KR20120115206A - 신규 글리코실 히드롤라제 효소 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 개시는 일반적으로, 글리코실 히드롤라제 효소, 그러한 효소를 포함하는 조성물, 및 효소 및 조성물을 이용하는 방법, 예를 들어 셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스 물질의 당으로의 당화 방법에 관한 것이다.

Description

신규 글리코실 히드롤라제 효소 및 이의 용도{NOVEL GLYCOSYL HYDROLASE ENZYMES AND USES THEREOF}
1. 관련 출원에 대한 교차-참조
본 출원은 그 개시가 본원에 참조로 혼입되어 있는 미국 가출원 제 61/245,273 호 (2009년 9월 23일자로 출원됨), 및 제 61/289,886 호 (2009년 12월 23일자로 출원됨) 를 우선권 주장한다.
2. 기술분야
일반적으로 본 개시는 글리코실 히드롤라제 효소, 그러한 효소를 포함하는 조성물, 및 예를 들어 셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스 물질을 당으로 전환 또는 당화를 위한 효소 및 조성물의 이용 방법에 관한 것이다.
3. 배경기술
액체 연료에 대한 대안으로서 알코올 (예를 들어, 에탄올) 을 제조하기 위해 이후 발효되는 발효가능한 당으로 재생가능한 리그노셀룰로오스 바이오매스의 생전환이 1970 년대 (OPEC 이 석유 생산량을 감소시켜 석유 위기가 발생했을때) 이래로, 연구자의 집중적인 주목을 끌고 있다 (Bungay, H. R., "Energy: Biomass options". NY: Wiley; 1981; Olsson L, Hahn-Hagerdal B. enzymes Microb Technol 1996,18:312-31; Zaldivar, J et al ., Appl Microbiol Biotechnol 2001, 56: 17-34; Galbe, M et al., Appl Microbiol Biotechnol 2002, 59:618-28). 에탄올은, 지난 이십년간 브라질에서 탈것에 대한 깔끔한 연로로서 또는 미국에서 가솔린에 대한 10% 배합물로서 널리 사용되어 왔다. 바이오에탄올 연료의 중요성은 오일 원천의 점차적 고갈 및 오일에 대한 가격이 고공행진하므로 날로 증가할 것이다. 또한, 발효가능한 당은 플라스틱을 생산하기 위해 사용이 증가되고 있고, 중합체 및 다른 바이오계 제품, 및 이의 산업이 앞으로 상당히 확장될 것으로 예상된다. 따라서, 석유계 공급재료를 대신하는 공급재료로서 사용될 수 있는 상당한 저비용의 발효가능한 당이 계속 요구되고 있다.
이용가능한 재생가능한 공급재료 중에서 주는 셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스 (자일란) 이며, 이는 발효가능한 당으로 전환될 수 있다. 이들 다당류를 가용성 당 (예를 들어, 글루코오스, 자일로오스, 아라비노오스, 갈락토오스, 만노오스, 및/또는 다른 헥소오스 및 펜토오스) 으로 효소적으로 전환하는 것은 다양한 효소의 조합된 작용으로 인해 발생한다. 예를 들어, 엔도-1,4-β-글루카나아제 (EG) 및 엑소-셀로비오스히드롤라제 (CBH) 는 셀로올리고당 (예를 들어, 셀로비오스가 주요 생성물임) 으로의 불용성 셀룰로오스의 가수분해를 촉매하는 반면, β-글루코시다아제 (BGL) 는 글루코오스로의 올리고당의 전환을 촉매한다. 자일라나아제 다른 부속 단백질과 함께 자일라나아제는 (이의 비제한적 예에는 L-α-아라비노푸라노시다아제, 페룰로일 및 아세틸자일란 에스테라아제, 글루쿠로니다아제, 및 β-자일로시다아제가 포함된다) 헤미셀룰로오스의 가수분해를 촉매한다.
식물의 세포벽은 공유적 및 비공유적 수단을 통해 상호작용하는 다당류 착물의 불균질 혼합물로 구성된다. 보다 높은 식물 세포벽의 다당류 착물에는 예를 들어 셀룰로오스 (β-1,4 글루칸) 이 포함되며, 이는 일반적으로 세포벽 성분에서 발견되는 탄소의 35-50% 를 구성한다. 셀룰로오스 중합체 자신은 반결정형 셀룰로오스 미소섬유를 형성하기 위해 수소 결합, 반데르발스 상호작용 및 소수성 상호작용을 통해 연계된다. 또한, 이들 미소섬유는 비결정형 부위, 일반적으로 무정형 셀룰로오스를 포함한다. 셀룰로오스 미소섬유는 헤미셀룰로오스 (예를 들어 자일란, 아라비난 및 만난 포함), 펙틴 (예를 들어, 갈락투로난스 및 갈락탄스), 및 다양한 다른 β-1,3 및 β-1,4 글루칸으로 형성된 매트릭스 중에서 파묻힌다. 예를 들어, 아라비노오스, 갈락토오스 및/또는 자일로오스로 종종 치환된 이들 매트릭스 중합체는 종종 고 착물 아라비노자일란, 아라비노갈락탄, 갈락토만난, 및 자일로글루칸을 고 산출하기 위해 남아 있다. 차례로, 헤미셀룰로오스 매트릭스는 폴리페놀성 리그닌으로 둘러싸인다.
매트릭스의 복잡성은, 효소가 미생물에 의해 핵심 셀룰로오스 미소섬유 상에 작용하기 전에 깨져야만 하는 리그닌 및 헤미셀룰로오스로서 미생물에 의해 분해되기 어렵게 만든다. 보통, 상이한 효소적 활성도의 제휴는 구성요소 단당류를 방출하기 위한 세포벽 중합체를 분해하는데 요구된다. 식물 세포벽의 당화를 위해, 리그닌은 침투화되어야만 하고 붕괴된 헤미셀룰로오스는 셀룰로오스-분해 효소가 이들의 기질 상에 작용하는 것을 허용해야만 한다.
셀룰로오스 원료 재료의 유형에 관계없이, 비용 및 효소의 가수분해성 효능은 바이오매스 바이오전환 공정의 상업적 이용가능성을 제한하는 주요 인자이다. 미생물학적으로 제조된 효소의 생산 비용은 효소-생산 긴장 및 발효 브로쓰에서 최종 활성 수율의 생산성과 밀접하게 연결되어 있다. 다중효소 착물의 가수분해성 착물은 개별 효소의 특성에 모두 의존적이고, 이들 중에서 다중효소 배합물에서 이들의 비에 상응효과를 낸다.
효소 및/또는 효소적 배합물/조성물을 동정하기 위한 필요성이 당업계에 존재하고 있으며 이는 개선된 효능 및 수율을 갖는 발효가능한 당으로 식물 및/또는 다른 셀룰로오스 또는 헤미셀룰로오스 물질을 전환할 수 있게 한다.
4. 개요
본 개시는 예를 들어, 자일라나아제 (예를 들어, 엔도자일라나아제), 자일로시다아제 (예를 들어, β-자일로시다아제), 아라비노푸라노시다아제 (예를 들어, L-α-아라비노푸라노시다아제), 이들 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함하는 헤미셀룰로라이틱 활성을 갖는 특정 글리코실 히드롤라제 폴리펩티드를 제공하며, 폴리펩티드 및/또는 핵산을 제조하는 방법 및 사용하는 방법을 제공한다. 본 개시는 부분적으로 자일라나아제, β-자일로시다아제, 및/또는 L-α-아라비노푸라노시다아제 활성을 갖는 신규한 효소 및 변이체의 발견에 부분적으로 기초하고 있다. 또한, 본 개시는 셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스 물질의 가수분해를 효율적으로 촉매하는 효소 배합물 (또는 조성물) 의 동정에 기초하고 있다. 본 개시의 목적을 위해, 효소는 특정 효소적 활성을 갖는 폴리펩티드로서 또는 효소로서 규정될 수 있다. 예를 들어, 자일라나아제는 자일라나아제 활성을 갖는 폴리펩티드로서 지칭될 수 있거나 자일라나아제 효소로서 지칭될 수 있고, β-자일로시다아제는 β-자일로시다아제 활성을 갖는 폴리펩티드 또는 β-자일로시다아제 효소로서 지칭될 수 있다.
본 개시의 효소 및/또는 효소 배합물/조성물은 바이오매스로부터 당을 제조하기 위해 사용될 수 있다. 이에 따라 제조된 당은 다양한 산업 적용에서 다른 바이오생성물을 제조하기 위해 사용될 수 있거나 에탄올 생산을 위한 미생물에 의해 사용될 수 있다. 따라서, 본 개시는 또한 본원에 기재되는 효소 및/또는 효소 배합물/조성물을 이용하는 산업적 적용을 제공한다 (예를 들어, 에탄올 생산에서 당화 공정). 본 개시의 효소 및/또는 효소 배합물/조성물은 바이오연료 제조에서 효소 비용을 감소시키기 위해 사용될 수 있다.
하나의 양태에서, 본 발명은 효소 (이의 변이체 포함), 또는 리그노셀룰로오스 바이오매스의 주요 성분을 가수분해하는데 유용한 효소 배합물/조성물 (예를 들어, 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 및 리그닌 포함) 또는 셀룰로오스 및/또는 헤미셀룰로오스를 포함하는 임의의 물질에 관한 것이다. 그러한 셀룰로오스 및/또는 헤미셀룰로오스를 포함하는 리그노셀룰로오스 바이오매스 및/또는 물질에는 예를 들어, 씨, 낟알, 튜버, 식물 폐기물 또는 식품 가공 또는 산업적 가공의 부산물 (예를 들어, 줄기), 옥수수 (예를 들어, 콥, 여물, 등 포함), 풀 (예를 들어, 인디안 그래스 (Indian grass), 예컨대 소르르가스트럼 누탄 (Sorghastrum nutan); 또는, 스위치그래스 (Switchgrass), 예를 들어, 파니쿰 종, 예컨대 파니쿰 비르가툼), 나무 (예를 들어, 목재 칩 (wood chip), 가공 폐기물 포함), 종이, 펄프, 재활용 종이 (예를 들어, 신문) 를 포함한다.
본 발명의 효소 배합물/조성물은 다양한 여러 식물에서 착물 구조의 β-1,4-연결된 글루코오스 부분, 또는 헤미셀룰로오스의 선형 사슬을 포함하는 셀룰로오스를 가수분해하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 효소 배합물/조성물은 다수의 상이한 효소를 포함할 수 있고, 이에는 예를 들어 셀룰라아제 및/또는 헤미셀룰라아제를 포함한다. 예를 들어, 본 발명의 효소 배합물/조성물은 적합한 공급재료 또는 바이오매스를 가수분해하기 위해 사용될 수 있다. 본 발명의 효소 배합물/조성물은 예를 들어, 예를 들어, 자일라나아제, 자일로시다아제, 셀로비오히드롤라제, 아라비노푸라노시다아제, 및/또는 단량체 당에 대한 헤미셀룰로오스를 소화할 수 있는 다른 효소로부터 선택된다. 본 발명의 효소 배합물/조성물은 하나 이상의 자일라나아제, 하나 이상의 자일로시다아제, 하나 이상의 셀로비오히드롤라제, 하나 이상의 아라비노푸라노시다아제로부터 선택되는 효소 둘 이상, 셋 이상, 또는 넷 이상의 혼합물, 및 단량체 당으로 헤미셀룰로오스를 전환할 수 있는 하나 이상의 다른 효소의 혼합물을 포함할 수 있다. 본 발명의 효소 배합물/조성물은 자일라나아제, 자일로시다아제, 셀로비오히드롤라제, 아라비노푸라노시다아제로부터 선택되는 효소 둘 이상, 셋 이상, 또는 넷 이상, 및 효소 배합물/조성물은 헤미셀룰로오스를 단량체 당으로 전환할 수 있는 하나 이상의 다른 효소의 혼합물을 포함할 수 있다. 본 발명의 효소 배합물/조성물의 비제한적 예에는 자일라나아제, 자일로시다아제, 셀로비오히드롤라제, 아라비노푸라노시다아제, 및 β-글루코시다아제의 혼합물이 포함된다. 본 발명의 효소 배합물/조성물은 비-자연 발생인 것에 적합하다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "자연 발생 조성물" 은 자연적으로 발생하는 기원에 의해 제조되는 조성물을 지칭하고, 이는 하나 이상의 효소적 성분 또는 활성을 포함하고, 이때 이들 성분 또는 활성 각각은 자연상태에서 발견되는 사람이 손이 닿지 않고 변형되지 않은 것에 의해 제조되는 수준 및 비율로 발견된다. 따라서, 자연적으로 발생하는 조성물은 예를 들어, 성분 효소의 비 또는 수준이 이의 자연 환경에서 자연 유기체에 의해 생산되는 것에서 변경되지 않은 것이다. 반면, "비-자연 발생 조성물" 은 하기에 의해 제조되는 조성물을 지칭한다: (1) 자연적으로 발생하는 비 또는 비-자연 발생 (즉, 변경된) 비에서 셀룰로오스분해 또는 헤미셀룰로오스분해 효소 성분을 조합하는 것, 즉 변경되는 비; 또는 (2) 하나 이상의 내인성 또는 외인성 효소를 발현하거나, 과다발현하거나 축소발현하기 위해 유기체를 변형한 것; 또는 (3) 하나 이상의 내인성 효소가 결실되도록 유기체를 변형한 것. "비-자연 발생 조성물" 은 또한 자연-발생 및 변형되지 않은 유기체에 의해 제조되는 조성물을 지칭할 수 있으나, 특정 효소의 중량 비 또는 양이 이의 자연 습성대로 자연 유기체 성장에 의해 제조된 조성물 중에 존재하는 것과 상이하도록, 조성물을 지칭할 수 있다.
본원에 기술되는 본 발명의 효소 배합물/조성물은, 예를 들어 발효 브로쓰이다. 발효 브로쓰는 사상균 중 하나 일 수 있고, 예를 들어 하기를 포함한다: 트리코더마 (Trichoderma), 휴미콜라 (Humicola), 후사리움 (Fusarium), 아스퍼길러스 (Aspergillus), 뉴로스포라 (Neurospora), 페니실리움 (Penicillium), 세팔로스포리움 (Cephalosporium), 아클야 (Achlya), 포도스포라 (Podospora), 엔도티아 (Endothia), 무코르 (Mucor), 코클리오볼러스 (Cochliobolus), 피리쿨라리아 (Pyricularia), 또는 크리소스포리움 (Chrysosporium). 트리코더마 종 (Trichoderma spp.) 의 예시적 균류는 트리코더마 레세이 (Trichoderma reesei) 이다. 페니실리움 종 (Penicillium spp.) 의 예시적 균류는 페니실리움 푸니쿨로숨 (Penicillium funiculosum) 이다. 발효 브로쓰는 예를 들어 세포-미함유 발효 브로쓰 또는 전체 세포 브로쓰일 수 있다.
본원에 기술된 본 발명의 효소 배합물/조성물은 다른 예에서 셀룰라아제 조성물이다. 셀룰라아제 조성물은 사상균 셀룰라아제 조성물이며, 예를 들어, 트리코더마, 예컨대 트리코더마 레세이, 셀룰라아제 조성물을 포함한다. 셀룰라아제 조성물은 사상균, 예를 들어, 트리코더마, 예컨대 트리코더마 레세이에 의해 생산될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 효소 배합물/조성물은 하기를 포함한다: (a) 하나 이상의 자일라나아제 효소(들), 이때 상기 하나 이상의 자일라나아제 효소(들) 중 하나 이상은 트리코더마 레세이 Xyn2, 트리코더마 레세이 Xyn3, AfuXyn2, 또는 AfuXyn5; (b) 하나 이상의 β-자일로시다아제 효소(들), 이때 상기 하나 이상의 β-자일로시다아제 효소(들) 중 하나 이상은 그룹 1 β-자일로시다아제 또는 그룹 2 β-자일로시다아제이며, 이때 상기 그룹 1 β-자일로시다아제는 Fv3A 또는 Fv43A 이고, 그룹 2 β-자일로시다아제는 Pf43A, Fv43D, Fv39A, Fv43E, Fo43A, Fv43B, Pa51A, Gz43A, 또는 트리코더마 레세이 Bxl1 이고; (c) 하나 이상의 L-α-아라비노푸라노시다아제 효소(들), 이때 상기 하나 이상의 L-α-아라비노푸라노시다아제 중 하나 이상은 Af43A, Fv43B, Pf51A, Pa51A, 또는 Fv51A 이고; (d) 하나 이상의 셀룰라아제 효소; 및 임의로는 (e) 하나 이상의 다른 성분. 효소 배합물/조성물은 적합하게는 비-자연 발생인 것이다. (d) 중 하나 이상의 셀룰라아제 효소(들) 은 인산 팽창된 셀룰로오스 (PASC) 1 g 당 단백질 1 mg 당 0.00005 이상의 분획 생성물을 달성할 수 있다 (칼코플루오르 검정에 의해 측정). 비제한적 예에서, 조성물 중 자일라나아제 효소(들)의 조합 중량은 조성물 중 총 단백질 중량 또는 조합된 단백질 중량의 5 중량% 내지 45 중량% (예를 들어, 5 중량% 내지 25 중량%, 5 중량% 내지 15 중량%, 10 중량% 내지 15 중량%) 를 구성하거나 나타낼 수 있는 반면, β-자일로시다아제 효소(들)의 조합된 중량은 조성물 중 총 단백질 중량 또는 조합된 단백질 중량의 2 중량% 내지 50 중량% (예를 들어, 2 중량% 내지 30 중량%, 5 중량% 내지 25 중량%, 5 중량% 내지 10 중량%) 를 구성하거나 나타낼 수 있는 반면, L-α-아라비노푸라노시다아제 효소(들) 중 조합된 중량은 조성물 중 총 단백질 중량 또는 조합된 중량의 2 중량% 내지 50 중량% (예를 들어, 2 중량% 내지 30 중량%, 2 중량% 내지 20 중량%, 5 중량% 내지 15 중량%, 5 중량% 내지 10 중량%) 를 구성하거나 나타낼 수 있는 반면, 셀룰라아제 효소(들)의 조합된 중량은 조성물 중 총 단백질 중량 또는 조합된 단백질 중량의 30 중량% 내지 80 중량% (예를 들어, 40 중량% 내지 70 중량%, 50 중량% 내지 60 중량%) 를 구성하거나 나타낼 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 효소 배합물/조성물은 예를 들어 발효 브로쓰 조성물이다. 발효 브로쓰는 예를 들어 사상균 중 하나이고 비제한적으로 하기를 포함한다: 트리코더마, 휴미콜라, 후사리움, 아스퍼길러스, 뉴로스포라, 페니실리움, 세팔로스포리움, 아클야, 포도스포라, 엔도티아, 무코르, 코클리오볼러스, 피리쿨라리아, 또는 크리소스포리움. 트리코더마 종의 예시적 균류는 트리코더마 레세이이다. 페니실리움 종의 예시적 균류는 페니실리움 퍼니쿨로숨이다. 발효는 예를 들어, 세포-미함유 발효 브로쓰 또는 전체 세포 브로쓰이다. 본원에 기술된 바와 같은 효소 배합물/조성물은 또한 셀룰라아제 조성물, 예를 들어, 사상균 셀룰라아제 조성물일 수 있다. 예를 들어, 셀룰라아제 조성물은 사상균, 예컨대 트리코더마에 의해 생산될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 효소 배합물/조성물은 하기를 포함할 수 있다: (a) 하나 이상의 자일라나아제 효소(들) (이때, 상기 하나 이상의 자일라나아제 효소(들) 중 하나 이상은 트리코더마 레세이 Xyn2, 트리코더마 레세이 Xyn3, AfuXyn2, 또는 AfuXyn5 임); (b) 하나 또는 둘 모두의 그룹 1 β-자일로시다아제 효소: Fv3A 및 Fv43A; (c) 하기로부터 선택되는 하나 이상의 그룹 2 β-자일로시다아제 효소(들): Pf43A, Fv43D, Fv39A, Fv43E, Fo43A, Fv43B, Pa51A, Gz43A, 및/또는 트리코더마 레세이 Bxl1; (d) 하나 이상의 셀룰라아제 효소(들); 및 임의로는 (e) 하나 이상의 다른 성분. (e) 의 하나 이상의 셀룰라아제 효소(들)은 바람직하게는 인산 팽창된 셀룰로오스 (PASC) 1 g 당 단백질 1 mg 당 0.00005 이상의 분획 생성물을 달성할 수 있다 (칼코플루오르 검정에 의해 측정된 바와 같음). 효소 배합물/조성물은 적합하게는 비-자연 발생인 것이다. 비제한적 예에서, 조성물 중 자일라나아제 효소(들)의 조합된 중량은 조성물 중 총 단백질 중량 또는 조합된 단백질 중량의 5 중량% 내지 45 중량% (예를 들어, 5 중량% 내지 25 중량%, 5 중량% 내지 15 중량%, 10 중량% 내지 15 중량%) 를 구성하거나 나타낼 수 있는 반면, 그룹 1 β-자일로시다아제 효소(들)의 조합된 중량은 조성물 중 총 단백질 중량의 2 중량% 내지 50 중량% (예를 들어, 2 중량% 내지 30 중량%, 5 중량% 내지 25 중량%, 5 중량% 내지 10 중량%) 를 구성할 수 있는 반면, 그룹 2 β-자일로시다아제 효소(들)은 조성물 중 총 단백질 중량의 2 중량% 내지 50 중량% (예를 들어, 2 중량% 내지 30 중량%, 5 중량% 내지 25 중량%, 5 중량% 내지 10 중량%) 를 구성할 수 있고, 이때 셀룰라아제 효소(들)의 조합된 중량은 조성물 중 총 단백질 중량 또는 조합된 단백질 중량의 30 중량% 내지 80 중량% (예를 들어, 40 중량% 내지 70 중량%, 50 중량% 내지 60 중량%) 를 구성하거나 나타낼 수 있다. 그룹 1 β-자일로시다아제 효소의 중량 대 그룹 2 β-자일로시다아제 효소의 중량의 비는 예를 들어, 1:10 내지 10:1 (예를 들어, 1:8 내지 8:1, 1:6 내지 6:1, 1:4 내지 4:1, 1:2 내지 2:1, 또는 1:1) 일 수 있다. 효소 배합물/조성물은 추가 성분을 추가로 포함할 수 있으며, 이는 부속 단백질 또는 다른 단백질/비-단백질 성분일 수 있다. 추가 성분은 조성물 중 단백질의 총 중량의 예를 들어, 1 중량% 내지 50 중량%, 1 중량% 내지 10 중량%, 2 중량% 내지 5 중량%, 5 중량% 내지 10 중량%, 또는 5 중량% 내지 20 중량% 를 구성할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 효소 배합물/조성물은 예를 들어, 발효 브로쓰 조성물이다. 발효 브로쓰는 예를 들어 사상균 중 하나이고 하기를 비제한적으로 포함한다: 트리코더마 , 휴미콜라 , 후사리움 , 아스퍼길러스 , 뉴로스포라 , 페니실리움 , 세팔로스포리움 , 아클야 , 포도스포라 , 엔도티아 , 무코르 , 코클리오볼러스 , 피리쿨라리 아, 또는 크리소스포리움. 트리코더마 종의 예시적 균류는 트리코더마 레세이이다. 페니실리움 종 의 예시적 균류는 페니실리움 푸니쿨로숨이다. 발효는 예를 들어, 세포-미함유 발효 브로쓰 또는 전체 세포 브로쓰일 수 있다. 또한, 본원에 기술된 바와 같은 효소 배합물/조성물은 셀룰라아제 조성물, 예를 들어, 사상균 셀룰라아제 조성물일 수 있다. 셀룰라아제 조성물은 예를 들어 사상균, 예컨대 트리코더마에 의해 생산될 수 있다.
추가의 예에서, 본 발명의 효소 배합물/조성물은 하기를 포함한다 (a) 하나 이상의 자일라나아제 효소(들) (이때, 상기 하나 이상의 자일라나아제 효소(들) 중 하나 이상은 트리코더마 레세이 Xyn2, 트리코더마 레세이 Xyn3, AfuXyn2, 또는 AfuXyn5 임); (b) 하나 이상의 β-자일로시다아제 효소(들) (이때, 하나 이상의 β-자일로시다아제 효소(들) 중 하나 이상은 그룹 1 β-자일로시다아제 효소 Fv3A 또는 Fv43A 또는 그룹 2 β-자일로시다아제 효소 Pf43A, Fv43D, Fv39A, Fv43E, Fo43A, Fv43B, Pa51A, Gz43A, 및/또는 트리코더마 레세이 Bxl1 임); (c) 하나 이상의 L-α-아라비노푸라노시다아제 효소(들) (이때, 상기 하나 이상의 L-α-아라비노푸라노시다아제 효소(들) 중 하나 이상은 Af43A, Fv43B, Pf51A, 또는 Fv51A 임); (d) 하나 이상의 β-글루코시다아제 효소(들); 및 임의로는 (e) 하나 이상의 다른 성분. 효소 배합물/조성물은 비-자연 발생인 것이다. 비제한적 예에서, 조성물 중 자일라나아제 효소(들)의 조합된 중량은 조성물 중 총 단백질 중량 또는 조합된 단백질 중량의 5 중량% 내지 45 중량% (예를 들어, 5 중량% 내지 25 중량%, 5 중량% 내지 15 중량%, 10 중량% 내지 15 중량%) 를 구성하거나 나타낼 수 있는 반면, β-자일로시다아제 효소(들)의 조합된 중량은 조성물 중 총 단백질 중량의 2 중량% 내지 50 중량% (예를 들어, 2 중량% 내지 30 중량%, 5 중량% 내지 25 중량%, 5 중량% 내지 10 중량%) 를 구성할 수 있는 반면, L-α-아라비노푸라노시다아제 효소(들)의 조합된 중량은 조성물 중 총 단백질 중량의 2 중량% 내지 50 중량% (예를 들어, 2 중량% 내지 30 중량%, 5 중량% 내지 25 중량%, 5 중량% 내지 10 중량%) 를 구성할 수 있고, 이때 β-글루코시다아제 효소(들)의 조합된 중량은 조성물 중 총 단백질 중량 또는 조합된 단백질 중량의 2 중량% 내지 50 중량% (예를 들어, up 내지 50 중량%, 2 중량% 내지 10 중량%, 또는 3 중량% 내지 8 중량%) 을 구성할 수 있다. 효소 배합물/조성물은 추가 성분을 추가로 포함할 수 있고, 이는 부속 단백질 또는 다른 단백질/비-단백질 성분일 수 있다. 추가 성분은 조성물 중 총 중량의 예를 들어, 1 중량% 내지 50 중량%, 1 중량% 내지 10 중량%, 2 중량% 내지 5 중량%, 5 중량% 내지 10 중량%, 또는 5 중량% 내지 20 중량% 를 구성할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 효소 배합물/조성물은 예를 들어, 발효 브로쓰 조성물이다. 발효 브로쓰는 예를 들어, 사상균 중에서 하기를 비제한적으로 포함한다: 트리코더마 , 휴미콜라 , 후사리움 , 아스퍼길러스 , 뉴로스포라 , 페니실리움 , 세팔로스포리움 , 아클야 , 포도스포라 , 엔도티아 , 무코 르, 코클리오볼러스, 피리쿨라리아, 또는 크리소스포리움. 트리코더마 종의 예시적 균류는 트리코더마 레세이이다. 페니실리움 종의 예시적 균류는 페니실리움 푸니쿨로숨이다. 발효는 예를 들어, 세포-미함유 발효 브로쓰 또는 전체 세포 브로쓰일 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 효소 배합물/조성물은 셀룰라아제 조성물, 예를 들어, 사상균 셀룰라아제 조성물일 수 있다. 셀룰라아제 조성물은, 예를 들어, 사상균, 예컨대 트리코더마에 의해 생산될 수 있다.
본 발명의 효소 배합물/조성물은 예를 들어 하기를 포함할 수 있다: (a) 하나 이상의 자일라나아제 효소(들) (이때, 상기 하나 이상의 자일라나아제 효소(들) 중 하나 이상은 트리코더마 레세이 Xyn2, 트리코더마 레세이 Xyn3, AfuXyn2, 또는 AfuXyn5 임); (b) 하나 또는 둘 모두의 그룹 1 β-자일로시다아제 효소: Fv3A 및 Fv43A; (c) 하기로부터 선택되는 하나 이상의 그룹 2 β-자일로시다아제 효소(들): Pf43A, Fv43D, Fv39A, Fv43E, Fo43A, Fv43B, Pa51A, Gz43A, 및/또는 트리코더마 레세이 Bxl1; 및 (d) 하나 이상의 β-글루코시다아제 효소(들); 및 임의로는 (e) 하나 이상의 다른 성분. 효소 배합물/조성물은 적합하게는 비-자연 발생인 것이다. 비제한적 예에서, 자일라나아제 효소(들) 중 조합된 중량은 조성물 중 단백질의 총 중량의 5 중량% 내지 45 중량% (예를 들어, 5 중량% 내지 25 중량%, 5 중량% 내지 15 중량%, 10 중량% 내지 15 중량%) 를 구성하는 반면, 그룹 1 β-자일로시다아제 효소(들)의 조합된 중량은 조성물 중 단백질의 총 중량의 2 중량% 내지 50 중량% (예를 들어, 2 중량% 내지 30 중량%, 5 중량% 내지 25 중량%, 5 중량% 내지 10 중량%) 를 구성하는 반면, 그룹 2 β-자일로시다아제 효소(들)의 조합된 중량은 조성물 중 단백질의 총 중량의 2 중량% 내지 50 중량% (예를 들어, 2 중량% 내지 30 중량%, 5 중량% 내지 25 중량%, 5 중량% 내지 10 중량%) 를 구성하는 반면, β-글루코시다아제 효소(들)의 조합된 중량은 조성물 중 단백질의 총 중량의 2 중량% 내지 50 중량% (예를 들어, 2 중량% 내지 30 중량%, 5 중량% 내지 25 중량%, 5 중량% 내지 10 중량%) 를 구성한다. 그룹 1 β-자일로시다아제 효소의 중량 대 그룹 2 β-자일로시다아제 효소의 중량의 비는 예를 들어, 1:10 내지 10:1, 예를 들어, 1:8 내지 8:1, 1:6 내지 6:1, 1:4 내지 4:1, 1:2 내지 2:1, 또는 1:1 일 수 있다. 효소 배합물/조성물은 추가 성분을 추가로 포함할 수 있고, 이는 부속 단백질 또는 다른 단백질/비-단백질 성분일 수 있다. 추가 성분은 조성물 중 단백질의 총 중량의 예를 들어, 1 중량% 내지 50 중량%, 1 중량% 내지 10 중량%, 2 중량% 내지 5 중량%, 5 중량% 내지 10 중량%, 또는 5 중량% 내지 20 중량% 를 구성할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 효소 배합물/조성물은 예를 들어, 발효 브로쓰 조성물이다. 발효 브로쓰는 예를 들어, 사상균 중에서 비제한적으로 하기를 포함한다: 트리코더마, 휴미콜라, 후사리움, 아스퍼길러스, 뉴로스포라, 페니실리움, 세팔로스포리움, 아클야, 포도스포라, 엔도티아, 무코르, 코클리오볼러스, 피리쿨라리아, 또는 크리소스포리움. 트리코더마 종의 예시적 균류는 트리코더마 레세이이다. 페니실리움 종의 예시적 균류는 페니실리움 푸니쿨로숨이다. 발효는 예를 들어, 세포-미함유 발효 브로쓰 또는 전체 세포 브로쓰일 수 있다. 또한, 본원에 기술된 바와 같은 효소 배합물/조성물은 셀룰라아제 조성물, 예를 들어, 사상균 셀룰라아제 조성물일 수 있다. 셀룰라아제 조성물은, 예를 들어, 사상균, 예컨대 트리코더마에 의해 생산될 수 있다.
더욱이, 본 발명의 효소 배합물/조성물은 예를 들어 하기를 포함할 수 있다: (a) 하나 이상의 자일라나아제 효소(들) (이때, 상기 하나 이상의 자일라나아제 효소(들) 중 하나 이상은 트리코더마 레세이 Xyn2, 트리코더마 레세이 Xyn3, AfuXyn2, 또는 AfuXyn5 임); (b) 하나 이상의 β-자일로시다아제 효소(들) (이때, 상기 하나 이상의 β-자일로시다아제 효소(들) 중 하나 이상은 그룹 1 β-자일로시다아제 또는 그룹 2 β-자일로시다아제이고, 이때 그룹 1 β-자일로시다아제는 Fv3A 또는 Fv43A 일 수 있고, 그룹 2 β-자일로시다아제는 Pf43A, Fv43D, Fv39A, Fv43E, Fo43A, Fv43B, Pa51A, Gz43A, 및/또는 트리코더마 레세이 Bxl1 일 수 있고; 및 (c) 하나 이상의 L-α-아라비노푸라노시다아제 효소(들) (이때, 상기 하나 이상의 L-α-아라비노푸라노시다아제 효소(들) 중 하나 이상은 Af43A, Fv43B, Pf51A, 또는 Fv51A 임); 및 임의로는 (d) 하나 이상의 다른 성분. 효소 배합물/조성물은 적합하게는 비-자연 발생인 것이다. 비제한적 예에서, 자일라나아제 효소(들)의 조합된 중량은 조성물 중 총 단백질 중량의 5 중량% 내지 45 중량% (예를 들어, 5 중량% 내지 25 중량%, 5 중량% 내지 15 중량%, 10 중량% 내지 15 중량%) 를 구성하는 반면, β-자일로시다아제 효소(들)의 조합된 중량은 조성물 중 총 단백질 중량의 2 중량% 내지 50 중량% (예를 들어, 2 중량% 내지 30 중량%, 5 중량% 내지 25 중량%, 5 중량% 내지 10 중량%) 를 구성하는 반면, L-α-아라비노푸라노시다아제 효소(들)의 조합된 중량은 조성물의 총 단백질 중량의 2 중량% 내지 50 중량% (예를 들어, 2 중량% 내지 30 중량%, 5 중량% 내지 25 중량%, 5 중량% 내지 10 중량%) 를 구성한다. 효소 배합물/조성물은 추가 성분을 추가로 포함할 수 있고, 이는 부속 단백질 또는 다른 단백질/비-단백질 성분일 수 있다. 추가 성분은 조성물 중 총 단백질의 예를 들어, 1 중량% 내지 50 중량%, 1 중량% 내지 10 중량%, 2 중량% 내지 5 중량%, 5 중량% 내지 10 중량%, 또는 5 중량% 내지 20 중량% 를 구성할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 효소 배합물/조성물은 예를 들어, 발효 브로쓰 조성물이다. 발효 브로쓰는 예를 들어, 사상균 중에서 비제한적으로 하기를 포함한다: 트리코더마 , 휴미콜라 , 후사리움 , 아스퍼길러스 , 뉴로스포라 , 페니실리움 , 세팔로스포리움 , 아클야 , 포도스포라, 엔도티아 , 무코르 , 코클리오볼러 스, 피리쿨라리아 , 또는 크리소스포리움. 트리코더마 종의 예시적 균류는 트리코더마 레세이이다. 페니실리움 종의 예시적 균류는 페니실리움 푸니쿨로숨이다. 발효는 예를 들어, 세포-미함유 발효 브로쓰 또는 전체 세포 브로쓰일 수 있다. 또한, 본원에 기술된 바와 같은 효소 배합물/조성물은 셀룰라아제 조성물, 예를 들어, 사상균 셀룰라아제 조성물일 수 있다. 셀룰라아제 조성물은, 예를 들어, 사상균, 예컨대 트리코더마에 의해 생산될 수 있다.
또한, 본 발명의 효소 배합물/조성물 하기를 포함하는 것일 수 있다: (a) 하나 이상의 자일라나아제 효소(들) (이때, 상기 하나 이상의 자일라나아제 효소(들) 중 하나 이상은 트리코더마 레세이 Xyn2, 트리코더마 레세이 Xyn3, AfuXyn2, 또는 AfuXyn5 임); (b) 하나 또는 둘 모두의 그룹 1 β-자일로시다아제 효소: Fv3A 및 Fv43A; (c) 하기로부터 선택되는 하나 이상의 그룹 2 β-자일로시다아제 효소(들): Pf43A, Fv43D, Fv39A, Fv43E, Fo43A, Fv43B, Pa51A, Gz43A, 및/또는 트리코더마 레세이 Bxl1; 및 임의로는 (d) 하나 이상의 다른 성분. 효소 배합물/조성물은 적합하게는 비-자연 발생인 것이다. 비제한적 예에서, 자일라나아제 효소(들)의 조합된 중량은 조성물 중 총 단백질 중량의 5 중량% 내지 45 중량% (예를 들어, 5 중량% 내지 25 중량%, 5 중량% 내지 15 중량%, 10 중량% 내지 15 중량%) 를 구성할 수 있는 반면, 그룹 1 β-자일로시다아제 효소(들)의 조합된 중량은 조성물 중 총 단백질 중량의 2 중량% 내지 50 중량% (예를 들어, 2 중량% 내지 30 중량%, 5 중량% 내지 25 중량%, 5 중량% 내지 10 중량%) 를 구성할 수 있는 반면, 그룹 2 β-자일로시다아제 효소(들)의 조합된 중량은 조성물 중 총 단백질 중량의 2 중량% 내지 50 중량% (예를 들어, 2 중량% 내지 30 중량%, 5 중량% 내지 25 중량%, 5 중량% 내지 10 중량%) 를 구성할 수 있다. 그룹 1 β-자일로시다아제 효소의 중량 대 그룹 2 β-자일로시다아제 효소의 중량은 예를 들어, 1:10 내지 10:1, 예를 들어, 1:8 내지 8:1, 1:6 내지 6:1, 1:4 내지 4:1, 1:2 내지 2:1, 또는 1:1 일 수 있다. 효소 배합물/조성물은 추가 성분을 추가로 포함할 수 있고, 이는 부속 단백질 또는 다른 단백질/비-단백질 성분일 수 있다. 추가 성분은 조성물 중 단백질의 총 중량의 예를 들어, 1 중량% 내지 50 중량%, 1 중량% 내지 10 중량%, 2 중량% 내지 5 중량%, 5 중량% 내지 10 중량%, 또는 5 중량% 내지 20 중량% 를 구성할 수 있다. 본원에 기술된 바와 같은 효소 배합물/조성물은 예를 들어, 발효 브로쓰 조성물이다. 발효 브로쓰는 예를 들어, 사상균 중에서 비제한적으로 하기를 포함한다: 트리코더마, 휴미콜라 , 후사리움 , 아스퍼길러스 , 뉴로스포라 , 페니실리움 , 세팔로스포리움 , 아클야 , 포도스포라 , 엔도티아 , 무코르 , 코클리오볼러스 , 피리쿨라리아 , 또는 크리소스포리움. 트리코더마 종의 예시적 균류는 트리코더마 레세이이다. 페니실리움 종의 예시적 균류는 페니실리움 푸니쿨로숨이다. 발효는 예를 들어, 세포-미함유 발효 브로쓰 또는 전체 세포 브로쓰일 수 있다. 또한, 본원에 기술된 바와 같은 효소 배합물/조성물은 셀룰라아제 조성물, 예를 들어, 사상균 셀룰라아제 조성물일 수 있다. 셀룰라아제 조성물은, 예를 들어, 사상균, 예컨대 트리코더마에 의해 생산될 수 있다.
본 개시의 효소, 효소 배합물/조성물은 식품 산업에서, 예를 들어, 베이킹에서, 과실 및 야채 가공에서, 농산 폐기물 분해에서, 동물 사료 제조에서, 펄프 및 종이 제조에서, 직물 제조에서, 또는 가전 및 산업 세정제에서 사용될 수 있다. 효소, 및 본 개시의 효소 배합물/조성물 중에서의 효소는 예를 들어, 각각 독립적으로 미생물, 예를 들어, 균류 또는 박테리아에 의해 생산된다.
또한, 본 개시의 효소, 효소 배합물/조성물은 임의의 적합한 원천 (모든 생물학적 원천, 예컨대 식물 바이오매스, 예를 들어, 옥수수, 낟알, 풀 (예를 들어, 인디안 그래스 (Indian grass), 예컨대 소르가스트럼 누탄스 (Sorghastrum nutans); 또는, 스위치그래스 (switchgrass), 예를 들어, 파니쿰 (Panicum) 종, 예컨대 파니쿰 비르가툼 (Panicum virgatum)) 포함) 으로부터 리그노셀룰로오스를 소화하기 위한 상업적 효소 또는 조성물로서 사용될 수 있거나, 목재 또는 목재 가공 부산물, 예를 들어, 목재 가공에서, 펄프 및/또는 종이 산업에서, 직물 제조에서, 가정용 및 산업용 세정제에서, 및/또는 바이오매스 폐기물 가공에서 사용될 수 있다.
또다른 양태에서, 본 개시는 적어도 약 10, 예를 들어, 적어도 약 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, 또는 2000, 잔기의 영역에 걸쳐, SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 46, 47, 48, 49, 또는 50 의 핵산 서열에 대해, 적어도 약 70%, 예를 들어, 적어도 약 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%; 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 완전한 (100%) 서열 일치성 을 갖는 단리된, 합성 또는 재조합 핵산을 제공한다. 이와 관련하여, 본 개시는 SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 46, 47, 48, 49, 또는 50 의 핵산 서열 또는 이의 단편에 대한 97%, 98%, 99%, 또는 완전한 (100%) 서열 일치성을 상보적으로 하기 위해 고도의 엄격 조건 하에서, 하이브리드화할 수 있는 단리된, 합성 또는 재조합 핵산을 제공한다. 단편은, 예를 들어, 적어도 150 인접 잔기 (길이), 예를 들어, 적어도 200, 250, 또는 300 인접 잔기 (길이) 일 수 있다. 본 개시는 헤미셀룰로오스분해 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 제공한다. 헤미셀룰로오스분해 활성을 갖는 폴리펩티드의 예에는 비제한적으로 하기가 포함된다: 자일라나아제, β-자일로시다아제, 및/또는 L-α- 아라비노푸라노시다아제.
또한, 본 개시는 하기를 포함하는 폴리펩티드를 포함하는 본 개시의 효소를 인코딩하는 단리된, 합성 또는 재조합 핵산을 제공한다: SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 43, 또는 44 의 아미노산 서열 또는 이의 하위서열 (예를 들어, 촉매적 도메인 ("CD") 또는 카르보하이드레이트 결합 모듈 ("CBM"), 또는 이의 적합한 변이체. 몇몇 구현예에서, 본 개시의 핵산은 SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 43, 또는 44 의 아미노산 서열의 성숙 단백질 부분을 인코딩하고, 이는 임의로는 비상동성 신호 서열, 예를 들어, 트리 코더마 레세이 CBHI 신호 서열에 작동가능하게 연결된다. 핵산은 바람직하게는 헤미셀룰로오스분해 활성을 갖는, 예를 들어, 자일라나아제, β-자일로시다아제, 및/또는 L-α- 아라비노푸라노시다아제 활성을 갖는 폴리펩티드를 인코딩한다. 본 개시의 핵산은 헤미셀룰라아제, 예를 들어, 자일라나아제, β-자일로시다아제, 및/또는 L-α- 아라비노푸라노시다아제, 또는 이의 적합한 변이체를 인코딩한다. 또한, 본 개시의 핵산은 하기 구획 6.2 에서 기술된다.
본 개시는 추가로 본 개시의 핵산은 또는 이의 하위서열을 포함하는 발현 카세트를 제공한다. 예를 들어, 핵산은 적어도 약 10 잔기, 예를 들어, 적어도 약 10, 20, 30, 40, 50, 75, 90, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 또는 500 잔기의 영역에 걸쳐 SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 46, 47, 48, 49, 또는 50 의 핵산 서열에 대해 적어도 약 70%, 예를 들어, 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 일치성을 갖는다. 또다른 예에서, 핵산은 SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 43, 또는 44 의 폴리펩티드를 인코딩하고, 이때 핵산은 임의로는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 프로모터는 예를 들어, 균류, 바이러스, 박테리아, 포유동물 또는 식물 프로모터일 수 있다. 프로모터는 구성요소적 프로모터 또는 유도가능한 프로모터일 수 있다. 적합한 예시적 프로모터는 사상균, 예를 들어, 트리코더마 레세 이에서 발현될 수 있다. 적합한 프로모터는 사상균, 예를 들어, 트리코더마 레세이로부터 유래될 수 있으며, 예를 들어, 트리코더마 레세이로부터의 셀로비오히드롤라제 I ("cbh1") 유전자 프로모터일 수 있다.
본 개시는 추가로 본 개시의 핵산을 발현하기 위해 조작된 재조합 세포 또는 본 개시의 발현 카세트를 제공한다. 예를 들어, 핵산은 적어도 약 10, 예를 들어, 적어도 약 15, 20, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 또는 500 뉴클레오티드 잔기의 영역에 걸쳐, SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 46, 47, 48, 49, 또는 50 의 핵산 서열에 대해 적어도 약 70%, 예를 들어, 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 일치성을 갖는다. 핵산은 SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 43, 또는 44 의 폴리펩티드를 인코딩할 수 있으며, 이때 핵산은 임의로는 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 발현 카세트는 적어도 약 10 뉴클레오티드 잔기에 걸쳐, SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 46, 47, 48, 49, 또는 50 에 대해 적어도 약 70% (예를 들어, 적어도 약 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%) 서열 일치성을 갖는 핵산을 포함할 수 있다. 예를 들어, 발현 카세트는 SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 43, 또는 44 의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 포함할 수 있으며, 이때 핵산은 임의로는 내지 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 재조합 세포는 바람직하게는 재조합 박테리아 세포, 재조합 포유동물 세포, 재조합 균류 세포, 재조합 효모 세포, 재조합 곤충 세포, 재조합 조류 세포, 또는 재조합 식물 세포이다. 예를 들어, 재조합 세포는 재조합 사상균 세포, 예컨대 트리코더마, 휴미콜라, 후사리움, 아스퍼길러스, 뉴로스포라, 페니실리움, 세팔로스포리움, 아클야, 포도스포라, 엔도티아, 무코르, 코클리오볼러스, 피리쿨라리아, 또는 크리소스포리움 세포이다.
본 개시는 본 개시의 핵산은 또는 본 개시의 발현 카세트를 포함하는 트랜스제닉 식물을 제공한다.
본 개시는 적어도 약 10, 예를 들어, 적어도 약 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 또는 350 잔기의 영역에 걸쳐, 또는 전장 미성숙 폴리펩티드, 전장 성숙 폴리펩티드, 전장 CD, 또는 전장 CBM 에 걸쳐, SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 43, 또는 44 의 폴리펩티드에 대해 적어도 약 80%, 예를 들어, 적어도 약 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 또는 완전한 (100%) 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 합성 또는 재조합 폴리펩티드를 제공한다. 예시적 폴리펩티드는 적어도 약 10, 예를 들어, 적어도 약 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600 잔기 (길이) 의 단편을 포함한다. 특정 구현예에서, 단편은 CD 및/또는 CBM 을 포함한다. 단편이 본 개시의 효소의 CD 및 CBM 둘 다를 포함하는 경우, 단편은 임의로는 CD 및 CBM 을 분리하는 링커를 포함한다. 링커는 자연 링커 또는 비상동성 링커일 수 있다. 특정 구현예에서, 본 개시의 폴리펩티드는 하나 이상의 헤미셀룰라아제 활성을 갖는다. 본 개시의 폴리펩티드 또는 펩티드 서열은 본 개시의 핵산에 의해 인코딩되는 서열을 포함한다. 예시적 폴리펩티드는 구획 6.1 에 기술되어 있다.
또한, 본 개시는 본 개시의 폴리펩티드의 하나 이상의 도메인을 포함하는 (예를 들어, CD, CBM, 또는 둘 다) 키메라 또는 융합 단백질을 제공한다. 하나 이상의 도메인은 제 2 아미노산 서열, 예를 들어, 신호 펩티드 서열에 작동가능하게 연결될 수 있다.
역으로, 본 개시는 본 개시의 폴리펩티드의 신호 서열을 포함하는 키메라 또는 융합 단백질을 제공하며, 이는 신호 서열과 자연적으로 연계되지 않은 비상동성 폴리펩티드의 아미노산 서열을 인코딩하는 제 2 서열에 작동가능하게 연결된다. 따라서, 본 개시는 하기를 포함하는 재조합 폴리펩티드를 제공한다: 잔기 1 내지 13, 1 내지 14, 1 내지 15, 1 내지 16, 1 내지 17, 1 내지 18, 1 내지 19, 1 내지 20, 1 내지 21, 1 내지 22, 1 내지 23, 1 내지 24, 1 내지 25, 1 내지 26, 1 내지 27, 1 내지 28, 1 내지 28, 1 내지 30, 1 내지 31, 1 내지 32, 1 내지 33, 1 내지 34, 1 내지 35, 1 내지 36, 1 내지 37, 1 내지 38, 또는 1 내지 40 의 폴리펩티드, 예를 들어, SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 43, 또는 44. 추가로 예시적 키메라 또는 융합 폴리펩티드는 구획 6.1.1 에 기술되어 있다.
또한, 본 개시는 하기를 포함하는 재조합 폴리펩티드의 제조 방법을 제공한다: (a) 본 개시의 폴리펩티드를 발현하기 위해 조작된 숙주 세포를 배양 하는 것; 및 (b) 폴리펩티드를 회수하는 것. 폴리펩티드의 회수는 예를 들어 폴리펩티드를 포함하는 발효 브로쓰의 회수를 포함한다. 특정 구현예에서, 폴리펩티드의 회수는 추가 정제 단계(들)을 포함할 수 있다.
본 개시는 하기를 포함하는 셀로올리고사카라이드, 아라비노자일란 올리고머, 또는 글루칸- 또는 셀룰로오스-포함 조성물을 가수분해, 분해 또는 붕괴하는 방법을 제공한다: 적합한 조건하에서 본 개시의 효소, 효소 배합물/조성물과 조성물을 접촉시키는 것, 이때 효소, 또는 효소 배합물/조성물은 셀로올리고사카라이드, 아라비노자일란 올리고머, 또는 글루칸- 또는 셀룰로오스-포함 조성물을 가수분해, 분해 또는 붕괴한다.
본 개시는 본 개시의 핵산에 의해 인코딩되는 본 개시의 폴리펩티드는, 또는 폴리펩티드를 포함하는 효소 "배합물" 또는 조성물 (또한 본원에서 용어 "효소 배합물/조성물") 을 제공한다. 몇몇 구현예에서, 본 개시의 폴리펩티드는 하기로부터 선택되는 하나 이상의 활성을 갖는다: 자일라나아제, β-자일로시다아제, 및 L-α-아라비노푸라노시다아제 활성을 갖는, 특정 구현예에서, 효소 배합물/조성물은 셀룰로오스 및 헤미셀룰로오스 중합체의 대사가능한 탄소 부분으로의 해중합에 사용되거나 또는 이에 유용하다. 본 개시의 효소 배합물은 조성물 예를 들어, 제조 생성물 형태일 수 있다. 조성물은 예를 들어 제형일 수 있고, 예를 들어, 액체 또는 고체의 물리적 형태를 취할 수 있다. 예시적 구현예에서, 본 개시의 효소 배합물/조성물은 하기로부터 선택되는 셋 이상의 상이한 효소 유형을 포함하는 셀룰라아제를 포함한다: (1) 엔도글루카나아제, (2) 셀로비오히드롤라제, 및 (3) β-글루코시다아제; 또는 하기로부터 선택되는 셋 이상의 상이한 효소적 활성 (1) 셀룰로오스 또는 헤미셀룰로오스 물질의 내부 β-1,4 연결의 분해를 촉매작용하는 엔도글루카나아제 활성, (보다 짧은 글루코올리고당 생성), (2) 셀로비오히드롤라제 활성 (셀로비오스 단위 (예를 들어, β-1,4 글루코오스-글루코오스 디사카라이드) 의 분해 및 방출을 촉매작용함 ("엑소" 방식)), 및 (3) β-글루코시다아제 활성 (짧은 셀로올리고당 (예를 들어, 셀로비오스) 으로부터 글루코오스 단량체의 방출을 촉매작용함). 예시적 본 개시의 효소 배합물/조성물은 하기 구획 6.3.4. 에 기술되어 있다.
또다른 양태에서, 본 개시는 하기를 포함하는 리그노셀룰로오스를 포함하는 바이오매스 물질을 가공하는 방법을 제공한다: 본 개시의 폴리펩티드와 발효가능한 당 및/또는 셀룰로오스를 포함하는 조성물을 접촉시키는 것, 또는 본 개시의 핵산에 의해 인코딩되는 폴리펩티드, 또는 본 개시의 효소 배합물/조성물 (예를 들어, 제조 생성물). 리그노셀룰로오스를 포함하는 적합한 바이오매스 물질은 농작물, 식품 또는 사료 생성 부산물, 리그노셀룰로오스 폐기물 생성, 식물 잔류물, 또는 폐지 또는 폐지 생성물로부터 유래될 수 있다. 본 개시의 폴리펩티드는 하기로부터 선택되는 하나 이상의 효소적 활성을 가질 수 있다: 셀룰라아제, 엔도글루카나아제, 셀로비오히드롤라제, β-글루코시다아제, 자일라나아제, 만난아제, β-자일로시다아제, 아라비노푸라노시다아제, 및 다른 헤미셀룰라아제 활성을 갖는, 적합한 식물 잔류물은 곡물, 씨, 줄기, 잎, 겉껍질, 껍질, 옥수수 속대, 옥수수 여물, 밀짚, 풀, 목재, 목재 칩, 목재 펄프 및 톱밥을 포함한다. 풀은 예를 들어, 인디안 그래스, 또는 스위치그래스일 수 있다. 또한, 풀은 예를 들어, 미스칸터스 (Miscanthus) 일 수 있다. 폐지는 예를 들어, 폐기된 또는 사용된 복사지, 컴퓨터 프린트지, 노트북 종이, 노트패드 종이, 타자기 종이, 신문지, 잡지, 보드지, 및 다양한 종이계 포장 물질일 수 있다. 폐지는 또한 예를 들어, 펄프일 수 있다.
본 개시는 헤미셀룰로오스- 및 셀룰로오스-가수분해 효소, 및 하나 이상의 바이오매스 물질의 혼합물을 포함하는 조성물 (본 개시의 효소, 효소 배합물/조성물, 예를 들어, 본 개시의 제조 생성물 포함) 을 제공한다. 임의로는 바이오매스 물질은 농작물로부터 유래하는 리그노셀룰로오스 물질을 포함한다. 대안적으로 바이오매스 물질은 식품 또는 사료 생성의 부산물이다. 적합한 바이오매스 물질은 또한 리그노셀룰로오스 폐기물 생성물, 식물 잔류물, 폐지 또는 폐지 생성물일 수 있거나, 또는 식물 잔류물을 포함한다. 식물 잔류물은 예를 들어, 곡물, 씨, 줄기, 잎, 겉껍질, 껍질, 옥수수 속대, 옥수수 여물, 풀, 밀짚, 목재, 목재 칩, 목재 펄프, 또는 톱밥을 포함하는 것 일 수 있다. 예시적 풀에는 비제한적으로 하기가 포함된다: 인디안 그래스 또는 스위치그래스. 또한 예시적 풀에는 미스칸터스가 포함될 수 있다. 예시적 폐지에는 비제한적으로 하기가 포함된다: 폐기된 또는 사용된 복사지, 컴퓨터 프린트지, 노트북 종이, 노트패드 종이, 타자기 종이, 신문지, 잡지, 보드지 및 종이계 포장 물질. 또한, 예시적 폐지에는 예를 들어, 펄프가 포함될 수 있다.
본원에 인용되는 공보, 특허, 특허 출원, GenBank 서열 및 ATCC 기탁을 포함하는 모든 공개물의 출원일로부터 이용가능한 정보는 본원에 참조로서 포함되어 있다.
표 및 도면의 간단한 설명
(도 111a-111c) 표 1A-1B: 표 1A 는 글리코실 히드롤라제 효소에 대해 본 개시에서 사용되는 서열 일치성의 요약을 제공하며; 표 1B 는 실시예에서 지칭되는 추가 글리코실 히드롤라제 효소에 대한 수납번호를 제공한다.
(도 111d) 표 2: 합성 기질 pNP 및 pNPX 상에서의 발현 단백질의 활성(하기 구획 7.1.6 에서 정의된 바와 같음) (트리코더마 레세이 Quad 결실 숙주 백그라운드 활성에 관한 면에서). Quad 결실 숙주 백그라운드 (또는 "XQuad") 는 Quad 결실 백그라운드 균주 (발현된 단백질(들) 없음) 의 활성에 의해 나눠지는 Quad 결실 균주에서 발현되는 단백질(들)의 활성으로서 정의된다. 예를 들어, >1 의 값은 발현 단백질이 백그라운드 보다 큰 활성을 갖는 것을 나타낸다.
(도 111e) 표 3: 버치우드 자일란을 갖는 정제된 후보자 엔도-자일라나아제의 자일라나아제 활성 (50℃, pH 5 에서 인큐베이션).
(도 111f) 표 4: 산 가수분해에 의해 측정된 바와 같이 총 당 이용성에 기초한 단량체 생성물에 대한 cob 아라비노자일란 올리고머의 %전환율. 참조, 실시예 4.
(도 111g) 표 5: 실험 결과 (실시예 7 에 기술된 바와 같음) 는 가수분해 처리된 옥수수속대의 단량체 당으로의 헤미셀룰라아제 활성의 수준으로 규정됨. "run #" 로 표시된 컬럼은 무작위 실험 순서를 나타낸다. "trial #" 로 표시된 컬럼은 표준 실험 설계 순서를 나타낸다. "Quad" 로 표시된 컬럼은 Quad 결실된 T. reesei 균주의 성장을 위한 배양 상청액으로부터의 총 단백질 분획을 나타낸다. "Xyn3" 로 표시된 컬럼은 트리코더마 레세이 Xyn3 인 총 단백질 분획을 나타낸다. "Fv43D" 로 표시된 컬럼은 Fv43D 인 총 단백질의 분획을 나타낸다. "Fv51A" 로 표시된 컬럼은 Fv51A 인 총 단백질의 분획을 나타낸다. "Fv43A" 로 표시된 컬럼은 Fv43A 인 총 단백질의 분획을 나타낸다. "Fv43B" 로 표시된 컬럼은, Fv43B 인 총 단백질의 분획을 나타낸다. "로딩 (ug/mg carbo)" 으로 표시된 컬럼은 카르보하이드레이트 1 mg 당 단백질의 미생물 1 ㎍ 의 단위로 당화 반응으로 로딩되는 단백질을 나타낸다. "Xyl mg/mL, Glu mg/mL, Arab mg/mL, 및 G+X+ mg/mL" 로 표시되는 컬럼은 자일로오스, 글루코오스, 아라비노오스의 농도를 나타내고, 당화 반응의 마지막에 검출되는 3 개의 당 생성물의 조합을 나타낸다. "Xyl %theor, Glu %theor, 및 Arab %theor" 로 표시된 컬럼은 당화 반응의 마지막에 도달되는 자일로오스, 글루코오스, 및 아라비노오스의 이론적 수율% 를 나타낸다.
(도 111i) 표 6: 옥수수속대의 가수분해로부터의 글루코오스, 자일로오스 및 아라비노오스의 예상되는 최대 수율을 위한 7 개의 효소적 성분의 계산 비. 컬럼 "총 로딩 mg/gr carb" 으로 표시되는 컬럼은 예측되는 총 효소 투여량을 계산한 것을 나타낸다. "총 mg/ml G+X+A, %수율 글루코오스, %수율 자일로오스, 및 %수율 아라비노오스" 로 표시된 열은 최적치가 계산되는 반응을 나타낸다. "r2 데이타 핏 투 모델 (둘 모두의 로딩 포함)" 으로 나타낸 컬럼은 표 5 에 제시된 모델 핏 투 데이타를 위한 r-정사각형 통계적 매개변수를 나타낸다. "분획 엑셀러라아제, 분획 Quad del sup, 정제 분획 트리코더마 레세이 Xyn3, 정제 분획Fv43D, 정제 분획Fv51A, 정제 분획Fv43A, 및 정제 분획Fv43B" 로 표시된 컬럼은 표 5 에서 모델 피팅된 데이타에 의해 최적으로 계산된 성분의 분획을 나타낸다.
(도 111j) 표 7: 1.06 g, 14% 건조 고체 전처리된 cob 반응에서 Fv3A 및 Fv43D 효소에 포함되는 배합물을 사용하는 옥수수속대의 최대 가수분해성 전환율에 대한 효소 로딩의 정련. 당화를 위한 조건은 실시예 7 에 기술되어 있다. 효소명으로 표시된 컬럼은 사용되는 자일란 또는 글루칸 1 g 당 나열된 효소 각각의 1 mg 을 나타낸다.
(도 111k) 표 8: 1.06 gr, 14% 건조 고체 전처리된 cob 반응에서 오직 L-α-아라비노푸라노시다아제로서 Fv51A 를 함유하는 배합물을 사용하는 옥수수속대의 최대 전환율의 효소 로딩의 정련. 당화를 위해 사용되는 조건은 실시예 7 에 기술된 바와 같다. 효소명으로 마킹된 컬럼은 사용되는 자일란 또는 글루칸의 1 g 당 나열된 효소 각각의 1 mg 을 나타낸다. 카르보하이드레이트로 마킹된 컬럼은 크기 배제 크로마토그래피 측정을 기초로 하여 생산된 각각의 카르보하이드레이트 생성물 1 mL 당 mg 을 나타낸다. >dp2 컬럼은 디사카라이드보다 큰 모든 올리고머를 나타낸다.
(도 111l) 표 9: 1.06 g, 14% 건조 고체 전처리된 cob 반응에서 시험되는 헤미셀룰라아제의 믹스 A, B, C 로부터 수득되는 당 수율. 당화를 위해 사용되는 조건은 실시예 7 에서 기술되는 바와 같다. 믹스 A: 6 mg 트리코더마 레세이 Xyn3, 4 mg Fv3A, 1 mg Fv51A (자일란 1 g 당). 믹스 B: 6 mg 트리코더마 레세이 Xyn3, 1 mg Fv43D, 3 mg Fv43A, 3 mg Fv43B (자일란 1 g 당). 믹스 C: 6 mg 트리코더마 레세이 Xyn3, 3 mg Fv3A, 1 mg Fv43D, 1 mg Fv51A (자일란 1 g 당). 단량체 당으로 마킹된 컬럼은 나열된 단량체 각각의 %수율을 나타낸다.
(도 111m) 표 10: 옥수수속대, 수수류, 스위치그래스 및 당 케인 바가스로부터 제조된 헤미셀룰로오스의 처리로부터 당 수율 (헤미셀룰라아제 믹스 A, B, C 에 의해) . 반응을 100-mL 규모로 수행하였고 48℃ 에서 6 시간 동안 50 mM pH 5.0 나트륨 아세테이트 완충제 중에서 수행하였다 (실시예 8 에 기술된 바와 같음). 각 단량체에 대한 %수율을 보여준다.
(도 111n) 표 11: 다양한 T. reesei 통합된 발현 균주 (designated H3A, 39A, 69A, A10A, G6A, 102, 44A, 11A, G9A) 에 의해 대다수 효소 발현되는 농도 (통합된 HPLC 영역의 % 로 측정되는 바와 같음).
(도 111o) 표 12: 스위치그래스 전처리 매개변수 목록 및 다양한 전처리로부터 생성된 당화.
(도 111p) 표 13: T. reesei 통합된 균주, H3A, 상이한 양의 고체, 효소, 및 인큐베이션 시간의 상이한 양으로 반응하는 T. reesei 통합된 균주, H3A 에 의해 생산되는 효소 조성물을 갖는 경질 목재 펄프의 당화 결과.
(도 111q) 표 14: 온도 및 pH 범위에 걸쳐 통합된 균주 H3A 에 의해 생산되는 효소 조성물을 갖는 경질목재 펄프의 당화.
하기 및 도면에 나열된 신호 서열은 예상된다. 신호 P 알고리틈으로 예측한다 ( http://www.cbs.dtu.dk). 도메인 예측은 Pfam, SMART, 또는 NCBI 데이타베이스 하나 이상을 기초로 함.
도 1A-1B: 도 1A: Fv3A 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO:1). 도 1B: Fv3A 아미노산 서열 (SEQ ID NO:2). SEQ ID NO:2 는 미성숙 Fv3A 의 서열이다. Fv3A 는 SEQ ID NO:2 의 위치 1 내지 23 에 상응하는 신호 서열을 예측한 것이다 (밑줄); 신호 서열의 쪼개짐은 SEQ ID NO:2 의 위치 24 내지 766 에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 수득하기 위해 예측되고, 예측된 전환 도메인은 볼드체로 나타낸다.
도 2A-2B: 도 2A: Pf43A 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO:3). 도 2B: Pf43A 아미노산 서열 (SEQ ID NO:4). SEQ ID NO:4 은 미성숙 Pf43A 의 서열이다. Pf43A 는 SEQ ID NO:4 (밑줄) 의 위치 1 내지 20 에 상응하는 신호 서열을 예측한다; 신호 서열의 쪼개짐은 SEQ ID NO:4 의 위치 21 내지 445 에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 수득하기 위해 예측된다. 예측된 보존된 도메인은 볼드체이고, 카르보하이드레이트 결합 모듈로 예측된다 ("CBM" 은 상위 유형이고, CD 및 CBM 를 분리하는 예측된 링커는 이탤릭체로 나타냄).
도 3A-3B: 도 3A: Fv43E 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO:5). 도 3B: Fv43E 아미노산 서열 (SEQ ID NO:6). SEQ ID NO:6 은 미성숙 Fv43E 의 서열이다. Fv43E 는 SEQ ID NO:6 (밑줄) 의 위치 1 내지 18 에 상응하는 신호 서열을 예측한 것이다; 신호 서열의 쪼개짐은 SEQ ID NO:6 의 위치 19 내지 530 에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 수득하기 위해 예측된다. 예측된 보존된 도메인은 볼드체로 나타낸다.
