CN102027124B - 用于生产异戊二烯的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明描述了从培养的细胞生产异戊二烯的方法。本发明也提供了包含这些培养的细胞的组合物。

Description

用于生产异戊二烯的组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2007年12月13日递交的美国临时专利申请号61/013,574的优先权。该申请的内容在此通过整体引用作为参考。
发明领域
本发明大体涉及从培养细的胞生产异戊二烯的方法以及包括这些培养细胞的组合物。
发明背景
异戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)是多种合成聚合物，最典型为合成橡胶的关键起始材料。异戊二烯是由多种微生物、植物、和动物种类所天然生产的。特别地，已经鉴定出异戊二烯的两种生物合成途径：甲羟戊酸(MVA)途径和非甲羟戊酸(DXP)途径(图19A和19B)。然而，来自天然发生的生物的异戊二烯产量在商业上并不具吸引力。每年从异戊二烯的聚合生产约800,000吨的顺式聚异戊二烯；该聚异戊二烯中大多数被用于轮胎和橡胶工业。异戊二烯也被共聚合以在其他产品如鞋类、机械产品、医药产品、运动商品和胶乳中用作合成高弹体。
目前，轮胎和橡胶工业是基于天然和合成橡胶的使用。天然橡胶获自橡胶树或在非洲雨林中发现的植物的乳汁。合成橡胶主要是基于丁二烯聚合物。对于这些聚合物，丁二烯作为乙烯和丙烯生产的副产物而获得。
虽然异戊二烯可以通过石油分馏而获得，但是这一物质的纯化是昂贵且耗时的。对C5烃类流的石油裂化只产生约15％的异戊二烯。因此，需要生产异戊二烯的更加经济的方法。特别地，期望在速度、滴定度和纯度方面有足以满足稳健的商业化工艺要求的生产异戊二烯的方法。也期望从廉价的起始材料生产异戊二烯的系统。
发明简要说明
一方面，本发明表征了生产异戊二烯的培养细胞。在一些实施方式中，本发明提供培养细胞，该培养细胞产生基于异戊二烯的细胞湿重/小时(纳摩尔/gwcm/hr)计，大于约400纳摩尔的异戊二烯/克细胞。在一些实施方式中，该细胞具有(i)编码异戊二烯合酶多肽和(ii)有效地连接到启动子的异源核酸。在一些实施方式中，该细胞在包括碳源的培养基中培养，该碳源例如但不限于碳水化合物(例如木糖或葡萄糖)、乙酸盐/酯、丙三醇、甘油、二羟丙酮、单碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂类、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源(例如水解的生物量碳源)、多肽(例如微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、来自酵母提取物的组分或前述两种或更多种的任一组合。
在一些实施方式中，本发明提供具有异戊二烯的平均体积生产力大于约0.1mg/L培养液/hr的培养细胞。在一些实施方式中，本发明提供具有异戊二烯的峰值体积生产力大于约0.5mg/L培养液/hr的培养细胞。在一些实施方式中，该细胞具有(i)编码异戊二烯合酶多肽和(ii)有效地连接到启动子的异源核酸。在一些实施方式中，该细胞在包括碳源的培养基中培养，该碳源例如但不限于碳水化合物(例如，木糖或葡萄糖)、乙酸盐/酯、丙三醇、甘油、二羟丙酮、单碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂类、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源(例如水解的生物量碳源)、多肽(例如微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、来自酵母提取物的组分或前述两种或更多种的任一组合。
在一些实施方式中，本发明提供将细胞培养基中大于约0.002％的碳转化成异戊二烯的培养细胞。在一些实施方式中，该细胞具有(i)编码异戊二烯合酶多肽和(ii)有效地连接到启动子的异源核酸。在一些实施方式中，该细胞在包括碳源的培养基中培养，该碳源例如但不限于碳水化合物(例如，木糖或葡萄糖)、乙酸盐/酯、丙三醇、甘油、二羟丙酮、单碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂类、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源(例如水解的生物量碳源)、多肽(例如微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、来自酵母提取物的组分或前述两种或更多种的任一组合。
在一些实施方式中，本发明提供包括编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸的培养细胞。在一些实施方式中，该细胞具有(i)编码异戊二烯合酶多肽和(ii)有效地连接到启动子的异源核酸。在一些实施方式中，该细胞在包括碳源的培养基中培养，该碳源例如但不限于碳水化合物(例如，木糖或葡萄糖)、乙酸盐/酯、丙三醇、甘油、二羟丙酮、单碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂类、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源(例如水解的生物量碳源)、多肽(例如微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、来自酵母提取物的组分或前述两种或更多种的任一组合。
在一方面，本发明表征了生产异戊二烯的方法，例如使用在此所述的任何细胞生产异戊二烯的方法。在一些实施方式中，该方法包括在足以生产大于约400纳摩尔/gwcm/hr的异戊二烯的条件下，培养细胞。在一些实施方式中，该方法也包括回收由该细胞生产的异戊二烯。在一些实施方式中，该方法包括纯化由该细胞生产的异戊二烯。在一些实施方式中，该方法包括使异戊二烯聚合。在一些实施方式中，该细胞具有(i)编码异戊二烯合酶多肽和(ii)有效地连接到启动子的异源核酸。在一些实施方式中，该细胞在包括碳源的培养基中培养，该碳源例如但不限于碳水化合物(例如，木糖或葡萄糖)、乙酸盐/酯、丙三醇、甘油、二羟丙酮、单碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂类、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源(例如水解的生物量碳源)、多肽(例如微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、来自酵母提取物的组分或前述两种或更多种的任一组合。
在一方面，本发明表征了生产异戊二烯的方法，例如使用在此所述的任何细胞生产异戊二烯的方法。在一些实施方式中，该方法包括在使得异戊二烯的平均体积生产力大于约0.1mg/L培养液/hr的条件下，培养细胞。在一些实施方式中，该方法包括在使得异戊二烯的峰值体积生产力大于约0.5mg/L培养液/hr的条件下，培养细胞。在一些实施方式中，该方法也包括回收由该细胞生产的异戊二烯。在一些实施方式中，该方法包括纯化由该细胞生产的异戊二烯。在一些实施方式中，该方法包括使异戊二烯聚合。在一些实施方式中，该细胞具有(i)编码异戊二烯合酶多肽和(ii)有效地连接到启动子的异源核酸。在一些实施方式中，该细胞在包括碳源的培养基中培养，该碳源例如但不限于碳水化合物(例如木糖或葡萄糖)，乙酸盐/酯、丙三醇、甘油、二羟丙酮、单碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂类、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源(例如水解的生物量碳源)、多肽(例如微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、来自酵母提取物的组分或前述两种或更多种的任一组合。
在一些实施方式中，该方法包括在足以将细胞培养基中大于约0.002％的碳转化成异戊二烯的条件下，培养细胞。在一些实施方式中，该方法也包括回收由该细胞生产的异戊二烯。在一些实施方式中，该方法包括纯化由该细胞生产的异戊二烯。在一些实施方式中，该方法包括使异戊二烯聚合。在一些实施方式中，该细胞具有(i)编码异戊二烯合酶多肽和(ii)有效地连接到启动子的异源核酸。在一些实施方式中，该细胞在包括碳源的培养基中培养，该碳源例如但不限于碳水化合物(例如，木糖或葡萄糖)、乙酸盐/酯、丙三醇、甘油、二羟丙酮、单碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂类、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源(例如水解的生物量碳源)、多肽(例如微生物或植物蛋白或肽)、酵母提取物、来自酵母提取物的组分或前述两种或更多种的任一组合。
在本发明任何方面的一些实施方式中，培养细胞以大于或约400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、12,500、20,000、30,000、40,000、50,000、75,000、100,000、125,000、150,000、188,000，或更多纳摩尔/gwcm/hr的异戊二烯来生产异戊二烯。在一些实施方式中，培养细胞具有异戊二烯的平均体积生产力为大于或约0.1、1.0、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1100、1200、1300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,100、2,200、2,300、2,400、2,500、2,600、2,700、2,800、2,900、3,000、3,100、3,200、3,300、3,400、3,500，或更多mg的异戊二烯/L培养液/hr(mg/L培养液/hr，其中培养液的体积包括细胞和细胞培养基的体积)。在一些实施方式中，培养细胞具有异戊二烯的峰值体积生产力高于或约0.5、1.0、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1100、1200、1300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,100、2,200、2,300、2,400、2,500、2,600、2,700、2,800、2,900、3,000、3,100、3,200、3,300、3,400、3,500、3,750、4,000、4,250、4,500、4,750、5,000、5,250、5,500、5,750、6,000、6,250、6,500、6,750、7,000、7,250、7,500、7,750、8,000、8,250、8,500、8,750、9,000、9,250、9,500、9,750、10,000、12,500、15,000，或更多mg的异戊二烯/L的培养液/hr(mg/L培养液/hr，其中培养液的体积包括细胞和细胞培养基的体积)。在本发明任何方面的一些实施方式中，培养细胞将在细胞培养基中以大于或约0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.12、0.14、0.16、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6、2.0、2.2、2.4、2.6、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0、15.0、16.0、17.0、18.0、19.0、20.0、21.0、22.0、23.0、23.2、23.4、23.6、23.8、24.0、25.0、30.0、31.0、32.0、33.0、35.0、37.5、40.0、45.0、47.5、50.0、55.0、60.0、65.0、70.0、75.0、80.0、85.0、90.0摩尔％，或更多的碳转化成异戊二烯。在本发明任何方面的一些实施方式中，培养细胞以基于细胞湿重/hr(ng/gwcm/h)计，大于或约1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、100,000，或更多ng的异戊二烯/克细胞来生产异戊二烯。在本发明任何方面的一些实施方式中，培养细胞以大于或约1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、50,000、100,000，或更多mg的异戊二烯/L培养液(mg/L培养液，其中培养液的体积包括细胞和细胞培养基的体积)来生产累积滴定度(总量)的异戊二烯。在此公开了其他示例性的异戊二烯生产速率和异戊二烯生产总量。
在本发明任何方面的一些实施方式中，细胞还包括编码IDI多肽的异源核酸。在本发明任何方面的一些实施方式中，细胞还包括编码IDI多肽的内源核酸拷贝的插入。在本发明任何方面的一些实施方式中，细胞还包括编码DXS多肽的异源核酸。在本发明任何方面的一些实施方式中，细胞还包括编码DXS多肽的内源核酸拷贝的插入。在本发明任何方面的一些实施方式中，细胞还包括编码IDI多肽和DXS多肽的一种或多种核酸。在本发明任何方面的一些实施方式中，一种核酸编码异戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS多肽。在本发明任何方面的一些实施方式中，一种载体编码异戊二烯合酶多肽、IDI多肽和DXS多肽。在本发明一些实施方式中，载体包括选择标记，如抗生素抗性核酸。
在本发明任何方面的一些实施方式中，异源异戊二烯合酶核酸有效连接T7启动子，例如在中或高拷贝质粒中含有的T7启动子。在本发明任何方面的一些实施方式中，异源异戊二烯合酶核酸有效连接Trc启动子，例如在中或高拷贝质粒中含有的Trc启动子。在本发明任何方面的一些实施方式中，异源异戊二烯合酶核酸有效连接Lac启动子，例如在低拷贝质粒中含有的Lac启动子。在本发明任何方面的一些实施方式中，异源异戊二烯合酶核酸有效连接内源启动子，例如内源性碱性丝氨酸蛋白酶启动子。在一些实施方式中，异源异戊二烯合酶核酸整合到不带选择性标记的细胞的染色体中。
在本发明任何方面的一些实施方式中，至少一部分细胞在连续培养(如未稀释的连续培养)中维持异源异戊二烯合酶核酸至少或约5、10、20、40、50、60、65或更多的细胞分裂。在本发明任何方面的一些实施方式中，包括异戊二烯合酶、IDI或DXS核酸的核酸也包括选择性标记，例如抗生素抗性核酸。
在本发明任何方面的一些实施方式中，细胞还包括编码MVA途径多肽(例如来自酿酒酵母(Saccharomycescerevisi)、马氏甲烷八叠球菌(Methanosarcinamazei)、或粪肠球菌(Enterococcusfaecalis)的MVA途径多肽)的异源核酸。在本发明任何方面的一些实施方式中，细胞还包括编码MVA途径多肽(例如来自酿酒酵母、马氏甲烷八叠球菌、或粪肠球菌的MVA途径多肽)的内源核酸拷贝的插入。在本发明任何方面的一些实施方式中，细胞包括异戊二烯合酶、DXS和MVA途径核酸。在本发明任何方面的一些实施方式中，细胞包括异戊二烯合酶核酸、DXS核酸、IDI核酸和MVA途径核酸(除了IDI核酸以外)。
在本发明任何方面的一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽是天然发生的多肽，其来自植物如葛属(Pueraria)(例如，葛麻姆(Puerariamontana))、或杨(Populus)(如Populustremuloides，银白杨(P.alba)，黑杨(Populusnigra)，Populustrichocarpa，或银白杨欧洲山杨的杂交品种)。
在本发明任何方面的一些实施方式中，细胞是细菌细胞，如革兰氏阳性细菌细胞(例如芽孢杆菌细胞如枯草杆菌(Bacillussubtilis)细胞或链霉菌(Streptomyces)细胞如浅青紫链霉菌(Streptomyceslividans)、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)、天蓝色链霉菌(Streptomycescoelicolor)、白色链霉菌(Streptomycesalbus)、或灰色链霉菌(Streptomycesgriseus)细胞)。在本发明任何方面的一些实施方式中，细胞是革兰氏阴性细菌细胞(例如埃希氏菌(Escherichia)细胞如大肠杆菌细胞或泛菌(Pantoea)细胞如柠檬泛菌(Pantoeacitrea)细胞)。在一些实施方式中，大肠杆菌细胞是大肠杆菌FadRatoC突变细胞。在一些实施方式中，大肠杆菌细胞表达(例如组成型表达)ybhE(也称作pgl)。在本发明任何方面的一些实施方式中，细胞是真菌细胞如丝状真菌细胞(例如木霉属(Trichoderma)细胞如里氏木霉(Trichodermareesei)细胞或曲霉(Aspergillus)细胞如米曲霉(Aspergillusoryzae)和黑曲霉(Aspergillusniger)或酵母细胞(如耶氏酵母属(Yarrowia)细胞如解脂耶氏酵母(Yarrowialipolytica)细胞)。
在本发明任何方面的一些实施方式中，微生物多肽碳源包括来自酵母或细菌的一或多种多肽。在本发明任何方面的一些实施方式中，植物多肽碳源包括来自大豆、玉米、油菜、麻风树、棕榈树、花生、向日葵、椰子、芥菜、油菜籽、棉籽、棕榈仁、橄榄、红花、芝麻、或亚麻籽的一或多种多肽。
在一方面，本发明提供包含聚异戊二烯的轮胎。在一些实施方式中，该聚异戊二烯是由(i)聚合来自在此所述的任一组合物或方法的异戊二烯或(ii)聚合由在此所述的任一组合物或方法回收的异戊二烯所生产的。在一些实施方式中，聚异戊二烯包含顺式-1，4-聚异戊二烯。
在一方面，本发明表征了由任何的本发明组合物或方法所生产的产物(例如轮胎)。
应理解的是，可组合在此所述的多种实施方式的一个、多个或全部特性以形成本发明的其它实施方式。本发明的这些以及其他方面对于本领域技术人员是显而易见的。
附图简要说明
图1是用于在大肠杆菌中表达而密码子优化的野葛异戊二烯合酶基因的核苷酸序列(SEQIDNO：1)。atg起始密码子为斜体，终止密码子为粗体而添加的PstI位点有下划线。
图2是pTrcKudzu的图谱。
图3是pTrcKudzu的核苷酸序列(SEQIDNO：2)。RBS有下划线，野葛异戊二烯合酶起始密码子为粗体大写字母而终止密码子为粗体、大写、斜体字母。载体骨架是pTrcHis2B。
图4是pETNHisKudzu的图谱。
图5是pETNHisKudzu的核苷酸序列(SEQIDNO：5)。
图6是pCL-lac-Kudzu的图谱。
图7是pCL-lac-Kudzu的核苷酸序列(SEQIDNO：7)。
图8A是示出在没有载体的大肠杆菌BL21细胞中异戊二烯生产的图。
图8B是示出在具有pCL-lac-Kudzu的大肠杆菌BL21细胞中异戊二烯生产的图。
图8C是示出在具有pTrcKudzu的大肠杆菌BL21细胞中异戊二烯生产的图。
图8D是示出在具有pETN-HisKudzu的大肠杆菌BL21细胞中异戊二烯生产的图。
图9A是示出在14升补料分批发酵中大肠杆菌BL21/pTrcKudzu随发酵进程的OD的图。
图9B是示出在14升补料分批发酵中大肠杆菌BL21/pTrcKudzu随发酵进程的异戊二烯生产的图。
图10A是示出在柠檬泛菌中的异戊二烯生产的图。对照细胞没有重组野葛异戊二烯合酶。灰色菱形表示异戊二烯合成，黑色方块表示OD600。
图10B是示出在表达pCL-lacKudzu的柠檬泛菌中异戊二烯的生产的图。灰色菱形表示异戊二烯合成，黑色方块表示OD600。
图10C是示出在表达pTrcKudzu的柠檬泛菌中的异戊二烯生产的图。灰色菱形表示异戊二烯合成，黑色方块表示OD600。
图11是示出在表达重组异戊二烯合酶的枯草杆菌中的异戊二烯生产的图。BG3594comK是没有质粒的枯草杆菌菌株(天然异戊二烯生产)。CF443-BG3594comK是具有pBSKudzu的枯草杆菌菌株(重组异戊二烯生产)。y-轴上的IS表示异戊二烯。
图12是pBSKudzu#2的核苷酸序列(SEQIDNO：57)。
图13是用于在耶氏酵母中表达而密码子优化的野葛异戊二烯合酶的核苷酸序列(SEQIDNO：8)。
图14是包含用于在耶氏酵母中表达而密码子优化的野葛异戊二烯合酶基因的pTrex3g图谱。
图15是载体pSPZ1(MAP29Spb)的核苷酸序列(SEQIDNO：11)。
图16是用于在耶氏酵母中表达而密码子优化的合成的野葛(葛麻姆)异戊二烯基因的核苷酸序列(SEQIDNO：12)。
图17是合成的杂交杨(银白杨x欧洲山杨)异戊二烯合酶基因的核苷酸序列(SEQIDNO：13)。ATG起始密码子为粗体而终止密码子有下划线。
图18A示出描绘载体pYLA1、pYL1和pYL2的构建的示意图。
图18B示出描绘载体pYLA(POP1)的构建的示意图。
图18C示出描绘载体pYLA(KZ1)的构建的示意图。
图18D示出描绘载体pYL1(KZ1)的构建的示意图。
图18E示出描绘载体pYLI(MAP29)的构建的示意图。
图18F示出描绘载体pYLA(MAP29)的构建的示意图。
图19A示出异戊二烯的MVA和DXP代谢途径(根据F.Bouvier等人，ProgressinLipidRes.44：357-429，2005)。下面的描述包括对于途径中每种多肽的替代名称以及公开有用于测量所示多肽活性的检测法的参考(这些参考各在此通过整体引用作为参考，特别是对于在MVA和DXP途径中的多肽的多肽活性检测法)。甲羟戊酸途径：AACT；乙酰基-CoA乙酰基转移酶，MvaE，EC2.3.1.9.Assay：J.Bacteriol.，184：2116-2122，2002；HMGS；羟甲基戊二酰基-CoA合成酶，MvaS，EC2.3.3.10.Assay：IBacteriol.，184：4065-4070，2002；HMGR；3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA还原酶，MvaE，EC1.1.1.34.Assay：IBacteriol.，184：2116-2122，2002；MVK；甲羟戊酸激酶，ERG12，EC2.7.1.36.Assay：CurrGenet19：9-14，1991.PMK；磷酸甲羟戊酸激酶，ERG8，EC2.7.4.2，Assay：MolCellBiol.，11：620-631，1991；DPMDC；二磷酸甲羟戊酸脱羧酶，MVD1，BC4.1.1.33.Assay：Biochemistry，33：13355-13362，1994；IDI；异戊烯二磷酸δ异构酶，IDI1，EC5.3.3.2.Assay：IBiol.Chem.264：19169-19175，1989。DXP途径：DXS；1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶，dxs，BC2.2.1.7.Assay：PNAS，94：12857-62，1997；DXR；1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸还原异构酶，dxr，BC2.2.1.7.Assay：Eur.IBiochem.269：4446-4457，2002；MCT；4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D赤藓糖醇合酶，IspD，EC2.7.7.60.Assay：PNAS，97：6451-6456，2000；CMK；4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D赤藓糖醇激酶，IspE，BC2.7.1.148.Assay：PNAS，97：1062-1067，2000；MCS；2C-甲基-D-赤藓糖醇2，4-环二磷酸合酶，IspF，BC4.6.1.12.Assay：PNAS，96：11758-11763，1999；HDS；1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合酶，ispG，EC1.17.4.3.Assay：IOrg.Chem.，70：9168-9174，2005；HDR；1-羟基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸还原酶，IspH，BC1.17.1.2.Assay：JACS，126：12847-12855，2004。
