用いてカイコウオオソコエビを捕獲した(11°22.11’N、142°25.86’E、深さ:10,897m)。その結果、本発明者らは、3時間の間に185個体を捕獲するのに成功した。
カイコウオオソコエビが合成する加水分解酵素について、カイコウオオソコエビを破砕して得た抽出物を用いて、それぞれの基質を含む寒天平板上に形成されたハローを観察することにより確認した。デンプン、カルボキシメチルセルロース(CMC)、グルコマンナン、およびキシランを基質として含む寒天平板上でハローを確認することができた(図1cを参照)。アミラーゼ、セルラーゼ、マンナナーゼ、キシラナーゼ、α−グルコシダーゼおよびプロテアーゼの各活性を、任意に選択したカイコウオオソコエビの5個体を用いて測定した(表1を参照)。
破砕したカイコウオオソコエビの80% 飽和硫酸アンモニウム沈殿物を粗酵素として使用して、薄層クロマトグラフィー(TLC)により基質分解生成物を測定した。粗酵素におけるアミラーゼ活性により、30℃にて、ジャガイモ澱粉からグルコース、マルトース、マルトトリオースおよびマルトテトラオースを生成した(図1dを参照)。粗酵素におけるマンナナーゼ活性により、グルコマンナンを分解して、多くの低分子量多糖類を生成した。グルコマンナンの消化パターンは典型的なエンド型多糖類ヒドロラーゼの特性を示していた(図1eを参照)。ガラクトマンナンおよびカードランについては検出できなかった。
カイコウオオソコエビ抽出物は、pH 5.2〜6.0の間に最大の触媒活性があり、pH 8.0では活性が失われた(図1gを参照)。チャレンジャー海淵がpH 8.0であることからすると、上記結果は、これらの多糖類ヒドロラーゼがカイコウオオソコエビの体内において活性があることを示唆する。さらに、木質をセルロースおよびヘミセルロースへ加水分解する酵素活性の能力は、カイコウオオソコエビが海淵の最深部において、木質から栄養素を引き出す蓋然性を強く示唆する。
上記仮説を検証するために、カイコウオオソコエビ体内のオリゴ糖組成を測定した。カイコウオオソコエビの2個体はグルコースおよび二糖類を含み、体内に多糖類ヒドロラーゼ活性があることが証明された(図2a)。平均グルコース含有量は、0.43±0.1%(w/w)(乾燥質量)(n=5)であったが、二糖類含有量は大きな個体間差が見られた。そこで、30個体のカイコウオオソコエビを用いて、体内の二糖類の組成を測定したところ、マルトースおよびセロビオースの含有量はそれぞれグルコース含有量の35%および17%であった(図2bを参照)。
10個体のカイコウオオソコエビから新規セルラーゼであるHGcelを精製した。HGcelの分子量はSDS−PAGEにより59kDaであると判明した(図3aおよび図5を参照)。セルロースを加水分解するセルラーゼ活性の至適pHは5.6であった(図3bを参照)。また、セルラーゼ活性はpH 7.8(海底と同一のpH)では検出されなかった。pH 5.6における至適温度は25〜35℃であった(図3cを参照)。驚くべきことに、酵素は4℃条件下でも活性の20%以上を維持し、35℃で最も安定していた。さらに、40℃を超えると活性は消失し始めた(図3cを参照)。
0.28UのHGcelを含む酵素調製液を用いて3.8mgのコピー用紙片から生成されたグルコース量は0.82μgであった。また、HGcel酵素溶液をコピー用紙に滴下し(図7aを参照)、室温(25℃)で15時間おいて加水分解反応に供したところ、滴下した箇所を中心にグルコースが生産されていることが、グルコースCIIキット試薬を用いたピンク色の呈色により確認できた(図7bを参照)。同様にHGcel酵素溶液中におがくずを加えて加水分解反応に供したところ、グルコース生成による呈色が確認できた(図7cを参照)。これらの結果から、HGcelを含む酵素溶液を用いれば、セルロース固形材料からグルコースを生産できることが示された。