도 4A-4B: 도 4A: Fv39A 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO:7). 도 4B: Fv39A 아미노산 서열 (SEQ ID NO:8). SEQ ID NO:8 은 미성숙 Fv39A 의 서열이다. Fv39A SEQ ID NO:8 (밑줄) 의 위치 1 내지 19 에 상응하는 신호 서열을 예측한 것이다; 신호 서열의 쪼개짐은 SEQ ID NO:8 의 위치 20 내지 439 에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 수득하기 위해 예측된다. 예측된 보존된 도메인은 볼드체로 나타낸다.
도 5A-5B: 도 5A: Fv43A 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO:9). 도 5B: Fv43A 아미노산 서열 (SEQ ID NO:10). SEQ ID NO:10 은 미성숙 Fv43A 의 서열이다. Fv43A 는 SEQ ID NO:10 (밑줄) 의 위치 1 내지 22 에 상응하는 신호 서열을 예측한 것이다; 신호 서열의 쪼개짐은 SEQ ID NO:10 의 위치 23 내지 449 에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 수득하기 위해 예측된다. 예측된 보존된 도메인은 볼드체로 나타내고, 예측된 CBM 은 대문자로 나타내고, 보존된 도메인 및 CBM 을 분리하는 예측된 링커는 이탤릭체로 나타낸다.
도 6A-6B: 도 6A: Fv43B 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO:11). 도 6B: Fv43B 아미노산 서열 (SEQ ID NO:12). SEQ ID NO:12 은 미성숙 Fv43B 의 서열임. Fv43B 는 SEQ ID NO:12 (밑줄) 의 위치 1 내지 16 에 상응하는 예측된 신호 서열을 갖고; 신호 서열의 쪼개짐은 SEQ ID NO:12 의 위치 17 내지 574 에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 수득하기 위해 예측된다. 예측된 보존된 도메인은 볼드체로 나타낸다.
도 7A-7B: 도 7A: Pa51A 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO:13). 도 7B: Pa51A 아미노산 서열 (SEQ ID NO:14). SEQ ID NO:14 은 미성숙 Pa51A 의 서열이다. Pa51A 는 SEQ ID NO:14 (밑줄) 의 위치 1 내지 20 에 상응하는 예측된 신호 서열을 갖고; 신호 서열의 쪼개짐은 SEQ ID NO:14 의 위치 21 내지 676 에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 수득하기 위해 예측된다. 예측된 L-α-아라비노푸라노시다아제 보존된 도메인은 볼드체로 나타낸다. 발현 목적을 위해, 게놈 DN 는 T. reesei (참조, 도 60B) 에서 발현을 위해 최적화된 코돈이었다.
도 8A-8B: 도 8A: Gz43A 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO:15). 도 8B: Gz43A 아미노산 서열 (SEQ ID NO:16). SEQ ID NO:16 은 미성숙 Gz43A 의 서열이다. Gz43A 은 SEQ ID NO:16 (밑줄) 의 위치 1 내지 18 에 상응하는 예측된 신호 서열을 갖는다; 신호 서열의 쪼개짐은 SEQ ID NO:16 의 위치 19 내지 340 에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 수득하기 위해 예측된다. 예측된 보존된 도메인은 볼드체로 나타낸다. 발현 목적을 위해, Gz43A 예측된 신호 서열은 T. reesei 에서 T. reesei CBH1 신호 서열 (미르클라비사플라타라 (myrklavisaflatara) (SEQ ID NO: 51))에 의해 대체되었다 (참조, 도 61).
도 9A-9B: 도 9A: Fo43A 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO:17). 도 9B: Fo43A 아미노산 서열 (SEQ ID NO:18). SEQ ID NO:18 은 미성숙 Fo43A 의 서열이다. Fo43A 는 SEQ ID NO:18 (밑줄) 의 위치 1 내지 20 에 상응하는 예측된 신호 서열을 갖는다; 신호 서열의 쪼개짐은 SEQ ID NO:18 의 위치 21 내지 348 에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 수득하기 위해 예측된다. 예측된 보존된 도메인은 볼드체로 나타낸다. 발현 목적을 위해, Fo43A 예측된 신호 서열은 T. reesei CBH1 신호 서열에 의해 대체되었다 (myrklavisaflatara (SEQ ID NO:51)) (참조, 도 62).
도 10A-10B: 도 10A: Af43A 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO:19). 도 10B: Af43A 아미노산 서열 (SEQ ID NO:20). SEQ ID NO:20 은 미성숙 Af43A 의 서열이다. 예측된 보존된 도메인은 볼드체로 나타낸다.
도 11A-11B: 도 11A: Pf51A 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO:21). 도 11B: Pf51A 아미노산 서열 (SEQ ID NO:22). SEQ ID NO:22 은 미성숙 Pf51A 의 서열이다. Pf51A 는 SEQ ID NO:22 (밑줄) 의 위치 1 내지 20 에 상응하는 예측된 신호 서열을 갖는다; 신호 서열의 쪼개짐은 SEQ ID NO:22 의 위치 21 내지 642에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 수득하기 위해 예측된다. 예측된 L-α-아라비노푸라노시다아제 보존된 도메인은 볼드체이다. 발현 목적을 위해, 예측된 Pf51A 신호 서열은 코돈 최적화된 T. reesei CBH1 신호 서열 (myrklavisaflatara (SEQ ID NO:51)) (밑줄) 에 의해 대체되었고 Pf51A 뉴클레오티드 서열은 T. reesei 에서 발현을 위해 코돈 최적화되었다 (참조, 도 63).
도 12A-12B: 도 12A: AfuXyn2 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO:23). 도 12B: AfuXyn2 아미노산 서열 (SEQ ID NO:24). SEQ ID NO:24 은 미성숙 AfuXyn2 의 서열이다. AfuXyn2 는 SEQ ID NO:24 (밑줄) 의 위치 1 내지 18 에 상응하는 예측된 신호 서열을 갖는다; 신호 서열의 쪼개짐은 SEQ ID NO:24 의 위치 19 내지 228 에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 수득하기 위해 예측된다. 예측된 GH11 보존된 도메인은 볼드체로 나타낸다.
도 13A-13B: 도 13A: AfuXyn5 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO:25). 도 13B: AfuXyn5 아미노산 서열 (SEQ ID NO:26). SEQ ID NO:26 은 미성숙 AfuXyn5 의 서열이다. AfuXyn5 는 SEQ ID NO:26 (밑줄) 의 위치 1 내지 19 에 상응하는 예측된 신호 서열을 갖는다; 신호 서열의 쪼개짐은 SEQ ID NO:26 의 위치 20 내지 313 에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 수득하기 위해 예측된다. 예측된 GH11 보존된 도메인은 볼드체이다.
도 14A-14B: 도 14A: Fv43D 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO:27). 도 14B: Fv43D 아미노산 서열 (SEQ ID NO:28). SEQ ID NO:28 은 미성숙 Fv43D 의 서열이다. Fv43D 은 SEQ ID NO:28 (밑줄) 의 위치 1 내지 20 에 상응하는 예측된 신호 서열을 갖고; 신호 서열의 쪼개짐은 SEQ ID NO:28 의 위치 21 내지 350 에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 수득하기 위해 예측된다. 예측된 보존된 도메인은 볼드체로 나타낸다.
도 15A-15B: 도 15A: Pf43B 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO:29). 도 15B: Pf43B 아미노산 서열 (SEQ ID NO:30). SEQ ID NO:30 은 미성숙 Pf43B 의 서열이다. Pf43B 는 SEQ ID NO:30 (밑줄) 의 위치 1 내지 20 에 상응하는 예측된 신호 서열을 갖고; 신호 서열의 쪼개짐은 SEQ ID NO:30 의 위치 21 내지 321 에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 수득하기 위해 예측된다. 예측된 보존된 도메인은 볼드체로 나타낸다.
도 16A-16B: 도 16A: Fv51A 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO:31). 도 16B: Fv51A 아미노산 서열 (SEQ ID NO:32). SEQ ID NO:32 은 미성숙 Fv51A 의 서열이다. Fv51A 은 SEQ ID NO:32 (밑줄) 의 위치 1 내지 19 에 상응하는 예측된 신호 서열을 갖고; 신호 서열의 쪼개짐은 SEQ ID NO:32 의 위치 20 내지 660 에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 수득하기 위해 예측된다. 예측된 L-α-아라비노푸라노시다아제 보존된 도메인은 볼드체이다.
도 17A-17B: 도 17A: Cg51B 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO:33). 도 17B: Cg51B 아미노산 서열 (SEQ ID NO:34). SEQ ID NO:34 은 미성숙 Cg51B 의 서열이다. Cg51B 는 SEQ ID NO:34 (밑줄) 의 위치 1 내지 20 에 상응하는 예측된 신호 서열을 갖고; 신호 서열의 쪼개짐은 SEQ ID NO:34 의 위치 21 내지 670 에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 수득하기 위해 예측된다. 예측된 보존된 도메인은 볼드체로 나타낸다.
도 18A-18B: 도 18A: Fv43C 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO:35). 도 18B: Fv43C 아미노산 서열 (SEQ ID NO:36). SEQ ID NO:36 은 미성숙 Fv43C 의 서열이다. Fv43C 는 SEQ ID NO:36 (밑줄) 의 위치 1 내지 22 에 상응하는 예측된 신호 서열을 갖고; 신호 서열의 쪼개짐은 SEQ ID NO:36 의 위치 23 내지 333 에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 수득하기 위해 예측된다. 예측된 보존된 도메인은 볼드체로 나타낸다.
도 19A-19B: 도 19A: Fv30A 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO:37). 도 19B: Fv30A 아미노산 서열 (SEQ ID NO:38). SEQ ID NO:38 미성숙 Fv30A 의 서열이다. Fv30A 는 SEQ ID NO:38 (밑줄) 의 위치 1 내지 19 에 상응하는 예측된 신호 서열을 갖고; 신호 서열의 쪼개짐은 SEQ ID NO:38 의 위치 20 내지 537 에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 수득하기 위해 예측된다.
도 20A-20B: 도 20A: Fv43F 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO:39). 도 20B: Fv43F 아미노산 서열 (SEQ ID NO:40). SEQ ID NO:40 은 미성숙 Fv43F 의 서열이다. Fv43F 은 SEQ ID NO:40 (밑줄) 의 위치 1 내지 20 에 상응하는 예측된 신호 서열을 갖고; 신호 서열의 쪼개짐은 SEQ ID NO:40 의 위치 21 내지 315 에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 수득하기 위해 예측된다.
도 21A-21B: 도 21A: 트리코더마 레세이 Xyn3 뉴클레오티드 서열 (SEQ ID NO:41). 도 21B: 트리코더마 레세이 Xyn3 아미노산 서열 (SEQ ID NO:42). SEQ ID NO:42 은 미성숙 트리코더마 레세이 Xyn3 의 서열이다. 트리코더마 레세이 Xyn3 은 SEQ ID NO:42 (밑줄) 의 위치 1 내지 16 에 상응하는 예측된 신호 서열을 갖고; 신호 서열의 쪼개짐은 SEQ ID NO:42 의 위치 17 내지 347 에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 수득하기 위해 예측된다. 예측된 보존된 도메인은 볼드체이다.
도 22: 트리코더마 레세이 Xyn2 (SEQ ID NO:43) 의 아미노산 서열. 신호 서열은 밑줄로 표시한다. 예측된 보존된 도메인 볼드체이다. 코딩 서열은 [Torronen et al. Biotechnology, 1992, 10:1461-65] 에서 발견될 수 있다.
도 23: 트리코더마 레세이 Bxl1 의 아미노산 서열(SEQ ID NO:44). 신호 서열은 밑줄로 표시한다. 예측된 보존된 도메인 볼드체이다. 코딩 서열은 [Margolles-Clark et al. Appl. Environ. Microbiol. 1996, 62(10):3840-46] 에서 발견될 수 있다.
도 24: 트리코더마 레세이 Bgl1 의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:45). 신호 서열은 밑줄로 표시한다. 예측된 보존된 도메인 볼드체이다. 코딩 서열은 [Barnett et al. Bio-Technology, 1991, 9(6):562-567] 에서 발견될 수 있다.
도 25: 칼코플루오르 검출을 갖는 PASC 가수분해를 사용하는 셀룰라아제 활성 검정.
도 26: 자일라나아제 용리 특성.
도 27: AfuXyn 5 의 2 개의 분리 단계의 SDS-PAGE 검출. 레인 1: 미정제 샘플; 레인 2: 페닐 컬럼으로부터의 용출액; 레인 3: GF 컬럼으로부터의 용출액.
도 28: pENTR/D-TOPO 플라스미드.
도 29: pTrex3gM.
도 30A-30B: 옥수수속대 기질 상에서 상이한 효소 성능. 에러 바는 삼중 cob 검정과 연계된 실험 에러를 나타냄. x-축에 따른 괄호 안의 숫자는 셀룰로오스의 1 g 당 단백질의 1 mg 에서 효소 투여량을 나타낸다.
도 31: 옥수수속대 기질 상에서 상이한 효소 배합물/조성물의 성능. 에러 바는 삼중 cob 검정과 연계된 실험 에러를 나타냄. X-축에 따른 괄호안의 숫자는 셀룰로오스 1 g 당 단백질 1 mg 으로 효소 투여량을 나타낸다.
도 32: 옥수수속대 기질 상에서 상이한 효소 배합물/조성물의 성능. 에러 바는 삼중 cob 겅점과 연계된 실험 에러를 나타낸다. X-축에 따른 괄호안의 숫자는 셀룰로오스 1 g 당 단백질 1 mg 으로 효소 투여량을 나타낸다.
도 33: 옥수수속대 기질 상에서 상이한 효소 배합물/조성물의 성능. 에러 바는 삼중 cob 겅점과 연계된 실험 에러를 나타낸다. X-축에 따른 괄호안의 숫자는 셀룰로오스 1 g 당 단백질 1 mg 으로 효소 투여량을 나타낸다.
도 34: 옥수수속대 기질 상에서 상이한 효소 배합물/조성물의 성능. 에러 바는 삼중 cob 겅점과 연계된 실험 에러를 나타낸다. X-축에 따른 괄호안의 숫자는 셀룰로오스 1 g 당 단백질 1 mg 으로 효소 투여량을 나타낸다.
도 35A-35C: 옥수수속대 기질 상에서 상이한 효소 배합물/조성물의 성능. 에러 바는 삼중 cob 겅점과 연계된 실험 에러를 나타낸다. x-축에 따른 숫자는 셀룰로오스 1 g 당 단백질 1 mg 으로 효소 투여량을 나타낸다.
도 36: 짧은 아라비노자일란 올리고머의 아노머 양자 NMR 영역은 Fv43A + Fv43B 에 의한 쪼개짐을 나타낸다.
도 37: 짧은 아라비노자일란 올리고머의 아노머 양자 NMR 영역은 Fv3A 에 의한 아라비노오스로부터 β-1,2-연결된 자일로오스의 쪼개짐을 나타낸다.
도 38: 트리코더마 레세이 β-자일로시다아제 및 Fv3A 의 아미노산 서열 사이의 정렬
도 39: pENTR-TOPO-Bgl1 (943/942) 플라스미드.
도 40: pTrex3g 943/942 Bgl1 발현 벡터.
도 41: pENTR-트리코더마 레세이 Xyn3 플라스미드.
도 42: pTrex3g/트리코더마 레세이 Xyn3 발현 벡터.
도 43: pENTR-Fv3A 플라스미드.
도 44: pTrex6g/Fv3A 발현 벡터.
도 45: TOPO Blunt/Pegl1-Fv43D 플라스미드.
도 46: TOPO Blunt/Pegl1-Fv51A 플라스미드.
도 47A-47D: T. reesei 통합된 발현 균주로부터 분비되는 효소 발효 브로쓰에 의한 단량체 당으로의 글루칸 (도 47A) 및 자일란 (도 47B) 전환. 단량체 및 가용성 올리고머 생성물 (도 47C) 둘 모두로 글루칸 및 자일란의 전환 정도를 위해 3-일 샘플을 분석하였다. 도 47D 은 3 개의 T. reesei 통합된 발현 균주로부터 효소 생성물의 크로마토그래피 비교를 나타낸다. 실험 조건은 실시예 1 에 기술된다. 단백질 비는 형질전환체에서 상이하고 총 통합 피크 영역의 % 로서 정량호될 수 있다. "EGL" 은 엔도글루카나아제 피크 영역 총합을 표시한다. EndoH 는 HPLC 분석법을 위한 시약으로서 소량의 단백질 샘플로 첨가되었다.
도 48A-48B: 암모니아 전처리된 cob 에서 글루칸 + 자일란 1 g 당 7 mg 의 총 단백질에서 통합된 균주에 의해 생산되는 효소 조성물 외에도 헤미셀룰라아제에 반응하는 자일로오스 단량체 수율에서 증가하는 당화. 도 48A: 구성요소 후사 리움 버티실리오이드 헤미셀룰라아제 (통합된 균주에 의해 생산되는 효소 조성물에서). 도 48B: 헤미셀룰라아제 (다른 균류로부터)
도 49A-49B: 통합된 균주에 의해 생산되는 효소 조성물 외에도 헤미셀룰라아제에 반응하는 글루코오스 단량체 수율에서 증가된 당화 (암모니아 전처리된 cob 에서 글루칸 + 자일란 1 g 당 7 mg 의 총 단백질에서). 도 49A: 구성요소 후사 리움 버티실리오이드 헤미셀룰라아제 (통합된 균주에 의해 생산되는 효소 조성물에서). 도 49B: 헤미셀룰라아제 (다른 균류로부터)
도 50A-50B: 통합된 균주에 의해 생산되는 효소 조성물 외에도 헤미셀룰라아제에 반응하는 아라비노오스 단량체에서 증가되는 당화 (암모니아 전처리된 cob 에서 글루칸 + 자일란 1 g 당 7 mg 의 총 단백질에서). 도 50A: 구성요소 후사리움 버티실 리오이드 헤미셀룰라아제 (통합된 균주에 의해 생산되는 효소 조성물에서). 도 50B: 헤미셀룰라아제 (다른 균류로부터)
도 51: 전처리 조건에 걸친 당화 성능의 그래프 표시. X-축은 표 12 에 나열된 실험 결과에 상응한다. 수율은 원료 스위치그래스에서 이용가능한 글루칸 또는 자일란의 이론적인 양을 기초로 하여 계산되었다. 모든 수율은 효소 칵테일로 당화 3 일 후 방출되는 단량체성 당을 기초로 한다.
도 52: 다수의 GH39 β-자일로시다아제의 아미노산 정렬. 볼드체로 밑줄친 잔기는 예측된 촉매적 일반적으로 산-염기 잔기 (상기 정렬에서 "A" 로 표시) 및 촉매적 친핵 잔기 (상기 정렬에서 "N" 으로 표시) 이다. 바닥의 2 개의 서열에서 단순히 밑줄만 그은 잔기는 각각의 3D 구조 (pdb: 1uhv 및 2bs9, 각각) 의 활성 자리에서 기질의 4 옴스트롱 내이다. Fv39A 서열에서 밑줄친 잔기는 활성 자리에서 결합된 기질의 4 옴스트롱 내인 것으로 예측된다.
도 53: 다수의 GH43 패밀리 히드롤라제의 아미노산 정렬. 패밀리의 구성원 중에서 고도로 보존된 아미노산 잔기는 밑줄로 나타내고 볼드체로 나타낸다.
도 54: 다수의 GH51 패밀리 효소의 아미노산 정렬. 패밀리의 구성원 중에서 고도로 보존된 아미노산 잔기는 밑줄치고 볼드체로 나타낸다.
도 55A-55B: 다수의 GH10 및 GH11 패밀리 엔도자일라나아제의 아미노산 정렬. 도 55A; GH10 패밀리 자일라나아제의 정렬. 볼드체로 나타낸 밑줄친 잔기는 촉매적 친핵 잔기이다 (상기 정렬에서 "N" 으로 표시). 도 55B; GH11 패밀리 자일라나아제의 정렬. 볼드체로 나타낸 밑줄친 잔기는 촉매적 친핵 잔기 및 일반 산 염기 잔기이다 (상기 정렬에서 각각 "N" 및 "A" 로 나타냄).
도 56A-56B: 다양한 효소 배합물/조성물을 갖는 희석 암모니아 전처리된 스위치그래스의 당화; 도 56A: 글루칸 전환; 도 56B: 자일란 전환. x-축 상의 하기 수는 실시예 13 에 기술된 바와 같은 글루칸 또는 자일란 1 g 당 주어진 배합물/조성물에서 각 단백질의 총 mg 의 양을 지칭한다 (실시예 13 에 기술된 바와 같음).
도 57A-57B: 통합된 균주 H3A 에 의해 생산되는 효소 조성물을 갖는 희석 암모니아 전처리된 스위치그래스의 당화; 도 57A: 글루칸 전환; 도 57B: 자일란 전환. 실험 조건은 실시예 14 에 기술된다.
도 58A-58C: 통합된 균주 H3A (상이한 효소 투여량에서) 에 의해 생산되는 효소 조성물을 갖는 스팀-팽창된 사탕수수 바가스의 당화; 도 58A: 글루칸 전환; 도 58B: 자일란 전환; 도 58C: 3-일 글루칸 및 자일란 전환. 실험 조건은 실시예 17 에 기술된다.
도 59A-59C: 다양한 효소 또는 효소 배합물을 갖는 희석-산 전처리된 옥수수 섬유의 당화; 도 59A: 글루칸 전환; 도 59B: 자일란 전환: 도 59C: 5-일 글루칸 및 자일란 전환. 조정된 당 (글루코오스 또는 자일로오스) 은 효소적 단계 - 출발 당 수준으로부터 생산되는 당을 반영하였다. x-축에 따라 나타내는 비율은 셀룰로오스의 1 g 당 총 단백질의 mg 으로 효소 투여량을 나타낸다. 실험 조건은 실시예 18 에 기술된다.
도 60A-60B: 도 60A: 추론된 cDN (Pa51A 에 대해) (SEQ ID NO:46). 도 60B: 코돈 최적화 cDN (Pa51A 에 대해) (SEQ ID NO:47).
도 61: 성숙 Gz43A 를 인코딩하는 게놈 DN 의 CBH1 신호 서열 (밑줄) 업스트림을 포함하는 구축물에 대한 코딩 서열 (SEQ ID NO:48).
도 62: 성숙 Fo43A 를 인코딩하는 게놈 DN 의 CBH1 신호 서열 (밑줄) 업스트림을 포함하는 구축물에 대한 코딩 서열 (SEQ ID NO:49).
도 63: 성숙 Pf51A 를 인코딩하는 코돈 최적화 CBH1 신호 서열 (밑줄) 업스트림 을 포함하는 구축물에 대한 코돈 최적화 코딩 서여열(SEQ ID NO:50).
도 64: 많은 GH3A 패밀리 히드롤라제의 아미노산 서열 정렬. 패밀리 구성원 중에서 고도로 보존된 아미노산 잔기는 밑줄로 나타내고 볼드체로 나타낸다. 박스는 기질 결합에 포함되는 것으로 예측되는 측 잔기를 갖는 예측된 촉매적 잔기를 마킹한다.
도 65: 2 개의 대표적 후사리움 GH30 패밀리 히드롤라제의 아미노산 정렬. 패밀리 구성원 중에서 보존된 아미노산 잔기는 밑줄로 표시하고 볼드체로 나타낸다.
6. 상세한 설명
효소는 통상적으로 기질 특이성 및 반응 생성물에 의해 분류된다. 게놈 시대 이전에, 기능이 효소를 비교하기 위한 가장 다루기 쉬운 (아마 가장 유용한) 기초인 것으로 여겨졌으며, 다양한 효소적 활성에 대한 검정이 수년간 잘 발전시켜, 친숙한 EC 분류 체계를 만들었다. 셀룰라아제 및 다른 글리코실 히드롤라제는 2 개의 카르보하이드레이트 부분 (또는 카르보하이드레이트 및 비-카르보하이드레이트 부분 - 니트로페놀-글리코시드 유도체에서 발생한 바와 같음) 사이의 글리코시딕 결합 상에서 작용하고, EC 3.2.1.- 로서 나타내는 이러한 분류 체계 하에서, 마지막 숫자는 쪼개진 결합의 정확한 유형을 나타낸다. 예를 들어, 이러한 계획에 따라 엔도-작용 셀룰라아제 (1,4-β-엔도글루카나아제) 는 EC 3.2.1.4 로 나타낸다.
널리퍼진 게놈 서열화 프로젝트의 등장으로, 서열화 데이터는 분석을 촉진하고 관련 유전자 및 단백질의 비교를 촉진하였다. 또한, 카르보하이드레이트 부분에 작용할 수 있는 효소 (즉, 카르보히드라아제) 의 증가하는 수는 결정화되고 이의 3-D 구조조가 해결되었다. 그러한 분석은 관련된 서열을 갖는 효소의 패밀리를 분별하는 것을 확인하였고, 이는 이들의 아미노산 서열을 기초로 하여 예측될 수 있는 보존된 3차원 접힘을 함유한다. 또한, 동일한 또는 유사한 3-차원 접힘을 갖는 효소는 가수분해의 동일하거나 유사한 입체특이성을 나타내는 것으로 밝혀졌고, 심지어 상이한 반응을 촉매하는 경우에도 그러하다 (Henrissat et al ., 1998, FEBS Lett 425(2): 352-4; Coutinho & Henrissat, 1999, Genetics, biochemistry and ecology of cellulose degradation. T. Kimura. Tokyo, Uni Publishers Co: 15-23.).
이러한 발견은 카르보히드라아제 모듈의 서열-기초 분류의 기반을 형성하였고, 이는 인터넷 데이타베이스, 카르보하이드레이트-활성 효소 서버 (CAZy), http://afmb.cnrs-mrs.fr/CAZY/index.html (카르보하이드레이트-활성 효소: 통합된 데이타베이스 접근 형태로 입수가능하다. 참조, [Cantarel et al ., 2009, Nucleic acid Res. 37 (Database issue):D233-38].
CAZy 는 촉매되는 반응의 유형에 의해 구별될 수 있는 카르보히드라아제의 4 개의 주요 부류로 정의된다: 글리코실 히드롤라제 (GH's), 글리코실트랜스퍼라아제 (GT's), 폴리사카라이드 리아제 (PL's), 및 카르보하이드레이트 에스터라아제 (CE's). 본 개시의 효소는 글리코실 히드롤라제이다. GH's 는 둘 이상 카르보하이드레이트 사이, 또는 카르보하이드레이트 및 비-카르보하이드레이트 부분 사이의 글리코시딕 결합을 가수분해하는 효소의 그룹이다. 글리코실 히드롤라제에 대한 분류 시스템 (서열 유사성에 의해 그룹화) 은 85 초과의 상이한 패밀리를 정의하게 했다. 이러한 분류는 CAZy 웹사이트에서 입수가능하다.
본 개시의 효소는 그 중에서도, 글리코실 히드롤라제 패밀리 3, 10, 11, 30, 39, 43, 및/또는 51 에 속한다.
글리코시드 히드롤라제 패밀리 3 (" GH3 ") 효소는 하기를 포함한다: 예를 들어, β-글루코시다아제 (EC:3.2.1.21); β-자일로시다아제 (EC:3.2.1.37); N-아세틸 β-글루코사미니다아제 (EC:3.2.1.52); 글루칸 β-1,3-글루코시다아제 (EC:3.2.1.58); 셀로덱스트리나아제 (EC:3.2.1.74); 엑소-1,3-1,4-글루카나아제 (EC:3.2.1); 및 β-갈락토시다아제 (EC 3.2.1.23). 예를 들어, GH3A 효소는 β-글루코시다아제, β-자일로시다아제, N-아세틸 β-글루코사미니다아제, 글루칸 β-1,3-글루코시다아제, 셀로덱스트리나아제, 엑소-1,3-1,4-글루카나아제, 및/또는 β-갈락토시다아제 활성을 갖는 것일 수 있다. 일반적으로, GH3A 효소는 구형 단백질이고 둘 이상 하위도메인으로 이루어진다. 촉매적 잔기는 β-글루코시다아제에서, 펩티드의 세번째 N-말단에서 위치하고 아미노산 단편 SDW 내에 위치하는 아스파르테이트 잔기인 것으로 확인되었다 (Li et al. 2001, Biochem. J. 355:835-840). T. reesei 로부터 Bgl1 에서 상응하는 서열은 T266D267W268 이고 (출발 위치에서 메티오닌으로부터 카운팅), 촉매적 잔기 아스파르테이트는 D267 이다. 또한, 히드록실/아스파르테이트 서열은 시험된 GH3A β-자일로시다아제에서 보존된다. 예를 들어, T. reesei Bxl1 에서 상응하는 서열은 S310D311 이고 Fv3A 에서 상응하는 서열은 S290D291 이다.
글리코시드 히드롤라제 패밀리 39 (" GH39 ") 효소는 α-L-이두로니다아제 (EC:3.2.1.76) 또는 β-자일로시다아제 (EC:3.2.1.37) 활성을 갖는다. 2 개의 GH39 β-자일로시다아제의 3차원 구조, (써모언에어로박테리움 사카로라이티쿰 (Thermoanaerobacterium saccharolyticum) (Uniprot 수납 번호 P36906) 및 지오바실러스 스테아로써모필루스 (Geobacillus stearothermophilus) (Uniprot 수납 번호 Q9ZFM2) 로부터) 가 해결되었다 (참조, Yang et al. J. Mol. Biol. 2004, 335(1):155-65 및 Czjzek et al ., J. Mol. Biol. 2005, 353(4):838-46). 이들 효소에서 가장 고도로 보존된 영역은 이들의 N-말단 구획에서 위치하고, 이는 통상적 (α/β)8 TIM 배럴 접힌다 (β-가닥 4 (산/염기) 및 7 (친핵) 의 C-말단 마지막에 위치한 2 개의 핵심 활성 부위 글루탐산에서 접힘). Fv39A 잔기 E168 및 E272 는 각각 촉매적 산-염기 및 친핵으로서 기능하는 것으로 예측되고, 이는 각각 써모언에어로박테리움 사카로라이티쿰 및 지오바실러스 스테아로써모필러스 (Fv39A 가짐) 로부터의 상기 언급된 GH39 β-자일로시다아제의 서열 정렬을 기초로 한다.
글리코시드 히드롤라제 패밀리 43 (" GH43 ") 효소는 하기를 포함한다: 예를 들어, L-α-아라비노푸라노시다아제 (EC 3.2.1.55); β-자일로시다아제 (EC 3.2.1.37); 엔도-아라비난아제 (EC 3.2.1.99); 및/또는 갈락탄 1,3-β갈락토시다아제 (EC 3.2.1.145). 예를 들어, GH43 효소는 L-α-아라비노푸라노시다아제 활성, β-자일로시다아제 활성, 엔도-아라비난아제 활성, 및/또는 갈락탄 1,3-β-갈락토시다아제 활성을 가질 수 있다. GH43 패밀리 효소는 5-블레이드-β-프로펠라-유사 구조를 나타낸다. 프로펠러-유사 구조는 4-가닥 β-시트로 이루어진 블레이트의 5-접힘 반복에 기초한다. 촉매적 일반 염기, 아스파르테이트, 촉매적 일반 산, 글루타메이트, 및 아스파르테이트 (일반 염기의 pKa 를 조절) 는 셀비브리오 자포니쿠스 (셀비브리오 자포니쿠스) CjAbn43 의 결정 구조를 확인하고, 부위-지향 돌연변이생성에 의해 확인된다 (참조, Nurizzo et al. Nat. Struct. Biol. 2002, 9(9) 665-8). 촉매적 잔기는 아미노산 서열을 통해 널리 퍼진 3 개의 보존 블록에서 배열된다 (Pons et al. Protein: Structure, Function and Bioinformatics, 2004, 54:424-432). 바이오매스 가수분해에서 유용한 활성을 위해 시험되는 GH43 패밀리 효소 중에서, 예측된 촉매적 잔기는 볼드체로 나타내고 도 53 의 서열에서 밑줄로 표시한다. 지오바실러스 스테라오써모필루스 자일로시다아제의 결정 구조(Brux et al. J. Mol. Bio., 2006, 359:97-109) 는 이러한 효소에서 기질 결합을 위해 중요할 수 있는 수 개의 추가 잔기를 제안한다. 바이오매스 가수분해를 위해 시험되는 GH43 패밀리 효소는 상이한 기질 선호도를 가지기 때문에, 이들 잔기는 도 53 에 정렬된 서열에서 완전하게 보존되지 않는다. 그러나, 시험되는 자일로시다아제 중에서, 기질 결합에 기여하는 수 개의 보존된 잔기 (소수성 상호작용 또는 수소 결합을 통해) 는 보존되고 도 53 에서 단일 밑줄로 표시된다.
글리코시드 히드롤라제 패밀리 51 (" GH51 ") 효소는 L-α-아라비노푸라노시다아제 (EC 3.2.1.55) 및/또는 엔도글루카나아제 (EC 3.2.1.4) 활성을 갖는다. 지오바실러스 스테아로써모필루스 T-6 으로부터 GH51 L-α-아라비노푸라노시다아제의 고-재용해 결정 구조는, 효소가 헥사머이고, 2 개의 도메인으로 체계화된 각 단량체를 갖는 헥사머 임을 보여준다 : 8-배럴 (젤리-롤 위상의 β/α 및 12-가닥의 β 샌드위치 (참조, Hovel et al. EMBO J. 2003, 22(19):4922-4932). 촉매적 잔기가 산성이고 패밀리에서 효소적 서열을 통해 보존될 것이다. Fv51A, Pf51A, 및 Pa51A 의 아미노산 서열이 더욱 다양한 서열의 GH51 효소로 정렬되는 경우, 8 개의 산성 잔기가 보존되게 남아 있는다. 이들은 도 54 에서 밑줄치고 볼드체로 표시한다.
글리코시드 히드롤라제 패밀리 10 (" GH10 ") 효소는 또한 8-배럴 (β/α 구조를 갖는다. 이들은 일반적인 산/염기 촉매 공정에서 하나 이상의 산성 촉매 잔기를 사용하는 기전을 보유하는 엔도 패션에서 가수분해한다 (Pell et al ., J. Biol. Chem., 2004, 279(10): 9597-9605). 활성 자리에서 기질과 착화되는 페니실리움 심플리시시뭄 (Uniprot P56588) 및 써모아스쿠스 아우란티아쿠스 (Uniprot P23360) 의 GH10 자일라나아제의 결정 구조가 해결되었다 (참조, Schmidt et al. Biochem., 1999, 38:2403-2412; 및 Lo Leggio et al. FEBS Lett. 2001, 509: 303-308).
기질 결합 및 촉매 작용에 중요한 트리코더마 레세이 Xyn3 잔기가 페니실리움 심플리시시뭄 및 써모아스쿠스 아우란티아쿠스로부터 상기 언급된 GH10 자일라나아제의 서열을 갖는 정렬로부터 유래될 수 있다 (도 55A). 트리코더마 레세이 Xyn3 잔기 E282 이 촉매적 친핵성 잔기로 예측되는 반면, 잔기 E91, N92, K95, Q97, S98, H128, W132, Q135, N175, E176, Y219, Q252, H254, W312, 및/또는 W320 은 기질 결합 및/또는 촉매작용에 연관된 것으로 예측된다.
글리코시드 히드롤라제 패밀리 11 (" GH11 ") 효소는 β-젤리 롤 구조를 갖는다. 일반적인 산/염기 촉매 공정에서 하나 이상의 산성 촉매적 잔기를 사용하는 기전을 보유하는 엔도 패션에서 가수분해한다. 이들 구조를 통해 퍼져 있는 몇몇 다른 잔기는 가수분해에 의해 분해되는 자일로오스 단량체의 이웃 쌍을 기질에서 자일로오스 단위를 안정화하는 것에 대해 기여할 수 있다. 3 개의 GH11 패밀리 엔도자일라나아제는 시험되고 이들의 서열이 도 55B 에 정렬된다. E118 (또는 성숙 T. reesei Xyn2 에서 E86) 및 E209 (성숙 T. reesei Xyn2 에서 E177) 은 트리코더마 레세이 Xyn2 에서 각각 촉매적 친핵 및 일반적/산 염기 잔기로서 확인되었다 (참조, Havukainen et al. Biochem., 1996, 35:9617-24).
글리코시드 히드롤라제 패밀리 30 (" GH30 ")효소는 글루코실세라미다아제 (EC 3.2.1.45); β-1,6-글루카나아제 (EC 3.2.1.75); β-자일로시다아제 (EC 3.2.1.37); β-글루코시다아제 (3.2.1.21) 활성을 갖는 보유 효소이다. 제 1 GH30 결정 구조는 Grabowski, Gatt 및 Horowitz 에 의해 풀린 Gaucher 질병-관련 인간 β-글루코세레브로시다아제였다 (Crit Rev Biochem Mol Biol 1990; 25(6) 385-414). GH30 은 β-가닥 4 (산/염기) 및 7 (친핵) 의 C-말단 마지막에 위치한 2 개의 핵심 자리 글루탐산으로 접힌 (α/β)8 TIM 배럴을 갖는다 (Henrissat B, et al. Proc Natl Acad Sci U S A, 92(15):7090-4, 1995; Jordan et al., Applied Microbiol Biotechnol, 86:1647, 2010). Fv30A 의 글루타메이트 162 는 14 개의 14 정렬된 GH30 단백질에서 보존되고 (13 개의 박테리아 단백질 및 하나의 엔도-b-자일라나아제 (바이오스포라 균류로부터, 수납 번호 ADG62369)) 및 Fv30A 의 글루타메이트 250 이 동일한 14 개 중 10 개에서 보존되고, 이는 또다른 3 개 중에서 아스파르테이트이고 하나에서는 비-산성이다. 다른 온화하게 보존된 산성 잔기가 있으나 다른 것들도 폭넓게 보존된다.
6.1 본 개시의 폴리펩티드
본 개시는 적어도 약 10, 예를 들어, 적어도 약 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 125, 150, 175, 200, 225, 250, 275, 300, 325, 또는 350 잔기에 걸쳐, 또는 전장의 미성숙 폴리펩티드, 전장 성숙 폴리펩티드, 전장의 보존된 도메인, 및/또는 전장 CBM 에 걸쳐, SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16,18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 43, 44, 또는 45 의 폴리펩티드에 대해 적어도 약 80%, 예를 들어, 적어도 약 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 완전한 (100%) 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 단리된 합성 또는 재조합 폴리펩티드를 제공한다. 보존된 도메인은 예측된 촉매적 도메인 ("CD") 일 수 있다. 또한, 예시적 폴리펩티드 적어도 약 10, 예를 들어, 적어도 약 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 80, 85, 90, 95, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 또는 600 잔기 (길이) 의 단편을 포함한다. 단편은 보존된 도메인 및/또는 CBM 을 포함할 수 있다. 단편이 보존된 도메인 및 효소의 CBM 을 포함하는 곳에서, 단편은 임의로는 2 개를 분리하는 링커를 포함한다. 링커는 자연 링커 또는 비상동성 링커일 수 있다. 본 개시의 폴리펩티드는 SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 또는 41 에 대해 적어도 약 85%, 약 86%, 약 87%, 약 88%, 약 89%, 또는 약 90% 서열 일치성을 갖는 핵산 서열에 의해 인코딩될 수 있거나, 또는 SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 또는 41, 또는 이의 단편에 대해의 상보적인 매우 엄격한 조건 하에서 하이브리드화할 수 있는 핵산 서열에 의해 인코딩될 수 있는 것으로 생각된다. 본 개시의 예시적 핵산은 하기 구획 6.2 에서 기술되어 있다.
본 개시의 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 43, 44, 또는 45 의 글리코실 히드롤라제 서열의 적어도 50 개의 아미노산 잔기에 대해 적어도 85%, 예를 들어, 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 일치성을 갖는 단백질을 포함한다. 예를 들어, 본 개시의 폴리펩티드는 SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 43, 44, 또는 45 의 글리코실 히드롤라제 서열의 적어도 10, 예를 들어, 적어도 11,12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 또는 350 인접하는 아미노산 잔기에 대해 적어도 85%, 예를 들어, 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 인접하는 아미노산 서열은 보존된 도메인 및/또는 CBM 및/또는 신호 서열에 상응한다.
본원에 기술되는 임의의 아미노산 서열은 함께 제조될 수 있거나 또는 본 개시의 효소의 C- 및/또는 N-말단 마지막으로부터 적어도 1, 예를 들어, 적어도 2, 3, 5, 10, 또는 20 아미노산의 결실 및/또는 특정 아미노산 서열의 각 측의 C- 및/또는 N-말단 마지막에서 적어도 1, 예를 들어, 적어도 2, 3, 5, 10, 또는 20 비상동성 아미노산과 연합될 수 있다.
또한 다른 변이체는 이러한 개시의 범위 내에 있다. 예를 들어, 하나 이상의 아미노산 잔기는 이를 또다른 아미노산 잔기로 대체하여 효소의 pI 를 증가시키거나 감소시킬 수 있다.
구체적으로, 본 개시는 하기를 제공한다: Fv3A, Pf43A, Fv43E, Fv39A, Fv43A, Fv43B, Pa51A, Gz43A, Fo43A, Af43A, Pf51A, AfuXyn2, AfuXyn5, Fv43D, Pf43B, Fv43B, Fv51A, 트리코더마 레세이 Xyn3, 트리코더마 레세이 Xyn2, 트리코더마 레세이 Bxl1, 및/또는 트리코더마 레세이 Bgl1 폴리펩티드. 하나 이상의 이들 효소의 하나 이상의 조합은 적합하게는 본 발명의 효소 배합물/조성물 중에서 존재하고, 예를 들어, 비-자연 발생인 것이다.
Fv3A : Fv3A (SEQ ID NO:2) 의 아미노산 서열을 도 1B, 38, 및 64 에 나타낸다. SEQ ID NO:2 은 미성숙 Fv3A 의 서열이다. Fv3A 은 SEQ ID NO:2 의 잔기 1 내지 23 에 상응하는 (밑줄) 예측된 신호 서열을 갖고; 신호 서열의 쪼개짐은 SEQ ID NO:2 의 잔기 24 내지 766에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 수득하기 위해 예측된다. 예측된 보존된 도메인은 도 1B 에서 볼드체로 나타낸다. Fv3A 은 예를 들어 헤미셀룰로오스, 또는 희석 암모니아 전처리된 옥수수속대 (기질로서) 로부터 p-니트로페닐-β-자일로피라노시드, 자일로비오스, 혼합된 선형 자일로-올리고머, 분지형 아라비노자일란 올리고머를 사용하는 효소적 검정에서 β-자일로시다아제 활성을 갖는 것으로 보인다. 예측된 촉매적 잔기는 D291 인 반면, 측 잔기, S290 및 C292 는 기질 결합에 포함되는 것으로 예측된다 (도 64). E175 및 E213 는 다른 GH3A 효소를 거쳐 보존되고 촉매적 기능을 갖는 것으로 예측된다. 본원에 사용된 바와 같이, "Fv3A 폴리펩티드" 는 SEQ ID NO:2 의 잔기 24 내지 766 중에서 적어도 50, 예를 들어, 적어도 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 또는 700 인접하는 아미노산 잔기에 대해 적어도 85%, 예를 들어, 적어도 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩티드 및/또는 이의 변이체를 지칭한다. Fv3A 폴리펩티드 바람직하게는 잔기 D291, S290, C292, E175, 및 E213 에서 자연 Fv3A 과 비교시 변경되지 않는다. Fv3A 폴리펩티드는 Fv3A, 트리코더마 레세이 Bxl1 및/또는 트리코더마 레세이 Bgl1 중에서 보존된 아미노산 잔기의 적어도 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 에서 변경되지 않는다 (도 64 의 정렬에서 나타낸 바와 같음). Fv3A 폴리펩티드는 적합하게는 자연 Fv3A 의 전체 예측된 보존된 도메인을 포함한다 (도 1B 에 나타낸 바와 같음). 본 발명의 예시적 Fv3A 폴리펩티드는 성숙 Fv3A 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 일치성을 갖는 서열을 포함한다 (도 1B 에 나타낸 바와 같음). 본 발명의 Fv3A 폴리펩티드는 바람직하게는 β-자일로시다아제 활성을 갖는다.
따라서 본 발명의 Fv3A 폴리펩티드 적합하게는 SEQ ID NO:2 의 아미노산 서열에 대해, 또는 SEQ ID NO:2의 잔기 (i) 24-766, (ii) 73-321, (iii) 73-394, (iv) 395-622, (v) 24-622, 또는 (vi) 73-622 에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 폴리펩티드 적합하게는 β-자일로시다아제 활성을 갖는다.
Pf43A : Pf43A 의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:4) 을 도 2B 및 53 에 나타낸다. SEQ ID NO:4 은 미성숙 Pf43A 서열이다. Pf43A 는 SEQ ID NO:4 의 잔기 1 내지 20 에 상응하는 (도 2B 에서 밑줄) 의 예측된 신호 서열을 갖고; 신호 서열의 쪼개짐은 SEQ ID NO:4 의 잔기 21 내지 445에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 수득하기 위해 예측된다. 예측된 보존된 도메인은 볼드체로 나타내고, 예측된 CBM 은 대문자로 나타내고, CD 및 CBM 를 분리하는 예측된 링커는 이탤릭체로 나타낸다 (도 2B). Pf43A 는 예를 들어, p-니트로페닐-β-자일로피라노시드, 자일로비오스, 혼합된 선형 자일로-올리고머, 또는 암모니아 전처리된 옥수수속대 (기질로서) 를 사용하는 효소적 검정에서 β-자일로시다아제 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 예측된 촉매적 잔기는 D32 또는 D60, D145, 및 E206 를 포함한다. 도 53 에서 밑줄친 C-말단 영역은 예측된 CBM 이다. 본원에 사용된 바와 같이, "Pf43A 폴리펩티드"는 SEQ ID NO:4 의 잔기 21 내지 445 중에서 적어도 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 또는 400 인접하는 아미노산 잔기에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩티드 및/또는 이의 변이체를 지칭한다. Pf43A 폴리펩티드 바람직하게는 잔기 D32 또는 D60, D145, 및 E206 에서 자연 Pf43A 와 비교시 변경된다. Pf43A 는 바람직하게는 도 53 의 정렬에서 다른 아미노산 서열에서 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 모든 8 개 및 Pf43A 를 포함하는 단백질의 패밀리에 걸쳐 보존된 것으로 밝혀진 아미노산 잔기의 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 에서 변경되지 않는다. 본 발명의 Pf43A 폴리펩티드는 적합하게는 하기 도메인의 둘 이상 또는 모두를 포함한다: (1) 예측된 CBM, (2) 예측된 보존된 도메인, 및 (3) Pf43A 의 링커 (도 2B 에 나타낸 바와 같음). 예시적 본 발명의 Pf43A 폴리펩티드는 성숙 Pf43A 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 일치성을 가는 서열을 포함한다 (도 2B 에서 나타낸 바와 같음). 본 발명의 Pf43A 폴리펩티드 바람직하게는 β-자일로시다아제 활성을 갖는다.
따라서 본 발명의 Pf43A 폴리펩티드는 적합하게는 SEQ ID NO:4 의 아미노산 서열에 대해, 또는 잔기 (i) 21-445, (ii) 21-301, (iii) 21-323, (iv) 21-444, (v) 302-444, (vi) 302-445, (vii) 324-444, 또는 (viii) SEQ ID NO:4 의 324-445 에 대해, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 폴리펩티드 적합하게는 β-자일로시다아제 활성을 갖는다.
Fv43E : Fv43E 의 아미노산 서열(SEQ ID NO:6) 을 도 3B 및 53 에 나타낸다. SEQ ID NO:6 은 미성숙 Fv43E 의 서열이다. Fv43E 는 SEQ ID NO:6 의 잔기 1 내지 18 에 상응하는 예측된 신호 서열을 갖는다 (도 3B 에서 밑줄); 신호 서열의 쪼개짐은 SEQ ID NO:6 의 잔기 19 내지 530 에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 수득하기 위해 예측된다. 예측된 보존된 도메인은 도 3B 에서 볼드체로 표시한다. Fv43E 은 예를 들어, 4-니토페닐-β-D-자일로피라노시드, 자일로비오스, 및 혼합된, 선형 자일로-올리고머, 또는 암모니아 전처리된 옥수수속대 (기질로서) 를 사용하는 효소적 검정에서 β-자일로시다아제 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 예측된 촉매적 잔기는 D40 또는 D71, D155, 및 E241 를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "Fv43E 폴리펩티드" 는 SEQ ID NO:6 의 잔기 19 내지 530 중에서 적어도 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 또는 500 인접하는 아미노산 잔기에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩티드 및/또는 이의 변이체를 지칭한다. Fv43E 폴리펩티드는 바람직하게는 잔기 D40 또는 D71, D155, 및 E241 에서 자연 Fv43E 와 비교시 변경되지 않는다. Fv43E 폴리펩티드는 바람직하게는 도 53 의 정렬에서 Fv43E, 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 또는 모든 다른 8 아미노산 서열을 포함하는 효소의 패밀리 중에서 보존되는 것으로 밝혀진 아미노산 잔기의 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 에서 변경되지 않는다. Fv43E 폴리펩티드는 적합하게는 자연 Fv43E 의 전체 예측된 보존된 도메인을 포함한다 (도 3B 에서 나타낸 바와 같음). 예시적 Fv43E 폴리펩티드는 성숙 Fv43E 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 일치성을 갖는 서열을 포함한다 (도 3B 에서 나타낸 바와 같음). 본 발명의 Fv43E 폴리펩티드는 바람직하게는 β-자일로시다아제 활성을 갖는다.
따라서, 본 발명의 Fv43E 폴리펩티드는 적합하게는 SEQ ID NO:6 의 아미노산 서열에 대해, 또는 SEQ ID NO:6 의 잔기 (i) 19-530, (ii) 29-530, (iii) 19-300, 또는 (iv) 29-300 에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 폴리펩티드는 적합하게는 β-자일로시다아제 활성을 갖는다.
Fv39A : Fv39A 의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:8) 을 도 4B 및 52 에 나타낸다. SEQ ID NO:8 은 미성숙 Fv39A 의 서열이다. Fv39A 는 SEQ ID NO:8 의 잔기 1 내지 19 에 상응하는 (도 4B 에서 밑줄) 예측된 신호 서열을 갖고; 신호 서열의 쪼개짐은 SEQ ID NO:8 의 잔기 20 내지 439 에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 수득하기 위해 예측된다. 예측된 보존된 도메인 볼드체로 나타낸다 (도 4B). Fv39A 는 예를 들어, p-니토페틸-β-자일로피라노시드, 자일로비오스 또는 혼합된, 선형 자일로-올리고머 (기질로서) 를 사용하는 효소적 검정에서 β-자일로시다아제 활성을 갖는 것으로 나타났다. Fv39A 잔기 E168 및 E272 는 각각 써모언에어로박테리움 사카로라이티쿰 (Uniprot 수납 번호 P36906) 및 지오바실러스 스테아로써모필루스 (Uniprot 수납 번호 Q9ZFM2) (Fv39A 가짐) 로부터 상기 언급된 GH39 자일로시다아제의 서열 정렬을 기초로 하여 각각 촉매적 산-염기 및 친핵으로서 기능을 하는 것으로 예측된다. 본원에 사용된 바와 같이, "Fv39A 폴리펩티드" 는 SEQ ID NO:8 의 잔기 20 내지 439 중에서 적어도 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 또는 400 인접하는 아미노산 잔기에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩티드 및/또는 이의 변이체를 지칭한다. Fv39A 폴리펩티드는 바람직하게는 잔기 E168 및 E272 에서 자연 Fv39A 비교시 변경되지 않는다. Fv39A 폴리펩티드는 바람직하게는 써모언에어로박테리움 사카로라이티쿰 및 지오바실러스 스테아로써모필루스로부터 Fv39A 및 자일로시다아제를 포함하는 패밀리 또는 효소 중에서 보존된 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 의 아미노산 잔기에서 변경되지 않는다 (상기 참조). Fv39A 폴리펩티드는 적합하게는 도 4B 에서 나타낸 바와 같이 자연 Fv39A 의 전체 예측된 보존된 도메인을 포함한다. 예시적 Fv39A 폴리펩티드는 성숙 Fv39A 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 일치성을 갖는 서열을 포함한다 (도 4B 에서 나타낸 바와 같음). 본 발명의 Fv39A 폴리펩티드는 바람직하게는 β-자일로시다아제 활성을 갖는다.
따라서, 본 발명의 Fv39A 폴리펩티드는 SEQ ID NO:8 의 아미노산 서열에 대해, 또는 SEQ ID NO:8 의 잔기 (i) 20-439, (ii) 20-291, (iii) 145-291, 또는 (iv) 145-439 에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 폴리펩티드 적합하게는 β-자일로시다아제 활성을 갖는다.
Fv43A : Fv43A 의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:10) 은 도 5B 및 53 에서 제공된다. SEQ ID NO:10 은 미성숙 Fv43A 의 서열이다. Fv43A 은 SEQ ID NO:10 의 잔기 1 내지 22 에 사응하는 신호 예측된 신호 서열을 갖고 (도 5B 에서 밑줄); 신호 서열의 쪼개짐은 SEQ ID NO:10 의 잔기 23 내지 449 에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 수득하기 위해 예측된다. 도 5B 에서, 예측된 보존된 도메인은 볼드체로 나타내고, 예측된 CBM 대문자로 나타내고, CD 및 CBM 를 분리하는 예측된 링커는 이탤릭체로 나타낸다. Fv43A 는 헤미셀룰로오스, 및/또는 선형 자일로-올리고머 (기질로서) 로부터 4-니토페틸-β-D-자일로피라노시드, 자일로비오스, 혼합된, 선형 자일로-올리고머, 분지형 아라비노자일란 올리고머를 사용하는 효소적 검정에서 β-자일로시다아제 활성을 갖는 것으로 밝혀졌다. 예측된 촉매적 잔기는 D34 또는 D62, D148, 및 E209 를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "Fv43A 폴리펩티드" 는 SEQ ID NO:10 의 잔기 23 내지 449 중에서 적어도 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 또는 400 인접하는 아미노산 잔기에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩티드 및/또는 이의 변이체를 지칭한다. Fv43A 폴리펩티드는 바람직하게는, 자연 Fv43A 과 비교시, 잔기 D34 또는 D62, D148, 및 E209 에서, Fv43A 폴리펩티드 바람직하게는 Fv43A 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 모든 9 다른 아미노산 서열 (도 53 의 정렬에서) 을 포함하는 효소 패밀리 중에서 보존된 아미노산 잔기의 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 에서 변경되지 않는다. Fv43A 폴리펩티드는 적합하게는 자연 Fv43A 의 전체 예측된 CBM, 및/또는 자연 Fv43A 의 전체 예측된 보존된 도메인, 및/또는 Fv43A 의 링커 (도 5B 에 나타낸 바와 같음) 를 포함한다. 예시적 Fv43A 폴리펩티드는 성숙 Fv43A 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 일치성을 갖는 서열을 포함한다 (도 5B 에서 나타낸 바와 같음). 본 발명의 Fv45 폴리펩티드는 바람직하게는 β-자일로시다아제 활성을 갖는다.
따라서 본 발명의 Fv43A 폴리펩티드 적합하게는 SEQ ID NO:10 의 아미노산 서열에 대해, 또는 SEQ ID NO:10 의 잔기 (i) 23-449, (ii) 23-302, (iii) 23-320, (iv) 23-448, (v) 303-448, (vi) 303-449, (vii) 321-448, 또는 (viii) 321-449 에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 폴리펩티드 적합하게는 β-자일로시다아제 활성을 갖는다.
Fv43B : Fv43B 의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:12) 을 도 6B 및 53 에 나타낸다. SEQ ID NO:12 는 미성숙 Fv43B 의 서열이다. Fv43B 는 SEQ ID NO:12 (도 6B 에서 밑줄) 의 잔기 1 내지 16 에 상응하는 예측된 신호 서열을 갖고; 신호 서열의 쪼개짐은 SEQ ID NO:12 의 잔기 17 내지 574 에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 수득하기 위해 예측된다. 예측된 보존된 도메인은 볼드체로 나타낸다 (도 6B). Fv43B 는 4-니토페틸-β-D-자일로피라노시드 및 p-니트로페닐-β-L-아라비노푸라노시드 (기질로서) 를 사용하는 제 1 효소적 검정에서 β-자일로시다아제 및 L-α-아라비노푸라노시다아제 활성 둘 모두를 갖는 것으로 나타났다. 제 2 효소적 검정에서, 분지형 아라비노-자일로올리고머로부터 아라비노오스의 방출을 촉매작용하고 다른 자일로시다아제 효소의 존재 하에 올리고머 혼합물로부터 자일로오스 방출의 증가를 촉매작용 하는 것으로 밝혀졌다. 예측된 촉매적 잔기는 D38 또는 D68, D151, 및 E236 를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "Fv43B 폴리펩티드" 는 SEQ ID NO:12 의 잔기 17 내지 574 중에서 적어도 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 또는 550 인접하는 아미노산 잔기에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩티드 및/또는 이의 변이체를 지칭한다. Fv43B 폴리펩티드 바람직하게는 내지 자연 Fv43B 과 비교시, 잔기 D38 또는 D68, D151, 및 E236 에서 변경되지 않는다. Fv43B 폴리펩티드는 바람직하게는 Fv43B 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 모든 9 다른 아미노산 서열 (도 53 의 정렬에서) 을 포함하는 효소의 패밀리 중에서 보존되는 아미노산 잔기의 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 에서 변경되지 않는다. Fv43B 폴리펩티드는 적합하게는 도 6B 및 53 에서 나타낸 자연 Fv43B 의 전체 예측된 보존된 도메인을 포함한다. 예시적 Fv43B 폴리펩티드는 성숙 Fv43B 서열 (도 6B 에서 나타낸 바와 같음) 에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 일치성을 갖는 서열을 포함한다. 본 발명의 Fv43B 폴리펩티드는 바람직하게는 β-자일로시다아제 활성, L-α-아라비노푸라노시다아제 활성, 또는 둘 모두의 β-자일로시다아제 및 L-α-아라비노푸라노시다아제 활성을 갖는다.
따라서, 본 발명의 Fv43B 폴리펩티드는 적합하게는 SEQ ID NO:12 의 아미노산 서열에 대해, 또는 SEQ ID NO:12 의 잔기 (i) 17-574, (ii) 27-574, (iii) 17-303, 또는 (iv) 27-303 에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 폴리펩티드는 적합하게는 β-자일로시다아제 활성, L-α-아라비노푸라노시다아제 활성, 또는 β-자일로시다아제 및 L-α-아라비노푸라노시다아제 활성 둘 모두를 갖는다.
Pa51A : Pa51A 의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:14) 을 도 7B 및 54 에 나타낸다. SEQ ID NO:14 은 미성숙 Pa51A 의 서열이다. Pa51A 은 SEQ ID NO:14 의 잔기 1 내지 20 에 상응하는 예측된 신호 서열을 갖고 (도 7B 에서 밑줄); 신호 서열의 쪼개짐은 SEQ ID NO:14 의 잔기 21 내지 676 에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 수득하기 위해 예측된다. 예측된 L-α-아라비노푸라노시다아제 보존된 도메인은 볼드체로 나타낸다 (도 7B). Pa51A 은 예를 들어, 인공적 기질 p-니트로페닐-β-자일로피라노시드 및 p-니토페틸-β-L-아라비노푸라노시드를 사용하는 효소적 검정에서 β-자일로시다아제 활성 및 L-α-아라비노푸라노시다아제 활성 둘 모두를 갖는 것으로 나타났다. 분지형 아라비노-자일로 올리고머로부터 아라비노오스의 방출을 촉매작용하고 다른 자일로시다아제 효소의 존재 하에 올리고머 혼합물로부터 증가된 자일로오스 방출을 촉매작용하는 것으로 나타났다. 보존된 산성 잔기는 E43, D50, E257, E296, E340, E370, E485, 및 E493 를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "Pa51A 폴리펩티드" 는 SEQ ID NO:14 의 잔기 21 내지 676 중에서 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 일치성 내지 적어도 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 또는 650 인접하는 아미노산 잔기를 갖는 서열을 포함하는 폴리펩티드 및/또는 이의 변이체를 지칭한다. Pa51A 폴리펩티드는 바람직하게는 잔기 E43, D50, E257, E296, E340, E370, E485, 및 E493 에서 자연 Pa51A 와 비교시 변경되지 않는다. Pa51A 폴리펩티드는 바람직하게는 Pa51A, Fv51A, 및 Pf51A 를 포함하는 효소의 그룹 중에서 보존된 아미노산 잔기 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 에서 변경되지 않는다 (도 54 의 정렬에서 나타낸 바와 같음). Pa51A 폴리펩티드는 적합하게는 자연 Pa51A 의 예측된 보존된 도메인을 포함한다 (도 7B 에서 나타낸 바와 같음). 예시적 Pa51A 폴리펩티드는 성숙 Pa51A 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 일치성을 갖는 서열을 포함한다 (도 7B 에서 나타낸 바와 같음). 본 발명의 Pa51A 폴리펩티드 바람직하게는 β-자일로시다아제 활성, L-α-아라비노푸라노시다아제 활성, 또는 둘 모두의 β-자일로시다아제 및 L-α-아라비노푸라노시다아제 활성을 갖는다.
따라서, 본 발명의 Pa51A 폴리펩티드는 SEQ ID NO:14 의 아미노산 서열에 대해, 또는 SEQ ID NO:14 의 잔기 (i) 21-676, (ii) 21-652, (iii) 469-652, 또는 (iv) 469-676 에 대해, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 폴리펩티드는 적합하게는 β-자일로시다아제 활성, L-α-아라비노푸라노시다아제 활성, 또는 둘 모두의 β-자일로시다아제 및 L-α-아라비노푸라노시다아제 활성을 갖는다.
Gz43A : Gz43A 의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:16) 을 도 8B 및 53 에 나타낸다. SEQ ID NO:16 은 미성숙 Gz43A 의 서열이다. Gz43A 은 SEQ ID NO:16 의 잔기 1 내지 18 에 상응하는 예측된 신호 서열을 갖고(도 8B 에서 밑줄); 신호 서열의 쪼개짐은 SEQ ID NO:16 의 잔기 19 내지 340 에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 수득하기 위해 예측된다. 예측된 보존된 도메인은 볼드체로 나타낸다 (도 8B). Gz43A 는 예를 들어, p-니토페틸-β-자일로피라노시드, 자일로비오스 또는 혼합된, 및/또는 선형 자일로-올리고머 (기질로서) 를 사용하는 효소적 검정에서 β-자일로시다아제 활성을 갖는 것으로 나타났다. 예측된 촉매적 잔기 D33 또는 D68, D154, 및 E243 을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "Gz43A 폴리펩티드" 는 SEQ ID NO:16 의 잔기 19 내지 340 중에서 적어도 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 또는 300 인접하는 아미노산 잔기에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩티드 및/또는 이의 변이체를 지칭한다. Gz43A 폴리펩티드는 바람직하게는 잔기 D33 또는 D68, D154, 및 E243 에서 자연 Gz43A 와 비교시 변경되지 않는다. Gz43A 폴리펩티드는 바람직하게는 Gz43A 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 모든 9 다른 아미노산 서열을 포함하는 효소의 그룹 중에서 보존된 아미노산 잔기의 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 에서 변경되지 않는다 (도 53 의 정렬에서). Gz43A 폴리펩티드는 적합하게는 자연 Gz43A 의 예측된 보존된 도메인을 포함한다 (도 8B 에 나타낸 바와 같음). 예시적 Gz43A 폴리펩티드는 성숙 Gz43A 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 일치성을 갖는 서열을 포함한다 (도 8B 에서 나타낸 바와 같음). 본 발명의 Gz43A 폴리펩티드는 바람직하게는 β-자일로시다아제 활성을 갖는다.
따라서 본 발명의 Gz43A 폴리펩티드는 적합하게는 SEQ ID NO:16 의 아미노산 서열에 대해, 또는 SEQ ID NO:16 의 잔기 (i) 19-340, (ii) 53-340, (iii) 19-383, 또는 (iv) 53-383 에 대해, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 폴리펩티드는 적합하게는 β-자일로시다아제 활성을 갖는다.
Fo43A : Fo43A 의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:18) 을 도 9B 및 53 에 나타낸다. SEQ ID NO:18 은 미성숙 Fo43A 의 서열이다. Fo43A 은 SEQ ID NO:18 의 잔기 1 내지 20 에 상응하는 예측된 신호 서열을 갖고 (도 9B 에서 밑줄); 신호 서열의 쪼개짐은 SEQ ID NO:18 의 잔기 21 내지 348 에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 수득하기 위해 예측된다. 예측된 보존된 도메인은 볼드체로 나타낸다 (도 9B). Fo43A 는 예를 들어 p-니토페틸-β-자일로피라노시드, 자일로비오스 및/또는 혼합된, 선형 자일로-올리고머 (기질로서) 를 사용하는 효소적 검정에서 β-자일로시다아제 활성을 갖는 것으로 나타났다. 예측된 촉매적 잔기는 D37 또는 D72, D159, 및 E251 를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "Fo43A 폴리펩티드" 는 SEQ ID NO:18 의 잔기 18 내지 344 중에서 적어도 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 또는 300 인접하는 아미노산 잔기에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩티드 및/또는 이의 변이체를 지칭한다. Fo43A 폴리펩티드는 바람직하게는 잔기 D37 또는 D72, D159, 및 E251 에서 자연 Fo43A 비교시 변경되지 않는다. Fo43A 폴리펩티드는 바람직하게는 Fo43A 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 또는 모든 9 다른 아미노산 서열을 포함하는 효소 그룹 중에서 보존된 아미노산 잔기의 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 에서 변경되지 않는다 (도 53 의 정렬에서). Fo43A 폴리펩티드는 적합하게는 도 9B 에서 나타낸 바와 같은 자연 Fo43A 의 예측된 보존된 도메인을 포함한다. 예시적 Fo43A 폴리펩티드는 성숙 Fo43A 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 일치성을 갖는 서열을 포함한다 (도 9B 에서 나타낸 바와 같음). 본 발명의 Fo43A 폴리펩티드는 바람직하게는 β-자일로시다아제 활성을 갖는다.