图19B说明了经典的和改良的MVA途径。1，乙酰-CoA乙酰基转移酶(AACT)；2，HMG-CoA合酶(HMGS)；3，HMG-CoA还原酶(HMGR)；4，甲羟戊酸激酶(MVK)；5，磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)；6，二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD或DPMDC)；7，异戊烯基二磷酸异构酶(IDI)；8，磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMDC)；9，异戊烯基磷酸激酶(IPK)。经典MVA途径从反应1开始，通过反应5和6至反应7来进行，而改良MVA途径经反应8和9至反应7。结构式中的P和PP分别是磷酸和焦磷酸。这一图取自Koga和Morii，MicrobiologyandMol.BiologyReviews，71：97-120，2007，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于改良MVA途径的核酸和多肽。改良MVA途径例如存在于诸如马氏甲烷八叠球菌的一些古生物中。
图20示出表示由没有(左)或具有(右)野葛异戊二烯合酶基因的重组解脂耶氏酵母菌株生产的异戊二烯的GC-MS分析结果的图。箭头表示真正的异戊二烯标准的洗脱时间。
图21是pTrcKudzuyIDIDXSKan的图谱。
图22是pTrcKudzuyIDIDXSKan的核苷酸序列(SEQIDNO：20)。
图23A是示出在BL21/pTrcKudzukan中从葡萄糖生产异戊二烯的图。时间0是以IPTG(400μmol)诱导的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600并且y2轴是异戊二烯的总生产力(μg/L顶空或比生产力(μg/L顶空/OD)。菱形表示OD600，圆圈表示总异戊二烯生产力(μg/L)而方块表示异戊二烯的比生产力(μg/L/OD)。
图23B是示出在BL21/pTrcKudzuyIDIkan中从葡萄糖生产的异戊二烯的图。时间0是以IPTG(400μmol)诱导的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600并且y2轴是异戊二烯的总生产力(μg/L顶空或比生产力(μg/L顶空/OD)。菱形表示OD600，圆圈表示总异戊二烯生产力(μg/L)而方块表示异戊二烯的比生产力(μg/L/OD)。
图23C是示出在BL21/pTrcKudzuDXSkan中从葡萄糖生产的异戊二烯的图。时间0是以IPTG(400μmol)诱导的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600并且y2轴是异戊二烯的总生产力(μg/L顶空或比生产力(μg/L顶空/OD)。菱形表示OD600，圆圈表示总异戊二烯生产力(μg/L)而方块表示异戊二烯的比生产力(μg/L/OD)。
图23D是示出在BL21/pTrcKudzuyIDIDXSkan中从葡萄糖生产的异戊二烯的图。时间0是以IPTG(400μmol)诱导的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600并且y2轴是异戊二烯的总生产力(μg/L顶空或比生产力(μg/L顶空/OD)。菱形表示OD600，圆圈表示总异戊二烯生产力(μg/L)而方块表示异戊二烯的比生产力(μg/L/OD)。
图23E是示出在BL21/pCLPTrcKudzu中从葡萄糖生产异戊二烯的图。时间0是以IPTG(400μmol)诱导的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600并且y2轴是异戊二烯的总生产力(μg/L顶空或比生产力(μg/L顶空/OD)。菱形表示OD600，圆圈表示总异戊二烯生产力(μg/L)而方块表示异戊二烯的比生产力(μg/L/OD)。
图23F是示出在BL21/pCLPTrcKudzuyIDI中从葡萄糖生产异戊二烯的图。时间0是以IPTG(400μmol)诱导的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600并且y2轴是异戊二烯的总生产力(μg/L顶空或比生产力(μg/L顶空/OD)。菱形表示OD600，圆圈表示总异戊二烯生产力(μg/L)而方块表示异戊二烯的比生产力(μg/L/OD)。
图23G是示出在BL21/pCLPTrcKudzuDXS中从葡萄糖生产异戊二烯的图。时间0是以IPTG(400μmol)诱导的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600并且y2轴是异戊二烯的总生产力(μg/L顶空或比生产力(μg/L顶空/OD)。菱形表示OD600，圆圈表示总异戊二烯生产力(μg/L)而方块表示异戊二烯的比生产力(μg/L/OD)。
图23H是示出在BL21/pTrcKudzuIDIDXSkan中从葡萄糖生产的异戊二烯的图。时间0是以IPTG(400μmol)诱导的时间。x轴是诱导后的时间；y轴是OD600并且y2轴是异戊二烯的总生产力(μg/L顶空或比生产力(μg/L顶空/OD)。黑色菱形表示OD600，黑色三角表示总异戊二烯生产力(μg/L)而白色方块表示异戊二烯的比生产力(μg/L/OD)。
图24是pTrcKKDyIkISkan的图谱。
图25是pTrcKKDyIkISkan的核苷酸序列(SEQIDNO：33)。
图26是pCLPtrcUpperPathway的图谱。
图27是pCLPtrcUpperPathway的核苷酸序列(SEQIDNO：46)。
图28示出含有下游MVA途径和用于整合到枯草杆菌染色体nprE座位的酵母idi的表达盒的图谱。nprE上游/下游表示来自nprE位点用于整合的各1kb序列。aprE启动子(碱性丝氨酸蛋白酶启动子)表示aprE基因的启动子(-35，-10，+1转录起始位点，RBS)。MVK1表示酵母甲羟戊酸激酶基因。RBS-PMK表示具有起始位点的芽孢杆菌RBS上游的酵母磷酸甲羟戊酸激酶基因。RBS-MPD表示具有起始位点上游的芽孢杆菌PBS的酵母二磷酸甲羟戊酸脱羧酶基因。RBS-IDI表示具有起始位点上游的芽孢杆菌RBS的酵母idi基因。终止子表示来自解淀粉芽孢杆菌(B.amyliquefaciens)的终止子碱性丝氨酸蛋白酶转录终止子。SpecR表示壮观霉素抗性标记。“用于扩增的nprE上游重复”表示用于扩增的上游区域的直接重复。
图29是含有下游MVA途径和用于整合到枯草杆菌染色体nprE座位的酵母idi的表达盒的核苷酸序列(SEQIDNO：47)。
图30是p9796-poplar的图谱。
图31是p9796-poplar的核苷酸序列(SEQIDNO：48)。
图32是pTrcPoplar的图谱。
图33是pTrcPoplar的核苷酸序列(SEQIDNO：49)。
图34是pTrcKudzuyIDIKan的图谱。
图35是pTrcKudzuyIDIKan的核苷酸序列(SEQIDNO：50)。
图36是pTrcKudzuDXSKan的图谱。
图37是pTrcKudzuDXSKan的核苷酸序列(SEQIDNO：51)。
图38是pCLPTrcKudzu的图谱。
图39是pCLPTrcKudzu的核苷酸序列(SEQIDNO：52)。
图40是pCLPTrcKudzuA3的图谱。
图41是pCLPTrcKudzuA3的核苷酸序列(SEQIDNO：53)。
图42是pCLPTrcKudzuyIDI的图谱。
图43是pCLPTrcKudzuyIDI的核苷酸序列(SEQIDNO：54)。
图44是pCLPTrcKudzuDXS的图谱。
图45是pCLPTrcKudzuDXS的核苷酸序列(SEQIDNO：55)。
图46示出表示从生物质原料生产异戊二烯的图。小图A示出来自玉米秸秆的异戊二烯生产，小图B示出来自甘蔗渣的异戊二烯生产，小图C示出来自软木材木浆的异戊二烯生产，小图D示出来自葡萄糖的异戊二烯生产，和小图E示出来自没有添加原料的细胞的异戊二烯生产。灰色方块表示在接种后的指定时间处，对培养物的OD600测量而黑色三角表示在接种后的指定时间的异戊二烯生产。
图47示出表示在没有添加葡萄糖的培养物中由BL21(λDE3)pTrcKudzuyIDIDXS(kan)生产的异戊二烯的图。方块表示OD600，而三角表示所生产的异戊二烯(μg/ml)。
图47B示出表示由BL21(λDE3)pTrcKudzuyIDIDXS(kan)从1％葡萄糖原料转化糖生产的异戊二烯的图。方块表示OD600，而三角表示所生产的异戊二烯(μg/ml)。
图47C示出表示由BL21(λDE3)pTrcKudzuyIDIDXS(kan)从1％转化糖原料生产的异戊二烯的图。方块表示OD600，而三角表示所生产的异戊二烯(μg/ml)。
图47D示出表示由BL21(λDE3)pTrcKudzuyIDIDXS(kan)从1％AFEX玉米秸秆原料生产的异戊二烯的图。方块表示OD600，而三角表示所生产的异戊二烯(μg/ml)。
图48示出表明酵母提取物对异戊二烯生产的影响的图。小图A示出在供给不同量的酵母提取物的发酵罐中光密度的时间进程。小图B示出在供给不同量的酵母提取物的发酵罐中异戊二烯滴定度的时间进程。滴定度定义为每升发酵培养液产生的异戊二烯的量。小图C示出酵母提取物对在生长于补料分批培养物中的大肠杆菌中异戊二烯生产的影响。
图49示出表明在500L生物反应器中含有pTrcKudzu和yIDI和DXS质粒的大肠杆菌细胞生产异戊二烯的图。小图A示出在供应葡萄糖和酵母提取物的500-L生物反应器中的光密度的时间进程。小图B示出在小图葡萄糖和酵母提取物的500-L生物反应器中异戊二烯滴定度的时间进程。滴定度定义为每升发酵培养液产生的异戊二烯的量。小图C示出从供应葡萄糖和酵母提取物的500-L生物反应器生产的总异戊二烯的时间进程。
图50是pJMupperpathway2的图谱。
图51是pJMupperpathway2的核苷酸序列(SEQIDNO：56)。
图52是pBSKudzu#2的图谱。
图53A是示出在14升补料分批发酵中表达重组野葛异戊二烯合酶的芽孢杆菌发酵时间期间的生长。黑色菱形表示没有重组异戊二烯合酶(天然异戊二烯生产)的对照菌株(BG3594comK)而灰色三角表示具有pBSKudzu(重组异戊二烯生产)的芽孢杆菌。
图53B是示出在14升补料分批发酵中表达重组野葛异戊二烯合酶的芽孢杆菌发酵时间期间的异戊二烯生产。黑色菱形表示没有重组异戊二烯合酶(天然异戊二烯生产)的对照菌株(BG3594comK)而灰色三角表示具有pBSKudzu(重组异戊二烯生产)的芽孢杆菌。
图54是质粒pET24P.albaHGS的图谱。
图55A和55B是质粒pET24P.albaHGS的核苷酸序列(SEQIDNO：87)。
图56是示出用于内切核酸酶消化以构建质粒EWL230的限制性位点以及在BspHI和NcoI位点之间的相容性粘性末端的示意图。
图57是质粒EWL230的图谱。
图58A和58B是质粒EWL230的核苷酸序列(SEQIDNO：88)。
图59是示出用于内切核酸酶消化以构建质粒EWL244的限制性位点以及在NsiI和PstI位点之间的相容性粘性末端的示意图。
图60是EWL244的图谱。
图61A和61B是质粒EWL244的核苷酸序列(SEQIDNO：89)。
图62是质粒MCM484-487的图谱。
图63A-63C是质粒MCM484的核苷酸序列(SEQIDNO：90)。
图64A-64C是质粒MCM485的核苷酸序列(SEQIDNO：91)。
图65A-65C是质粒MCM486的核苷酸序列(SEQIDNO：92)。
图66A-66C是质粒MCM487的核苷酸序列(SEQIDNO：93)。
图67A-67D是表达MVA途径的基因并且在以15-L规模的没有酵母提取物供料的补料分批培养中生长的大肠杆菌菌株(EWL256)的异戊二烯生产图。图67A示出在供料葡萄糖的15-L生物反应器中光密度的时间进程。图67B示出在供料葡萄糖的15-L生物反应器中异戊二烯滴定度的时间进程。滴定度定义为每升发酵培养液产生的异戊二烯的量。图67C示出从供料葡萄糖的15-L生物反应器生产的总异戊二烯的时间进程。图67D示出在供料葡萄糖的15-L生物反应器中的总二氧化碳进化率(TCER)、或代谢活性谱。
图68A-68E是表达MVA途径的基因并且在以15-L规模的具有酵母提取物供料的补料分批培养中生长的大肠杆菌菌株(EWL256)的异戊二烯生产图。图68A示出在供料葡萄糖的15-L生物反应器中光密度的时间进程。图68B示出在供料葡萄糖的15-L生物反应器中异戊二烯滴定度的时间进程。滴定度定义为每升发酵培养液产生的异戊二烯的量。图68C示出从供料葡萄糖的15-L生物反应器生产的总异戊二烯的时间进程。图68D示出在供料葡萄糖的15-L生物反应器中的体积生产力。在40小时期间(23-63小时)维持平均值为1.1g/L/hr的酵母提取物加料。图68E示出在供料葡萄糖的15-L生物反应器中的二氧化碳进化率(TCER)、或代谢活性谱。
图69A-69D示出从不同碳源通过MVA(途径)的异戊二烯生产。图69A示出含有MVA途径和异戊二烯合酶的大肠杆菌EWL256在葡萄糖、生物量水解物、丙三醇或乙酸盐/酯作为唯一碳源上的生长。在培养基中添加不同碳源至浓度为1％。包括没有添加碳源的阴性对照。以600nM处的光密度测量生长。图69B示出含有MVA途径和异戊二烯合酶的大肠杆菌EWL256在葡萄糖、生物量水解物、丙三醇或乙酸盐/酯作为唯一碳源上生长时的异戊二烯比生产力。在培养基中添加不同碳源至浓度为1％。包括没有添加碳源的阴性对照。接种后190分钟、255分钟和317分钟取样并使用GC-MS测量细菌生产的异戊二烯。图69C示出大肠杆菌EWL256在葡萄糖或木糖作为唯一碳源上的生长。在培养基中添加不同碳源至浓度为1％。包括没有添加碳源的阴性对照。生长测量为600nM下的光密度。图69D示出大肠杆菌EWL256在葡萄糖或木糖作为唯一碳源上生长的比生产力。在培养基中添加碳源至浓度为1％。包括没有添加碳源的阴性对照。接种后260分钟、322分钟和383分钟取样并使用GC-MS测量细菌生产的异戊二烯。
图70A和70B示出由大肠杆菌菌株分别从葡萄糖和脂肪酸的异戊二烯生产。对于图70A，挑取11个来自用具有下游甲羟戊酸途径的质粒pMCM118转化WW4的菌落来验证下游途径的存在。在含有0.1％酵母提取物和2％葡萄糖的TM3培养基中培养来自这些菌落的细胞。在诱导4小时后检测等份诱导培养物的异戊二烯生产。所有菌落都示出了异戊二烯生产。诱导物IPTG具有强的生长抑制作用，这可见于由50至900uM浓度的诱导物得到3至4.6倍降低的细胞密度(数据未示出)。该图示出较高诱导，导致较高的异戊二烯比滴定度。对于图70B，生产培养物是由以1至10倍稀释的冲洗后的过夜培养物接种。培养物生长若干小时并用50uMIPTG诱导。左栏示出诱导4小时后紧接着1小时异戊二烯累积检测的异戊二烯检测结果。中栏示出对于相同培养物用相同诱导时间，但分析12小时异戊二烯积累检测的1小时归一化数值。右栏示出诱导1小时的培养物的1小时异戊二烯累积检测的数值。
图71是用于从野葛克隆异戊二烯合酶的大肠杆菌-链霉菌(Streptomyces)穿梭载体pUWL201PW(6400bp)的图谱。Tsr，硫链丝菌肽抗性基因。图片取自Doumith等人，Mol.Gen.Genet.264：477-485，2000。
图72示出由白色链霉菌(Streptomycesalbus)野生型菌株(“wt”)和带有质粒pUWL201PW(阴性对照)或pUWL201_iso(编码来自野葛的异戊二烯合酶)的菌株的异戊二烯形成。
图73A是马氏甲烷八叠球菌古细菌的LowerPathway操纵子的图谱。
图73B和73C是马氏甲烷八叠球菌古细菌的LowerPathway操纵子的核苷酸序列(SEQIDNO：113)。
图74A是来自马氏甲烷八叠球菌古细菌的LowerinpET200D的MCM376-MVK图谱。
图74B和74C是来自马氏甲烷八叠球菌古细菌的LowerinpET200D的MCM376-MVK的核苷酸序列(SEQIDNO：114)。
图75A-75D示出相比于RM11608-2，EWL256的异戊二烯生产的生长和比生产力。白色菱形表示生长(OD550)；实心条表示异戊二烯的比生产力。x-轴是以200(图75A和75B)或400(图75C和75D)uMIPTG诱导后的时间(小时)。Y-1轴是异戊二烯的生产力(ug/L/OD/hr)而Y-2是波长为550处的光密度的任意单位。对于OD550的这些数值必须乘以6.66以获得培养物的实际OD。
图76是质粒pBBRCMPGI1.5-pgl的图谱。
图77A和77B是质粒pBBRCMPGI1.5-pgl的核苷酸序列(SEQIDNO：122)。
图78A-78F是由表达甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶、银白杨异戊二烯合酶和pgl(RHM111608-2)并且在15L规模的补料分批培养中生长的大肠杆菌菌株的异戊二烯生产的图。图78A示出在供料葡萄糖的15-L生物反应器中光密度的时间进程。图78B示出在供料葡萄糖的15-L生物反应器中异戊二烯滴定度的时间进程。滴定度定义为每升发酵培养液生产的异戊二烯的量。计算异戊二烯的方法：59hr中的累积异戊二烯生产，在59hr时的g/发酵罐体积，L[＝]g/L培养液。图78C也示出在供料葡萄糖的15-L生物反应器中的异戊二烯滴定度的时间进程。计算异戊二烯的方法：∫(瞬时异戊二烯生产速率，g/L/hr)dt，t＝0至59小时[＝]g/L培养液。图78D示出由供料葡萄糖的15-L生物反应器产生的总异戊二烯的时间进程。图78E示出在供料葡萄糖的15-L生物反应器内的体积生产力。图78F示出在供料葡萄糖的15-L生物反应器内的二氧化碳进化率(CER)，或代谢活性谱。
图79A是质粒pJ201：19813的图谱。
图79B和79C是pJ201：19813的核苷酸序列(SEQIDNO：123)。
发明详细说明
本发明表征了生产增加量的异戊二烯的组合物和方法。特别地，这些组合物和方法增加异戊二烯生产力并且增加生产的异戊二烯的总量。例如，制造了产生4.8x104纳摩尔/gwem/hr的异戊二烯的细胞培养体系(表1)。这些体系的效率被细胞从细胞培养基所消耗的～23.6摩尔％产率(10.7重量％产率)的碳转化成异戊二烯(％碳产率)所阐明。如实施例和表2所示，产生了每升培养液约60.5g异戊二烯。以1.88x105nmol/OD/hr(1.88x105纳摩尔/gwcm/hr)的峰值比速率生产异戊二烯。如果需要，可以使用其他条件，如在此所述的那些，获得更大量的异戊二烯。在一些实施方式中，将可再生的碳源用于异戊二烯的生产。本发明的组合物和方法是想要的，因为它们允许每细胞的高异戊二烯产率，允许高碳产率、高异戊二烯纯度、高生产力、低能量利用、低生产成本和投资、以及最小的副反应。这一用于异戊二烯生产的有效、大规模、生物合成工艺为合成异戊二烯类橡胶提供了异戊二烯来源，并且为使用天然橡胶提供了期望的低成本替代。
如下面进一步讨论，可以通过向细胞导入编码异戊二烯合酶多肽(例如植物异戊二烯合酶多肽)的异源核酸来显著增加由该细胞生产的异戊二烯量。异戊二烯合酶多肽将二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)转化成异戊二烯。如在实施例中所示，在诸如大肠杆菌、柠檬泛菌、枯草杆菌、解脂耶氏酵母菌和里氏木霉的多种宿主细胞中表达异源葛麻姆(PuerariaMontana)(野葛)或银白杨(杨)异戊二烯合酶多肽。如也在实施例中所示，在诸如大肠杆菌的宿主细胞中表达异源马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶(MVK)来增加异戊二烯生产。所有这些细胞比没有异源异戊二烯合酶多肽的相应细胞生产出更多的异戊二烯。如表1和2所示，使用在此所述的方法生产了大量的异戊二烯。例如，具有异源异戊二烯合酶核酸的枯草杆菌细胞在14升发酵罐中比没有异源核酸的相应对照枯草杆菌细胞生产出高约10倍的异戊二烯(表2)。在发酵罐中由大肠杆菌生产出每升培养液(mg/L，其中培养液的体积包括细胞培养基的体积和细胞的体积)60.5g异戊二烯而由枯草杆菌生产的是30mg/L，这表明可以产生相当量的异戊二烯(表2)。如果需要，可以在更大规模生产异戊二烯或者可以使用在此所述的其他条件来进一步增加异戊二烯的量。在下面以及在实施例部分中进一步详述表1和2所列出的载体以及实验条件。
表1：使用本发明的细胞培养物和方法，从摇瓶生产异戊二烯的示例性产率。用于测量异戊二烯生产的检测法描述于实施例I，第II部分。对于这一检测法，在一或多个时间点从摇瓶取出样品并培养30分钟。然后测量这一样品中生产的异戊二烯量。表1中列出了异戊二烯生产的顶空浓度和比速率，并且在此进一步描述。
＊标准化为1OD600的1mL，在密封顶空瓶中培养1小时，其中液体与顶空体积比为1∶19。
表2：使用本发明的细胞培养物和方法，在发酵罐中的示例性异戊二烯产率。用于测量异戊二烯生产的检测法描述于实施例I，第II部分。对于这一检测法，取发酵罐的废气样品，并分析异戊二烯的量。表2中列出了峰值顶空浓度(它是发酵期间的最高顶空浓度)、滴定度(它是每升培养液所生产的异戊二烯的累积总量)以及异戊二烯生产的峰值比速率(它是发酵期间的最高比速率)，并且在此进一步描述。
＊＊标准化为1vvm的废气流速(每1L培养液每分钟1体积废气)。
此外，通过含有异源异戊二烯合酶核酸的细胞的异戊二烯生产可以经增加由该细胞所表达的1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合成酶(DXS)多肽和/或异戊烯基二磷酸异构酶(IDI)多肽的量所增强。例如，可以将DXS核酸和/或IDI核酸导入细胞中。DXS核酸可为异源核酸或内源核酸的拷贝。类似地，IDI核酸可为异源核酸或内源核酸的拷贝。在一些实施方式中，通过用产生DXS和/或IDI核酸更大转录的其他启动子和/或调控区代替内源DXS和/或IDI启动子和/或调控区来增加DXS和/或IDI多肽的量。在一些实施方式中，细胞含有编码异戊二烯合酶多肽(例如植物异戊二烯合酶核酸)的异源核酸以及编码异戊二烯合酶多肽的内源核酸的拷贝。
编码的DXS和IDI多肽是用于生物合成异戊二烯的DXP途径的一部分(图19A)。DXS多肽将丙酮酸和D-甘油醛3-磷酸转变成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸。虽然不想受任何特定理论所限，但相信增加DXS多肽量会增加通过DXP途径的碳流动，导致更大的异戊二烯生产。IDI多肽催化异戊烯二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)的相互转化。虽然不想受任何特定理论所限，但相信增加细胞中的IDI多肽量会增加IPP的量，IPP被转化成DMAPP，其又被转化成异戊二烯。
例如，使用具有野葛异戊二烯合酶、酿酒酵母IDI和大肠杆菌DXS的大肠杆菌细胞发酵生产异戊二烯。异戊二烯的水平在15小时的时间段从50至300μg/L变化(实施例7，第VII部分)。作为另一实例，使用具有马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶(MVK)、银白杨异戊二烯合酶、上游MVA途径和整合的下游MVA途径的大肠杆菌发酵生产异戊二烯。异戊二烯的水平在67小时的时间段从32至36.5g/L变化(实施例10，第III部分)。
在又一实施例中，使用具有马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶(MVK)、银白杨异戊二烯合酶、pgl过表达(RHM111608-2)、上游MVA途径和整合下游MVA途径的大肠杆菌细胞发酵生产异戊二烯。异戊二烯的水平在40小时的时间段从33.2g/L至40.0g/L变化或在59小时的时间段从48.6g/L至60.5g/L变化(实施例13，第(ii)部分)。
在一些实施方式中，异源或额外的内源异戊二烯合酶、IDI和DXS核酸的存在使得细胞相比于只具有这些异源或额外的内源核酸中一种或两种的相应细胞更加可繁殖地生长或者存活更长。例如，含有异源异戊二烯合酶、IDI和DXS核酸的细胞比只有异源异戊二烯合酶和DXS核酸或者只有异源异戊二烯合酶核酸的细胞生长得更好。而且，已将异源异戊二烯合酶、IDI和DXS核酸成功地有效连接至在大肠杆菌细胞中维持的高拷贝质粒上的强启动子，这表明大量的这些多肽可以在细胞中表达而不会对细胞造成过量的毒性。虽然不想受特定理论所限，但是相信异源或额外的内源异戊二烯合酶和IDI核酸的存在可降低一种或多种潜在的毒性中间产物的量，该中间产物本来是在细胞中存在仅仅一种异源或额外的内源DXS核酸时积累的。