配列表の配列番号5〜7に記載のアミノ酸配列の情報に基づいて混合塩基プライマー(配列表の配列番号12〜17)を作成した。すなわち、配列番号5(TPPMGWLAWER)のアミノ酸配列に対してPrimer 211−F(ACNCCNCCNATGGGNTGGYTNGCNTGGGA:配列番号12)およびPrimer 211−R(TCCCANGCNARCCANCCCATNGGNGGNGT:配列番号13)を作成し;配列番号6(SQMALWAIMAAPLFMSNDLR)のアミノ酸配列に対して、Primer 212−F(ATGGCNYTNTGGGCNATHATGGCNGCNCCNYTNTTYATG:配列番号14)およびPrimer 212−R(CATRAANARNGGNGCNGCCATDATNGCCCANARNGCCAT:配列番号15)を作成し;ならびに、配列番号7(AVIAVNQDPLGIQGR)のアミノ酸配列に対してPrimer 22−F(GCNGTNATHGCNGTNAAYCARGAYCCNYTNGGNATHCARGG:配列番号16)およびPrimer 22−R(CCYTGDATNCCNARNGGRTCYTGRTTNACNGCDATNACNGC:配列番号17)を作成した。
Claims (10)
- 下記(1)〜(3)の性質を有する、結晶性セルロースを加水分解して主生成物としてグルコースを生成するエキソセルラーゼ活性を有する、カイコウオオソコエビ(Hirondellea gigas)に由来するセルラーゼ。
(1)分子量がSDS−PAGE法で55,000〜63,000である
(2)至適pHが5.4〜5.8である
(3)至適温度が25〜40℃である - 結晶性セルロースを加水分解して副生成物としてセロビオースを生成するエキソセルラーゼ活性を有する、請求項1に記載のセルラーゼ。
- 非結晶性セルロースを加水分解して主生成物としてグルコースを生成する活性を有し、かつ、結晶性セルロースを加水分解して生成されるグルコースの量が非結晶性セルロースを加水分解して生成されるグルコース量の1/100以上である、請求項1に記載のセルラーゼ。
- 酢酸ナトリウム緩衝液(pH 5.6)において35℃で5時間である反応条件下で、5%(w/v) おがくずを加水分解して主生成物として1μg/mL以上のグルコースを生成する活性を有する、請求項1に記載のセルラーゼ。
- 主生成物であるグルコースおよび副生成物であるセロビオースのモル比は1.5:1〜2.5:1である、請求項2に記載のセルラーゼ。
- 前記結晶性セルロースがおがくず、紙、繊維、木材およびアビセル、ならびに植物の茎、根、花および葉からなる群から選ばれる、請求項1に記載のセルラーゼ。
- 前記非結晶性セルロースがカルボキシメチルセルロース、リン酸膨潤セルロース、アルカリ膨潤セルロース、およびセルロースキサントゲン酸ナトリウムからなる群から選ばれる、請求項3に記載のセルラーゼ。
- 配列表の配列番号8に記載の塩基配列または該塩基配列に相補的な塩基配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする塩基配列によってコードされるアミノ酸配列を含み、かつ、結晶性セルロースを加水分解して主生成物としてグルコースを生成するエキソセルラーゼ活性を有し、かつ、カイコウオオソコエビ(Hirondellea gigas)に由来するセルラーゼ。
- 結晶性セルロースおよび/または非結晶性セルロースと請求項1〜8のいずれか1項に記載のセルラーゼとを反応させて主生成物としてグルコースを生成する工程を含む、
グルコースの製造方法。 - 結晶性セルロースおよび/または非結晶性セルロースと請求項1〜8のいずれか1項に記載のセルラーゼとを反応させて主生成物としてグルコースを生成する工程、および
生成したグルコースを醗酵させてアルコールを生産する工程を含む、
アルコールの製造方法。
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