따라서 본 발명의 Fo43A 폴리펩티드는 적합하게는 SEQ ID NO:18 의 아미노산 서열에 대해, 또는 SEQ ID NO:18 의 잔기 (i) 21-341, (ii) 107-341, (iii) 21-348, 또는 (iv) 107-348 에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 폴리펩티드는 적합하게는 β-자일로시다아제 활성을 갖는다.
Af43A : Af43A 의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:20) 을 도 10B 및 53 에 나타낸다. SEQ ID NO:20 은 미성숙 Af43A 의 서열이다. 예측된 보존된 도메인은 볼드체로 나타낸다 (도 10B). Af43A 은 예를 들어, p-니토페틸-β-L-아라비노푸라노시드 (기질로서) 를 사용하는 효소적 검정에서 L-α-아라비노푸라노시다아제 활성을 갖는 것으로 나타났다. Af43A 은 엔도자일라나아제의 작용을 통해 헤미셀룰로오스로부터 방출되는 올리고머의 세트로부터 아라비노오스의 방출을 촉매작용하는 것으로 나타났다. 예측된 촉매적 잔기는 D26 또는 D58, D139, 및 E227 를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "Af43A 폴리펩티드" 는 SEQ ID NO:20 의 적어도 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 또는 300 인접하는 아미노산 잔기에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 일치성을 포함하는 폴리펩티드 및/또는 이의 변이체를 지칭한다. Af43A 폴리펩티드는 바람직하게는 잔기 D26 또는 D58, D139, 및 E227 에서 자연 Af43A 와 비교시 변경되지 않는다. Af43A 폴리펩티드는 바람직하게는 Af43A 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 모든 9 다른 아미노산 서열을 포함하는 효소 그룹 중에서 보존된 아미노산 잔기의 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 에서 변경되지 않는다 (도 53 의 정렬에서). Af43A 폴리펩티드는 적합하게는 자연 Af43A 의 예측된 보존 도메인을 포함한다 (도 10B 에서 나타낸 바와 같음). 예시적 Af43A 폴리펩티드는 SEQ ID NO:20 에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 서열을 포함한다. 본 발명의 Af43A 폴리펩티드는 바람직하게는 L-α-아라비노푸라노시다아제 활성을 갖는다.
따라서 본 발명의 Af43A 폴리펩티드는 적합하게는 SEQ ID NO:20 의 아미노산 서열에 대해, 또는 SEQ ID NO:20 의 잔기 (i)15-558, 또는 (ii)15-295 에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 폴리펩티드는 적합하게는 L-α-아라비노푸라노시다아제 활성을 갖는다.
Pf51A : Pf51A 의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:22) 을 도 11B 및 54 에 나타낸다. SEQ ID NO:22 는 미성숙 Pf51A 의 서열이다. Pf51A 는 SEQ ID NO:22 의 잔기 1 내지 20 에 상응하는 예측된 신호 서열을 갖고 (도 11B 에서 밑줄); 신호 서열의 쪼개짐은 SEQ ID NO:22 의 잔기 21 내지 642 에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 수득하기 위해 예측된다. 예측된 L-α-아라비노푸라노시다아제 보존된 도메인은 볼드체로 나타낸다 (도 11B). Pf51A 는 예를 들어 4-니트로페닐-β-L-아라비노푸라노시드 (기질로서) 를 사용하는 효소적 검정에서 L-α-아라비노푸라노시다아제 활성을 갖는 것으로 나타났다. Pf51A 는 엔도자일라나아제의 작용을 통해 헤미셀룰로오스로부터 방출되는 올리고머의 세트로부터 아라비노오스의 방출을 촉매작용하는 것으로 나타났다. 예측된 보존된 산성 잔기는 E43, D50, E248, E287, E331, E360, E472, 및 E480 을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, " Pf51A 폴리펩티드" 는 SEQ ID NO:22 의 적어도 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 또는 600 인접하는 아미노산 잔기에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 폴리펩티드 및/또는 이의 변이체를 지칭한다. Pf51A 폴리펩티드는 바람직하게는 잔기 E43, D50, E248, E287, E331, E360, E472, 및 E480 에서 자연 Pf51A 와 비교시 변경되지 않는다. Pf51A 폴리펩티드는 바람직하게는 Pf51A, Pa51A, 및 Fv51A 중에서 보존된 아미노산 잔기의 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 에서 변경되지 않는다 (도 54 의 정렬에서 나타낸 바와 같음). Pf51A 폴리펩티드는 적합하게는 자연 Pf51A 의 예측된 보존 도메인을 포함한다 (도 11B). 예시적 Pf51A 폴리펩티드는 성숙 Pf51A 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 일치성을 갖는 서열을 포함한다 (도 11B). 본 발명의 Pf51A 폴리펩티드는 바람직하게는 L-α-아라비노푸라노시다아제 활성을 갖는다.
따라서 본 발명의 Pf51A 폴리펩티드는 적합하게는 SEQ ID NO:22 의 아미노산 서열에 대해, 또는 SEQ ID NO:22 의 잔기 (i) 21-632, (ii) 461-632, (iii) 21-642, 또는 (iv) 461-642 에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 폴리펩티드는 L-α-아라비노푸라노시다아제 활성을 갖는다.
AfuXyn2 : AfuXyn2 의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:24) 을 도 12B 및 55B 에 나타낸다. SEQ ID NO:24 은 미성숙 AfuXyn2 의 서열이다. AfuXyn2 는 SEQ ID NO:24 의 잔기 1 내지 18 에 상응하는 예측된 신호 서열을 갖고 (도 12B 에서 밑줄); 신호 서열의 쪼개짐은 SEQ ID NO:24 의 잔기 19 내지 228 에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 수득하기 위해 예측된다. 예측된 GH11 보존된 도메인을 볼드체로 나타낸다 (도 12B). AfuXyn2 는 효소가 단리된 헤미셀룰로오스 상에서 전처리된 바이오매스 상에 작용할 때 자일로비오시다아제의 존재 하에서 증가된 자일로오스 단량체 생성을 촉매작용할 수 있는 이의 능력을 관찰함으로써 간접적으로 엔도자일라나아제 활성을 갖는 것으로 나타났다. 보존된 촉매적 잔기는 E124, E129, 및 E215 를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "AfuXyn2 폴리펩티드"는 SEQ ID NO:24 의 잔기 19 내지 228 중에서 적어도 50, 75, 100, 125, 150, 175, 또는 200 인접하는 아미노산 잔기에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩티드 및/또는 이의 변이체를 지칭한다. AfuXyn2 폴리펩티드는 바람직하게는 잔기 E124, E129 및 E215 에서 자연 AfuXyn2 와 비교시 변경되지 않는다. AfuXyn2 폴리펩티드는 바람직하게는 AfuXyn2, AfuXyn5, 및 트리코더마 레세이 Xyn2 중에서 보존된 아미노산 잔기의 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 에서 변경되지 않는다 (도 55B 의 정렬에서 나타낸 바와 같음). AfuXyn2 폴리펩티드는 적합하게는 도 12B 에서 나타낸 자연 AfuXyn2 의 전체 예측된 보존 도메인을 포함한다. 예시적 AfuXyn2 폴리펩티드는 성숙 AfuXyn2 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 일치성을 갖는 서열을 포함한다 (도 12B 에 나타냄). 본 발명의 AfuXyn2 폴리펩티드는 바람직하게는 자일라나아제 활성을 갖는다.
AfuXyn5 : AfuXyn5 의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:26) 을 도 13B 및 55B 에 나타낸다. SEQ ID NO:26 은 미성숙 AfuXyn5 의 서열이다. AfuXyn5 는 SEQ ID NO:26 의 잔기 1 내지 19 에 상응하는 예측된 신호 서열을 갖고 (도 13B 에서 밑줄); 신호 서열의 쪼개짐은 SEQ ID NO:26 의 잔기 20 내지 313 에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 수득하기 위해 예측된다. 예측된 GH11 보존된 도메인을 볼드체로 나타낸다 (도 13B). AfuXyn5 는 효소가 전처리된 바이오매스 상에서 또는 단리된 헤미셀룰로오스 상에서 작용할 때 자일로비오시다아제의 존재 하에 증가된 자일로오스 단량체 생성을 촉매작용하는 이의 능력을 관찰함으로써 간접적으로 엔도자일라나아제 활성을 갖는 것으로 나타났다. 보존된 촉매적 잔기는 E119, E124, 및 E210 를 포함한다. 예측된 CBM 는 C-말단 마지막 근처이고, 수많은 소수성 잔기를 특징으로 하고, 세린-, 트레오닌-풍부한 일련의 긴 아미노산을 따른다. 영역은 도 55B 에서 밑줄로 나타낸다. 본원에 사용된 바와 같이, "AfuXyn5 폴리펩티드" 는 SEQ ID NO:26 의 잔기 20 내지 313 중에서 적어도 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 또는 275 인접하는 아미노산 잔기에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩티드 및/또는 이의 변이체를 지칭한다. AfuXyn5 폴리펩티드 바람직하게는 잔기 E119, E120, 및 E210 에서 자연 AfuXyn5 와 비교시 변경되지 않는다. AfuXyn5 폴리펩티드는 바람직하게는 AfuXyn5, AfuXyn2, 및 트리코더마 레세이 Xyn2 중에서 보존된 아미노산 잔기의 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 에서 변경되지 않는다 (도 55B 의 정렬에서). AfuXyn5 폴리펩티드는 적합하게는 자연 AfuXyn5 의 전체 예측된 CBM 및/또는 자연 AfuXyn5 의 전체 예측된 보존된 도메인을 포함한다 (밑줄) (도 13B 에 나타냄). 예시적 AfuXyn5 폴리펩티드는 성숙 AfuXyn5 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 일치성을 갖는 서열을 포함한다 (도 13B 에 나타냄) 본 발명의 AfuXyn5 폴리펩티드는 바람직하게는 자일라나아제 활성을 갖는다.
Fv43D : Fv43D 의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:28) 을 도 14B 및 53 에 나타낸다. SEQ ID NO:28 은 미성숙 Fv43D 의 서열이다. Fv43D 는 SEQ ID NO:28 의 잔기 1 내지 20 에 상응하는 예측된 신호 서열을 갖고 (도 14B 에서 밑줄); 신호 서열의 쪼개짐은 SEQ ID NO:28 의 잔기 21 내지 350 에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 수득하기 위해 예측된다. 예측된 보존된 도메인은 볼드체로 나타낸다 (도 14B). Fv43D 는 예를 들어, p-니토페틸-β-자일로피라노시드, 자일로비오스, 및/또는 혼합된, 선형 자일로-올리고머 (기질로서) 를 사용하는 효소적 검정에서 β-자일로시다아제 활성을 갖는 것으로 나타났다. 예측된 촉매적 잔기는 D37 또는 D72, D159, 및 E251 를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "Fv43D 폴리펩티드" 는 SEQ ID NO:28 의 잔기 21 내지 350 중에서 적어도 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 또는 320 인접하는 아미노산 잔기에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩티드 및/또는 이의 변이체를 지칭한다. Fv43D 폴리펩티드는 바람직하게는 잔기 D37 또는 D72, D159, 및 E251 에서 자연 Fv43D 와 비교시 변경되지 않는다. Fv43D 폴리펩티드는 바람직하게는 Fv43D 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 모든 9 다른 아미노산 서열을 포함하는 효소 그룹 중에서 보존된 아미노산 잔기의 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 에서 변경되지 않는다 (도 53 의 정렬에서). Fv43D 폴리펩티드는 적합하게는 자연 Fv43D 의 전체 예측된 CD 를 포함한다 (도 14B 에 나타냄). 예시적 Fv43D 폴리펩티드는 성숙 Fv43D 서열 에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 일치성을 갖는 서열을 포함한다 (도 14B 에 나타냄). 본 발명의 Fv43D 폴리펩티드는 바람직하게는 β-자일로시다아제 활성을 갖는다.
따라서 본 발명의 Fv43D 폴리펩티드는 적합하게는 SEQ ID NO:28 의 아미노산 서열에 대해, 또는 SEQ ID NO:28 의 잔기 (i) 20-341, (ii) 21-350, (iii) 107-341, 또는 (iv) 107-350 에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 폴리펩티드 적합하게는 β-자일로시다아제 활성을 갖는다.
Pf43B : Pf43B 의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:30) 을 도 15B 및 53 에 나타낸다. SEQ ID NO:30 은 미성숙 Pf43B 의 서열이다. Pf43B 는 SEQ ID NO:30 의 잔기 1 내지 20 에 상응하는 예측된 신호 서열을 갖고(도 15B 에 밑줄); 신호 서열의 쪼개짐은 SEQ ID NO:30 의 잔기 21 내지 321 에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 수득하기 위해 예측된다. 예측된 보존된 도메인은 볼드체로 나타낸다 (도 15B). 보존된 도메인 내의 보존된 산성 잔기는 D32, D61, D148, 및 E212 를 포함한다. Pf43B 는 예를 들어, p-니트로페닐-β-자일로피라노시드, 자일로비오스, 및/또는 혼합된, 선형 자일로-올리고머 (기질로서) 를 사용하는 효소적 검정에서 β-자일로시다아제 활성을 갖는 것으로 나타났다. 본원에 사용된 바와 같이, "Pf43B 폴리펩티드" 는 SEQ ID NO:30 의 잔기 21 내지 321 중에서 적어도 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 또는 280 인접하는 아미노산 잔기에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩티드 및/또는 이의 변이체를 지칭한다. Pf43B 폴리펩티드는 바람직하게는 잔기 D32, D61, D148, 및 E212 에서 자연 Pf43B 와 비교시 변경되지 않는다. Pf43B 폴리펩티드는 바람직하게는 Pf43B 및 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 또는 모든 9 다른 아미노산 서열을 포함하는 효소 그룹 중에서 보존된 아미노산 잔기의 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 에서 변경되지 않는다 (도 53 의 정렬). Pf43B 폴리펩티드 적합하게는 자연 Pf43B 의 예측된 보존된 도메인을 포함한다 (도 15B 에 나타냄). 예시적 Pf43B 폴리펩티드는 성숙 Pf43B 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 일치성을 갖는 서열을 포함한다 (도 15B 에 나타냄). 본 발명의 Pf43B 폴리펩티드는 바람직하게는 β-자일로시다아제 활성을 갖는다.
따라서 본 발명의 Pf43B 폴리펩티드는 SEQ ID NO:30 의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 폴리펩티드 적합하게는 β-자일로시다아제 활성을 갖는다.
Fv51A : Fv51A 의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:32) 을 도 16B 및 54 에 나타낸다. SEQ ID NO:32 는 미성숙 Fv51A 의 서열이다. Fv51A 는 SEQ ID NO:32 의 잔기 1 내지 19에 상응하는 예측된 신호 서열을 갖고 (도 16B 에서 밑줄); 신호 서열의 쪼개짐은 SEQ ID NO:32 의 잔기 20 내지 660 에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 수득하기 위해 예측된다. 예측된 L-α-아라비노푸라노시다아제 보존된 도메인은 볼드체로 나타낸다 (도 16B). Fv51A 은, 예를 들어, 4-니트로페닐-β-L-아라비노푸라노시드 (기질로서) 를 사용하는 효소적 검정에서 L-α-아라비노푸라노시다아제 활성을 갖는 것으로 나타났다. Fv51A 은 엔도자일라나아제의 작용을 통해 헤미셀룰로오스로부터 방출되는 올리고머의 세트로부터 아라비노오스의 방출을 촉매작용하는 것으로 나타났다. 보존된 잔기는 E42, D49, E247, E286, E330, E359, E479, 및 E487 를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "Fv51A 폴리펩티드" 는 SEQ ID NO:32 의 잔기 20 내지 660 중에서 적어도 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 또는 625 인접하는 아미노산 잔기에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩티드 및/또는 이의 변이체를 지칭한다. Fv51A 폴리펩티드는 바람직하게는 잔기 E42, D49, E247, E286, E330, E359, E479, 및 E487 에서 자연 Fv51A 와 비교시 변경되지 않는다. Fv51A 폴리펩티드는 바람직하게는 Fv51A, Pa51A, 및 Pf51A 중에서 보존된 아미노산 잔기의 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 에서 변경되지 않는다 (도 54 의 정렬에서 나타낸 바와 같음). Fv51A 폴리펩티드는 적합하게는 자연 Fv51A 의 예측된 보존된 도메인을 포함한다 (도 16B 에 나타냄). 예시적 Fv51A 폴리펩티드는 성숙 Fv51A 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 일치성을 갖는 서열을 포함한다 (도 16B 에 나타냄). 본 발명의 Fv51A 폴리펩티드는 바람직하게는 L-α-아라비노푸라노시다아제 활성을 갖는다.
따라서 본 발명의 Fv51A 폴리펩티드는 SEQ ID NO:32 의 아미노산 서열에 대해, 또는 SEQ ID NO:32 의 잔기 (i) 21-660, (ii) 21-645, (iii) 450-645, 또는 (iv) 450-660 에 대해, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 폴리펩티드 적합하게는 L-α-아라비노푸라노시다아제 활성을 갖는다.
Xyn3 : 트리코더마 레세이 Xyn3 의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:42) 을 도 21B 에 나타낸다. SEQ ID NO:42 는 미성숙 트리코더마 레세이 Xyn3 의 서열이다. 트리코더마 레세이 Xyn3 는 SEQ ID NO:42 의 잔기 1 내지 16 에 상응하는 예측된 신호 서열을 갖고 (도 21B 에 밑줄); 신호 서열의 쪼개짐은 SEQ ID NO:42 의 잔기 17 내지 347 에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 수득하기 위해 예측된다. 예측된 보존된 도메인은 볼드체로 나타낸다 (도 21B). 트리코더마 레세이 Xyn3 은 효소가 전처리된 바이오매스 상에 또는 단리된 헤미셀룰로오스 상에 작용할 때 자일로비오시다아제의 존재 하에 증가된 자일로오스 단량체 생성을 촉매작용하는 이의 능력의 관찰에 의해 간접적으로 엔도자일라나아제 활성을 갖는 것으로 보여졌다. 보존된 촉매적 잔기는 E91, E176, E180, E195, 및 E282 를 포함하며 (또다른 GH10 패밀리 효소, 스트렙토마이세스 할스테디로부터 Xys1 델타를 갖는 정렬에 의해 측정) (Canals et al., 2003, Act Crystalogr. D Biol. 59:1447-53), 이는 트리코더마 레세이 Xyn3 에 대해 33% 서열 일치성을 갖는다. 본원에 사용된 바와 같이, "트리코더마 레세이 Xyn3 폴리펩티드" 는 SEQ ID NO:42 의 잔기 17 내지 347 중에서 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩티드 및/또는 이의 변이체를 지칭한다. 트리코더마 레세이 Xyn3 폴리펩티드는 바람직하게는 잔기 E91, E176, E180, E195, 및 E282 에서 자연 트리코더마 레세이 Xyn3 과 비교시 변경되지 않는다. 트리코더마 레세이 Xyn3 폴리펩티드는 바람직하게는 트리코더마 레세이 Xyn3 및 Xys1 델타 사이에 보존된 아미노산 잔기의 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 에서 변경되지 않는다. 트리코더마 레세이 Xyn3 폴리펩티드는 적합하게는 자연 트리코더마 레세이 Xyn3 의 전체 예측된 보존된 도메인을 포함한다 (도 21B 에 나타냄) 도 21B. 예시적 트리코더마 레세이 Xyn3 폴리펩티드는 성숙 트리코더마 레세이 Xyn3 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 일치성을 갖는 서열을 포함한다 (도 21B 에 나타냄). 본 발명의 트리코더마 레세이 Xyn3 폴리펩티드는 바람직하게는 자일라나아제 활성을 갖는다.
Xyn2 : 트리코더마 레세이 Xyn2 의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:43) 을 도 22 및 55B 에 나타낸다. SEQ ID NO:43 은 미성숙 트리코더마 레세이 Xyn2 의 서열이다. 트리코더마 레세이 Xyn2 는 SEQ ID NO:43 의 잔기 1 내지 33 에 상응하는 예측된 프리프로펩티드 서열을 갖고 (도 22 에서 밑줄); 위치 16 및 17 사이의 예측된 신호 서열의 쪼개짐은 프로펩티드를 산출하기 위해 예측되고, 이는 위치 32 및 33 사이에서 켁신-유사 프로테아제에 의해 가공되며, SEQ ID NO:43 의 잔기 33 내지 222 에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 생성한다. 예측된 보존된 도메인은 볼드체로 나타낸다 (도 22). 트리코더마 레세이 Xyn2 는 효소가 전처리된 바이오매스 상에 또는 단리된 헤미셀룰로오스 상에 작용할 때 자일로비오시다아제의 존재 하에 증가된 자일로오스 단량체 생성을 촉매작용하는 이의 능력의 관찰에 의해 간접적으로 엔도자일라나아제 활성을 갖는 것으로 보여졌다. 보존된 산성 잔기는 E118, E123, 및 E209 를 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "트리코더마 레세이 Xyn2 폴리펩티드" 는 SEQ ID NO:43 의 잔기 33 내지 222 중에서 적어도 50, 75, 100, 125, 150, 또는 175 인접하는 아미노산 잔기에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩티드 및/또는 이의 변이체를 지칭한다. 트리코더마 레세이 Xyn2 폴리펩티드는 바람직하게는 잔기 E118, E123, 및 E209 에서 자연 트리코더마 레세이 Xyn2 와 비교시 변경되지 않는다. 트리코더마 레세이 Xyn2 폴리펩티드는 바람직하게는 트리코더마 레세이 Xyn2, AfuXyn2, 및 AfuXyn5 중에서 보존된 아미노산 잔기의 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 에서 변경되지 않는다 (도 55B 의 정렬에서 나타낸 바와 같음). 트리코더마 레세이 Xyn2 폴리펩티드는 적합하게는 자연 트리코더마 레세이 Xyn2 의 전체 예측된 보존된 도메인을 포함한다 (도 22 에 나타냄). 예시적 트리코더마 레세이 Xyn2 폴리펩티드는 성숙 트리코더마 레세이 Xyn2 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 일치성을 갖는 서열을 포함한다 (도 22 에 나타냄). 본 발명의 트리코더마 레세이 Xyn2 폴리펩티드는 바람직하게는 자일라나아제 활성을 갖는다.
Bxl1 : 트리코더마 레세이 Bxl1 의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:44) 을 도 23 및 64 에 나타낸다. SEQ ID NO:44 는 미성숙 트리코더마 레세이 Bxl1 의 서열이다. 트리코더마 레세이 Bxl1 는 SEQ ID NO:44 의 잔기 1 내지 18 에 상응하는 예측된 신호 서열을 갖고 (도 23 에서 밑줄); 신호 서열의 쪼개짐은 SEQ ID NO:44 의 잔기 19 내지 797 에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 수득하기 위해 예측된다. 예측된 보존된 도메인 볼드체로 나타낸다 (도 23). 트리코더마 레세이 Bxl1 는 예를 들어, 효소적 검정 p-니토페틸-β-자일로피라노시드, 자일로비오스 및/또는 혼합된, 선형 자일로-올리고머 (기질로서) 를 사용하는 효소적 검정에서 β-자일로시다아제 활성을 갖는 것으로 보여졌다. 보존된 산성 잔기는 E193, E234, 및 D310 을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "트리코더마 레세이 Bxl1 폴리펩티드" 는 SEQ ID NO:44 의 잔기 17 내지 797 중에서 적어도 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 또는 750 인접하는 아미노산 잔기에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 폴리펩티드 및/또는 이의 변이체를 지칭한다. 트리코더마 레세이 Bxl1 폴리펩티드는 바람직하게는 잔기 E193, E234, 및 D310 에서 자연 트리코더마 레세이 Bxl1 와 비교시 변경되지 않는다. 트리코더마 레세이 Bxl1 폴리펩티드는 바람직하게는 트리코더마 레세이 Bxl1, Fv3A, 및 트리코더마 레세이 Bgl1 중에서 보존된 아미노산 잔기의 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 에서 변경되지 않는다 (도 64 의 정렬에서 나타낸 바와 같음). 트리코더마 레세이 Bxl1 폴리펩티드는 적합하게는 자연 트리코더마 레세이 Bxl1 의 전체 예측된 보존된 도메인을 포함한다 (도 23 에 나타냄) . 예시적 트리코더마 레세이 Bxl1 폴리펩티드는 성숙 트리코더마 레세이 Bxl1 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 일치성을 갖는 서열을 포함한다 (도 23 에 나타냄) 도 23. 본 발명의 트리코더마 레세이 Bxl1 폴리펩티드는 바람직하게는 β-자일로시다아제 활성을 갖는다.
따라서 본 발명의 트리코더마 레세이 Bxl1 폴리펩티드는 적합하게는 SEQ ID NO: 44 의 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함한다. 폴리펩티드 적합하게는 β-자일로시다아제 활성을 갖는다.
Bgl1 : 트리코더마 레세이 Bgl1 의 아미노산 서열 (SEQ ID NO:45) 을 도 24 및 64 에 나타낸다. 트리코더마 레세이 Bgl1 는 SEQ ID NO:45 의 잔기 1 내지 19 에 상응하는 예측된 신호 서열을 갖고(밑줄친 in 도 24); 신호 서열의 쪼개짐은 SEQ ID NO:45 의 잔기 20 내지 744 에 상응하는 서열을 갖는 성숙 단백질을 수득하기 위해 예측된다. 예측된 보존된 도메인은 볼드체로 나타낸다 (도 24). 트리코더마 레세이 Bgl1 은 파라-니트로페놀를 제조하기 위한 파라-니트로페닐-β-D-글루코피라노시드의 가수분해를 촉매작용하기 위한 수용력, 및 셀로비오스의 가수분해를 촉매작용하는 수용력을 관찰함으로써 β-글루코시다아제 활성을 갖는 것으로 보여졌다. 보존된 산성 잔기는 D164, E197, 및 D267 을 포함한다. 본원에 사용된 바와 같이, "트리코더마 레세이 Bgl1 폴리펩티드" 는 SEQ ID NO:45 의 잔기 20 내지 744 중에서 적어도 50, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 또는 780 인접하는 아미노산 잔기에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 서열을 포함하는 폴리펩티드 및/또는 이의 변이체를 지칭한다. 트리코더마 레세이 Bgl1 폴리펩티드는 바람직하게는 잔기 D164, E197, 및 D267 에서 자연 Bgl1 과 비교시 변경되지 않는다. 트리코더마 레세이 Bgl1 폴리펩티드는 바람직하게는 트리코더마 레세이 Bgl1, Fv3A, 및 트리코더마 레세이 Bxl1 중에서 보존된 아미노산 잔기의 적어도 70%, 80%, 90%, 95%, 98%, 또는 99% 에서 변경되지 않는다(도 64 의 정렬에서 나타낸 바와 같음). 트리코더마 레세이 Bgl1 폴리펩티드는 적합하게는 전체 예측된 보존된 도메인 of 자연 트리코더마 레세이 Bgl1 의 전체 예측된 보존된 도메인을 포함한다 (도 24 에 나타냄). 예시적 트리코더마 레세이 Bgl1 폴리펩티드는 성숙 트리코더마 레세이 Bgl1 서열에 대해 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 또는 100% 일치성을 갖는 서열을 포함한다 (도 24 에 나타냄). 본 발명의 트리코더마 레세이 Bgl1 폴리펩티드는 바람직하게는 β-글루코시다아제 활성을 갖는다.
따라서, 본 개시는 하기 설명되는 바와 같은 단리된, 합성 또는 재조합 헤미셀룰로이틱 폴리펩티드 또는 변이체의 구성원을 제공한다:
(1) 하기 위치에 상응하는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드: (i) SEQ ID NO:2 의 24 내지 766 ; (ii) SEQ ID NO:2 의 73 내지 321; (iii) SEQ ID NO:2 의 73 내지 394; (iv) SEQ ID NO:2 의 395 내지 622; (v) SEQ ID NO:2 의 24 내지 622; 또는 (iv) SEQ ID NO:2 의 73 내지 622; (폴리펩티드는 바람직하게는 β-자일로시다아제 활성을 가짐); 또는
(2) 하기 위치에 상응하는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드: (i) SEQ ID NO:4 의 21 내지 445; (ii) SEQ ID NO:4 의 21 내지 301; (iii) SEQ ID NO:4 의 21 내지 323; (iv) SEQ ID NO:4 의 21 내지 444; (v) SEQ ID NO:4 의 302 내지 444; (vi) SEQ ID NO:4 의 302 내지 445; (vii) SEQ ID NO:4 의 324 내지 444; 또는 (viii) SEQ ID NO:4 의 324 내지 445; (폴리펩티드는 바람직하게는 β-자일로시다아제 활성을 가짐); 또는
(3) 폴리펩티드 하기 위치에 상응하는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드: (i) SEQ ID NO:6 의 19 내지 530; (ii) SEQ ID NO:6 의 29 내지 530; (iii) SEQ ID NO:6 의 19 내지 300; 또는 (iv) SEQ ID NO:6 의 29 내지 300; (폴리펩티드는 바람직하게는 β-자일로시다아제 활성을 가짐); 또는
(4) 하기 위치에 상응하는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드: (i) SEQ ID NO:8 의 20 내지 439; (ii) SEQ ID NO:8 의 20 내지 291; (iii) SEQ ID NO:8 의 145 내지 291; 또는 (iv) SEQ ID NO:8 의 145 내지 439; (폴리펩티드는 바람직하게는 β-자일로시다아제 활성을 가짐); 또는
(5) 하기 위치에 상응하는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드: (i) SEQ ID NO:10 의 23 내지 449; (ii) SEQ ID NO:10 의 23 내지 302; (iii) SEQ ID NO:10 의 23 내지 320; (iv) SEQ ID NO:10 의 23 내지 448; (v) SEQ ID NO:10 의 303 내지 448; (vi) SEQ ID NO:10 의 303 내지 449; (vii) SEQ ID NO:10 의 321 내지 448; 또는 (viii) SEQ ID NO:10 의 321 내지 449; (폴리펩티드는 바람직하게는 β-자일로시다아제 활성을 가짐); 또는
(6) 하기 위치에 상응하는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드: (i) SEQ ID NO:12 의 17 내지 574; (ii) SEQ ID NO:12 의 27 내지 574; (iii) SEQ ID NO:12 의 17 내지 303; 또는 (iv) SEQ ID NO:12 의 27 내지 303; (폴리펩티드는 바람직하게는 둘 모두의 β-자일로시다아제 활성 및 L-α-아라비노푸라노시다아제 활성을 가짐); 또는
(7) 하기 위치에 상응하는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드: (i) SEQ ID NO:14 의 21 내지 676; (ii) SEQ ID NO:14 의 21 내지 652; (iii) SEQ ID NO:14 의 469 내지 652; 또는 (iv) SEQ ID NO:14 의 469 내지 676; (폴리펩티드 바람직하게는 둘 모두의 β-자일로시다아제 활성 및 L-α-아라비노푸라노시다아제 활성을 가짐); 또는
(8) 하기 위치에 상응하는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드: (i) SEQ ID NO:16 의 19 내지 340; (ii) SEQ ID NO:16 의 53 내지 340; (iii) SEQ ID NO:16 의 19 내지 383; 또는 (iv) SEQ ID NO:16 의 53 내지 383; (폴리펩티드는 바람직하게는 β-자일로시다아제 활성을 가짐); 또는
(9) 하기 위치에 상응하는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드: (i) SEQ ID NO:18 의 21 내지 341; (ii) SEQ ID NO:18 의 107 내지 341; (iii) SEQ ID NO:18 의 21 내지 348; 또는 (iv) SEQ ID NO:18 의 107 내지 348; (폴리펩티드는 바람직하게는 β-자일로시다아제 활성을 가짐); 또는
(10) 하기 위치에 상응하는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드: (i) SEQ ID NO:20 의 15 내지 558; 또는 (ii) SEQ ID NO:20 의 15 내지 295; (폴리펩티드는 바람직하게는 L-α-아라비노푸라노시다아제 활성을 가짐); 또는
(11) 하기 위치에 상응하는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드: (i) SEQ ID NO:22 의 21 내지 632; (ii) SEQ ID NO:22 의 461 내지 632; (iii) SEQ ID NO:22 의 21 내지 642; 또는 (iv) SEQ ID NO:22 의 461 내지 642; (폴리펩티드는 바람직하게는 L-α-아라비노푸라노시다아제 활성을 가짐); 또는
(12) 하기 위치에 상응하는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드: (i) SEQ ID NO:28 의 20 내지 341; (ii) SEQ ID NO:28 의 21 내지 350; (iii) SEQ ID NO:28 의 107 내지 341; 또는 (iv) SEQ ID NO:28 의 107 내지 350; (폴리펩티드는 β-자일로시다아제 활성을 가짐); 또는
(13) 하기 위치에 상응하는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드: (i) SEQ ID NO:32 의 21 내지 660; (ii) SEQ ID NO:32 의 21 내지 645; (iii) SEQ ID NO:32 의 450 내지 645; 또는 (iv) SEQ ID NO:32 의 450 내지 660; (폴리펩티드는 바람직하게는 L-α-아라비노푸라노시다아제 활성을 가짐).
또한, 본 개시는 상기 기술된 폴리펩티드 하나 이상이 풍부한 조성물 (예를 들어, 셀룰라아제 조성물, 또는 효소 배합물/조성물) 또는 발효 브로쓰를 제공한다. 따라서, 효소 배합물/조성물은 비-자연 발생 조성물이다. 셀룰라아제 조성물은 예를 들어, 사상균 셀룰라아제 조성물, 예컨대 트리코더마 셀룰라아제 조성물일 수 있다. 발효 브로쓰는 하기의 사상균의 발효 브로쓰일 수 있다: 예를 들어, 트리코더마, 휴미콜라, 후사리움, 아스퍼길러스, 뉴로스포라, 페니실리움, 세팔로스포리움, 아클야, 포도스포라, 엔도티아, 무코르, 코클리오볼러스, 피리쿨라리아, 또는 크리소스포리움 발효 브로쓰. 특히, 발효 브로쓰는 예를 들어 하기일 수 있다: 트리코더마 종 중 하나, 예컨대 트리코더마 레세이, 또는 페니실리움 종, 예컨대 페니실리움 푸니쿨로숨. 또한, 발효 브로쓰는 적합하게는 세포-미함유 발효 브로쓰일 수 있다.
추가로, 본 개시는 상기 기술된 폴리펩티드를 발현하기 위해 재조합적으로 조작된 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 예를 들어 하기일 수 있다: 사상균 숙주 세포, 예컨대 트리코더마, 휴미콜라, 후사리움, 아스퍼길러스, 뉴로스포라, 페니실리움, 세팔로스포리움, 아클야, 포도스포라, 엔도티아, 무코르, 코클리오볼러스, 피리쿨라리아, 또는 크리소스포리움 세포. 특히, 숙주 세포는 하기일 수 있다: 트리코더마 종 세포 (예컨대 트리코더마 레세이 세포), 또는 페니실리움 세포 (예컨대 페니실리움 푸니쿨로숨 세포), 아스퍼길러스 세포 (예컨대 아스퍼길러스 오리재 또는 아스퍼길러스 니둘란스 세포), 또는 후사리움 세포 (예컨대 후사리움 버티실로이드 또는 후사리움 옥시스포룸 세포).
6.1.1. 융합 단백질
또한, 본 개시는 하나 이상의 융합 분절에 부착된 본 개시의 단백질의 도메인을 포함하는 융합 단백질을 제공하며, 이는 전형적으로 단백질에 대해 비상동성이다 (즉, 본 개시의 단백질 보다 상이한 원천으로부터 유래함). 적합한 융합 분절에는 단백질의 안정성을 증강시킬 수 있는 분절이 포함되나 이로써 제한되지 않으며, 다른 바람직한 생물학적 호라성을 제공하고/하거나 단백질의 정제를 촉진한다 (예를 들어, 친화도 크로마토그래피). 적합한 융합 분절은, 원하는 기능을 갖는 임의의 크기의 도메인일 수 있다 (예를 들어, 증가된 안정도, 용해도, 작용 또는 생물학적 활성을 부여하고/하거나 단백질의 정제를 단순화함). 융합 분절은 본 개시의 단백질의 도메인(들)의 아미노 및/또는 카르복실 말단에 연결될 수 있다. 융합 분절은 쪼개짐에 민감할 수 있다. 이러한 민감성에서 몇몇 유리한 점이 있을 수 있는데, 예를 들어 관심 단백질의 곧바로 정방향 회수를 가능하게 할 수 있다는 점이다. 융합 단백질은 바람직하게는 단백질을 인코딩하는 융합 핵산으로 트랜스펙션된 재조합 세포를 배양함으로써 제조되고, 이는 단백질 똔느 이의 도메인의 카르복실 또는 아미노 말단 마지막에 부착되는 융합 분절을 포함하거나, 카르복실 및 아미노 말단 둘 모두에 부착된 융합 분절을 포함한다.
따라서, 본 개시의 단백질은 또한 돌연변이화된 유전자 (예를 들어, 전사 및 해독 유전자를 증강시키기 위해 코돈 변형을 갖는 유전자), 및 말단이 잘린 유전자 (예를 들어, 신호 서열을 갖는 유전자가 제거되거나 비상동성 신호 서열로 치환됨) 의 유전자 융합 (예를 들어, 과다발현, 가용화 및 재조합 단백질의 활성 형태) 의 발현 생성물을 포함한다.
불용성 기질을 이용하는 글리코실 히드롤라제는 종종 모듈 효소이다. 이들은 통상적으로 하나 이상의 비-촉매적 카르보하이드레이트-결합 도메인 (CBM) 에 첨부되어 있는 촉매적 모듈을 포함한다. 자연 상태에서, CBM 은 기질 폴리사카라이드를 이의 표적으로 하는 글리코실 히드롤라제의 상호작용을 촉진하는 것으로 생각된다. 따라서, 본 개시는 하기를 포함하는 변경된 기질 특이성을 갖는 키메라 효소를 제공한다; 예를 들어 "스플라이스-인" 비상동성 CBM 의 결과로서 다중 기질을 갖는 키메라 효소를 포함한다. 또한, 본 개시의 키메라 효소의 비상동성 CBM 은 촉매적 모듈 또는 촉매적 도메인에 첨부되도록 모듈화되기 위해 설계될 수 있고 (예를 들어 활성 자리에서 "CD"), 이는 마찬가지로 글리코실 히드롤라제에 대해 비상동성 또는 상동성일 수 있다.
따라서, 본 개시는 CBM/CD 모듈을 포함하는 또는 이로 이루어진 펩티드 및 폴리펩티드를 제공하는 것이며, 이는 상동적으로 쌍으로 되거나 키메라 (비상동성) CBM/CD 쌍을 형성하기 위해 연결될 수 있다. 따라서, 이들 키메라 폴리펩티드/펩티드는 관심 효소의 성능을 변경하기 위해 또는 개선하기 위해 사용될 수 있다. 따라서, 본 개시는 예를 들어, SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 43, 44, 또는 45 의 효소의 하나 이상의 CBM 을 포함하는 키메라 효소를 제공한다. 본 개시의 폴리펩티드는, 예를 들어, SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 43, 44, 또는 45 의 글리코실 히드롤라제 서열의 CD 및/또는 CBM 을 포함하는 아미노산 서열을 포함한다.
따라서, 본 개시의 폴리펩티드는 적합하게는 둘 이상의 상이한 단백질로부터 기능적 도메인을 포함하는 융합 단백질일 수 있다 (예를 들어, 하나의 단백질로부터의 CBM 이 또다른 단백질로부터 CD 에 연결됨).
본 개시의 폴리펩티드는 적합하게는 "실질적으로 순수한" 형태로 수득되고/되거나 사용될 수 있다. 예를 들어, 본 개시의 폴리펩티드는 주어진 조성물에서 총 단백질의 적어도 약 80 중량% (예를 들어, 적어도 약 85 중량%, 90 중량%, 91 중량%, 92 중량%, 93 중량%, 94 중량%, 95 중량%, 96 중량%, 97 중량%, 98 중량%, 또는 99 중량%) 를 구성하고, 이는 또한 다른 성분, 예컨대 완충제 또는 용액을 포함한다.
또한, 본 개시의 폴리펩티드는 적합하게는 재조합 배양 브로쓰 (예를 들어, 사상균 배양 브로쓰) 에서 사용되고/되거나 수득될 수 있다. 재조합 배양 브로쓰는 비-자연 발생일 수 있으며; 예를 들어, 배양 브로쓰는 비상동성을 발현하기 위해 조작된 재조합 숙주 세포에 의해 생산될 수 있다. 본 개시의 폴리펩티드는, 내인성 발현 수준보다 많거나 적은 양으로 본 개시의 내인성 폴리펩티를 발현하기 위해 조작된 재조합 숙주 세포에 의해 조작된다 (예를 들어, 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 또는 그 이상의 배로 내인성 발현 수준 보다 많거나 적은 양으로). 게다가, 본 개시의 폴리펩티드는 적합하게는 원하는 비율로 복수의 본 개시의 폴리펩티드를 발현하기 위해 조작된 "통합된" 숙주 세포 균주에 의해 생산되는 재조합 배양 브로쓰로서 사용되고/되거나 수득될 수 있다. 원하는 비율의 예는 본원에서 예를 들어 하기 구획 6.3.4 에서 기술된다.
6.2 핵산 및 숙주 세포
본 개시는 예를 들어 상기 구획 6.1 에서 기술되는 것인 본 개시의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 제공한다.
본 개시는 적어도 약 10, 예를 들어, 적어도 약 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 550, 600, 650, 700, 750, 800, 850, 900, 950, 1000, 1050, 1100, 1150, 1200, 1250, 1300, 1350, 1400, 1450, 1500, 1550, 1600, 1650, 1700, 1750, 1800, 1850, 1900, 1950, 또는 2000 뉴클레오티드의 영역에 걸쳐, SEQ ID NO:1, 3, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19, 21, 23, 25, 27, 29, 31, 33, 35, 37, 39, 41, 46, 47, 48, 49, 또는 50 의 핵산에 대해 적어도 약 70%, 예를 들어, 적어도 약 71%, 72%, 73%, 74%, 75%, 76%, 77%, 78%, 79%, 80%, 81%, 82%, 83%, 84%, 85%, 86%, 87%, 88%; 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 또는 99%, 또는 완전한 (100%) 서열 일치성을 갖는 핵산 서열을 포함하는 단리된 합성 또는 재조합 핵산을 제공한다. 또한, 본 개시는 헤미셀룰로오스분해 활성을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 제공한다 (예를 들어, 자일라나아제, β-자일로시다아제, 및/또는 L-α- 아라비노푸라노시다아제 활성).
또한, 본 개시의 핵산은 SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 43, 44, 또는 45 의 서열, 및 이의 하위서열을 갖는 효소를 인코딩하는 단리된 합성 또는 재조합 핵산을 포함한다 (예를 들어, 보존된 도메인 또는 카르보하이드레이트 결합 도메인 ("CBM"), 및 이의 변이체). 본 개시의 핵산은 예를 들어, SEQ ID NO:2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 22, 24, 26, 28, 30, 32, 34, 36, 38, 40, 42, 43, 44, 또는 45 의 단백질의 성숙 부분을 인코딩할 수 있다.
구체적으로 본 개시는 Fv3A, Pf43A, Fv43E, Fv39A, Fv43A, Fv43B, Pa51A, Gz43A, Fo43A, Af43A, Pf51A, AfuXyn2, AfuXyn5, Fv43D, Pf43B, Fv43B, Fv51A, 트리코더마 레세이 Xyn3, 트리코더마 레세이 Xyn2, 트리코더마 레세이 Bxl1, 또는 트리코더마 레세이 Bgl1 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산을 제공한다.
예를 들어, 본 개시는 단리된 핵산 분자를 제공하며, 이때 핵산 분자는 하기를 인코딩한다:
(1) 하기 위치에 상응하는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드: (i) SEQ ID NO:2 의 24 내지 766; (ii) SEQ ID NO:2 의 73 내지 321; (iii) SEQ ID NO:2 의 73 내지 394; (iv) SEQ ID NO:2 의 395 내지 622; (v) SEQ ID NO:2 의 24 내지 622; 또는 (iv) SEQ ID NO:2 의 73 내지 622; 또는
(2) 하기 위치에 상응하는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드: (i) SEQ ID NO:4 의 21 내지 445; (ii) SEQ ID NO:4 의 21 내지 301; (iii) SEQ ID NO:4 의 21 내지 323; (iv) SEQ ID NO:4 의 21 내지 444; (v) SEQ ID NO:4 의 302 내지 444; (vi) SEQ ID NO:4 의 302 내지 445; (vii) SEQ ID NO:4 의 324 내지 444; 또는 (viii) SEQ ID NO:4 의 324 내지 445; 또는
(3) 하기 위치에 상응하는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드: (i) SEQ ID NO:6 의 19 내지 530; (ii) SEQ ID NO:6 의 29 내지 530; (iii) SEQ ID NO:6 의 19 내지 300; 또는 (iv) SEQ ID NO:6 의 29 내지 300; 또는
(4) 하기 위치에 상응하는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드: (i) SEQ ID NO:8 의 20 내지 439; (ii) SEQ ID NO:8 의 20 내지 291; (iii) SEQ ID NO:8 의 145 내지 291; 또는 (iv) SEQ ID NO:8 의 145 내지 439; 또는
(5) 하기 위치에 상응하는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드: (i) SEQ ID NO:10 의 23 내지 449; (ii) SEQ ID NO:10 의 23 내지 302; (iii) SEQ ID NO:10 의 23 내지 320; (iv) SEQ ID NO:10 의 23 내지 448; (v) SEQ ID NO:10 의 303 내지 448; (vi) SEQ ID NO:10 의 303 내지 449; (vii) SEQ ID NO:10 의 321 내지 448; 또는 (viii) SEQ ID NO:10 의 321 내지 449; 또는
(6) 하기 위치에 상응하는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드: (i) SEQ ID NO:12 의 17 내지 574; (ii) SEQ ID NO:12 의 27 내지 574; (iii) SEQ ID NO:12 의 17 내지 303; 또는 (iv) SEQ ID NO:12 의 27 내지 303; 또는
(7) 하기 위치에 상응하는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드: (i) SEQ ID NO:14 의 21 내지 676; (ii) SEQ ID NO:14 의 21 내지 652; (iii) SEQ ID NO:14 의 469 내지 652; 또는 (iv) SEQ ID NO:14 의 469 내지 676; 또는
(8) 하기 위치에 상응하는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드: (i) SEQ ID NO:16 의 19 내지 340; (ii) SEQ ID NO:16 의 53 내지 340; (iii) SEQ ID NO:16 의 19 내지 383; 또는 (iv) SEQ ID NO:16 의 53 내지 383; 또는
(9) 하기 위치에 상응하는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드: (i) SEQ ID NO:18 의 21 내지 341; (ii) SEQ ID NO:18 의 107 내지 341; (iii) SEQ ID NO:18 의 21 내지 348; 또는 (iv) SEQ ID NO:18 의 107 내지 348; 또는
(10) 하기 위치에 상응하는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드: (i) SEQ ID NO:20 의 15 내지 558; 또는 (ii) SEQ ID NO:20 의 15 내지 295; 또는
(11) 하기 위치에 상응하는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드: (i) SEQ ID NO:22 의 21 내지 632; (ii) SEQ ID NO:22 의 461 내지 632; (iii) SEQ ID NO:22 의 21 내지 642; 또는 (iv) SEQ ID NO:22 의 461 내지 642; 또는
(12) 하기 위치에 상응하는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드: (i) SEQ ID NO:28 의 20 내지 341; (ii) SEQ ID NO:28 의 21 내지 350; (iii) SEQ ID NO:28 의 107 내지 341; 또는 (iv) SEQ ID NO:28 의 107 내지 350; 또는
(13) 하기 위치에 상응하는 아미노산 서열에 대해 적어도 90%, 적어도 95%, 적어도 98%, 적어도 99%, 또는 100% 서열 일치성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드: (i) SEQ ID NO:32 의 21 내지 660; (ii) SEQ ID NO:32 의 21 내지 645; (iii) SEQ ID NO:32 의 450 내지 645; 또는 (iv) SEQ ID NO:32 의 450 내지 660.
또한, 본 개시는 하기를 제공한다:
(1) SEQ ID NO:1 에 대해 적어도 90% (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상) 서열 일치성을 갖는 핵산, 또는 SEQ ID NO:1 의 상보서열에 대해 또는 이의 단편에 대해 매우 엄격한 조건 하에서 하이브리드화할 수 있는 핵산; 또는
(2) SEQ ID NO:3 에 대해 적어도 90% (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상) 서열 일치성을 갖는 핵산, 또는 SEQ ID NO:3 의 상보서열에 대해 또는 이의 단편에 대해 매우 엄격한 조건 하에서 하이브리드화할 수 있는 핵산; 또는
(3) SEQ ID NO:5 에 대해 적어도 90% (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상) 서열 일치성을 갖는 핵산, 또는 SEQ ID NO:5 의 상보서열에 대해 또는 이의 단편에 대해 매우 엄격한 조건 하에서 하이브리드화할 수 있는 핵산; 또는
(4) SEQ ID NO:7 에 대해 적어도 90% (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상) 서열 일치성을 갖는 핵산, 또는 SEQ ID NO:7 의 상보서열에 대해 또는 이의 단편에 대해 매우 엄격한 조건 하에서 하이브리드화할 수 있는 핵산; 또는
(5) SEQ ID NO:9 에 대해 적어도 90% (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상) 서열 일치성을 갖는 핵산, 또는 SEQ ID NO:9 의 상보서열에 대해 또는 이의 단편에 대해 매우 엄격한 조건 하에서 하이브리드화할 수 있는 핵산; 또는
(6) SEQ ID NO:11 에 대해 적어도 90% (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상) 서열 일치성을 갖는 핵산, 또는 SEQ ID NO:11 의 상보서열에 대해 또는 이의 단편에 대해 매우 엄격한 조건 하에서 하이브리드화할 수 있는 핵산; 또는
(7) SEQ ID NO:13 에 대해 적어도 90% (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상) 서열 일치성을 갖는 핵산, 또는 SEQ ID NO:13 의 상보서열에 대해 또는 이의 단편에 대해 매우 엄격한 조건 하에서 하이브리드화할 수 있는 핵산; 또는
(8) SEQ ID NO:15 에 대해 적어도 90% (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상) 서열 일치성을 갖는 핵산, 또는 SEQ ID NO:15 의 상보서열에 대해 또는 이의 단편에 대해 매우 엄격한 조건 하에서 하이브리드화할 수 있는 핵산; 또는
(9) SEQ ID NO:17 에 대해 적어도 90% (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상) 서열 일치성을 갖는 핵산, 또는 SEQ ID NO:17 의 상보서열에 대해 또는 이의 단편에 대해 매우 엄격한 조건 하에서 하이브리드화할 수 있는 핵산; 또는
(10) SEQ ID NO:19 에 대해 적어도 90% (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상) 서열 일치성을 갖는 핵산, 또는 SEQ ID NO:19 의 상보서열에 대해 또는 이의 단편에 대해 매우 엄격한 조건 하에서 하이브리드화할 수 있는 핵산; 또는
(11) SEQ ID NO:21 에 대해 적어도 90% (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상) 서열 일치성을 갖는 핵산, 또는 SEQ ID NO:21 의 상보서열에 대해 또는 이의 단편에 대해 매우 엄격한 조건 하에서 하이브리드화할 수 있는 핵산; 또는
(12) SEQ ID NO:27 에 대해 적어도 90% (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상) 서열 일치성을 갖는 핵산, 또는 SEQ ID NO:27 의 상보서열에 대해 또는 이의 단편에 대해 매우 엄격한 조건 하에서 하이브리드화할 수 있는 핵산; 또는
(13) SEQ ID NO:31 에 대해 적어도 90% (예를 들어, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상) 서열 일치성을 갖는 핵산 , 또는 SEQ ID NO:31 의 상보서열에 대해 또는 이의 단편에 대해 매우 엄격한 조건 하에서 하이브리드화할 수 있는 핵산.
또한, 본 개시는 상기 기술된 핵산을 포함하는 발현 카세트 및/또는 벡터를 제공한다.
적합하게는, 본 개시의 효소를 인코딩하는 핵산은 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 구체적으로는, 사상균 숙주를 목적으로 하는 재조합 발현에서, 프로모터는 사상균 프로모터일 수 있다. 핵산은 예를 들어, 비상동성 프로모터의 제어하에 있을 수 있다. 또한, 핵산은 구성요소적 또는 유도가능한 프로모터의 제어 하에서 발현될 수 있다. 사용될 수 있는 프로모터의 예에는 비제한적으로 하기가 포함된다: 셀룰라아제 프로모터, 자일라나아제 프로모터, 1818 프로모터 (EST 맵핑 트리코더마에 의해 고도로 발현되는 단백질로서 이미 확인됨). 예를 들어, 프로모터는 적합하게는 셀로비오히드롤라제, 엔도글루카나아제, 또는 β-글루코시다아제 프로모터일 수 있다. 특별히 적합한 프로모터는 예를 들어, T. reesei 셀로비오히드롤라제, 엔도글루카나아제, 또는 β-글루코시다아제 프로모터일 수 있다. 예를 들어, 프로모터는 셀로비오히드롤라제 I (cbh1) 프로모터이다. 프로모터의 비제한적 예에는 하기가 포함된다: cbh1 , cbh2 , egl1 , egl2 , egl3, egl4 , egl5 , pki1 , gpd1 , xyn1, 또는 xyn2 프로모터. 프로모터의 추가의 비제한적 예에는 하기가 포함된다: T. reesei cbh1 , cbh2 , egl1 , egl2 , egl3 , egl4 , egl5 , pki1 , gpd1 , xyn1, 또는 xyn2 프로모터.
본 개시는 하나 이상의 본 개시의 효소를 발현하기 위해 조작된 숙주 세포를 제공한다. 적합한 숙주 세포에는 임의의 미생물의 세포 (예를 들어, 박테리움, 원생생물, 조류, 균류 (예를 들어, 효모 또는 사상균), 또는 다른 미생물) 의 세포가 포함되며, 박테리움, 효모, 또는 사상균의 세포가 바람직하다.
박테리아 종류의 적합한 숙주 세포에는 하기가 포함되나 이로써 제한되지 않는다: 에스케리챠, 바실러스, 락토바실러스, 슈도모나스, 및 스트렙토마이세스 의 세포. 박테리아 종의 적합한 세포는 하기가 포함되나 이로써 제한되지 않는다: 에스케리챠 콜라이, 바실러스 서브틸리스, 바실러스 리케니포르미스, 락토바실러스 브레비스, 슈도모나스 아에루기노사, 및 스트렙토마이세스 리비단스의 세포.
효모 종류의 적합한 숙주 세포에는 하기가 포함되나, 이로써 제한되지 않는다: 사카로마이세스, 스키조사카로마이세스, 칸디다, 한세눌라, 피키아, 글루이베로마이세스, 및 파피아. 효모 종의 적합한 세포에는 하기가 포함되나 이로써 제한되지 않는다: 사카로마이세스 세레비시애, 스키조사카로마이세스 폼브, 칸디다 알비칸스, 한세눌라 폴리모르파, 피키아 파스토리스, P. 카나덴시스, 글루이베로마이세스 마르시아누스, 및 파피아 로도지마 의 세포.
사상균의 적합한 숙주 세포는 세분 유마이코티나 (Eumycotina) 의 모든 사상 형태를 포함한다. 사상균 종류의 적합한 세포에는 하기가 포함되나, 이로써 제한되지 않는다: 아크레모니움 , 아스퍼길러스 , 아우레오바시디움 , 브저르칸데라 , 세리포리옵시스 , 크리소포리움 , 코프리누스 , 코리올루스 , 코리나스쿠스, 캐토미움 , 크립토코쿠스 , 필로바시디움 , 후사리움 , 지베렐라 , 휴미콜 라, 히포크레아 , 마그나포르테 , 무코르 , 마이셀리오프토라 , 무코르 , 메오칼리마스 틱스, 뉴로스포라 , 파에실로마이세스 , 페니실리움 , 파네로카에트 , 플레비아 , 피로마 이세스, 플레우로투스 , 사이탈리디움 , 스키조필룸 , 스포로트리춤 , 탈라로마이세스 , 써모아스쿠스, 티엘라비아 , 톨리포클라디움 , 트라메테스 , 및 트리코더마의 세포. 적합한 세포는 다양한 아나모프의 세포 및 이들 사상균 종류의 완전세대형 형태를 포함할 수 있다.
사상균 종의 적합한 세포에는 하기가 포함되나 이로써 제한되지 않는다: 아스퍼길러스 아와모리, 아스퍼길러스 후미가투스, 아스퍼길러스 포에티두스, 아스퍼길러스 자포니쿠스, 아스퍼길러스 니둘란스 , 아스퍼길러스 니거, 아스퍼길러 스 오리재 , 크리소스포리움 럭노웬스, 후사리움 박트리디오이드, 후사리움 세레알리스, 후사리움 크룩웰렌스, 후사리움 쿨모룸, 후사리움 그라미네아룸, 후사리움 그라미눔 , 후사리움 헤테로스포룸 , 후사리움 네군디, 후사리움 옥시스포룸, 후사리움 레티쿨라툼, 후사리움 로세움 , 후사리움 삼부시눔, 후사리움 사르코크로움, 후사리움 스포로트리치오이드, 후사리움 술푸레움, 후사리움 토룰로숨, 후사리움 트리코테시오이드, 후사리움 베네나툼, 브저르칸데라 아두스타, 세리포리옵시스 아네이리나, 세리포리옵시스 아네이리나, 세리포리옵시스 카레기에아, 세리포리옵시스 길베센스, 세리포리옵시스 판노신타, 세리포리옵시스 리불로사 , 세리포리옵시스 수브루파, 세리포리옵시스 수베르미스포라, 코프리누스 시네레우스, 코리올루스 히르수투스, 휴미콜라 인솔렌스 , 휴미콜라 라누기노사 , 무코르 미에헤이, 마이셀리오프토라 써모필라, 뉴로스포라 크라사 , 뉴로스포라 인테르메디아, 페니실리움 푸르푸로게눔 , 페니실리움 카네센스, 페니실리움 솔리툼, 페니실리움 푸니쿨로숨, 파네로카에트 크리소스포리움, 플레비아 라디에이트, 플레우로투스 에린기, 탈라로마이세스 플라부스, 티엘라비아 테레스트리스, 트라메테스 빌로사, 트라메테스 베르시콜로르, 트리코더마 하르지아늄, 트리코더마 코닌기, 트리코더마 롱기브라키아툼, 트리코더마 레세이 , 및 트리코더마 비리드의 세포.
본 개시는 추가로 하나 이상, 둘 이상, 셋 이상, 넷 이상, 또는 다섯 이상의 Fv3A, Pf43A, Fv43E, Fv39A, Fv43A, Fv43B, Pa51A, Gz43A, Fo43A, Af43A, Pf51A, AfuXyn2, AfuXyn5 Fv43D, Pf43B, 및 Fv51A 폴리펩티드를 발현하기 위해 조작된 재조합 숙주 세포를 제공한다. 재조합 숙주 세포는, 예를 들어, 재조합 트리코더마 레세이 숙주 세포이다. 특정 실시예에서, 본 개시는 하나 이상의, 둘 이상, 셋 이상, 넷 이상, 또는 다섯 이상의 Fv3A, Pf43A, Fv43E, Fv39A, Fv43A, Fv43B, Pa51A, Gz43A, Fo43A, Af43A, Pf51A, AfuXyn2, AfuXyn5, Fv43D, Pf43B, 및 Fv51A 폴리펩티드를 발현하기 위해 조작된 재조합 균류, 예컨대 재조합 트리코더마 레세이를 제공한다. 본 개시는 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 Fv3A, Pf43A, Fv43E, Fv39A, Fv43A,an Fv43B, Pa51A, Gz43A, Fo43A, Af43A, Pf51A, AfuXyn2, AfuXyn5, Fv43D, Pf43B, 및 Fv51A 폴리펩티드를 발현하기 위해 조작된 재조합 트리 코더마 레세이 숙주 세포를 제공한다.
본 개시는 하나 이상의 자일라나아제, 하나 이상의 β-자일로시다아제, 및 하나의 L-α-아라비노푸라노시다아제를 재조합적으로 발현하기 위해 조작된 숙주 세포, 예를 들어, 재조합 균류 숙주 세포 또는 재조합 사상균를 제공한다.
또한, 본 개시는 하나 이상의 트리코더마 레세이 Xyn2, 트리코더마 레세이 Xyn3, 트리코더마 레세이 Bxl1 및/또는 트리코더마 레세이 Bgl1 외에도, 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 Fv3A, Pf43A, Fv43E, Fv39A, Fv43A, Fv43B, Pa51A, Gz43A, Fo43A, Af43A, Pf51A, AfuXyn2, AfuXyn5, Fv43D, Pf43B, 및 Fv51A 폴리펩티드를 발현하기 위해 조작된 재조합 숙주 세포, 예를 들어, 재조합 균류 숙주 세포 또는 재조합 사상균 예컨대 재조합 트리코더마 레세이를 제공한다. 재조합 숙주 세포는 예를 들어, 트리코더마 레세이 숙주 세포이다. 재조합 균류는 is, 예를 들어, 재조합 트리코더마 레세이이다. 본 개시는 하나 이상의 트리코더마 레세이 Xyn2, 트리코더마 레세이 Xyn3, 트리코더마 레세이 Bxl1 및/또는 트리코더마 레세이 Bgl1 를 재조합적으로 발현하는 것 외에도, 1, 2, 3, 4, 5 또는 그 이상의 Fv3A, Pf43A, Fv43E, Fv39A, Fv43A,an Fv43B, Pa51A, Gz43A, Fo43A, Af43A, Pf51A, AfuXyn2, AfuXyn5, Fv43D, Pf43B, 및 Fv51A 폴리펩티드를 재조합적으로 발현하기 위해 조작된 트리코더마 레세이 숙주 세포, 또는 재조합 트리코더마 레세이 균류를 제공한다.
또한, 본 개시는 트리코더마 레세이 Xyn3, 트리코더마 레세이 Bgl1, Fv3A, Fv43D, 및 Fv51A 폴리펩티드를 재조합적으로 발현하기 위해 조작된 재조합 숙주 세포 예를 들어, 재조합 균류 숙주 세포 또는 재조합 유기체, 예를 들어, 사상균, 예컨대 재조합 트리코더마 레세이를 제공한다. 예를 들어, 재조합 숙주 세포는 적합하게는 트리코더마 레세이 숙주 세포이다. 재조합 균류는 적합하게는 재조합 트리코더마 레세이이다. 본 개시는 트리코더마 레세이 Xyn3, 트리코더마 레세이 Bgl1, Fv3A, Fv43D, 및 Fv51A 폴리펩티드를 재조합적으로 발현하기 위해 조작된 예를 들어, 트리코더마 레세이 숙주 세포를 제공한다.
추가로, 본 개시는 당화에 적합한 비율로 적합한 효소를 포함하는 효소 배합물을 발현하기 위해 조작된 재조합 숙주 세포 또는 재조합 균류를 제공한다. 재조합 숙주 세포 예를 들어, 균류 숙주 세포이다. 재조합 균류는 예를 들어, 재조합 트리코더마 레세이이다. 적합한 효소 배합물에 존재하는 예시적 효소 비/양은 하기 구획 6.3.4 에서 기술된다.
본 개시는 추가로 본 개시의 핵산은 또는 본 개시의 발현 카세트를 포함하는 트랜스제닉 식물을 제공한다. 트랜스제닉 식물은 예를 들어, 곡초류, 옥수수 식물, 감자 식물, 토마토 식물, 밀 식물, 지방종자 식물, 평지씨 식물, 콩 식물, 쌀 식물, 보리 식물 또는 담배 식물일 수 있다.
6.3 당화를 위한 효소 배합물
본 개시는 리그노셀룰로오스 물질을 분해할 수 있는 효소 배합물/조성물을 포함하는 조성물을 제공한다. 그러한 다중-효소 배합물/조성물은 하나 이상의 본 개시의 폴리펩티드를, 하나 이상의 추가 본 개시의 폴리펩티드와 조합으로, 또는 다른 미생물, 식물, 또는 유기체로부터 하나 이상의 효소와 조합으로 포함한다. 상승작용하는 효소 조합 및 관련 방법이 고려된다. 본 개시는 특정 리그노셀룰로오스 물질을 분해하기 위한 배합물/조성물 중에서 포함되는 효소의 최적 비를 확인하기 위한 방법을 포함한다. 이들 방법은 예를 들어, 주어진 리그노셀룰로오스 기질 내지 이의 구성요소 당의 효율적 전환을 위한 최적 효소 배합물/조성물을 확인하기 위한 시험을 포함한다. 하기 예는 리그노셀룰로오스 물질를 분해하기 위한 효소의 배합물/조성물 및 최적 비를 확인하기 위해 사용될 수 있는 검정을 포함한다.