在一些实施方式中，通过增加细胞表达的MVA多肽的量，由含有异源异戊二烯合酶核酸的细胞生产的异戊二烯增加(图19A和19B)。示例性MVA途径多肽包括任何下述多肽：乙酰-CoA乙酰转移酶(AA-CoA硫解酶)多肽、3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA合酶(HMG-CoA合酶)多肽、3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA还原酶(HMG-CoA还原酶)多肽、甲羟戊酸激酶(MVK)多肽、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)多肽、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)多肽、磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMDC)多肽、异戊烯磷酸激酶(IPK)多肽、IDI多肽和具有两种或更多种MVA途径多肽活性的多肽(例如融合多肽)。例如，可以将一或多个MVA途径核酸导入细胞中。在一些实施方式中，细胞含有上游MVA途径，其该上游MVA途径包括AACoA硫解酶、HMG-CoA合酶和HMG-CoA还原酶核酸。在一些实施方式中，细胞含有下游MVA途径，该下游MVA途径包括MVK、PMK、MVD和IDI核酸。在一些实施方式中，细胞含有整个MVA途径，该整个MVA途径包括AA-CoA硫解酶、HMG-CoA合酶、HMG-CoA还原酶、MVK、PMK、MVD和IDI核酸。在一些实施方式中，细胞含有包括AA-CoA硫解酶、HMG-CoA合酶、HMG-CoA还原酶、MVK、PMDC、IPK和IDI核酸的整个MVA途径。MVA途径核酸可为异源核酸或者内源核酸的拷贝。在一些实施方式中，通过用导致MVA途径核酸更大转录的其他启动子和/或调控区来替代MVA途径核酸的内源启动子和/或调控区而增加该一种或多种MVA途径多肽的量。在一些实施方式中，细胞含有编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸(例如植物异戊二烯合酶核酸)和编码异戊二烯合酶多肽的内源核酸的拷贝。
例如，含有编码野葛异戊二烯合酶多肽的核酸以及编码酿酒酵母MVK、PMK、MVD和IDI多肽的核酸的大肠杆菌细胞以6.67x104nmol/L培养液/OD600/hr的比率产生异戊二烯(参见实施例8)。此外，14升具有编码粪肠球菌(Enterococcusfaecaiis)AA-Co硫解酶、HMG-CoA合酶和HMG-CoA还原酶的核酸的大肠杆菌发酵物产生22克甲羟戊酸(MVA途径的中间产物)。这些细胞的摇瓶产生每升2-4克的甲羟戊酸。这些结果表明异源MVA途径核酸在大肠杆菌中是有活性的。含有上游MVA途径和下游MVA途径以及野葛异戊二烯合酶的核酸的大肠杆菌细胞(菌株MCM127)相比于具有只用于下游MVA途径和野葛异戊二烯合酶的核酸的大肠杆菌细胞(菌株MCM131)产生显著更多的异戊二烯(874μg/L培 养液/hr/OD)(参见表3和实施例8，第VIII部分)。
作为另一实例，含有编码银白杨异戊二烯合酶多肽的核酸以及编码马氏甲烷八叠球菌MVK多肽的核酸的大肠杆菌细胞，在没有酵母提取物加料下，在67小时发酵期间产生320.6g(峰值比速率为9.54x104nmol/L培 养液/OD600/hr(即9.5x104nmol/L培养液/OD600/hr))的异戊二烯，或在存在酵母提取物加料下，在68小时发酵期间产生395.5g(峰值比速率为8.66x104nmol/L培养液/OD600/hr)的异戊二烯(参见实施例10)。
在一些实施方式中，在连续培养物(例如没有稀释的连续培养物)中，至少一部分的细胞维持异源异戊二烯合酶、DXS、IDI、和/或MVA途径核酸至少约5、10、20、50、75、100、200、300或更多的细胞分裂。在本发明任何方面的一些实施方式中，包含异源或内源异戊二烯合酶拷贝、DXS、IDI、和/或MVA途径核酸的核酸也包含选择标记，如卡那霉素、氨苄青霉素、羧苄青霉素、庆大霉素、潮霉素、腐草霉素、博来霉素、新霉素、或氯霉素抗生素抗性核酸。
如实施例7，第VI部分所示，可以通过将酵母提取物加入细胞培养基中，使用具有野葛异戊二烯合酶、酿酒酵母IDI和大肠杆菌DXS核酸的大肠杆菌细胞来生产异戊二烯而进一步增加所生产的异戊二烯的量。特别地，所生产的异戊二烯的量与用于浓度检测的细胞培养基中的酵母提取物的量为线性比例的(图48C)。此外，从具有酵母提取物和葡萄糖的细胞培养基生产了约每升培养液0.11克异戊二烯(实施例7，第VIII部分)。相比于在酵母提取物存在下增加葡萄糖的量，在葡萄糖存在下增加酵母提取物的量导致生产更多的异戊二烯。而且，增加酵母提取物的量允许细胞在更长的时间里生产高水平的异戊二烯并且提高细胞的健康水平。
也使用三种类型的水解生物量(甘蔗渣，玉米秸秆和软木材木浆)作为碳源来阐述了异戊二烯的生产(图46A-C和图69A和69B)。具有野葛异戊二烯合酶、酿酒酵母IDI和大肠杆菌DXS核酸的大肠杆菌细胞从这些水解的生物量碳源比从等量葡萄糖(例如，1％葡萄糖，w/v)生产出更多的异戊二烯。表达银白杨异戊二烯合酶和MVA途径的大肠杆菌细胞从氨纤维膨胀(AFEX)预处理的玉米秸秆比从等量葡萄糖以更高的初始生长率生产异戊二烯(图69A和69B)。如果需要，本发明的组合物和方法中可以使用任何其他生物量碳源。生物量碳源是想要的，因为它们比许多常规细胞培养基更便宜，从而促进经济地生产异戊二烯。
此外，转化糖显示出起用于生产异戊二烯的碳源的作用(图47D)。
此外，木糖、乙酸盐/酯、以及丙三醇也显示出起生产异戊二烯的碳源的作用(图69A-69D)。例如，在乙酸盐/酯作为唯一碳源上生长的具有银白杨异戊二烯合酶和MVA途径的大肠杆菌细胞的异戊二烯的比生产力是在葡糖糖上生长期间约两倍高(实施例10，第IV部分；图69A和69B)。
在一些实施方式中，细胞培养基中包括油。例如，含有野葛异戊二烯合酶核酸的枯草杆菌细胞在含有油和葡萄糖源的细胞培养基中培养时，产生异戊二烯(实施例4，第III部分)。作为另一实例，含有上游和下游MVA途径加野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌fadRatoC突变细胞在含有棕榈油和葡萄糖源的细胞培养基中培养时，产生异戊二烯(实施例12，第II部分)。在一些实施方式中，细胞培养基中包括一种以上的油(例如2、3、4、5或更多种油)。虽然不想受任何特定理论所限，但相信(i)油可增加在细胞中可用于向异戊二烯转变的碳量，(ii)油可增加在细胞中的乙酰-CoA的量，从而增加通过MVA途径的碳流动，和/或(ii)油可向细胞提供额外的营养，这是想要的，因为细胞中的许多碳转变成异戊二烯而不是其他产物。在一些实施方式中，在含有油的细胞培养基中培养的细胞天然使用MVA途径来生产异戊二烯或者通常被修饰以含有用于整个MVA途径的核酸。在一些实施方式中，油在加入细胞培养基中之前部分或全部水解以促进宿主细胞对油的使用。
示例性多肽和核酸
多种异戊二烯合酶，DXS，IDI，和/或MVA途径多肽和核酸可以用于本发明的组合物和方法。
如在此使用，“多肽”包括多肽、蛋白质、肽、多肽片段和融合多肽，该融合多肽包括第一多肽(例如异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽)的部分或全部以及第二多肽(例如方便融合多肽纯化及检测的肽，如His-标签)的部分或全部。在一些实施方式中，融合多肽具有两种或更多种MVA途径多肽(例如AA-CoA硫解酶和HMG-CoA还原酶多肽)的活性。在一些实施方式中，多肽是具有两种或更多种MVA途径多肽活性的天然发生的多肽(例如由粪肠球菌mvaE核酸编码的多肽)。
在多种实施方式中，多肽具有至少或约50、100、150、175、200、250、300、350、400或更多个氨基酸。在一些实施方式中，多肽片段含有来自全长多肽的至少或约25、50、75、100、150、200、300或更多个连续氨基酸并且它具有相应全长多肽活性的至少或约5％、10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％。在具体实施方式中，多肽包括任何天然发生的异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽的整个氨基酸序列或序列区段。在一些实施方式中，多肽相比于野生型(即天然发生的序列)异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽序列具有一或多个突变。
在一些实施方式中，多肽是分离的多肽。如在此所用，“分离的多肽”不是多肽文库，例如2、5、10、20、50或更多种不同多肽的文库的一部分，并且与至少一种与其一起天然发生的组分分离。分离的多肽可以例如通过表达编码该多肽的重组核酸而获得。
在一些实施方式中，多肽是异源多肽。对于“异源多肽”，指氨基酸序列与在相同宿主细胞中天然表达的另一多肽的氨基酸序列不相同的多肽。
如在此使用，“核酸”指单链或双链形式的两个或更多个脱氧核糖核酸和/或核糖核酸。在一些实施方式中，核酸是重组核酸。“重组核酸”，指不含一种或多种核酸(例如基因)的目的核酸，该一种或多种核酸在该目的核酸所源自的生物的天然发生的基因组中，以该目的核酸为侧翼。该术语因此包括，例如整合到载体、整合到自主复制的质粒或病毒，或整合到原核或真核生物的基因组DNA，或者以独立于其他序列而作为分离分子(如cDNA、基因组DNA片段、或由PCR或限制性内切酶酶切所产生的cDNA片段)存在的重组DNA。在一些实施方式中，异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸有效连接到编码全部或部分的另一多肽的另一核酸以便该重组核酸编码包括异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽以及全部或部分另一多肽(例如，促进融合多肽纯化或检测的肽，例如His-标签)的融合多肽。在一些实施方式中，部分或全部的重组核酸是化学合成的。
在一些实施方式中，核酸是异源核酸。对于“异源核酸”，指核酸序列与在相同宿主细胞中天然发现的另一核酸的核酸序列不相同的核酸。
在具体实施方式中，核酸包括任何天然发生的异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸的整个核酸序列或其区段。在一些实施方式中，核酸包括来自天然发生的异戊二烯合酶核酸、DXS、IDI或MVA途径核酸的至少或约50、100、150、200、300、400、500、600、700、800或更多连续核苷酸。在一些实施方式中，核酸相比于野生型(即天然发生的序列)异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸的序列具有一个或多个突变。在一些实施方式中，核酸具有增加异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸转录或翻译的一或多个突变(例如，沉默突变)。在一些实施方式中，核酸是任何编码异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽的核酸的简并变体。
“密码子简并性”指遗传密码的发散，这允许核苷酸序列的变化而不会影响编码多肽的氨基酸序列。熟练技术人员会充分意识到在使用核苷酸密码子来说明给定氨基酸时，由特定宿主细胞所展现的“密码子偏好”。因此，当合成核酸以改善在宿主细胞中的表达时，想要在一些实施方式中设计核酸，使得其密码子使用频率接近宿主细胞的偏好密码子使用频率。
示例性异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽和核酸的登录号列于附录1(附录1的登录号和它们相应的序列在此通过整体引用作为参考，特别是对于异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽和核酸的氨基酸和核酸序列)。Kegg数据库也含有许多示例性异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽和核酸的氨基酸和核酸序列(参见，例如，网址为“genome.jp/kegg/pathway/map/map00100.html”的互联网和其中的序列，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽和核酸的氨基酸和核酸序列)。在一些实施方式中，一种或多种异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽和/或核酸具有与2007年12月12日或2008年12月11日公开可获得的序列(例如对应于附录1中任何登录号的任何序列或者Kegg数据库中存在的任何序列)相同的序列。进一步在下面描述其他的示例性异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽和核酸。
示例性异戊二烯合酶多肽和核酸
如上面所指出，异戊二烯合酶多肽将二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)转变成异戊二烯。示例性的异戊二烯合酶多肽包括多肽、多肽片段、肽和具有异戊二烯合酶多肽的至少一种活性的融合多肽。标准方法可以通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将DMAPP转变成异戊二烯的能力而用来测定该多肽是否具有异戊二烯合酶多肽活性。在示例性的检测法中，通过按实施例1所述以摇瓶法生长菌株(例如在此所述的E.coli/pTrcKudzu菌株)来制备细胞提取物。在完成诱导后，将约10mL的细胞在7000xg离心10分钟沉淀并在5ml没有甘油的PEB中重悬浮。使用标准方法，用弗氏压碎器裂解细胞。或者，在-80℃冻融后，用溶菌酶(Ready-Lyse溶菌酶溶液；EpiCentre)处理细胞。
例如，可以按照Silver等人，JBiol.Chem.270：13010-13016，1995以及其中参考文献所述来测量细胞提取物中的异戊二烯合酶多肽活性，它们在此通过整体引用作为参考，特别是对于异戊二烯合酶多肽活性的检测法。在氮蒸汽下蒸发DMAPP(Sigma)至干燥并且在pH8.2的100mM磷酸钾缓冲液中再水化至100mM浓度并储存于-20℃。为了进行检测法，在具有金属螺帽和涂覆特氟龙的硅隔板(AgilentTechnologies)的20ml顶空样品瓶(AgilentTechnologies)中，将5μl的1MMgCl2、1mM(250μg/ml)DMAPP、65μl的PlantExtractBuffer(PEB)(50mMTris-HCl，pH8.0，20mMMgCl2，5％丙三醇，和2mMDTT)加入25μl的细胞提取物中并在37℃振荡培养15分钟。通过加入200μl的250mMEDTA淬灭反应并通过GC/MS来量化，如在实施例1，第II部分所述。
示例性异戊二烯合酶核酸包括编码多肽、多肽片段、肽或具有异戊二烯合酶多肽的至少一种活性的融合多肽的核酸。示例性的异戊二烯合酶多肽和核酸包括来自任何在此所述的来源生物的天然发生的多肽和核酸以及源自在此所述任何来源生物的突变多肽和核酸。
在一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽或核酸是来自豆科(Fabaceae)，例如蝶形花亚科(Faboideae)。在一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽或核酸是来自葛麻姆(Puerariamontana)(野葛)(Sharkey等人，PlantPhysiology137：700-712，2005)，野葛(Puerarialobata)，杨(如银白杨、黑杨、Populustrichocarpa、银白杨xtremula(CAC35696)或银白杨)(Sasaki等人，FEBSLetters579(11)：2514-2518，2005；Miller等人，Planta213：483-487，2001)、白杨(如Populustremuloides)(Silver等人，JBC270(22)：13010-1316，1995)或英国栎(夏栎(Quercusrobur))(Zimmer等人，WO98/02550)的多肽或核酸，其各在此通过整体引用作为参考，特别是对于异戊二烯合酶核酸和异戊二烯合酶多肽的表达。适合的异戊二烯合酶包括但不限于，Genbank登录号AY341431、AY316691、AY279379、AJ457070和AY182241所鉴定的那些，其各在此通过整体引用作为参考，特别是对于异戊二烯合酶核酸和多肽的序列。在一些实施方式中，异戊二烯合酶多肽或核酸不是来自夏栎的天然发生的多肽或者核酸(即异戊二烯合酶多肽或核酸是除了来自夏栎的天然发生的多肽或者核酸以外的异戊二烯合酶多肽或核酸)。在一些实施方式中，异戊二烯合酶核酸或多肽是来自杨的天然发生的多肽或核酸。在一些实施方式中，异戊二烯合酶核酸或多肽不是来自杨的天然发生的多肽或核酸。
示例性DXS多肽和核酸
如上所指出，1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)多肽将丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸转变成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸。示例性DXS多肽包括多肽、多肽片段、肽和具有DXS多肽的至少一种活性的融合多肽。标准方法(如在此所述的那些)可以通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将丙酮酸和D-甘油醛-3-磷酸转变成1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸的能力而用来测定该多肽是否具有DXS多肽活性。示例性DXS核酸包括编码具有DXS多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性DXS多肽和核酸包括来自在此所述的任何源生物的天然发生的多肽和核酸以及源自在此所述的任何源生物的突变多肽和核酸。
示例性IDI多肽和核酸
异戊烯二磷酸异构酶多肽(异戊烯二磷酸δ异构酶或IDI)催化异戊烯二磷酸(IPP)和二甲基烯丙基二磷酸(DMAPP)的相互转变(例如将IPP转变成DMAPP和/或将DMAPP转变成IPP)。示例性IDI多肽包括具有IDI多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。标准方法(如在此所述的那些)可以通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内对IPP和DMAPP相互转变的能力而用来测定该多肽是否具有IDI多肽活性。示例性IDI核酸包括编码具有IDI多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性IDI多肽和核酸包括来自在此所述的任何源生物的天然发生的多肽和核酸以及源自在此所述的任何源生物的突变多肽和核酸。
示例性MVA途径多肽和核酸
示例性MVA途径多肽包括乙酰基-CoA乙酰转移酶(AACoA硫解酶)多肽、3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA合酶(HMG-CoA合酶)多肽、3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA还原酶(HMG-CoA还原酶)多肽、甲羟戊酸激酶(MVK)多肽、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)多肽、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)多肽、磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMDC)多肽、异戊烯磷酸激酶(IPK)多肽、IDI多肽、和具有两种或更多种MVA途径多肽活性的多肽(例如融合多肽)。特别地，MVA途径多肽包括具有MVA途径多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽和融合多肽。示例性MVA途径核酸包括编码具有MVA途径多肽的至少一种活性的多肽、多肽片段、肽或融合多肽的核酸。示例性MVA途径多肽和核酸包括来自在此所述的任何源生物的天然发生的多肽和核酸以及源自在此所述的任何源生物的突变多肽和核酸。
特别地，乙酰基-CoA乙酰转移酶多肽(AA-CoA硫解酶或AACT)将两分子的乙酰基-CoA转变成乙酰乙酰基-CoA。标准方法(如在此所述的那些)可以通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将两分子乙酰基-CoA转变成乙酰乙酰基-CoA的能力而用来测定该多肽是否具有AA-CoA硫解酶多肽活性。
3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA合酶(HMG-CoA合酶或HMGS)多肽将乙酰乙酰基-CoA转变成3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA。标准方法(如在此所述的那些)可以通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将乙酰乙酰基-CoA转变成3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA的能力而用来测定该多肽是否具有HMG-CoA合酶多肽活性。
3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA还原酶(HMG-CoA还原酶或HMGR)多肽将3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA转变成甲羟戊酸。标准方法(如在此所述的那些)可以通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA转变成甲羟戊酸的能力而用来测定该多肽是否具有HMG-CoA还原酶多肽活性。
甲羟戊酸激酶(MVK)多肽使甲羟戊酸磷酸化以形成甲羟戊酸-5-磷酸。标准方法(如在此所述的那些)可以通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将甲羟戊酸转变成甲羟戊酸-5-磷酸的能力而用来测定该多肽是否具有MVK多肽活性。
磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)多肽使甲羟戊酸-5-磷酸磷酸化以形成甲羟戊酸-5-二磷酸。标准方法(如在此所述的那些)可以通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将甲羟戊酸-5-磷酸转变成甲羟戊酸-5-二磷酸的能力而用来测定该多肽是否具有PMK多肽活性。
二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD或DPMDC)多肽将甲羟戊酸-5-二磷酸转变成异戊烯二磷酸(IPP)。标准方法(如在此所述的那些)可以通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将甲羟戊酸-5-二磷酸转变成IPP的能力而用来测定该多肽是否具有MVD多肽活性。
磷酸甲羟戊酸脱羧酶(PMDC)多肽将甲羟戊酸-5-磷酸转变成异戊烯磷酸(IP)。标准方法(如在此所述的那些)可以通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将甲羟戊酸-5-磷酸转变成IP的能力而用来测定该多肽是否具有PMDC多肽活性。
异戊烯磷酸激酶(IPK)多肽使异戊烯磷酸(IP)磷酸化以形成异戊烯二磷酸(IPP)。标准方法(如在此所述的那些)可以通过测量多肽在体外、在细胞提取物中或在体内将IP转变成IPP的能力而用来测定该多肽是否具有IPK多肽活性。
示例性IDI多肽和核酸如上所述。
分离核酸的示例性方法
可以使用标准方法来分离异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径核酸。从目的源生物(例如细菌基因组)获得想要的核酸的方法是常规的并且是分子生物学领域公知的(参见，例如WO2004/033646及其中引用的文献，其各在此通过整体引用作为参考，特别是对于目的核酸的分离)。例如，如果核酸序列是已知的(例如任何在此所述的已知核酸)，那么可通过限制性内切核酸酶消化来产生适当的基因组文库并且可用与想要的核酸序列互补的探针筛选该文库。一旦分离了序列，可使用标准引物导向扩增方法，如聚合酶链式反应(PCR)来扩增DNA(美国专利号4,683,202，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于PCR方法)来获得适于使用适当的载体来转化的DNA量。