6.3.1 백그라운드
고등 식물의 세포벽은 다양한 카르보하이드레이트 중합체 (CP) 성분으로 구성된다. 이들 CP 는 식물에서 팽압에 저항하고 단단한 세포벽을 형성하기 위해 요구되는 구조적 통합성을 제공하는 공유결합 및 비-공유결합 수단을 통해 상호작용한다. 식물에서 발견되는 주요 CP 는 세포벽의 구조적 골격을 형성하는 셀룰로오스이다. 셀룰로오스 생합성 동안, 폴리-β-1,4-D-글루코오스 자신의 사슬이 수소 결합을 통해 연계되고 소수성 상호작용하여 셀룰로오스 미소섬유를 형성하며, 이는 더 큰 피브릴을 형성하기 위해 추가로 연계된다. 셀룰로오스 미소섬유는 자주 구조적으로 불규칙하고 다양한 결정도 영역을 함유한다. 셀룰로오스 피브릴의 결정도는 이의 성분 셀룰로오스 사슬 중에서 및 이들 사이에서 수소 결합이 어떻게 엄밀하게 순서화되어 있는지에 의존적이다. 덜 순서화된 결합을 갖는 영역, 따라서 더욱 접근가능한 글루코오스 사슬은 무정형 영역으로서 지칭된다.
글루코오스에 대해 셀룰로오스 해중합을 위한 일반적 모델은, 최소 3 개의 별개의 효소적 활성을 포함한다. 엔도글루카나아제는 셀룰로오스 사슬을, 접근가능한 말단의 수를 증가시키는 공정에서 더욱 짧은 사슬로 내부적으로 분해하고, 이는 원래대로의 셀룰로오스 사슬 보다 엑소글루카나아제 활성에 대해 더욱 민감하다. 이들 엑소글루카나아제 (예를 들어, 셀로비오히드롤라제) 는 대부분의 경우에서, 셀로비오스, 글루코오스의 이량체를 유리시키는 환원 말단 또는 비-환원 말단 중 하나에 대해 특이적이다. 이후, 축적된 셀로비오스는 셀로비아제 (예를 들어, β-1,4-글루코시다아제) 에 의해 글루코오스로 분해되게 된다.
셀룰로오스는 오직 무수-글루코오스만을 함유한다. 대조적으로, 헤미셀룰로오스는 많은 상이한 당 단량체를 함유한다. 예를 들어, 글루코오스와는 별도로, 헤미셀룰로오스에서 당 단량체는 또한 자일로오스, 만노오스, 갈락토오스, 람노오스, 및 아라비노오스를 포함할 수 있다. 헤미셀룰로오스는 대개 D-펜토스 당을 함유하고 때때로 소량의 L-당을 함유한다. 자일로오스는 전형적으로 가장 대량으로 존재하나, 마누론산 및 갈락투론산 또한 존재하는 경향이 있다. 헤미셀룰로오스는 자일란, 글루쿠로노자일란, 아라비노자일란, 글루코마난, 및 자일로글루칸을 포함한다.
본 개시의 효소 및 다중-효소 조성물은 예를 들어, 자일란, 아라비노자일란, 및 자일란- 또는 아라비노자일란-함유 기질을 포함하는 헤미셀룰로오스 물질의 당화에 유용하다. 아라비노자일란은 자일로오스 및 아라비노오스로 구성된 폴리사카라이드이고, 이때 L-α-아라비노푸라노오스 잔기는 β(1,4)-연결된 자일로오스 중합성 골격에 대한 분지점으로서 부착된다.
대부분의 바이오매스 원천은 다른 성분 중에서 셀룰로오스, 헤미셀룰로오스, 펙틴, 리그닌, 단백질, 및 애쉬를 함유하는 오히려 착물이다. 따라서, 특정 양태에서, 본 개시는 가장 효율적 방식으로 발효가능한 당으로 바이오매스를 분해하기 위해 함께 작업할때 다양한 기질 특이성 또는 범위를 부여하는 효소를 함유하는 효소 배합물/조성물을 제공한다. 본 발명의 다중-효소 배합물/조성물의 하나의 예는 셀로비오히드롤라제(들), 자일라나아제(들), 엔도글루카나아제(들), β-글루코시다아제(들), β-자일로시다아제(들), 및, 임의로는, 부속 단백질의 혼합물이다. 효소 배합물/조성물은 적합하게는 비-자연 발생 조성물이다.
따라서, 본 개시는 자일란-가수분해, 헤미셀룰로오스- 및/또는 셀룰로오스-가수분해 효소의 혼합물을 포함하는 (제조 생성물 포함) 효소 배합물/조성물을 제공하며, 이는 글루카나아제; 셀로비오히드롤라제; L-α-아라비노푸라노시다아제; 자일라나아제; β-글루코시다아제; 및 β-자일로시다아제를 포함하는 셀룰라아제 하나 이상, 수개 또는 모두를 포함한다. 바람직하게는 본 개시의 효소 배합물/조성물 각각은 하나 이상의 본 개시의 효소를 포함한다. 또한, 본 개시는 비-자연 발생 조성물인 효소 배합물/조성물을 제공한다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "효소 배합물/조성물" 은 하기를 지칭한다:
(1) 성분 효소를 조합하여 제조된 조성물 (발효 브로쓰 또는 부분적으로 또는 완전하게 단리된 또는 정제된 형태);
(2) 하나 이상의 성분 효소를 발현하기 위해 변형된 유기체에 의해 생산된 조성물; 특정 구현예에서, 하나 이상의 유전자를 결실시키기 위해 변형될 수 있는 하나 이상의 성분 효소를 발현하기 위해 사용되는 유기체; 특정 다른 구현예에서, 자일란 가수분해, 헤미셀룰로오스 가수분해, 및/또는 셀룰로오스 가수분해에 영향미치는 단백질을 추가로 포함할 수 있는 하나 이상의 성분 효소를 발현하기 위해 사용되는 유기체;
(3) 당화 또는 발효 반응 동안 동시에, 별도로 또는 순차적으로 성분 효소를 조합하여 제조된 조성물; 및
(4) 예를 들어, 당화 또는 발효 반응 동안 제자리에서 제조된 효소 혼합물;
(5) 상기 (1)-(4) 중 임의의 것 또는 모든 것에 따라 제조된 조성물.
본원에 사용된 바와 같은 용어 "발효 브로쓰" 는 발효에 대해 최소한의 후속 회수 및/또는 정제를 거치거나 이를 거치지 않은 발효에 의해 생산되는 효소 제제를 지칭한다. 예를 들어, 미생물의 배양액은 탄소-제한 조건 내지 allow 단백질 합성을 허용하는 것에 대한 탄소-제한 조건 하에서 포화, 인큐베이션시킨다 (예를 들어, 효소의 발효). 그 후, 일단 효소(들)이 세포 배양 배지로 분비되면, 발효 브로쓰가 사용될 수 있다. 본 개시의 발효 브로쓰는 발효 마지막에 유래되는 발효 물질의 분획화된 내용물 또는 분획화되지 않은 내용물을 함유할 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 발효 브로쓰는 분획화되지 않고, 미생물 세포 (예를 들어, 사상균 세포) 가 발효 공정을 거친 후 존재하는 세포 파편 및 소비된 배양 배지를 포함한다. 발효 브로쓰는 적합하게는 세포 배양 배지, 세포외 효소, 및 미생물의 생세포 또는 사세포를 함유할 수 있다. 대안적으로, 발효 브로쓰는 미생물의 세포를 제거하기 위해 분획화될 수 있다. 이들 경우에서, 발효 브로쓰는 예를 들어, 소비된 세포 배양 배지 및 세포외 효소를 포함할 수 있다.
본원에서 구체적으로 기술되는 임의의 효소는 임의의 하나 이상의 효소와, 또는 적합한 다중-효소 배합물/조성물을 제조하기 위해 임의의 다른 이용가능하고 적합한 효소와 조합될 수 있다. 본 개시는 하기 목록의 특정 예시적 조합으로 한정되지 않는다.
6.3.2 바이오매스
본 개시는 본 개시의 효소, 효소 배합물/조성물을 사용하는 바이오매스 당화를 위한 과정 및 방법을 제공한다. 본원에 사용된 바와 같은 용어 "바이오매스"는 셀룰로오스 및/또는 헤미셀룰로오스 (임의로는 리그노셀룰로오스 바이오매스 물질에서 리그닌 또한) 를 포함하는 임의의 조성물을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, 바이오매스는 하기를 포함하나 이로써 제한되지 않는다: 씨, 낟알, 줄기, 식품 가공 또는 산업적 가공의 식물 폐기물 또는 부산물 (예를 들어, 대), 옥수수 (예를 들어, 옥수수속대, 여물, 등 포함), 풀 (예를 들어, 인디안 그래스, 예컨대 소르가스트럼 누탄스; 또는, 스위치그래스, 예를 들어, 파니쿰 종, 예컨대 파니쿰 비르가툼 포함), 목재 (예를 들어, 목재 칩, 가공 폐기물 포함), 종이, 펄프, 및 재활용 종이 (예를 들어, 신문, 프린터 종이, 등 포함). 다른 바이오매스 물질은 하기를 포함하나 이로써 제한되지 않는다: 감자, 대두 (예를 들어, 평지씨), 보리, 호밀, 귀리, 밀, 비트, 및 당 케인 바가스.
본 개시는 바이오매스 물질, 예를 들어, 자일란, 헤미셀룰로오스, 셀룰로오스, 및/또는 발효가능한 당을 포함하는 물질을, 본 개시의 폴리펩티드는, 또는 폴리펩티드 (본 개시의 핵산에 의해 인코딩됨), 또는 효소 배합물/조성물 중 임의의 것, 또는 본 개시의 제조 생성물과 접촉시키는 것을 포함하는 당화 방법을 제공한다.
사카라이드화된 바이오매스 (예를 들어, 본 개시의 효소에 의해 가공된 리그노셀룰로오스 물질) 는 예를 들어, 미생물의 발효 및/또는 화학적 합성 과정을 통해, 많은 생물계 생성물로 제조될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "미생물 발효" 는 적합한 조건 하에서 미생물을 성장시키고 발효한 미생물을 수확하는 공정을 지칭한다. 발효 미생물은 생물계 생성물의 생성을 위해 원하는 발효 가정에 사용되는데 적합한 임의의 미생물일 수 있다. 적합한 발효 미생물은 하기를 포함하나 이로써 한정되지 않는다: 사상균, 효모, 및 박테리아. 사카라이드화된 바이오매스는 발효 및/또는 화학적 합성을 통해 연료 (예를 들어, 바이오연료 예컨대 바이오에탄올, 바이오부탄올, 바이오메탄올, 바이오프로판올, 바이오디젤, 제트 연료, 등) 로 제조될 수 있다. 사카라이드화된 바이오매스는 발효 및/또는 화학적 합성을 통해 일상적 화학적 (예를 들어, 아스코르브산, 이소프렌, 1,3-프로판디올), 지질, 아미노산, 단백질, 및 효소로 제조될 수 있다.
6.3.3. 전처리
당화 전에, 바이오매스 (예를 들어, 리그노셀룰로오스 물질) 는, 자일란, 헤미셀룰로오스, 셀룰로오스 및/또는 리그닌 물질이, 효소에 대해 더욱 영향받기 쉽게 또는 민감하게 되어 효소(들) 및/또는 본 개시의 효소 배합물/조성물에 의해 가수분해하기에 더욱 다루기 쉽게 되도록 하나 이상의 전처리 단계(들) 로 처리하는 것이 바람직하다.
예시적 구현예에서, 전처리는 반응기 중에서 강산 및 금속 염의 희석액을 포함하는 촉매에 대해 바이오매스 물질을 처리하는 것을 수반한다. 바이오매스 물질은 예를 들어, 원료 물질 또는 건조된 물질일 수 있다. 이러한 전처리는 궁극적으로 발효가능한 당의 고수율을 허용하는 셀룰로오스 가수분해의 온도 또는 활성화 에너지를 낮출 수 있다. 예를 들어, 미국 특허 제 6,660,506 호; 제 6,423,145 호를 참조한다.
또다른 예시적 전처리 방법은, 셀룰로오스 글루코오스로의 현저한 해중합을 달성하지 않고 헤미셀룰로오스의 1차적인 해중합을 실시하기 위해 선택된 온도 및 압력에서 수성 배지에서 제 1 가수분해 단계로 바이오매스 물질을 처리함으로써 바이오매스의 가수분해를 수반한다. 이러한 단계는 슬러리를 산출하게 되는데 이때 액체 수성 상은, 헤미셀룰로오스의 해중합으로부터 생성되는 용해된 모노사카라이드, 및 셀룰로오스 및 리그닌을 함유하는 고체 상을 함유한다. 이후, 슬러리는 셀룰로오스의 주요 부분이 해중합되게 하는 조건 하에서 제 2 가수분해 단계로 처리되어, 셀룰로오스의 용해된/가용성 해중합 생성물을 함유하는 액체 수성 상을 수득한다. 예를 들어, 미국 특허 번호 제 5,536,325 호를 참조한다.
추가로 예시적 방법은 약 0.4% 내지 약 2% 의 강산을 이용하는 희석 산 가수분해 단계 하나 이상; 이어서 알칼리 탈리그닌화로 산 가수분해된 물질의 미반응 고체 리그노셀룰로오스 성분을 처리하는 것에 의해 바이오매스 물질을 가공하는것을 포함한다. 참조, 예를 들어, 미국 특허 번호 제 6,409,841 호.
또다른 예시적 전처리 방법은 하기를 포함한다: 예비가수분해 반응기에서 바이오매스 (예를 들어, 리그노셀룰로오스 물질)의 예비가수분해; 산성 액체 내지 고체의 리그노셀룰로오스 물질을 첨가하여 혼합물을 제조하는 것 내지; 혼합물을 반응 온도로 가열하는 것; 리그노셀룰로오스 물질을 리그노셀룰로오스 물질로부터 적어도 약 20% 의 리그닌을 함유하는 용해된 부분, 및 셀룰로오스를 함유하는 고체 분획으로 분획화하는데 충분한 기간 동안 반응온도를 유지하는 것 ; 고체 분획으로부터 용해된 부분을 분리하는 것, 및 반응 온도 또는 반응 온도 근처에서 용해된 부분을 제거하는 것; 및 용해된 부분을 회수하는 것. 고체 분획에서 셀룰로오스는 효소적 소화에 대해 더욱 다루기 쉽게 된다. 참조, 예를 들어, 미국 특허 번호 제 5,705,369 호.
추가로 전처리 방법은 과산화수소 H2O2 의 사용을 포함할 수 있다. 참조, [Gould, 1984, Biotech, 및 Bioengr. 26:46-52].
또한, 전처리는 수산화나트륨 및 수산화암모늄의 화학량론적 양을 매우 낮은 농도로 바이오매스 물질과 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 참조, [Teixeira et al.,1999, Appl. Biochem. 및 Biotech. 77-79:19-34]
또한, 전처리는 화학적 (예를 들어, 염기, 예컨대 탄산 나트륨 또는 수산화칼륨), 약 9 내지 약 14 의 pH 에서, 온화한 온도, 압력, 및 pH 에서 화학물질 (예를 들어, 염기, 예컨대 탄산 나트륨 또는 수산화칼륨) 과 접촉시키는 것을 포함할 수 있다. 참조, PCT 공보 WO2004/081185.
암모니아는 예를 들어, 바람직한 전처리 방법에서 사용될 수 있다. 이러한 전처리 방법은 고도의 고체 조건 하에서 낮은 암모니아 농도로 바이오매스 물질을 처리하는 것을 포함한다. 참조, 예를 들어, 미국 특허 공보 번호 제 20070031918 호 및 PCT 공보 제 WO 06110901 호.
6.3.4 예시적 효소 배합물
본 개시는 하나 이상의 본 개시의 효소를 포함하는 효소 배합물/조성물을 제공한다. 효소 배합물/조성물의 하나 이상의 효소는 재조합 숙주 세포 또는 재조합 유기체에 의해 제조될 수 있다. 효소 배합물/조성물는 적합하게는 비-자연 발생 조성물이다.
본 개시의 효소 배합물/조성물은 적합하게는 β-자일로시다아제 활성을 갖는 폴리펩티드을 갖는 제 1 폴리펩티드, 및 추가로 β-자일로시다아제 활성을 갖는 1, 2, 3, 또는 4 개의 제 2 폴리펩티드, L-α-아라비노푸라노시다아제 활성을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드, 자일라나아제 활성을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드, 및 셀룰라아제 활성을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드를 포함할 수 있다. β-자일로시다아제 활성을 갖는 제 1 폴리펩티드는, 예를 들어, Fv3A, Pf43A, Fv43E, Fv43A, Fv43B, Pa51A, Gz43A, Fo43A, 또는 Fv39A 폴리펩티드이다. β-자일로시다아제 활성을 갖는 제 2 폴리펩티드 (존재하는 경우) 는, 예를 들어, 상이한 from 제 1 β-자일로시다아제 활성을 갖는 폴리펩티드, 및 적합하게는 Fv3A, Pf43A, Fv43E, Fv43A, Fv43B, Pa51A, Gz43A, Fv43D, Fo43A, Fv39A, 또는 트리코더마 레세이 Bxl1 폴리펩티드이다. L-α-아라비노푸라노시다아제 활성 (존재하는 경우) 을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드 각각은 예를 들어, Af43A, Pf51A, Pa51A, Fv43B, 또는 Fv51A 폴리펩티드이다. 자일라나아제 활성을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드 각각은 예를 들어, 트리코더마 레세이 Xyn, 트리코더마 레세이 Xyn2, AfuXyn2, 또는 AfuXyn5 이다. 셀룰라아제 활성 (존재하는 경우) 을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드 각각은, 예를 들어, 엔도글루카나아제, 예를 들어, 트리코더마 레세이 EG1 또는 EG2, 셀로비오히드롤라제, 예를 들어, 트리코더마 레세이 CBH1 또는 CBH2, 또는 β-글루코시다아제, 예를 들어, 트리코더마 레세이 Bgl1 이다.
또다른 본 개시의 효소 배합물/조성물은 적합하게는 L-α-아라비노푸라노시다아제 활성을 갖는 제 1 폴리펩티드를 포함할 수 있고, 및 L-α-아라비노푸라노시다아제 활성을 갖는 1, 2, 3, 또는 4 of 제 2 폴리펩티드, β-자일로시다아제 활성을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드, 자일라나아제 활성을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드, 및/또는 셀룰라아제 활성을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드를 추가로 포함할 수 있다. 제 1 L-α-아라비노푸라노시다아제는 Af43A, Pf51A, 또는 Fv51A 폴리펩티드이다. 제 2 L-α-아라비노푸라노시다아제는 제 1 L-α-아라비노푸라노시다아제로부터 상이하고, 및 예를 들어, Af43A, Pf51A, Pa51A, Fv43B, 또는 Fv51A 폴리펩티드이다. 하나 이상의 β-자일로시다아제 각각은 예를 들어, Fv3A, Pf43A, Fv43E, Fv43A, Fv43B, Pa51A, Fv43D, Gz43A, Fo43A, Fv39A, 또는 트리코더마 레세이 Bxl1 폴리펩티드이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 자일라나아제 각각은 트리코더마 레세이 Xyn3, 트리코더마 레세이 Xyn2, AfuXyn2, 또는 AfuXyn5 폴리펩티드이다. 특정 구현예에서, 하나 이상의 셀룰라아제 각각은 독립적으로 엔도글루카나아제, 예를 들어, 트리코더마 레세이 EG1 또는 EG2 폴리펩티드, 셀로비오히드롤라제, 예를 들어, 트리코더마 레세이 CBH1 또는 CBH2 폴리펩티드, 또는 β-글루코시다아제, 예를 들어, 트리코더마 레세이 Bgl1 폴리펩티드이다.
자일라나아제 : 자일라나아제(들) 적합하게는 본 개시의 효소 배합물/ 조성물에서 약 0.05 중량% 내지 약 75 중량%의 효소를 구성한다 (즉, % 자일라나아제(들) 은 조성물에서 모든 단백질의 중량에 대해 상대적인 중량%임) 또는 이는 상대적 중량 기초이다 (즉, 이때 % 자일라나아제(들)은 자일라나아제, β-자일로시다아제, 셀룰라아제, L-α-아라비노푸라노시다아제, 및 부속 단백질의 조합된 중량에 대해 상대적인 중량%임). 서로 상대적인 임의의 단백질 쌍의 비는 본 개시의 효소 배합물/조성물에서 용이하게 계산될 수 있다. 본원에 개시된 중량%로부터 유도할 수 있는 임의의 중량비로 효소를 포함하는 배합물/조성물이 고려된다. 자일라나아제 함량은 하한선이 배합물/조성물에서 효소의 총 중량의 0.05 중량%, 1 중량%, 2 중량%, 3 중량%, 4 중량%, 5 중량%, 6 중량%, 7 중량%, 8 중량%, 9 중량%, 10 중량%, 12 중량%, 15 중량%, 20 중량%, 25 중량%, 30 중량%, 40 중량%, 45 중량%, 또는 50 중량% 효소이고, 상한선이 배합물/조성물에서 효소의 총 중량의 10 중량%, 15 중량%, 20 중량%, 25 중량%, 30 중량%, 35 중량%, 40 중량%, 50 중량%, 55 중량%, 60 중량%, 65 중량%, 70 중량%, 또는 75 중량% 효소인 범위일 수 있다. 효소 배합물 또는 조성물에서 하나 이상의 자일라나아제는 효소 배합물/조성물에서 총 효소의 예를 들어, 5 중량% 내지 20 중량%, 10 중량% 내지 15 중량%, 또는 15 중량% 내지 25 중량%이다. 본 개시의 효소 배합물/조성물에 포함되는 예시적 적합한 자일라나아제는 하기 구획 6.3.6 에 기술된다.
L-α- 아라비노푸라노시다아제 : L-α-아라비노푸라노시다아제(들)은 적합하게는 주어진 효소 배합물/조성물에서 모든 효소의 총 중량의 약 0.05 중량% 내지 약 75 중량% 를 구성한다 (즉, 이때 % L-α-아라비노푸라노시다아제(들)은 배합물/조성물에서 모든 단백질의 중량에 대한 중량%임) 또는 상대적 중량 기초 (즉, 이때 % L-α-아라비노푸라노시다아제(들)은 자일라나아제, β-자일로시다아제, 셀룰라아제, L-α-아라비노푸라노시다아제, 및 부속 단백질의 조합된 중량에 대한 중량%임). 각각의 다른 것에 대해 상대적 단백질 쌍의 임의의 비는 본 개시를 기초로 하여 용이하게 계산될 수 있다. 본원에 개시된 중량% 로부터 유도할 수 있는 임의의 중량비에서 효소를 포함하는 배합물/조성물이 고려된다. L-α-아라비노푸라노시다아제 함량은, 하한선이 배합물/조성물에서 효소의 총 중량의 0.05 중량%, 1 중량%, 2 중량%, 3 중량%, 4 중량%, 5 중량%, 6 중량% 7 중량%, 8 중량%, 9 중량%, 10 중량%, 12 중량%, 15 중량%, 20 중량%, 25 중량%, 30 중량%, 40 중량%, 45 중량%, 또는 50 중량%이고, 상한선이 배합물/조성물에서 효소의 총 중량의 10 중량%, 15 중량%, 20 중량%, 25 중량%, 30 중량%, 35 중량%, 40 중량%, 50 중량%, 55 중량%, 60 중량%, 65 중량%, 70 중량% 또는 75 중량%인 범위일 수 있다. 예를 들어, 하나 이상의 L-α-아라비노푸라노시다아제(들)은 적합하게는 배합물/조성물에서 효소의 총 중량의 2 중량% 내지 25 중량%; 5 중량% 내지 20 중량%; 또는 5 중량% 내지 10 중량%를 나타낼 수 있다. 본 개시의 효소 배합물/조성물에 포함되기 위한 예시적 적합한 L-α-아라비노푸라노시다아제(들)은 하기 구획 6.3.8 에 기술되어 있다.
β- 자일로시다아제 : β-자일로시다아제(들)은 적합하게는 효소 배합물/조성물에서 효소의 총 중량의 약 0.05 중량% 내지 약 75 중량%를 구성한다. 서로 상대적인 임의의 단백질 쌍의 비는 본원에서 본 개시에 기초하여 용이하게 계산될 수 있다. 본원에 개시된 중량%로 유도할 수 있는 임의의 중량비로 효소를 포함하는 배합물/조성물이 고려된다. β-자일로시다아제 함량은 하한선이 배합물/조성물에서 효소의 총 중량의 약 0.05 중량%, 1 중량%, 2 중량%, 3 중량%, 4 중량%, 5 중량%, 6 중량% 7 중량%, 8 중량%, 9 중량%, 10 중량%, 12 중량%, 15 중량%, 20 중량%, 25 중량%, 30 중량%, 40 중량%, 45 중량%, 또는 50 중량%이고, 상한선이 배합물/조성물에서 효소의 총 중량의 약 10 중량%, 15 중량%, 20 중량%, 25 중량%, 30 중량%, 35 중량%, 40 중량%, 50 중량%, 55 중량%, 60 중량%, 65 중량%, 70 중량%, 또는 75 중량%인 범위일 수 있다. 예를 들어, β-자일로시다아제(들)은 배합물/조성물에서 효소의 총 중량의 약 0.05 중량% 내지 약 75 중량%를 나타낼 수 있다. 또한, β-자일로시다아제(들)은 배합물/조성물에서 효소의 총 중량의0.05 중량% 내지 약 70 중량%, 약 1 중량% 내지 약 65 중량%, 약 1 중량% 내지 약 60 중량%, 약 2 중량% 내지 약 55 중량%, 약 3 중량% 내지 약 50 중량%, 약 4 중량% 내지 약 45 중량%, 또는 약 5 중량% 내지 약 40 중량%를 나타낼 수 있다. 추가예에서, β-자일로시다아제(들) 적합하게는 배합물/조성물에서 효소의 총 중량의 2 중량% 내지 30 중량%; 10 중량% 내지 20 중량%; 또는 5 중량% 내지 10 중량%를 나타낸다. 예시적 적합한 β-자일로시다아제(들)은 하기 구획 6.3.7 에서 기술된다.
셀룰라아제: 셀룰라아제(들) 적합하게는 배합물/조성물에서 효소의 총 중량의 약 0.05 중량% 내지 약 90 중량% 효소를 구성한다. 서로 상대적인 임의의 단백질 쌍의 비는 본원의 본 개시에 기초하여 용이하게 계산될 수 있다. 본원에 개시된 중량%로부터 유도할 수 있는 임의의 중량비로 효소를 포함하는 배합물/조성물이 고려된다. 셀룰라아제 함량은, 하한선이 배합물/조성물에서 효소의 총 중량의 약 0.05 중량%, 5 중량%, 10 중량%, 20 중량%, 30 중량%, 40 중량%, 50 중량%, 60 중량%, 70 중량%이고, 상한선 배합물/조성물에서 효소의 총 중량의 약 20 중량%, 30 중량%, 40 중량%, 50 중량%, 60 중량%, 70 중량%, 80 중량%, 또는 90 중량% 범위일 수 있다. 예를 들어, 셀룰라아제(들) 적합하게는 배합물/조성물에서 효소의 총 중량의 30 중량% 내지 80 중량%, 50 중량% 내지 70 중량%, 또는 40 중량% 내지 60 중량%를 나타낸다. 예시적 적합한 셀룰라아제는 하기 구획 6.3.5 에서 기술된다. 본 개시의 효소 배합물/조성물에서 셀룰라아제 성분은 적합하게는 인산 팽창된 셀룰로오스 (PASC) 의 1 g 당 단백질 1 mg 당 적어도 약 0.005 분획 생성물을 달성할 수 있다 (칼코플루오르 검정에서 측정된 바와 같음). 본 개시의 배합물/조성물에서 예를 들어, 셀룰라아제 성분은 PASC 의 1 g 당 단백질 1 mg 당 분획 생성물의 범위를 달성할 수 있고, 이때 하한선 범위가 약 0.005, 0.01, 0.015, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.075, 또는 0.1 이고, 이때 상한선 범위가 0.03, 0.04, 0.05, 0.06, 0.075, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 또는 0.7 이다. 셀룰라아제 성분은 본 개시의 배합물/조성물에서 예를 들어, 0.00005-0.0001, 0.0005 -0.001, 0.001-0.005, 0.005-0.03, 0.01-0.06, 0.02-0.04, 0.01-0.03, 0.02-0.05, 0.02-0.04, 0.01-0.05, 0.015-0.035, 또는 0.015-0.075 생성물을 달성할 수 있다 (칼코플루오르 검정에서 측정된 바와 같이 PASC 1 g 당 단백질 1 mg 당 분획 생성물). 셀룰라아제는 예를 들어, 전체 셀룰라아제일 수 있다. 또한, 셀룰라아제는 예를 들어, 적합하게는 β-글루코시다아제가 풍부할 수 있다.
부속 단백질: 효소 배합물/조성물은 적합하게는 하나 이상의 부속 단백질을 추가로 포함할 수 있다. 효소 배합물/조성물의 부속 단백질 함량은 효소 배합물/조성물에서 단백질의 총 중량의 약 0 중량% 내지 약 60 중량% 범위일 수 있다. 서로 상대적인 임의의 단백질 쌍의 비는 본원에서 본 개시에 기초하여 용이하게 측정될 수 있다. 효소를 포함하는 배합물/조성물 본원에 개시된 중량%로부터 유도할 수 있는 임의의 중량비로 고려된다. 부속 단백질 함량은 하한선이 효소 배합물/조성물에서 단백질의 총 중량의 0 중량%, 1 중량%, 2 중량%, 3 중량%, 4 중량%, 5 중량%, 6 중량%, 7 중량%, 8 중량%, 10 중량%, 12 중량%, 15 중량%, 20 중량%, 25 중량%, 또는 35 중량%이고, 상한선이 효소 배합물/조성물에서 단백질의 총 중량의 2 중량%, 3 중량%, 4 중량%, 5 중량%, 6 중량%, 7 중량%, 8 중량%, 9 중량%, 10 중량%, 11 중량%, 12 중량%, 13 중량%, 14 중량% 15 중량%, 20 중량%, 30 중량%, 40 중량%, 50 중량%, 또는 60 중량%인 범위일 수 있다. 예를 들어, 부속 단백질(들)은 적합하게는 효소 배합물/조성물에서 0 중량% 내지 2 중량%, 5 중량% 내지 10 중량%, 20 중량% 내지 50 중량%, 또는 2 중량% 내지 5 중량%를 나타낼 수 있다. 본 개시의 효소 배합물/조성물에 포함되는 예시적 적합한 부속 단백질은 하기 구획 6.3.9 에서 기술된다.
본 개시는 하기를 포함하는 리그노셀룰로오스 당화를 위한 제 1 효소 배합물/조성물을 제공한다:
(1) 약 30 중량% 내지 약 80 중량% (예를 들어, 30 중량% 내지 80 중량%, 35 중량% 내지 75 중량%, 40 중량% 내지 70 중량%, 40 중량% 내지 60 중량%, 50 중량% 내지 70 중량%, 등) 의 셀룰라아제(들), 예를 들어, 전체 셀룰라아제 또는 β-글루코시다아제 풍부한 전체 셀룰라아제;
(2) 약 3 중량% 내지 약 50 중량% (예를 들어, 5 중량% 내지 40 중량%, 10 중량% 내지 30 중량%, 5 중량% 내지 20 중량%, 10 중량% 내지 15 중량%, 15 중량% 내지 25 중량%, 등)의 자일라나아제(들), 예를 들어, 트리코더마 레세이 Xyn2, 트리코더마 레세이 Xyn3, AfuXyn2, AfuXyn5, 또는 상기 효소의 둘 이상의 혼합물;
(3) 약 2 중량% 내지 약 40 중량% (예를 들어, 2 중량% 내지 35 중량%, 5 중량% 내지 30 중량%, 10 중량% 내지 25 중량%, 2 중량% 내지 30 중량%, 10 중량% 내지 20 중량%, 5 중량% 내지 10 중량%, 등) 의 β-자일로시다아제(들), 예를 들어, Fv3A, Pf43A, Fv43D, Fv39A, Fv43E, Fv43A, Fv43B, Pa51A, Fo43A, Gz43A, 트리코더마 레 세이 Bxl1, 또는 상기 효소의 둘 이상의 혼합물;
(4) 약 2 중량% 내지 약 40 중량% (예를 들어, 2 중량% 내지 35 중량%, 5 중량% 내지 30 중량%, 10 중량% 내지 25 중량%, 2 중량% 내지 25 중량%, 5 중량% 내지 20 중량%, 5 중량% 내지 10 중량%, 등) 의 L-α-아라비노푸라노시다아제(들), 예를 들어, Af43A, Fv43B, Pa51A, Pf51A, Fv51A, 또는 상기 효소의 둘 이상의 혼합물; 및
(5) 약 0 중량% 내지 약 50 중량% (2 중량% 내지 40 중량%, 5 중량% 내지 30 중량%, 10 중량% 내지 25 중량%, 0 중량% 내지 2 중량%, 5 중량% 내지 10 중량%, 20 중량% 내지 50 중량%, 2 중량% 내지 5 중량%, 등) 부속 단백질(들).
본 개시는 하기를 포함하는 리그노셀룰로오스 당화를 위한 제 2 효소 배합물/조성물을 제공한다:
(1) 약 30 중량% 내지 약 80 중량% (예를 들어, 30 중량% 내지 80 중량%, 35 중량% 내지 75 중량%, 40 중량% 내지 70 중량%, 40 중량% 내지 60 중량%, 50 중량% 내지 70 중량%, 등) 의 셀룰라아제(들), 예를 들어, 전체 셀룰라아제 또는 β-글루코시다아제 풍부한 전체 셀룰라아제, 또는 약 2 중량% 내지 약 10 중량% (예를 들어, 2 중량% 내지 8 중량%, 4 중량% 내지 6 중량%, 2 중량% 내지 4 중량%, 6 중량% 내지 8 중량%, 8 중량% 내지 10 중량%, 2 중량% 내지 10 중량%, 등) β-글루코시다아제(들), 예를 들어, 트리코더마 레세이 Bgl1;
(2) 약 3 중량% 내지 약 50 중량% (예를 들어, 5 중량% 내지 40 중량%, 10 중량% 내지 30 중량%, 5 중량% 내지 20 중량%, 10 중량% 내지 15 중량%, 15 중량% 내지 25 중량%, 등) 의 자일라나아제(들), 예를 들어, 트리코더마 레세이 Xyn2, 트리코더마 레세이 Xyn3, AfuXyn2, AfuXyn5, 또는 상기 효소의 둘 이상의 혼합물;
(3) 약 2 중량% 내지 약 40 중량% (예를 들어, 2 중량% 내지 35 중량%, 5 중량% 내지 30 중량%, 10 중량% 내지 25 중량%, 2 중량% 내지 30 중량%, 10 중량% 내지 20 중량%, 5 중량% 내지 10 중량%, 등) 의 둘 이상의2 개의 β-자일로시다아제(들), 이때 하나 이상의 β-자일로시다아제는 그룹 1 로부터 선택되고 하나 이상의 β-자일로시다아제는 그룹 2 로부터 선택됨;
이때:
그룹 1: Fv3A, Fv43A, 또는 이의 혼합물;
그룹 2: Fv43D, Pa51A, Gz43A, 트리코더마 레세이 Bxl1, Pf43A, Fv43E, Fv39A, Fo43A, Fv43B, 또는 상기 효소의 둘 이상의 혼합물;
(4) 약 2 중량% 내지 약 25 중량% (예를 들어, 2 중량% 내지 25 중량%, 5 중량% 내지 20 중량%, 5 중량% 내지 10 중량%, 등) 의 L-α-아라비노푸라노시다아제(들), 예를 들어, Af43A, Fv43B, Pa51A, Pf51A, Fv51A, 또는 상기 효소의 둘 이상의 혼합물; 및
(5) 약 0 중량% 내지 약 50 중량% (2 중량% 내지 40 중량%, 5 중량% 내지 30 중량%, 10 중량% 내지 25 중량%, 0 중량% 내지 2 중량%, 5 중량% 내지 10 중량%, 20 중량% 내지 50 중량%, 2 중량% 내지 5 중량%, 등) 의 부속 단백질(들).
본 개시는 하기를 포함하는 리그노셀룰로오스 당화를 위한 제 3 효소 배합물/조성물을 제공한다:
(1) 약 3 중량% 내지 약 50 중량% (예를 들어, 5 중량% 내지 40 중량%, 10 중량% 내지 30 중량%, 5 중량% 내지 20 중량%, 10 중량% 내지 15 중량%, 15 중량% 내지 25 중량%, 등) 의 자일라나아제(들), 예를 들어, 트리코더마 레세이 Xyn2, 트리코더마 레세이 Xyn3, AfuXyn2, AfuXyn5, 또는 상기 효소의 둘 이상의 혼합물; 및
(2) 약 2 중량% 내지 40 중량% (예를 들어, 2 중량% 내지 35 중량%, 5 중량% 내지 30 중량%, 10 중량% 내지 25 중량%, 2 중량% 내지 30 중량%, 10 중량% 내지 20 중량%, 5 중량% 내지 10 중량%, 등) 의 둘 이상의 β-자일로시다아제(들), 이때 하나 이상의 β-자일로시다아제 그룹 1 로부터 선택되고 하나 이상의 β-자일로시다아제 그룹 2로부터 선택되고;
이때:
그룹 1: Fv3A, Fv43A, 또는 이의 혼합물;
그룹 2: Fv43D, Pa51A, Gz43A, 트리코더마 레세이 Bxl1, Pf43A, Fv43E, Fv39A, Fo43A, Fv43B, 또는 상기 효소의 둘 이상의 혼합물.
본 개시는 하기를 포함하는 리그노셀룰로오스 당화를 위한 제 4 효소 배합물/조성물을 제공한다:
(1) 약 5 중량% 내지 약 25 중량% (예를 들어, 2 중량% 내지 25 중량%, 5 중량% 내지 20 중량%, 5 중량% 내지 10 중량%, 등) 의 자일라나아제(들), 예를 들어, 트리코더마 레세이 Xyn2, 트리코더마 레세이 Xyn3, AfuXyn2, AfuXyn5, 또는 상기 효소의 둘 이상의 혼합물;
(2) 약 2 중량% 내지 약 30 중량% (예를 들어, 2 중량% 내지 30 중량%, 10 중량% 내지 20 중량%, 5 중량% 내지 10 중량%, 등) 의 β-자일로시다아제(들), 예를 들어, Fv3A, Pf43A, Fv43D, Fv39A, Fv43E, Fv43A, Fv43B, Pa51A, Gz43A, Fo43A, 트리코더마 레세이 Bxl1, 또는 상기 효소의 둘 이상의 혼합물; 및
(3) 약 2 중량% 내지 약 50 중량% (예를 들어, 2 중량% 내지 5 중량%, 5 중량% 내지 45 중량%, 10 중량% 내지 40 중량%, 15 중량% 내지 30 중량%, 10 중량% 내지 25 중량%, 5 중량% 내지 20 중량%, 15 중량% 내지 40 중량%, 등) 의 β-글루코시다아제(들), 예를 들어, 트리코더마 레세이 Bgl1.
본 개시는 하기를 포함하는 리그노셀룰로오스 당화를 위한 제 5 효소 배합물/조성물을 제공한다:
(1) 약 5 중량% 내지 약 25 중량% (예를 들어, 2 중량% 내지 25 중량%, 5 중량% 내지 20 중량%, 5 중량% 내지 10 중량%, 등) 의 자일라나아제(들), 예를 들어, 트리코더마 레세이 Xyn2, 트리코더마 레세이 Xyn3, AfuXyn2, AfuXyn5, 또는 상기 효소의 둘 이상의 혼합물; 및
(2) 약 2 중량% 내지 약 30 중량% (예를 들어, 2 중량% 내지 30 중량%, 10 중량% 내지 20 중량%, 5 중량% 내지 10 중량%, 등) 의 β-자일로시다아제(들), 예를 들어, Fv3A, Pf43A, Fv43D, Fv39A, Fv43E, Fv43A, Fv43B, Pa51A, Gz43A, Fo43A, 트리코더마 레세이 Bxl1, 또는 상기 효소의 둘 이상의 혼합물.
본 개시는 하기를 포함하는 리그노셀룰로오스 당화를 위한 제 6 효소 배합물/조성물을 제공한다:
(1) 약 2 중량% 내지 약 50 중량% (예를 들어, 2 중량% 내지 5 중량%, 5 중량% 내지 45 중량%, 10 중량% 내지 40 중량%, 15 중량% 내지 30 중량%, 10 중량% 내지 25 중량%, 5 중량% 내지 20 중량%, 15 중량% 내지 40 중량%, 등) 의 β-글루코시다아제(들), 예를 들어, Bgl1;
(2) 약 3 중량% 내지 약 50 중량% (예를 들어, 5 중량% 내지 40 중량%, 10 중량% 내지 30 중량%, 5 중량% 내지 20 중량%, 10 중량% 내지 15 중량%, 15 중량% 내지 25 중량%, 등) 의 자일라나아제(들), 예를 들어, 트리코더마 레세이 Xyn2, 트리코더마 레세이 Xyn3, AfuXyn2, AfuXyn5, 또는 상기 효소의 둘 이상의 혼합물;
(3) 약 2 중량% 내지 40 중량% (예를 들어, 2 중량% 내지 35 중량%, 5 중량% 내지 30 중량%, 10 중량% 내지 25 중량%, 2 중량% 내지 30 중량%, 10 중량% 내지 20 중량%, 5 중량% 내지 10 중량%, 등) 의 β-자일로시다아제(들), 예를 들어, Fv3A, Pf43A, Fv43D, Fv39A, Fv43E, Fv43A, Fv43B, Pa51A, Gz43A, Fo43A, 트리코더마 레세이 Bxl1, 또는 상기 효소의 둘 이상의 혼합물; 및
(4) 약 2 중량% 내지 약 25 중량% (예를 들어, 2 중량% 내지 25 중량%, 5 중량% 내지 20 중량%, 5 중량% 내지 10 중량%, 등) 의 L-α-아라비노푸라노시다아제(들), 예를 들어, Af43A, Fv43B, Pa51A, Pf51A, Fv51A, 또는 상기 효소의 둘 이상의 혼합물.
상기 리그노셀룰로오스 당화를 위한 제 6 효소 배합물/조성물은, 예를 들어 약 2 중량% 내지 약 40 중량% 의 둘 이상의 β-자일로시다아제를 포함할 수 있고, 이때 하나 이상의 β-자일로시다아제 그룹 1 로부터 선택되고 하나 이상의 β-자일로시다아제 그룹 2로부터 선택되고; 이때:
그룹 1: Fv3A, Fv43A, 또는 이의 혼합물;
그룹 2: Fv43D, Pa51A, Gz43A, 트리코더마 레세이 Bxl1, Pf43A, Fv43E, Fv39A, Fo43A, Fv43B, 또는 상기 효소의 둘 이상의 혼합물.
본 개시의 효소 배합물/조성물은 둘 모두의 그룹 1 및 그룹 2 β-자일로시다아제를 함유하는 경우, 그룹 1 대 그룹 2 β-자일로시다아제의 비는 바람직하게는 1:10 내지 10:1 이다. 예를 들어, 상기 비는 적합하게는 1:2 내지 2:1, 2:5 내지 5:2, 3:8 내지 8:3, 1:4 내지 4:1, 1:5 내지 5:1, 1:7 내지 7:1, 또는 상기 양 종결점의 임의의 쌍의 임의의 범위 (예를 들어, 1:10 내지 2:1, 4:1 내지 2:5, 3:8 내지 5:1, 등) 이다. 적합한 비의 특정 예는 대략 1:1 이다.
본 개시의 효소 배합물/조성물이 β-자일로시다아제로서 Fv43A 을 함유하는 경우, 배합물/조성물 L-α-아라비노푸라노시다아제로서 Fv43B 를 추가로 함유할 수 있다.
본 개시의 효소 배합물/조성물은 예를 들어, 적합하게는 효소 배합물/조성물의 성분 외에도 바이오매스를 함유하는 당화 반응 혼합물의 일부이다. 예를 들어, 당화 반응 혼합물은 하기 특성 중 1, 2, 3 또는 모든 4 개를 특징으로 할 수 있다:
(1) 상기 당화 반응 혼합물에서 헤미셀룰라아제 1 kg 당 자일라나아제(들)의 총 중량은 하한선이 약 0.5 g, 1 g, 2 g, 3 g, 4 g, 5 g, 7 g, 또는 10 g 이고, 상한선이 독립적으로 약 5 g, 7 g, 10 g, 15 g, 20 g, 30 g, 또는 40 g 인 범위이고; 예를 들어, 반응 혼합물에서 헤미셀룰라아제 1 kg 당 자일라나아제(들)의 총 중량은 0.5 g 내지 40 g, 0.5g 내지 30 g, 0.5 g 내지 20 g, 0.5 내지 10 g, 0.5 내지 5 g, 1 g 내지 40 g, 2 g 내지 40 g, 3 g 내지 40 g, 5 g 내지 40 g, 7 g 내지 30 g, 10 g 내지 30 g, 5 g 내지 20 g, 또는 5 g 내지 30 g 일 수 있다.
(ii) 상기 당화 반응 혼합물에서 헤미셀룰라아제 1 kg 당 β-자일로시다아제(들)의 총 중량은 하한선이 약 0.5 g, 1 g, 2 g, 3 g, 4 g, 5 g, 7 g, 또는 10 g 이고 상한선이 독립적으로 약 5 g, 7 g, 10 g, 15 g, 20 g, 30 g, 40 g, 또는 50 g 인 범위이고; 예를 들어, 반응 혼합물에서 헤미셀룰라아제의 1 kg 당 β-자일로시다아제(들)의 총 중량은 0.5 g 내지 40 g, 0.5 내지 50 g, 0.5 g 내지 30 g, 0.5 g 내지 20 g, 0.5 g 내지 10 g, 0.5 g 내지 5g, 1 g 내지 40 g, 2 g 내지 40 g, 3 g 내지 40 g, 5 g 내지 40 g, 7 g 내지 30 g, 10 g, 내지 30 g, 5 g 내지 30 g, 5 g 내지 20 g 일 수 있다.
(iii) 상기 당화 반응 혼합물에서 헤미셀룰라아제 1 kg 당 L-α-아라비노푸라노시다아제(들)의 총 중량은 하한선이 약 0.2 g, 0.5 g, 1 g, 1.5 g, 2 g, 2.5 g, 3 g, 4 g, 또는 5 g 이고 상한선이 독립적으로 약 2 g, 3 g, 4 g, 5 g, 7 g, 10 g, 15 g, 또는 20 g 인 범위이고; 예를 들어, 반응 혼합물에서 헤미셀룰라아제의 1 kg 당 L-α-아라비노푸라노시다아제(들)의 총 중량은 0.2 g 내지 20 g, 0.5 g 내지 20 g, 1 g 내지 20 g, 2 g 내지 20 g, 2.5 g 내지 20 g, 3 g 내지 15 g, 4 g 내지 20 g, 5 g 내지 15 g, 5 g 내지 10 g, 5 g 내지 20 g, 또는 2.5 g 내지 15 g 일 수 있다.
(iv) 상기 당화 반응 혼합물에서 셀룰라아제의 1 kg 당 셀룰라아제(들)의 총 중량은 하한선이 약 1 g, 3 g, 5 g, 7 g, 10 g, 12 g, 15 g, 18 g, 또는 20g 이고, 상한선이 독립적으로 약 10 g, 15 g, 18 g, 20 g, 25 g, 30g, 50 g, 75 g, 또는 100g 인 범위이고; 예를 들어, 상기 반응 혼합물에서 셀룰라아제의 1 kg 당 셀룰라아제(들)의 총 중량은 1 g 내지 100 g, 3 g 내지 100 g, 5 g 내지 100 g, 7 g 내지 100 g, 12 g 내지 100 g, 15 g 내지 100 g, 18 g 내지 100 g, 3 g 내지 75 g, 5 g 내지 50 g, 7 g 내지 75 g, 10 g 내지 75 g, 10 g 내지 50 g, 12 g 내지 75 g, 12 g 내지 50 g, 15 g 내지 75 g, 15 g 내지 50 g, 18 g 내지 30 g, 18 g 내지 75 g 일 수 있다.
6.3.5. 셀룰라아제
본 개시의 효소 배합물/조성물은 하나 이상의 셀룰라아제를 포함할 수 있다. 셀룰라아제는 셀룰로오스 (β-1,4-글루칸 또는 β D-글루코시드 연결) 를 가수분해하여 글루코오스, 셀로비오스, 셀로올리고당, 등을 형성하는 효소이다. 셀룰라아제는 하기의 주요 3 개의 부류로 통상적으로 나뉜다: 엔도글루카나아제 (EC 3.2.1.4) ("EG"), 엑소글루카나아제 또는 셀로비오히드롤라제 (EC 3.2.1.91) ("CBH") 및 β-글루코시다아제 (β-D-글루코시드 글루코히드롤라제; EC 3.2.1.21) ("BG") (Knowles et al ., 1987, Trends in Biotechnology 5(9):255-261; Shulein, 1988, Methods in Enzymology, 160:234-242). 엔도글루카나아제는 셀룰로오스 섬유의 무정형 부분에 주로 작용하는 반면, 셀로비오히드롤라제는 결정형 셀룰로오스를 분해할 수 있다.
본 개시의 조성물 및 방법에 따라 사용되기 위한 셀룰라아제는 하기로부터 수득될 수 있거나 그중에서도 하나 이상의 하기 유기체에 의해 생산될 수 있다: 크리니펠리스 스카펠라 , 마크로포미나 파세올리나 , 마이셀리오프토라 써모필라 , 소르다리아 피미콜라 , 볼루텔라 콜레토트리초이드 , 티엘라비아 테레스트리스 , 아크레모니움 종, 엑 시디아 글란둘로사 , 포메스 포멘타리우스 , 스포기펠리스 종, 리조플릭티스 로세아 , 리조무코르 푸실러스 , 파이코마이세스 니테우스 , 카에토스틸룸 프레세니 , 디플로디아 고시피나 , 울로스포라 빌그라미 , 사코볼루스 딜루텔루스 , 페니실리움 베루쿨로숨 , 페니실리움 크리소게눔 , 써모마이세스 베루코수스 , 디아포르테 신게네시아 , 콜레토트리춤 라게나리움 , 니그로스포라 종, 자일라리아 히포자일론 , 넥트리아 피네아 , 소르다리아 마크로스포라 , 티엘라비아 써 모 필라, 캐토미움 모로룸 , 캐토미움 비르센스 , 캐토미움 브라실리엔시스 , 캐토미움 쿠니콜로룸 , 시스파스토스포라 보니넨시스 , 클라도리눔 포에쿤디시뭄 , 사이탈리디움 써모필라 , 글리오클라디움 카테눌라툼 , 후사리움 옥시스포룸 ssp . 라이코페르시시 , 후사리움 옥시스포룸 ssp . 파시플로라 , 후사리움 솔라니 , 후사리움 안구이오이드 , 후사리움 포애 , 휴 미콜라 니그레센스 , 휴미콜라 그리세아 , 파나에올루스 레티루기스 , 트라메테스 산구이네아 , 스키조필룸 코뮤네 , 트리초테시움 로세움 , 미크로스파에롭시스 종, 악소볼루스 스틱토이데우스 spej ., 포로니아 펀타타 , 노둘리스포룸 종, 트리코더마 종 (예를 들어, 트리코더마 레세이) 및 실린드로카르폰 종.
예를 들어, 본 개시의 방법 및/또는 조성물에 사용하기 위한 셀룰라아제는 전체 셀룰라아제이고/이거나 적어도 0.1 (예 0.1 내지 0.4) 분획 생성물을 달성할 수 있다 (칼코플루오르 검정에서 측정된 바와 같음) (하기 구획 7.1.10 에서 기술됨).
6.3.5.1 β- 글루코시다아제
본 개시의 효소 배합물/조성물은 임의로는 하나 이상의 β-글루코시다아제를 포함할 수 있다. 본원에 사용되는 바와 같은 용어 "β-글루코시다아제"는 EC 3.2.1.21, 및/또는 특정 GH 패밀리의 구성원으로서 분류되는 β-D-글루코시드 글루코히드롤라제를 지칭하며 (GH 패밀리 1, 3, 9 또는 48 의 구성원을 포함하나, 이에 제한되지 않음), 이는 셀로비오스의 가수분해를 촉매작용하여 β-D-글루코오스를 방출한다.
적합한 β-글루코시다아제는 재조합 수단에 의해 미생물 구성원으로부터 수득될 수 있거나, 시판되는 구입원으로부터 구입할 수 있다. 미생물로부터의 β-글루코시다아제의 예에는 박테리아 및 균류로부터의 것이 포함되나 이로써 제한되지 않는다. 예를 들어, 본 개시의 β-글루코시다아제는 적합하게는 사상균으로부터 수득된다.
β-글루코시다아제는 그 중에서도 하기로부터 수득되거나 재조합적으로 생산될 수 있다: 아스퍼길러스 아쿠레아투스 (Kawaguchi et al. Genes 1996, 173: 287-288), 아스퍼길러스 가와치 (Iwashita et al. Appl. Environ. Microbiol. 1999, 65: 5546-5553), 아스퍼길러스 오리재 (WO 2002/095014), 셀룰로모나스 비아조테아 (Wong et al. Gene, 1998, 207:79-86), 페니실리움 푸니쿨로숨 (WO 2004/078919), Saccharomycopsis fibuligera (Machida et al. Appl. Environ. Microbiol. 1988, 54: 3147-3155), 스키조사카로마이세스 폼베 (Wood et al. Nature 2002, 415: 871-880), 또는 트리코더마 레세이 (예를 들어, β-글루코시다아제 1 (미국 특허 번호 제 6,022,725 호), β-글루코시다아제 3 (미국 특허 제 6,982,159 호), β-글루코시다아제 4 (미국 특허 번호 제 7,045,332 호), β-글루코시다아제 5 (미국 특허 번호 제 7,005,289 호), β-글루코시다아제 6 (미국 공보 번호 제 20060258554 호), β-글루코시다아제 7 (미국 공보 번호 제 20060258554 호)).
β-글루코시다아제는 β-글루코시다아제를 인코딩하는 내인성 또는 외인성 유전자를 발현함으로써 생산될 수 있다. 예를 들어, β-글루코시다아제는 예를 들어, 그람-양성 유기체 (예를 들어, 바실러스 또는 악티노마이세테스), 또는 진핵 숙주 (예를 들어, 트리코더마, 아스퍼길러스, 사카로마이세스, 또는 피키아) 에 의해 세포외 공간으로 분비될 수 있다. 몇몇 환경에서, β-글루코시다아제는 과다발현되거나 억제발현될 수 있다.
β-글루코시다아제는 시판되는 구입원으로부터 수득할 수 있다. 본 개시에서 사용하는데 적합한 시판되는 β-글루코시다아제 제제의 예에는 하기가 포함된다: 예를 들어, 엑셀러라아제® BG 에서 트리코더마 레세이 β-글루코시다아제 (Danisco US Inc., Genencor); NOVOZYM® 188 (아스퍼길러스 니거로부터의 β-글루코시다아제); Megazyme 으로부터의 아그로박테리움 종. β-글루코시다아제, 및 써마토가 마리티마 β-글루코시다아제 (Megazyme International Ireland Ltd., Ireland.).
더욱이, β-글루코시다아제는 하기 구획 6.3.5.4 에서 기술되는 바와 같이, 전체 셀룰라아제의 성분일 수 있다.
β-글루코시다아제 활성은 당업계에 공지된 많은 적합한 수단에 의해 측정될 수 있으며, 예컨대 문헌 [Biochimica et Biophysica Acta 1992, 121:54-60] 에서 기술되며, 이때 1 pNPG 은 50℃ (122℃) 및 pH 4.8 에서 10 분 후 4-니트로페닐-b-D-글루코피라노시드로부터 유리된 니트로페놀의 1 μmoL 을 나타낸다.
6.3.5.2 엔도글루카나아제
본 개시의 효소 배합물/조성물은 임의로는 하나 이상의 엔도글루카나아제를 포함한다. 임의의 엔도글루카나아제 (EC 3.2.1.4) 는 본 개시의 조성물 및 방법에서 사용될 수 있다. 엔도글루카나아제는 내인성 또는 외인성 엔도글루카나아제 유전자를 발현함으로써 생산될 수 있다. 몇몇 환경에서, 엔도글루카나아제는 과다발현되거나 억제발현될 수 있다.
예를 들어, 트리코더마 레세이 EG1 (Penttila et al., Gene 1986, 63:103-112) 및/또는 EG2 (Saloheimo et al., Gene 1988, 63:11-21) 는 적합하게는 본 개시의 조성물 및 방법에서 사용된다.
열안정적 티엘라비아 테레스트리스 엔도글루카나아제 (Kvesitadaze et al., Applied Biochem. Biotech. 1995, 50:137-143) 는 또다른 예에서, 본 개시의 조성물 및 방법에서 사용된다. 더욱이, 트리코더마 레세이 EG3 (Okada et al. Appl. Environ. Microbiol. 1988, 64:555-563), EG4 (Saloheimo et al. Eur. J. Biochem. 1997, 249:584-591), EG5 (Saloheimo et al. Molecular Microbiology 1994, 13:219-228), EG6 (미국 특허 공보 번호 제 20070213249), 또는 EG7 (미국 특허 공보 번호 제 20090170181), 아시도써무스 (Acidothermus) 셀룰로오스분해성 EI 엔도글루카나아제 (미국 특허 번호 제 5,536,655 호), 휴미콜라 이노솔렌스 엔도글루카나아제 V (EGV) (Protein Data Bank entry 4ENG), 스태필로트리쿰 코코스포룸 엔도글루카나아제 (미국 특허 공보 번호 제 20070111278), 아스퍼길러스 아쿠레아투스 엔도글루카나아제 F1-CMC (Ooi et al. 핵산 Res. 1990, 18:5884), 아스퍼길러스 가와치 IFO 4308 엔도글루카나아제 CMCase-1 (Sakamoto et al. Curr. Genet. 1995, 27:435-439), 에르위니아 카로토바라 (Erwinia carotovara) (Saarilahti et al. Gene 1990, 90:9-14); 또는 아크레모니움 써모필룸 (아크레모니움 써모필룸) ALKO4245 엔도글루카나아제 (미국 특허 공보 번호 제 20070148732) 가 사용될 수 있다. 추가의 적합한 엔도글루카나아제는 예를 들어, WO 91/17243, WO 91/17244, WO 91/10732, 미국 특허 번호 제 6,001,639 호에 기술되어 있다.
6.3.5.3 셀로비오 히드롤라제
임의의 셀로비오히드롤라제 (EC 3.2.1.91) ("CBH") 는 임의로는 본 개시의 배합물/조성물 및 방법에서 사용될 수 있다. 셀로비오히드롤라제는 내인성 또는 외인성 셀로비오히드롤라제 유전자를 발현함으로써 생산될 수 있다. 몇몇 환경에서, 셀로비오히드롤라제는 과다발현되거나 억제발현될 수 있다.
예를 들어, 트리코더마 레세이 CBHI (Shoemaker et al. Bio/Technology 1983, 1:691-696) 및/또는 CBHII (Teeri et al. Bio/Technology 1983, 1:696-699) 는 본 개시의 배합물/조성물 및 방법에서 사용될 수 있다.
적합한 CBH 는 하기로부터 선택될 수 있다: 아가리쿠스 비스포루스 CBH1 (Swiss Prot 수납 번호 Q92400), 아스퍼길러스 아쿨레아투스 CBH1 (Swiss Prot 수납 번호 O59843), 아스퍼길러스 니둘란스 CBH (GenBank 수납 번호 AF420019) 또는 CBHB (GenBank 수납 번호 AF420020), 아스퍼길러스 니거 CBH (GenBank 수납 번호 AF156268) 또는 CBHB (GenBank 수납 번호 AF156269), 클라비셉스 푸르푸레아 CBH1 (Swiss Prot 수납 번호 O00082), 코클리오볼러스 카보나룸 CBH1 (Swiss Prot 수납 번호 Q00328), 크리포넥트리아 파라시티카 CBH1 (Swiss Prot 수납 번호 Q00548), 후사리움 옥시스포룸 CBH1 (Cel7A) (Swiss Prot 수납 번호 P46238), 휴미콜라 그리세아 CBH1.2 (GenBank 수납 번호 U50594), 휴미콜라 그리세아 var. 써모이데아 CBH1 (GenBank 수납 번호 D63515) CBHI.2 (GenBank 수납 번호 AF123441), 또는 exo1 (GenBank 수납 번호 AB003105), 멜라노카르푸스 알보마이세스 Cel7B (GenBank 수납 번호 AJ515705), 뉴로스포라 크라사 CBHI (GenBank 수납 번호 X77778), 페니실리움 푸니쿨로숨 CBHI (Cel7A) (미국 특허 공보 번호 제 20070148730), 페니실리움 잔티넬룸 CBHI (GenBank 수납 번호 S56178), 파네로카에트 크리소스포리움 CBH (GenBank 수납 번호 M22220), 또는 CBHI-2 (Cel7D) (GenBank 수납 번호 L22656), 탈라로마이세스 에머소니 CBH1 (GenBank 수납 번호 AF439935), 트리코더마 비리드 CBH1 (GenBank 수납 번호 X53931), 또는 볼바리엘라 볼바세아 V14 CBH1 (GenBank 수납 번호 AF156693).
6.3.5.4 전체 셀룰라아제
본 개시의 효소 배합물/조성물은 추가로 전체 셀룰라아제를 포함할 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "전체 셀룰라아제" 는 하기의 3 이상의 상이한 효소 유형을 포함하는 자연 발생 또는 비-자연 발생 셀룰라아제-함유 조성물을 지칭한다: (1) 엔도글루카나아제, (2) 셀로비오히드롤라제, 및 (3) β-글루코시다아제, 또는 하기의 3 이상의 상이한 효소적 활성을 포함한다: (1) 엔도글루카나아제 활성 (이는 내부의 β-1,4 연결의 쪼개짐을 촉매작용하여, 보다 짧은 글루코올리고당을 생성함) , (2) 셀로비오히드롤라제 활성 (이는 셀로비오스 단위 (β-1,4 글루코오스-글루코오스 디사카라이드) 의 "엑소"-유형 방출을 촉매작용함), 및 (3) β-글루코시다아제 활성 (이는 보다 짧은 셀로올리고당 (예를 들어, 셀로비오스) 로부터의 글루코오스 단량체의 방출을 촉매작용함).
"자연 발생 셀룰라아제-함유" 조성물은 자연 발생 원천에 의해 생산되는 것이며, 이는 하나 이상의 셀로비오히드롤라제-유형, 하나 이상의 엔도글루카나아제-유형, 및 하나 이상의 β-글루코시다아제-유형 성분 또는 활성을 포함하며, 이때 각각의 이들 성분 또는 활성은 인간에 의해 영향받지 않은 자연에서 생산되는 수준 및 비로 발견된다. 따라서, 자연 발생 셀룰라아제-함유 조성물은 예를 들어, 성분 효소의 비 또는 수준이 자연에서 자연 유기체에 의해 생산되는 것으로부터 변경되지 않도록 셀룰로오스분해 효소에 대해 변형되지 않은 유기체 의해 생산된 것이다. "비-자연 발생 셀룰라아제-함유 조성물" 은 하기에 의해 생산되는 조성물을 지칭한다: (1) 자연 발생 비 또는 비-자연 발생, 즉, 변경된 비 중 하나로 성분 셀룰로오스분해 효소를 조합하는 것; 또는 (2) 하나 이상의 셀룰로오스분해 효소를 과다발현하거나 억제발현하기 위해 유기체를 변형하는 것; 또는 (3) 하나 이상의 셀룰로오스분해 효소가 결실되도록 유기체를 변형하는 것. "비-자연발생 셀룰라아제 함유" 조성물이란, 효소의 변경된 수준 또는 비를 제조하기 위해, 자연-발생 유기체가 비-자연 조건 하에서 자라도록, 자연 발생 유기체를 위한 배양 조건을 조정함으로써 생성되는 조성물을 지칭할 수 있다. 따라서, 몇몇 구현예에서, 본 개시의 전체 셀룰라아제 제제는 결실된 및/또는 과다발현되는 하나 이상의 EG 및/또는 CBH 및/또는 β-글루코시다아제를 가질 수 있다.
본 개시에서, 전체 셀룰라아제 제제는 셀룰로오스 물질을 가수분해할 수 있는 임의의 미생물로부터일 수 있다. 몇몇 구현예에서, 전체 셀룰라아제 제제는 사상균 전체 셀룰라아제이다. 예를 들어, 전체 셀룰라아제 제제는 하기로부터일 수 있다: 아크레모니움 , 아스퍼길러스 , 에머리셀라 , 후사리움 , 휴미콜라 , 무코르, 미셀리오프토라 , 뉴로스포라 , 페니실리움 , 사이탈리디움 , 티엘라비아 , 톨리 포클라디움 또는 트리코더마 종. 전체 셀룰라아제 제제는 예를 들어 하기이다: 아스퍼길러스 아쿨레아투스, 아스퍼길러스 아와모리, 아스퍼길러스 포에티두스, 아스퍼길러스 자포니쿠스 , 아스퍼길러스 니둘란스 , 아스퍼길러스 니거 , 또는 아스퍼길러스 오리재 전체 셀룰라아제. 더욱이, 전체 셀룰라아제 제제는 하기일 수 있다: 후사리움 박트리디오이드 , 후사리움 세레알리스 , 후사리움 크룩웰렌스, 후사리움 쿨모룸 , 후사리움 그라미네아룸 , 후사리움 그라미눔 , 후사리움 헤테로스포룸 , 후 사리움 네군디, 후사리움 옥시스포룸, 후사리움 레티쿨라툼, 후사리움 로세움 , 후사리움 삼부시눔, 후사리움 사르코크로움, 후사리움 스포로트리치오이드, 후사리움 술푸레움, 후사리움 토룰로숨, 후사리움 트리코테시오이드, 또는 후 사리움 베네나툼 전체 셀룰라아제 제제. 전체 셀룰라아제 제제는 하기일 수 있다: 휴미콜라 인솔렌스 , 휴미콜라 라누기노사 , 무코르 미에헤이 , 마이셀리오프토라 써모필라, 뉴로스포라 크라사 , 페니실리움 푸르푸로게눔 , 페니실리움 푸니쿨로숨 , 사이탈리디움 써모필룸 , 또는 티엘라비아 테레스트리스 전체 셀룰라아제 제제. 더욱이, 전체 셀룰라아제 제제는 하기일 수 있다: 트리코더마 하르지아늄 , 트리코 더마 코닌기 , 트리코더마 롱기브라키아툼 , 트리코더마 레세이 (예를 들어, RL-P37 (Sheir-Neiss G et al. Appl. Microbiol. Biotechnology, 1984, 20, pp.46-53), QM9414 (ATCC 번호 제 26921), NRRL 15709, ATCC 13631, 56764, 56466, 56767), 또는 트리코더마 비리드 (예를 들어, ATCC 32098 및 32086) 전체 셀룰라아제 제제.
특히, 전체 셀룰라아제 제제는 적합하게는 트리코더마 레세이 RutC30 전체 셀룰라아제 제제일 수 있고, 이는 American Type Culture Collection 로부터 트리코더마 레세이 ATCC 56765 로서 이용가능하다. 예를 들어, 전체 셀룰라아제 제제는 페니실리움 푸니쿨로숨의 전체 셀룰라아제일 수 있고, 이는 American Type Culture Collection 로부터 페니실리움 푸니쿨로숨 ATCC Number: 10446 로서 이용가능하다.
또한, 전체 셀룰라아제 제제는 시판되는 원천으로부터 수득될 수 있다. 본 개시의 방법 및 조성물에 사용되는데 적합한 시판되는 셀룰라아제 제제의 예에는 예를 들어 하기가 포함된다: 예를 들어, CELLUCLASTTM 및 CellicTM (Novozymes A/S) 및 LAMINEXTM BG, IndiAgeTM 44L, PrimafastTM 100, PrimafastTM 200, SpezymeTM CP, Accelerase® 1000 및 Accelerase® 1500 (Danisco US. Inc., Genencor).
적합한 전체 셀룰라아제 제제는 셀룰로오스 물질을 가수분해할 수 있는 효소의 발현을 생성하는, 특히 발효에서 당업계에 공지된 임의의 미생물 배양 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, "발효" 는 관심 효소 및/또는 셀룰라아제가 발현되고/되거나 단리되게 하는 조건 하에서 적합한 배지 중에서 수행되는 산업적 발효 또는 실험실에서의 소- 또는 대-규모 발효, 예컨대 연속식, 배치식, 페드-배치식 (fed-batch), 또는 고체 상태 발효, 플라스크 배양을 진탕하는 것을 지칭한다.
일반적으로, 미생물은 셀룰로오스 물질을 가수분해할 수 있는 효소 생성에 적합한 세포 배양 배지에서 배양된다. 배양은 당업계에 공지된 절차 및 변형을 사용하여, 타소원 및 질소원 및 무기 염을 포함하는 적합한 영양 배지에서 발생한다. 적합한 배양 배지, 온도 범위 및 성장을 위한 다른 조건 및 셀룰라아제 생성은 당업계에 공지되어 있다. 비-제한적인 예로서, 트리코더마 레세이에 의한 셀룰라아제의 생성을 위한 전형적인 온도 범위는 24℃ 내지 28℃ 이다.
전체 셀룰라아제 제제는 최소 회수 및/또는 정제 또는 이들이 없는, 발효에 의해 생산되는 그 자체로서 사용될 수 있다. 예를 들어, 일단 셀룰라아제가 세포 배양 배지로 분비되면, 셀룰라아제를 함유하는 세포 배양 배지는 직접 사용될 수 있다. 전체 셀룰라아제 제제는 발효 물질의 분획화되지 않은 함량을 포함할 수 있고, 이는 소비된 세포 배양 배지, 세포외 효소 및 세포를 포함한다. 다른 한편으로는, 전체 셀룰라아제 제제는 또한 일상적 단계, 예를 들어 침전, 원심분리, 친화성 크로마토그래피, 여과 등의 다수의 추가 가공으로 처리될 수 있다. 예를 들어, 전체 셀룰라아제 제제는 농축될 수 있고, 이후 추가의 정제 없이 사용될 수 있다. 전체 셀룰라아제 제제는 예를 들어 발효 후 세포 생존 또는 세포 사멸을 감소시키는 특정 화학적 작용제를 포함하기 위해 발효될 수 있다. 세포는 예를 들어 당업계에 공지된 방법을 사용하여 용균되거나 투과될 수 있다.
전체 셀룰라아제 제제의 엔도글루카나아제 활성은 카르복시메틸 셀룰로오스 (CMC) (기질로서) 를 사용하여 측정될 수 있다. 적합한 검정은 CMC 상에 작용하는 효소 혼합물에 의해 창출되는 환원 말단의 생성을 측정하는 것이고, 이때 1 단위는 1 μmoL 의 생성물/분을 유리시키는 효소의 양이다 (Ghose, T. K., Pure & Appl. Chem. 1987, 59, pp. 257-268).
전체 셀룰라아제는 β-글루코시다아제-풍부한 셀룰라아제일 수 있다. β-글루코시다아제-풍부한 전체 셀룰라아제는 일반적으로 β-글루코시다아제 및 전체 셀룰라아제 제제를 포함한다. β-글루코시다아제-풍부한 전체 셀룰라아제 조성물은 재조합 수단에 의해 생산될 수 있다. 예를 들어, 그러한 전체 셀룰라아제 제제는 전체 셀룰라아제를 생산할 수 있는 미생물에서 β-글루코시다아제를 발현함으로써 달성될 수 있다. 또한, β-글루코시다아제-풍부한 전체 셀룰라아제 조성물은 예를 들어, 전체 셀룰라아제 제제 및 β-글루코시다아제를 포함할 수 있다. 예를 들어, β-글루코시다아제-풍부한 전체 셀룰라아제 조성물은 적합하게는 배합물/조성물에서 단백질의 총 중량에 기초하여 적어도 5 중량%, 7 중량%, 10 중량%, 15 중량% 또는 20 중량%, 및 up 내지 25 중량%, 30 중량%, 35 중량%, 40 중량%, 또는 50 중량% β-글루코시다아제를 포함할 수 있다.
6.3.6 자일라나아제
본 개시의 효소 배합물/조성물은, 예를 들어, 하나 이상의 그룹 자일라나아제를 포함할 수 있고, 이는 트리코더마 레세이 Xyn2, 트리코더마 레세이 Xyn3, AfuXyn2, 또는 AfuXyn5 일 수 있다. 적합한 트리코더마 레세이 Xyn2, 트리코더마 레세이 Xyn3, AfuXyn2, 또는 AfuXyn5 폴리펩티드는 상기 구획 6.1 에 기술되어 있다.
본 개시의 효소 배합물/조성물은 임의로는 하나 이상의 그룹 자일라나아제 대신에 또는 이것 외에 하나 이상의 자일라나아제를 포함한다. 임의의 자일라나아제 (EC 3.2.1.8) 는 추가 하나 이상의 자일라나아제로서 사용될 수 있다. 적합한 자일라나아제는 예를 들어 하기를 포함한다: 칼도셀룸 사카로라이티쿰 자일라나아제 (Luthi et al. 1990, Appl. Environ. Microbiol. 56(9):2677-2683), 써마토가 마리티마 자일라나아제 (Winterhalter & Liebel, 1995, Appl. Environ. Microbiol. 61(5):1810-815), 써마토가 종 균주 FJSS-B.1 자일라나아제 (Simpson et al. 1991, Biochem. J. 277, 413-417), 바실러스 시르쿨란스 자일라나아제 (BcX) (미국 특허 번호 제 5,405,769), 아스퍼길러스 니거 자일라나아제 (Kinoshita et al. 1995, Journal of Fermentation and Bioengineering 79(5):422-428), 스트렙토마이세스 리비단스 자일라나아제 (Shareck et al. 1991, 유전자 107:75-82; Morosoli et al. 1986 Biochem. J. 239:587-592; Kluepfel et al. 1990, Biochem. J. 287:45-50), 바실러스 서브틸리스 자일라나아제 (Bernier et al. 1983, 유전자 26(1):59-5), 셀룰로모나스 피미 자일라나아제 (Clarke et al., 1996, FEMS Microbiology Letters 139:27-35), 슈도모나스 플루오레센스 자일라나아제 (Gilbert et al. 1988, Journal of General Microbiology 134:3239-3247), 클로스트리디움 써모셀룸 자일라나아제 (Dominguez et al., 1995, Nature Structural Biology 2:569-576), 바실러스 푸밀루스 자일라나아제 (Nuyens et al. Applied Microbiology 및 Biotechnology 2001, 56:431-434; Yang et al. 1998, Nucleic Acid Res. 16(14B):7187), 클로스트리디움 아세토부틸리쿰 P262 자일라나아제 (Zappe et al. 1990, 핵산 Res. 18(8):2179), 또는 트리코더마 하르지아늄 자일라나아제 (Rose et al. 1987, J. Mol. Biol.194(4):755-756).
자일라나아제는 자일라나아제를 인코딩하는 내인성 또는 외인성 유전자를 발현함으로써 생산될 수 있다. 자일라나아제는 몇몇 환경에서, 과다발현되거나 억제발현될 수 있다.
6.3.7 β- 자일로시다아제
본 개시의 효소 배합물/조성물은, 예를 들어, 적합하게는 하나 이상의 β-자일로시다아제를 포함할 수 있다. 예를 들어, β-자일로시다아제는 그룹 1 β-자일로시다아제 효소 (예를 들어, Fv3A 또는 Fv43A) 또는 그룹 2 β-자일로시다아제 효소 (예를 들어, Pf43A, Fv43D, Fv39A, Fv43E, Fo43A, Fv43B, Pa51A, Gz43A, 또는 트리코더마 레세이 Bxl1) 일 수 있다. 이들 폴리펩티드는 상기 구획 O 에서 기술되어 있다. 예를 들어, 본 개시의 효소 배합물/조성물은 적합하게는 하나 이상의 그룹 1 β-자일로시다아제 및 하나 이상의 그룹 2 β-자일로시다아제를 포함할 수 있다.
본 개시의 효소 배합물/조성물은 임의로는 하나 이상의 β-자일로시다아제, 상기 그룹 1 및/또는 그룹 2 β-자일로시다아제 외에도, 하나 이상의 β-자일로시다아제를 포함할 수 있다. 임의의 β-자일로시다아제 (EC 3.2.1.37) 는 추가 β-자일로시다아제로서 사용될 수 있다. 적합한 β-자일로시다아제는 예를 들어 하기를 포함한다: 탈라로마이세스 에머소니 Bxl1 (Reen et al. 2003, Biochem Biophys Res Commun. 305(3):579-85), 지오바실러스 스테아로써모필루스 β-자일로시다아제 (Shallom et al. 2005, Biochemistry 44:387-397), 사이탈리디움 써모필룸 β-자일로시다아제 (Zanoelo et al. 2004, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 31:170-176), 트리코더마 리그노룸 β-자일로시다아제 (Schmidt, 1998, Methods Enzymol. 160:662-671), 아스퍼길러스 아와모리 β-자일로시다아제 (Kurakake et al. 2005, Biochim. Biophys. Acta 1726:272-279), 아스퍼길러스 베르시컬러 β-자일로시다아제 (Andrade et al. 2004, Process Biochem. 39:1931-1938), 스트렙토마이세스 종 β-자일로시다아제 (Pinphanichakarn et al. 2004, World J. Microbiol. Biotechnol. 20:727-733), 써모토가 마리티마 β-자일로시다아제 (Xue and Shao, 2004, Biotechnol. Lett. 26:1511-1515), 트리코더마 종 SY β-자일로시다아제 (Kim et al. 2004, J. Microbiol. Biotechnol. 14:643-645), 아스퍼길러스 니거 β-자일로시다아제 (Oguntimein and Reilly, 1980, Biotechnol. Bioeng. 22:1143-1154), 또는 페니실리움 워트만니 β-자일로시다아제 (Matsuo et al. 1987, Agric. Biol. Chem. 51:2367-2379).
β-자일로시다아제는 β-자일로시다아제를 인코딩하는 내인성 또는 외인성 유전자를 발현함으로써 제조될 수 있다. 몇몇 환경에서, β-자일로시다아제는 과다발현되거나 억제발현될 수 있다.
6.3.8 L-α- 아라비노푸라노시다아제
본 개시의 효소 배합물/조성물은 예를 들어, 적합하게는 하나 이상의 L-α-아라비노푸라노시다아제를 포함할 수 있다. L-α-아라비노푸라노시다아제는 예를 들어, Af43A, Fv43B, Pf51A, Pa51A, 또는 Fv51A 이다. Af43A, Fv43B, Pf51A, Pa51A, 및 Fv51A 폴리펩티드는 상기 구획 6.1 에 기술되어 있다.
본 개시의 효소 배합물/조성물은 임의로는 L-α-아라비노푸라노시다아제 대신에 또는 이것 외에도 하나 이상의 L-α-아라비노푸라노시다아제를 포함한다. 임의의 적합한 유기체로부터의 L-α-아라비노푸라노시다아제 (EC 3.2.1.55) 는 추가 L-α-아라비노푸라노시다아제로서 사용될 수 있다. 적합한 L-α-아라비노푸라노시다아제에는 예를 들어 하기가 포함된다: L-α-아라비노푸라노시다아제 of 아스퍼길러스 오리재 (Numan & Bhosle, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2006, 33:247-260), 아스퍼길러스 소재 (Oshima et al. J. Appl. Glycosci. 2005, 52:261-265), 바실러스 브레비스 (Numan & Bhosle, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2006, 33:247-260), 바실러스 스테아로써모필루스 (Kim et al., J. Microbiol. Biotechnol. 2004,14:474-482), 비피도박테리움 브레브 (Shin et al., Appl. Environ. Microbiol. 2003, 69:7116-7123), 비피도박테리움 론굼 (Margolles et al., Appl. Environ. Microbiol. 2003, 69:5096-5103), 클로스트리디움 써모셀룸 (Taylor et al., Biochem. J. 2006, 395:31-37), 후사리움 옥시스포룸 (Panagiotou et al., Can. J. Microbiol. 2003, 49:639-644), 후사리움 옥시스포룸 f. sp. 디안티 (Numan & Bhosle, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2006, 33:247-260), 지오바실러스 스테아로써모필루스 T-6 (Shallom et al., J. Biol. Chem. 2002, 277:43667-43673), 호르데움 불가레 (Lee et al., J. Biol. Chem. 2003, 278:5377-5387), 페니실리움 크리소게눔 (Sakamoto et al., Biophys. Acta 2003, 1621:204-210), 페니실리움 sp. (Rahman et al., Can. J. Microbiol. 2003, 49:58-64), 슈도모나스 셀룰로사 (Numan & Bhosle, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2006, 33:247-260), 리조무코르 푸실루스 (Rahman et al., Carbohydr. Res. 2003, 338:1469-1476), 스트렙토마이세스 카르트레우시스, 스트렙토마이세스 써모비올락쿠스, 써모아나에로박터 에탄올리쿠스, 써모바실러스 자일란 일리티쿠스 (Numan & Bhosle, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 2006, 33:247-260), 써모모노스포라 푸스카 (Tuncer and Ball, Folia Microbiol. 2003, (Praha) 48:168-172), 써모토가 마리티마 (Miyazaki, Extremophiles 2005, 9:399-406), 트리코더마 sp. SY (Jung et al. Agric. Chem. Biotechnol. 2005, 48:7-10), 아스퍼길러스 가와치 (Koseki et al., Biochim. Biophys. Acta 2006, 1760:1458-1464), 후사리움 옥시스포룸 f. sp. 디안티 (Chacon-Martinez et al., Physiol.Mol. Plant Pathol. 2004,64:201-208), 써모바실러스 자일라닐리티쿠스 (Debeche et al., Protein Eng. 2002, 15:21-28), 휴미콜라 인솔렌스, 메리필루스 기간테우스 (Sorensen et al., Biotechnol. Prog. 2007, 23:100-107), 또는 라파누스 사티부스 (Kotake et al. J. Exp. Bot. 2006, 57:2353-2362).
L-α-아라비노푸라노시다아제는 L-α-아라비노푸라노시다아제를 인코딩하는 내인성 또는 외인성 유전자를 발현함으로써 제조될 수 있다. 몇몇 환경에서, L-α-아라비노푸라노시다아제는 과다발현되거나 억제발현될 수 있다.
6.3.9 부속 단백질
본 개시의 효소 배합물/조성물은 예를 들어, 적합하게는 추가로 하나 이상의 부속 단백질을 포함할 수 있다. 부속 단백질의 예에는 하기가 포함되나 이로로써 제한되지 않는다: 만난아제 (예를 들어, 엔도만난아제, 엑소만난아제, 및 만노시다아제), 갈락타나아제 (예를 들어, 엔도- 및 엑소-갈락타나아제), 아라비나아제 (예를 들어, 엔도-아라비나아제 및 엑소-아라비나아제), 리그나아제, 아킬라아제, 글루쿠로니다아제, 프로테아제, 에스터라아제 (예를 들어, 페룰산 에스터라아제, 아세틸 자일란 에스터라아제, 쿠마르산 에스터라아제 또는 펙틴 메틸 에스터라아제), 리파아제, 글리코시드 히드롤라제 패밀리 61 폴리펩티드, 자일로글루카나아제, CIP1, CIP2, 팽창물질, 확장물질, 및 셀룰로오스 붕괴 단백질. 부속 단백질의 예에는 또한 CIP1-유사 단백질, CIP2-유사 단백질, 셀로비오스 탈히드로게나아제 및 과산화망간를 포함할 수 있다. 특정 구현예에서, 셀룰로오스 붕괴 단백질은 셀룰로오스 결합 모듈이다.
6.4 추가 적용
바이오매스의 당화 외에도, 효소 및/또는 본 개시의 효소 배합물/조성물은 식품 및 사료 공급 가공 공정 뿐만 아니라, 산업적, 농업적, 식품 및 사료에서 사용될 수 있다. 예시적 적용은 하기 기술된다.
6.4.1 목재, 페이퍼 및 펄프 처리
본 개시의 효소, 효소 배합물/조성물, 및 방법은 목재, 목재 생성물, 목재 폐기물 또는 부산물, 종이, 종이 생성물, 종이 또는 목재 펄프, Kraft 펄프, 또는 목재 또는 종이 재활용 처리 또는 산업적 가공에서 사용될 수 있다. 이들 가공은 하기를 포함한다: 예를 들어, 목재, 목재 펄프, 폐지는, 종이, 또는 펄프의 처리, 또는 목재 또는 종이의 탈잉크. 본 개시의 효소, 효소 배합물/조성물은 종이 펄프, 또는 재활용 종이 또는 종이 펄프, 등을 처리/전처리하는데 사용될 수 있다. 본 개시의 효소, 효소 배합물/조성물은 종이, 펄프, 재활용 종이 또는 종이 펄프 처리/전처리에서 포함되는 경우 종이의 "백화"를 증가시키는데 사용될 수 있다. 이는 종이의 보다 고 등급, 더욱 백화에 고려될 수 있고; 백화는 광학 스캐닝 장치의 스캔 용량에 영향 미칠 수 있다. 그 자체로서, 효소, 효소 배합물/조성물, 및 방법/과정은 잉크젝, 레이져 및 포토 프린팅 품질 종이를 포함하는 "밝은" 종이를 고 등급으로 제조하는데 사용될 수 있다.
본 개시의 효소, 효소 배합물/조성물은 예를 들어, 목재, 면, 삼, 아마 또는 린넨으로부터 섬유를 포함하는 다른 셀룰로오스 물질의 수를 가공하거나 처리하는데 사용될 수 있다.
따라서, 본 개시는 본 개시의 효소, 효소 배합물/조성물을 사용하는 목재, 목재 펄프, 종이, 종이 펄프, 폐지는 또는 목재 또는 종이 재활용 처리 공정을 제공한다.
본 개시의 효소, 효소 배합물/조성물은 인쇄된 폐지, 예컨대 신문의 탈잉크, 또는 비접착-인쇄된 폐지, 예를 들어, 제로그래픽 및 레이져-인쇄된 종이, 및 접착 및 비접착-인쇄된 폐지의 혼합형의 탈잉크에 사용될 수 있다 (이는 미국 특허 번호 제 6,767,728 호 또는 제 6,426,200 호; Neo, J. Wood Chem. Tech. 1986, 6(2):147 에 기술되어 있다). 또한, 이들은 하기를 포함하는 공정에서 종이-등급의 경질 목재 펄프부터 자일로오스를 제조하기 위해 사용될 수 있다: 액체 상으로 펄프에 함유되는 자일란을 추출하는 것, 자일란 내지 자일로오스를 가수분해하는데 충분한 조건으로 액체 상을 수득되는데 함유되는 자일란을 처리하는 것, 및 자일로오스를 회수하는 것. 추출 단계는 예를 들어 효소 또는 효소 배합물/조성물에 의해 알칼리-가용성 물질 또는 펄프의 수성 현탁액의 하나 이상의 처리를 포함할 수 있다 (참조, 미국 특허 번호 제 6,512,110 호). 본 개시의 효소, 효소 배합물/조성물은 셀룰로오스 섬유로부터의 펄프, 예컨대 경질목재 섬유로부터 제조된 재활용 종이 생성물로부터의 펄프로부터 제조된 재활용 종이 생성물, 경질목재 섬유 및 연질목재 섬유의 혼합물, 및 인쇄되지 않은 봉투, 탈잉크된 봉투, 인쇄되지 않은 대석 종이, 탈잉크된 대석 종이, 등으로부터 폐지를 용해시키는데 사용될 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 번호 제 6,254,722 호에 기술된 바와 같음).
6.4.2 섬유 및 직물의 처리
본 개시는 하나 이상의 본 개시의 효소, 효소 배합물/조성물을 사용하는 섬유 및 패브릭을 처리하는 ㅂ방법을 제공한다. 효소, 효소 배합물/조성물은 임의의 섬유- 또는 패브릭-처리 방법에서 사용될 수 있으며, 이는 당업계에 공지되어 있다. 예를 들어, 미국 특허 제 6,261,828 호; 6,077,316 호; 6,024,766 호; 6,021,536 호; 6,017,751 호; 5,980,581 호; 미국 특허 공보 번호 제 20020142438 A1 호를 참조한다. 예를 들어, 본 개시의 효소, 효소 배합물/조성물은 섬유 및/또는 패브릭 규모축소에 사용될 수 있다. 패브릭의 느낌 및 외관은 예를 들어 용액 중의 본 개시의 효소 또는 효소 배합물/조성물과 패브릭을 접촉시키는 것을 포함하는 방법에 의해 개선될 수 있다. 본 개시의 효소, 효소 배합물/조성물은 얼룩을 제거하기 위해 사용될 수 있다.
본 개시의 효소, 효소 배합물/조성물은 섬유 (예를 들어, 섬유 면, 삼, 아마 또는 린넨으로부터의 섬유), 직조 및 비직조 패브릭, 예를 들어, 니트, 우븐, 데님, 얀, 및 수건(면, 면 배합물 또는 천연 또는 인공 셀룰로오스 또는 이의 배합물로부터 제조됨) 를 포함하는 다수의 다른 셀룰로오스 물질을 처리하기 위해 사용될 수 있다. 직물 처리 공정은 다른 직물 처리, 예를 들어, 스코링 및/또는 표백과 연합되어 사용될 수 있다. 스코링은 예를 들어 면 섬유, 예를 들어, 큐티클 (주로 왁스로 이루어짐) 및 1차 세포벽 (주로 펙틴, 단백질 및 자일로글루칸으로 이루어짐) 으로부터 비-셀룰로오스 물질의 제거이다.
6.4.3 식품 및 사료 가공 처리
본 개시의 효소, 효소 배합물/조성물은 수많은 식품 가공 산업에 적용된다. 이들은, 오일이 풍부한 식물 물질, 예를 들어 오일이 풍부한 씨로부터 오일을 추출하는 것을 개선하기 위해 사용된다. 본 개시의 효소, 효소 배합물/조성물은, 대두로부터 대두유를 추출하기 위해, 올리브로부터 올리브 오일을 추출하기 위해, 평지씨로부터 평지씨 오일을 추출하기 위해, 또는 해바라시끼로부터 해바라기씨 오일을 추출하기 위해 사용될 수 있다.
본 개시의 효소, 효소 배합물/조성물은 식물 세포를 성분으로 분리하기 위해 사용될 수 있다. 또한, 본 개시의 효소, 효소 배합물/조성물은 농작물을 단백질, 오일 및 껍질 분획물로 분리하기 위해 사용될 수 있다. 분리 공정은 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다.
본 개시의 효소, 효소 배합물/조성물은 상기 용도 외에도, 과실 또는 식물 쥬스, 시럽, 추출물 등을 제조하는데 수율을 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 또한, 이들은 예를 들어 시리얼, 낟알, 와인 또는 쥬스 생성으로부터 다양한 식물 세포벽-유래된 물질 또는 폐기물 물질 또는 농업적 잔류물, 예컨대 식물 껍질, 콩 껍질, 당 비트 펄프, 올리브 펄프, 포테이토 펄프 등의 효소적 처리에서 사용될 수 있다.
추가로, 이들은 가공되는 과실 또는 야채의 외관 및/또는 지속성을 변형시키기 위해 사용될 수 있다. 또한, 이들은 식물 성분의 정제 또는 추출, 식물 물질 (식품 포함) 의 가공을 촉진하기 위해 식물 물질을 처리하는데 사용될 수 있다. 본 개시의 효소, 효소 배합물/조성물은 공급 값을 개선시키기 위해, 수 결합능을 감소시키기 위해, 폐기물 수 식물에서 분해성을 개선시키기 위해 및/또는 식물 물질을 신선 목초로 전환시키는 것을 개선시키기 위해 사용될 수 있다.
본 개시의 효소, 효소 배합물/조성물은 베이킹 적용에 사용될 수 있다. 몇몇 구현예에서, 이들은 기계로 처리하기에 어렵지 않은 끈적이지 않는 반죽을 창출하기 위해 사용될 수 있고, 비스킷 크리고 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 또한, 이들은 바삭함을 잃고 선반에서 유지기간이 감소되는 것을 야기할 수 있는 베이킹된 생성물의 신속한 재수화를 방지하기 위해 아라비노자일란을 가수분해하는데 사용될 수 있다. 예를 들어, 이들은 반죽 가공에서 첨가제로서 사용될 수 있다.
6.4.4 동물 사료 및 식품 또는 사료 또는 식품 첨가제
본 개시는 본 개시의 효소, 효소 배합물/조성물을 사용하여 동물 사료 및 식품 및 식품 또는 사료 첨가제 (보충물) 을 처리하는 방법을 제공한다. 동물은 포유동물 (예를 들어, 인간), 조류, 어류 등을 포함한다. 본 개시는 본 개시의 효소, 효소 배합물/조성물을 포함하는 동물 사료, 식품 및 첨가제 (보충물) 를 제공한다.
본 개시의 효소를 이용하여 동물 사료, 식품 및 첨가제를 처리하는 것은 동물 사료 및 첨가제 (보충물) 에서 영양분, 예를 들어 전분, 단백질 등의 이용가능성을 돕는다. 단백질 또는 간접적으로 또는 직접적으로 마스킹되지 않은 전분 (또는 다른 영양분)을 소화시키는데 어려움이 있는 것을 분해함으로써, 효소, 효소 배합물/조성물은 영양분 더욱 영향받기 쉬운 내지 다른 내인성 또는 외인성 효소에 더욱 영향받기 쉬운 영양분을 제조할 수 있다. 또한, 이들은 용이하게 소화될 수 있는 방출을 단순히 야기할 수 있고 영양분 및 당을 용이하게 흡수할 수 있다.
동물 사료에 첨가될 때, 본 개시의 효소, 효소 배합물/조성물은 장내 점도 환원에 의해 식물 세포벽 물질의 부분적 생체내 분해를 개선시키는 (참조, 예를 들어, Bedford et al., Proceedings of 1st Symposium on 효소 in Animal Nutrition, 1993, pp. 73-77) 반면, 동물에 의한 식물 영양분의 보다 양호한 이용이 달성된다.
따라서, 사료에서 본 개시의 효소, 효소 배합물/조성물을 사용하는 것은, 동물의 성장속도 및/또는 사료 전환 비 (즉 중량 획득에 대해 상대적으로 소화된 사료의 중량) 를 개선시킬 수 있다.
본 개시의 동물 사료 첨가제는 사료 성분과 용이하게 혼합될 수 있는 과립화된 효소 생성물일 수 있다. 대안적으로, 본 개시의 사료 첨가제는 프리믹스 성분을 형성할 수 있다. 본 개시의 과립화된 효소 생성물은 코팅되거나 코팅되지 않을 수 있다. 효소 과립의 입자 크기는 사료 및/또는 프리믹스 성분과 양립할 수 있다. 이는 효소를 사료로 혼입하는 안전하고 편리한 수단을 제공한다. 대안적으로, 본 개시의 동물 사료 첨가제는 액체 조성물을 안정화시킬 수 있다. 이는 수성- 또는 오일-기재 슬러리일 수 있다. 참조, 예를 들어, 미국 특허 번호 제 6,245,546 호.
본 개시의 효소, 효소 배합물/조성물은 트랜스제닉 사료 작물 (예를 들어, 트랜스제닉 식물, 씨 등으로서 예컨대 낟알, 시리얼, 옥수수, 대두, 평지씨, 루핀 등) 에서 직접적으로 발현됨으로써 공급될 수 있다. 상기 논의된 바와 같이, 본 개시는 본 개시의 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 트랜스제닉 식물, 식물부 및 식물세포를 제공한다. 핵산은 본 개시의 효소가 회수가능한 양으로 생산되도록 발현된다. 자일라나아제는 임의의 식물 또는 식물 부로부터 회수될 수 있다. 대안적으로 재조합 폴리펩티드를 함유하는 식물 또는 식물 부는 식품 또는 사료의 품질을 개선시키기 위한 그 자체로서 사용될 수 있고, 예를 들어 영양분 값, 기호특성 및 유동학적 특정 또는 항영양 인자를 파괴하기 위해 사용될 수 있다.
본 개시는 본 개시의 효소, 효소 배합물/조성물을 사용하여 동물 처리에 의해 소비되기 전에 사료로부터 올리고당을 제거하는 방법을 제공한다. 이러한 공정에서, 사료는 증가된 대사가능한 에너지 값을 갖기 위해 형성된다. 본 개시의 효소, 효소 배합물/조성물 외에도, 갈락토시다아제, 셀룰라아제 및 이의 조합이 사용될 수 있다.
본 개시는, 본 개시의 재조합 효소를 함유하는 영양 보충물을 제조하고, 동물에 의해 소화되는 식품에 함유된 헤미셀룰라아제의 이용을 증가시키기 위해 동물에 대한 영양분 보충물을 투여함으로써 동물의 식이에서 영양적 보충물로서 본 개시의 효소, 효소 배합물/조성물을 이용하는 방법을 제공한다.
6.4.5 폐기물 처리
본 개시의 효소, 효소 배합물/조성물은 다양한 다른 산업적 적용, 예를 들어 폐기물 처리에서 사용될 수 있다. 예를 들어, 하나의 태양에서, 본 개시는 본 개시의 효소, 효소 배합물/조성물을 이용하여, 고체 폐기물 분해 공정을 제공한다. 상기 방법은 실질적으로 처리되지 않은 고체 폐기물의 부피 및 환원 질량을 포함할 수 있다. 고체 폐기물은 제어 온도에서 (본 개시의 효소, 효소 배합물/조성물을 포함하는) 효소적 용액의 존재 하에서 효소적 소화 공정으로 처리될 수 있다. 첨가된 미생물로부터 고려될 수 있는 박테리아 발효가 없는 반응을 생성한다. 고체 폐기물은 액체화된 폐기물 및 임의의 잔류 고체 폐기물로 전환된다. 생성된 액체화된 폐기물을 상기 임의의 잔류 고체화된 폐기물로부터 분리될 수 있다. 참조, 예를 들어, 미국 특허 번호 제 5,709,796 호.
6.4.6 세제, 살균제 및 세정 조성물
본 개시는 하나 이상의 본 개시의 효소, 효소 배합물/조성물을 포함하는 세제, 살균제 또는 세정제 (세정 또는 클렌징) 조성물, 및 이들 조성물을 제조하는 방법 및 이들을 이용하는 방법을 제공한다. 본 개시는 세제, 살균제 또는 세정제 조성물을 제조하고 사용하는 모든 공지된 방법을 혼입한다. 참조, 예를 들어, 미국 특허 제 6,413,928 호; 6,399,561 호; 6,365,561 호; 6,380,147 호.
특정 구현예에서, 세제, 살균제 또는 세정제 조성물은 1- 및 2-부 수성 조성물, 비-수성 액체 조성물, 캐스트 고체, 과립 형태, 입자 형태, 압착된 정제, 겔 및/똔느 페이스트 및 슬러리 형태일 수 있다. 또한, 본 개시의 효소, 효소 배합물/조성물은 고체 또는 액체 형태로 세제, 살균제, 또는 세정제 첨가제 생성물로서 사용될 수 있다. 그러한 첨가제 생성물은 통상적인 세제 조성물의 보충하기 위해 또는 이를 강화하기 위해 의도되고, 이는 세정 공정의 임의의 단계에서 첨가될 수 있다.
본 개시는, 경질 표면을 세정하기 위한 세제 조성물, 패브릭을 세정하기 위한 세제 조성물, 식기세척 조성물, 경구 세정 조성물, 의치 세정 조성물, 및 콘택트렌즈 세정 용액을 포함하는 세정 조성물을 제공한다.
본 개시의 효소가 세탁기 세척 방법에서 사용되기에 적합한 조성물의 성분일 때, 조성물은, 본 개시의 효소 외에도, 효소 배합물/조성물은 둘 모두의 계면활성제 및 빌터 화합물을 포함할 수 있다. 이들은 하나 이상의 세제 성분, 예를 들어 하나 이상의 세제 성분, 예를 들어, 유기 중합성 화합물, 표백제, 추가 효소, 서드 억제제, 분산제, 라임-솝 분산제, 토양 현탁액 및 항-재침전제, 및 부식 저해제 을 추가로 포함할 수 있다.
본 개시의 세탁 조성물은 추가 세제 성분으로서 연화제를 함유할 수 있다. 카르보히드라아제를 함유하는 그러한 조성물은 세탁 세제 조성물로서 제형화될 때 패브릭 세정, 얼룩 제거, 백화 유지, 연화, 색 외관, 염료 이동 저해 및 위생처리를 제공할 수 있다.
따라서, 본 개시는 헤미셀룰로오스를 포함하는 바이오매스 물질의 공정을 제공한다. 그러한 바이오매스 물질은 임의로는 셀룰로오스를 포함할 수 있다. 예시적 바이오매스 물질로는 예를 들어 하기가 포함되나 이로써 제한되지 않는다: 코르코브 (corcob), 스위치그래스, 수수류, 및/또는 바가스. 따라서 본 개시는 헤미셀룰로오스를 포함하는 본원의 바이오매스 물질 및 임의로는 본원에 기술된 바와 같은 효소 배합물/조성물을 갖는 셀로오스를 처리하는 것을 포함하는, 당화 과정을 제공한다. 본 발명의 그러한 공정에 사용되는 효소 배합물/조성물은 하기를 포함한다: 바이오매스 물질에서 헤미셀룰로오스 1 kg 당 0.5 g 내지 40 g (예를 들어, 0.5 g 내지 20 g, 0.5 g 내지 30 g, 0.5 g 내지 40 g, 0.5 g 내지 15 g, 0.5 g 내지 10 g, 0.5 g 내지 5 g, 0.5 g 내지 7 g, 등) 의, 자일라나아제 활성을 갖는 폴리펩티드. 또한, 그러한 공정에서 사용되는 효소 배합물/조성물은 하기를 포함할 수 있다: 바이오매스 물질 중에서 헤미셀룰로오스 1 kg 당 1 g 내지 40 g (예를 들어, 2 g 내지 20 g, 3 g 내지 7 g, 1 g 내지 5 g, 또는 2 g 내지 5 g, 등) 의, 자일라나아제 활성을 갖는 폴리펩티드. 그러한 공정에서 사용되는 효소 배합물/조성물은 하기를 포함할 수 있다: 바이오매스 물질에서 헤미셀룰로오스 1 kg 당 0.5 g 내지 50 g (예를 들어, 0.5 g 내지 50 g, 0.5 g 내지 45 g, 0.5 g 내지 40 g, 0.5 g 내지 30 g, 0.5 g 내지 25 g, 0.5 g 내지 20 g, 0.5 g 내지 15 g, 0.5 g 내지 10 g, 등) 의, β-자일로시다아제 활성을 갖는 폴리펩티드. 그러한 공정에서 사용되는 효소 배합물/조성물은 하기를 포함할 수 있다: 바이오매스 물질에서 헤미셀룰로오스 1 kg 당 1 g 내지 50 g (예를 들어, 2 g 내지 40 g, 4 g 내지 20 g, 4 g 내지 10 g, 2 g 내지 10 g, 3 g 내지 7 g, 등) 의, β-자일로시다아제 활성을 갖는 폴리펩티드. 본 발명의 그러한 공정에 사용되는 효소 배합물/조성물은 하기를 포함할 수 있다: 바이오매스 물질에서 헤미셀룰로오스 1 kg 당 0.2 g 내지 20 g (예를 들어, 0.2 g 내지 18 g, 0.2 g 내지 15 g, 0.3 g 내지 10 g, 0.2 g 내지 8 g, 0.2 g 내지 5 g, 등) 의, L-α-아라비노푸라노시다아제 활성을 갖는 폴리펩티드. 본 발명의 그러한 공정에 사용되는 효소 배합물/조성물은 하기를 포함할 수 있다: 바이오매스 물질에서 헤미셀룰로오스 1 kg 당 0.5 g 내지 20 g (예를 들어, 1 g 내지 10 g, 1 g 내지 5 g, 2 g 내지 6 g, 0.5 g 내지 4 g, 또는 1 g 내지 3 g, 등) 의 폴리펩티드 (L-α-아라비노푸라노시다아제 활성 가짐). 또한, 효소 배합물/조성물은 하기를 포함할 수 있다: 바이오매스 물질에서 셀룰로오스 1 kg 당 1 g 내지 100 g (예를 들어, 1 g 내지 100 g, 2 g 내지 80 g, 3 g 내지 50 g, 5 g 내지 40 g, 2 g 내지 20 g, 10 g 내지 30 g, 또는 12 g 내지 18 g, 등) 의 폴리펩티드 (셀룰라아제 활성 가짐). 임의로는, β-글루코시다아제 활성을 갖는 폴리펩티드의 양은 셀룰라아제 활성을 갖는 폴리텝티드의 총 중량의 50% 이하로 구성될 수 있다.
본 발명의 적합한 공정은 바람직하게는 바이오매스 물질 처리된 헤미셀룰로오스 자일란으로부터의 60% 내지 90% 자일로오스를 수득한다. 적합한 바이오매스 물질은 하나 이상의 예를 들어, 옥수수속대, 스위치그래스, 수수류, 및/또는 바가스를 포함한다. 그 자체로서, 본 발명의 공정은 바람직하게는 하나 이상의 이들 바이오매스 물질로부터 헤미셀룰로오스 자일란으로부터의 자일로오스를 적어도 70% (예, 적어도 75%, 적어도 80%) 수득한다. 예를 들어, 공정은 헤미셀룰로오스를 포함하는 바이오매스 물질의 헤미셀룰로오스 자일란으로부터 60% 내지 90% 의 자일로오스를 수득하고, 이는 옥수수속대, 스위치그래스, 수수류, 및/또는 바가스를 포함하나 이로써 제한되지 않는다.
본 발명의 공정은 임의로는 추가로 모노사카라이드를 회수하는 것을 추가로 포함한다.
본 발명은 하기 예에 의해 추가로 설명된다. 예는 오직 예시적 목적으로만 제공된다. 이들은 어떤 방식으로든 발명의 내용 또는 범위를 한정하지 않는다.
7. 실시예 1: 대표 실험 방법
7.1 물질 및 방법
하기 검정/방법을 실시예 1 에서 사용하고 후속 실시예에서 사용하였다. 하기 제시된 프로토콜로부터 임의의 편차가 있을 수 있다.
7.1.1 식물 조직으로부터의 헤미셀룰로오스의 제조
미셀룰로오스 제제는 Erbringerova et al. (Carbohydrate Polymers 1998, 37:231) 에 의해 기재된 NaOH/초음파분쇄 절차의 변경을 사용하여 제조하였다. 건조 식물 물질을 1 mm 스크린을 통과하도록 분쇄하고, 10 g 의 이러한 물질을 250 mL 의 5% (wt/v) NaOH 에 현탁하였다. 현탁액을 교반 없이 30 분 동안 80℃ 로 가열한 다음, 높은 설정에서 탐침 초음파분쇄기를 사용하여 15 분 동안 주위 온도에서 초음파분쇄하였다. 현탁액을 80℃ 로 추가 30 분 동안 되돌린 다음, 실온으로 냉각시켰다. 3000 x g 에서 15 분 동안 원심분리에 의해 현탁액으로부터 고체를 제거하고, 수득된 상청액을 빙상에 냉각된 1 L 의 에탄올 내에 디캔팅하였다. 30 분 후, 수득된 침전물을 제 1 디캔팅에 의해 회수하고 그 다음 침전물 상의 맑은 액체를 침전물이 완전히 공기 건조되지 않도록 하면서 여과하였다. 필터 케이크를 200 mL 의 냉각, 80% 에탄올로 제 1 세척한 다음, 공기 건조되지 않도록 하면서 필터로부터 제거하였다. 필터 케이크를 200 mL 의 물에 재용해하고, 용액의 pH 를 아세트산으로 5.5 로 조정하였다. 추출된 카르보하이드레이트를 빙상의 1 L 의 에탄올에 첨가함으로써 재침전시키고, 수득된 침전물을 상기와 같이 여과에 의해 다시 회수하였다. 필터 케이크를 동결시키고, 남은 용매 및 물을 동결건조에 의해 제거하였다. 회수된 카르보하이드레이트의 수율은 조직 및 제제에 따라 출발 식물 물질의 6 내지 23% 범위였다.
7.1.2 바이오매스 기질의 희석 암모니아 전처리
옥수수속대 및 스위치그래스를 WO06110901 에 기재된 방법 및 가공 범위에 따라 효소적 가수분해 전에 전처리하였다 (다르게 명시되지 않은 경우).
7.1.3 바이오매스의 조성 분석
["Determination of structural carbohydrates and lignin in the biomass" (National Renewable Energy Laboratory, Golden, CO 2008, http://www.nrel.gov/biomass/pdfs/42618.pdf 에서 이용가능)] 에 기재된 2 단계 산 가수분해 방법을 사용하여 바이오매스 기질의 조성을 측정하였다. 효소적 가수분해 결과는 기질의 출발 글루칸 및 자일란 함량으로부터의 이론적 수율에 대해 %전환율로서 보고된다.
7.1.4 암모니아 전처리된 옥수수속대로부터의 미정제 올리고머의 제조
헤미셀룰라아제의 스크리닝을 위한 미정제 올리고머를 하기 절차에 의해 옥수수속대로부터 제조하였다. 해머-밀링된 옥수수속대 (~1/4 in 평균 직경) + 6% 암모니아 (w/w) 를 교반된 압력 반응기 내로 스팀을 직접 주입하면서 145℃ 로 가열하였다. 20 분 후 과량의 암모니아를 ~0.1 bar 의 최종 진공에서 반응기 밖으로 플러시하였다. 그 다음 암모니아 전처리된 옥수수속을, 효소 당화를 위해 살균 교반된 반응기에 두었다. 충분한 물을 첨가하여, 모든 첨가가 이루어진 후, 25% (w/w) 의 최종 총 고체 적재량을 수득하였다. 4 N 황산으로 반응기의 pH 를 pH 5.3 으로 유지하였고, 온도는 47℃ 로 조절하였다. Spezyme® CP, Multifect® 자일라나아제 (Danisco US Inc., Genencor), 및 Novo 188 (Novozymes, Denmark) 를 각각 20, 10 및 5 mg/g 의 셀룰로오스 적재량으로 첨가하고, 전처리된 옥수수속을 당 및 올리고머로 116 h 동안 당화시켰다. 그 다음 물질을 33℃ 로 냉각시키고, pH 를 4 N NaOH 로 5.8 로 조정하였다. 그 다음 글루코오스 및 자일로오스를 U.S. 7,354,755 에 기재된 바와 같이 재조합 지모모나스 모빌리스 균주의 종자 배양 (10% 총 부피, ATCC 접근 번호. PTA-1798) 을 첨가함으로써 에탄올로 발효시켰다. 모든 글루코오스 및 ~95% 의 자일로오스가 소모될 때까지 발효 공정을 진행하였다. 발효 브로쓰의 0.5 L 분취액을 20 분 동안의 원심분리 (21,000 x g) 에 의해 정화시킨 후 0.2 마이크론 필터 단위 (Nalgene) 를 통해 상청액을 여과하였다. 가정용 진공청소기로 35℃ 에서 유지된 로토바프 (rotovap) 상에서 여과된 발효 브로쓰로부터 에탄올을 제거하였다. 최종 액체의 총 부피는 상기 절차에 의해 ~4x 감소하였다.
7.1.5 총 단백질 검정
단백질 샘플의 특성 (즉, 정제됨, 발효 브로쓰, 시판되는 생성물, 등) 에 따라 상이한 총 단백질 측정 방법을 이용하였다. BC 단백질 검정은 분광광도계로 단백질 농도를 측정하는 비색 검정의 예이다.
시약: BC Protein Assay Kit (Pierce Chemical, Product #23227), 50 mM 나트륨 아세테이트 완충액 pH 5.0, 15% 트리클로로아세트산 (TCA), 0.1 N NaOH, BS 저장액, 시약 A, 시약 B (단백질 검정 키트로부터)
절차: 효소 희석액을 50 mM 나트륨 아세테이트 완충액을 사용하여 시험 튜브에서 제조하였다. 희석된 효소 용액 (0.1 mL) 을 1 mL 15% TCA 를 함유하는 2 mL Eppendorf 원심분리 튜브에 첨가하였다. 튜브를 와동시키고, 아이스 배스에 10 분 동안 두었다. 그 다음 샘플을 14,000 rpm 에서 6 분 동안 원심분리하였다. 상청액을 따라 붓고, 펠릿을 1 mL 0.1 N NaOH 에 재현탁하고, 펠릿이 용해될 때까지 튜브를 와동시켰다. BS 표준 용액을 2 mg/mL 의 저장액으로부터 제조하였다. 0.5 mL 시약 B 와 25 mL 시약 A 를 혼합하여 BC 작동 용액을 제조하였다. 재현탁된 단백질 (0.1 mL 각각) 을 3 개의 Eppendorf 원심분리 튜브에 첨가하였다. 2 mL Pierce BC 작동 용액을 각각의 샘플에 첨가하고, BS 표준 Eppendorf 튜브에 연속 희석하였다. 모든 튜브를 37℃ 수조에서 30 분 동안 인큐베이션하였다. 그 다음 샘플을 실온으로 냉각시키고 (15 분), 흡광도를 분광광도계로 562 nm 에서 측정하였다.
계산: 각각의 BS 단백질 표준 흡광도에 대한 평균 값을 계산하고 x-축에 흡광도 및 y-축에 농도 (mg/mL) 로 플롯팅하였다. 선형 곡선 핏을 적용하고, 선에 대한 방정식을 식: y = mx + b 를 사용하여 계산하여삳
효소 샘플의 원 농도는 x-값에 대한 흡광도를 빼서 계산하였다. 총 단백질 농도는 희석 인자를 곱하여 계산하였다.
정제된 샘플의 총 단백질은 A280 에 의해 측정되었다 (예를 들어, Pace et al., Protein Science, 1995, 4:2411 참조).
일부 단백질 샘플은 보정자로서 소 혈청 알부민을 사용하는 Weichselbaum 및 Gornall 에 의해 변형된 뷰렛 방법을 사용하여 측정하였다 (변형된 뷰렛) (Weichselbaum, Amer. J. Clin. Path. 1960, 16:40; Gornall et al., J. Biol. Chem. 1949, 177:752).
발효 생성물의 총 단백질 함량을 또한 종종 Kjeldahl 에 의해 (rtech laboratories, www.rtechlabs.com) 또는 인-하우스 DUMAS 방법에 의해 내부에서 (TruSpec CN, www.leco.com) (SADER, et al. Archives of Veterinary Science, 9(2):73-79, 2004), 연소에 의한 총 질소, 방출된 질소의 포획 및 측정으로서 측정하였다. 착물 단백질-함유 샘플, 예 발효 브로쓰의 경우, 평균 16% N 함량, 및 질소에서 단백질로의 전환 인자 6.25 를 사용하였다. 일부 경우에서, 총 침전가능 단백질을 측정하여 간섭하는 비-단백질 질소를 제거하였다. 12.5 % 최종 TC 농도를 사용하고, 단백질-함유 TC 펠릿을 0.1 M NaOH 에 재현탁하였다.
다른 경우에서, Coomassie Plus-Better Bradford Assay (Thermo Scientific, Rockford, IL 제품 #23238) 를 제조자의 권고에 따라 사용하였다.
7.1.6 합성 기질 (파라- 니트로페닐 기질) 활성 검정
클로닝된 유전자의 T. reesei 발현으로부터 활성 단백질을 모델 기질 검정으로 확인하였다. 합성 기질, 예컨대 4-니트로페닐 α-L-아라비노푸라노시드 (pNPA, Sigma N3641) 및 4-니트로페닐 β-D-글루코피라노시드 (pNPG, Sigma N7006), 및 4-니트로페닐 β-D-자일로피라노시드 (pNPX, Sigma N2132) 에 대한 셀룰라아제 및 헤미셀룰라아제 활성을 하기와 같이 측정하였다: 100 mL 50 mM 나트륨 아세테이트 완충액 (pH 4.8) 에 30 mg 의 합성 기질을 용해하여 기질 용액을 제조하였다. 탄산나트륨 (1 M) 을 반응 중지를 위해 제조하였다. 기질 용액 (100 ㎕) 을 Costar 96 웰 플레이트 (Cat no. 9017) 에 분배하였다. 20 ㎕ 의 효소 샘플을 마이크로타이터 플레이트 웰에 분배하였다. 마이크로타이터 플레이트를 Thermomixer R 가열 및 냉각 진탕기 (Eppendorf) 를 사용하여 50℃ 에서 10 분 동안 인큐베이션하였다. 50 ㎕ 의 1 M 탄산나트륨을 각각의 웰에 첨가하여 반응을 중지시켰다. 400 nm 파장에서의 흡광도를 SpectraMax 340C384 Microplate Spectrophotometer (Molecular Devices) 로 판독하였다. mL 당 단위를 p-니트로페놀 표준 곡선을 사용하여 측정하였다. cbh1 , cbh2 , egl1 및 egl2 유전자가 결실된 (참조, WO 05/001036) Quad-결실 트리코더마 숙주를 이러한 백그라운드에서 발현된 효소의 활성에 대한 대조군으로서 효소 샘플과 함께 분석하였다.
7.1.7 옥수수속 당화 검정
전형적으로, 마이크로타이터 플레이트 형식 내 옥수수속대 당화는 하기 절차에 따라 수행되었다. 바이오매스 기질인 희석 암모니아 전처리된 옥수수속대를 물에 희석하고, 직접 검정에 사용되는 pH 5, 7% 셀룰로오스 슬러리를 만들기 위해 황산으로 pH 를 조절하였다. 시험된 효소는 하기를 포함했다: 시판되는 셀룰라아제 생성물, 예 엑셀러라아제® 1000, 엑셀러라아제® 1500 (Danisco US Inc., Genencor), T. reesei 발효 브로쓰, 및 정제된 효소. 효소를 옥수수속대 기질 내 셀룰로오스 그램 당 총 단백질 mg 에 근거하여 적재하였다 (조성 분석에 의해 측정된 바와 같음). 효소를 50 mM 나트륨 아세테이트 pH 5.0 에 희석하여, 필요한 부피로 원하는 적재량 농도를 수득하였다. 40 마이크로리터의 효소 용액을 웰 당 7% 셀룰로오스로 70 mg 의 희석-암모니아 전처리된 옥수수속대에 첨가하였다 (최종 4.5% 셀룰로오스에 동등함). 검정 플레이트를 실온에서 10 분 동안 인큐베이션하였다. 검정 플레이트를 알루미늄 플레이트 밀봉재로 덮고, 플레이트를 50℃, 200 rpm 에서 3 일 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션 기간 종료시에, 당화 반응을 웰 당 100 ㎕ 의 100 mM 글리신 완충액 (pH 10.0) 을 첨가하여 중지시키고, 플레이트를 5 분 동안 3,000 rpm 에서 원심분리시켰다. 10 마이크로리터의 상청액을 96-웰 HPLC 플레이트 내 200 ㎕ 의 MilliQ 물에 첨가하고, 가용성 당을 HPLC 에 의해 측정하였다.
이것은 본원의 복합 실시예에서 사용했던 전형적인 방법을 설명한다. 특정 실시예에서, 옥수수속대 당화를 변형된 프로토콜을 사용하여 측정하였다. 변형은 개별 예로 기재된다.
7.1.8 HPLC 에 의한 당 분석
전형적으로는, 옥수수속 당화 가수분해로부터의 샘플을, 불용성 물질을 세정하기 위한 원심분리, 0.22 ㎛ 나일론 필터 (Spin-X 원심분리 튜브 필터, Corning Incorporated, Corning, NY) 를 통한 여과 및 증류수로의 가용성 당의 적합한 농도로의 희석에 의해 제조하였다. 단량체 당을 6x50 mm SH-1011P 가드 컬럼이 있는 Shodex Sugar SH-G SH1011, 8x300mm (www.shodex.net) 상에서 측정하였다. 용매는 0.6 mL/분에서 실행되는 0.01 N H2SO4 였다. 컬럼 온도는 50℃ 였고, 검출은 굴절률 검출기를 사용하여 수행하였다. 글루코오스, 자일로오스 및 아라비노오스의 외부 표준을 각각의 샘플 세트로 실행하였다. 본원의 특정 예는 다소 변형된 프로토콜 세트로 동일한 결말을 달성하기 위해 프로토콜을 사용한다. 프로토콜에 대한 특이적 변형은 개별 예로 기재된다.
올리고머성 당을 Tosoh Biosep G2000PW 컬럼 7.5 mm x 60 cm (www.tosohbioscience.de) 을 사용하는 크기 배재 크로마토그래피에 의해 분리하였다. 용매를 0.6 mL/분의 물로 증류하였고, 컬럼을 실온에서 실행하였다. 크기 보정을 위해 사용된 6 개의 탄소 당 표준은 다음과 같았고: 스타키오스, 라피노오스, 셀로비오스 및 글루코오스; 및 5 탄소 당은 다음과 같았다: 자일로헥소스, 자일로펜토스, 자일로테트로스, 자일로트리오스, 자일로비오스 및 자일로오스. 자일로-올리고머는 Megazyme (www.megazyme.com) 에서 입수하였다. 검출을 굴절률에 의해 수행하였고, 정량적으로 보고하는 경우 결과는 피크 면적 단위 또는 백분율에 의한 상대 피크 면적이다.
총 가용성 당을 상기 기재된 원심분리되고 필터 정화된 샘플의 산 가수분해에 의해 측정하였다. 정화된 샘플을 0.8 N H2SO4 로 1:1 희석하고, 수득된 용액을 121℃ 에서 1 h 의 총 주기 시간 동안 캡 바이알에서 오토클레이브 하였다. 결과를 가수분해 동안의 단량체 당의 손실에 대한 교정 없이 보고한다.
7.1.9 HPLC 에 의한 단백질 분석
통합된 발현 균주의 14L 발효로부터 브로쓰에 함유된 효소를 분리하고 정량하기 위해, 액체 크로마토그래피 (LC) 및 질량 분광분석 (MS) 을 수행하였다. 　효소 샘플을 S. plicatus (예를 들어, NEB P0702L) 로부터 재조합적으로 발현된 endoH 글리코시다제로 제 1 처리하였다. EndoH 를 샘플 총 단백질 ㎍ 당 0.01-0.03 ㎍ endoH 단백질의 비로 사용하고, 3 h 동안 37℃, pH 4.5-6.0 에서 인큐베이션하여, HPLC 분석 전에 N-연결된 글리코실화를 효소적으로 제거하였다. 그 다음 대략 50 ㎍ 의 단백질을 HIC-페닐 컬럼이 있는 Agilent 1100 HPLC 시스템을 사용하여 소수성 상호작용 크로마토그래피에 대해 주입하고, 35 분에 걸친 고-에서-저 염 구배를 농축된 발효 브로쓰의 샘플 상에 수행하였다. 고염 완충액 A: 20 mM 인산칼륨 pH 6.75 를 함유하는 4 M 암모늄 술페이트 및 저염 완충액 B: 20 mM 인산칼륨 pH 6.75 를 사용하여 구배를 달성하였다. 　 222 nm 에서의 UV 광으로 피크를 검출하고, 분획을 수집하고 질량 분광분석에 의해 확인하였다.
7.1.10 칼코플루오르 화이트를 사용하는 셀룰라아제 활성 검정
셀룰라아제 활성을 칼코플루오르 화이트 검출 방법을 사용하는 PASC 에 대해 측정하였다 (Appl. Biochem. Biotechnol. 161:313-317). 사용된 모든 화학약품은 분석 등급이었다. Avicel PH-101 을 FMC BioPolymer (Philadelphia, PA) 에서 구입하였다. 칼코플루오르 화이트를 Sigma (St. Louis, MO) 에서 구입하였다. 인산 팽창된 셀룰로오스 (PASC) 를 Walseth, TAPPI 1971, 35:228 및 Wood, Biochem. J. 1971, 121:353-362 의 채용된 프로토콜을 사용하여 Avicel PH-101 로부터 제조하였다. 간단하게는, Avicel 을 농축 인산에 가용화시킨 다음, 냉각 탈이온화수를 사용하여 침전시켰다. 셀룰로오스를 수집하고 pH 를 중화하기 위해 더 많은 물로 세척한 후, 이것을 50 mM 나트륨 아세테이트 완충액 (pH 5.0) 중 1% 고체로 희석하였다.
모든 효소 희석물을 50 mM 나트륨 아세테이트 완충액 (pH 5.0) 으로 제조하였다. GC220 셀룰라아제 (Danisco US Inc., Genencor) 를 2.5, 5, 10, 및 15 mg 단백질/g PASC 로 희석하여 선형 보정 곡선을 생성하였다. 시험되는 샘플을 보정 곡선의 범위 내에 있도록, 즉, 0.1 내지 0.4 분획 생성물의 응답을 수득하도록 희석하였다. 150 ㎕ 의 냉각 1% PASC 를 96-웰 마이크로타이터 플레이트 중 20 ㎕ 의 효소 용액에 첨가하였다. 플레이트를 덮고 2 h 동안 50℃ 에서, Innova 인큐베이터/진탕기 내 200 rpm 로 인큐베이션하였다. 반응을 100 mM 글리신 (pH 10) 중 100 ㎕ 의 50 ㎍/mL 칼코플루오르로 중지시켰다. 형광 마이크로플레이트 판독기 (SpectraMax M5, Molecular Devices 사제) 로 여기 파장 Ex = 365 nm 및 방출 파장 Em = 435 nm 에서 형광을 판독하였다. 결과 (도 25 에 나타냄) 를 하기 방정식에 따라 분획 생성물로서 표현한다:
FP = 1 - (Fl 샘플 - Fl 완충액)/(Fl 영 효소 - Fl 완충액),
이때 FP 는 분획 생성물, 및 Fl = 형광 단위임.
7.1.11 세포외 단백질에서 검출된 주요 헤미셀룰라아제 활성의 후사리움 버티실리오이드 의 배양 및 정제
야생형 후사리움 버티실리오이드 공급원은 [Fuchs et al ., Fungal Genetics and Biology 2004, 41:852-863] 의 표 1A 에 기재되어 있는 것과 같았다. 균류를 [Li et al ., Applied Biochemistry and Biotechnology 2005, (121-124):321-334] 에 기재된 방법의 변형을 사용하여 탈전분화된 (destarched) 옥수수 곡물 섬유를 사용하여 성장시켰다.
3 L 의 수돗물에 200 g 의 옥수수 과피를 슬러리화 하고, 5 mL (500 mg) 의 고온 아밀라아제 Liquozyme SC DS (Novozymes, Denmark) 로 80℃ 로 가열함으로써 옥수수 건조 분쇄 분획화로부터의 건조된 옥수수 과피 분획으로부터 전분을 제거하였다. 혼합물을 스파츌라로 때때로 교반하고, 80℃ 에서 30 분 동안 유지한 다음, 실온으로 약 2 h 동안 냉각시켰다. 수득된 슬러리를 부분적으로 탈수하기 위해 20 메시 스크린 상에 디캔팅하였다. 스크린 상의 고체를 4 L 의 수돗물로 추가로 세척한 다음, 밤새 공기 건조시킨 후, 60℃ 오븐에서 최종 건조시켰다. 건조된 물질을 사용 전에 나이프 밀로 1 mm 스크린을 통과하도록 분쇄하였다.
F. 버티실리오이드 배양물을 감자 덱스트로스 아가 (Sigma P6685) 상에 유지하고, 24 g/L 감자 덱스트로스의 풍부 성장 배지를 플레이트로부터 균사로 접종하였다. 성장 배양물을 130 rpm 에서 진탕하면서 3 일 동안 30℃ 에서 인큐베이션하였다. 3 일 성장 후, 150 mL 의 수득된 세포 질량 및 소비된 배지를 옥수수 과피 유도 배지를 접종하기 위해 사용하였다. 유도 배지는 1 L 염기 배지 (15 g KH2PO4, 5 g 암모늄 술페이트, 20 g 효모 추출물, 0.5 g 마그네슘 술페이트 및 1 g Tween 80, pH4.8) 중 80 g 탈전분화된 옥수수 과피였다. 배양을 130 rpm 에서 7 일 동안 진탕하면서 30℃ 에서 유지하였다.
세포외 단백질을 2,000 x G 에서 20 분 동안의 원심분리에 의해 소비된 곡물 및 균류 세포 질량으로부터 분리하였다. 부분적으로 정화된 상청액을 0.45 ㎛ 필터를 먼저 통과시킨 다음 0.22 ㎛ 필터를 통과시켰다.
투명해진 여과물을 사용시까지 4℃ 에서 보관하였다. 여과물을 30 kD 절삭을 갖는 Amicon ultra-4 원심분리 필터 (Millipore) 로 대략 14 배 농축하였다.
L-α-아라비노푸라노시다아제 (LARF) 및 β-자일로시다아제 (BXL) 활성을, 단백질을 50 mM pH 6.3 (N-모르폴리노) 에탄술폰산-NaOH (MES) 완충액으로 먼저 교환한 후, 단백질을 GE Health Sciences Q-Sepharose Fast Flow 4 차 아민 음이온 교환 컬럼 (MES 으로 평형화된 20 ㎖ 층 부피) 에 적용함으로써 균류 상청액으로부터 정제하였다. 사용한 단백질 정제 시스템은 Unicorn 소프트웨어를 사용하는 GH Health Sciences Akta system 이었다. 단백질을 MES 완충액 중 0-0.5 M NaCl 구배로 용리하였다.
컬럼 분획 중 활성을 4-니트로페닐 β-D-자일로피라노시드 (BXL 활성에 대해) 또는 4-니트로페닐 α-L-아라비노푸라노시드 (LARF 활성에 대해) 를 사용하여 모니터링하였다. 둘 모두의 경우, 2 ㎕ 의 컬럼 분획을 95 ㎕ 의 50 mM pH 5.0 나트륨 아세테이트 완충액 및 5 ㎕ 의 p-니트로페닐 기질에 추가하고, 혼합하고 23℃ 에서 2 분 동안 인큐베이션하였다. 100 ㎕ 의 1 N 탄산 나트륨 중지 용액을 추가하고, 405 nm 에서의 흡광도를 판독하였다.
음이온 교환 시스템으로부터의 활성 효소 분획을 수집하고, Amicon Centriprep 여과에서 농축하고, 상기 기재된 동일한 단백질 정제 시스템으르 사용하여 GE Health Sciences SP-Sepharose Fast Flow 술포프로필 양이온 교환 컬럼 (나트륨 아세테이트 완충액으로 평형화된 20 ㎖ 층) 에 적용하였다. 단백질을 나트륨 아세테이트 완충액 중 0-1 M NaCl 구배로 용리하고, 분획 중 활성을 상기 기재된 바와 같이 모니터링하였다. 활성 분획을 이후 수집하고, 풀링하고 필요시 농축하였다. 활성 분획 중 단백질을 MS-MS 로 확인하였다.
7.1.12 MS - MS 에 의한 단백질 확인
후사리움 버티실리오이드 패밀리 GH54 L-α-아라비노푸라노시다아제 (LARF), 패밀리 GH51 LARF, 두 패밀리 GH3A β-자일로시다아제 및 패밀리 GH30 β-자일로시다아제 (BXL) 의 확인을 하기에 기재하였다.