或者，可以使用标准方法来化学合成异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径核酸，例如具有已知核酸序列的任何异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径核酸。
可以使用标准方法来鉴定可适合用于在此所述组合物和方法的其他异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径的多肽。例如，可以在诸如大肠杆菌的生物中构建已知天然产生异戊二烯的生物的染色体DNA的黏粒文库，然后筛选异戊二烯生产。特别地，可产生黏粒文库，在该文库中，基因组DNA的大区段(35-45kb)包装到载体并用于转化适当的宿主。黏粒载体是独特的，因为能接纳大量DNA。通常，黏粒载体具有封装以及随后环化异源DNA所需的至少一个拷贝的cosDNA序列。除了cos序列，这些载体也含有诸如ColEI的复制起点以及药物抗性标记如对于氨苄青霉素或新霉素有抗性的核酸。使用黏粒载体来转化适当的细菌宿主的方法充分描述于Sambrook等人，MolecularCloning：ALaboratoryManual，第二版，ColdSpringHarbor，1989，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于转化方法。
通常对于克隆黏粒，使用适当的限制性内切核酸酶分离异源DNA并使用适当的连接酶将与其邻近黏粒载体的cos区连接。然后将含有线性异源DNA的黏粒载体与DNA包装载体如噬菌体反应。在包装过程期间，切割cos位点并将异源DNA包装到细菌病毒颗粒的头部。然后使用这些颗粒来转染适当的宿主细胞如大肠杆菌。一旦注入细胞，异源DNA在cos粘末端的影响下环化。以这一方式，可以将大区段异源DNA导入宿主细胞并表达。
其他获得异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径核酸的方法包括通过检测法(例如在此所述的顶空检测法)或通过使用针对于编码一段保守氨基酸(例如，至少3个保守氨基酸)的核苷酸的引物进行PCR来筛选宏基因组文库。可以通过比对已知异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径多肽的氨基酸序列来鉴定保守氨基酸。可以基于已知的异戊二烯合酶多肽的比对序列鉴定异戊二烯合酶多肽的保守氨基酸。可以对发现能天然生产异戊二烯的生物进行标准蛋白纯化方法(这是本领域公知的)并且可以使用标准方法对得到的纯化多肽测序。文献中记载了其他方法(参见，例如Julsing等人，Applied.Microbiol.Biotechnol.75：1377-84，2007；Withers等人，ApplEnvironMicrobiol.73(l9)：6277-83，2007，其各在此通过整体引用作为参考，特别是对于参与异戊二烯合成的核酸鉴定)。
此外，可以使用标准序列比对和/或结构预测程序来根据其他DXS、IDI或MVA途径多肽和核酸的一级和/或预测的多肽二级结构与已知DXS、IDI或MVA途径多肽和核酸的结构的相似性而鉴定它们。也可以使用标准数据库如swissprot-trembl数据库(网址在“expasy.org”，SwissInstituteofBioinformaticsSwiss-ProtgroupCMU-1rueMichelServetCH-1211Geneva4，Switzerland)来鉴定异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽和核酸。可以使用标准结构预测程序(例如PredictProtein(630West，168Street，BB217，NewYork，N.Y.10032，USA))的默认设置来预测异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽的二级和/或三级结构。或者，可以使用标准方法来测定异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽的实际二级和/或三级结构。也可以通过与从已知异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸产生的探针杂交来鉴定其他异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸。
示例性启动子和载体
任何在此所述的异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸可以包括在一或多个载体中。因此，本发明也表征了具有编码在此所述的任何异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽的一种以上的核酸的载体。如在此使用，“载体”指能够递送，并期望地在宿主细胞中表达一种或多种目的核酸的构建体。载体的实例包括但不限于质粒、病毒载体、DNA或RNA表达载体、黏粒和噬菌体载体。在一些实施方式中，载体含有受表达控制序列所控的核酸。
如在此使用，“表达控制序列”指指导目的核酸转录的核酸序列。表达控制序列可以是启动子，如组成型或诱导型启动子，或增强子。“诱导型启动子”是在环境或发育调控下有活性的启动子。表达控制序列有效地连接待转录的核酸区段。
在一些实施方式中，载体含有选择标记。术语“选择标记”指能够在宿主细胞中表达的核酸，该选择标记允许轻易选择那些含有导入的核酸或载体的宿主细胞。选择标记的实例包括但不限于抗生素抗性核酸(例如卡那霉素、氨苄青霉素、羧苄青霉素、庆大霉素、潮霉素、腐草霉素、博来霉素、新霉素或氯霉素、)和/或赋予宿主细胞代谢优势如营养优势的核酸。示例性营养选择标记包括本领域已知的那些标记如amdS、argB和pyr4。可用于转化木霉的载体系统中的标记是本领域已知的(参见例如Finkelstein，BiotechnologyoffilamentousFungi，第6章，Finkelstein等人编，Butterworth-Heinemann，Boston，MA，Chap.6.，1992；和Kinghorn等人，AppliedMolecularGeneticsoffilamentousFungi，BlackieAcademicandProfessional，ChapmanandHall，London，1992，其各在此通过整体引用作为参考，特别是对于选择标记)。在一些实施方式中，选择标记是amdS核酸，其编码乙酰胺酶，允许转化的细胞在作为氮源的乙酰胺上生长。构巢曲霉(A.nidulans)amdS核酸作为选择标记的使用描述于Kelley等人，EMBOJ.4：475-479，1985和Penttila等人，Gene61：155-164，1987(其各在此通过整体引用作为参考，特别是对于选择标记)。在一些实施方式中，异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸整合到没有选择标记的细胞的染色体中。
适当的载体是与所用宿主细胞兼容的那些。适当的载体可以源自，例如细菌、病毒(如噬菌体T7或源自M13的噬菌体)、黏粒、酵母或植物。获得和使用此种载体的方法是本领域技术人员已知的(参见，例如Sambrook等人，MolecularCloning：ALaboratoryManual，第二版，ColdSpringHarbor，1989，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于载体的使用)。
启动子是本领域公知的。任何在宿主细胞中起作用的启动子可以用于在宿主细胞中表达异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸。用于在多种宿主细胞中驱动异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸表达的起始控制区或启动子很多并且是本领域技术人员所熟知的(参见，例如WO2004/033646及其中引用的文献，其每篇都在此通过整体引用作为参考，特别是对于表达目的核酸的载体)。事实上，任何能够驱动这些核酸的启动子都适于本发明，这些启动子包括但不限于CYC1、HIS3、GAL1、GAL10、ADH1、PGK、PHO5、GAPDH、ADCI、TRP1、URA3、LEU2、ENO和TPI(用于在酵母菌中表达)；AOX1(用于在毕赤酵母(Pichia)中表达)；和lac、trp、λPL、λPR、T7、tac和trc(用于在大肠杆菌中表达)。
在一些实施方式中，使用葡萄糖异构酶启动子(参见，例如美国专利号7,132,527及其中引用的文献，其每篇都在此通过整体引用作为参考，特别是对于用于表达目的多肽的启动子和质粒系统)。可以使用报道的葡萄糖异构酶启动子突变体来改变由有效连接葡萄糖异构酶启动子的核酸所编码的多肽的表达水平(美国专利号7,132,527)。在多种实施方式中，葡萄糖异构酶启动子含于低、中或高拷贝质粒中(美国专利号7,132,527)。
在多种实施方式中，异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径核酸含于低拷贝质粒中(例如维持在每个细胞约1至约4拷贝的质粒)、中度拷贝质粒(例如维持在每个细胞约10至约15拷贝的质粒)或高拷贝质粒(例如维持在每个细胞约50或更高拷贝的质粒)。在一些实施方式中，异源或额外内源异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸有效连接T7启动子。在一些实施方式中，有效连接T7启动子的异源或额外的内源异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸含于中或高拷贝质粒中。在一些实施方式中，异源或额外的内源异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸有效连接Trc启动子。在一些实施方式中，有效连接Trc启动子的异源或额外的内源异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸含于中或高拷贝质粒中。在一些实施方式中，异源或额外的内源异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸有效连接Lac启动子。在一些实施方式中，有效连接Lac启动子的异源或额外的内源异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸含于低拷贝质粒中。在一些实施方式中，异源或额外的内源异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸有效连接内源启动子，如内源埃希氏菌、泛菌、芽孢杆菌、耶氏酵母、链霉菌、或木霉菌启动子或内源碱性丝氨酸蛋白酶、异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径启动子。在一些实施方式中，有效连接内源启动子的异源或额外的内源异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸含于高拷贝质粒中。在一些实施方式中，载体是不整合到细胞染色体的复制质粒。在一些实施方式中，载体部分或全部整合到细胞染色体中。
在一些实施方式中，载体是任何在引入到真菌宿主细胞时，整合到该宿主细胞基因组中并复制的载体。载体列表参考FungalGeneticsStockCenterCatalogueofStrains(FGSC，网址为“fgsc.net”及其引用的文献，其每篇都在此通过整体引用作为参考，特别是对于载体)。其他适合的表达和/或整合载体的实例提供于Sambrook等人，MolecularCloning：ALaboratoryManual，第二版，ColdSpringHarbor，1989，CurrentProtocolsinMolecularBiology(F.M.Ausubel等人编，1987，Supplement30，section7.7.18)；vandenHondel等人，BennettandLasure(编)MoreGeneManipulationsinFungi，AcademicPresspp.396-428，1991；以及美国专利号5,874,276，其每篇都在此通过整体引用作为参考，特别是对于载体。特别有用的载体包括pFB6、pBR322、PUC18、pUC100和pENTR/D。
在一些实施方式中，异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸有效连接在真菌宿主细胞中显示出转录活性的适当的启动子。启动子可源自一种或多种编码宿主内源或异源的多肽的核酸。在一些实施方式中，启动子可用于木霉宿主。启动子的适当的非限制性实例包括cbh1、cbh2、egl1、egl2、pepA、hfb1、hfb2、xyn1，和amy。在一些实施方式中，启动子是宿主细胞天然的启动子。例如，在一些实施方式中，当里氏木霉是宿主时，启动子是天然里氏木霉启动子。在一些实施方式中，启动子是里氏木霉cbhl，它是诱导型启动子并且以登录号D86235保藏于GenBank，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于启动子。在一些实施方式中，启动子是真菌宿主细胞异源的启动子。有用的启动子的其他实例包括来自泡盛曲霉(A.awamori)和黑曲霉(A.niger)葡糖淀粉酶(glaA)基因的启动子(Nunberg等人，MotCellBiol.4：2306-2315，1984和Boel等人，EMBOJ.3：1581-1585，1984，其每篇都在此通过整体引用作为参考，特别是对于启动子)；黑曲霉α淀粉酶、米曲霉TAKA淀粉酶、里氏木霉xln1和里氏木霉纤维二糖水解酶1的基因的启动子(EP137280，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于启动子)。
在一些实施方式中，表达载体也包括终止序列。终止控制区也可源自宿主细胞天然的多种基因。在一些实施方式中，终止序列和启动子序列源自相同来源。在另一实施方式中，终止序列是宿主细胞内源的。特别适合的终止子序列是源自木霉菌株(例如里氏木霉)的cbh1.其他有用的真菌终止子包括来自黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶核酸的终止子(Nunberg等人，MotCellBiol.4：2306-2315，1984和Boel等人，EMBOJ3：1581-1585，1984；其每篇都在此通过整体引用作为参考，特别是对于真菌终止子)。任选地，可包括终止位点。对于多肽的有效表达，编码该多肽的DNA通过起始密码子而有效连接至选择的表达控制区以便表达导致适当信使RNA的形成。
在一些实施方式中，启动子、编码区和终止子都源自待表达的异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸。在一些实施方式中，异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸的编码区插入通用表达载体以便其处在表达构建体启动子和终止子序列的转录控制下。在一些实施方式中，基因或其部分插入到强cbh1启动子的下游。
可以使用标准技术(Sambrook等人，MolecularCloning：ALaboratoryManual，ColdSpringHarbor，1982，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于适当DNA序列的筛选和载体的构建)将异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸插入载体，如表达载体。用于连接包含目的核酸(例如异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸)、启动子、终止子或其他序列的DNA构建体以及将它们插入适当载体的方法是本领域公知的。例如，可以使用限制性酶来切割异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸和载体。然后，可以将切割下的异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸的相容末端和切割下的载体相连。连接通常是在常规限制性位点处连接来完成。如果不存在此种位点，根据常规实践使用合成的寡核苷酸接头(参见，Sambrook等人，MolecularCloning：ALaboratoryManual，第二版，ColdSpringHarbor，1989以及Bennett和Lasure，MoreGeneManipulationsinFungi，AcademicPress，SanDiego，pp70-76，1991，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于寡核苷酸接头)。此外，可以使用已知的重组技术(例如InvitrogenLifeTechnologies，GatewayTechnology)来构建载体。
在一些实施方式中，可能想要以远高于目前在天然发生的细胞中发现的水平来过表达异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸。这一结果可通过将编码那些多肽的核酸选择性地克隆到多拷贝质粒或将那些核酸放在强诱导型或组成型启动子下而实现。过表达想要的多肽的方法是常见的并且是分子生物学领域公知的，并且实例可见于Sambrook等人，MolecularCloning：ALaboratoryManual，第二版，ColdSpringHarbor，1989，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于克隆技术)。
下面的来源包括根据本发明有用的其他通用方法学的描述：Kreigler，GeneTransferandExpression；ALaboratoryManual，1990和Ausubel等人编，CurrentProtocolsinMolecularBiology，1994，其每篇都在此通过整体引用作为参考，特别是对于分子生物学和克隆技术)。
示例性源生物
异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸(以及它们的编码多肽)可以获自任何天然含有异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径核酸的生物。如上所指出，通过多种生物，如细菌、酵母、植物和动物而天然形成异戊二烯。生物含有用于生产异戊二烯的MVA途径、DXP途径或MVA和DXP途径两者(图19)。因此，DXS核酸可以获自，例如任何含有DXP途径或含有MVA和DXP途径两者的生物。IDI和异戊二烯合酶核酸可以获自，例如任何含有MVA途径、DXP途径或MVA和DXP途径两者的生物。MVA途径核酸可以获自，例如任何含有MVA途径或MVA和DXP途径两者的生物。
在一些实施方式中，异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸的核酸序列与由自然界中任何下述生物所产生的核酸序列相同。在一些实施方式中，异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径多肽的氨基酸序列与由自然界中任何下述生物所产生的多肽序列相同。在一些实施方式中，异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸或多肽是源自在此所述的任何生物的突变核酸或多肽。如在此使用，“源自”指被导入一或多个突变的核酸或多肽来源。例如，“源自植物多肽”的多肽指通过向野生型植物多肽的序列(即，天然发生的序列)导入一或多个突变所产生的目的多肽。
在一些实施方式中，源生物是真菌，其实例是曲霉种如米曲霉和黑曲霉，酵母种如酿酒酵母，裂殖酵母(Schizosaccharomyces)种如粟酒裂殖酵母(S.pombe)，和木霉种如里氏木霉。在一些实施方式中，源生物是丝状真菌细胞。术语“丝状真菌”指真菌亚门的所有丝状形式(参见，Alexopoulos，C.I.(1962)，IntroductoryMycology，Wiley，NewYork)。这些真菌特征为营养菌丝体，其细胞壁由几丁质、纤维素和其他复杂多糖所构成。丝状真菌在形态、生理和遗传上与酵母不同。丝状真菌的营养生长是菌丝延伸并且碳代谢是专性有氧的。丝状真菌的亲本细胞可为下述物种的细胞：木霉(如里氏木霉，红褐肉座菌(Hypocreajecorina)的无性形态，以前归类为T.longibrachiatum、绿色木霉(Trichodermaviride)、康氏木霉(Trichodermakoningii)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum))(Sheir-Neirs等人，Appi.Microbiol.Biotechnol20：46-53，1984；ATCCNo.56765和ATCCNo.26921)；青霉属(Peniciliiumsp.)，腐质霉属(Humicolasp.)(如特异腐质霉(H.insolens)、疏毛腐质霉(H.lanuginose)或灰色腐质霉(H.grisea))；金孢霉属(Chrysosporiumsp.)(如C.iucknowense)、Gliociadiumsp、曲霉属(如米曲霉、黑曲霉、酱油曲霉(A.sojae)、日本曲霉(A.japonicus)、构巢曲霉(A.nidulans)或泡盛曲霉(A.awamori))(Ward等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.39：7380743、1993和Goedegebuur等人，Genet41：89-98、2002)、镰孢(Fusariumsp)、(如粉红镰孢(F.roseum)、赤禾镰孢(F.graminum)、F.cerealis、尖镰孢(F.oxysporuim)或F.venenatum)、脉孢菌(Neurosporasp.)、(如粗糙脉胞菌(N.crassa))、肉座菌(Hypocreasp.)、毛霉菌(Mucorsp.)、(如米黑毛霉(M.miehei))、根霉菌(Rhizopussp.)和Emericellasp.(也参见Innis等人，Sci.228：21-26，1985)，但不限于此。术语“Trichoderma”或“Trichodermasp.”或“Trichodermaspp.”指任何以前或目前被归类为木霉属的真菌属。
在一些实施方式中，真菌是构巢曲霉、泡盛曲霉、米曲霉、棘孢曲霉(A.aculeatus)、黑曲霉、日本曲霉、里氏木霉、绿色木霉、尖镰孢或腐皮镰孢(F.solani)。曲霉菌株公开于Ward等人，Appl.Microbiol.Biotechnol.39：738-743，1993和Goedegebuur等人，CurrGene41：89-98，2002，其每篇都在此通过整体引用作为参考，特别是对于真菌。在具体实施方式中，真菌是木霉属的菌株，例如里氏木霉的菌株。里氏木霉的菌株是已知的并且非限制性实例包括ATCCNo.13631，ATCCNo.26921，ATCCNo.56764，ATCCNo.56765，ATCCNo.56767和NRRL15709，其每篇都在此通过整体引用作为参考，特别是对于里氏木霉菌株。在一些实施方式中，宿主菌株是RL-P37的衍生物。RL-P37公开于Sheir-Neiss等人，Appl.Microbiol.Biotechnology20：46-53，1984，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于里氏木霉菌株。
在一些实施方式中，源生物是酵母，例如酿酒酵母，裂殖酵母(Schizosaccharomycessp.)，毕氏酵母(Pichiasp.)或假丝酵母(Candidasp.)。
在一些实施方式中，源生物是细菌，例如芽孢杆菌菌株，如地衣芽孢杆菌或枯草杆菌，泛菌(Pantoea)菌株如柠檬泛菌(P.citrea)，假单胞菌(Pseudomonas)菌株如产碱假单胞菌(P.alcaligenes)，链霉菌(Streptomyces)菌株如白色链霉菌(S.albus)、浅青紫链霉菌(S.lividans)或锈赤链霉菌(S.rubiginosus)，或埃希氏菌菌株如大肠杆菌。