GH54 LARF 의 확인을 위해서, 200 ㎕ 의 1N HCl (EM Industries, Hawthorne, NY) 을 상기 기재된 정제 절차로부터의 250 ㎕ 의 "분획 B3" (0.35 mg 단백질) 에 추가하고, 샘플을 10 분 동안 빙냉하였다. 다음으로, 200 ㎕ 의 50% TCA (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 를 추가하고, 샘플을 추가 10 분 동안 빙냉하여 단백질을 침전시켰다. 샘플을 16,000 rcf 에서 2 분 동안 원심분리하고, 상청액을 폐기하였다. 펠릿화된 단백질을 90% 차가운 아세톤 (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ) 으로 세척한 후, 16,000 rcf 에서 1 분 동안 원심분리하였다. 상청액을 폐기하고, 펠릿을 공기 건조되게 두었다. 먼저, 30 ㎕ 의 8 M 우레아 (MP Biomedicals, Solon, OH) 를 펠릿에 추가한 후, 4 ㎕ 의 0.2 M DTT (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 를 추가하였다. 샘플을 52℃ 에서 30 분 동안 인큐베이션 한 후, 4 ㎕ 의 0.44 M 요오도아세트아미드 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 를 추가하고 용액을 30 분 동안 암환경에서 실온에서 인큐베이션하였다. 다음으로, 120 ㎕ 의 0.1% n-옥틸 B-D-글루코피라노시드 수 (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 를 천천히 추가한 후, 샘플을 2 개의 동일 부분으로 나누었다. 절반의 샘플에, 7.5 ㎍ 트립신 (Promega Corp., Madison, WI) 을 추가하고, 다른 절반에 4 ㎍ 의 AspN (Roche Applied Science, Indianapolis, IN) 을 추가하였다. 둘 모두의 샘플을 37℃ 에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 샘플을 0.1% TFA 의 최종 부피에 대해 10% 트리플루오로아세트산 (Thermoscientific, Waltham, MA) 으로 켄칭하였다. 둘 모두의 샘플을 Thermofinnigan (San Jose, CA) LCQ-Deca 전기분무 이온화 (ESI) 이온-트랩 질량 분광계에서 실행시켰다. Vydac C18 컬럼 (5 u, 300A, 0.2 x 150 mm, Michrom Bioresources, Auburn, CA) 을 200 ㎕/분의 유속으로 실행시켰다. 주입 부피는 50 ㎕ 이었고, 컬럼에 로딩하기 전에 온라인 트래핑 카트리지 (Peptide CapTrap, Michrom Bioresources, Auburn, CA) 를 통해 여과하였다. 소화물의 분리를 하기와 같은 구배로 수행하였다 (용매 A: H2O 중 0.1% 트리플루오로아세트산 (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ), 용매 B: 아세토니트릴 중 0.08% 트리플루오로아세트산 (J.T. Baker, Phillipsburg, NJ)). GH51 LARF, 두 개의 GH3A β-자일로시다아제 및 GH30 β-자일로시다아제의 확인을 위해서, 트립신 및 AspN 에 추가로 키모트립신 (7.5 ㎍, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 으로 샘플을 소화시킨 것을 제외하고는, 상기 기재된 방법을 사용하였다. Bioworks 3.31 내 TurboSequest search engine (Thermo, San Jose) 을 사용하여 후사리움 버티실리오이드 단백질 데이타베이스로부터 단백질을 확인하였다. 단백질 데이타베이스를, http://www.broadinstitute.org/annotation/genome/fusarium_verticillioides/MultiDownloads.ht㎖ 에서 BROAD 기관으로부터 다운로드하였다.
7.1.13 희석 수성 암모니아 전처리된 스위치그래스에 의한 후사리움 버티실리오이드 효소의 유도
희석 수성 암모니아 전처리된 스위치그래스에 반응하여 후사리움 버티실리오이드 효소를 유도하기 위해서, 스위치그래스를 <1 mm 직경으로 분쇄한 후, 90 분 동안 160℃ 최대 온도에서 50% 초기 건조 물질에서의 건조 중량을 기준으로 하여 6% 암모니아로 전처리하였다. 생성된 물질은 43.3% 고체였으며 0.336% 잔류 암모니아를 함유하였다.
야생형 F. 버티실리오이드 배양물을 감자 덱스트로오스 아가 (Sigma P6685) 에서 유지시키고, 24 g/L 감자 덱스트로오스의 풍부 성장 배지에 플레이트로부터의 균사체를 접종하였다. 성장 배양물을 3 일 동안 24℃ 에서 140 rpm 에서 휘저으면서 인큐베이션하고, 그동안 이는 후사리움 세포로 혼탁해졌다. 3 일 성장 후, 4 개의 플라스크는 각각 100 ㎖ 의 베이스 크리스타카포울로스 (Christakapoulos) 배지 (0.1% KH2PO4, 0.03% CaCl2, 0.03% MgSO4 x 7 H2O, 2.61% Na2HPO4 x 7 H20, 0.134% NaH2PO4 x 1 H2O, 1.0% 무수 암모늄 포스페이트) 에 4 ㎖ 의 생성된 세포 현탁액을 접종하였다. 현탁액에, 희석 수성 암모니아-전처리된 스위치그래스의 2 g 건조 물질을 단독 탄소원으로서 추가하였다.
전처리된 스위치그래스를 추가한 후, pH 를 6.5 로 조정하고 플라스크를 180 rpm 에서 23℃ 에서 168 시간 동안 휘저였다. 크기 배제 크로마토그래피 전에, 샘플을 단백질, p-니트로페닐 아라비노푸라노시다아제, p-니트로페닐 자일로시다아제 및 p-니트로페닐 글루코시다아제 활성에 대해서는 Bradford 검정에 의해, 효소의 유도에 대해서는 SDS-PAGE 겔에 의해 상이한 시간 지점에서 분석하였다. 미손상 비-전처리된 스위치그래스, 2% 글루코오스 및 비-탄소원을 대등한 대조군으로서 포함시켰고, 희석 수성 암모니아-전처리된 스위치그래스 탄소원에 대한 경우보다 매우 낮은 수준의 효소 유도가 유발되었음을 발견하였다.
7.1.14 후사리움 버티실리오이드 배양 브로쓰의 크기 배제 크로마토그래피 분획화
상기 기재된 168 시간 유도로부터 발현된 효소를 함유하는 후사리움 버티실리오이드 배양 배지를 3,500 x g 에서 원심분리하여 파편 및 세포를 제거하였다. 상청액을 0.4 ㎛ 필터를 통해 여과하여, 투명한 진황색 액체를 수득하였다. 상기 액체를 대용량 Amicon ultra 10K MW 절삭 농축기 (UFC901024) 에서 2 회 농축 (~4X) 하였다. 1.7 ㎖ 농축 샘플을 크기 배제 크로마토그래피 (SEC) 에 대해 책정하고 이전에 기재된 바와 같이 BCA 검정에 의해 단백질 함량을 검정하였다. 농축 단백질 샘플을 50 mM 나트륨 아세테이트 완충액 pH 5.0 으로 평형화된 Superdex 16/60 SEC 컬럼에 로딩하였다. 상기 컬럼을 1 ㎖/분에서 4℃ 에서 용리하였다. 214 nm 및 280 nm 에서의 샘플 흡광도를 모니터링하였다. 허공 부피 (void volume) 의 용리 후, 1 ㎖ 분획을 깊은 웰 폴리프로필렌 마이크로타이터 플레이트에서 수집하였다. 단백질 함유 분획을 별도의 깊은 웰 플레이트 내로 모으고, 모든 분획을 BCA 검정에 의해 총 단백질 농축, 및 p-니트로페닐 아라비노시다아제, p-니트로페닐 자일로시다아제 및 p-니트로페닐 글루코시다아제 활성에 대해 실시예 1 에서 기재된 바와 같이 측정하였다 (합성 기질 활성 검정).
7.1.15 양이온 교환 크로마토그래피에 의한 T. 레세이 발효로부터의 많은 GH43 , GH51 및 GH3A 상동체 (하기 섹션 8.1) 의 정제
야생형 트리코더마 레세이 배양물로부터의 진탕 플라스크-규모 효소 생성을 WO 2005/001036 에서 기재된 바와 같이 수행하였다. 세포외 효소 제조물을 필요시 Amicon Centriprep 여과에 의해 농축하고, Unicorn 소프트웨어를 사용하는 GE Health Sciences Akta 시스템 단백질 정제 시스템을 사용하여 GE Health Sciences SP-Sepharose Fast Flow 술포프로필 양이온 교환 컬럼 (나트륨 아세테이트 완충액으로 평형화된 20 ㎖ 층) 에 적용하였다. 단백질을 나트륨 아세테이트 완충액 중 0-1 M NaCl 구배로 용리하고, 분획 중 활성을 상기 기재된 바와 같이 모니터링하였다. 활성 분획을 이후 수집하고, 풀링하고 필요시 농축하였다. 컬럼 분획 중 활성을 4-니트로페닐 β-D-자일로피라노시드 (BXL 활성에 대해) 또는 4-니트로페닐 α-L-아라비노푸라노시드 (LARF 활성에 대해) 를 사용하여 모니터링하였다. 둘 모두의 경우에서, 2 ㎕ 의 컬럼 분획을 95 ㎕ 의 50 mM pH 5.0 나트륨 아세테이트 완충액 및 5 ㎕ 의 p-니트로페닐 기질에 추가하고, 혼합하고 23℃ 에서 2 분 동안 인큐베이션하였다. 100 ㎕ 의 1 N 탄산 나트륨 중지 용액을 추가하고, 흡광도를 405 nm 에서 측정하였다. 일부 경우에서, 음이온 교환 단백질 정제 단계는 양이온 교환 전에 유용하였다. 이러한 경우, 상기 효소 분획을 50 mM pH 6.3 (N-모르폴리노) 에탄술폰산-NaOH (MES) 완충액으로 교환한 후, 단백질 샘플을 GE Health Sciences Q-Sepharose Fast Flow 4 차 아민 음이온 교환 컬럼 (MES 완충액으로 평형화된 20 ㎖ 층 부피) 에 적용하였다. 양이온 교환 단계에 대해 기재된 바와 같은 Akta 단백질 정제 시스템을 사용하였다. 단백질을 MES 완충액 중 0-0.5 M NaCl 구배로 용리하였다. 활성 효소를 이후, 양이온 교환 크로마토그래피 전에 50 mM, pH 5.0 나트륨 아세테이트 완충액으로 교환하였다.
7.1.16 자일라나아제의 정제
자일라나아제 정제를 하기 두 단계로 수행하였다:
단계 1: 소수성 상호작용 크로마토그래피 (HIC). (NH4)2SO4 를 발효 상청액에 추가하여 1 M 의 최종 농도를 얻었다. 사용한 분리 컬럼은 Hiprep 페닐 (highsub), 16/10, 20 ㎖ 이었다. 완충액 A: 20 mM 인산나트륨, pH 6.0. 완충액 B: 완충액 + 1 M (NH4)2SO4 . 점차적 용리: 45% B; 0% B; 물+10% 글리세롤.
단계 2: 겔 여과 (GF). HIC 컬럼으로부터의 0% B 의 용출액을 수집하고 HiLoad 26/60 Superdex 75 prep 그레이드 (320 ㎖, GE Healthcare) 컬럼에 로딩하였다. 이동상은 20 mM 인산나트륨, pH 6.8 (0.15 M NaCl 함유) 이었다. 용리 특성을 도 26에 나타내었다. 도 27 은 AfuXyn 5 의 두 단계 분리의 SDS-PAGE 검출을 나타낸다.
Applied Biosystems BIOAD
Figure pct00001
Vision 및 Amersham Pharmacia Biotech AKT Explorer 를 T. 레세이 XYN3 의 단백질 정제에 사용하였다. 한외여과 농축물로부터의 대략 150 ㎖ 의 자일라나아제 3 을 10 mM TES 완충액, pH 6.8 로 평형화된 Sephadex G-25M 탈염 컬럼 (총 부피 약 525 ㎖) 에 로딩하였다. 300-400 ㎖ 의 이러한 탈염 샘플을 이후 음이온-교환 컬럼 (고밀도 4 차 아민 수지; Applied Biosystems Inc.) 에 로딩하였다. 이후, 결합한 단백질을 25 mM TES 완충액의 8-컬럼 부피를 사용하여 0 내지 1 M 염화나트륨의 염 구배를 사용하여 용리하였다. 단백질의 용리는 0 내지 250 mM 염화나트륨에서 발생하였으며, 10% 비스-트리스 NUPAGE
Figure pct00002
SDS-PAGE (Novex) 를 사용하여 검출하였다.
용리된 자일라나아제 3-함유 샘플을 Vivaspin 5,000 MWCO (분자량 절삭) 막 농축기 (Vivascience; GE Healthcare) 로 10 ㎖ 로 농축하였다. 농축물을 이후 High Load 26/60 Superdex 200 (ID 번호 17-1071-01; GE Healthcare) 에 로딩하였다. 컬럼을 25 mM TES 완충액, pH 6.8 (100 mM 염화나트륨 함유) 로 평형화한 후, 결합한 단백질을 염화나트륨과 함께 TES 완충액의 8-컬럼 부피 초과로 용리하였다.
용리된 단백질의 순도를 10% 비스-트리스 NUPAGE
Figure pct00003
SDS-PAGE (Novex) 를 사용하여 평가하였고, 95% 초과의 순도인 것으로 측정되었다.
7.1.17 Fv43D 의 정제
후사리움 버티실리오이드 43D 의 한외여과 농축물 (UFC) 을 완충액 교환하고, 50 mM 나트륨 아세테이트 완충액, pH 4.0 에 대해 밤새 투석하였다. 투석된 물질을, 주사기와 함께 사용하기 위해 설계된 술포프로필 sepharose fast flow 수지로 사전패킹된 HiTrap 1 ㎖ 컬럼 (GE Healthcare) 을 통과시켰다. 정제된 Fv43D 를 250 mM 염화나트륨과 함께 50 mM 나트륨 아세테이트 완충액, pH 4.0 으로 용리하였다. UFC 및 나트륨 아세테이트 완충액을 GE Healthcare 커넥터에 달린 5 ㎖ 주사기를 사용하여 컬럼을 통과시켰다. 정제된 Fv43D 를 50 mM 나트륨 아세테이트 완충액, pH 4.0 에 대해 밤새 투석하였다. 정제된 단백질을 SDS-PAGE, HPLC 및 질량 분광기로 검정하여 동질성을 입증하였다.
7.1.18 Fv51A 의 정제
후사리움 버티실리오이드 51 의 한외여과 농축물 (UFC) 을 완충액 교환하고, 50 mM 나트륨 아세테이트 완충액, pH 5.0 에 대해 밤새 투석하였다. 투석된 물질을, 메틸 술포네이트 배지로 사전패킹된 RESOURCE 15 6 ㎖ 컬럼 (GE Healthcare) 을 통과시켰다. UFC 를 1 ㎖/분으로 50 mM 나트륨 아세테이트 완충액, pH 5.0에 대해 로딩하고, 5 ㎖/분으로 50 mM 나트륨 아세테이트 완충액, pH 5.0 에 대해 용리하였다 (0 내지 250 mM 염화나트륨 구배 사용). 용리된 분획을 수집하고 SDS-PAGE 로 검정하였다. 정제된 Fv51A 를 갖는 분획을 Sartorius Stemdim Biotech 사로부터의 10,000 MWCO Vivaspin 농축기를 사용하여 농축하였다. 정제된 Fv51A 를 50 mM 나트륨 아세테이트 완충액, pH 5.0 에 대해 밤새 투석하였다. 정제된 단백질을 SDS-PAGE, HPLC 및 질량 분광기로 검정하여 동질성을 입증하였다. GE Healthcare 사로부터의 AKT Explorer 100 시스템을 Fv51A 의 정제에 사용하였다.
8. 실시예 2: 트리코더마 레세이 에서의 다양한 종으로부터의 개별적 헤미셀룰라아제 유전자의 발현
8.1 후사리움 버티실리오이드 유전자
Fv51A 에 대한 서열을, GH51 아라비노푸라노시다아제 상동체에 대한 Broad Institute 데이타베이스 (http://www.broadinstitute.org/) 에서 후사리움 버티실 리오이드 게놈을 탐색하여 수득하였다.
후사리움 버티실리오이드로부터의 하기 유전자를 트리코더마 레세이에서 발현시켰다: Fv3A, Fv43A, Fv43B, Fv43D, Fv51A, Fv3B, Fv43C, Fv39A, Fv43E, Fv30A, Fv30B 및 Fv43F. Fv3A 서열을 후사리움 버티실리오이드 게놈에서의 GH3A β-자일로시다아제 상동체에 대해 탐색하여 수득하였다. 주석을 단 서열은 신호 서열이 결여되었으며 유전자 예측 프로그램 Augustus (http://augustus.gobics.de/) 를 사용하여 신호 서열을 포함하는 업스트림 서열을 확인하였다. Fv39A, Fv43A, Fv43B, Fv43D, Fv43E 및 Fv30A 에 대한 서열을, GH39, GH30 및 GH43 β-자일로시다아제 상동체에 대한 후사리움 버티실리오이드 게놈을 탐색하여 수득하였다.
관심 헤미셀룰라아제 유전자의 개방 판독 프레임을, 주형으로서 후사리움 버티실리오이드로부터의 정제/추출된 게놈 DNA 를 사용하여 PCR 에 의해 증폭하였다. 사용한 PCR 써모사이클러는 DNA Engine Tetrad 2 Peltier Thermal Cycler (BioRad Laboratories) 였다. 사용한 DNA 중합효소는 PfuUltra II Fusion HS DNA 중합효소 (Stratagene) 였다. 개방 판독 프레임을 증폭시키는데 사용한 프라이머는 하기와 같다:
Figure pct00004
정방향 프라이머는 pENTR/D-TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA) 로 방향성 클로닝을 촉진하기 위해 5'-말단에서 4 개의 추가 뉴클레오티드 (서열-CACC) 을 포함했다 (도 28). 오픈 리딩 프레임을 증폭하기 위한 PCR 조건은 하기와 같았다 (Fv51A 제외): 단계 1: 2분 동안 94℃. 단계 2: 30초 동안 94℃. 단계 3: 30초 동안 57℃. 단계 4: 30-45초 동안 72℃. 단계 2, 3 및 4 를 추가 29 사이클 동안 반복하였다. 단계 5: 2분 동안 72℃. Fv51A 에 대해, 하기 조건을 사용하였다: 단계 1: 2분 동안 94℃. 단계 2: 30초 동안 94℃. 단계 3: 30초 동안 56℃. 단계 4: 45초 동안 72℃c. 단계 2, 3, 4 를 추가 25 사이클 동안 반복하였다. 단계 5: 4℃ 유지.
상응하는 헤미셀룰라아제 오픈 피딩 프레임의 PCR 생성물을 Qiaquick PCR Purification Kit (Qiagen, Valencia, CA) 를 사용하여 정제하였다. 정제된 PCR 생성물을 pENTR/D-TOPO 벡터로 클로닝하고, TOP10 화학적으로 유능한 E. coli 세포 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 로 형질전환하고, 50 ppm 카나마이신으로 L 플레이트 상에 플레이팅하였다. 플라스미드 DN 을 QIAspin 플라스미드 제제 kit (Qiagen) 를 사용하여 E. coli 형질전환체로부터 수득하였다. pENTR/D-TOPO 벡터로 삽입된 DN 에 대한 서열 데이터를 M13 정방향 및 역방향 프라이머 (Sequetech, Mountain View, CA) 를 사용하여 수득하였다. 상응하는 헤미셀룰라아제 오픈 리딩 프레임의 DN 서열을 교정한 pENTR/D-TOPO 벡터를 LR 클로나아제 반응 혼합물 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 을 사용하여 제조자의 지시사항에 따라 pTrex3gM 목적 벡터 (WO 05/001036, 도 29) 와 재조합하였다. 이어서, LR 클로나아제 반응의 생성물을 50ppm 카르베니실린을 함유하는 L 상에서 플레이팅된 TOP10 의 화학적으로 유능한 E. coli 세포로 형질전환시켰다. 생성된 발현 벡터는 pTrex3gM 및 attL1 및 attL2 의 attR1 및 attR2 사이의 재조합 경우로부터 생성된 상응하는 헤미셀룰라아제 오픈 리딩 프레임을 함유하는 pTrex3gM 플라스미드였다. 생성된 발현 벡터는 attR1 및 attR2 자리 사이의 pTrex3gM 및 attL1 및 attL2 자리 사이의 pENTR/D-TOPO; 및 아스퍼길러스 니둘란스 아세트아미다아제 선별 마커 (amdS) 의 재조합 사건으로부터 생성된 상응하는 헤미셀룰라아제 오픈 리딩 프레임을 함유하는 pTrex3gM 플라스미드였다. 상응하는 헤미셀룰라아제 오픈 리딩 프레임을 함유하는 발현 벡터의 DN 을 Qiagen miniprep kit 를 사용하여 단리하고 트리코더마 레세이 spoRes 의 바이오리스틱 형질전환을 위해 사용하였다.
상응하는 헤미셀룰라아제 오픈 리딩 프레임을 함유하는 트리코더마 레세이 with pTrex3gM 발현 벡터의 바이오리스틱 형질전환을 하기 프로토콜을 사용하여 수행하였다. 헬륨-충격에 의한 트리코더마 레세이 셀룰라아제 quad 결실 (Δ cbh1 , Δc b h2, Δ eg1 , Δ eg2) 균주의 형질전환을 Bio-Rad (Hercules, CA) 로부터 Biolistic® PDS-1000/He Particle Delivery System 을 사용하여 하기 제조자의 지시사항에 따라 수행하였다 (참조, 특허 공보 WO 05/001036 및 US 2006/0003408). 형질전환체를 신선한 아세트아미드 선별 플레이트로 형질전환시켰다 (참조, 특허 공보 WO 2009114380). 안정적 형질전환체를 200㎕/글리신 최소 배지의 웰 (6.0 g/L glycine; 4.7 g/L (NH4)2SO4; 5.0 g/L KH2PO4; 1.0 g/L MgSO4?7H2O; 33.0 g/L PIPPS; pH 5.5) 을 함유하는 여과 마이크로적정 플레이트 (Corning) 로 접종하였고, 탄소원으로서 ~2% 글루코오스/소포로오스 혼합물 (US 7,713,725) 의 후 무균 첨가하였다: 10 mL/L 의 100 g/L 의 CaCl2, 2.5 mL/L 의 T. reesei 미량 원소 (400X): 175 g/L 무수 시트르산; 200 g/L FeSO4?7H2O; 16 g/L ZnSO4?7H2O; 3.2 g/L CuSO4?5H2O; 1.4 g/L MnSO4?H2O; 0.8 g/L H3Bo3). 형질전환체를 28℃ 인큐베이터에서 하우징된 O2-풍부 챔버에서 5 일 동안 액체 배양시켰다. 여과 마이크로적정 플레이트로부터 상청액 샘플을 진공 다기관 상에서 수집하였다. 상청액 샘플을 발현을 위한 체크지에 대해 제조자의 지시사항에 따라 4-12% NuPAGE 겔 (Invitrogen, Carlsbad, CA) 상에서 수행하였다. 겔을 단순 청색 염색으로 염색하였다 (Invitrogen, Carlsbad, CA). T. reesei 발효물로부터의 GH43, GH51 및 GH3A 효소를 정제하는 것을 실시예 1 에서 기술된 바와 같은 양이온 교환 크로모토그래피에 의해 수행하였다.
8.2 다른 종으로부터의 유전자
Pf43A 및 Pf51A 서열은 페니실리움 푸니쿨로숨 게놈의 서열화에 의해 수득되었다.
P. 푸니쿨로숨 게놈의 연구에 사용되는 의문점은 공공 게놈에서 이용가능한 다른 균류 GH43 및 GH51 상동체였다. Augustus (http://augustus.gobics.de/) 로 명명된 유전자 예측 프로그램을 사용하여 출발 코돈에 따라 인트론 서열을 검증하였다.
Fv43D 서열을 사용하여 지베렐라 zeae (후사리움 그라미네아룸) 및 후사리움 옥시스포룸 게놈 available in Broad Institute 데이타베이스에서 이용가능한 지베렐라 zeae (후사리움 그라미네아룸) 및 후사리움 옥시스포룸 게놈을 의심하고 각각 Gz43A 및 Fo43A 에 대한 서열을 회수하였다. 유전자 for Gz43A 및 Fo43A 에 대한 유전자를 자연 신호 서열 대신 CBH1 신호 서열을 갖는 GeneArt (Geneart GmbH, Regensburg, Germany) 에 의해 합성하였다. 어떤 유전자도 인트론을 함유하지 않았다. Pf51A 유전자를 코돈-최적화하고 자연 신호 서열 대신 CBH1 신호 서열을 갖는 GeneArt 에 의해 합성하였다. Pf43A 및 Pf51A 를 클로닝하고 하기 프라이머를 사용하여 트리코더마 레세이 중에서 발현시켰다:
Figure pct00006
3 개의 유전자를 트리코더마 레세이: GH11 자일라나아제 2 (AfuXyn2), GH11 자일라나아제 5 (AfuXyn5), 및 GH43 Af43A 에서 발현을 위해 아스퍼길러스 푸미가투스로부터 클로닝하였다. 프라이머를 클로닝하는 AfuXyn2, AfuXyn5, 및 Af43A 에 대한 프라이머를 하기에 나타냈다:
Figure pct00007
Figure pct00008
클로닝을 위해 사용되는 방법 및 모든 이들 유전자의 발현은 후사리움 유전자의 클로닝을 위해 기술되는 절차에 대해 유사하였다. 표 1B 에 나열된 것을 포함하는 추가의 유전자를 유사한 방식으로 클로닝하였다.
9. 실시예 3: 합성 기질 상에서 신규 헤미셀룰라아제의 활성을 위한 시험
예를 들어, Fv3A, Fv43A, Fv43B, Fv43D 및 다수의 다른 단백질의 활성을 (표 2), 실시예 1 에서 합성 기질 활성 검정에서 기술되는 바와 같은 합성 기질 pNPX 및 pNP 상에서 시험하였다. T. reesei Bxl1 를 0.7 g/L 로 사용하였다. 다른 효소 샘플, 및 Quad-결실 숙주 제어를 성장 배양액 (마이크로적정 플레이트 또는 진탕 플라스크 규모) 로부터의 부피에 의해 첨가하였다. 따라서, 절대적 활성은 샘플에 걸쳐 비교될 수 없고, 표 2 에 나타낸 상대적인 pNPX 및 pNP 활성에 대해 활성 발현되는 단백질을 나타낸다. 파라-니트로페닐 기질 상의 활성은 바이오매스 당화에서 수행의 예측자로서 사용되지 않는다.
10. 실시예 4: 셀룰라아제 및 헤미셀룰라아제 제제에 의한 전처리된 옥수수속대의 가수분해
10.1 발현된 단백질의 당화 성능
L-α-아라비노푸라노시다아제 결핍을 갖는 효소 혼합물로의 첨가제로서 발현 단백질의 당화 성능을 평가하였다. 하기 효소 및 양/농도를 갖는 옥수수속대 당화 검정 (실시예 1) 에서 기술된 바와 같이 스크리닝을 수행하였다.
Figure pct00009
엑셀러라아제® 1500, TP (총 Nitrogen) 54.2 mg/mL
Figure pct00010
트리코더마 레세이 Xyn3, 2.9 mg/mL TP (정제됨)
Figure pct00011
Fv3A, 3.2 mg/mL TP (정제됨)
Figure pct00012
Fv51A, 7.8 mg/mL TP (정제됨)
Figure pct00013
Mg51A, 6.8 mg/mL TP (TCA/BCA)
Figure pct00014
At51A, 6.7 mg/mL TP (TCA/BCA)
Figure pct00015
Pt51A, 3.3 mg/mL TP (TCA/BCA)
Figure pct00016
Ss51A, 3.0 mg/mL TP (TCA/BCA)
Figure pct00017
Vd51A, 6.8 mg/mL TP (TCA/BCA)
Figure pct00018
Cg51B, 3.6 mg/mL TP (TCA/BCA)
Figure pct00019
Af43A, 2.6 mg/mL TP (TCA/BCA)
Figure pct00020
Pf43A, 2 mg/mL TP (TCA/BCA)
Figure pct00021
Fv43E, 1.37 mg/mL TP (TCA/BCA)
총 단백질 (TP) 의 정제된 샘플을 달리 명시되지 않는 한 A280 에 의해 측정하였다. 정제되지 않은 샘플의 총 단백질을 달리 명시되지 않는 한 제조자의 지시사항에 따라 BC 에 의해 측정하였다. 엑셀러라아제® 1500 를 20 mg 단백질/g 셀룰로오스에서 첨가하고; 트리코더마 레세이 Xyn3 를 5 mg 단백질/g 셀룰로오스에서 첨가하고; Fv3A 을 5 mg 단백질/g 셀룰로오스에서 첨가하였다. Fv51A, Mg51A, At51A, Pt51A, Ss51A, Vd51A, Cg51B, Af43A, Pf43A, 또는 Fv43E 를 1, 3, 및 5 mg 단백질/g 셀룰로오스에서 첨가하였다. 4 일 인큐베이션 후, 50℃, 200 rpm, 검정 플레이트를 중지하고 가용성 당에 대해 HPLC 에 의해 분석하였다.
효소가, 글루코오스 또는 자일로오스 또는 아라비노오스 수율을 증가시키거나, 이 효소 혼합물에서 셀로비오스 또는 자일로비오스 농도를 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 결과를 도 30 및 30B 에 나타낸다.
또한, 발현된 단백질의 당화 성능을 L-α-아라비노푸라노시다아제 및 β-자일로시다아제 결핍된 효소 혼합물에 첨가제로서 평가되었다. β-자일로시다아제 후보자를 엑셀러라아제® 1500/T. reesei Xyn3 의 효소 혼합물로의 첨가에 의한 cob 당화 검정 3 일 후 평가하였다. 스크리닝을 하기 효소 및 양/농도를 갖는 옥수수속대 당화 검정에서 기술된 바와 같이 (실시예 1) 수행하였다.
Figure pct00022
엑셀러라아제® 1500, TP (총 질소) 54.2 mg/mL
Figure pct00023
트리코더마 레세이 Xyn3, 2.9 mg/mL (정제됨)
Figure pct00024
Fv3A, 3.2 mg/mL (정제됨)
Figure pct00025
Fv43D, 6.8 mg/mL (정제됨)
Figure pct00026
Pf43A, 2 mg/mL TP (BCA)
Figure pct00027
Pf43B, 2.7 mg/mL TP?(BCA)
Figure pct00028
Fv43E, 1.37 mg/mL TP (BCA)
Figure pct00029
Fv43F, 2.8 mg/mL TP (BCA)
Figure pct00030
Fv30A, 2.7 mg/mL TP (BCA)
엑셀러라아제® 1500 를 17.9 mg 단백질/g 셀룰로오스에서 첨가하고; T. reesei Xyn3 를 5 mg 단백질/g 셀룰로오스에서 첨가하였다. Fv3A, Fv43D, Pf43A, Pf43B, Fv43E, Fv43F, 또는 Fv30A 를 1, 3, 및 5 mg 단백질/g 셀룰로오스에서 첨가하였다 (Fv43E는 1 및 3 mg/g 에서만 첨가됨). 50℃, 200 rpm, 3 일 인큐베이션 후, 검정 플레이트를 중지하고 가용성 당에 대해 HPLC 로 분석하였다. 결과를 도 31 에 나타냈다. 효소가, 글루코오스, 또는 자일로오스 또는 아라비노오스 수율을 증가시키고, 이러한 효소 혼합물에서 셀로비오스 또는 자일로비오스 농도를 감소시키는 것으로 밝혀졌다.
또한, 발현된 단백질의 당화 성능을 자일라나아제가 결핍된 효소 믹스로의 첨가로서 평가하였다. 트리코더마 레세이 통합된 발현 균주 (하기 실시예 9 에 기술됨) 의 구축 동안, 과다발현된 Bgl1, Fv3A, Fv51A, Fv43D 단백질을 과다발현하나 엔도-자일라나아제를 과다발현하지 않는 하나의 T. reesei 균주 (균주 # 44) 를 단리하였다. 이러한 균주를 백그라운드로서 사용하여 이에 대한 후보자 자일라나아제를 성능 스크리닝에 대해 첨가하였다. 엔도-자일라나아제 후보자를 균주 #44 로부터의 효소 생성물로의 첨가에 의한 3 일 cob 당화 검정에서 평가하였다. 스크리닝을 하기 효소 및 양/농도를 갖는 옥수수속대 당화 검정 (실시예 1) 에서 기술된 바와 같이 수행하였다:
Figure pct00031
균주 #44 효소 생성물 78.6 mg/mL TP (변형된 Biuret)
Figure pct00032
트리코더마 레세이 Xyn3 2.9 mg/mL TP (정제됨)
Figure pct00033
AfuXyn2 3.3 mg/mL TP (정제됨)
Figure pct00034
AfuXyn3 5.8 mg/mL TP (정제됨)
Figure pct00035
AfuXyn5 14.8 mg/mL TP (정제됨)
Figure pct00036
PfuXyn1 1.9 mg/mL TP (정제됨)
Figure pct00037
SspXyn1 1.2 mg/mL TP (정제됨)
균주 #44 에 의해 생산되는 효소 조성물을 20 mg 단백질/g 셀룰로오스에서 첨가하고; 후보자 자일라나아제 효소를 3 및 7 mg 단백질/g 셀룰로오스에서 첨가하였다. 50℃, 200 rpm 에서 3 일 인큐베이션 후, 검정 플레이트를 중지하고 가용성 당에 대한 HPLC 에 의해 분석하였다. 효소가, 자일로오스, 또는 글루코오스, 또는 아라비노오스 수율을 증가시키거나, 또는 이러한 효소 혼합물에서 셀로비오스 또는 자일로비오스 농도를 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 결과를 도 32 에 나타낸다.
L-α-아라비노푸라노시다아제가 결핍된 효소 혼합물에서 발현된 Fv51A 및 Pa51A 단백질의 당화 성능을 평가하고 비교하였다. Fv51A 및 Pa51A 를 엑셀러라아제® 1000/T. reesei Xyn2/Bxl1 또는 Fv3A 의 효소 혼합물로의 첨가에 의한 3일 cob 당화 검정으로 평가하였다. 스크리닝을 하기 효소 및 양/농도로 옥수수속대 당화 검정 (실시예 1) 에서 기술된 바와 같이 수행하였다:
Figure pct00038
엑셀러라아제® 1000, 60.6 mg/mL TP (총 질소)
Figure pct00039
트리코더마 레세이 Xyn2 4.1 mg/mL TP (정제됨)
Figure pct00040
트리코더마 레세이 Bxl1 69 mg/mL TP (TCA/총 질소)
Figure pct00041
Fv3A 65 mg/mL TP (TCA/총 질소)
Figure pct00042
Fv51A 43 mg/mL TP (TCA/BCA)
Figure pct00043
Pa51A 85.4 mg/mL TP (TCA/총 질소)
엑셀러라아제® 1000 을 20 mg 단백질/g 셀룰로오스에서 첨가하고; 트리코더마 레세이 Xyn2 를 5 mg 단백질/g 셀룰로오스에서 첨가하고; 트리코더마 레세이 Bxl1 또는 Fv3A 를 5 mg 단백질/g 셀룰로오스에서 첨가하였다. Fv51A 를 5 mg 단백질/g 셀룰로오스에서 첨가하였다. Pa51A 를 1, 2, 또는 5 mg 단백질/g 셀룰로오스에서 첨가하였다. 50℃, 200 rpm 에서 3 일 인큐베이션 후, 검정 플레이트를 켄칭하고 가용성 당에 대한 HPLC 로 분석하였다. 효소 조합이, 자일로오스, 또는 글루코오스, 또는 아라비노오스 수율을 증가시키거나, 또는 이러한 효소 혼합물에서 셀로비오스 또는 자일로비오스 농도를 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 결과를 도 33 에 나타낸다.
또한, Fv51A 및 Pa51A 를 엑셀러라아제® 1000/트리코더마 레세이 Xyn2 의 효소 혼합물로의 첨가에 의한 3 일 cob 당화 검정으로 평가하였다. 정제된 Fv51A (29 mg/mL TP) 및 Pa51A (29 mg/mL) 를 연구의 이 부분에서 사용하였다. 엑셀러라아제®1000 을 17.5 mg 단백질/g 셀룰로오스에서 첨가하였고; 트리코더마 레세이 Xyn2 를 4.4 mg 단백질/g 셀룰로오스에서 첨가하였다. Fv51A 를 4.4 mg 단백질/g 셀룰로오스에서 첨가하였다. Pa51A 를 0.9, 1.8, 및 4.4 mg 단백질/g 셀룰로오스에서 첨가하였다. 50℃, 200 rpm 에서 3 일 인큐베이션 후, 검정 플레이트를 켄칭하고 가용성 당에 대한 HPLC 로 분석하였다. 효소 조합이, 이러한 효소 혼합물에서 자일로오스, 또는 글루코오스, 또는 아라비노오스 수율을 증강시키는 것으로 밝혀졌다. 결과를 도 34 에 나타낸다.
발현된 단백질의 당화 성능을 또한 β-자일로시다아제가 결핍된 효소 믹스에의 첨가로서 평가하였다. β-자일로시다아제 후보물을 엑셀러라아제® 1000/ 트리코더마 레세이 Xyn2/Fv51A 의 효소 혼합물에의 첨가에 의한 3 일간의 속대 당화 검정으로 평가하였다. 하기 효소 및 양/농도를 사용하여 옥수수속대 당화 검정 (실시예 1) 에 기술된 바에 따라 검사를 수행하였다:
Figure pct00044
엑셀러라아제
Figure pct00045
1000, TP (TCA/총 질소) 60.6 ㎎/㎖
Figure pct00046
트리코더마 레세이 Xyn2, 4.1 ㎎/㎖ TP (정제됨)
Figure pct00047
Fv3A, 65 ㎎/㎖ TP (TCA/총 질소)
Figure pct00048
Fv3B, 62.9 ㎎/㎖TP (TCA/총 질소)
Figure pct00049
Fv39A, 47.5 ㎎/㎖ TP (TCA/총 질소)
Figure pct00050
Fv30B, 62.9 ㎎/㎖ TP (TCA/총 질소)
Figure pct00051
Fv51A, 43 ㎎/㎖ TP (TCA/BCA)
엑셀러라아제® 1000 을 20 ㎎ 단백질/g 셀룰로오스에 첨가하고; 트리코더마 레세이 Xyn2 를 5 ㎎ 단백질/g 셀룰로오스에 첨가하고; Fv51A 을 5 ㎎ 단백질/g 셀룰로오스에 첨가하였다. Fv39A, Fv30B, Fv3A, 또는 Fv3B 를 1, 2, 또는 5 ㎎ 단백질/g 셀룰로오스에 첨가하였다. 3 일 배양 후 50 ℃ 에서 200 rpm 으로 검정 플레이트를 켄칭시키고, 가용성 당에 대해 HPLC 로 분석하였다. 또다른 β-자일로시다아제 (T. reesei Bxl1) 를 사용하거나 사용하지 않고 글루코오스 또는 자일로오스 또는 아라비노오스 수율을 향상시키거나 셀로비오스 또는 자일로비오스 농도를 감소시키는 효소 및 조합을 발견하였다. 결과를 도 35A-35C 에 나타내었다.
10.2 버치우드 자일란을 사용한 후보물 엔도- 자일라나아제의 활성
후보물 엔도-자일라나아제의 활성을 하기 검정을 사용하고 기질로서 버치우드 자일란을 사용하여 평가하였다. 1% (wt/vol) 버치우드 자일란 (Sigma X0502) 저장 용액 90 마이크로리터를 96-웰 마이크로리터 플레이트에 첨가하고 50 ℃ 에서 10 분 동안 예비-배양시켰다. 효소 희석액 및 자일로오스 표준 (10 ㎕) 를 마이크로리터 플레이트에 첨가하고, 플레이트를 50 ℃ 에서 10 분 동안 배양시켰다. 한편, DNS 용액 100 ㎕ 를 PCR 튜브에 첨가하였다. 10-분 배양 후, 효소 반응물 60 ㎕ 를 DNS 용액을 함유하는 PCR 튜브로 이동시켰다. 튜브를 95 ℃ 에서 5 분 동안 서모사이클에서 배양시킨 후 4 ℃ 로 냉각시켰다. 반응 혼합물 100 마이크로리터를 96-웰 플레이트로 이동시키고, 540 ㎚ 에서 흡광도를 측정하였다. 자일로오스 표준 곡선을 생성하고 활성을 계산하는데 사용하였다. 하나의 자일라나아제 단위는 검정 조건 하에 1 분당 당 동등물을 환원시켜 자일로오스 1μmole 을 생성하는데 필요로 되는 효소의 양으로서 정의된다. 결과를 표 3 에 나타내었다.
10.3 당화된 옥수수속대로부터의 아라비노자일란 올리고머의 효소 가수분해
본 연구에서, 셀룰라아제 및 헤미셀룰라아제 제제를 사용한 희석 암모니아로 전처리된 옥수수속대의 소화 후 잔류된 아라비노자일란 올리고머의 효소 가수분해를 관찰하였다. 미정제 올리고머의 제제는 실시예 1 에 기재되어 있다. 전체 올리고머 당을 밀봉된 바이알에서 120 ℃ 에서 30 분 동안 2% (v/v) 황산을 사용하는 미정제 올리고머의 산 가수분해 후 HPLC (실시예 1 참조) 에 의해 결정하였다. 동일과 과정에 의해 처리되는 공지된 당 혼합물의 대조군 샘플에 의해 결정되는 바와 같이 당 농도를 소량의 당 분해를 위해 보정하였다. 이러한 방법에 의해 결정되는 미정제 올리고머 제제에서의 전체 당의 농도는 45 g/L 글루코오스, 168 g/L 자일로오스, 및 46 g/L 아라비노오스이었다. 산 가수분해 이전의 미정제 올리고머에 존재하는 단량체 당의 계산시 86 % 의 글루코오스, 90 % 의 자일로오스, 및 43 % 의 아라비노오스가 미정제 올리고머 형태에 존재하였다. 다양한 β-자일로시다아제, 아라비노푸라노시다아제, 및 이의 혼합물이 미정제 올리고머 제제로부터의 아라비노오스 단량체의 증가된 전환을 위해 시험되었다. 미정제 올리고머 제제를 50 mM 아세트산나트륨 완충액, pH 5.0 중의 12 g/L 올리고머로 20-배 희석시켰고, 마개를 닫은 1.5 ㎖ 에펀돌프 튜브에서의 가열 블록에서 50 ℃ 로 유지시켰다. 효소를 0.06-0.09 g/L 의 최종 농도로 첨가하였고, 24 시간 동안 배양시켜 완료하였다. 이후 실시예 1 에 기재된 바와 같이 단량체 당의 HPLC 분석을 위해 샘플을 제거하였다. 결과를 산 가수분해에 의해 결정된 바와 같이 전체 당에 기초한 단량체 당에 대한 % 전환율로서 표 4 에 열거하였다.
미정제 올리고머 믹스 내에 잔류된 아라비노자일란 올리고머로부터 아라비노오스의 최고 수율 (44-71 %) 을 얻기 위해 표 4 의 데이터는 Fv3A+Fv51A, Fv3A+Fv43B, 및 Fv43A+Fv43B 의 이원적 조합이 최고의 결과를 제공한다는 것을 나타내었다. 인공적 기질에 대한 서열 패밀리 및 활성으로부터, Fv3A 는 β-자일로시다아제이고 Fv51A 는 L-α-아라비노푸라노시다아제이라는 것이 추론된다.
옥수수속대로부터의 아라비노자일란 내의 아라비노오스 당은 아라비노오스 당의 2 및 3 탄소 위치 모두에서 자일로오스에 대개 연결된다. 따라서 Fv3A 의 활성은 자일(1-2)아라 연결을 가수분해하기 용이하기, 이는 이후 L-α-아라비노푸라노시다아제에 의한 가수분해에 아라(1-3) 자일 연결을 이용할 수 있게 한다. 시험된 β-자일로시다아제 중에서 Fv3A 및 Fv43A 만 이러한 활성을 갖는 것으로 나타냈다. 또한 이러한 검사에서 후사리움 버티실리오이드로부터의 패밀리 43 멤버 중 Fv43B 만 L-α-아라비노푸라노시다아제 활성을 갖는 것으로 나타났다.
11. 실시예 5: 효과적인 옥수수속대 가수분해를 위한 β- 자일로시다아제의 기질 범위
본 실시예에서 3 β-자일로시다아제의 기질 범위 및 단량체 당으로의 옥수수속대 자일로올리고머의 효과적인 전환에 대한 이의 관계를 결정하였다. 올리고머 당을 함유하는 옥수수속대 가수분해물의 제조 및 단량체 당의 검정을 실시예 1 에 기술된 바와 같이 수행하였다. 바이오-겔 P2 (Bio-Gel P2) 에 대한 크기배제 크로마토그래피에 의해 분리된 바와 같은 2 초과의 중합도를 갖는 올리고머 당의 양자 NMR 스펙트럼이 결정되었다 (도 36 및 도 37). 효소 처리 이전의 올리고머의 스펙트럼을 도 36 의 하부 판넬에 "MD07 올리고머" 로 표식하고, 효소 처리 후의 분획을 함유하는 동일한 올리고의 스펙트럼을 도 36 및 도 37 의 잔여 판넬 중에 효소 처리로 표식하였다.
DP2 (5-10 ㎎) 초과의 올리고머를 함유하는 바이오-겔 P2 분획을 동결 건조시킨 후, 내부 표준으로서 2,2-디메틸-2-실라펜탄-5-술포네이트 (DSS) 0.5 mM 를 함유하는 D2O 용액 0.7 ㎖ 중에 용해시켰다. 잔여 물 피크의 억제를 최적화하기 위해 NMR 샘플에 대해 분액 0.55 ㎖ 를 사용하였다. 이종핵 실험에 대해 13C 스펙트럼폭의 최적화를 갖는 Varian 2D correlation pulse sequence 의 표준판을 사용하였다. 500 MHz 에서 작동하는 고감도 저온 탐침을 사용하여 Varian Unity Inova 에서 스펙트럼을 얻었다. 각각의 당 잔기에 대한 스핀-계를 특징으로 하는 상관 관계를 확인한 후 내부-글리코시드 상관 관계를 확인하여 구조 분석을 수행하였다.
NMR 에 의해 결정된 바와 같이 올리고머를 함유하는 아라비노오스는 아라비노오스가 중합체 분획 내의 자일로오스 잔기에 β-1→3 연결되는 하나 이상의 분지형 구조에 의해 좌우되었다. 생성된 분지에서의 아라비노오스 잔기는 아라비노오스에 β-1→2 연결되는 자일로오스 잔기에 의해 추가로 치환된다. T. reesei Bxl1 은 스펙트럼에서 5.5 내지 5.55 ppm 에서의 잔류된 신호에 의해 입증되는 바와 같이 아라비노오스 결합에 대한 자일로오스 1→2 를 가장 잘 분리시키는데 있어 매우 효과적이지 않다. 긴 사슬 자일로오스 올리고머에 대해 효과적인 Fv43A 및 Fv43B L-α-아라비노푸라노시다아제의 조합은 5.5 ppm 범위에서의 신호를 갖는 분지형 종을 전부는 아니지만 대부분 제거하고, T. reesei Bxl1 를 사용한 처리와 다르게 자일로오스 올리고머에 대해 분지화된 잔류된 아라비노오스에 기인하는 5.35 에서의 어떠한 신호도 남기지 않았다.
Fv51A 단독 또는 Fv3A 과의 조합으로 처리된 후의 잔류된 자일로-올리고머의 스펙트럼의 아노머 양자 영역은 상이한 결과를 나타내었다. L-α-아라비노푸라노시다아제 단독은 상기 영역의 신호의 복잡성을 감소시키는데 효과적이지 않다. Fv3A β-자일로시다아제는 대부분 단순 연결된 아라비노오스 1→3 자일로오스 올리고머 구조가 남겨진 아라비노오스 분지와 마주하는 모든 자일로오스를 필수적으로 제거한다. β-자일로시다아제에 대한 L-α-아라비노푸라노시다아제의 첨가는 환원 당의 α 및 β 아노머 양자로부터의 신호의 증가에 의해 입증되는 바와 같이 단량체 당으로의 거의 완전한 전환을 야기하였다.
따라서 다른 것에 대한 하나의 β-자일로시다아제의 증가된 효과는 기질로서 허용되는 아글리콘의 구조적 복잡성의 의미에서의 기질 범위에 기인한 것일 수 있는 것으로 결론을 내릴 수 있다.
12. 실시예 6: GH3A β- 자일로시다아제에서 기질 범위의 결정에 있어서의 서열 비교 및 주요 잔기
도 38 의 정렬에 나타난 바와 같이 T. reesei β-자일로시다아제 (Bxl1) 은 F. 버티실리오이드 오르토로그 (Fv3A) 와 61 % 유사하고, 42 % 서열 일치성을 공유한다. Fv3A 은 Bxl1 보다 넓은 기질 범위를 갖고, 이는 2 개의 단백질 중 비-전환된 아미노산에 기인한 것일 수 있다.
13. 실시예 7: 단량체 당으로의 옥수수속대 가수분해를 위한 정의된 헤미셀룰라아제 활성의 결정
실시예 1 에 기재된 바와 같이 전처리된 옥수수속대를 물 중 H2SO4 를 사용하여 약 pH 5 로 조절된 물 슬러리로서 건조 옥수수속대 18.6 g/전체 슬러리 100 g 으로 사용하였다. 슬러리 0.78 g 을 4 ㎖ 유리 바이알에 첨가하였고, 충분한 pH 5.0, 50 mM 아세트산나트륨 완충액을 첨가하여 원하는 효소 첨가 후에 총 반응 중량 1.06 g 을 얻었다. 헤미셀룰라아제를 실시예 1 에 기재된 정제된 제제로서 첨가하였다. 쿼드 (quad) 결실된 T. reesei 균주 (표 5 및 표 6 에서의 쿼드) 로부터의 상청액은 4 주요 셀룰라아제 활성이 결실된 T. reesei 균주에 의해 발현된 백그라운드 단백질의 농축물이다 (WO 05/001036 에 기재됨). 엑셀러라아제® 1000 은 높은 β-글루코시다아제 활성을 갖는 전체 셀룰라아제 혼합물이다. 바이알은 48℃ 에서 72 시간 동안 오비탈 쉐이커에서 230 rpm 으로 배양되었고, 이후 물 2 ㎖ 를 첨가하였다. 서브-샘플을 취하여 추가로 희석시키고, 원심 분리시키고 실시예 1 에 기재된 바와 같이 단량체 당에 대한 HPLC 분석을 위해 여과시켰다. 전처리된 옥수수속대를 단량체 당으로 가수분해하기 위해 정의된 헤미셀룰라아제 활성의 유용한 양을 정의하는 실험 결과를 표 5 에 나타내었다.
실험 계획 (DoE) 으로부터의 결과를 표면 모델에 적용하고, 시험된 2 개의 전체 단백질 농도에서의 글루코오스, 자일로오스 및 아라비노오스의 최고 수율을 위한 7 개의 효소 성분의 최상의 비를 결정하기 위해 사용하였다. 7 개의 효소 성분에 대한 비의 결과를 표 6 에 나타내었다.
Fv3A 및 또한 Fv43D 를 포함하고 낮은 수준에서의 활성 상수를 유지하여, 비의 또다른 조사 (표 7) 를 수행하였다. 반응을 설정하고 반응 조건을 전체 DoE 실험에 대해 기재한 것과 동일하게 하였다.
반응물 (수행 번호) 20, 21 및 22 는 전체 셀룰라아제 효소 믹스만을 함유하고, 21 ㎎/g 의 글루칸의 양에서 속대에 존재하는 글루코오스 약 48 % 및 자일로오스 24 % 를 단량체화시켰다. 엔도자일라나아제, 트리코더마 레세이 Xyn3 의 첨가는 한편 거의 동일한 글루코오스 단량체 수율을 유지시키면서 전체 셀룰라아제 단백질 양의 감소를 가능하게 하였고 약 40 % 로 자일로오스 단량체 수율 (수행# 1) 을 증가시켰다. 약 40 % 의 아라비노오스 수율을 나타내는 모든 조합은 Fv43D, Fv43A 및 Fv43B 또는 Fv51A 의 조합 또는 Fv3A 및 Fv51A 또는 Fv43B 의 조합을 필요로 한다. 이러한 조합은 또한 단량체 당으로의 자일렌의 최고의 방출을 갖는 경향이 있다.
필요로 되는 헤미셀루라아제의 믹스를 정제하기 위한 또다른 일련의 반응을 전체 셀룰라아제 상수의 양 및 엔도자일라나아제 상수의 양을 모두 고정하여 수행하였다. 엑셀러라아제® 1000 전체 셀룰라아제 제제를 12 ㎎/g 글루칸으로 상수를 고정하고, 정제되는 T. reesei Xyn3 엔도자일라나아제를 6 ㎎/g 자일란으로 고정하였다. Fv51A 는 상이한 투여량에서의 혼합물 중의 L-α-아라비노푸라노시다아제 단독이였다. 다른 반응 조건을 동일하게 유지하는 한편 가수분해물을 실시예 1 에 기재된 바와 같이 크기배제 크로마토그래피에 의해 분석하였다. 개개의 당의 정량을 피크 면적으로만 수행하였고, 결과를 표 8 에 나타내었다.
모든 조합은 유사한 양의 글루코오스 및 대략 동일한 양의 전체 가용성 자일로오스를 방출하였다. 단량체 자일로오스의 감소도는 처리에 의해 변화되었다. 올리고머를 단량체로 전환시키기 위한 추가된 활성 없이도 적어도 β-자일로시다아제를 첨가하지 않는 이상 약 50 % 의 가용성화된 자일로오스가 올리고머로 유지되었다. 2 ㎎ Fv3A 단백질/g 자일란에서의 Fv3A 는 3.6 ㎎/㎖ 이하로 DP2 올리고머를 감소시켰다. 2 ㎎ Fv51A 단백질/g 자일란 및 2 ㎎ Fv3A 단백질/g 자일란의 첨가는 1.5 ㎎/㎖ 이하로 DP2 올리고머를 추가로 감소시켰다. 필요로 되는 2 ㎎/g Fv3A 가 존재하는 경우 약 2 ㎎ 의 Fv51A/g 자일란은 DP2 올리고머를 최소한으로 감소시키기에 충분한 것으로 나타났다 (표 8).
6 ㎎/g 자일란 T. reesei Xyn3, 2 ㎎/g Fv3A 및 1 또는 2 ㎎/g Fv51A 의 믹스는 단량체 당에 대해 총 속대 아라비노자일란을 감소시키기에 적합한 양이다. 믹스로의 Fv43D 의 첨가는 단량체로 자일로비오스 또는 다른 DP2 올리고머를 취하는데 도움이 된다. 단량체로의 아라비노오스 가수분해는 본 실험에서 측정하지 않았다.
14. 실시예 8: 옥수수속대로부터 단량체 당의 생산시의 헤미셀룰라아제의 효과
본 실시예에서는 희석된 암모니아로 전처리된 옥수수속대에 대해 단독으로 작용하는 경우에서 단량체 자일로오스 및 아라비노오스 당의 생산시의 일련의 정제된 헤미셀룰라아제 활성의 효과를 입증하였다. 정제된 헤미셀룰라아제의 3 개의 혼합물 (믹스 A, B, & C) 을 제조하고, 실시예 1 과 같이 준비되고 실시예 1 에 기재된 바와 같은 조건에서 수행된 14 % 고체 반응물 총 1 g 중의 전처리된 속대에서의 헤미셀룰루오스를 가수분해시키는데 사용하였다. 단량체 당을 72 시간의 반응 후 실시예 1 에 기재된 바와 같이 HPLC 로 분석하였고, 수득된 양을 표 9 에 나타내었다.
Figure pct00052
믹스 A: 6 ㎎ 트리코더마 레세이 Xyn3; 4 ㎎ Fv3A; 1 ㎎ Fv51A/g 자일란
Figure pct00053
믹스 B: 6 ㎎ 트리코더마 레세이 Xyn3; 1 ㎎ Fv43D; 3 ㎎ Fv43A; 3 ㎎ Fv43B/g 자일란
Figure pct00054
믹스 C: 6 ㎎ 트리코더마 레세이 Xyn3; 3 ㎎ Fv3A; 1 ㎎ Fv43D; 1 ㎎ Fv51A/g 자일란
본 실험에서는 정의된 헤미셀룰라아제가 셀룰로오스를 가용성화시키는 활성을 포함하는 초기 실험에서 보여진 것보다 단량체 당을 더 적게 산출시켰다. 수율은 여전히 전체 셀룰라아제 제제에 대한 엔도자일라나아제-단독 첨가에서 보여지는 것보다 더 높았다. 헤미셀룰라아제 활성은 단량체로 자일란을 취하는데 효과적이다.
동일한 일련의 혼합물을 실시예 1 에 따른 일반 방법에서의 과정을 사용하여 옥수수속대, 수수로부터의 전체 짚, 스위치그래스 및 사탕수수 바가스로부터 제조된 헤미셀룰로오스 제제에 대해 사용하였다. pH 5.0 아세트산나트륨 완충액 50 mM 중 100 ㎎/㎖ 으로 각각의 헤미셀룰로오스 제제의 저장 현탁액을 제조하였고, pH 를 체크하였다. 이들 각각을 50 mM 초과의 아세테이트 완충액을 사용하여 ㎖ 당 10 ㎎ 제제로 희석시켰다. 각각의 효소 혼합물의 분액을 10 ㎎/㎖ 현탁액 100 ㎕ 에 첨가하였고 반응을 반복하여 수행하였고, 교반하면서 48 ℃ 에서 6 시간 동안 배양시켰다. 반응물을 물 100 ㎕ 로 희석시키고, 원심 분리시키고, 실시예 1 에 기재된 바와 같이 단량체 당에 대한 HPLC 분석 전에 여과시켰다. 각각의 헤미셀룰로오스 현탁액 200 ㎕ 를 0.8 N H2SO4 200 ㎕ 로 희석시키고, 액체 순환하며 121 ℃ 에서 30 분 동안 오토클레이브로 처리한 후 여과시키고, 당을 실시예 1 에 기재된 바에 따라 HPLC 로 분석하였다. 표 10 에 나타난 결과는 반응에서 존재하는 산 가수분해가 가능한 당의 퍼센트로서 효소 혼합물에 의해 방출되는 평균 단량체 당으로 보고된 것이다.
믹스 A 및 C 는 전체 전처리된 속대에 대한 다른 실험에서 보여지는 바와 같이 속대로부터의 헤미셀룰로오스에 대해 잘 수행되었다. Fv3A 를 함유하는 혼합물은 단량체로의 아라비노오스의 전환을 증가시키고 단량체로의 자일로오스의 전환에서 다소 유리한 점을 제공한다. 모든 3 개의 혼합물은 다른 외떡잎 식물로부터 정제된 헤미셀룰로오스에 대해 잘 작용하였다. 하나의 엔도자일라나아제, 하나 또는 두 개의 β-자일로시다아제의 혼합 (이 둘 중 하나는 β-1→4 연결된 둘 또는 세 개의 자일로오스 단위 및 L α-아라비노푸라노시다아제보다 우수한 기질 특이성을 갖음) 은 외떡잎 식물 헤미셀룰로오스에 대해 효과적인 헤미셀룰라아제 배합물을 생성한다.
15. 실시예 9: 트리코더마 레세이 의 통합된 발현 균주의 구성
트리코더마 레세이의 통합된 발현 균주는 동시-발현된 5 개의 유전자를 구성하였다: T. reesei β- 글루코시다아제 유전자 bgl1, T. reesei 엔도자일라나아제 유전자 xyn3 , F. 버티실리오이드 β- 자일로시다아제 유전자 fv3A, F. 버티실리오이드 β- 자일로시다아제 유전자 fv43D , 및 F. 버티실리오이드 α- 아라비노푸라노시다아제 유전자 fv51A .
이러한 상이한 유전자에 대한 발현 카세트의 구성 및 T. reesei 균주의 전환을 하기에 기재하였다.
15.1 β- 글루코시다아제 발현 카세트의 구성
자연 T. reesei β- 글루코시다아제 유전자 bgl1 의 N-말단부는 DNA 2.0 (Menlo Park, USA) 에 의해 최적화된 코돈이었다. 이러한 합성된 부분은 코딩된 영역의 제 1 의 447 염기를 포함하였다. 이러한 분획을 프라이머 SK943 및 SK941 을 사용하여 PCR 증폭시켰다. 자연 bgl1 유전자의 잔여 영역을 프라이머 SK940 및 SK942 을 사용하여 T. reesei 균주로부터 추출한 게놈 DNA 샘플로부터 PCR 증폭시켰다.
bgl1 유전자의 이들 2 개의 PCR 단편을 하기 프라이머 SK943 및 SK942 를 사용하여 융합 PCR 반응으로 함께 융합시켰다:
Figure pct00055
수득된 융합 PCR 단편을 Gateway® 엔트리 벡터 pENTR™/D-TOPO® 에 삽입하여 클로닝하고, E. coli One Shot ® TOP10 화학적 적격 세포 (Invitrogen) 를 형질전환시켜, 중간 벡터인 pENTRY-943/942 (도 39) 를 수득했다. 삽입된 DNA 의 뉴클레오티드 서열을 확인했다. 정확한 bgl1 서열이 포함된 pENTRY-943/942 벡터를 Invitrogen 에 의해 개요가 서술된 LR 클로나아제® 반응 프로토콜을 사용하여 pTrex3g 와 재조합했다. LR 클로나아제 반응 혼합물로 E. coli One Shot ® TOP10 화학적 적격 세포 (Invitrogen) 를 형질전환시켜, 최종 발현 벡터인 pTrex3g 943/942 를 수득했다 (도 40). 벡터는 티.레세이의 형질전환용 선별가능마커로서 아세타미다아제를 인코딩하는 아스퍼길러스 니둘란스 amdS 유전자를 또한 함유한다. 발현 카세트를 프라이머 SK745 및 SK771 로 PCR 증폭시켜, WO 08153712 에 기재된 전기천공법을 사용하는 균주의 형질전환용 생성물을 생성했다.
Figure pct00056
15.2 엔도자일라나아제 발현 카세트의 구축
자연 티.레세이 엔도자일라나아제 유전자 xyn3 을 티.레세이로부터 추출된 게놈 DNA 샘플로부터 하기 프라이머 xyn3F-2 및 xyn3R-2 를 사용하여 PCR 증폭시켰다.
Figure pct00057
수득된 PCR 단편을 Gateway® 엔트리 벡터 pENTR™/D-TOPO® 에 삽입하여 클로닝하고, E. coli One Shot ® TOP10 화학적 적격 세포 (Invitrogen) 를 형질전환시켜, 중간 벡터인 pENTR/Xyn3 (도 41) 을 수득했다. 삽입된 DNA 의 뉴클레오티드 서열을 확인했다. Invitrogen 에 의해 개요가 서술된 LR 클로나아제® 반응 프로토콜을 사용하여 정확한 xyn3 서열이 포함된 pENTR/Xyn3 벡터를 pTrex3g 와 재조합했다. LR 클로나아제 반응 혼합물을 E. coli One Shot ® TOP10 화학적 적격 세포 (Invitrogen) 를 형질전환시켜, 최종 발현 벡터인 pTrex3g/Xyn3 (도 42) 을 수득했다. 벡터는 티.레세이의 형질전환용 선별가능 마커로서 아세타미다아제를 인코딩하는 아스퍼길러스 니둘란스 amdS 유전자를 또한 함유한다. 발현 카세트를 프라이머 SK745 및 SK822 로 PCR 증폭시켜, 전기천공법을 사용하는 균주의 형질전환용 생성물을 생성했다.
Figure pct00058
15.3 β- 자일로시다아제 Fv3A 발현 카세트의 구축
에프. 버티실로이데스 β-자일로시다아제 fv3A 유전자를 에프. 버티실로이데스 게놈 DNA 샘플로부터 하기 프라이머 MH124 및 MH125 를 사용하여 증폭시켰다.
Figure pct00059
PCR 단편을 Gateway® 엔트리 벡터 pENTR™/D-TOPO® 에 삽입하여 클로닝하고 E. coli One Shot ® TOP10 화학적 적격 세포 (Invitrogen) 를 형질전환시켜, 중간 벡터인 pENTR-Fv3A (도 43) 을 수득했다. 삽입된 DNA 의 뉴클레오티드 서열을 확인했다. Invitrogen 에 의해 개요가 서술된 LR 클로나아제® 반응 프로토콜을 사용하여 정확한 fv3A 서열이 포함된 pENTRY-Fv3A 벡터를 pTrex6g 와 재조합했다. LR 클로나아제 반응 혼합물로 E. coli One Shot ® TOP10 화학적 적격 세포 (Invitrogen) 를 형질전환시켜, 최종 발현 벡터인 pTrex6g/Fv3A (도 44) 을 수득했다. 벡터는 alsR 로 표기되는 자연 티.레세이 아세토락테이트 신타아제 (als) 유전자의 클로리무론 에틸 내성 돌연변이체를 또한 함유하며, 이는 티.레세이의 형질전환용 선별가능 마커로서 이의 자연 프로모터 및 터미네이터와 함께 사용된다 (WO2008/039370 A1). 발현 카세트를 프라이머 SK1334, SK1335 및 SK1299 로 PCR 증폭시켜, 전기천공법을 사용하는 티.레세이의 형질전환용 생성물을 생성했다 (참고, 예를 들어, WO2008153712 A2).
Figure pct00060
15.4 β- 자일로시다아제 Fv43D 발현 카세트의 구축
에프. 버티실로이데스 β-자일로시다아제 Fv43D 발현 카세트의 구축을 위해, fv43D 유전자 생성물을 에프. 버티실로이데스 게놈 DNA 로부터 프라이머 SK1322 및 SK1297 을 사용하여 증폭시켰다. 엔도글루카나아제 유전자 egl1 의 프로모터 영역을 균주 RL-P37 로부터 추출된 티.레세이 게놈 DNA 로부터 프라이머 SK1236 및 SK1321 을 사용하여 PCR 증폭시켰다. 이들 2 개의 PCR 증폭된 DNA 단편을 프라이머 SK1236 및 SK1297 을 사용하여 융합 PCR 반응으로 함께 융합시켰다. 수득된 융합 PCR 단편을 pCR-Blunt II-TOPO 벡터 (Invitrogen) 에 삽입하여 클로닝하여 플라스미드 TOPO Blunt/Pegl1-Fv43D (도 45) 를 수득하고, 이러한 플라스미드를 사용하여 E. coli One Shot ® TOP10 화학적 적격 세포 (Invitrogen) 를 형질전환시켰다. 플라스미드 DNA 를 수 개의 이.콜라이 클론으로부터 추출하고, 제한 소화에 의해 확인했다.
Figure pct00061
발현 카세트를 TOPO Blunt/Pegl1-Fv43D 로부터 프라이머 SK1236 및 SK1297 로 PCR 증폭시켜, WO2008153712A2 에 기재된 전기천공법을 사용하는 티.레세이의 형질전환용 생성물을 생성했다.
15.5 α- 아라비노푸라노시다아제 발현 카세트의 구축
에프. 버티실로이데스 α-아라비노푸라노시다아제 유전자 fv51A 발현 카세트의 구축을 위해, 에프. 버티실로이데스 게놈 DNA 로부터 fv51A 유전자 생성물을 프라이머 SK1159 및 SK1289 를 사용하여 증폭시켰다. 엔도글루카나아제 유전자 egl1 의 프로모터 영역을 균주 RL-P37 로부터 추출된 티.레세이 게놈 DNA 샘플로부터 프라이머 SK1236 및 SK1262 를 사용하여 PCR 증폭시켰다. 이어서 이들 2 개의 PCR 증폭된 DNA 단편을 프라이머 SK1236 및 SK1289 를 사용하여 융합 PCR 반응으로 함께 융합시켰다. 수득된 융합 PCR 단편을 pCR-Blunt II-TOPO 벡터 (Invitrogen) 에 삽입하여 클로닝하여 플라스미드 TOPO Blunt/Pegl1-Fv51A (도 46) 를 수득하고, 이러한 플라스미드를 사용하여 E. coli One Shot ® TOP10 화학적 적격 세포 (Invitrogen) 를 형질전환시켰다.
Figure pct00062
발현 카세트를 하기 프라이머 SK1298 및 SK1289 로 PCR 증폭시켜, 전기천공법을 사용하는 티.레세이의 형질전환용 생성물을 생성했다.
Figure pct00063
15.6 β- 글루코시다아제 및 엔도자일라나아제 발현 카세트에 의한 티. 레세이 의 동시-형질전환
RL-P37 (Sheir-Neiss, G et al . Appl. Microbiol. Biotechnol. 1984, 20:46-53) 로부터 유래되고 높은 셀룰라아제 생성에 대해 선별된 트리코더마 레세이 돌연변이체 균주를 PEG-매개되는 형질전환 (Penttila, M et al . Gene 1987, 61(2):155-64) 을 사용하여 β-글루코시다아제 발현 카세트 (cbh1 프로모터, 티.레세이 β-글루코시다아제1 유전자, cbh1 터미네이터, 및 amdS 마커), 및 엔도자일라나아제 발현 카세트 (cbh1 프로모터, 티.레세이 xyn3, 및 cbh1 터미네이터) 로 동시-형질전환시켰다. 수많은 형질전환체를 단리하고 β-글루코시다아제 및 엔도자일라나아제 생성에 대해 검사했다. 티.레세이 균주 #229 로 호칭되는 하나의 형질전환체를 다른 발현 카세트에 의한 형질전환에 사용했다.
15.7 2 개의 β- 자일로시다아제 및 α- 아라비노푸라노시다아제 발현 카세트에 의한 티. 레세이 균주 # 229 의 동시-형질전환
티.레세이 균주 #229 를 전기천공법을 사용하여 β-자일로시다아제 fv3A 발현 카세트 (cbh1 프로모터, fv3A 유전자, cbh1 터미네이터, 및 alsR 마커), β-자일로시다아제 fv43D 발현 카세트 (egl1 프로모터, fv43D 유전자, 자연 fv43D 터미네이터), 및 fv51A α-아라비노푸라노시다아제 발현 카세트 (egl1 프로모터, fv51A 유전자, fv51A 자연 터미네이터) 로 동시-형질전환시켰다. 형질전환체를 클로리무론 에틸 (80 ppm) 을 함유하는 보겔스 아가 플레이트 상에서 선별했다. 보겔스 아가를 1 ℓ 당 하기와 같이 제조했다.
50× 보겔스 원액 (하기) 20 ㎖
BBL 아가 20 g
탈염 H2O, 멸균 후 첨가 980 ㎖ 까지
50% 글루코오스 20 ㎖
50× 보겔스 원액 (WO 2005/001036), 1 ℓ 당:
750 ㎖ 탈염 H2O 에, 하기를 연속적으로 용해시킨다:
Na3시트레이트*2H2O 125.00 g
KH2PO4 (무수) 250.00 g
NH4NO3 (무수) 100 g
MgSO4*7H2O 10.00 g
CaCl2*2H2O 5.00 g
보겔스 미량 원소 용액 5.0 ㎖
보겔스 비오틴 용액 2.5 ㎖
탈염 H2O 1 ℓ 까지
수많은 형질전환체를 단리하고 β-자일로시다아제 및 L-α-아라비노푸라노시다아제 생성에 대해 검사했다. 형질전환체를 실시예 1 에 기재된 cob 당화 검정에 따라 바이오매스 전환 능력에 대해서도 스크리닝했다. 본원에 기재된 티.레세이 통합된 발현 균주의 예는 H3A, 39A, A10A, 11A, 및 G9A 이며, 이들은 티.레세이 베타-글루코시다아제 1, 티.레세이 Xyn3, Fv3A, Fv51A, 및 Fv43D 에 대한 유전자 모두를 상이한 비율로 발현한다 (표 11). 본원에 기재된 티.레세이 통합된 발현 균주의 예는 44A, 69A, G6A 및 102 를 또한 포함하고, 이들 각각은 티.레세이 베타-글루코시다아제 1, 티.레세이 XYN3, Fv3A, Fv51A, 및 Fv43D 에 대한 유전자의 대부분을 포함하고 상이한 비율로 발현한다. 균주 44A 는 과발현된 티.레세이 XYN3 을 결여하고; 균주 69A 는 Fv51A 를 결여하고 (웨스턴 블롯에 의해 확인됨, 제시되지 않음); 균주 G6A 및 102 는 Fv3A 를 결여하고 (표 11), 이는 HPLC 단백질 분석 (실시예 1) 에 의해 확인된다.
16. 실시예 10: 암모니아 전처리된 옥수수속대에 대한 티. 레세이 통합된 발현 균주의 당화 능력
희석 암모니아 전처리된 옥수수속대에 대한 티.레세이 통합된 발현 균주에 의해 생성되는 효소 조성물의 당화 능력을 평가했다. 티.레세이 효소 샘플을 초여과 농축물 (UFC) (들)로서 생성했다. UFC 의 생성을 위해, Millipore 10 kD 분자량 컷오프 막을 통한 막-초여과를 사용하여 농축되는 원심분리에 의해 세포 분리하여 티.레세이 발효 브로쓰 (14 ℓ-규모) 를 수득했다. 그 후 pH 를 4.8 로 조정했다. 그 후 세포-분리된 브로쓰를 FW6 부흐너 여과를 사용하는 여과에 의해 정제했다. 각각의 효소 샘플을 변형된 뷰렛 방법을 사용하여 총 단백질 농도에 대해 검정했다.
당화 능력을 바이알 또는 진탕 플라스크 내에서 평가했다. 희석 암모니아 전처리된 옥수수속대를 포함하는 20% 건조 고체 (DS) 에 대한 당화 능력에 대해 각각의 효소 제제를 검정했다 (참고, WO2006/110901). 그 후 미생물의 오염 제어를 위해, 모든 당화 반응을 황산으로 pH 5.0 으로 적정하고, 나트륨 아지드를 첨가하여 최종 농도가 0.01% (w/v) 가 되게 했다. 그 후 각각의 당화 반응에 기질 글루칸 또는 자일란 1 g 당 총 단백질 (TP) 효소 제제 20 ㎎ 을 적절히 투여했다. 엑셀러라아제® 1500 (Ac1500) 및 통합된 균주 UFC 를 20 ㎎ 총 단백질/g 글루칸으로 투여했다. 효소 배합물을 25:9:4:3:1 엑셀러라아제® 1500:Xyn3:Fv3A:Fv51A:FV43D 의 비율로 제조했다. 배합물에서, 엑셀러라아제® 1500 을 20 ㎎ 총 단백질/g 글루칸으로 투여하고, 헤미셀룰라아제를 자일란 1 g 당 (4.3 ㎎ Xyn3/g 자일란, 1.7 ㎎ Fv3A/g 자일란, 1.4 ㎎ Fv51A/g 자일란, 0.5 ㎎ Fv43D/g 자일란) 으로 투여했다. 각각의 당화 반응을 200 rpm 으로 설정된 회전 진탕기에서 50 ℃ 에서 인큐베이션한 후, 1, 2, 3 및 7 일의 당화 후 샘플링하고 10×(v/v) 희석한 후 HPLC 분석을 사용하여 단량체 당 농도를 측정했다 (구획 16.1 에서 "단량체 HPLC 분석" 구획 아래 상술됨) (도 47A, 47B). 또한, 당화 제 3 일에 각각의 반응을 샘플링하여 HPLC 분석 (구획 16.1, 도 47C) 에 의해 중량 (w/w) 에 의한 올리고머 당 농도를 측정했다. 이들 결과는 통합된 균주 H3A 및 G9A 에 의해 생성된 효소 조성물이 개별적으로 발현된 효소로부터 생성된 효소 배합물 또는 엑셀러라아제® 1500 보다 양호한 글루코오스 및 자일로오스 수율을 제공함을 보여준다.
3 가지 상이한 통합된 균주에 의해 생성된 효소 조성물의 크로마토그래피 비교가 도 47D 에 나타나 있다.
16.1 HPLC 분석
단량체 당 HPLC 분석: 각각의 샘플을 BioRad Aminex HPX-87H 이온 배제 컬럼 (300 ㎜ × 7.8 ㎜) 을 사용하는 HPLC 에 의해 분석했다. 제 1, 2, 3, 및 7 일 샘플 모두를 5 mM 황산으로 부피로 10× 희석하고, 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과한 후, HPLC 내로 주입하여 제조 시방서에 따라 실시했다.
올리고머 당 HPLC 분석 (산 가수분해): 제 3 일 당화 샘플을 Milli-Q 물로 중량에 의해 10× 희석한 후, 황산을 첨가하여 최종 농도가 4% (w/w) 가 되게 했다. 알려진 농도의 자일로오스 및 글루코오스 표준 (당 회수 표준 - "SRS") 을 또한 제조하여 상기 언급된 단량체 당 HPLC 분석 및 올리고머 당 HPLC 분석을 위해 측정했다. 그 후 올리고머 HPLC 샘플을 121 ℃ 에서 15 분 동안 오토클레이브하고, 0.2 ㎛ 필터를 통해 여과한 후, HPLC BioRad Aminex HPX-87H 이온 배재 컬럼 (300 ㎜ × 7.8 ㎜) 내로 주입하고, 제조 시방서에 따라 실시했다. 산 가수분해 후 당 회수 표준 (SRS) 의 퍼센트 보유된 자일로오스 및 글루코오스 농도에, 각각의 샘플의 산 가수분해 HPLC 후 당 농도로 곱한 후, 상기 "단량체 당 HPLC 분석" 구획에서 측정된 단량체 당 농도를 빼서, 올리고머 당 농도를 결정했다.
17. 실시예 11: 티. 레세이 통합된 발현 균주의 당화 능력를 개선시킬 수 있는 계통발생적으로 광범위한 효소 부류의 동정
이러한 실시예에서, 티.레세이 통합된 발현 균주에 의해 생성된 효소 조성물의 효능을 제한하는 효소 활성을 동정하고, 이러한 활성 제한을 보상할 수 있거나 통합된 균주 성분을 대체할 수 있는 상이한 종으로부터의 효소를 예시했다.
실시예 1 에 기재된 전처리된 옥수수속대 0.95 g 을 20 ㎖ 유리 바이알에 첨가했다. 충분한 pH 5.0, 50 mM 아세트산 나트륨 완충액 및 1 N H2SO4 를 첨가하여 22 g 건조 옥수수속대 고체/100 g 의 총 슬러리에서 총 반응 중량 3.00 g, 효소 첨가 후 pH 5.0 이 되게 했다.
통합된 균주 H3A (도 48A, 49A 및 50A) 에 의해 생성된 T. reesei 효소 조성물을, 공급재료에 조합된 글루칸 및 자일란의 g 당 총 단백질 7 mg 으로의 초여과 (즉, 세포-미함유) 농축물로서 모든 바이알에 첨가하였다. 또한, T. reesei Quad 결실 균주 (WO 05/001036 에 기재됨) 에 의해 발현된 발효 배양액 14 ℓ 로부터의 초여과 제제로서 후보 헤미셀룰라아제를 첨가하였다. 조합된 글루칸 및 자일란의 g 당 효소 단백질 0, 0.5, 1.0 또는 3.0 mg 으로 후보 헤미셀룰라아제를 첨가하였다. 헤미셀룰라아제는 하기를 포함하는 통합된 균주 자체에 의해 생성된 효소 조성물의 구성요소:
Figure pct00064
후사리움 버티실리오이드 Fv3A
Figure pct00065
후사리움 버티실리오이드 Fv51A
Figure pct00066
후사리움 버티실리오이드 Fv43D
및 상이한 균류로부터의 효소를 포함하였다:
Figure pct00067
후사리움 옥시스포럼 Fo43A
Figure pct00068
길베렐라 제아 Gz43A
Figure pct00069
페니실리움 푸니쿨로숨 Pf43A
Figure pct00070
아스퍼길러스 푸미가터스 Af43A
Figure pct00071
포도스포라 안세리나 Pa51A
Figure pct00072
페니실리움 푸니쿨로숨 Pf51A.
72 시간 동안 48 ℃ 의 오비탈 쉐이커에서 180 rpm 으로 바이알을 인큐베이션하였다. 이후 물 12 ㎖ 을 첨가하였다. 보조-샘플을 취하고 추가로 희석시키고, 원심 분리하고, 여과하여, 실시예 1 에 기재된 바와 같이 단량체 당에 대하여 HPLC 분석하였다.
도 48A 및 도 48B 에 나타낸 결과는, β-자일로시다아제 활성물 예컨대 후사리움 버티실리오이드 Fv43D 및 후사리움 옥시스포럼 Fo43A 의 첨가가 조합된 글루칸 및 자일란의 g 당 T. reesei 통합된 균주 총 단백질 7 mg 에 비례하여 단량체 자일로오스 방출을 크게 개선시킨다는 것을 증명하였다. 상당한 개선이 심지어 0.5 내지 1.0 mg/g 의 낮은 첨가에서도 관찰되었다.
도 49A 및 도 49B 에 나타낸 결과는, 모든 헤미셀룰라아제의 첨가가 심지어 조합된 글루칸 및 자일란 g 당 1-3 mg 의 헤미셀룰라아제 장입물에서 10 % 초과로, 단량체 글루코오스의 상당한 증가를 야기한다는 것을 증명한다.
도 50A 및 도 50B 에 나타낸 결과는 GH51 효소 예컨대 후사리움 버티실리오이드 Fv51A, 및 특히 포도스포라 안세린 Pa51A 및 페니실리움 푸니쿨로숨 Pfu51A 의 첨가가 단량체 아라비노오스 수준의 증가를 야기한다는 것을 증명한다.
18. 실시예 12: 셀룰라아제 및 헤미셀룰라아제 제제에 의한 다양하게 전처리된 스위치그래스의 당화
전처리된 원료 스위치그래스에 대하여, 발현된 셀룰라아제 및 헤미셀룰라아제의 당화 성능을 평가하였다. 스위치그래스의 희석 암모니아 전처리를 위한 조건 범위를 본원에 기재된 효소로 구성된 효소 칵테일에 의한 당화 성능에 대해 평가하였다. 전처리 조건은 변화하며 전처리 효율은 효소적 가수분해 성능에 영향을 준다.
가열된 모래 배쓰에 함침된 밀봉 6" x 1/2" 스테인레스 스틸 튜브에서 원료 스위치그래스의 전처리를 수행하였다. 원료 스위치그래스, 물 및 수산화암모늄 (~28% 용액) 의 슬러리를 원하는 고체 백분율 및 암모니아 백분율로 혼합한 후, 전처리 튜브에 장입하였다. 이후 튜브를 원하는 시간 동안 원하는 온도 (+/- 2 ℃) 에 둔 후, 실온으로 만들기 전에 약 1 분 동안 얼음 물에서 켄칭하였다. 전처리된 슬러리를 튜브로부터 제거하고 후드에서 하룻밤 동안 건조시켰다 (> 90% 고체를 수득할 수 있음)
이후 건조된 전처리 고체를 Accellerase
Figure pct00073
1500, Xyn 3, Fv3A, Fv51A 및 Fv43D (각각 총 단백질 25, 9, 7, 3, 1 mg/글루칸 또는 자일란 g) 를 사용하여, 10% 고체, pH 5, 50 ℃, 200 rpm 에서 당화하였다. 20 ㎖ 신틸레이션 바이알 중 총 가수 분해물 부피 5 ㎖ 을 사용하였다.
글루칸 및 자일란 수율은 원료 바이오매스로부터 이용가능한 글루칸 또는 자일란과 비교하여 방출된 단량체성 글루코오스 및 자일로오스를 기준으로 하였다. 단량체성 당 농도를 HPLC (BioRad Aminex HPX 87-H 컬럼) 로 측정하였다.
전처리 시간, 온도, 고체 백분율 및 NH3A 백분율을 당화 결과를 최적화하기 위해 넓은 범위에 걸쳐 변화시켰다. 글루칸 및 자일란 둘 모두의 수율이 ~50 % 보다 더 양호한 각각의 전처리 조건은 강한 실시제 (performer) 로 고려된다. 강하게 실시되는 전처리 매개변수는 이의 각각의 글루칸, 자일란 및 총 백분율 수율과 함께 표 12 에 열거되어 있다. 글루칸 및 자일란 전환은 원료 스위치그래스에서 이론적으로 이용가능한 글루칸 또는 자일란에 비해 당화 동안 방출된 단량체성 당을 기반으로 한다. 총 전환은 오직 글루코오스 및 자일로오스이다 (도 51).
19. 실시예 13: 셀룰라아제 및 헤미셀룰라아제 제제에 의한 전처리된 스위치그래스의 당화
상기 실시예 이외에, 통합된 균주에 의해 생성된 효소 믹스 및 효소 조성물의 당화 성능을 수 개의 기질, 전처리 및 조건에 대하여 시험하였다. 이들 실험은 효소 믹스 또는 통합된 균주 생성물을 사용하여 성능 범위를 나타낸다. 이는 기질 및 전처리 범위, pH 및 온도를 넘는 양호한 성능을 입증한다.
희석 암모니아 전처리된 스위치그래스를 WO6110901A 의 방법 및 과정 범위에 따라 제조하였다: 스위치그래스 (38.7% 글루칸, 22.2% 자일란, 2.5% 아라비난, 23.2% 리그닌) 를 1 mm 스크린을 통과하도록 해머밀 (hammer-mill) 한 후, 6% NH3A (중량/중량 DM, NH4OH 로서 첨가됨) 로 90 분 동안 160 ℃ 에서 전처리하였다. 이러한 전처리된 기질을, 엑셀러라아제® 1500, Multifect® 자일라나아제 (Danisco A/S, Genencor Division, Palo Alto, CA 의 모든 시판되는 제품), Fv3A, Fv51A 및 Fv43D 를 15 % 고체로 50 g 의 총 반응 질량으로 함유하는 효소 믹스로 처리하였다. 시판되는 제품의 총 단백질 (TP) 을 뷰렛 검정으로 측정하였다. 다른 효소는 TCA-침전성 단백질의 총 질소 분석에 의해 측정된 TP 를 갖는, T. reesei 의 셀룰라아제 4-결실된 균주에서의 발현에 따른 초여과 농축물 (UFC) 였다. 모든 반응물에 25 mg TP/g 글루칸의 엑셀러라아제® 1500 및 9 mg TP/g 자일란의 Multifect® 자일라나아제 (MF Xyl) 을 투여하였고, Fv3A, Fv51A 및 Fv43D 를 도 56A-56B 에 나타낸 바와 같이 각각 3.6 mg TP/g 자일란, 3.0 mg TP/g 자일란 및 1.0 mg TP/g 자일란으로 첨가하였다. 모든 효소를 전처리 전의 스위치그래스의 출발 카르보하이드레이트 함량에 비례하여 투여하였다. 3 일 동안 pH 5.3 에서 47 ℃ 및 33 ℃ 에서 당화 반응을 수행하였다.
33 ℃ 에서의 결과는 Fv3A, Fv51A 및 Fv43D 의 첨가가 글루칸 전환 (도 56A) 을 증가시키고 2 배 초과로 자일란 전환 (도 56B) 된다는 것을 나타낸다. 47 ℃ 에서의 결과는 Fv3A, Fv51A 및 Fv43D 의 첨가가 일부 증가된 글루칸 전환 (도 56A) 을 산출하고 2 배 초과로 자일란 전환 (도 56B) 된다는 것을 나타낸다. Fv51A 또는 Fv43D 단독으로의 첨가는 각각 특히 자일로-올리고머 또는 자일로오스 단량체로의 자일란 전환의 큰 증가를 야기한다. Fv3A 단독 첨가는 자일로오스 수율을 증가시키지만, Fv51A 과의 조합의 경우 단량체로의 자일란 전환의 큰 증가를 야기한다.
20. 통합된 T. reesei 균주에 의해 전처리된 스위치그래스의 당화
통합된 T. reesei 균주 (H3A) 에 의해 생성된 효소 조성물의 당화 성능을 WO06110901A 의 방법 및 과정 범위에 따라 제조된 희석 암모니아 전처리된 스위치그래스에 대하여 평가하였다: 스위치그래스 (37% 글루칸, 21% 자일란, 5% 아라비난, 18% 리그닌) 를 1 mm 스크린을 통과하도록 해머-밀한 후, 10.0 % (NH3) (중량/중량 DM, NH4OH 로서 첨가) 로 90 분 동안 160 ℃ 에서 전처리하였다. 똑같은 500 ㎖ 유리 에를렌마이어 (Erlenmeyer) 플라스크에서, 25% 고체의 전처리된 슬러리 50 g 을 48 ℃, pH 5.3 에서 7 일 동안 당화하고, 통합된 균주로부터의 상청액을 카르보하이드레이트 (글루칸 + 자일란) 14 mg TP/g 으로 투여하였다. H3A 의 TP 를 TCA-침전성 단백질의 총 질소 분석에 의해 측정하였다. 효소를 전처리 전에 스위치그래스의 출발 카르보하이드레이트 함량에 비례하여 투여하였다.
7 일 말에, 글루칸 전환 (52-55%, 도 57A) 및 자일란 전환 (51%-53%, 도 57B) 의 높은 수준을 HPLC 로 측정하였다. 이들 결과는 통합된 균주에 의해 생성된 효소 조성물이 높은 고체 (25% 건조 물질) 의 희석 암모니아 전처리된 스위치그래스를 당화할 수 있다는 것을 보여준다.
21. 실시예 15: 통합된 T. reesei 균주에 의한 경질목재 펄프의 당화
통합된 T reesei 균주 H3A 에 의해 생성된 효소 조성물의 당화 성능을 하기 조성물로 산업적 경질목재 미표백 펄프 (크라프트법 및 산소 탈리그닌화로부터 유래됨, Smurfit Kappa 셀룰로오스 Du Pin, Biganos, France) 에 대해 평가하였다: 글루칸 75.1 %, 자일란 19.1 %, 산 가용성 리그닌 2.2 %. 셀룰로오스 장입이 상이 (9.3-20% 에서 변화함) 하고 100 g 의 총 질량이 사용되는 것을 제외하고는, NREL 표준 검정 방법 LAP-009 "리그노셀룰로오스 바이오매스의 효소적 당화" (http://www.nrel.cov/biomass/pdfs/42629.pdf) 를 사용하여 효소적 당화 연구를 수행하였다. 실험 조건은 200 rpm 및 pH 5.0, 50 ℃ 였다. 실험 시작시에 효소를 20 mg TP/g 글루칸 (최종 건조 물질 기준) 으로 투여하였다. 액화되는 경우 샘플을 시간 간격을 두고 취한 후, 당 농도에 관하여 HPLC 로 분석하였다. 글루코오스, 자일로오스 및 셀로비오스 농도를 Waters HPLC 시스템 (Alliance system, Waters Corp., Milford, MA) 을 사용하여 측정하였다. 당 분석에 사용된 HPLC 컬럼은 BioRad (Aminex HPX-87H 이온 배제 컬럼 (300 mm x 7.8 mm), BioRad Inc., Hercules, CA) 로부터의 것이다. 모든 샘플을 5 mM 황산으로 10 회 희석하고, 0.2 ㎛ 여과기를 통해 여과한 후 HPLC 에 주입하였다. 나타낸 바와 같이 (표 13) 2 개의 실험을 "공급-배치" 방식으로 수행하였다: 시간 0 에서 7.0 % 의 초기 건조 물질 함량으로의 전처리된 경질목재 펄프 및 기질의 나머지를 최초 24 시간 동안 4 개의 동일 분획으로 불연속 시간에 첨가하여, 20% 로 장입된 최종 건조 고체를 산출하였다.
결과는 통합된 균주 H3A 에 의해 생성된 효소 조성물을 사용하여 단량체로의 높은 수준의 글루칸 및 자일란 전환 (각각 89% 및 90% 이하) 을 나타냈다. 전환은 더 높은 효소 장입 및 더 긴 당화 시간에 따라 증가하였다. 전환은 고체가 15% 일 때 보다 20% 일 때 더 낮지만, 이러한 20 % 의 더 낮은 전환은 공급-배치 방법을 사용하여 부분적으로 완화될 수 있다.
22. 실시예 16: 온도 및 pH 의 범위를 넘는 통합된 T. reesei 균주에 의한 경질목재 펄프의 당화
통합된 균주 상청액의 7% 셀룰로오스 장입 및 20 mg TP/g 글루칸 (최종 건조 물질 및 전처리된 기질의 조성물 기준) 으로 (상기 실시예에서 사용된 바와 같은) 산업적 경질목재 미표백 펄프에 대하여, 통합된 T. reesei 균주 (H3A) 에 의해 생성된 효소 조성물의 당화 성능을, 45 ℃ 내지 60 ℃ 의 온도 및 4.65 내지 5.4 의 pH (0.1 M 나트륨 시트레이트에 완충됨) 에서 시험하였다. 2 일 당화 후의 결과를 표 14 에 나타냈고, 시험된 조건의 전체 범위에 걸쳐 양호한 글루칸 및 자일란 전환을 나타냈다. 이들 결과는 pH 4.9 및 50 ℃ 와 같이 이러한 기질의 당화를 위한 최적 조건을 제안하지만, 양호한 전환은 심지어 pH 5.0, 60 ℃ 에서도 볼 수 있다. 낮은 pH (및 달리 변화되지 않은 실험 조건) 를 포함하는 50 ℃ 에서의 실험에 덧붙여, 양호한 당화는 각각 45.1 & 9.7 g/L; 50.0 & 11.4 g/L; 및 57.2 & 13.2 g/L 의 글루코오스 & 자일로오스 적정 농도로 pH 3.8, pH 4.0 및 pH 4.25 에서 볼 수 있다.
23. 실시예 17: 상이한 효소 투여량에서 통합된 균주에 의해 생성된 효소 조성물을 사용한 스팀-팽창 사탕수수 바가스의 당화
스팀-팽창된 사탕수수 바가스에 대하여 통합된 T reesei 균주 (H3A) 에 의해 생성된 효소 조성물의 당화 성능을 7% 셀룰로오스 장입에서 평가하였다. 4 분 체류 시간으로 210 psig, 200 ℃ 에서 StakeTeck 반응기에서 스팀 주입에 의하여 바가스를 전처리하였다. 전처리된 물질은 하기 조성을 가졌다: 글루칸 40.9 %, 자일란 20.8 %, 리그닌 27 %. 통합된 균주 상청액을 10, 20, 30, 50 또는 80 mg TP/g 글루칸 (최종 건조 물질 및 전처리된 기질의 조성 기준) 으로 투여하였다. 3 시간 동안 50 ℃, pH 5 에서 5 ㎖ 반응 부피로 당화를 수행하였다. 결과 (도 58A-C) 는 통합된 균주 생성물이 심지어 절반의 엑셀러라아제® 1500 투여량에서도, 글루코오스로의 글루칸 전환 (도 58A 및 도 58C), 특히 자일로오스로의 자일란 전환 (도 58B 및 도 58C) 에서 엑셀러라아제® 1500 (20 mg 단백질/g 글루칸) 을 뛰어 넘는다는 것을 나타냈다. 특히 제 1 일에, 글루칸 전환은 증가된 H3A 총 단백질 (도 58A 및 도 58C) 의 투여량과 같이 상당히 증가되는 반면, 자일란 전환은 제 1 일 로부터 제 3 일 까지의 약간의 증가와 함께 더욱 빨라지고, 심지어 가장 낮은 H3A 총단백질의 투여량 (도 58B 및 도 58C) 에서도 매우 높다.
24. 실시예 18: 다양한 효소에 의한 희석- 산 전처리된 옥수수 섬유의 당화
희석 황산 전처리된 옥수수 섬유에 대한 효소 혼합물의 당화 성능을 250 ㎖ 쉐이크 플라스크에서 평가하였다. 전형적인 실험에서, 옥수수 섬유 (최초 조성 38% C6 당 및 27% C5 당) 를 조절하여, 15% DS (건조 고체) 및 0.36 % (w/w%) 황산을 첨가하였다. 이후 옥수수 섬유 슬러리를 60 분 동안 121 ℃ 에서 오토클레이브하였다. 이후 슬러리를 6 N NaOH 를 사용하여 pH 5.0 으로 조절하였다. 전처리된 샘플의 당 함량은 21 g/ℓ 글루코오스 및 12 g/ℓ 자일로오스였다. 하기와 같이 (도 59A, 59B, 59C 에 나타낸 바와 같이) 전처리된 기질에 효소를 첨가하였다: 엑셀러라아제® 1500 (AC 1500): 20 mg TP/g 글루칸 및 45 mg TP/g 글루칸; 엑셀러라아제® 1500 + Multifect® 자일라나아제 (MF): (25 mg/g 글루칸 + 9 mg TP/g 자일란) 및 (25 mg TP/g 글루칸 + 20 mg TP/g 자일란); 엑셀러라아제
Figure pct00074
1500 + Xyn3 + Fv3A + Fv51A + Fv43D: (25 mg TP/g 글루칸 + 9 mg TP/g 자일란 + 7 mg TP/g 자일란 + 3 mg TP/g 자일란 + 1 mg TP/g 자일란) (완전 효소 "배합물"). 시판되는 제품의 총 단백질 (TP) (엑셀러라아제® 1500 및 Multifect® 자일라나아제: Danisco US Inc., Genencor) 를 뷰렛 검정으로 측정하였다. 다른 효소는 T. reesei (이미 기재된 바와 같음) 의 셀룰라아제 4-결실된 균주에서의 발현에 따른 초여과 농축물 (UFC) 이었고 - 이의 TP 는 TCA-침전성 단백질의 총 질소 분석에 의해 측정하였다. 모든 효소를 전처리 전에 옥수수 섬유의 출발 카르보하이드레이트 함량에 비례하여 투여하였다. 200 rpm 및 50 ℃ 에서 24 시간, 48 시간 및 120 시간 동안 효소적 당화를 수행하였다. 상이한 시간 간격으로 샘플을 꺼내고, 글루코오스 및 자일로오스 당의 형성에 대하여 HPLC 로 분석하였다. 조정된 당 (글루코오스 또는 자일로오스) 은 제거된 출발 당과 함께, 효소적 단계로부터 제조된 당을 반영하였다.
결과는 완전 효소 배합물이, 심지어 둘 모두가 동일한 총 단백질로 투여되는 경우에도 글루칸 전환 및 자일란 전환에서 (엑셀러라아제® 1500 + Multifect® 자일라나아제) ("AC 1500 + MF") 를 뛰어넘는다는 것을 나타낸다. 완전 효소 배합물은 당화 5 일 후에 이러한 기질의 거의 완전한 글루칸 전환을 야기한다.
25. 특정 구현예 및 참조 인용
본 출원에서 언급된 모든 공보, 특허, 특허 출원 및 기타 문헌은, 모든 목적을 위해 참조 인용되는 각각의 개별적 공보, 특허, 특허 출원 또는 기타 문헌이 개별적으로 나타나는 바와 동일한 정도로 모든 목적을 위해 그 전체로 본원에서 참조 인용된다.
다양한 특정 구현예가 설명 및 기재되지만, 다양한 변화가 본 개시(들) 의 취지 및 범주를 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있다는 것이 인식될 것이다.
SEQUENCE LISTING <110> Danisco US Inc. Bower, Benjamin Hsi, Megan Yee Kaper, Thijs Kelemen, Bradley R. Lantz, Suzanne E. Larenas, Edmund A. Mitchinson, Colin Kim, Steven Hitz, William D. Emptage, Mark Wing, Keith Dumont <120> Novel Glycosyl Hydrolase Enzymes and Uses Thereof <130> 31376WO <140> PCT/US2010/049849 <141> 2010-09-22 <150> US 61/245,273 <151> 2009-09-23 <150> US 61/289,886 <151> 2009-12-23 <160> 117 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 2358 <212> DNA <213> Fusarium verticillioides <400> 1 atgctgctca atcttcaggt cgctgccagc gctttgtcgc tttctctttt aggtggattg 60 gctgaggctg ctacgccata tacccttccg gactgtacca aaggaccttt gagcaagaat 120 ggaatctgcg atacttcgtt atctccagct aaaagagcgg ctgctctagt tgctgctctg 180 acgcccgaag agaaggtggg caatctggtc aggtaaaata tacccccccc cataatcact 240 attcggagat tggagctgac ttaacgcagc aatgcaactg gtgcaccaag aatcggactt 300 ccaaggtaca actggtggaa cgaagccctt catggcctcg ctggatctcc aggtggtcgc 360 tttgccgaca ctcctcccta cgacgcggcc acatcatttc ccatgcctct tctcatggcc 420 gctgctttcg acgatgatct gatccacgat atcggcaacg tcgtcggcac cgaagcgcgt 480 gcgttcacta acggcggttg gcgcggagtc gacttctgga cacccaacgt caaccctttt 540 aaagatcctc gctggggtcg tggctccgaa actccaggtg 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Asp Leu Ala Leu Arg Ser Ala Val Glu Gly Ala Val Leu Leu Lys Asn 385 390 395 400 Asp Gly Thr Leu Pro Leu Lys Leu Lys Lys Lys Asp Ser Val Ala Met 405 410 415 Ile Gly Phe Trp Ala Asn Asp Thr Ser Lys Leu Gln Gly Gly Tyr Ser 420 425 430 Gly Arg Ala Pro Phe Leu His Ser Pro Leu Tyr Ala Ala Glu Lys Leu 435 440 445 Gly Leu Asp Thr Asn Val Ala Trp Gly Pro Thr Leu Gln Asn Ser Ser 450 455 460 Ser His Asp Asn Trp Thr Thr Asn Ala Val Ala Ala Ala Lys Lys Ser 465 470 475 480 Asp Tyr Ile Leu Tyr Phe Gly Gly Leu Asp Ala Ser Ala Ala Gly Glu 485 490 495 Asp Arg Asp Arg Glu Asn Leu Asp Trp Pro Glu Ser Gln Leu Thr Leu 500 505 510 Leu Gln Lys Leu Ser Ser Leu Gly Lys Pro Leu Val Val Ile Gln Leu 515 520 525 Gly Asp Gln Val Asp Asp Thr Ala Leu Leu Lys Asn Lys Lys Ile Asn 530 535 540 Ser Ile Leu Trp Val Asn Tyr Pro Gly Gln Asp Gly Gly Thr Ala Val 545 550 555 560 Met Asp Leu Leu Thr Gly Arg Lys Ser Pro Ala Gly Arg Leu Pro Val 565 570 575 Thr Gln Tyr Pro Ser Lys Tyr Thr Glu Gln Ile Gly Met Thr Asp Met 580 585 590 Asp Leu Arg Pro Thr Lys Ser Leu Pro Gly Arg Thr Tyr Arg Trp Tyr 595 600 605 Ser Thr Pro Val Leu Pro Tyr Gly Phe Gly Leu His Tyr Thr Lys Phe 610 615 620 Gln Ala Lys Phe Lys Ser Asn Lys Leu Thr Phe Asp Ile Gln Lys Leu 625 630 635 640 Leu Lys Gly Cys Ser Ala Gln Tyr Ser Asp Thr Cys Ala Leu Pro Pro 645 650 655 Ile Gln Val Ser Val Lys Asn Thr Gly Arg Ile Thr Ser Asp Phe Val 660 665 670 Ser Leu Val Phe Ile Lys Ser Glu Val Gly Pro Lys Pro Tyr Pro Leu 675 680 685 Lys Thr Leu Ala Ala Tyr Gly Arg Leu His Asp Val Ala Pro Ser Ser 690 695 700 Thr Lys Asp Ile Ser Leu Glu Trp Thr Leu Asp Asn Ile Ala Arg Arg 705 710 715 720 Gly Glu Asn Gly Asp Leu Val Val Tyr Pro Gly Thr Tyr Thr Leu Leu 725 730 735 Leu Asp Glu Pro Thr Gln Ala Lys Ile Gln Val Thr Leu Thr Gly Lys 740 745 750 Lys Ala Ile Leu Asp Lys Trp Pro Gln Asp Pro Lys Ser Ala 755 760 765 <210> 3 <211> 1338 <212> DNA <213> Penicillium funiculosum <400> 3 atgcttcagc gatttgctta tattttacca ctggctctat tgagtgttgg agtgaaagcc 60 gacaacccct ttgtgcagag catctacacc gctgatccgg caccgatggt atacaatgac 120 cgcgtttatg tcttcatgga ccatgacaac accggagcta cctactacaa catgacagac 180 tggcatctgt tctcgtcagc agatatggcg aattggcaag atcatggcat tccaatgagc 240 ctggccaatt tcacctgggc caacgcgaat gcgtgggccc cgcaagtcat ccctcgcaac 300 ggccaattct acttttatgc tcctgtccga cacaacgatg gttctatggc tatcggtgtg 360 ggagtgagca gcaccatcac aggtccatac catgatgcta tcggcaaacc gctagtagag 420 aacaacgaga ttgatcccac cgtgttcatc gacgatgacg gtcaggcata cctgtactgg 480 ggaaatccag acctgtggta cgtcaaattg aaccaagata tgatatcgta cagcgggagc 540 cctactcaga ttccactcac cacggctgga tttggtactc gaacgggcaa tgctcaacgg 600 ccgaccactt ttgaagaagc tccatgggta tacaaacgca acggcatcta ctatatcgcc 660 tatgcagccg attgttgttc tgaggatatt cgctactcca cgggaaccag tgccactggt 720 ccgtggactt atcgaggcgt catcatgccg acccaaggta gcagcttcac caatcacgag 780 ggtattatcg acttccagaa caactcctac tttttctatc acaacggcgc tcttcccggc 840 ggaggcggct accaacgatc tgtatgtgtg gagcaattca aatacaatgc agatggaacc 900 attccgacga tcgaaatgac caccgccggt 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gttttgttca atggcacatg gaacaagggc 900 gaatggccca agttgcaacc agtacgaggt cgcatgcctg gaaacctcct cccaaagccg 960 acgcgaaacg ttcccggaga tgggcccttc aacgctgacc cagacaacta caacttgaag 1020 aagactaaga agatccctcc tcactttgtg caccatagag tcccaagaga cggtgccttc 1080 tctttgtctt ccaagggtct gcacatcgtg cctagtcgaa acaacgttac cggtagtgtg 1140 ttgccaggag atgagattga gctatcagga cagcgaggtc tagctttcat cggacgccgc 1200 caaactcaca ctctgttcaa atatagtgtt gatatcgact tcaagcccaa gtccgatgat 1260 caggaagctg gaatcaccgt tttccgcacg cagttcgacc atatcgatct tggcattgtt 1320 cgtcttccta caaaccaagg cagcaacaag aaatctaagc ttgccttccg attccgggcc 1380 acaggagctc agaatgttcc tgcaccgaag gtagtaccgg tccccgatgg ctgggagaag 1440 ggcgtaatca gtctacatat cgaggcagcc aacgcgacgc actacaacct tggagcttcg 1500 agccacagag gcaagactct cgacatcgcg acagcatcag caagtcttgt gagtggaggc 1560 acgggttcat ttgttggtag tttgcttgga ccttatgcta cctgcaacgg caaaggatct 1620 ggagtggaat gtcccaaggg aggtgatgtc tatgtgaccc aatggactta taagcccgtg 1680 gcacaagaga ttgatcatgg tgtttttgtg aaatcagaat tgtag 1725 <210> 12 <211> 574 <212> PRT <213> Fusarium verticillioides <400> 12 Met Arg Phe Ser Trp Leu Leu Cys Pro Leu Leu Ala Met Gly Ser Ala 1 5 10 15 Leu Pro Glu Thr Lys Thr Asp Val Ser Thr Tyr Thr Asn Pro Val Leu 20 25 30 Pro Gly Trp His Ser Asp Pro Ser Cys Ile Gln Lys Asp Gly Leu Phe 35 40 45 Leu Cys Val Thr Ser Thr Phe Ile Ser Phe Pro Gly Leu Pro Val Tyr 50 55 60 Ala Ser Arg Asp Leu Val Asn Trp Arg Leu Ile Ser His Val Trp Asn 65 70 75 80 Arg Glu Lys Gln Leu Pro Gly Ile Ser Trp Lys Thr Ala Gly Gln Gln 85 90 95 Gln Gly Met Tyr Ala Pro Thr Ile Arg Tyr His Lys Gly Thr Tyr Tyr 100 105 110 Val Ile Cys Glu Tyr Leu Gly Val Gly Asp Ile Ile Gly Val Ile Phe 115 120 125 Lys Thr Thr Asn Pro Trp Asp Glu Ser Ser Trp Ser Asp Pro Val Thr 130 135 140 Phe Lys Pro Asn His Ile Asp Pro Asp Leu Phe Trp Asp Asp Asp Gly 145 150 155 160 Lys Val Tyr Cys Ala Thr His Gly Ile Thr Leu Gln Glu Ile Asp Leu 165 170 175 Glu Thr Gly Glu Leu Ser Pro Glu Leu Asn Ile Trp Asn Gly Thr Gly 180 185 190 Gly Val 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ctgatatcat gtatggtctt 120 atgcacgagg tatgtgtttt gcgagatctc ccttttgttt ttgcgcactg ctgacatgga 180 gactgcaaac aggatatcaa caactccggc gacggcggca tctacgccga gctaatctcc 240 aaccgcgcgt tccaagggag tgagaagttc ccctccaacc tcgacaactg gagccccgtc 300 ggtggcgcta cccttaccct tcagaagctt gccaagcccc tttcctctgc gttgccttac 360 tccgtcaatg ttgccaaccc caaggagggc aagggcaagg gcaaggacac caaggggaag 420 aaggttggct tggccaatgc tgggttttgg ggtatggatg tcaagaggca gaagtacact 480 ggtagcttcc acgttactgg tgagtacaag ggtgactttg aggttagctt gcgcagcgcg 540 attaccgggg agacctttgg caagaaggtg gtgaagggtg ggagtaagaa ggggaagtgg 600 accgagaagg agtttgagtt ggtgcctttc aaggatgcgc ccaacagcaa caacaccttt 660 gttgtgcagt gggatgccga ggtatgtgct tctttgatat tggctgagat agaagttggg 720 ttgacatgat gtggtgcagg gcgcaaagga cggatctttg gatctcaact tgatcagctt 780 gttccctccg acattcaagg gaaggaagaa tgggctgaga attgatcttg cgcagacgat 840 ggttgagctc aagccggtaa gtcctctcta gtcagaaaag tagagccttt gttaacgctt 900 gacagacctt cttgcgcttc cccggtggca acatgctcga gggtaacacc ttggacactt 960 ggtggaagtg gtacgagacc attggccctc tgaaggatcg cccgggcatg gctggtgtct 1020 gggagtacca gcaaaccctt ggcttgggtc tggtcgagta catggagtgg gccgatgaca 1080 tgaacttgga gcccagtatg tgatcccatt ttctggagtg acttctcttg ctaacgtatc 1140 cacagttgtc ggtgtcttcg ctggtcttgc cctcgatggc tcgttcgttc ccgaatccga 1200 gatgggatgg gtcatccaac aggctctcga cgaaatcgag ttcctcactg gcgatgctaa 1260 gaccaccaaa tggggtgccg tccgcgcgaa gcttggtcac cccaagcctt ggaaggtcaa 1320 gtgggttgag atcggtaacg aggattggct tgccggacgc cctgctggct tcgagtcgta 1380 catcaactac cgcttcccca tgatgatgaa ggccttcaac gaaaagtacc ccgacatcaa 1440 gatcatcgcc tcgccctcca tcttcgacaa catgacaatc cccgcgggtg ctgccggtga 1500 tcaccacccg tacctgactc ccgatgagtt cgttgagcga ttcgccaagt tcgataactt 1560 gagcaaggat aacgtgacgc tcatcggcga ggctgcgtcg acgcatccta acggtggtat 1620 cgcttgggag ggagatctca tgcccttgcc ttggtggggc ggcagtgttg ctgaggctat 1680 cttcttgatc agcactgaga gaaacggtga caagatcatc ggtgctactt acgcgcctgg 1740 tcttcgcagc ttggaccgct ggcaatggag catgacctgg gtgcagcatg 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tagtagatgg actgcggatc cttcggctca tgtctttaac 120 gacaccttgt ggctctaccc gtctcatgac atcgatgctg gatttgagaa tgatcctgat 180 ggaggccagt acgccatgag agattaccat gtctactcta tcgacaagat ctacggttcc 240 ctgccggtcg atcacggtac ggccctgtca gtggaggatg tcccctgggc ctctcgacag 300 atgtgggctc ctgacgctgc ccacaagaac ggcaaatact acctatactt ccctgccaaa 360 gacaaggatg atatcttcag aatcggcgtt gctgtctcac caacccccgg cggaccattc 420 gtccccgaca agagttggat ccctcacact ttcagcatcg accccgccag tttcgtcgat 480 gatgatgaca gagcctactt ggcatggggt ggtatcatgg gtggccagct tcaacgatgg 540 caggataaga acaagtacaa cgaatctggc actgagccag gaaacggcac cgctgccttg 600 agccctcaga ttgccaagct gagcaaggac atgcacactc tggcagagaa gcctcgcgac 660 atgctcattc ttgaccccaa gactggcaag ccgctccttt ctgaggatga agaccgacgc 720 ttcttcgaag gaccctggat tcacaagcgc aacaagattt actacctcac ctactctact 780 ggcacaaccc actatcttgt ctatgcgact tcaaagaccc cctatggtcc ttacacctac 840 cagggcagaa ttctggagcc agttgatggc tggactactc actctagtat cgtcaagtac 900 cagggtcagt ggtggctatt ttatcacgat 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ggatggatca agcaacccga caaagtggat ttcaggcccg gatcgaagat accggcgcac 1020 ttccagtact ggcgatatcc caagacagag gattttaccg tctcccctcg gggccacccg 1080 aatactcttc ggctcacacc ctccttttac aacctcaccg gaactgcgga cttcaagccg 1140 gatgatggcc tgtcgcttgt tatgcgcaaa cagaccgaca ccttgttcac gtacactgtg 1200 gacgtgtctt ttgaccccaa ggttgccgat gaagaggcgg gtgtgactgt tttccttacc 1260 cagcagcagc acatcgatct tggtattgtc cttctccaga caaccgaggg gctgtcgttg 1320 tccttccggt tccgcgtgga aggccgcggt aactacgaag gtcctcttcc agaagccacc 1380 gtgcctgttc ccaaggaatg gtgtggacag accatccggc ttgagattca ggccgtgagt 1440 gacaccgagt atgtctttgc ggctgccccg gctcggcacc ctgcacagag gcaaatcatc 1500 agccgcgcca actcgttgat tgtcagtggt gatacgggac ggtttactgg ctcgcttgtt 1560 ggcgtgtatg ccacgtcgaa cgggggtgcc ggatccacgc ccgcatatat cagcagatgg 1620 agatacgaag gacggggcca gatgattgat tttggtcgag tggtcccgag ctactga 1677 <210> 20 <211> 558 <212> PRT <213> Aspergillus fumigatus <400> 20 Met Ala Ala Pro Ser Leu Ser Tyr Pro Thr Gly Ile Gln Ser Tyr Thr 1 5 10 15 Asn Pro Leu 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tcggaaaacg atttgcagcc atatatcgac gacaccctca 1200 accaactgga attcctgatg ggtgccccag atacgccata tggtagttgg cgtgcgtctc 1260 tgggctatcc gaagccgtgg acgattaact acgtcgagat tggaaacgaa gacaatctat 1320 acgggggact agaaacatac atcgcctacc ggtttcaggc atattacgac gctataacag 1380 ctaaatatcc ccatatgacg gtcatggaat ctttgacgga gatgcctggt ccggcggccg 1440 ctgcaagcga ttaccatcaa tattctactc ctgatgggtt tgtttcccag ttcaactact 1500 ttgatcagat gccagtcact aatagaacac tgaacggtat gaaaaccccc ccttttttaa 1560 atatgctttt aatggtatta accatctttc ataggagaga ttgcaaccgt ttatccaaat 1620 aatcctagta attcggtggc ctggggaagc ccattcccct tgtatccttg gtggattggg 1680 tccgttgcag aagctgtttt cctaattggt gaagagagga attcgccaaa gataatcggt 1740 gctagctacg tacggaattc tacttttcga gattttaaca ttggataaga aggactaacc 1800 tcaatacagg ctccaatgtt cagaaatatc aacaattggc agtggtctcc aacactcatc 1860 gcttttgacg ctgactcgtc gcgtacaagt cgttcaacaa gctggcatgt gatcaaggta 1920 tgctaatttt cctcctcatt caaacccgca gatgtgagct aactttccga agcttctctc 1980 gacaaacaaa atcacgcaaa 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cgacaaagct 600 gctcccaacg gcaccaacgc cctatctcct cagatcgcca agctaagcaa ggacatgcac 660 aagatcaccg agacaccccg cgatctcgtc atcctggccc ccgagacagg caagcccctt 720 caagcagagg acaataagcg acgatttttc gaggggccct gggttcacaa gcgcggcaag 780 ctgtactacc tcatgtactc taccggcgac acgcacttcc tcgtctacgc gacttccaag 840 aacatctacg gtccttatac ctatcagggc aagattctcg accctgttga tgggtggact 900 acgcatggaa gtattgttga gtacaaggga cagtggtggt tgttctttgc ggatgcgcat 960 acttctggaa aggattatct gagacaggtt aaggcgagga agatctggta tgacaaggat 1020 ggcaagattt tgcttactcg tcctaagatt tag 1053 <210> 28 <211> 350 <212> PRT <213> Fusarium verticillioides <400> 28 Met Gln Leu Lys Phe Leu Ser Ser Ala Leu Leu Leu Ser Leu Thr Gly 1 5 10 15 Asn Cys Ala Ala Gln Asp Thr Asn Asp Ile Pro Pro Leu Ile Thr Asp 20 25 30 Leu Trp Ser Ala Asp Pro Ser Ala His Val Phe Glu Gly Lys Leu Trp 35 40 45 Val Tyr Pro Ser His Asp Ile Glu Ala Asn Val Val Asn Gly Thr Gly 50 55 60 Gly Ala Gln Tyr Ala Met Arg Asp Tyr His Thr Tyr Ser Met Lys Thr 65 70 75 80 Ile Tyr Gly 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gatggaaaca gtctagacgg tgatggaacc acacatccta 600 cccccatcat gcttcaacaa atggaggcag acggaacaac cccaaccggc agcccaatcc 660 aactcattga ccgatccgac ctcgacggac ctttgatcga ggctcctagt ttgctcctct 720 ccaatggaat ctactacctc agtttctctt ccaactacta caacactaat tactacgaca 780 cttcatacgc ctatgcctcg tcgattactg gtccttggac caaacaatct gcgccttatg 840 cacccttgtt ggttactgga accgagacta gcaatgacgg cgcattgagc gcccctggtg 900 gtgccgattt ctccgtcgat ggcaccaaga tgttgttcca cgcaaacctc aatggacaag 960 atatctcggg cggacgcgcc ttatttgctg cgtcaattac tgaggccagc gatgtggtta 1020 cattgcagta g 1031 <210> 30 <211> 321 <212> PRT <213> Penicillium funiculosum <400> 30 Met Ser Arg Ser Ile Leu Pro Tyr Ala Ser Val Phe Ala Leu Leu Gly 1 5 10 15 Gly Ala Ile Ala Glu Pro Phe Leu Val Leu Asn Ser Asp Phe Pro Asp 20 25 30 Pro Ser Leu Ile Glu Thr Ser Ser Gly Tyr Tyr Ala Phe Gly Thr Thr 35 40 45 Gly Asn Gly Val Asn Ala Gln Val Ala Ser Ser Pro Asp Phe Asn Thr 50 55 60 Trp Thr Leu Leu Ser Gly Thr Asp Ala Leu Pro Gly Pro Phe Pro Ser 65 70 75 80 Trp 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tttgataaca ataagtatgg tcacatcatt ggtgaggttg 1560 cttctaccca ccccaacggt ggaactggct ggagtggtaa ccttatgcct tacccctggt 1620 ggatctctgg tgttggcgag gccgtcgctc tctgcggtta tgagcgcaac gccgatcgta 1680 ttcccggaac attctacgct cctatcctca agaacgagaa ccgttggcag tgggctatca 1740 ccatgatcca attcgccgcc gactccgcca tgaccacccg ctccaccagc tggtatgtct 1800 ggtcactctt cgcaggccac cccatgaccc atactctccc caccaccgcc gacttcgacc 1860 ccctctacta cgtcgctggt aagaacgagg acaagggaac tcttatctgg aagggtgctg 1920 cgtataacac caccaagggt gctgacgttc ccgtgtctct gtccttcaag ggtgtcaagc 1980 ccggtgctca agctgagctt actcttctga ccaacaagga gaaggatcct tttgcgttca 2040 atgatcctca caagggcaac aatgttgttg atactaagaa gactgttctc aaggccgatg 2100 gaaagggtgc tttcaacttc aagcttccta acctgagcgt cgctgttctt gagaccctca 2160 agaagggaaa gccttactct agctag 2186 <210> 32 <211> 660 <212> PRT <213> Fusarium verticillioides <400> 32 Met Val Arg Phe Ser Ser Ile Leu Ala Ala Ala Ala Cys Phe Val Ala 1 5 10 15 Val Glu Ser Val Asn Ile Lys Val Asp Ser Lys Gly Gly Asn Ala Thr 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<213> Fusarium verticillioides <400> 37 atgctcttct cgctcgttct tcctaccctt gcctttcaag ccagcctggc gctcggcgat 60 acatccgtta ctgtcgacac cagccagaaa ctccaggtca tcgatggctt tggtgtctca 120 gaagcctacg gccacgccaa acaattccaa aacctcggtc ctggaccaca gaaagagggc 180 ctcgatcttc tcttcaacac tacaaccggc gcaggcttat ccatcatccg aaacaagatc 240 ggctgcgacg cctccaactc catcaccagc accaacaccg acaacccaga taagcaggct 300 gtttaccatt ttgacggcga tgatgatggt caggtatggt ttagcaaaca ggccatgagc 360 tatggtgtag atactatcta cgctaatgct tggtctgcgc ctgtatacat gaagtcagcc 420 cagagtatgg gccgtctctg cggtacacct ggtgtgtcgt gctcctctgg agattggaga 480 catcgttacg ttgagatgat agctgagtac ctctcctact acaagcaggc tggcatccca 540 gtgtcgcacg ttggattcct caatgagggt gacggctcgg actttatgct ctcaactgcc 600 gaacaggctg cagatgtcat tcctcttcta cacagcgctt tgcagtccaa gggccttggc 660 gatatcaaga tgacgtgctg tgataacatc ggttggaagt cacagatgga ctataccgcc 720 aagctggctg agcttgaggt ggagaagtat ctatctgtca tcacatccca cgagtactcc 780 agcagcccca accagcctat gaacactaca ttgccaacct ggatgtccga gggagctgcc 840 aatgaccagg catttgccac agcgtggtac gtcaacggcg gttccaacga aggtttcaca 900 tgggcagtca agatcgcaca aggcatcgtc aatgccgacc tctcagcgta tatctactgg 960 gagggcgttg agaccaacaa caaggggtct ctatctcacg tcatcgacac ggacggtacc 1020 aagtttacca tatcctcgat tctctgggcc attgctcact ggtcgcgcca tattcgccct 1080 ggtgcgcata gactttcgac ttcaggtgtt gtgcaagata cgattgttgg tgcgtttgag 1140 aacgttgatg gcagtgtcgt catggtgctc accaactctg gcactgctgc tcagactgtg 1200 gacctgggtg tttcgggaag tagcttctca acagctcagg ctttcacttc ggatgctgag 1260 gcgcagatgg tcgataccaa ggtgactctg tccgacggtc gtgtcaaggt tacggtcccg 1320 gtgcacggtg tcgtcactgt gaagctcaca acagcaaaaa gctccaaacc ggtctcaact 1380 gctgtttctg cgcaatctgc ccccactcca actagtgtta agcacacctt gactcaccag 1440 aagacttctt caacaacact ctcgaccgcc aaggccccaa cctccactca gactacctct 1500 gtagttgagt cagccaaggc ggtgaaatac cctgtccccc ctgtagcatc caagggatcc 1560 tcgaagagtg ctcccaagaa gggtaccaag aagaccacta cgaagaaggg ctcccaccaa 1620 tcgcacaagg cgcatagtgc tactcatcgt cgatgccgcc atggaagtta ccgtcgtggc 1680 cactgcacca actaa 1695 <210> 38 <211> 537 <212> PRT <213> Fusarium verticillioides <400> 38 Met Leu Phe Ser Leu Val Leu Pro Thr Leu Ala Phe Gln Ala Ser Leu 1 5 10 15 Ala Leu Gly Asp Thr Ser Val Thr Val Asp Thr Ser Gln Lys Leu Gln 20 25 30 Val Ile Asp Gly Phe Gly Val Ser Glu Ala Tyr Gly His Ala Lys Gln 35 40 45 Phe Gln Asn Leu Gly Pro Gly Pro Gln Lys Glu Gly Leu Asp Leu Leu 50 55 60 Phe Asn Thr Thr Thr Gly Ala Gly Leu Ser Ile Ile Arg Asn Lys Ile 65 70 75 80 Gly Cys Asp Ala Ser Asn Ser Ile Thr Ser Thr Asn Thr Asp Asn Pro 85 90 95 Asp Lys Gln Ala Val Tyr His Phe Asp Gly Asp Asp Asp Gly Gln Ser 100 105 110 Ala Gln Ser Met Gly Arg Leu Cys Gly Thr Pro Gly Val Ser Cys Ser 115 120 125 Ser Gly Asp Trp Arg His Arg Tyr Val Glu Met Ile Ala Glu Tyr Leu 130 135 140 Ser Tyr Tyr Lys Gln Ala Gly Ile Pro Val Ser His Val Gly Phe Leu 145 150 155 160 Asn Glu Gly Asp Gly Ser Asp Phe Met Leu Ser Thr Ala Glu Gln Ala 165 170 175 Ala Asp Val Ile Pro Leu Leu His Ser Ala Leu Gln Ser Lys 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cagcgcgatt 480 accggggaga cctttggcaa gaaggtggtg aagggtggga gtaagaaggg gaagtggacc 540 gagaaggagt ttgagttggt gcctttcaag gatgcgccca acagcaacaa cacctttgtt 600 gtgcagtggg atgccgaggg cgcaaaggac ggatctttgg atctcaactt gatcagcttg 660 ttccctccga cattcaaggg aaggaagaat gggctgagaa ttgatcttgc gcagacgatg 720 gttgagctca agccgacctt cttgcgcttc cccggtggca acatgctcga gggtaacacc 780 ttggacactt ggtggaagtg gtacgagacc attggccctc tgaaggatcg cccgggcatg 840 gctggtgtct gggagtacca gcaaaccctt ggcttgggtc tggtcgagta catggagtgg 900 gccgatgaca tgaacttgga gcccattgtc ggtgtcttcg ctggtcttgc cctcgatggc 960 tcgttcgttc ccgaatccga gatgggatgg gtcatccaac aggctctcga cgaaatcgag 1020 ttcctcactg gcgatgctaa gaccaccaaa tggggtgccg tccgcgcgaa gcttggtcac 1080 cccaagcctt ggaaggtcaa gtgggttgag atcggtaacg aggattggct tgccggacgc 1140 cctgctggct tcgagtcgta catcaactac cgcttcccca tgatgatgaa ggccttcaac 1200 gaaaagtacc ccgacatcaa gatcatcgcc tcgccctcca tcttcgacaa catgacaatc 1260 cccgcgggtg ctgccggtga tcaccacccg tacctgactc ccgatgagtt cgttgagcga 1320 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catggagtgg 900 gccgacgaca tgaacctcga gcccatcgtc ggcgtctttg ctggcctggc cctggatggc 960 agctttgtcc ccgagagcga gatgggctgg gtcatccagc aggctctcga tgagatcgag 1020 ttcctcaccg gcgacgccaa gaccaccaag tggggcgccg tccgcgccaa gctcggccac 1080 cctaagccct ggaaggtcaa atgggtcgag atcggcaacg aggactggct cgccggccga 1140 cctgccggct tcgagagcta catcaactac cgcttcccca tgatgatgaa ggccttcaac 1200 gagaaatacc ccgacatcaa gatcattgcc agcccctcca tcttcgacaa catgaccatt 1260 ccagccggtg ctgccggtga ccaccacccc tacctcaccc ccgacgaatt tgtcgagcgc 1320 ttcgccaagt tcgacaacct cagcaaggac aacgtcaccc tcattggcga ggccgccagc 1380 acccacccca acggcggcat tgcctgggag ggcgacctca tgcccctgcc ctggtggggc 1440 ggcagcgtcg ccgaggccat cttcctcatc agcaccgagc gcaacggcga caagatcatc 1500 ggcgccacct acgcccctgg cctccgatct ctcgaccgct ggcagtggag catgacctgg 1560 gtccagcacg ccgccgaccc tgccctcacc acccgcagca ccagctggta cgtctggcgc 1620 atcctcgccc accacatcat tcgcgagacc ctccccgtcg acgcccccgc cggcaagccc 1680 aacttcgacc ccctcttcta cgtcgctggc aagtcggaga gcggcaccgg catcttcaag 1740 gccgccgtct acaacagcac cgagagcatc cccgtcagcc tcaagttcga cggcctcaac 1800 gagggcgccg tcgccaacct caccgtcctc accggccccg aggaccccta cggctacaac 1860 gaccccttca ccggcatcaa cgtcgtcaag gaaaagacca ccttcatcaa ggccggcaag 1920 ggcggcaagt tcacctttac cctccccggc ctctctgtcg ccgtcctcga gaccgccgac 1980 gccgtgaagg gtggcaaggg aaagggaaag ggcaagggta agggtaacta a 2031 <210> 48 <211> 1020 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> constructed GZ43A sequence <400> 48 atgtatcgga agttggccgt catctcggcc ttcttggcca cagctcgtgc taccaacgac 60 gactgtcctc tcatcactag tagatggact gcggatcctt cggctcatgt ctttaacgac 120 accttgtggc tctacccgtc tcatgacatc gatgctggat ttgagaatga tcctgatgga 180 ggccagtacg ccatgagaga ttaccatgtc tactctatcg acaagatcta cggttccctg 240 ccggtcgatc acggtacggc cctgtcagtg gaggatgtcc cctgggcctc tcgacagatg 300 tgggctcctg acgctgccca caagaacggc aaatactacc tatacttccc tgccaaagac 360 aaggatgata tcttcagaat cggcgttgct gtctcaccaa cccccggcgg accattcgtc 420 cccgacaaga gttggatccc tcacactttc agcatcgacc 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<213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 64 caccatgaaa ctctctagct acctctg 27 <210> 65 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 65 ctacgaaact gtgacagtca cgttg 25 <210> 66 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 66 caccatgctc ttctcgctcg ttcttcctac 30 <210> 67 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 67 ttagttggtg cagtggccac g 21 <210> 68 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 68 caccatgaat cctttatctc tcggccttg 29 <210> 69 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 69 cagccctcat agtcgtcttc ttc 23 <210> 70 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 70 caccatgcgt cttctatcgt ttcc 24 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 71 ctacaaaggc ctaggatcaa 20 <210> 72 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 72 caccatgcac tacgctaccc tcaccac 27 <210> 73 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 73 tcaagtagag gggctgctca cc 22 <210> 74 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 74 caccatgaag gtatactggc tcgtgg 26 <210> 75 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 75 ctatgcagct gtgaaagact caacc 25 <210> 76 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 76 caccatgtgg aaactcctcg tcagc 25 <210> 77 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 77 ctaataagca acaggccagc cattg 25 <210> 78 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 78 caccatgctt cagcgatttg cttatatttt acc 33 <210> 79 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 79 ttatgcgaac tgccaataat caaagttg 28 <210> 80 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 80 caccatgtac cggaagctcg ccgtg 25 <210> 81 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 81 ctactccgtc ttcagcacag ccac 24 <210> 82 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 82 ccgcggccgc accatggttt ctttctccta cctgctgctg 40 <210> 83 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 83 ccggcgcgcc cttactagta gacagtgatg gaagcagatc cg 42 <210> 84 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 84 ccgcggccgc accatgatct ccatttcctc gctcagct 38 <210> 85 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 85 ccggcgcgcc cttatcactt ggatataacc ctgcaagaag gta 43 <210> 86 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 86 caccatggca gctccaagtt tatcc 25 <210> 87 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 87 tcagtagctc gggaccactc 20 <210> 88 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 88 caccatgaga tatagaacag ctgccgct 28 <210> 89 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 89 cgaccgccct gcggagtctt gcccagtggt cccgcgacag 40 <210> 90 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 90 ctgtcgcggg accactgggc aagactccgc agggcggtcg 40 <210> 91 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 91 cctacgctac cgacagagtg 20 <210> 92 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 92 