如在此所述，“芽孢杆菌属”包括如本领域技术人员已知的“芽孢杆菌”属中的所有种，包括但不限于枯草杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌(B.lentus)、短小芽孢杆菌(B.brevis)、嗜热脂肪芽孢杆菌(B.stearothermophilus)、嗜碱性芽孢杆菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)、嗜碱芽孢杆菌(B.halodurans)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、凝固芽孢杆菌(B.coagulans)、环状芽孢杆菌(B.circulans)、灿烂芽孢杆菌(B.lautus)和苏云金芽孢杆菌(B.thuringiensis)。已经意识到该芽孢杆菌属持续经历分类学重组。因此，该属意在包括已经被重分类的种，包括但不限于如嗜热脂肪芽孢杆菌(现称作嗜热脂肪土芽孢杆菌(Geobacillusstearothermophilus))的生物。认为在氧气存在下，抗性内孢子的生产是芽孢杆菌属的限定特征，但是这一特征也用于近来命名的脂环酸杆菌属(Alicyclobacillus)、双芽孢杆菌属(Amphibacillus)、硫胺素芽孢杆菌属(Aneurinibacillus)、厌氧芽孢杆菌属(Anoxybacillus)、短芽孢杆菌(Brevibacillus)、Filobacillus、薄壁芽孢杆菌属(Gracilibacillus)、喜盐芽孢杆菌(Halobacillus)、类芽孢杆菌属(Paenibacillus)、需盐芽孢杆菌属(Salibacillus)、热杆菌属(Thermobacillus)、脲芽孢杆菌属(Ureibacillus)和枝芽孢杆菌属(Virgibacillus)。
在一些实施方式中，源生物是革兰氏阳性细菌。非限制性实例包括链霉菌(如，白色链霉菌、浅青紫链霉菌、天蓝色链霉菌(S.coelicolor)或灰色链霉菌(S.griseus)和芽孢杆菌菌株。在一些实施方式中，源生物是革兰氏阴性细菌，如大肠杆菌或假单胞菌。
在一些实施方式中，源生物是植物，如来自豆科(Fabaceae)的植物，如蝶形花亚科。在一些实施方式中，源生物是野葛，杨(如银白杨xtremulaCAC35696或银白杨)(Sasaki等人，FEBSLetters579(11)：2514-2518，2005)，白杨(如Populustremuloides)，或夏栎(Quercusrobur)。
在一些实施方式中，源生物是藻类，如绿藻、红藻、灰绿藻(glaucophyte)、chlorarachniophyte、眼虫、chromista或沟鞭藻。
在一些实施方式中，源生物是蓝藻，如根据形态学而被分类为下述组的蓝藻：色球藻目(Chroococcales)、宽球藻目(Pleurocapsales)、颤藻目(Oscillatoriales)、念珠藻目(Nostocales)或真枝藻目(Stigonematales)。
示例性宿主细胞
可以使用多种宿主细胞来表达异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径多肽并按所要求保护的发明的方法来生产异戊二烯。示例性的宿主细胞包括来自在前面标题为“示例性源生物”部分所列出的任何生物的细胞。宿主细胞可为天然产生异戊二烯的细胞或不天然产生异戊二烯的细胞。在一些实施方式中，宿主细胞天然使用DXP途径生产异戊二烯，并且加入异戊二烯合酶、DXS和/或IDI核酸以增强使用这一途径的异戊二烯生产。在一些实施方式中，宿主细胞天然使用MVA途径生产异戊二烯，并且加入异戊二烯合酶和/或一或多种MVA途径核酸以增强使用这一途径的异戊二烯生产。在一些实施方式中，宿主细胞天然使用DXP途径生产异戊二烯，并且加入一或多种MVA途径核酸来使用DXP途径以及MVA途径的部分或者全部来生产异戊二烯。在一些实施方式中，宿主细胞天然使用DXP和MVA两种途径生产异戊二烯，并且加入一或多种异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸以增强使用这些途径中一种或两种的异戊二烯生产。
示例性转化方法
可以使用用于表达编码的异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径多肽的标准技术将异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径核酸或含有它们的载体插入宿主细胞(例如，在此所述的植物细胞、真菌细胞、酵母细胞或细菌细胞)。可以使用诸如转化、电穿孔、核微注射、转导、转染(如，脂转染介导的或DEAE-Dextrin介导的转染或使用重组噬菌体病毒的转染)、磷酸钙DNA沉淀孵育、DNA包被微粒的高速轰击以及原生质体融合这些技术进行DNA构建体或载体向宿主细胞的导入。通用的转化技术是本领域已知的(参见例如，CurrentProtocolsinMolecularBiology(F.M.Ausubel等人编，Chapter9，1987；Sambrook等人，MolecularCloning：ALaboratoryManual，第二版，ColdSpringHarbor，1989；和Campbell等人，Curr.Genet.16：53-56，1989，其各在此通过整体引用作为参考，特别是对于转化方法)。异源多肽在木霉菌中的表达描述于美国专利号6,022,725；美国专利号6,268,328；美国专利号7,262,041；WO2005/001036；Harkki等人，EnzymeMicrob.Technol.13：227-233，1991；Harkki等人，BioTechnol.7：596-603，1989；EP244,234；EP215,594；和Nevalainen等人，TheMolecularBiologyofTrichodermaanditsApplicationtotheExpressionofBothHomologousandheterologousGenes，在MolecularIndustrialMycology，Leong和Berka编，MarcelDekkerInc.，NYpp.129-148，1992，其各在此通过整体引用作为参考，特别是对于转化和表达方法)。对于曲霉菌株的转化也参考Cao等人，Sci.9：991-1001，2000；EP238023；和Yelton等人，Proceedings.Nail.Acad.Sci.USA81：1470-1474，1984(其各在此通过整体引用作为参考，特别是对于转化方法)。所导入的核酸可整合到染色体DNA或者作为染色体外复制序列维持。
任何本领域已知的方法可用于筛选转化体。在一个非限制性实例中，包括amdS标记的稳定转化体与不稳定转化体的区别在于它们更快的生长速率以及在含有乙酰胺的固体培养基上形成平滑而非齿状轮廓的圆形菌落。此外，在通过于固体非选择性培养基(例如缺乏乙酰胺的培养基)上生长转化体来进行稳定性的进一步检测的情形下，从这一培养基收获孢子，并测定随后在含有乙酰胺的选择培养基上萌发并生长的这些孢子的百分数。
在一些实施方式中，通过如下方法来转化真菌细胞，该方法涉及原生质体形成以及原生质体转化以及以已知方式再生细胞壁。在一个具体实施方式中，制备木霉菌用来转化包括从真菌菌丝体制备原生质体(参见，Campbell等人，Curr.Genet.16：53-56，1989，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于转化方法)。在一些实施方式中，菌丝体获自萌发的营养孢子。用消化细胞壁的酶来处理菌丝体，得到原生质体。然后通过在悬浮培养基中渗透压稳定剂的存在来保护原生质体。这些稳定剂包括山梨醇、甘露醇、氯化钾、硫酸镁等。通常，这些稳定剂的浓度在0.8M和1.2M之间变化。希望使用在悬浮培养基中约1.2M的山梨醇溶液。
DNA向宿主木霉菌菌株的摄取取决于钙离子浓度。通常，在摄取溶液中使用约10mMCaCl2到50mMCaCl2。除了摄取溶液中的钙离子，通常包括的其他化合物是缓冲系统，如TE缓冲液(10mMTris，pH7.4；1mMEDTA)或10mMMOPS，pH6.0缓冲液(吗啉丙磺酸)和聚乙二醇(PEG)。尽管不希望受任何具体理论所限，但相信聚乙二醇用于融合细胞膜，从而允许培养基中的内容物被送到木霉菌菌株的细胞质中并且质粒DNA被转入核中。这一融合经常留下多拷贝的整合到宿主染色体的质粒DNA。
通常，在转化中使用含有木霉菌原生质体或细胞的悬浮液，这些原生质体或细胞以105至107/mL(如2x106/mL)的密度进行了通透性处理。在适当溶液(如1.2M山梨醇和50mMCaCl2)中100μL体积的这些原生质体或细胞与想要的DNA混合。通常，向摄取溶液中加入高浓度PEG。可将0.1至1体积的25％的PEG4000加入原生质体悬浮液中。在一些实施方式中，约0.25体积加入原生质体悬浮液。也可将诸如二甲亚砜、肝素、亚精胺、氯化钾等添加剂加入摄取溶液，帮助转化。对于其他真菌宿主细胞可以用类似的方法(参见例如，美国专利号6,022,725和6,268,328，其每篇都在此通过整体引用作为参考，特别是对于转化方法)。
通常，然后在约0℃培养混合物10至30分钟的时间。然后向混合物加入另外的PEG以进一步增强想要的核酸序列的摄取。通常以转化混合物体积的5至15倍体积来添加25％的PEG4000；然而，更大或更小的体积也可为适合的。希望25％的PEG4000是转化混合物体积的约10倍。在加入PEG后，在室温或在冰上培养该转化混合物，然后加入山梨醇和CaCl2溶液。然后向熔化的生长培养基等份进一步加入原生质体悬浮液。当生长培养基包括生长选择(如乙酰胺或抗生素)时，其仅允许转化体生长。
可根据常规方法进行细菌细胞的转化，如Sambrook等人，MolecularCloning：ALaboratoryManual，ColdSpringHarbor，1982所述，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于转化方法。
示例性细胞培养基
本发明也包括产生异戊二烯的培养细胞或细胞群。“培养细胞”指在允许细胞经历一或多次细胞分裂的溶液(如细胞培养基)中的两种或更多种细胞。“培养细胞”不包括这样的植物细胞，其是含有已经分化成植物组织的细胞的活的多细胞植物的一部分。在多种实施方式中，细胞培养物包括至少或约10、20、50、100、200、500、1,000、5,000、10,000或更多的细胞。
任何碳源可以用于培养宿主细胞。术语“碳源”指能够被宿主细胞或生物所代谢的一种或多种含碳化合物。例如，用于培养宿主细胞的细胞培养基可包括任何适于维持宿主细胞存活或生长的碳源。
在一些实施方式中，碳源是碳水化合物(例如单糖、二糖、寡糖或多糖)、转化糖(例如，酶促处理的蔗糖浆)、丙三醇、甘油(例如，生物柴油或制造肥皂工艺的甘油副产物)、二羟丙酮、单碳源、油(例如，植物油如玉米、棕榈或大豆油)、乙酸盐/酯、动物脂肪、动物油、脂肪酸(例如，饱和脂肪酸、不饱和脂肪酸、或多不饱和脂肪酸)、脂类、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、多肽(例如，微生物或植物蛋白或肽)、可再生碳源(例如，生物量碳源，如水解的生物量碳源)、酵母提取物、来自酵母提取物的组分，聚合物，酸，醇，醛，酮，氨基酸，琥珀酸，乳酸，乙酸，乙醇、或者前述两种或更多种的任意组合。在一些实施方式中，碳源是光合合成的产物，包括但不限于葡萄糖。在一些实施方式中，碳水化合物是木糖或葡萄糖。
示例性单糖包括葡萄糖和果糖；示例性寡糖包括乳糖和蔗糖，而示例性多糖包括淀粉和纤维素。示例性碳水化合物包括C6糖(例如果糖、甘露糖、半乳糖或葡萄糖)和C5糖(例如木糖或阿拉伯糖)。在一些实施方式中，细胞培养基包括碳水化合物以及碳水化合物之外的碳源(例如丙三醇、甘油、二羟丙酮、单碳源、油、动物脂肪、动物油、脂肪酸、脂类、磷脂、甘油脂、甘油单酯、甘油二酯、甘油三酯、可再生碳源、或酵母提取物的组分)。在一些实施方式中，细胞培养基包括碳水化合物以及多肽(例如微生物或植物蛋白或肽)。在一些实施方式中，微生物多肽是来自酵母或细菌的多肽。在一些实施方式中，植物多肽是来自大豆、玉米、油菜、麻风树、棕榈树、花生、向日葵、椰子、芥菜、油菜籽、棉籽、棕榈仁、橄榄、红花、芝麻、或亚麻籽的多肽。
在一些实施方式中，碳水化合物的浓度为至少或约每升培养液5克(g/L，其中，培养液的体积包括细胞培养基的体积和细胞的体积)，例如至少或约10、15、20、30、40、50、60、80、100、150、200、300、400或更多g/L。在一些实施方式中，碳水化合物的浓度在约50和约400g/L之间，例如约100和约360g/L之间，约120和约360g/L之间，或约200和约300g/L之间。在一些实施方式中，碳水化合物的这一浓度包括在宿主细胞培养之前和/或培养期间，加入的碳水化合物的总量。
示例性脂类是任何含有一种或多种脂肪酸的物质，所述脂肪酸是饱和、不饱和或分支的C4以及以上的脂肪酸。
示例性油是室温为液态的脂类。在一些实施方式中，脂类含有一种或多种C4或更高的脂肪酸(例如，含有具有四个或更多个碳的一种或多种饱和、不饱和或分支脂肪酸)。在一些实施方式中，油获自大豆、玉米、油菜、麻风树、棕榈树、花生、向日葵、椰子、芥菜、油菜籽、棉籽、棕榈仁、橄榄、红花、芝麻、亚麻籽、产油微生物细胞、乌桕、或者是前述两种或更多种的任一组合。
示例性脂肪酸包括通式为RCOOH的化合物，其中“R”是烃。示例性不饱和脂肪酸包括其中“R”包括至少一个碳-碳双键的化合物。示例性不饱和脂肪酸包括但不限于油酸、11-十八碳烯酸、亚油酸、棕榈油酸以及花生四烯酸。示例性多不饱和脂肪酸包括化合物，其中“R”包括多个碳-碳双键。示例性饱和脂肪酸包括化合物，其中“R”是饱和脂族基团。在一些实施方式中，碳源包括一或多种C12-C22脂肪酸，例如C12饱和脂肪酸、C14饱和脂肪酸、C16饱和脂肪酸、C18饱和脂肪酸、C20饱和脂肪酸、或C22饱和脂肪酸。在示例性实施方式中，脂肪酸是棕榈酸。在一些实施方式中，碳源是脂肪酸(例如不饱和脂肪酸)的盐、脂肪酸(例如不饱和脂肪酸)的衍生物、或者脂肪酸(例如不饱和脂肪酸)衍生物的盐。适当的盐包括但不限于锂盐、钾盐、钠盐等。甘油二酯和甘油三酯是丙三醇的脂肪酸酯。
在一些实施方式中，脂类、油、脂肪、脂肪酸、甘油单酯、甘油二酯或甘油三酯的浓度是至少或约每升培养液1克(g/L，其中培养液的体积包括细胞培养基的体积和细胞的体积)，例如至少或约5、10、15、20、30、40、50、60、80、100、150、200、300、400或更多g/L。在一些实施方式中，脂类、油、脂肪、脂肪酸、甘油一酯、甘油二酯或甘油三酯的浓度是约10和约400g/L之间，例如约25和约300g/L之间，约60和约180g/L之间，或约75约150g/L之间。在一些实施方式中，浓度包括在培养宿主细胞之前和/或期间添加的脂类、油、脂肪、脂肪酸、甘油一酯、甘油二酯或甘油三酯的总量。在一些实施方式中，碳源包括(i)脂类、油、脂肪、脂肪酸、甘油一酯、甘油二酯或甘油三酯和(ii)碳水化合物，如葡萄糖。在一些实施方式中，脂类、油、脂肪、脂肪酸、甘油一酯、甘油二酯或甘油三酯与碳水化合物基于碳的比率是约1∶1(即每个碳水化合物碳对应脂类、油、脂肪、脂肪酸、甘油一酯、甘油二酯或甘油三酯中的一个碳)。在具体实施方式中，脂类、油、脂肪、脂肪酸、甘油一酯、甘油二酯或甘油三酯的量为约60和约180g/L之间，而碳水化合物的量为约120和约360g/L之间。
示例性微生物多肽碳源包括来自酵母或细菌的一或多种多肽。示例性植物多肽碳源包括来自大豆、玉米、油菜、麻风树、棕榈树、花生、向日葵、椰子、芥菜、油菜籽、棉籽、棕榈仁、橄榄、红花、芝麻、或亚麻籽的一或多种多肽。
示例性的可再生碳源包括奶酪乳清渗透物(cheesewheypermeate)、玉米浆、甜菜糖浆、大麦芽、和来自任何前述物质的组分。示例性可再生碳源也包括存在于生物量中的乙酸盐/酯、葡萄糖、己糖、戊糖和木糖，生物量如玉米、柳枝稷、甘蔗、发酵工艺的细胞废物，以及来自大豆、玉米、或小麦碾磨的蛋白副产物。在一些实施方式中，生物量碳源是木质纤维素、半纤维素或纤维素物质，例如但不限于草、小麦、麦秸、甘蔗渣、甘蔗渣、软木材木浆、玉米、玉米穗轴或外壳、玉米仁、来自玉米仁的纤维、玉米秸秆、柳枝稷、稻壳产品、或来自谷物(如玉米、高粱、黑麦、小黑麦(triticate)、大麦、小麦和/或酒糟)的湿或干碾磨的副产物。示例性纤维素物质包括木、纸和纸浆废物、草本植物和果浆。在一些实施方式中，碳源包括任何植物部分，例如茎、谷物、根或块茎。在一些实施方式中，将任何下述植物的全部或部分用作碳源：玉米、小麦、黑麦、高粱、小黑麦、水稻、粟、大麦、木薯、豆类例如豆和豌豆、马铃薯、甜薯、香蕉、甘蔗、和/或树薯粉。在一些实施方式中，碳源是生物量水解物，如包括木糖和葡萄糖或包括蔗糖和葡萄糖的生物量水解物。
在一些实施方式中，可再生碳源(例如生物量)在添加到细胞培养基之前被预处理。在一些实施方式中，预处理包括酶预处理、化学预处理、或酶和化学预处理两者的组合(参见，例如Farzaneh等人，BioresourceTechnology96(18)：2014-2018，2005；美国专利号6,176,176；美国专利号6,106,888；其每篇都在此通过整体引用作为参考，特别是对于可再生碳源的预处理)。在一些实施方式中，可再生碳源在添加到细胞培养基之前被部分或完全水解。
在一些实施方式中，可再生碳源(例如玉米秸秆)在添加到细胞培养基之前经历氨纤维膨胀(AFEX)预处理(参见例如，Farzaneh等人，BioresourceTechnology96(18)：2014-2018，2005)。在AFEX预处理期间，可再生碳源在中等温度(例如约60至约100℃)和高压(例如约250至约300psi)下受无水液态氨处理约5分钟。然后快速释放压力。在这一过程中，木质素溶解、半纤维素水解、纤维素解晶作用的组合的化学和物理效应，以及增加的表面积使得纤维素和半纤维素几乎完全酶促转化成可发酵糖。AFEX预处理具有可以回收几乎全部的氨并再利用，同时将剩余物用作下游过程中的微生物的氮源的优点。此外，AFEX预处理不需要冲洗流。因此，在AFEX处理后的干物质回收基本上为100％。AFEX基本上是干-干工艺。经处理的可再生碳源是长期稳定的并且可以在酶促水解或发酵工艺中以极高固体负载来供料。纤维素和半纤维素在AFEX工艺中得到很好地保留，只有很少或没有降解。不需要在经历AFEX预处理的可再生碳源酶促水解之前进行中和。AFEX处理的碳源的酶促水解产生清洁的糖流用于随后的发酵。
在一些实施方式中，碳源(例如可再生碳源)的浓度相当于至少或约0.1、0.5、1、1.5、2、3、4、5、10、15、20、30、40、或50％的葡萄糖(w/v)。可以使用标准HPLC方法，用葡萄糖作为参考来测量由碳源产生的葡萄糖的量，从而确定葡萄糖的当量。在一些实施方式中，碳源(例如可再生碳源)的浓度相当于约0.1和约20％之间的葡萄糖，例如约0.1和约10％之间的葡萄糖，约0.5和约10％之间的葡萄糖，约1和约10％之间的葡萄糖，约1和约5％之间的葡萄糖，或约1和约2％之间的葡萄糖。
在一些实施方式中，碳源包括酵母提取物或者酵母提取物的一种或多种组分。在一些实施方式中，酵母提取物的浓度为至少每升培养液1克酵母提取物(g/L，其中培养液的体积包括细胞培养基的体积和细胞的体积)，例如至少或约5、10、15、20、30、40、50、60、80、100、150、200、300或更多g/L。在一些实施方式中，酵母提取物的浓度是约1和约300g/L之间，例如约1和约200g/L之间，约5和约200g/L之间，约5和约100g/L之间，或约5和约60g/L之间。在一些实施方式中，浓度包括在培养宿主细胞之前和/或期间添加的酵母提取物的总量。在一些实施方式中，碳源包括酵母提取物(或其一或多种组分)和另一碳源如葡萄糖。在一些实施方式中，酵母提取物和另一碳源的比率为约1∶5，约1∶10，或约1∶20(w/w)。
此外，碳源也可为单碳底物，如二氧化碳或甲醇。来自单碳源(例如甲醇、甲醛或甲酸酯)的丙三醇生产已经报道于甲基营养酵母中(Yamada等人，Agric.Biol.Chem.，53(2)541-543，1989，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于碳源)和细菌中(Hunter等人，Biochemistry，24，4148-4155，1985，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于碳源)。这些生物可以同化单碳化合物，氧化态从甲烷到甲酸酯改变，并产生丙三醇。碳同化的途径可以通过核酮糖单磷酸，通过丝氨酸或通过木酮糖单磷酸(Gottschalk，BacterialMetabolism，第二版，Springer-Verlag：NewYork，1986，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于碳源)。核酮糖单磷酸途径包括甲酸酯与核酮糖-5-磷酸缩合以形成六碳糖，该六碳糖变成果糖并最终变成三碳产物甘油醛-3-磷酸。同样地，丝氨酸途径通过亚甲基四氢叶酸将单碳化合物同化到糖酵解途径。
除了一碳和二碳底物，也已知甲基营养生物利用许多含有其他含碳的化合物，如甲胺、葡糖胺以及多种氨基酸用于代谢活性。例如，已知甲基营养酵母利用来自甲胺的碳以形成海藻糖或丙三醇(Bellion等人，Microb.GrowthClCompd.，[mt.Symp.]，第7版，415-32.编者：Murrell等人，出版：Intercept，Andover，UK，1993，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于碳源)。类似地，众多假丝酵母(Candida)种代谢丙氨酸或油酸(Sulter等人，Arch.Microbiol.153(5)，485-9，1990，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于碳源)。
在一些实施方式中，在含有生理盐和营养物的标准培养基中培养细胞(见例如，Pourquie，J.等人，BiochemistryandGeneticsofCelluloseDegradation，Aubert等人编，AcademicPress，pp.71-86，1988和Ilmen等人，Appl.Environ.Microbiol.63：1298-1306，1997，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于细胞培养基)。示例性的生长培养基是常规商业制备的培养基如LuriaBertani(LB)培养液，SabouraudDextrose(SD)培养液，或酵母培养基(YM)培养液。也可使用其他限定的或合成的生长培养基，并且用于特定宿主细胞生长的适当培养基是微生物或发酵科学领域技术人员已知的。
除了适当的碳源，希望细胞培养基含有适当的矿物、盐、辅因子、缓冲液和本领域技术人员已知的适于培养物生长或增强异戊二烯生产的其他组分(参见例如，WO2004/033646以及其中引用的文献和WO96/35796以及其中引用的文献，其每篇都在此通过整体引用作为参考，特别是对于各自细胞培养基和细胞培养条件)。在异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径核酸处于诱导型启动子控制下的一些实施方式中，希望诱导剂(例如糖、金属盐或抗微生物剂)以对于诱导异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径多肽表达有效的浓度添加到培养基中。在一些实施方式中，细胞培养基具有抗生素(例如卡那霉素)，其对应于具有一或多种DXS、IDI和/或MVA途径核酸的载体上的抗生素抗性核酸(例如卡那霉素抗性核酸)。
示例性细胞培养条件
适于维持并生长细菌培养物的材料和方法是本领域公知的。示例性的技术可见于ManualofMethodsforGeneralBacteriologyGerhardt等人编，AmericanSocietyforMicrobiology，Washington，D.C.(1994)或BrockinBiotechnology：ATextbookofIndustrialMicrobiology，第二版，(1989)SinauerAssociates，Inc.，Sunderland，MA，其各在此通过整体引用作为参考，特别是对于细胞培养技术。在一些实施方式中，在允许表达由插入到宿主细胞的核酸所编码的异戊二烯合酶、DXS、IDI和/或MVA途径多肽中一种或多种的条件下，在培养基中培养细胞。
可以使用标准细胞培养条件来培养细胞(参见例如WO2004/033646以及其中引用的文献，其每篇都在此通过整体引用作为参考，特别是对于细胞培养和发酵条件)。细胞在适当温度、气体混合物和pH(例如约20至约37℃，约6％至约84％CO2，以及约5至约9的pH)下生长并维持。在一些实施方式中，细胞在35℃下于适当的细胞培养基中生长。在一些实施方式中，例如，培养物在接近28℃下于适当培养基中在摇动培养或发酵罐中培养直到达到想要量的异戊二烯生产。在一些实施方式中，用于发酵的pH范围为约pH5.0至约pH9.0之间(例如约pH6.0至约pH8.0之间或pH6.5至约pH7.0之间)。根据宿主细胞的要求，反应可在需氧、缺氧或厌氧的条件下进行。对于给定丝状真菌的示例性培养条件是本领域已知的并且可见于科学文献和/或来自真菌源如美国典型培养物保藏中心和真菌遗传种源中心(FungalGeneticsStockCenter)。
在多种实施方式中，使用任何已知的发酵模式，如分批、补料分批或连续发酵方法来培养细胞。在一些实施方式中，使用发酵的分批方法。经典的分批发酵是封闭系统，其中在发酵开始时设定培养基的组成并且该组成在发酵期间不进行人工改变。因此，在发酵开始时，用想要的宿主细胞接种细胞培养基并且允许发酵而不向系统添加任何物质。然而，通常，“分批”发酵是对于添加碳源而言的分批并且经常尝试控制诸如pH和氧浓度的因素。在分批系统中，系统的代谢物和生物量组成持续改变直到发酵停止时。在分批培养物中，细胞稳定地经过静态停滞期到高生长对数期并最终至生长率减小或停止的稳定期。在一些实施方式中，对数期的细胞负责大部分的异戊二烯生产。在一些实施方式中，稳定期的细胞生产异戊二烯。
在一些实施方式中，使用标准分批系统的变型，例如补料分批(Fed-Batch)系统。补料分批发酵方法包括典型的分批系统，只是随着发酵进展而以增量添加碳源。当分解代谢产物阻遏倾向于抑制细胞代谢，以及想要细胞培养基中具有有限量的碳源时，补料分批系统是有用的。可以有限量或过量的碳源(例如葡萄糖)来进行补料分批发酵。对补料分批系统中实际碳源浓度的测量很难，并且因此基于可测因子如pH、溶氧和废气(如CO2)分压的改变来进行估算。分批以及补料分批发酵是本领域普遍且公知的，并且实例可见于Brock，Biotechnology：ATextbookofIndustrialMicrobiology，第二版，(1989)SinauerAssociates，Inc.，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于细胞培养和发酵条件。
在一些实施方式中，使用连续发酵方法。连续发酵是开放系统，其中向生物反应器中连续添加限定的发酵培养基并且同时除去等量的条件培养基用于处理。连续发酵通常使培养物维持在恒定的高密度，而细胞主要处于对数期生长。
连续发酵允许调控影响细胞生长或异戊二烯生产的一个因素或任何数量的因素。例如，一种方法将限制营养物如碳源或氮水平维持在固定比率并且允许所有其他参数适度。在其他系统中，可以连续改变影响生长的许多因素同时保持细胞浓度(如培养基浑浊度所测量的浓度)恒定。连续系统致力于维持稳态生长条件。因此由于被丢掉的培养基，在发酵中，细胞损失相对于细胞生长速率保持平衡。调控用于连续发酵工艺的营养物和生长因子的方法以及使产物形成速率最大化的技术是工业微生物领域领域公知的并且多种方法详述于Brock，Biotechnology：ATextbookofIndustrialMicrobiology，第二版，(1989)SinauerAssociates，Inc.，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于细胞培养和发酵条件。
在一些实施方式中，细胞固定在基质上作为完整细胞催化剂并经历用于异戊二烯生产的发酵条件。
在一些实施方式中，将多瓶液体培养物放置在摇床上以便将氧气引入液体并维持培养物的均一性。在一些实施方式中，使用培养箱来控制培养物生长的温度、湿度、摇速和/或其他条件。最简单的培养箱是具有可调加热器的保温箱，其通常高达～65℃。更精细的培养箱也可以包括降低温度的能力(通过冷冻)，或控制湿度或CO2水平的能力。大多数培养箱包括计时器；一些也可以编程以通过不同的温度、湿度水平等来循环。培养箱可以从桌面的尺寸到小房间的尺寸来变化。
如果需要，可以改变一部分或者所有细胞培养基以补充营养物和/或避免积累潜在的有害代谢副产物和死亡细胞。在悬浮培养的情形下，可以利用离心或过滤该悬浮培养物而从培养基分离细胞并且然后在新鲜培养基中重悬细胞。在贴壁培养的情形下，可以通过吸取和替代而直接除去培养基。在一些实施方式中，细胞培养基允许在连续培养(例如没有稀释的连续培养)中至少一部分细胞分开用于至少或约5、10、20、40、50、60、65或更多细胞分裂。
在一些实施方式中，使用组成型或渗漏启动子(例如Trc启动子)，并且不添加化合物(如IPTG)来诱导有效连接至启动子的异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸的表达。在一些实施方案中，添加化合物(如IPTG)来诱导有效连接至启动子的异戊二烯合酶、DXS、IDI或MVA途径核酸的表达。
示例性异戊二烯生产
在一些实施方式中，在允许细胞生产异戊二烯的条件下，于细胞培养基中培养细胞。“峰值绝对生产力”指在培养细胞特定时间段内(例如在特定发酵期间的细胞培养)，在废气中异戊二烯的最大绝对量。“峰值绝对生产力时间点”指细胞培养的特定时间段内(例如在特定发酵期间的细胞培养)，当废气中的异戊二烯的绝对量为最大值时的时间点。在一些实施方式中，异戊二烯量在峰值绝对生产力时间点处测量。在一些实施方式中，细胞的峰值绝对生产力约为任何在此所公开的任一异戊二烯量。
“峰值比生产力”指在细胞培养的特定时间段内(例如在特定发酵期间的细胞培养)，每细胞生产的异戊二烯的最大量。“峰值比生产力时间点”指在细胞培养的特定时间段内(例如在特定发酵期间的细胞培养)，当每细胞生产的异戊二烯的量为最大值时的时间点。峰值比生产力通过用总生产力除以细胞量来测定，如由在600nm处的光密度(OD600)来测定。在一些实施方式中，异戊二烯量在峰值比生产力时间点处测量。在一些实施方式中，细胞的峰值比生产力约为任何在此所公开的每细胞的异戊二烯量。
“峰值体积生产力”指在细胞培养的特定时间段内(例如，在特定发酵期间的细胞培养)，每体积培养液生产的异戊二烯的最大量。“峰值比体积生产力时间点”指在细胞培养的特定时间段内(例如，在特定发酵期间的细胞培养)，当每体积培养液生产的异戊二烯的量为最大值时的时间点。峰值比体积生产力通过将总生产力除以培养液体积和时间量来测定。在一些实施方式中，异戊二烯量在峰值比体积生产力时间点处测量。在一些实施方式中，细胞的峰值比体积生产力约为任何在此所公开的每体积每时间异戊二烯量。
“峰值浓度”指在细胞培养的特定时间段内(例如在特定发酵期间的细胞培养)，生产的异戊二烯的最大量。“峰值浓度时间点”指在细胞培养的特定时间段内(例如，在特定发酵期间的细胞培养)，当每细胞所生产的异戊二烯的量为最大值时的时间点。在一些实施方式中，异戊二烯量在峰值浓度时间点处进行测量。在一些实施方式中，细胞的峰值浓度约为任何在此所公开的异戊二烯量。
“平均体积生产力”指在细胞培养的特定时间段内(例如在特定发酵期间的细胞培养)，每体积培养液(包括细胞和细胞培养基的体积)所生产的异戊二烯的平均量。平均体积生产力通过将总生产力除以培养液体积和时间量来测定。在一些实施方式中，细胞的平均比体积生产力约为任何在此所公开的每体积每时间异戊二烯量。
“累积总生产力”指在细胞培养的特定时间段内(例如在特定发酵期间的细胞培养)，生产的异戊二烯的累积总量。在一些实施方式中，测量异戊二烯的累计总量。在一些实施方式中，细胞的累计总生产力约为任何在此所公开的异戊二烯量。
在一些实施方式中，培养的细胞以大于或约1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、12,500、20,000、30,000、40,000、50,000、75,000、100,000、125,000、150,000、188,000、或更多纳摩尔的异戊二烯/克细胞(细胞湿重)/小时(纳摩尔/gwcm/hr)生产异戊二烯。在一些实施方式中，异戊二烯的量在约2至约200,000纳摩尔/gwcm/hr之间，例如在约2至约100纳摩尔/gwcm/hr之间、约100至约500纳摩尔/gwcm/hr、约150至约500纳摩尔/gwcm/hr、约500至约1,000纳摩尔/gwcm/hr、约1,000至约2,000纳摩尔/gwcm/hr、约2,000至约5,000纳摩尔/gwcm/hr、约5,000至约10,000纳摩尔/gwcm/hr、约10,000至约50,000纳摩尔/gwcm/hr、约50,000至约100,000纳摩尔/gwcm/hr、约100,000至约150,000纳摩尔/gwcm/hr、或约150,000至约200,000纳摩尔/gwcm/hr之间。在一些实施方式中，异戊二烯的量在约20至约200,000纳摩尔/gwcm/hr之间、约100至约5,000纳摩尔/gwcm/hr、约200至约2,000纳摩尔/gwcm/hr、约200至约1,000纳摩尔/gwcm/hr、约300至约1,000纳摩尔/gwcm/hr、约400至约1,000纳摩尔/gwcm/hr、约1,000至约5,000纳摩尔/gwcm/hr、约2,000至约20,000纳摩尔/gwcm/hr、约5,000至约50,000纳摩尔/gwcm/hr、约10,000至约100,000纳摩尔/gwcm/hr、约20,000至约150,000纳摩尔/gwcm/hr、或约20,000至约200,000纳摩尔/gwcm/hr。
以纳摩尔/gwcm/hr为单位的异戊二烯的量可以按照美国专利号5,849,970所公开来测量，其在此通过整体引用作为参考，特别是对于异戊二烯生产的测量。例如，使用标准气相色谱系统来分析2ml顶空(例如，来自培养物的顶空，该培养物如在32℃，在密封瓶中以200rpm摇动约3小时培养的2mL培养物)的异戊二烯，该系统为例如以正-辛烷/多孔硅胶C柱(AlitechAssociates，Inc.，Deerfield，Ill.)等温操作并且连接RGD2氧化汞还原气体检测器的系统(TraceAnalytical，MenloPark，CA)(参见例如，Greenberg等人，Atmos.Environ.27A：2689-2692，1993；Silver等人，PlantPhysiol.97：1588-1591，1991，其各在此通过整体引用作为参考，特别是对于异戊二烯生产的测量)。气相色谱面积单位通过标准异戊二烯浓度校准曲线而转换成nmol异戊二烯。在一些实施方式中，以细胞湿重计，细胞克数值通过获得细胞培养物的样品的A600值，然后根据具有已知A600值的细胞培养物的湿重的校准曲线将A600值转换成细胞克数来计算。在一些实施方式中，通过假定1升具有A600值为1的培养液(包括细胞培养基和细胞)具有1克湿重细胞来估计细胞克数。该值也除以该培养物被孵育的小时数，如3小时。
在一些实施方式中，培养细胞以大于或约1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、100,000，或更多ng的异戊二烯/克细胞(细胞湿重)/hr(ng/gwcm/h)生产异戊二烯。在一些实施方式中，异戊二烯的量在约2至约5,000ng/gwcm/h之间，例如约2至约100ng/gwcm/h之间，约100至约500ng/gwcm/h、约500至约1,000ng/gwcm/h、约1,000至约2,000ng/gwcm/h、或约2,000至约5,000ng/gwcm/h。在一些实施方式中，异戊二烯的量在约20至约5,000ng/gwcm/h、约100至约5,000ng/gwcm/h、约200至约2,000ng/gwcm/h、约200至约1,000ng/gwcm/h、约300至约1,000ng/gwcm/h、或约400至约1,000ng/gwcm/h。以ng/gwcm/h计的异戊二烯的量可以通过将在上面讨论的以纳摩尔/gwcm/hr为单位的异戊二烯生产的值乘以68.1来计算(如下面等式5所述)。
在一些实施方式中，培养细胞以大于或约1、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000、50,000、100,000、或更多mg的异戊二烯/L培养液(mg/L培养液，其中培养液的量包括细胞和细胞培养基的体积)来生产累积滴定度(总量)的异戊二烯。在一些实施方式中，异戊二烯的量在约2至约5,000mg/L培养液之间，例如约2至约100mg/L培养液之间、约100至约500mg/L培养液、约500至约1,000mg/L培养液、约1,000至约2,000mg/L培养液、或约2,000至约5,000mg/L培养液。在一些实施方式中，异戊二烯的量在约20至约5,000mg/L培养液之间、约100至约5,000mg/L培养液、约200至约2,000mg/L培养液、约200至约1,000mg/L培养液、约300至约1,000mg/L培养液、或约400至约1,000mg/L培养液。
来自摇瓶顶空或类似培养物的以mg异戊二烯/L计的异戊二烯的比生产力可以这样测量：在OD600值为约1.0下，从细胞培养物取1ml样品，将其至于20mL瓶中，孵育30分钟，然后测量顶空中异戊二烯的量(如例如，实施例I，第II部分所述)。如果OD600值不是1.0，那么可以通过除以OD600值而将测量归一为OD600值。mg异戊二烯/L顶空的值可以通过乘以因数38而转换成培养液的mg/L培养液/hr/OD600。以mg/L培养液/hr/OD600为单位的值可以乘以小时数以及OD600值以获得以mg异戊二烯/L培养液为单位的累积滴定度。
在一些实施方式中，培养细胞具有异戊二烯的平均体积生产力为高于或约0.1、1.0、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1100、1,200、1300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,100、2,200、2,300、2,400、2,500、2,600、2,700、2,800、2,900、3,000、3,100、3,200、3,300、3,400、3,500、或更高mg异戊二烯/L的培养液/hr(mg/L培养液/hr，其中培养液的体积包括细胞和细胞培养基的体积)。在一些实施方式中，异戊二烯的平均体积生产力在约0.1至约3,500mg/L培养液/hr之间，例如在约0.1至约100mg/L培养液/hr之间、约100至约500mg/L培养液/hr、约500至约1,000mg/L培养液/hr、约1,000至约1,500mg/L培养液/hr、约1,500至约2,000mg/L培养液/hr、约2,000至约2,500mg/L培养液/hr、约2,500至约3,000mg/L培养液/hr、或约3,000至约3,500mg/L培养液/hr。在一些实施方式中，异戊二烯的平均体积生产力在约10至约3,500mg/L培养液/hr之间、约100至约3,500mg/L培养液/hr、约200至约1,000mg/L培养液/hr、约200至约1,500mg/L培养液/hr、约1,000至约3,000mg/L培养液/hr、或约1,500至约3,000mg/L培养液/hr。
在一些实施方式中，培养细胞具有异戊二烯的峰值体积生产力高于或约0.5、1.0、10、25、50、100、150、200、250、300、400、500、600、700、800、900、1,000、1100、1200、1300、1,400、1,500、1,600、1,700、1,800、1,900、2,000、2,100、2,200、2,300、2,400、2,500、2,600、2,700、2,800、2,900、3,000、3,100、3,200、3,300、3,400、3,500、3,750、4,000、4,250、4,500、4,750、5,000、5,250、5,500、5,750、6,000、6,250、6,500、6,750、7,000、7,250、7,500、7,750、8,000、8,250、8,500、8,750、9,000、9,250、9,500、9,750、10,000、12,500、15,000，或更多mg异戊二烯/L的培养液/hr(mg/L培养液/hr，其中培养液的体积包括细胞和细胞培养基的体积)。在一些实施方式中，异戊二烯的峰值体积生产力在约0.5至约15,000mg/L培养液/hr之间，例如约0.5至约10mg/L培养液/hr之间、约1.0至约100mg/L培养液/hr、约100至约500mg/L培养液/hr、约500至约1,000mg/L培养液/hr、约1,000至约1,500mg/L培养液/hr、约1,500至约2,000mg/L培养液/hr、约2,000至约2,500mg/L培养液/hr、约2,500至约3,000mg/L培养液/hr、约3,000至约3,500mg/L培养液/hr、约3,500至约5,000mg/L培养液/hr、约5,000至约7,500mg/L培养液/hr、约7,500至约10,000mg/L培养液/hr、约10,000至约12,500mg/L培养液/h、或约12,500至约15,000mg/L培养液/hr。在一些实施方式中，异戊二烯的峰值体积生产力在约10至约15,000mg/L培养液/hr之间、约100至约2,500mg/L培养液/hr、约1,000至约5,000mg/L培养液/hr、约2,500至约7,500mg/L培养液/hr、约5,000至约10,000mg/L培养液/hr、约7,500至约12,500mg/L培养液/hr、或约10,000至约15,000mg/L培养液/hr。
可以通过对发酵罐废气取样品，按所述，如在实施例I，第II部分所述分析它的异戊二烯量(以例如mg异戊二烯/L气体为单位)并将这一值乘以废气流经每升培养液的速率(例如，以1vvm(空气体积/培养液体积/分钟)来测量发酵罐中以mg/L培养液/hr计的瞬间异戊二烯生产。因此，1mg/L气体的废气水平对应于在空气流速为1vvm时，60mg/L培养液/hr的瞬间生产力。如果需要，可以将以mg/L培养液/hr为单位的值除以OD600值以获得以mg/L培养液/hr/OD为单位的比速率。mg异戊二烯/L气体的平均值可以通过将这一平均废气异戊二烯浓度乘以发酵期间每升发酵培养液冒出的废气的总量而转换成总产物生产力(每升发酵培养液的异戊二烯克数，mg/L培 养液)。因此，在1vvm时10小时内0.5mg/L培养液/hr的平均废气异戊二烯浓度对应于300mg异戊二烯/L培养液的总产物浓度。
在一些实施方式中，培养细胞将细胞培养基中的大于或约0.0015、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.12、0.14、0.16、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.2、1.4、1.6、2.0、2.2、2.4、2.6、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0、13.0、14.0、15.0、16.0、17.0、18.0、19.0、20.0、21.0、22.0、23.0、23.2、23.4、23.6、23.8、24.0、25.0、30.0、31.0、32.0、33.0、35.0、37.5、40.0、45.0、47.5、50.0、55.0、60.0、65.0、70.0、75.0、80.0、85.0、或90.0摩尔％的碳转化成异戊二烯。在一些实施方式中，碳转化成异戊二烯的百分数在约0.002至约90.0摩尔％之间，例如约0.002至约0.005％、约0.005至约0.01％、约0.01至约0.05％、约0.05至约0.15％，0.15至约0.2％、约0.2至约0.3％、约0.3至约0.5％、约0.5至约0.8％、约0.8至约1.0％、约1.0至约1.6％、约1.6至约3.0％、约3.0至约5.0％、约5.0至约8.0％、约8.0至约10.0％、约10.0至约15.0％、约15.0至约20.0％、约20.0至约25.0％、约25.0％至30.0％、约30.0％至35.0％、约35.0％至40.0％、约45.0％至50.0％、约50.0％至55.0％、约55.0％至60.0％、约60.0％至65.0％、约65.0％至70.0％、约75.0％至80.0％、约80.0％至85.0％、或约85.0％至90.0％。在一些实施方式中，碳转化成异戊二烯的百分数在约0.002至约0.4摩尔％，0.002至约0.16摩尔％，0.04至约0.16摩尔％、约0.005至约0.3摩尔％、约0.01至约0.3摩尔％、约0.05至约0.3摩尔％、约0.1至0.3摩尔％、约0.3至约1.0摩尔％、约1.0至约5.0摩尔％、约2至约5.0摩尔％、约5.0至约10.0摩尔％、约7至约10.0摩尔％、约10.0至约20.0摩尔％、约12至约20.0摩尔％、约16至约20.0摩尔％、约18至约20.0摩尔％、约18至23.2摩尔％、约18至23.6摩尔％、约18至约23.8摩尔％、约18至约24.0摩尔％、约18至约25.0摩尔％、约20至约30.0摩尔％、约30至约40.0摩尔％、约30至约50.0摩尔％、约30至约60.0摩尔％、约30至约70.0摩尔％、约30至约80.0摩尔％、或约30至约90.0摩尔％。
碳转化成异戊二烯的百分数(也称作％碳产量)可以通过将所生产的异戊二烯的摩尔碳除以碳源中的摩尔碳(例如在分批和补料葡萄糖和酵母提取物中的摩尔碳)而测量。这一数字乘以100％得到百分数值(如等式1所示)。
等式1
％碳产量＝(生产的异戊二烯中的摩尔碳)/(碳源中的摩尔碳)＊100
对于这一计算，可以假定酵母提取物含有50％w/w碳。作为实例，对于实施例7，第III部分所述的500升，碳转化成异戊二烯的百分数可以按等式2所示来计算。
等式2
％碳产量＝(39.1g异戊二烯＊1/68.1mol/g＊5C/mol)/[(181221g葡萄糖＊1/180mol/g＊6C/mol)+(17780g酵母提取物＊0.5＊1/12mol/g)]＊100＝0.042％
对于在此所述的两个500升发酵(实施例7，第VII和VIII部分)，碳转化成异戊二烯的百分数在0.04-0.06％之间。使用在此所述的14升系统实现了0.11-0.16％碳产量。
本领域熟练技术人员可以容易地将异戊二烯生产率或生产的异戊二烯的量转化成任何其它单位。示例性的等式列于下面用于在单位间的相互转换。
异戊二烯生产率(总的和比生产率)的单位
等式3
1g异戊二烯/L培养液/hr＝14.7mmol异戊二烯/L培养液/hr(总体积率)
等式4
1nmol异戊二烯/gwcm/hr＝1nmol异戊二烯/L培养液/hr/OD600(这一转换假定具有OD600值为1的1升培养液具有1克湿细胞重量)
等式5
1nmol异戊二烯/gwcm/hr＝68.1ng异戊二烯/gwcm/hr(鉴于异戊二烯的分子量)
等式6
1mnol异戊二烯/L气体O2/hr＝90nmol异戊二烯/L培养液/hr(以O2流速为90L/hr每升培养液)
等式7
1ug异戊二烯/L气体废气中的异戊二烯＝60ug异戊二烯/L培养液/hr，流速为每L培养液60L气体(1vvm)
滴定度(总和比)单位
等式8
1nmol异戊二烯/mg细胞蛋白＝150nmol异戊二烯/L培养液/OD600(这一转换假定具有OD600值为1的一升培养液具有约150mg的总细胞蛋白)(比生产力)
等式9
1g异戊二烯/L培养液＝14.7mmol异戊二烯/L培养液(总滴定度)
如果需要，可以使用等式10将包括细胞湿重的任何单位转换成包括细胞干重的相应单位。
等式10
细胞干重＝细胞湿重/3.3
在本发明所包含的一些实施方式中，包括编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸的细胞生产异戊二烯的量为在基本上相同条件下，没有编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸时所生长的相应细胞产生的异戊二烯量的至少或约2倍、3倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、150倍、200倍、400倍或更高。
在本发明所包含的一些实施方式中，包含编码异戊二烯合酶多肽的异源核酸以及编码DXS、IDI和/或MVA途径多肽的一或多种异源核酸的细胞生产异戊二烯的量为在基本上相同条件下，没有异源核酸时所生长的相应细胞产生的异戊二烯量的至少或约2倍、3倍、5倍、10倍、25倍、50倍、100倍、150倍、200倍、400倍或更高。
示例性异戊二烯纯化方法
在一些实施方式中，在此所述的任何方法还包括回收异戊二烯。例如，可以使用标准技术来回收使用本发明组合物和方法所生产的异戊二烯。例如气提、分馏、吸附/解吸附、全蒸发、从固相热或真空解吸异戊二烯、或用溶剂提取固定化或吸附在固相上的异戊二烯(参见例如，美国专利号4,703,007和4,570,029，其各在此通过整体引用作为参考，特别是对于异戊二烯回收和纯化方法)。在一些实施方式中，异戊二烯的回收涉及以液体形式分离异戊二烯(例如异戊二烯纯溶液或溶剂中的异戊二烯溶液)。气提涉及以连续方式从发酵废气流除去异戊二烯蒸汽。此种去除可以以多种不同方式实现，包括但不限于吸附至固相，分配到液相，或直接冷凝。在一些实施方式中，在蒸发露点以上，稀释异戊二烯蒸汽流的膜富集导致液体异戊二烯的冷凝。