gtctagactg gaaacgcaac 20 <210> 93 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 93 gagttgtgaa gtcggtaatc c 21 <210> 94 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 94 caccatgaaa gcaaacgtca tcttgtgcct cctgg 35 <210> 95 <211> 43 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 95 ctattgtaag atgccaacaa tgctgttata tgccggcttg ggg 43 <210> 96 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 96 gagttgtgaa gtcggtaatc c 21 <210> 97 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 97 cacgaagagc ggcgattc 18 <210> 98 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 98 cacccatgct gctcaatctt cag 23 <210> 99 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 99 ttacgcagac ttggggtctt gag 23 <210> 100 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 100 gcttgagtgt atcgtgtaag 20 <210> 101 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 101 gcaacggcaa agccccactt c 21 <210> 102 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 102 gtagcggccg cctcatctca tctcatccat cc 32 <210> 103 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 103 caccatgcag ctcaagtttc tgtc 24 <210> 104 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 104 ggttactagt caactgcccg ttctgtagcg ag 32 <210> 105 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 105 catgcgatcg cgacgttttg gtcaggtcg 29 <210> 106 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 106 gacagaaact tgagctgcat ggtgtgggac aacaagaagg 40 <210> 107 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 107 caccatggtt cgcttcagtt caatcctag 29 <210> 108 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 108 gtggctagaa gatatccaac ac 22 <210> 109 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 109 catgcgatcg cgacgttttg gtcaggtcg 29 <210> 110 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 110 gaactgaagc gaaccatggt gtgggacaac aagaaggac 39 <210> 111 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 111 gtagttatgc gcatgctaga c 21 <210> 112 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> synthetic primer <400> 112 gtggctagaa gatatccaac ac 22 <210> 113 <211> 504 <212> PRT <213> Geobacillus stearothermophilus <400> 113 Met Lys Val Val Asn Val Pro Ser Asn Gly Arg Glu Lys Phe Lys Lys 1 5 10 15 Asn Trp Lys Phe Cys Val Gly Thr Gly Arg Leu Gly Leu Ala Leu Gln 20 25 30 Lys Glu Tyr Leu Asp His Leu Lys Leu Val Gln Glu Lys Ile Gly Phe 35 40 45 Arg Tyr Ile Arg Gly His Gly Leu Leu Ser Asp Asp Val Gly Ile Tyr 50 55 60 Arg Glu Val Glu Ile Asp Gly Glu Met Lys Pro Phe Tyr Asn Phe Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Asp Arg Ile Val Asp Ser Tyr Leu Ala Leu Asn Ile Arg Pro 85 90 95 Phe Ile Glu Phe Gly Phe Met Pro Lys Ala Leu Ala Ser Gly Asp Gln 100 105 110 Thr Val Phe Tyr Trp Lys Gly Asn Val Thr Pro Pro Lys Asp Tyr Asn 115 120 125 Lys Trp Arg Asp Leu Ile Val Ala Val Val Ser His Phe Ile Glu Arg 130 135 140 Tyr Gly Ile Glu Glu Val Arg Thr Trp Leu Phe Glu Val Trp Asn Glu 145 150 155 160 Pro Asn Leu Val Asn Phe Trp Lys Asp Ala Asn Lys Gln Glu Tyr Phe 165 170 175 Lys Leu Tyr Glu Val Thr Ala Arg Ala Val Lys Ser Val Asp Pro His 180 185 190 Leu Gln Val Gly Gly Pro Ala Ile Cys Gly Gly Ser Asp Glu Trp Ile 195 200 205 Thr Asp Phe Leu His Phe Cys Ala Glu Arg Arg Val Pro Val Asp Phe 210 215 220 Val Ser Arg His Ala Tyr Thr Ser Lys Ala Pro His Lys Lys Thr Phe 225 230 235 240 Glu Tyr Tyr Tyr Gln Glu Leu Glu Leu Glu Pro Pro Glu Asp Met Leu 245 250 255 Glu Gln Phe Lys Thr Val Arg Ala Leu Ile Arg Gln Ser Pro Phe Pro 260 265 270 His Leu Pro Leu His Ile Thr Glu Tyr Asn Thr Ser Tyr Ser Pro Ile 275 280 285 Asn Pro Val His Asp Thr Ala Leu Asn Ala Ala Tyr Ile Ala Arg Ile 290 295 300 Leu Ser Glu Gly Gly Asp Tyr Val Asp Ser Phe Ser Tyr Trp Thr Phe 305 310 315 320 Ser Asp Val Phe Glu Glu Met Asp Val Pro Lys Ala Leu Phe His Gly 325 330 335 Gly Phe Gly Leu Val Ala Leu His Ser Ile Pro Lys Pro Thr Phe His 340 345 350 Ala Phe Thr Phe Phe Asn Ala Leu Gly Asp Glu Leu Leu Tyr Arg Asp 355 360 365 Gly Glu Met Ile Val Thr Arg Arg Lys Asp Gly Ser Ile Ala Ala Val 370 375 380 Leu Trp Asn Leu Val Met Glu Lys Gly Glu Gly Leu Thr Lys Glu Val 385 390 395 400 Gln Leu Val Ile Pro Val Ser Phe Ser Ala Val Phe Ile Lys Arg Gln 405 410 415 Ile Val Asn Glu Gln Tyr Gly Asn Ala Trp Arg Val Trp Lys Gln Met 420 425 430 Gly Arg Pro Arg Phe Pro Ser Arg Gln Ala Val Glu Thr Leu Pro Ser 435 440 445 Ala Gln Pro His Val Met Thr Glu Gln Arg Arg Ala Thr Asp Gly Val 450 455 460 Ile His Leu Ser Ile Val Leu Ser Lys Asn Glu Val Thr Leu Ile Glu 465 470 475 480 Ile Glu Gln Val Arg Asp Glu Thr Ser Thr Tyr Val Gly Leu Asp Asp 485 490 495 Gly Glu Ile Thr Ser Tyr Ser Ser 500 <210> 114 <211> 500 <212> PRT <213> Thermoanaerobacterium saccharolyticum <400> 114 Met Ile Lys Val Arg Val Pro Asp Phe Ser Asp Lys Lys Phe Ser Asp 1 5 10 15 Arg Trp Arg Tyr Cys Val Gly Thr Gly Arg Leu Gly Leu Ala Leu Gln 20 25 30 Lys Glu Tyr Ile Glu Thr Leu Lys Tyr Val Lys Glu Asn Ile Asp Phe 35 40 45 Lys Tyr Ile Arg Gly His Gly Leu Leu Cys Asp Asp Val Gly Ile Tyr 50 55 60 Arg Glu Asp Val Val Gly Asp Glu Val Lys Pro Phe Tyr Asn Phe Thr 65 70 75 80 Tyr Ile Asp Arg Ile Phe Asp Ser Phe Leu Glu Ile Gly Ile Arg Pro 85 90 95 Phe Val Glu Ile Gly Phe Met Pro Lys Lys Leu Ala Ser Gly Thr Gln 100 105 110 Thr Val Phe Tyr Trp Glu Gly Asn Val Thr Pro Pro Lys Asp Tyr Glu 115 120 125 Lys Trp Ser Asp Leu Val Lys Ala Val Leu His His Phe Ile Ser Arg 130 135 140 Tyr Gly Ile Glu Glu Val Leu Lys Trp Pro Phe Glu Ile Trp Asn Glu 145 150 155 160 Pro Asn Leu Lys Glu Phe Trp Lys Asp Ala Asp Glu Lys Glu Tyr Phe 165 170 175 Lys Leu Tyr Lys Val Thr Ala Lys Ala Ile Lys Glu Val Asn Glu Asn 180 185 190 Leu Lys Val Gly Gly Pro Ala Ile Cys Gly Gly Ala Asp Tyr Trp Ile 195 200 205 Glu Asp Phe Leu Asn Phe Cys Tyr Glu Glu Asn Val Pro Val Asp Phe 210 215 220 Val Ser Arg His Ala Thr Thr Ser Lys Gln Gly Glu Tyr Thr Pro His 225 230 235 240 Leu Ile Tyr Gln Glu Ile Met Pro Ser Glu Tyr Met Leu Asn Glu Phe 245 250 255 Lys Thr Val Arg Glu Ile Ile Lys Asn Ser His Phe Pro Asn Leu Pro 260 265 270 Phe His Ile Thr Glu Tyr Asn Thr Ser Tyr Ser Pro Gln Asn Pro Val 275 280 285 His Asp Thr Pro Phe Asn Ala Ala Tyr Ile Ala Arg Ile Leu Ser Glu 290 295 300 Gly Gly Asp Tyr Val Asp Ser Phe Ser Tyr Trp Thr Phe Ser Asp Val 305 310 315 320 Phe Glu Glu Arg Asp Val Pro Arg Ser Gln Phe His Gly Gly Phe Gly 325 330 335 Leu Val Ala Leu Asn Met Ile Pro Lys Pro Thr Phe Tyr Thr Phe Lys 340 345 350 Phe Phe Asn Ala Met Gly Glu Glu Met Leu Tyr Arg Asp Glu His Met 355 360 365 Leu Val Thr Arg Arg Asp Asp Gly Ser Val Ala Leu Ile Ala Trp Asn 370 375 380 Glu Val Met Asp Lys Thr Glu Asn Pro Asp Glu Asp Tyr Glu Val Glu 385 390 395 400 Ile Pro Val Arg Phe Arg Asp Val Phe Ile Lys Arg Gln Leu Ile Asp 405 410 415 Glu Glu His Gly Asn Pro Trp Gly Thr Trp Ile His Met Gly Arg Pro 420 425 430 Arg Tyr Pro Ser Lys Glu Gln Val Asn Thr Leu Arg Glu Val Ala Lys 435 440 445 Pro Glu Ile Met Thr Ser Gln Pro Val Ala Asn Asp Gly Tyr Leu Asn 450 455 460 Leu Lys Phe Lys Leu Gly Lys Asn Ala Val Val Leu Tyr Glu Leu Thr 465 470 475 480 Glu Arg Ile Asp Glu Ser Ser Thr Tyr Ile Gly Leu Asp Asp Ser Lys 485 490 495 Ile Asn Gly Tyr 500 <210> 115 <211> 302 <212> PRT <213> Penicillium simplicissimum <400> 115 Gln Ala Ser Val Ser Ile Asp Ala Lys Phe Lys Ala His Gly Lys Lys 1 5 10 15 Tyr Leu Gly Thr Ile Gly Asp Gln Tyr Thr Leu Thr Lys Asn Thr Lys 20 25 30 Asn Pro Ala Ile Ile Lys Ala Asp Phe Gly Gln Leu Thr Pro Glu Asn 35 40 45 Ser Met Lys Trp Asp Ala Thr Glu Pro Asn Arg Gly Gln Phe Thr Phe 50 55 60 Ser Gly Ser Asp Tyr Leu Val Asn Phe Ala Gln Ser Asn Gly Lys Leu 65 70 75 80 Ile Arg Gly His Thr Leu Val Trp His Ser Gln Leu Pro Gly Trp Val 85 90 95 Ser Ser Ile Thr Asp Lys Asn Thr Leu Ile Ser Val Leu Lys Asn His 100 105 110 Ile Thr Thr Val Met Thr Arg Tyr Lys Gly Lys Ile Tyr Ala Trp Asp 115 120 125 Val Leu Asn Glu Ile Phe Asn Glu Asp Gly Ser Leu Arg Asn Ser Val 130 135 140 Phe Tyr Asn Val Ile Gly Glu Asp Tyr Val Arg Ile Ala Phe Glu Thr 145 150 155 160 Ala Arg Ser Val Asp Pro Asn Ala Lys Leu Tyr Ile Asn Asp Tyr Asn 165 170 175 Leu Asp Ser Ala Gly Tyr Ser Lys Val Asn Gly Met Val Ser His Val 180 185 190 Lys Lys Trp Leu Ala Ala Gly Ile Pro Ile Asp Gly Ile Gly Ser Gln 195 200 205 Thr His Leu Gly Ala Gly Ala Gly Ser Ala Val Ala Gly Ala Leu Asn 210 215 220 Ala Leu Ala Ser Ala Gly Thr Lys Glu Ile Ala Ile Thr Glu Leu Asp 225 230 235 240 Ile Ala Gly Ala Ser Ser Thr Asp Tyr Val Asn Val Val Asn Ala Cys 245 250 255 Leu Asn Gln Ala Lys Cys Val Gly Ile Thr Val Trp Gly Val Ala Asp 260 265 270 Pro Asp Ser Trp Arg Ser Ser Ser Ser Pro Leu Leu Phe Asp Gly Asn 275 280 285 Tyr Asn Pro Lys Ala Ala Tyr Asn Ala Ile Ala Asn Ala Leu 290 295 300 <210> 116 <211> 329 <212> PRT <213> Thermoascus aurantiacus <400> 116 Met Val Arg Pro Thr Ile Leu Leu Thr Ser Leu Leu Leu Ala Pro Phe 1 5 10 15 Ala Ala Ala Ser Pro Ile Leu Glu Glu Arg Gln Ala Ala Gln Ser Val 20 25 30 Asp Gln Leu Ile Lys Ala Arg Gly Lys Val Tyr Phe Gly Val Ala Thr 35 40 45 Asp Gln Asn Arg Leu Thr Thr Gly Lys Asn Ala Ala Ile Ile Gln Ala 50 55 60 Asp Phe Gly Gln Val Thr Pro Glu Asn Ser Met Lys Trp Asp Ala Thr 65 70 75 80 Glu Pro Ser Gln Gly Asn Phe Asn Phe Ala Gly Ala Asp Tyr Leu Val 85 90 95 Asn Trp Ala Gln Gln Asn Gly Lys Leu Ile Arg Gly His Thr Leu Val 100 105 110 Trp His Ser Gln Leu Pro Ser Trp Val Ser Ser Ile Thr Asp Lys Asn 115 120 125 Thr Leu Thr Asn Val Met Lys Asn His Ile Thr Thr Leu Met Thr Arg 130 135 140 Tyr Lys Gly Lys Ile Arg Ala Trp Asp Val Val Asn Glu Ala Phe Asn 145 150 155 160 Glu Asp Gly Ser Leu Arg Gln Thr Val Phe Leu Asn Val Ile Gly Glu 165 170 175 Asp Tyr Ile Pro Ile Ala Phe Gln Thr Ala Arg Ala Ala Asp Pro Asn 180 185 190 Ala Lys Leu Tyr Ile Asn Asp Tyr Asn Leu Asp Ser Ala Ser Tyr Pro 195 200 205 Lys Thr Gln Ala Ile Val Asn Arg Val Lys Gln Trp Arg Ala Ala Gly 210 215 220 Val Pro Ile Asp Gly Ile Gly Ser Gln Thr His Leu Ser Ala Gly Gln 225 230 235 240 Gly Ala Gly Val Leu Gln Ala Leu Pro Leu Leu Ala Ser Ala Gly Thr 245 250 255 Pro Glu Val Ala Ile Thr Glu Leu Asp Val Ala Gly Ala Ser Pro Thr 260 265 270 Asp Tyr Val Asn Val Val Asn Ala Cys Leu Asn Val Gln Ser Cys Val 275 280 285 Gly Ile Thr Val Trp Gly Val Ala Asp Pro Asp Ser Trp Arg Ala Ser 290 295 300 Thr Thr Pro Leu Leu Phe Asp Gly Asn Phe Asn Pro Lys Pro Ala Tyr 305 310 315 320 Asn Ala Ile Val Gln Asp Leu Gln Gln 325 <210> 117 <211> 485 <212> PRT <213> Fusarium verticillioides <400> 117 Met Asn Pro Leu Ser Leu Gly Leu Ala Ala Leu Ser Leu Leu Gly Tyr 1 5 10 15 Val Gly Val Asn Phe Val Ala Ala Phe Pro Thr Asp Ser Asn Ser Gly 20 25 30 Ser Glu Val Leu Ile Ser Val Asn Gly His Val Lys His Gln Glu Leu 35 40 45 Asp Gly Phe Gly Ala Ser Gln Ala Phe Gln Arg Ala Glu Asp Ile Leu 50 55 60 Gly Lys Asp Gly Leu Ser Lys Glu Gly Thr Gln His Val Leu Asp Leu 65 70 75 80 Leu Phe Ser Lys Asp Ile Gly Ala Gly Phe Ser Ile Leu Arg Asn Gly 85 90 95 Ile Gly Ser Ser Asn Ser Ser Asp Lys Asn Phe Met Asn Ser Ile Glu 100 105 110 Pro Phe Ser Pro Gly Ser Pro Gly Ala Lys Pro His Tyr Val Trp Asp 115 120 125 Gly Tyr Asp Ser Gly Gln Leu Thr Val Ala Gln Glu Ala Phe Lys Arg 130 135 140 Gly Leu Lys Phe Leu Tyr Gly Asp Ala Trp Ser Ala Pro Gly Tyr Met 145 150 155 160 Lys Thr Asn His Asp Glu Asn Asn Gly Gly Tyr Leu Cys Gly Val Thr 165 170 175 Gly Ala Ala Cys Ala Ser Gly Asp Trp Lys Gln Ala Tyr Ala Asp Tyr 180 185 190 Leu Leu Gln Trp Val Glu Phe Tyr Arg Lys Ser Gly Val Lys Val Thr 195 200 205 Asn Leu Gly Phe Leu Asn Glu Pro Gln Phe Ala Ala Pro Tyr Ala Gly 210 215 220 Met Leu Ser Asn Gly Thr Gln Ala Ala Asp Phe Ile Arg Val Leu Gly 225 230 235 240 Lys Thr Ile Arg Lys Arg Gly Ile His Asp Leu Thr Ile Ala Cys Cys 245 250 255 Asp Gly Glu Gly Trp Asp Leu Gln Glu Asp Met Met Ala Gly Leu Thr 260 265 270 Ala Gly Pro Asp Pro Ala Ile Asn Tyr Leu Ser Val Val Thr Gly His 275 280 285 Gly Tyr Val Ser Pro Pro Asn His Pro Leu Ser Thr Thr Lys Lys Thr 290 295 300 Trp Leu Thr Glu Trp Ala Asp Leu Thr Gly Gln Phe Thr Pro Tyr Thr 305 310 315 320 Phe Tyr Asn Asn Ser Gly Gln Gly Glu Gly Met Thr Trp Ala Gly Arg 325 330 335 Ile Gln Thr Ala Leu Val Asp Ala Asn Val Ser Gly Phe Leu Tyr Trp 340 345 350 Ile Gly Ala Glu Asn Ser Thr Thr Asn Ser Ala Leu Ile Asn Met Ile 355 360 365 Gly Asp Lys Val Ile Pro Ser Lys Arg Phe Trp Ala Phe Ala Ser Phe 370 375 380 Ser Arg Phe Ala Arg Pro Gly Ala Arg Arg Ile Glu Ala Thr Ser Ser 385 390 395 400 Val Pro Leu Val Thr Val Ser Ser Phe Leu Asn Thr Asp Gly Thr Val 405 410 415 Ala Thr Gln Val Leu Asn Asn Asp Thr Val Ala His Ser Val Gln Leu 420 425 430 Val Val Ser Gly Thr Gly Arg Asn Pro His Ser Leu Lys Pro Phe Leu 435 440 445 Thr Asp Asn Ser Asn Asp Leu Thr Ala Leu Lys His Leu Lys Ala Thr 450 455 460 Gly Lys Gly Ser Phe Gln Thr Thr Ile Pro Pro Arg Ser Leu Val Ser 465 470 475 480 Phe Val Thr Asp Phe 485 =

Claims (140)

  1. 하기를 포함하는 비-자연 발생 조성물:
    a. β-자일로시다아제 활성, L-α-아라비노푸라노시다아제 활성, 또는 둘 모두의 β-자일로시다아제 활성 및 L-α-아라비노푸라노시다아제 활성을 갖는 제 1 폴리펩티드 또는 이의 변이체; 및
    b. 자일라나아제 활성을 갖는 제 2 폴리펩티드 또는 이의 변이체.
  2. 제 1 항에 있어서, 제 1 폴리펩티드 또는 이의 변이체가 Fv43D, Fv3A, Pf43A, Fv43E, Fv39A, Fv43A, Fv43B, Pa51A, Fo43A, Gz43A, 트리코더마 레세이 (Trichoderma reesei) Bxl1, Fv51A, Af43A, 또는 Pf51A 폴리펩티드인 조성물.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서, 제 1 폴리펩티드 또는 이의 변이체가 β-자일로시다아제 활성을 갖는 조성물.
  4. 제 3 항에 있어서, β-자일로시다아제 활성을 갖는 제 1 폴리펩티드 또는 이의 변이체가 Fv43D, Fv3A, Pf43A, Fv43E, Fv39A, Fv43A, Fv43B, Pa51A, Fo43A, Gz43A, 또는 트리코더마 레세이 Bxl1 폴리펩티드인 조성물.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, L-α-아라비노푸라노시다아제 활성을 갖는 제 3 폴리펩티드 또는 이의 변이체를 추가로 포함하는 조성물.
  6. 제 5 항에 있어서, 제 3 폴리펩티드 또는 이의 변이체가 Fv51A, Af43A, Fv43B, Pa51A 또는 Pf51A 폴리펩티드인 조성물.
  7. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서, β-자일로시다아제 활성을 갖는 제 3 폴리펩티드를 추가로 포함하는 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서, 제 1 폴리펩티드가 Fv3A 폴리펩티드 또는 Fv43A 폴리펩티드이고, 제 3 폴리펩티드가 Fv43D, Pa51A, Gz43A, 트리코더마 레세이 Bxl1, Pf43A, Fv43E, Fv39A, Fo43A, 또는 Fv43B 폴리펩티드인 조성물.
  9. 제 2 항, 제 4 항, 제 6 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 존재하는 경우 Fv43D 폴리펩티드가 SEQ ID NO:28 에 대해, 또는 SEQ ID NO:28 의 잔기 (i) 20-341, (ii) 21-350, (iii) 107-341, 또는 (iv) 107-350 에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 조성물.
  10. 제 2 항, 제 4 항, 제 6 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 존재하는 경우, Fv3A 폴리펩티드가 SEQ ID NO:2 의 아미노산 서열에 대해, 또는 SEQ ID NO:2 의 잔기 (i) 24-766, (ii) 73-321, (iii) 73-394, (iv) 395-622, (v) 24-622, 또는 (vi) 73-622 에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 조성물.
  11. 제 2 항, 제 4 항, 제 6 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 존재하는 경우, Pf43A 폴리펩티드가 SEQ ID NO:4 의 아미노산 서열에 대해, 또는 SEQ ID NO:4 의 잔기 (i) 21-445, (ii) 21-301, (iii) 21-323, (iv) 21-444, (v) 302- 444; (vi) 302-445, (vii) 324-444, 또는 (viii) 324-445 에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 조성물.
  12. 제 2 항, 제 4 항, 제 6 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 존재하는 경우, Fv43E 폴리펩티드가 SEQ ID NO:6 의 아미노산 서열에 대해, 또는 SEQ ID NO:6 의 잔기 (i) 19-530, (ii) 29-530, (iii) 19-300, 또는 (iv) 29-300 에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 조성물.
  13. 제 2 항, 제 4 항, 제 6 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 존재하는 경우, Fv39A 폴리펩티드가 SEQ ID NO:8 의 아미노산 서열에 대해, 또는 SEQ ID NO:8 의 잔기 (i) 20-439, (ii) 20-291, (iii) 145-291, 또는 145-439 에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 조성물.
  14. 제 2 항, 제 4 항, 제 6 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 존재하는 경우, Fv43A 폴리펩티드가 SEQ ID NO:10 의 아미노산 서열에 대해, 또는 SEQ ID NO:10 의 잔기 (i) 23-449, (ii) 23-302, (iii) 23-320, (iv) 23-448, (v) 303-448, 또는 (vi) 321-449 에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 조성물.
  15. 제 2 항, 제 4 항, 제 6 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 존재하는 경우, Fv43B 폴리펩티드가 SEQ ID NO:12 의 아미노산 서열에 대해, 또는 SEQ ID NO:12 의 잔기 (i) 17-574, (ii) 27-574, (iii) 17-303, 또는 (iv) 27-303 에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 조성물.
  16. 제 2 항, 제 4 항, 제 6 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 존재하는 경우, Pa51A 폴리펩티드가 SEQ ID NO:14 의 아미노산 서열에 대해, 또는 SEQ ID NO:14 의 잔기 (i) 21-676, (ii) 21- 652, (iii) 469-652, 또는 (iv) 469-676 에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 조성물.
  17. 제 2 항, 제 4 항, 제 6 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 존재하는 경우, Fo43A 폴리펩티드가 SEQ ID NO:18 의 아미노산 서열에 대해, 또는 SEQ ID NO:18 의 잔기 (i) 21-341, (ii) 107-341, (iii) 21-348, 또는 (iv) 107-348 에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 조성물.
  18. 제 2 항, 제 4 항, 제 6 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 존재하는 경우, Gz43A 폴리펩티드가 SEQ ID NO:16 의 아미노산 서열에 대해, 또는 SEQ ID NO:16 의 잔기 (i) 19-340, (ii) 53-340, (iii) 19-383, 또는 (iv) 53-383 에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 조성물.
  19. .
  20. 제 2 항, 제 4 항, 제 6 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 존재하는 경우, 트리코더마 레세이 Bxl1 폴리펩티드가 SEQ ID NO:44 의 아미노산 서열에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 조성물.
  21. 제 2 항, 제 4 항, 제 6 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 존재하는 경우, Fv51A 폴리펩티드가 SEQ ID NO:32 의 아미노산 서열에 대해, 또는 SEQ ID NO:32 의 잔기 (i) 21-660, (ii) 21-645, (iii) 450-645, 또는 (iv) 450-660 에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 조성물.
  22. 제 2 항, 제 4 항, 제 6 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 존재하는 경우, Af43A 폴리펩티드가 SEQ ID NO:20 에 대해, 또는 SEQ ID NO:20 의 잔기 (i) 15-558, 또는 (ii) 15-295 에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 조성물.
  23. 제 2 항, 제 4 항, 제 6 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 존재하는 경우, Pf51A 폴리펩티드가 SEQ ID NO:22 의 아미노산 서열에 대해, 또는 SEQ ID NO:22 의 잔기 (i) 21-632, (ii) 461-632, (iii) 21-642, 또는 (iv) 461-642 에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 조성물.
  24. 제 2 항, 제 4 항, 제 6 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 존재하는 경우, Fv43D 폴리펩티드가, SEQ ID NO:27 또는 이의 단편에 대한 고도의 엄격 조건 하에서, SEQ ID NO:27 에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 핵산에 의해 또는 하이브리드화할 수 있는 핵산에 의해 인코딩되는 조성물.
  25. 제 2 항, 제 4 항, 제 6 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 존재하는 경우, Fv3A 폴리펩티드가, SEQ ID NO:1 또는 이의 단편에 대한 고도의 엄격 조건 하에서, SEQ ID NO:1 에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 핵산에 의해 또는 하이브리드화할 수 있는 핵산에 의해 인코딩되는 조성물.
  26. 제 2 항, 제 4 항, 제 6 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 존재하는 경우, Pf43A 폴리펩티드가, SEQ ID NO:3 또는 이의 단편에 대한 고도의 엄격 조건 하에서, SEQ ID NO:3 에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 핵산에 의해 또는 하이브리드화할 수 있는 핵산에 의해 인코딩되는 조성물.
  27. 제 2 항, 제 4 항, 제 6 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 존재하는 경우, Fv43E 폴리펩티드가, SEQ ID NO:5 또는 이의 단편에 대한 고도의 엄격 조건 하에서, SEQ ID NO:5 에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 핵산에 의해 또는 하이브리드화할 수 있는 핵산에 의해 인코딩되는 조성물.
  28. 제 2 항, 제 4 항, 제 6 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 존재하는 경우, Fv39A 폴리펩티드가, SEQ ID NO:7 또는 이의 단편에 대한 고도의 엄격 조건 하에서, SEQ ID NO:7 에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 핵산에 의해 또는 하이브리드화할 수 있는 핵산에 의해 인코딩되는 조성물.
  29. 제 2 항, 제 4 항, 제 6 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 존재하는 경우, Fv43A 폴리펩티드가, SEQ ID NO:9 또는 이의 단편에 대한 고도의 엄격 조건 하에서, SEQ ID NO:9 에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 핵산에 의해 또는 하이브리드화할 수 있는 핵산에 의해 인코딩되는 조성물.
  30. 제 2 항, 제 4 항, 제 6 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 존재하는 경우, Fv43B 폴리펩티드가, SEQ ID NO:11 또는 이의 단편에 대한 고도의 엄격 조건 하에서, SEQ ID NO:11 에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 핵산에 의해 또는 하이브리드화할 수 있는 핵산에 의해 인코딩되는 조성물.
  31. 제 2 항, 제 4 항, 제 6 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 존재하는 경우, Pa51A 폴리펩티드가, SEQ ID NO:13 또는 이의 단편에 대한 고도의 엄격 조건 하에서, SEQ ID NO:13 에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 핵산에 의해, 또는 하이브리드화할 수 있는 핵산에 의해 인코딩되는 조성물.
  32. 제 2 항, 제 4 항, 제 6 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 존재하는 경우, Fo43A 폴리펩티드가, SEQ ID NO:17 또는 이의 단편에 대한 고도의 엄격 조건 하에서, SEQ ID NO:17 에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 핵산에 의해 또는 하이브리드화할 수 있는 핵산에 의해 인코딩되는 조성물.
  33. 제 2 항, 제 4 항, 제 6 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 존재하는 경우, Gz43A 폴리펩티드가, SEQ ID NO:15 또는 이의 단편에 대해 고도의 엄격 조건 하에서, SEQ ID NO:15 에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 핵산에 의해 또는 하이브리드화할 수 있는 핵산에 의해 인코딩되는 조성물.
  34. 제 2 항, 제 4 항, 제 6 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 존재하는 경우, Fv51A 폴리펩티드가, SEQ ID NO:31 또는 이의 단편에 대한 고도의 엄격 조건 하에서, SEQ ID NO:31 에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 핵산에 의해 또는 하이브리드화할 수 있는 핵산에 의해 인코딩되는 조성물.
  35. 제 2 항, 제 4 항, 제 6 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 존재하는 경우, Af43A 폴리펩티드가, SEQ ID NO:19 또는 이의 단편에 대한 고도의 엄격 조건 하에서, SEQ ID NO:19 에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 핵산에 의해 또는 하이브리드화할 수 있는 핵산에 의해 인코딩되는 조성물.
  36. 제 2 항, 제 4 항, 제 6 항 또는 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 존재하는 경우, Pf51A 폴리펩티드가, SEQ ID NO:21 또는 이의 단편에 대해 고도의 엄격 조건 하에서, SEQ ID NO:21 에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 핵산에 의해, 또는 하이브리드화할 수 있는 핵산에 의해 인코딩되는 조성물.
  37. 제 1 항 내지 제 36 항 중 어느 한 항에 있어서, 제 2 폴리펩티드가 트리코더마 자일라나아제 또는 아스퍼길러스 자일라나아제인 조성물.
  38. 제 37 항에 있어서, 트리코더마 자일라나아제가 트리코더마 레세이 Xyn3 폴리펩티드 또는 트리코더마 레세이 Xyn2 폴리펩티드인 조성물.
  39. 제 38 항에 있어서, 존재하는 경우, 트리코더마 레세이 Xyn3 폴리펩티드가 SEQ ID NO:42 에 대해, 또는 SEQ ID NO:42 의 잔기 17-347 에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 조성물.
  40. 제 38 항에 있어서, 존재하는 경우, 트리코더마 레세이 Xyn2 폴리펩티드가 SEQ ID NO:43 에 대해, 또는 SEQ ID NO:43 의 잔기 33-222 에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 조성물.
  41. 제 38 항에 있어서, 존재하는 경우, 트리코더마 레세이 Xyn3 폴리펩티드가, SEQ ID NO:41 또는 이의 단편에 대한 고도의 엄격 조건 하에서, SEQ ID NO:41 에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 핵산에 의해 또는 하이브리드화할 수 있는 핵산에 의해 인코딩되는 조성물.
  42. 제 37 항에 있어서, 아스퍼길러스 자일라나아제가 AfuXyn2 폴리펩티드 또는 AfuXyn5 폴리펩티드인 조성물.
  43. 제 42 항에 있어서, 존재하는 경우, AfuXyn2 폴리펩티드가 SEQ ID NO:24 에 대해, 또는 SEQ ID NO:24 의 잔기 19-228 에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 조성물.
  44. 제 42 항에 있어서, 존재하는 경우, AfuXyn5 폴리펩티드가 SEQ ID NO:26 에 대해, 또는 SEQ ID NO:26 의 잔기 20-313 에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 조성물.
  45. 제 42 항에 있어서, 존재하는 경우, AfuXyn2 폴리펩티드가, SEQ ID NO:23 또는 이의 단편에 대한 고도의 엄격성 하에서, SEQ ID NO:23 에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 핵산에 의해, 또는 하이브리드화할 수 있는 핵산에 의해 인코딩되는 조성물.
  46. 제 42 항에 있어서, 존재하는 경우, AfuXyn5 폴리펩티드가, SEQ ID NO:25 의 상보서열 (complement) 또는 이의 단편에 대한 엄격 조건 하에서, SEQ ID NO:25 에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 핵산에 의해 또는 하이브리드화할 수 있는 핵산에 의해 인코딩되는 조성물.
  47. 제 1 항 내지 46 항 중 어느 한 항에 있어서, 셀룰라아제 활성을 갖는 폴리펩티드 하나 이상을 추가로 포함하는 조성물.
  48. 제 47 항에 있어서, 셀룰라아제 활성을 갖는 폴리펩티드 하나 이상이 전체 셀룰라아제의 독립적인 성분인 조성물.
  49. 제 48 항에 있어서, 전체 셀룰라아제가 β-글루코시다아제-풍부한 전체 셀룰라아제인 조성물.
  50. 제 48 항 또는 제 49 항에 있어서, 전체 셀룰라아제가 사상균 (filamentous fungi) 의 전체 셀룰라아제인 조성물.
  51. 제 48 항 내지 제 50 항 중 어느 한 항에 있어서, 사상균의 전체 셀룰라아제가 아크레모니움 (Acremonium), 아스퍼길러스 (Aspergillus), 에머리셀라 (Emericella), 후사리움 (Fusarium), 휴미콜라 (Humicola), 무코르 (Mucor), 마이셀리오프토라 (Myceliophthora), 뉴로스포라 (Neurospora), 페니실리움 (Penicillium), 사이탈리디움 (Scytalidium), 티엘라비아 (Thielavia), 크리소스포리움 (Chrysosporium), 파네로카에트 (Phanerochaete), 톨리포클라디움 (Tolypocladium), 또는 트리코더마 종 (Trichoderma sp.) 으로부터의 제제인 조성물.
  52. 제 48 항 내지 제 50 항 중 어느 한 항에 있어서, 전체 셀룰라아제가 크리소스포리움 럭노웬스 (Chrysosporium lucknowense), 파네로카에트 크리소스포리움 (Phanerochaete chrysosporium), 트리코더마 레세이 (Trichoderma reesei), 트리코더마 하르지아늄 (Trichoderma harzianum), 트리코더마 코닌기 (Trichoderma koningii), 트리코더마 롱기브라키아툼 (Trichoderma longibrachiatum), 트리코더마 비리드 (Trichoderma viride), 또는 펜실리움 푸니쿨로숨 (Pencillium funiculosum) 전체 셀룰라아제인 조성물.
  53. 제 47 항에 있어서, 셀룰라아제 활성을 갖는 폴리펩티드 하나 이상이 β-글루코시다아제, 엔도글루카나아제, 및 셀로비오히드롤라제로부터 선택되는 조성물.
  54. 제 49 항 또는 제 53 항에 있어서, β-글루코시다아제가 트리코더마 레세이 Bgl1 폴리펩티드인 조성물.
  55. 제 54 항에 있어서, 트리코더마 레세이 Bgl1 폴리펩티드가 SEQ ID NO:45 에 대해, 또는 SEQ ID NO:45 의 잔기 32-744 에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 조성물.
  56. 제 49 항 또는 제 53 항 내지 제 55 항 중 어느 한 항에 있어서, β-글루코시다아제 폴리펩티드가 조성물에서 셀룰라아제 효소의 총 중량의 50 중량% 이하를 구성하는 조성물.
  57. 제 49 항 또는 제 53 항 내지 제 56 항 중 어느 한 항에 있어서, β-글루코시다아제 폴리펩티드가 조성물 중에서 단백질의 총 중량의 2 중량% 내지 50 중량%를 구성하는 조성물.
  58. 제 47 항 내지 제 57 항 중 어느 한 항에 있어서, 셀룰라아제 활성을 갖는 폴리펩티드 하나 이상이 조성물 중에서 단백질의 총 중량의 30 중량% 내지 80 중량%를 구성하는 조성물.
  59. 제 58 항에 있어서, 셀룰라아제 활성을 갖는 하나 이상의 폴리펩티드가, 칼코플루오르 검정으로 측정시, 인산 팽창된 셀룰로오스 (PASC) 의 1 g 당 단백질 1 mg 당 0.00005 이상의 분획 생성물을 함께 달성할 수 있는 조성물.
  60. 제 1 항 내지 제 59 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 부속 단백질을 추가로 포함하는 조성물.
  61. 제 60 항에 있어서, 하나 이상의 부속 단백질이, 만난아제, 갈락타나아제, 아라비나아제, 리그니나아제, 아밀로아제, 글루쿠로니다아제, 프로테아제, 에스터라아제, 리파아제, 자일로글루카나아제, 글리코시드 히드롤라제 패밀리 61 폴리펩티드, CIP1, CIP2, 스월레닌 (swollenin), 및 익스팬신 (expansin) 으로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
  62. 제 60 항에 있어서, 하나 이상의 부속 단백질이 CIP1-유사 단백질, CIP2-유사 단백질, 셀로비오스 디히드로게나제, 및 망간 퍼옥시다아제로 이루어진 군으로부터 선택되는 조성물.
  63. 제 60 항 내지 제 62 항 중 어느 한 항에 있어서, 하나 이상의 부속 단백질이 조성물 중에서 단백질의 총 중량의 1 중량% 내지 50 중량%를 구성하는 조성물.
  64. 제 1 항 내지 제 63 항 중 어느 한 항에 있어서, 바이오매스로부터 헤미셀룰로오스 자일란의 60% 이상을 자일로오스로 전환시킬 수 있는 조성물.
  65. 제 64 항에 있어서, 바이오매스로부터 헤미셀룰로오스 자일란의 70% 이상을 자일로오스로 전환시킬 수 있는 조성물.
  66. 제 65 항에 있어서, 바이오매스로부터 헤미셀룰로오스 자일란의 80% 이상을 자일로오스로 전환시킬 수 있는 조성물.
  67. 제 64 항 내지 제 66 항 중 어느 한 항에 있어서, 바이오매스가 옥수수속대, 옥수수 여물, 옥수수 섬유, 스위치그래스 (switchgrass), 수수류, 종이, 펄프, 또는 사탕수수 바가스 (sugarcane bagasse) 인 조성물.
  68. 제 64 항 내지 제 66 항 중 어느 한 항에 있어서, 바이오매스가 미스칸투스 (Miscanthus) 인 조성물.
  69. 제 1 항 내지 제 68 항 중 어느 한 항에 있어서, 바이오매스를 추가로 포함하는 조성물.
  70. 제 69 항에 있어서, 자일라나아제 활성을 갖는 폴리펩티드의 조합 중량이 바이오매스 중에서 헤미셀룰로오스 1 kg 당 1 g 내지 40 g 인 조성물.
  71. 제 69 항에 있어서, 자일라나아제 활성을 갖는 폴리펩티드의 조합 중량이 바이오매스 중에서 헤미셀룰로오스 1 kg 당 0.5 g 내지 40 g 인 조성물.
  72. 제 71 항에 있어서, 자일라나아제 활성을 갖는 폴리펩티드의 조합 중량이 바이오매스 중에서 헤미셀룰로오스 1 kg 당 0.5 g 내지 20 g 인 조성물.
  73. 제 70 항 내지 제 72 항 중 어느 한 항에 있어서, 자일라나아제 활성을 갖는 폴리펩티드의 조합 중량이 바이오매스 중에서 헤미셀룰로오스 1 kg 당 2 g 내지 20 g 인 조성물.
  74. 제 69 항 내지 제 73 항 중 어느 한 항에 있어서, β-자일로시다아제 활성을 갖는 폴리펩티드의 조합 중량이 바이오매스 중에서 헤미셀룰로오스 1 kg 당 1 g 내지 50 g 인 조성물.
  75. 제 69 항 내지 제 73 항 중 어느 한 항에 있어서, β-자일로시다아제 활성을 갖는 폴리펩티드의 조합 중량이 바이오매스 중에서 헤미셀룰로오스 1 kg 당 0.5 g 내지 50 g 인 조성물.
  76. 제 75 항에 있어서, β-자일로시다아제 활성을 갖는 폴리펩티드의 조합 중량이 바이오매스 중에서 헤미셀룰로오스 1 kg 당 0.5 g 내지 40 g 인 조성물.
  77. 제 74 항 내지 제 76 항 중 어느 한 항에 있어서, β-자일로시다아제 활성을 갖는 폴리펩티드의 조합 중량이 바이오매스 중에서 헤미셀룰로오스 1 kg 당 2 g 내지 40 g 인 조성물.
  78. 제 69 항 내지 제 77 항 중 어느 한 항에 있어서, 존재하는 경우, L-α-아라비노푸라노시다아제 활성을 갖는 폴리펩티드의 조합 중량이 바이오매스 중에서 헤미셀룰로오스 1 kg 당 0.5 g 내지 20 g 인 조성물.
  79. 제 69 항 내지 제 77 항 중 어느 한 항에 있어서, 존재하는 경우, L-α-아라비노푸라노시다아제 활성을 갖는 폴리펩티드의 조합 중량이 바이오매스 중에서 헤미셀룰로오스 1 kg 당 0.2 g 내지 20 g 인 조성물.
  80. 제 69 항 내지 제 79 항 중 어느 한 항에 있어서, 존재하는 경우, 셀룰라아제 활성을 갖는 폴리펩티드의 조합 중량이 바이오매스 중에서 셀룰로오스 1 kg 당 1 g 내지 100 g 인 조성물.
  81. 제 1 항 내지 제 80 항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는 발효 브로쓰.
  82. 제 81 항에 있어서, 사상균인 발효 브로쓰.
  83. 제 82 항에 있어서, 사상균이 트리코더마 (Trichoderma), 휴미콜라 (Humicola), 후사리움 (Fusarium), 아스퍼길러스 (Aspergillus), 뉴로스포라 (Neurospora), 페니실리움 (Penicillium), 세팔로스포리움 (Cephalosporium), 아클야 (Achlya), 포도스포라 (Podospora), 엔도티아 (Endothia), 무코르 (Mucor), 코클리오볼러스 (Cochliobolus), 피리쿨라리아 (Pyricularia), 파네로카에트 (Phanerochaete), 또는 크리소스포리움 (Chrysosporium) 인 발효 브로쓰.
  84. 제 82 항에 있어서, 사상균이 아스퍼길러스 아와모리 (Aspergillus awamori), 아스퍼길러스 후미가투스 (Aspergillus fumigatus), 아스퍼길러스 포에티두스 (Aspergillus foetidus), 아스퍼길러스 자포니쿠스 (Aspergillus japonicus), 아스퍼길러스 니둘란스 (Aspergillus nidulans), 아스퍼길러스 니거 (Aspergillus niger), 아스퍼길러스 오리재 (Aspergillus oryzae), 크리소스포리움 럭노웬스 (Chrysosporium lucknowense), 후사리움 박트리디오이드 (Fusarium bactridioides), 후사리움 세레알리스 (Fusarium cerealis), 후사리움 크룩웰렌스 (Fusarium crookwellense), 후사리움 쿨모룸 (Fusarium culmorum), 후사리움 그라미네아룸 (Fusarium graminearum), 후사리움 그라미눔 (Fusarium graminum), 후사리움 헤테로스포룸 (Fusarium heterosporum), 후사리움 네군디 (Fusarium negundi), 후사리움 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum), 후사리움 레티쿨라툼 (Fusarium reticulatum), 후사리움 로세움 (Fusarium roseum), 후사리움 삼부시눔 (Fusarium sambucinum), 후사리움 사르코크로움 (Fusarium sarcochroum), 후사리움 스포로트리치오이드 (Fusarium sporotrichioides), 후사리움 술푸레움 (Fusarium sulphureum), 후사리움 토룰로숨 (Fusarium torulosum), 후사리움 트리코테시오이드 (Fusarium trichothecioides), 후사리움 베네나툼 (Fusarium venenatum), 브저르칸데라 아두스타 (Bjerkandera adusta), 세리포리옵시스 아네이리나 (Ceriporiopsis aneirina), 세리포리옵시스 아네이리나 (Ceriporiopsis aneirina), 세리포리옵시스 카레기에아 (Ceriporiopsis caregiea), 세리포리옵시스 길베센스 (Ceriporiopsis gilvescens), 세리포리옵시스 판노신타 (Ceriporiopsis pannocinta), 세리포리옵시스 리불로사 (Ceriporiopsis rivulosa), 세리포리옵시스 수브루파 (Ceriporiopsis subrufa), 세리포리옵시스 수베르미스포라 (Ceriporiopsis subvermispora), 코프리누스 시네레우스 (Coprinus cinereus), 코리올루스 히르수투스 (Coriolus hirsutus), 휴미콜라 인솔렌스 (Humicola insolens), 휴미콜라 라누기노사 (Humicola lanuginosa), 무코르 미에헤이 (Mucor miehei), 마이셀리오프토라 써모필라 (Myceliophthora thermophila), 뉴로스포라 크라사 (Neurospora crassa), 뉴로스포라 인테르메디아 (Neurospora intermedia), 페니실리움 푸르푸로게눔 (Penicillium purpurogenum), 페니실리움 카네센스 (Penicillium canescens), 페니실리움 솔리툼 (Penicillium solitum), 페니실리움 푸니쿨로숨 (Penicillium funiculosum), 파네로카에트 크리소스포리움 (Phanerochaete chrysosporium), 플레비아 라디에이트 (Phlebia radiate), 플레우로투스 에린기 (Pleurotus eryngii), 탈라로마이세스 플라부스 (Talaromyces flavus), 티엘라비아 테레스트리스 (Thielavia terrestris), 트라메테스 빌로사 (Trametes villosa), 트라메테스 베르시콜로르 (Trametes versicolor), 트리코더마 하르지아늄 (Trichoderma harzianum), 트리코더마 코닌기 (Trichoderma koningii), 트리코더마 롱기브라키아툼 (Trichoderma longibrachiatum), 트리코더마 레세이 (Trichoderma reesei), 또는 트리코더마 비리드 (Trichoderma viride) 인 발효 브로쓰.
  85. 제 82 항에 있어서, 사상균이 아스퍼길러스, 또는 후사리움인 발효 브로쓰.
  86. 제 82 항에 있어서, 사상균이 트리코더마 레세이인 발효 브로쓰.
  87. 제 82 항에 있어서, 사상균이 페니실리움 푸니쿨로숨인 발효 브로쓰.
  88. 제 81 항 내지 제 87 항 중 어느 한 항에 있어서, 세포-미함유 발효 브로쓰인 발효 브로쓰.
  89. 바이오매스를, 제 1 항 내지 제 80 항 중 어느 한 항에 따른 조성물과, 또는 제 81 항 내지 제 88 항 중 어느 한 항에 따른 발효 브로쓰와 접촉시키는 것을 포함하는, 바이오매스를 당으로 전환시키는 방법.
  90. 헤미셀룰로오스를 포함하는 물질을, 제 1 항 내지 제 80 항 중 어느 한 항에 따른 조성물로, 또는 제 81 항 내지 제 89 항 중 어느 한 항에 따른 발효 브로쓰로 처리하는 것을 포함하는 당화 방법.
  91. 제 90 항에 있어서, 헤미셀룰로오스를 포함하는 물질이 옥수수속대, 옥수수 여물, 옥수수 섬유, 스위치그래스, 수수류, 종이, 펄프, 또는 사탕수수 바가스인 방법.
  92. 제 90 항에 있어서, 헤미셀룰로오스를 포함하는 물질이 미스칸투스 (Miscanthus) 인 방법.
  93. 제 90 항 내지 제 92 항 중 어느 한 항에 있어서, 헤미셀룰로오스를 포함하는 물질의 헤미셀룰로오스 자일란으로부터 자일로오스를 60% 이상 수득하는 방법.
  94. 제 90 항 내지 제 93 항 중 어느 한 항에 있어서, 모노사카라이드를 회수하는 것을 추가로 포함하는 방법.
  95. β-자일로시다아제 활성을 갖는, SEQ ID NO:28 의 아미노산 서열에 대해, 또는 SEQ ID NO:28 의 잔기 (i) 20-341, (ii) 21-350, (iii) 107-341, 또는 (iv) 107-350 에 상응하는 아미노산 서열에 대해, 서열 일치성이 90% 이상인 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된, 합성 또는 재조합 핵산.
  96. β-자일로시다아제 활성을 갖는, SEQ ID NO:4 의 아미노산 서열에 대해, 또는 SEQ ID NO:4 의 잔기 (i) 21-445, (ii) 21-301, (iii) 21-323, (iv) 21-444, (v) 302-444, (vi) 302-445, (vii) 324-444, 또는 (viii) 324-445 에 상응하는 아미노산 서열에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된, 합성 또는 재조합 핵산.
  97. β-자일로시다아제 활성을 갖는, SEQ ID NO:6 의 아미노산 서열에 대해, 또는 SEQ ID NO:6 의 잔기 (i) 19-530, (ii) 29-530, (iii) 19-300, 또는 (iv) 29-300 에 상응하는 아미노산 서열에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된, 합성 또는 재조합 핵산.
  98. β-자일로시다아제 활성을 갖는, SEQ ID NO:8 의 아미노산 서열에 대해, 또는 SEQ ID NO:8 의 잔기 (i) 20-439, (ii) 20-291, (iii) 145-291, 또는 (iv) 145-439 에 상응하는 아미노산 서열에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 단리된, 합성 또는 재조합 핵산.
  99. β-자일로시다아제 활성을 갖는, SEQ ID NO:10 의 아미노산 서열에 대해, 또는 SEQ ID NO:10 의 잔기 (i) 23-449, (ii) 23-302, (iii) 23-320, (iv) 23-448, (v) 303-448, (vi) 303-449, (vii) 321-448, 또는 (viii) 321-449 에 상응하는 아미노산 서열에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된, 합성 또는 재조합 핵산.
  100. β-자일로시다아제 및/또는 L-α-아라비노푸라노시다아제 활성을 갖는, SEQ ID NO:12 의 아미노산 서열에 대해, 또는 SEQ ID NO:12 의 잔기 (i) 17-574, (ii) 27-574, (iii) 17-303, 또는 (iv) 27-303 에 상응하는 아미노산 서열에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된, 합성 또는 재조합 핵산.
  101. β-자일로시다아제 및/또는 L-α-아라비노푸라노시다아제 활성을 갖는, SEQ ID NO:14 의 아미노산 서열에 대해, 또는 SEQ ID NO:14 의 잔기 (i) 21-676, (ii) 21-652, (iii) 469-652, 또는 (iv) 469-676 에 상응하는 아미노산 서열에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된, 합성 또는 재조합 핵산.
  102. β-자일로시다아제 활성을 갖는, SEQ ID NO:16 의 아미노산 서열에 대해, 또는 SEQ ID NO:16 의 잔기 (i) 19-340, (ii) 53-340, (iii) 19-383, 또는 (iv) 53-383 에 상응하는 아미노산 서열에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된, 합성 또는 재조합 핵산.
  103. β-자일로시다아제 활성을 갖는, SEQ ID NO:18 의 아미노산 서열에 대해, 또는 SEQ ID NO:18 의 잔기 (i) 21-341, (ii) 107-341, (iii) 21-348, 또는 (iv) 107-348 에 상응하는 아미노산 서열에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된, 합성 또는 재조합 핵산.
  104. L-α-아라비노푸라노시다아제 활성을 갖는, SEQ ID NO:20 의 아미노산 서열에 대해, 또는 SEQ ID NO:20 의 잔기 (i) 15-558, 또는 (ii) 15-295 의 아미노산 서열에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된, 합성 또는 재조합 핵산.
  105. L-α-아라비노푸라노시다아제 활성을 갖는, SEQ ID NO:22 의 아미노산 서열에 대해, 또는 SEQ ID NO:22 의 잔기 (i) 21-632, (ii) 461-632, (iii) 21-642, 또는 (iv) 461-642 에 상응하는 아미노산 서열에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된, 합성 또는 재조합 핵산.
  106. β-자일로시다아제 활성을 갖는, SEQ ID NO:2 의 아미노산 서열에 대해, 또는 SEQ ID NO:2 의 잔기 (i) 24-766, (ii) 73-321, (iii) 73-394, (iv) 395-622, (v) 24-622, 또는 (iv) 73-622 에 상응하는 아미노산 서열에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된, 합성 또는 재조합 핵산.
  107. L-α-아라비노푸라노시다아제 활성을 갖는, SEQ ID NO:32 의 아미노산 서열에 대해, 또는 SEQ ID NO:32 의 잔기 (i) 21-660, (ii) 21-645, (iii) 450-645, 또는 (iv) 450-660 에 상응하는 아미노산 서열에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 폴리펩티드를 인코딩하는 단리된, 합성 또는 재조합 핵산.
  108. β-자일로시다아제 활성을 갖는, SEQ ID NO:28 의 아미노산 서열에 대해, 또는 SEQ ID NO:28 의 잔기 (i) 20-341, (ii) 21-350, (iii) 107-341, 또는 (iv) 107-350 에 상응하는 아미노산 서열에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 단리된 폴리펩티드.
  109. β-자일로시다아제 활성을 갖는, SEQ ID NO:4 의 아미노산 서열에 대해, 또는 SEQ ID NO:4 의 잔기 (i) 21-445, (ii) 21-301, (iii) 21-323, (iv) 21-444, (v) 302-444, (vi) 302-445, (vii) 324-444, 또는 (viii) 324-445 에 상응하는 아미노산 서열에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 단리된 폴리펩티드.
  110. β-자일로시다아제 활성을 갖는, SEQ ID NO:6 의 아미노산 서열에 대해, 또는 SEQ ID NO:6 의 잔기 (i) 19-530, (ii) 29-530, (iii) 19-300, 또는 (iv) 29-300 에 상응하는 아미노산 서열에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 단리된 폴리펩티드.
  111. β-자일로시다아제 활성을 갖는, SEQ ID NO:8 의 아미노산 서열에 대해, 또는 SEQ ID NO:8 의 잔기 (i) 20-439, (ii) 20-291, (iii) 145-291, 또는 (iv) 145-439 에 상응하는 아미노산 서열에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 단리된 폴리펩티드.
  112. β-자일로시다아제 활성을 갖는, SEQ ID NO:10 의 아미노산 서열에 대해, 또는 SEQ ID NO:10 의 잔기 (i) 23-449, (ii) 23-302, (iii) 23-320, (iv) 23-448, (v) 303-448, (vi) 303-449, (vii) 321-448, 또는 (viii) 321-449 에 상응하는 아미노산 서열에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 단리된 폴리펩티드.
  113. β-자일로시다아제 및/또는 L-α-아라비노푸라노시다아제 활성을 갖는, SEQ ID NO:12 의 아미노산 서열에 대해, 또는 SEQ ID NO:12 의 잔기 (i) 17-574, (ii) 27-574, (iii) 17-303, 또는 (iv) 27-303 에 상응하는 아미노산 서열에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 단리된 폴리펩티드.
  114. β-자일로시다아제 및/또는 L-α-아라비노푸라노시다아제 활성을 갖는, SEQ ID NO:14 의 아미노산 서열에 대해, 또는 SEQ ID NO:14 의 잔기 (i) 21-676, (ii) 21-652, (iii) 469-652, 또는 (iv) 469-676 에 상응하는 아미노산 서열에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 단리된 폴리펩티드.
  115. β-자일로시다아제 활성을 갖는, SEQ ID NO:16 의 아미노산 서열에 대해, 또는 SEQ ID NO:16 의 잔기 (i) 19-340, (ii) 53-340, (iii) 19-383, 또는 (iv) 53-383 에 상응하는 아미노산 서열에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 단리된 폴리펩티드.
  116. β-자일로시다아제 활성을 갖는, SEQ ID NO:18 의 아미노산 서열에 대해, 또는 SEQ ID NO:18 의 잔기 (i) 21-341, (ii) 107-341, (iii) 21-348, 또는 (iv) 107-348 에 상응하는 아미노산 서열에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 단리된 폴리펩티드.
  117. L-α-아라비노푸라노시다아제 활성을 갖는, SEQ ID NO:20 의 아미노산 서열에 대해, 또는 SEQ ID NO:20 의 잔기 (i) 15-558, 또는 (ii) 15-295 에 상응하는 아미노산 서열에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 단리된 폴리펩티드.
  118. L-α-아라비노푸라노시다아제 활성을 갖는, SEQ ID NO:22 의 아미노산 서열에 대해, 또는 SEQ ID NO:22 의 잔기 (i) 21-632, (ii) 461-632, (iii) 21-642, 또는 (iv) 461-642 에 상응하는 아미노산 서열에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 단리된 폴리펩티드.
  119. β-자일로시다아제 활성을 갖는, SEQ ID NO:2 의 아미노산 서열에 대해, 또는 SEQ ID NO:2 의 잔기 (i) 24-766, (ii) 73-321, (iii) 73-394, (iv) 395-622, (v) 24-622, 또는 (iv) 73-622 에 상응하는 아미노산 서열에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 단리된 폴리펩티드.
  120. L-α-아라비노푸라노시다아제 활성을 갖는, SEQ ID NO:32 의 아미노산 서열에 대해, 또는 SEQ ID NO:32 의 잔기 (i) 21-660, (ii) 21-645, (iii) 450-645, 또는 (iv) 450-660 에 상응하는 아미노산 서열에 대해 서열 일치성이 90% 이상인 단리된 폴리펩티드.
  121. 제 108 항 내지 제 120 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드를 재조합적으로 발현하기 위해 조작된 숙주 세포.
  122. 제 121 항에 있어서, 사상균의 세포인 숙주 세포.
  123. 제 122 항에 있어서, 트리코더마, 휴미콜라, 후사리움, 아스퍼길러스, 뉴로스포라, 페니실리움, 세팔로스포리움, 아클야, 포도스포라, 엔도티아, 무코르, 코클리오볼러스, 피리쿨라리아, 파네로카에트, 또는 크리소스포리움의 세포인 숙주 세포.
  124. 제 122 항에 있어서, 아스퍼길러스 아와모리, 아스퍼길러스 후미가투스, 아스퍼길러스 포에티두스, 아스퍼길러스 자포니쿠스, 아스퍼길러스 니둘란스, 아스퍼길러스 니거, 아스퍼길러스 오리재, 크리소스포리움 럭노웬스, 후사리움 박트리디오이드, 후사리움 세레알리스, 후사리움 크룩웰렌스, 후사리움 쿨모룸, 후사리움 그라미네아룸, 후사리움 그라미눔, 후사리움 헤테로스포룸, 후사리움 네군디, 후사리움 옥시스포룸, 후사리움 레티쿨라툼, 후사리움 로세움, 후사리움 삼부시눔, 후사리움 사르코크로움, 후사리움 스포로트리치오이드, 후사리움 술푸레움, 후사리움 토룰로숨, 후사리움 트리코테시오이드, 후사리움 베네나툼, 브저르칸데라 아두스타, 세리포리옵시스 아네이리나, 세리포리옵시스 아네이리나, 세리포리옵시스 카레기에아, 세리포리옵시스 길베센스, 세리포리옵시스 판노신타, 세리포리옵시스 리불로사, 세리포리옵시스 수브루파, 세리포리옵시스 수베르미스포라, 코프리누스 시네레우스, 코리올루스 히르수투스, 휴미콜라 인솔렌스, 휴미콜라 라누기노사, 무코르 미에헤이, 마이셀리오프토라 써모필라, 뉴로스포라 크라사, 뉴로스포라 인테르메디아, 페니실리움 푸르푸로게눔, 페니실리움 카네센스, 페니실리움 솔리툼, 페니실리움 푸니쿨로숨, 파네로카에트 크리소스포리움, 플레비아 라디에이트, 플레우로투스 에린기, 탈라로마이세스 플라부스, 티엘라비아 테레스트리스, 트라메테스 빌로사, 트라메테스 베르시콜로르, 트리코더마 하르지아늄, 트리코더마 코닌기, 트리코더마 롱기브라키아툼, 트리코더마 레세이, 또는 트리코더마 비리드의 세포인 숙주 세포.
  125. 제 122 항 또는 제 123 항에 있어서, 트리코더마 종, 펜실리움, 아스퍼길러스, 또는 후사리움의 세포인 숙주 세포.
  126. 제 125 항에 있어서,
    (a) 트리코더마 종이 트리코더마 레세이이거나;
    (b) 펜실리움이 펜실리움 푸니쿨로숨이거나;
    (c) 아스퍼길러스가 아스퍼길러스 오리재 또는 아스퍼길러스 니둘란스이거나;
    (d) 후사리움이 후사리움 버티실리오이드 또는 후사리움 옥시스포룸인 숙주 세포.
  127. 제 121 항에 있어서, 박테리움의 세포인 숙주 세포.
  128. 제 127 항에 있어서, 박테리움이 스트렙토마이세스 (Streptomyces), 써모모노스포라 (Thermomonospora), 바실러스 (Bacillus), 또는 셀룰로모나스 (Cellulomonas) 인 숙주 세포.
  129. 제 1 항 내지 제 80 항 중 어느 한 항에 따른 조성물 또는 제 81 항 내지 제 88 항 중 어느 한 항에 따른 발효 브로쓰를 제조하는 방법.
  130. 헤미셀룰로오스를 포함하는 바이오매스 물질을, 제 1 항 내지 제 80 항 중 어느 한 항에 따른 조성물 또는 제 81 항 내지 제 88 항 중 어느 한 항에 따른 발효 브로쓰로 처리하는 것을 포함하는 당화 방법.
  131. 제 130 항에 있어서, 바이오매스 물질이 셀룰로오스를 추가로 포함하는 방법.
  132. 제 130 항 또는 제 131 항에 있어서, 자일라나아제 활성을 갖는 폴리펩티드의 양이 바이오매스 물질 중에서 헤미셀룰로오스 1 kg 당 1 g 내지 40 g 인 방법.
  133. 제 130 항 또는 제 131 항에 있어서, 자일라나아제 활성을 갖는 폴리펩티드의 양이 바이오매스 물질 중에서 헤미셀룰로오스 1 kg 당 0.5 g 내지 40 g 인 방법.
  134. .
  135. 제 130 항 내지 제 133 항 중 어느 한 항에 있어서, β-자일로시다아제 활성을 갖는 폴리펩티드의 양이 바이오매스 물질 중에서 헤미셀룰로오스 1 kg 당 1 g 내지 50 g 인 방법.
  136. 제 130 항 내지 제 133 항 중 어느 한 항에 있어서, β-자일로시다아제 활성을 갖는 폴리펩티드의 양이 바이오매스 물질 중에서 헤미셀룰로오스 1 kg 당 0.5 g 내지 50 g 인 방법.
  137. 제 130 항 내지 제 136 항 중 어느 한 항에 있어서, L-α-아라비노푸라노시다아제 활성을 갖는 폴리펩티드의 양이 바이오매스 물질 중에서 헤미셀룰로오스 1 kg 당 0.5 g 내지 20 g 인 방법.
  138. 제 130 항 내지 제 136 항 중 어느 한 항에 있어서, L-α-아라비노푸라노시다아제 활성을 갖는 폴리펩티드의 양이 바이오매스 물질에서 헤미셀룰로오스 1 kg 당 0.2 g 내지 20 g 인 방법.
  139. 제 130 항 내지 제 138 항 중 어느 한 항에 있어서, 셀룰라아제 활성을 갖는 폴리펩티드의 양이 바이오매스 물질 중에서 셀룰로오스 1 kg 당 1 g 내지 100 g 인 방법.
  140. 제 130 항 내지 제 139 항 중 어느 한 항에 있어서, β-글루코시다아제 활성을 갖는 폴리펩티드의 양이 셀룰라아제 활성을 갖는 폴리펩티드의 총 중량의 50% 이하인 방법.
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