异戊二烯的回收可包括一步或多步。在一些实施方式中，从发酵废气除去异戊二烯蒸汽以及将异戊二烯转化成液相是同时进行的。例如，异戊二烯可以直接从废气流冷凝以形成液体。在一些实施方式中，从发酵废气除去异戊二烯蒸汽以及将异戊二烯转化成液相是顺序进行的。例如，可将异戊二烯吸附至固相然后用溶剂从固相提取。
在一些实施方式中，在此所述的任何方法进一步包括纯化异戊二烯。例如，可以使用标准技术来纯化使用本发明组合物和方法所生产的异戊二烯。纯化指一种方法，通过该方法将异戊二烯与在生产异戊二烯时存在的一种或多种组分分离。在一些实施方式中，异戊二烯作为基本上纯的液体来获得。纯化方法的实例包括(i)以液体提取物从溶液蒸馏和(ii)色谱。如在此使用，“纯化的异戊二烯”指已经与在生产异戊二烯时存在的一种或多种组分分离的异戊二烯。在一些实施方式中，异戊二烯是按重量计，至少约20％不含有在生产异戊二烯时存在的其它组分。在多种实施方式中，异戊二烯是按重量计至少或约25％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％、或99％纯的。纯度可以通过任何适当的方法来检测，例如通过柱色谱、HPLC分析或GC-MS分析。
在一些实施方式中，在此所述的任何方法还包括使异戊二烯聚合。例如，可以使用标准方法来聚合纯化的异戊二烯以形成顺式聚异戊二烯或使用标准方法形成其他下游产物。
其它方法和组合物描述于2008年9月15日递交的美国临时专利申请号61/097,186，2008年9月15日递交的美国临时专利申请号61/097,189，2008年9月15日递交的美国临时专利申请号61/097,163，它们全部在此通过整体引用作为参考，特别是对于生产异戊二烯的组合物和方法。
实施例
实施例也描述和详解了上面讨论的本发明的方面和实施方式，但是实施例旨在仅仅是本发明的示例并且因此不应以任何方式被认为是限定本发明。除非另有指明，否则温度是摄氏度而压力为大气压或近大气压。前面的实例和详细说明以说明的方式提供而非限制。所有在这一说明书中引用的出版物、专利申请和专利都在此通过引用作为参考，就如同每一出版物、专利申请或专利都具体且单独地引入本文作为参考。特别地，在此引用的所有出版物出于描述和公开可用于本发明的组合物和方法的目的而明确地通过引用作为参考。尽管出于清楚理解的目的，较详细地以说明方式描述了前面的发明，但是对于本领域熟练技术人员来讲显而易见的是，根据本发明的教导，可以进行某些改变和修改而不背离所附权利要求的精神或范围。
实施例1、在表达重组野葛异戊二烯合成酶的大肠杆菌中的异戊二烯生产
I.在大肠杆菌中表达野葛异戊二烯合酶的载体构建
野葛(葛麻姆(Puerariamontana)异戊二烯合酶基因(IspS)的蛋白序列获自GenBank(AAQ84170)。对于大肠杆菌密码子使用进行优化的野葛异戊二烯合酶基因购自DNA2.0(SEQIDNO：1)。通过用BspLU11I/PstI进行限制性内切核酸酶消化从供应的质粒取下异戊二烯合酶基因，凝胶纯化，并连接到已经用NcoI/PstI消化的pTrdHis2B(Invitrogen)。设计构建体以便异戊二烯合酶基因终止密码子在PstI位点的5’。结果是，当表达构建体时，His-Tag不连接异戊二烯合酶蛋白。对得到的质粒pTrcKudzu通过测序验证(图2和3)。
也将异戊二烯合酶基因克隆到pET16b(Novagen)。这种情形下，异戊二烯合酶基因插入pET16b以便重组异戊二烯合酶蛋白含有N端His标签。通过PCR使用引物对pET-His-Kudzu-2F：5’-CGTGAGATCATATGTGTGCGACCTCTTCTCAATTTAC(SEQIDNO：3)和pET-HisKudzu-R：5’-CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAGCTG(SEQIDNO：4)从pTrcKudzu扩增异戊二烯合酶基因。这些引物分别在基因5’端添加NdeI位点和在3’端添加BamH1位点。上述质粒pTrcKudzu用作模板DNA，根据生产商的指示，使用Herculase聚合酶(Stratagene)，并且以10pMol的浓度添加引物。在25μl的总体积下进行PCR。PCR产物用NdeI/BamH1消化并且克隆到用相同酶消化的pET16b中。将连接混合物转化到大肠杆菌Top10(Invitrogen)并通过测序筛选正确克隆。将得到的质粒(其中从T7启动子表达野葛异戊二烯合酶基因)命名为pETNHisKudzu(图4和5)。
也将野葛异戊二烯合酶基因克隆到低拷贝数质粒pCL1920中。使用引物来从上述pTrcKudzu扩增野葛异戊二烯合酶基因。正向引物向5’端添加HindIII位点和大肠杆菌共有序列RBS。PstI克隆位点已经存在于pTrcKudzu中，就在终止密码子3’，因此构建反向引物以便最终PCR产物包括PstI位点。引物序列为：HindIII-rbs-KudzuF：5’-CATATGAAAGCTTGTATCGATTAAATAAGGAGGAATAAACC(SEQIDNO：6)和BamH1-KudzuR：
5’-CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAGCTG(SEQIDNO：4)。使用Herculase聚合酶，以10pmol引物浓度引物和1ng模板DNA(pTrcKudzu)扩增PCR产物。扩增方案包括30个循环的(95℃持续1分钟，60℃持续1分钟，72℃持续2分钟)。产物用HindIII和PstI消化并连接到也用HindIII和PstI消化的pCL1920。连接混合物转化大肠杆菌Top10。通过测序检测若干转化体。得到的质粒命名为pCL-lac-Kudzu(图6和7)。
II.异戊二烯生产的测定
对于摇瓶培养，将来自摇瓶的1ml培养物转入20mlCTC顶空瓶(Agilent瓶目录#51882753；盖目录/I51882759)。拧紧盖并在相同温度下孵育瓶，以250rpm振荡。30分钟后，从培养箱中取出瓶并按下述分析(对于这一检测法的一些实验数值参见表1)。
在测量了发酵罐中的异戊二烯生产的情形下，从发酵罐的废气取样并按下述直接进行分析(对于这一检测法的一些实验数值参见表2)。
使用与CTCAnalytics(Switzerland)CombiPAL自动进样器接口的Agilent6890GC/MS系统，在顶空模式下进行分析。使用AgilentHP-5M5GC/MS柱(30mx0.25mm；0.25pm膜厚)分离分析物。设定取样器以注射500μL顶空气体。GC/MS法利用氦气作为载气，流速为1ml/分钟。注射口保持在250℃，分流比为50∶1。在分析期间，烘箱温度保持在37℃持续2分钟。Agilent5793N质量选择检测器在m/z67，以单离子监测(SIM)模式允许。从1.4至1.7分钟，关掉监测器以允许洗脱永久气体。在这些条件下，观察到异戊二烯(2-甲基-1，3-丁二烯)在1.78分钟洗脱。使用校准表来量化异戊二烯绝对量并且发现在1μg/L至200μg/L为线性的。预计使用这一方法的检测极限为50至100ng/L。
III.在含有表达重组异戊二烯合酶的大肠杆菌细胞的摇瓶中的异戊二烯生产
将上述载体导入大肠杆菌菌株BL21(Novagen)以生产菌株BL21/ptrcKudzu、BL21/pCL-lac-Kudzu和BL21/pETHisKudzu。在LA(Luria琼脂)和羧苄青霉素(50μg/ml)上涂布菌株用于分离并且在37℃过夜培养。将单菌落接种到含有20mlLuriaBertani培养基(LB)和羧苄青霉素(100μg/ml)的250ml带挡板的摇瓶中。培养物在20℃以200rpm振荡过夜生长。测量过夜培养物的OD600并将培养物稀释到含有30mlMagicMedia(Invitrogen)和羧苄青霉素(100μg/ml)的250ml带挡板的摇瓶中至OD600～0.5。在30℃以200rpm振荡培养培养物。当OD600～0.5-0.8时，加入400μMIPTG并将细胞在30℃以200rpm振荡再培养6小时。在用IPTG诱导后0、2、4和6小时后，收集1ml培养物等分试样，测定OD600并且按上述测量生产的异戊二烯的量。结果如图8所示。
IV.在14升发酵中从BL21/ptrcKudzu生产异戊二烯
从补料分批培养测定由含有重组野葛异戊二烯合酶基因的大肠杆菌大规模生产异戊二烯。每升发酵培养基的发酵培养基(TM2)的配方如下：K2HPO413.6g，KH2PO413.6g，MgSO4＊7H2O2g，一水合柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，(NH4)2SO43.2g，酵母提取物5g，1000X改良的微量金属溶液(ModifiedTraceMetalSolution)1ml。所有组分一起添加并溶解在diH2O中。用氢氧化钾(KOH)调节pH至6.8并定容至体积。终产物用0.22μ过滤器过滤灭菌(只此，不高压灭菌)。1000X改良的微量金属溶液的配方如下：柠檬酸＊H2O40g，MnSO4＊H2O30g，NaCl10g，FeSO4＊7H2O1g，CoCl2＊6H2O1g，ZnSO4＊7H2O1g，CuSO4＊5H2O100mg，H3BO3100mg，NaMoO4＊2H2O100mg。以每次在diH2O中溶解一种组分来溶解每一组分，用HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容至体积并用0.22μ过滤器过滤灭菌。
这一实验在14L生物反应器中进行以监控在想要的发酵、pH6.7和温度34℃下从葡萄糖形成的异戊二烯。在大豆胨-酵母提取物-葡萄糖培养基中制备取自冷冻瓶的大肠杆菌菌株BL21/ptrcKudzu的接种物。当接种物生长至OD550＝0.6后，将2个600ml烧瓶离心并将内容物在70ml上清液中重悬浮以将细胞沉淀(70ml的OD3.1材料)转入生物反应器。接种后不同时间下，取出样品并按上述测定所生产的异戊二烯的量。结果如图9所示。
实施例2、在表达重组杨异戊二烯合酶的大肠杆菌中的异戊二烯生产
杨(银白杨x欧洲山杨)异戊二烯合酶的蛋白序列(Schnitzler，J-P等人，(2005)Flanta222：777-786)获自GenBank(CAC35696)。对于大肠杆菌进行密码子优化的基因购自DNA2.0(p9796-杨，图30和31)。通过用BspLU11I/PstI进行限制性内切核酸酶消化从供应的质粒取下异戊二烯合酶基因，凝胶纯化，并连接到已经用NcoI/PstI消化的pTrcHis2B(Invitrogen)。克隆构建体以便插入片段中的终止密码子在PstI位点之前，这得到His-Tag不连接异戊二烯合酶蛋白的构建体。对得到的质粒pTrcPoplar(图32和33)进行测序验证。
实施例3、在表达重组野葛异戊二烯合酶的柠檬泛菌中的异戊二烯生产
将在实施例1所述的pTrcKudzu和pCL-lacKudzu质粒电穿孔到柠檬泛菌(美国专利号7,241,587)。在分别含有羧苄青霉素(200μg/ml)或壮观霉素(50μg/ml)的LA上选择转化体。按实施例1对于表达重组野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌菌株所述进行从摇瓶生产异戊二烯并测定所生产的异戊二烯的量。结果如图10所示。
实施例4、在表达重组野葛异戊二烯合酶的枯草杆菌中的异戊二烯生产
I.用于表达野葛异戊二烯合酶的枯草杆菌复制质粒的构建
使用在aprE启动子控制下的复制质粒(具有氯霉素抗性表达盒的pBS19)，在枯草杆菌aprEnprEPxylcomK菌株(BG3594comK)中表达野葛异戊二烯合酶基因。使用PCR分别扩增异戊二烯合酶基因、aprE启动子和转录终止子并融合。然后将构建体克隆到pBS19中并转化到枯草杆菌。
a)aprE启动子的扩增
使用下面的引物，从枯草杆菌的染色体DNA扩增aprE启动子：
CF797(+)起始aprE启动子MfeI
5’-GACATCAATTGCTCCATTTTCTTCTGCTATC(SEQIDNO：58)
CF07-43(-)与野葛ispS融合的aprE启动子
5’-ATTGAGAAGAGGTCGCACACACTCTTTACCCTCTCCTTTTA(SEQIDNO：59)
b)异戊二烯合酶基因的扩增
从质粒pTrcKudzu扩增野葛异戊二烯合酶基因(SEQIDNO：2)。该基因对于大肠杆菌进行了密码子优化并通过DNA2.0合成。使用下面的引物：
CF07-42(+)将aprE启动子与野葛异戊二烯合酶基因(GTG起始密码子)融合
5’-TAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGTGTGCGACCTCTTCTCAAT(SEQIDNO：60)
CF07-45(-)将野葛异戊二烯合酶基因的3’端与终止子融合
5’-CCAAGGCCGGTTTTTTTTAGACATACATCAGCTGGTTAATC(SEQIDNO：61)
c)转录终止子的扩增
使用下面的引物，从以前测序的质粒pJHPms382扩增解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyliquefaciens)的碱性丝氨酸蛋白酶的终止子：
CF07-44(+)将野葛异戊二烯合酶的3’端与终止子融合
5’-GATTAACCAGCTGATGTATGTCTAAAAAAAACCGGCCTTGG(SEQIDNO：62)
CF07-46(-)解淀粉芽孢杆菌终止子的末端(BamHI)
5’-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC(SEQIDNO：63)
使用下述引物进行PCR将野葛片段与终止子片段融合：
CF07-42(+)将aprE启动子与野葛异戊二烯合酶基因融合(GTG起始密码子)
5’-TAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGTGTGCGACCTCTTCTCAAT(SEQIDNO：61)
CF07-46(-)解淀粉芽孢杆菌终止子的末端(BamHI)
5’-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC(SEQIDNO：63)
使用下述引物进行PCR将野葛终止子片段与启动子片段融合：
CF797(+)起始aprE启动子MfeI
5’-GACATCAATTGCTCCATTTTCTTCTGCTATC(SEQIDNO：64)
CF07-46(-)解淀粉芽孢杆菌终止子的末端(BamHI)
5’-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC(SEQIDNO：63)
使用Qiagen试剂盒纯化融合PCR片段并用限制性酶MfeI和BamHI消化。这一消化的DNA片段用Qiagen试剂盒进行凝胶纯化并连接至称作pBS19的载体，该载体已经用EcoRI和BamHI消化并进行了凝胶纯化。
将连接混合物转化到大肠杆菌Top10细胞，并且在LA和50羧苄青霉素板上筛选菌落。选择总共6个菌落并在LB和50羧苄青霉素中过夜生长，然后用Qiagen试剂盒分离质粒。质粒用EcoRI和BamHI消化以检测插入片段并且将3个正确的质粒送去以下面的引物进行测序：
CF149(+)aprE启动子的EcoRI起点
5’-GACATGAATTCCTCCATTTTCTTCTGC(SEQIDNO：65)
CF847(+)pXX049的序列(aprE启动子末端)
5’-AGGAGAGGGTAAAGAGTGAG(SEQIDNO：66)
CF07-45(-)将野葛异戊二烯合酶的3’端与终止子融合
5’-CCAAGGCCGGTTTTTTTTAGACATACATCAGCTGGTTAATC(SEQIDNO：61)
CF07-48(+)野葛异戊二烯合酶的测序引物
5’-CTTTTCCATCACCCACCTGAAG(SEQIDNO：67)
CF07-49(+)野葛异戊二烯合酶中的测序
5’-GGCGAATGGTCCAACAACAAAATTATC(SEQIDNO：68)
通过测序发现名为pBSKudzu#2的质粒是正确的(图52和12)并且将它转化到枯草杆菌宿主菌株BG3594comK。在LA和5个氯霉素板上进行筛选。选择转化体并且在LA和5个氯霉素上挑选单菌落，然后在LB和5氯霉素中生长至其达到OD600为1.5。在甘油存在下，将其冻存在-80℃的瓶中。得到的菌株命名为CF443。
II.在含有表达重组异戊二烯合酶的枯草杆菌细胞的摇瓶中的异戊二烯生产
用来自LA和氯霉素(Cm，25μg/ml)的CF443单菌落接种过夜培养物。培养物在37℃下在LB和Cm中以200rpm摇动生长。使用这些过夜培养物(1ml)接种含有25mlGrantsII培养基和终浓度为25μg/ml的氯霉素的250ml带挡板的摇瓶。GrantsII培养基配方为10g大豆胨，3ml1MK2HPO4，75g葡萄糖，3.6g尿素，100ml的10xMOPS，用H2O定容至1L，pH7.2；10XMOPS配方为83.72gMOPS，7.17gtricine，12gKOH颗粒，10ml0.276MK2SO4溶液，10ml0.528MMgCl2溶液，29.22gNaCl，100ml的100x微量营养物，用H2O定容至1L；以及100X微量营养物的配方为1.47gCaCl2＊2H2O，0.4gFeSO4＊7H2O，0.1gMnSO4＊H2O，0.1gZnSO4＊H2O，0.05gCuCl2＊2H2O，0.1gCoCl2＊6H2O，0.1gNa2MoO4＊2H2O，用H2O定容至1L。在37℃孵育摇瓶并在18、24和44小时取样。在18小时时，对CF443和对照菌株顶空取样。这表示18小时异戊二烯累积。异戊二烯的量通过如实施例1所述的气相色谱来测定。通过表达重组异戊二烯合酶，异戊二烯的生产显著增强(图11)。
III.在14L发酵中由CF443生产异戊二烯
由补料-分批培养测定由在复制质粒上含有重组野葛异戊二烯合酶基因的枯草杆菌进行的大规模异戊二烯生产。通过常规补料-分批发酵在含有大豆粉(Cargill)、磷酸钠和磷酸钾、硫酸镁和柠檬酸、氯化铁和氯化镁溶液的营养培养基中培养表达野葛异戊二烯合酶基因的芽孢杆菌菌株CF443或不表达野葛异戊二烯合酶基因的对照菌株。在发酵之前，使用包括纤维素酶、半纤维素酶和果胶酶的酶混合物将培养基浸软90分钟(参见W095/04134)。向14-L分批发酵罐加料60％wt/wt葡萄糖(CargillDE99葡萄糖，ADMVersadexgreens或Danisco转化糖)和99％wt/wt油(WesternFamily豆油，其中99％wt/wt是它加入细胞培养基之前的油浓度)。当检测不到批次中的葡萄糖时，开始补料。补料速率在几小时内增加并且被调整以在相等的碳基础上添加油。使用28％w/v氢氧化铵将pH控制在6.8-7.4。在起泡情形下，向培养基中加入消泡剂。将发酵温度控制在37℃并且以750rpm搅拌发酵培养物。贯穿整个过程，对诸如pH、DO％、气流和压力的多种其它参数进行监控。DO％保持高于20。在36小时的时间进程中取样并分析细胞生长(OD550)和异戊二烯生产。这些实验的结果如图53A和53B所示。
IV.在枯草杆菌中野葛异戊二烯合酶(ispS)的整合
将野葛异戊二烯合酶基因克隆到在aprE启动子控制下的整合质粒(pJH101-cmpR)中。在检测条件下，未检测到异戊二烯。
实施例5、在木霉中的异戊二烯生产
I.在里氏木霉中表达野葛异戊二烯合酶的载体的构建
通过DNA2.0合成解脂耶氏酵母菌密码子优化的野葛IS基因(SEQIDNO：8)(图13)。这一质粒用作下面PCR扩增反应的模板：1μl质粒模板(20ng/ul)，1μl引物EL-945(10uM)5’-GCTTATGGATCCTCTAGACTATTACACGTACATCAATTGG(SEQIDNO：9)，1μl引物EL-965(10uM)5’-CACCATGTGTGCAACCTCCTCCCAGTTTAC(SEQIDNO：10)，1μldNTP(10mM)，5μl10xPfuUltraII融合HSDNA聚合酶缓冲液，1μlPfuUltraII融合HSDNA聚合酶，40μl水，总反应体积为50μl。正向引物在5’端含有额外的4个核苷酸，这4个核苷酸不与解脂耶氏酵母密码子优化的野葛异戊二烯合酶基因对应，但为克隆到pENTR/D-TOPO载体所需的。反向引物在5’端含有额外的21个核苷酸，这21个核苷酸不与解脂耶氏酵母密码子优化的野葛异戊二烯合酶基因对应，但被插入以克隆到其它载体骨架。使用MJResearchPTC-200热循环仪，按下面进行PCR反应：95℃持续2分钟(仅仅是首个循环)，95℃持续30秒，55℃持续30秒，72℃持续30秒(重复27个循环)，最后一个循环后于72℃持续1分钟。在1.2％E-gel上分析PCR产物以确认解脂耶氏酵母密码子优化的野葛异戊二烯合酶基因的成功扩增。
然后使用TOPOpENTR/D-TOPO克隆试剂盒，按照生产商说明克隆PCR产物：1μlPCR反应物，1μl盐溶液，1μlTOPOpENTR/D-TOPO载体和3μl水，总反应体积为6μl。在室温孵育反应物5分钟。将1微升TOPO反应物转化到TOP10化学感受态大肠杆菌细胞。在LA和50μg/ml卡那霉素板上筛选转化体。挑取若干菌落并且将每个接种到5ml含有LB和50μg/ml卡那霉素的试管中并在37℃以200rpm振荡过夜生长。使用QIAprepSpinMiniprepKit，按照生产商说明从过夜培养物管分离质粒。对若干质粒进行测序以验证DNA序列是正确的。
编码解脂耶氏酵母密码子优化的野葛异戊二烯合酶基因的单个pENTR/D-TOPO质粒用于Gateway克隆到定制的pTrex3g载体。pTrex3g的构建描述于WO2005/001036A2。按照制造商对于GatewayLRClonaseIIEnzymeMixKit(Invitrogen)的说明进行反应：1μl解脂耶氏酵母密码子优化的野葛异戊二烯合酶基因pENTR/D-TOPO供体载体，1μlpTrex3g目的载体，6μlTE缓冲液，pH8.0，总反应体积为8μl。反应物在室温孵育1小时然后加入1μl蛋白酶K溶液并继续在37℃孵育10分钟。然后将1μl反应物转化到TOP10化学感受态大肠杆菌细胞。在LA和50μg/ml羧苄青霉素板上筛选转化体。挑取若干菌落并且将每个接种到5ml含有LB和50μg/ml羧苄青霉素的试管中并在37℃以200rpm振荡过夜生长。使用QIAprepSpinMiniprepKit(Qiagen，Inc.)，按照生产商说明从过夜培养物管分离质粒。对若干质粒进行测序以验证DNA序列是正确的。
使用BiolisticPDS-1000/HEParticleDeliverySystem进行解脂耶氏酵母密码子优化的野葛异戊二烯合酶pTrex3g质粒(图14)向四缺失的里氏木霉的生物射弹转化(参见WO2005/001036A2)。使用专利公开WO2005/001036A2的实施例11所列方法进行稳定转化体的分离和摇瓶评估。
II.在里氏木霉重组菌株中的异戊二烯生产
将1ml上述异戊二烯合酶转化体的15和36小时龄培养物转入顶空瓶。密封瓶并在30℃孵育5小时。测量顶空气体并且通过实施例1所述的方法鉴定异戊二烯。两个转化体显示出痕量异戊二烯。异戊二烯的量可通过14小时的孵育而增加。两个阳性样品在14小时的孵育后显示出异戊二烯水平为约0.5μg/L。未转化的对照没显示出可检测的异戊二烯水平。这一实验表明当提供外源异戊二烯合酶时，里氏木霉能够从内源前体生产异戊二烯。
实施例6、在耶氏酵母中的异戊二烯生产
I.用于在解脂耶氏酵母中表达野葛异戊二烯合酶的载体的构建
用于在解脂耶氏酵母中表达野葛异戊二烯合酶基因的载体构建的起点是载体pSPZ1(MAP29Spb)。这一载体的完整序列(SEQIDNo：11)如图15所示。
使用解脂耶氏酵母菌株GICC120285的染色体DNA作为模板，通过PCR扩增下面的片段：无启动子形式的URA3基因，18S核糖体RNA基因的片段，解脂耶氏酵母XPR2基因的转录终止子，以及含有XPR2和ICL1基因的启动子的两种DNA片段。使用下面的PCR引物：
ICL13
5’-GGTGAATTCAGTCTACTGGGGATTCCCAAATCTATATATACTGCAGGTGAC(SEQIDNO：69)
ICL15
5’-GCAGGTGGGAAACTATGCACTCC(SEQIDNO：70)
XPR3
5’-CCTGAATTCTGTTGGATTGGAGGATTGGATAGTGGG(SEQIDNO：71)
XPR5
5’-GGTGTCGACGTACGGTCGAGCTTATTGACC(SEQIDNO：72)
XPRT3
5’-GGTGGGCCCGCATTTTGCCACCTACAAGCCAG(SEQIDNO：73)
XPRT5
5’-GGTGAATTCTAGAGGATCCCAACGCTGTTGCCTACAACGG(SEQIDNO：74)
Y18S3
5’-GGTGCGGCCGCTGTCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCG(SEQIDNO：75)
Y18S5
5’-GGTGGGCCCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAG(SEQIDNO：76)
YURA3
5’-GGTGACCAGCAAGTCCATGGGTGGTTTGATCATGG(SEQIDNO：77)
YURA50
5’-GGTGCGGCCGCCTTTGGAGTACGACTCCAACTATG(SEQIDNO：78)
YURA51
5’-GCGGCCGCAGACTAAATTTATTTCAGTCTCC(SEQIDNO：79)
对于PCR扩增，按照生产商的说明书，使用PfuUltraII聚合酶(Stratagene)，生产商提供的缓冲液和dNTPs，2.5μM引物和所示的模板DNA。使用下面的循环进行扩增：95℃持续1min；34x(95℃持续30sec；55℃持续30sec；72℃持续3min)和72℃持续10min，随后4℃孵育。
对于在耶氏酵母中表达进行密码子优化的编码野葛异戊二烯合酶基因的合成DNA分子得自DNA2.0(图16；SEQIDNO：12)。图18显示了携带分别在XPR2和ICL1启动子控制下的合成的野葛异戊二烯合酶基因的质粒pYLA(KZ1)和pYLI(KZ1)的构建方案的全部细节。也构建了对照质粒，其中插入交配因子基因(MAP29)代替异戊二烯合酶基因(图18E和18F)。
类似的克隆方法可以用于表达杨(PopulusalbaxPopulustremula)异戊二烯合酶基因。杨异戊二烯的序列描述于MillerB.等人，(2001)Planta213，483-487并且示出于图17(SEQIDNO：13)。图18A和B显示了产生携带分别在XPR2和ICL1启动子控制下的合成的杨异戊二烯合酶基因的质粒pYLA(POP1)和pYLI(POP1)的构建方案。
II.由解脂耶氏酵母重组菌株生产异戊二烯
载体pYLA(KZ1)、pYLI(KZ1)、pYLA(MAP29)和pYLI(MAP29)用SacII消化并通过标准醋酸锂/聚乙二醇方法转化菌株解脂耶氏酵母CLIB122以得到尿苷原养型。简言之，酵母细胞在YEPD(1％酵母提取物，2％蛋白胨，2％葡萄糖)中过夜生长，通过离心(4000rpm，10mm)收集，用无菌水冲洗并悬浮在0.1M醋酸锂，pH6.0中。将200μl等份细胞悬浮液与线性化质粒DNA溶液(10-20μg)混合，室温孵育10分钟并与1ml在相同缓冲液中的50％的PEG4000混合。进一步在室温孵育悬浮液1小时，随后在42℃热激2分钟。然后将细胞接种在SChisleu平板(0.67％酵母氮碱，2％葡萄糖，各100mg/L亮氨酸和组氨酸)上。在30℃孵育3-4天后出现转化体。
将三个来自pYLA(KZ1)转化的分离菌，三个来自pYLI(KZ1)转化的分离菌，两个来自pYLA(MAP29)转化的分离菌以及两个来自pYLI(MAP29)转化的分离菌在30℃于YEP7培养基(1％酵母提取物，2％蛋白胨，pH7.0)中振荡生长24小时。通过离心收集来自10ml培养物的细胞，在3ml新鲜YEP7中重悬浮并放入15ml螺口盖瓶。将瓶在室温温和(60rpm)振荡过夜培养。通过气相色谱使用如实施例1所述的质谱检测器分析这些瓶的顶空中异戊二烯含量。以pYLA(KZ1)和pYLI(KZ1)获得的所有转化体产生可容易检测量的异戊二烯(0.5μg/L至1μg/L，图20)。在携带植酸酶基因而不是异戊二烯合酶基因的对照菌株的顶空中没有检测到异戊二烯。
实施例7：在表达野葛异戊二烯合酶和idi、或dxs、或idi和dxs的大肠杆菌中生产异戊二烯
I.构建编码野葛异戊二烯合酶和idi、或dxs、或idi和dxs用于在大肠杆菌中生产异戊二烯的载体
i)构建pTrcKudzuKan
用赋予卡那霉素抗性的基因代替pTrcKudzu(实施例1所述)的bla基因。为了除去bla基因，pTrcKudzu用BspHI消化，用虾碱性磷酸酶(SAP)处理，在65℃热处死，然后用Klenow片段和dNTPs末端填平。从琼脂糖凝胶纯化5kbp大片段并将它连接到kanr基因，其已经使用引物MCM225’-GATCAAGCTTAACCGGAATTGCCAGCTG(SEQIDNO：14)和MCM235’-GATCCGATCGTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC(SEQIDNO：15)从pCR-Blunt-II-TOPO进行PCR扩增，用HindIII和PvuI消化并进行末端填充。在含有50μg/ml卡那霉素的LA上筛选携带有赋予卡那霉素抗性的质粒(pTrcKudzuKan)的转化体。
ii)构建pTrcKudzuyIDIKan
pTrcKudzuKan用PstI消化，用SAP处理，热处死并进行凝胶纯化。其通过合成RBS连接到编码来自酿酒酵母的idi的PCR产物。PCR的引物为NsiI-YIDI1F5’-CATCAATGCATCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAAAATGAC(SEQIDNO：16)和PstIYIDI1R5’-CCTTCTGCAGGACGCGTTGTTATAGC(SEQIDNO：17)；以及模板是酿酒酵母基因组DNA。PCR产物用NsiI和PstI消化并在连接前进行凝胶纯化。连接混合物转化到化学感受态TOP10细胞并在含有50μg/ml卡那霉素的LA上筛选。分离若干转化体并测序，将得到的质粒称作pTrcKudzu-yIDI(kan)(图34和35)。
iii)构建pTrcKudzuDXSKan
质粒pTrcKudzuKan用PstI消化，用SAP处理，热处死并进行凝胶纯化。其通过合成RBS连接到编码来自大肠杆菌的dxs的PCR产物。PCR的引物为MCM135’-GATCATGCATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGAGTTTTGATATTGCCAAATACCCG(SEQIDNO：18)和MCM145’-CATGCTGCAGTTATGCCAGCCAGGCCTTGAT(SEQIDNO：19)；以及模板是大肠杆菌基因组DNA。PCR产物用NsiI和PstI消化并在连接前进行凝胶纯化。将所得的转化反应物转化到TOP10细胞并在含有50μg/ml卡那霉素的LA上筛选。分离若干转化体并测序，将得到的质粒称作pTrcKudzuDXS(kan)(图36和37)。
iv)构建pTrcKudzu-yIDI-dxs(kan)
pTrcKudzu-yIDI(kan)用PstI消化，用SAP处理，热处死并进行凝胶纯化。其通过合成的RBS连接到编码大肠杆菌dxs的PCR产物(引物MCM13
5’-GATCATGCATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGAGTTTTGATATTGCCAAATACCCG(SEQIDNO：18)和MCM14
5’-CATGCTGCAGTTATGCCAGCCAGGCCTTGAT(SEQIDNO：19)，模板TOP10细胞)，该产物以及用NsiI和PstI消化并凝胶纯化。最终质粒称作pTrcKudzu-yIDI-dxs(kan)(图21和22)。
v)构建pCLPtrcKudzu
使用SspI从pTrcKudzu消化来自上述实施例1的含有启动子、结构基因和终止子的DNA片段并凝胶纯化。其连接至已经用PvuII消化，用SAP处理以及热处死的pCL1920。得到的连接混合物转化TOP10细胞并在含有50μg/ml壮观霉素的LA中筛选。分离若干克隆并测序，选择两个克隆。pCLPtrcKudzu和pCLPtrcKudzu(A3)具有相反方向的插入片段
(图38-41)。
vi)pCLPtrcKudzuyIDI的构建
来自上述(iii)的NsiI-PstI消化的，凝胶纯化的IDIPCR扩增子连接到已经用PstI消化，用SAP处理以及热处死的pCLPtrcKudzu。连接混合物转化到TOP10细胞并在含有50μg/ml壮观霉素的LA中筛选。分离若干克隆并测序，得到的质粒称作pCLPtrcKudzuyIDI(图42和43)。
vii)pCLPtrcKudzuDXS的构建
来自上述(iii)的NsiI-PstI消化的，凝胶纯化的DXSPCR扩增子连接到已经用PstI消化，用SAP处理以及热处死的pCLPtrcKudzu(A3)。连接混合物转化得TOP10细胞并在含有50μg/ml壮观霉素的LA中筛选。分离若干克隆并测序，得到的质粒称作pCLPtrcKudzuDXS(图44和45)。
II.在来自以不同拷贝数表达野葛异戊二烯合酶，idi，和/或dxs的培养物的顶空中的异戊二烯测量
在LB卡那霉素50μg/mL上生长之前转化有质粒pTrcKudzu(kan)(A)、pTrcKudzu-yIDIkan(B)、pTrcKudzu-DXSkan(C)、pTrcKudzu-yIDIDXSkan(D)的大肠杆菌BL21(λDE3)培养物。在LB壮观霉素50μg/mL上生长pCLPtrcKudzu(E)、pCLPtrcKudzu、pCLPtrcKudzu-yIDI(F)和pCLPtrcKudzu-DXS(G)的培养物。培养物在时间0用400μMIPTG诱导(OD600接近0.5)并且取样用于异戊二烯顶空测量(参见实施例1)。结果如图23A-23G所示。
将质粒pTrcKudzu-yIDI-dxs(kan)通过转化导入大肠杆菌菌株BL21。得到的菌株BL21/pTrcKudzuIDIDXS在20℃下于含有卡那霉素(50μg/ml)的LB中过夜生长并用于接种含1％葡萄糖的TM3(13.6gK2PO4，13.6gKH2PO4，2.0gMgSO4＊7H2O，2.0g一水合柠檬酸，0.3g柠檬酸铁铵，3.2g(NH4)2SO4，0.2g酵母提取物，1.0ml1000x改良的微量金属溶液(ModifedTraceMetalSolution)，调节至pH6.8并用H2O定容，并灭菌过滤)培养瓶。培养瓶在30℃孵育直到OD600达到0.8，然后用400μMIPTG诱导。在诱导后多个时间取样并按实施例1所述测量顶空中的异戊二烯的量。结果如图23H所示。
III.在大肠杆菌/pTrcKudzuyIDIDXS中从生物量生产异戊二烯
检测菌株BL21pTrcKudzuIDIDXS从三种类型的生物量：甘蔗渣、玉米秸秆和软材木浆产生异戊二烯的能力，以葡萄糖为对照。生物量的水解物由酶促水解来制备(Brown，L和Torget，R.，1996，NREL标准检测法Lap-009“EnzymaticSaccharificationofLignocellulosicBiomass”)并且根据葡萄糖当量以稀释液使用。这一实例中，葡萄糖当量等于1％葡萄糖。使用来自新鲜的转化细胞BL21(DE3)pTrcKudzuyIDIDXS(kan)的平板的单菌落来接种5ml的LB加卡那霉素(50μg/ml)。在25℃过夜振荡孵育培养物。第二天，将过夜培养物在25ml的TM3和0.2％YE和1％原料中稀释至OD600为0.05。原料是玉米秸秆、甘蔗渣或软材木浆。葡萄糖用作阳性对照而没有葡萄糖用作阴性对照。在30℃以180rpm振荡孵育培养物。监测培养物的OD600并且当它达到OD600为～0.8时，在1和3小时按实施例1所述分析培养物的异戊二烯生产。培养物未被诱导。所有含有添加的原料的培养物产生的异戊二烯与由葡萄糖阳性对照所产生的异戊二烯相等。实验以一式两份进行并且示出于图46。
IV.在大肠杆菌/pTrcKudzuIDIDXS中从转化糖生产异戊二烯
使用来自新鲜的转化细胞BL21(λDE3)/pTrcKudzuyIDIDXS(kan)的平板的单菌落来接种5ml的LB和卡那霉素(50μg/ml)。在25℃过夜振荡孵育培养物。第二天，将过夜培养物在25ml的TM3和0.2％YE和1％原料中稀释至OD600为0.05。原料是葡萄糖、转化葡萄糖或玉米秸秆。转化糖原料(DaniscoInvertSugar)通过酶处理蔗糖糖浆来制备。AFEX玉米秸秆按下述(第V部分)制备。细胞在30℃生长并且当培养物达到OD600为～0.8-1.0(0小时)时，测量第一个样品。按由OD600所测来分析培养物的生长以及按照实施例1，在0、1和3小时分析异戊二烯生产。结果如图47所示。
V.从AFEX预处理的玉米秸秆制备水解物
AFEX预处理的玉米秸秆获自MichiganBiotechnologyInstitute。预处理条件为60％湿度，1∶1氨负载，以及90℃持续30分钟，然后风干。AFEX预处理的玉米秸秆的水分含量为21.27％。在AFEX预处理的玉米秸秆中的葡聚糖和木聚糖含量分别是31.7％和19.1％(基于干物质)。糖化工艺如下：将20g的AFEX预处理玉米秸秆与5ml的1M柠檬酸钠缓冲液，pH4.8，2.25ml的Accellerase1000，0.1ml的GrindamylH121(来自用于面包制造工业的黑曲霉的Danisco木聚糖酶产物)，以及72.65ml的DI水加入500ml培养瓶。将培养瓶放入定轨摇床并在50℃孵育96小时。从摇床取一个样品并使用HPLC分析。水解物含有38.5g/l的葡萄糖，21.8g/l的木糖，和10.3g/l的葡萄糖和/或木糖寡聚物。
VI.酵母提取物对在补料分批培养中生长的大肠杆菌的异戊二烯生产的影响
以14-L规模按前面所述，用含有上述pTrcKudzuyIDIDXS质粒的大肠杆菌细胞进行发酵。以指数速率喂饲酵母提取物(BioSpringer，Montreal，Quebec，Canada)。在40小时发酵期间，送至发酵罐中的酵母提取物的总量在70-830之间变化。在550nm波长测量发酵液的光密度。发酵罐中的最终光密度与所添加的酵母提取物的量成比例(图48A)。按前述测定发酵罐的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯滴定度随发酵进程增加(图48B)。所生产的异戊二烯的量与喂饲的酵母提取物的量成线性比例(图48C)。
VII.在pTrcKudzuDXSyIDI的500-L发酵中生产异戊二烯
使用具有野葛异戊二烯合酶、酿酒酵母IDI以及大肠杆菌DXS核酸(大肠杆菌BL21(λDE3)pTrcKudzudxsyidi)的大肠杆菌细胞的500升发酵来生产异戊二烯。异戊二烯的水平在15小时的时间段从50至300μg/L变化。在平均异戊二烯浓度的基础上，通过装置的平均流量以及异戊二烯漏出的程度，收集的异戊二烯的量被计算为接近17g。
VIII.在补料分批培养中生长的大肠杆菌的500L发酵中的异戊二烯生产
培养基配方(每升发酵培养基)：
K2HPO47.5g，MgSO4＊7H2O2g，一水合柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物0.5g，1000X改良的微量金属溶液1ml。所有组分一起添加并溶解在diH2O中。对这一溶液高压灭菌。用氨气(NH3)调节pH至7.0并定容至体积。灭菌以及调节pH后，添加葡萄糖10g，硫胺素＊HCl0.1g以及抗生素。
1000X改良的微量金属溶液：
柠檬酸＊H2O40g，MnSO4＊H2O30g，NaCl10g，FeSO4＊7H2O1g，CoCl2＊6H2O1g，ZnSO4＊7H2O1g，CuSO4＊5H2O100mg，H3BO3100mg，NaMoO4＊2H2O100mg。以每次在DIH2O中溶解一种组分来溶解每一组分，用HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容至体积并用0.22微米过滤器过滤灭菌。
在500-L生物反应器中，用含有pTrcKudzuyIDIDXS质粒的大肠杆菌细胞进行发酵。进行这一实验来监控在期望的发酵pH7.0以及温度30℃下从葡萄糖和酵母提取物形成的异戊二烯。在大豆胨-酵母提取物-葡萄糖培养基中制备取自冷冻瓶的大肠杆菌菌株的接种物。当接种物生长至在550nm处测量的OD为0.15后，使用20ml接种含有2.5-L大豆胨-酵母提取物-葡萄糖培养基的生物反应器。该2.5-L生物反应器在30℃下生长至OD1.0并将2.0-L转入500-L生物反应器。
以指数速率喂饲酵母提取物(BioSpringer，Montreal，Quebec，Canada)和葡萄糖。在50小时发酵期间，送至生物反应器的葡萄糖和酵母提取物的总量分别为181.2kg和17.6kg。图49A显示了生物反应器中随着时间的光密度。按前述测定生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯滴定度随着发酵进程而增加(图49B)。在50小时发酵期间产生的异戊二烯总量为55.1g并且生产的时间进程如图49C所示。
实施例8、在表达野葛异戊二烯合酶和重组甲羟戊酸途径基因的大肠杆菌中生产异戊二烯
I.下游MVA途径的克隆
克隆下游甲羟戊酸途径的策略如下。通过PCR从酿酒酵母染色体DNA扩增甲羟戊酸生物合成途径的四种基因；甲羟戊酸激酶(MVK)，磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)、二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)和异戊烯二磷酸异构酶基因并且分别克隆到pCRBluntIITOPO质粒(Invitrogen)。在一些情形下，从大肠杆菌染色体DNA扩增idi基因。设计引物使得在5’端起始密码子上游8bp处插入大肠杆菌共有序列RBS(AGGAGGT(SEQIDNO：80)或AAGGAGG(SEQIDNO：81))以及在3’端添加PstI位点。然后一个接一个地将这些基因克隆到pTrcHis2B载体直到组装了整个途径。
酿酒酵母S288C的染色体DNA获自ATCC(ATCC204508D)。使用PfuTurbo按照生产商的说明书，用引物MVKF(5’-AGGAGGTAAAAAAACATGTCATTACCGTTCTTAACTTCTGC，SEQIDNO：21)和MVK-Pstl-R(5’-ATGGCTGCAGGCCTATCGCAAATTAGCTTATGAAGTCCATGGTAAATTCGTG，SEQIDNO：22)从酿酒酵母染色体扩增MVK基因。通过1.2％E-gel(Invitrogen)电泳鉴定正确大小的PCR产物(1370bp)并将其克隆pZeroBLUNTTOPO。将得到的质粒称作pMVK1。用SacI和Taq1限制性内切核酸酶消化质粒pMVK1并对片段凝胶纯化并连接到用SacI和BsIBI消化的pTrcHis2B。将得到的质粒命名为pTrcMVK1。
使用引物PstI-PMK1R(5’-GAATTCGCCCTTCTGCAGCTACC，SEQIDNO：23)和BsiHXAI-PMK1F(5’-CGACTGGTGCACCCTTAAGGAGGAAAAAAACATGTCAG，SEQIDNO：24)，通过PCR扩增甲羟戊酸生物合成途径的第二种基因PMK。使用PfuTurbo聚合酶(Stratagene)按照生产商的说明书进行PCR反应。将正确大小的产物(1387bp)用PstI和BsiHKI消化并连接到用PstI消化了的pTrcMVK1中。将得到的质粒命名为pTrcKK。以相同方式克隆MVD和idi基因。使用引物对PstI-MVD1R(5’-GTGCTGGAATTCGCCCTTCTGCAGC，SEQIDNO：25)和NsiI-MVD1F(5’-GTAGATGCATGCAGAATTCGCCCTTAAGGAGG，SEQIDNO：26)进行PCR以扩增MVD基因，并且使用引物对PstI-YIDI1R(5’-CCTTCTGCAGGACGCGTTGTTATAGC，SEQIDNO：27)和NsiI-YIDI1F(5’-CATCAATGCATCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAAAATGAC，SEQIDNO：28)扩增yIDI基因。在一些情形下，使用来自大肠杆菌的IPP异构酶基因，idi。为了扩增来自大肠杆菌染色体DNA的idi，使用下面的引物对：PstI-CIDI1R(5’-GTGTGATGGATATCTGCAGAATTCG，SEQIDNO：29)和NsiI-CIDI1F(5’-CATCAATGCATCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATG，SEQIDNO：30)。模板DNA是通过标准方法从大肠杆菌FM5分离的染色体DNA(WO96/35796和WO2004/033646，其各在此通过整体引用作为参考，特别是对于核酸的分离)。最终的质粒命名为pKKDIy用于编码酵母idi基因的构建体或者命名为pKKDIc用于编码大肠杆菌idi基因的构建体。将质粒转化到大肠杆菌宿主BL21用于随后分析。在一些情形下，将来自野葛的异戊二烯合酶克隆到pKKDIy，产生质粒pKKDIyIS。
也将下游MVA途径克隆到含有卡那霉素抗生素抗性标记的pTrc。用限制性内切核酸酶ApaI和PstI消化质粒pTrcKKDIy，在1.2％琼脂糖E-gel上分离5930bp片段并使用QiagenGelPurification试剂盒按照制造商的说明书进行纯化。用限制性内切核酸酶ApaI和PstI消化在实施例7中描述的质粒pTrcKudzuKan，使用QiagenGelPurification试剂盒从1.2％E-凝胶纯化3338bp含有载体的片段。使用RocheQuickLigation试剂盒连接该3338bp载体片段和5930bp下游MVA途径片段。将连接混合物转化到大肠杆菌TOP10细胞并将转化体在37℃下过夜生长，用含有卡那霉素(50μg/ml)的LA筛选。转化体通过限制性酶消化验证并将1个冷冻作为原种。质粒命名为pTrcKanKKDIy。
II.野葛异戊二烯合酶基因在pTrcKanKKDIy中的克隆使用引物MCM505’-GATCATGCATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGTGTGCGACCTCTTCTCAATTTACT(SEQIDNO：31)和MCM535’-CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAGCTG(SEQIDNO：32)，通过PCR从实施例1所述的pTrcKudzu扩增野葛异戊二烯合酶基因。将得到的PCR片段克隆到pCR2.1中并转化大肠杆菌TOP10。这一片段含有野葛异戊二烯合酶的编码序列以及含有大肠杆菌RBS的上游区。转化体在37℃下过夜孵育，在含有卡那霉素(50μg/ml)的LA上筛选。通过测序验证正确的片段插入并将这一菌株命名为MCM93。
用限制性内切核酸酶NsiI和PstI消化来自菌株MCM93的质粒以释放含有RBS和野葛异戊二烯合酶的1724bp插入片段。在1.2％琼脂糖E-gel上分离该1724bp片段并使用QiagenGelPurification试剂盒按照生产商的说明书进行纯化。用限制性内切核酸酶PstI消化质粒pTrcKanKKDIy，在37℃用SAP处理30分钟并使用QiagenPCR纯化试剂盒进行纯化。使用RocheQuickLigation试剂盒连接质粒和编码野葛异戊二烯合酶的DNA片段。将连接混合物转化到大肠杆菌TOP10细胞并且将转化体在37℃下过夜生长，在含有50μg/ml卡那霉素的LA上筛选。通过限制性酶切验证正确的转化体并且将质粒命名为pTrcKKDyIkISKan(图24和25)。将这一质粒转化得BL21(λDE3)细胞(Invitrogen)。
III.在表达重组下游甲羟戊酸途径以及来自野葛的异戊二烯合酶的大肠杆菌中从甲羟戊酸生产异戊二烯
在MOPS培养基中培养菌株BL21/pTrcKKDyIkISKan(Neidhardt等人，(1974)J.Bacteriology119：736-747)，调节至pH7.1并补充0.5％葡萄糖和0.5％甲羟戊酸。使用相同的条件只是不添加0.5％甲羟戊酸来建立对照培养。培养从用1％接种物的过夜种子培养物开始并且当培养物达到OD600为0.3至0.5时用500μMIPTG诱导。在30℃以250rpm振荡生长培养物。在使用实施例1所述的顶空测定法诱导3小时后分析异戊二烯生产。异戊二烯的最大产量为6.67x104nmol/L培养液/OD600/hr，其中L培养液是培养液的体积并且包括细胞培养基的体积和细胞的体积。没有补充甲羟戊酸的对照培养物没有产生可测量的异戊二烯。
IV.上游MVA途径的克隆
从粪肠球菌克隆包括两个编码三种酶促活性的基因的上游甲羟戊酸生物合成途径。mvaE基因编码一种蛋白质，该蛋白质具有在该途径中的第一和第三蛋白质乙酰-CoA乙酰转移酶和3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA(HMG-CoA)还原酶的酶促活性，并且mvaS基因编码该途径中第二种酶HMG-CoA合酶。使用下面的引物，从粪肠球菌基因组DNA(ATCC700802D-5)扩增mvaE基因，该基因前面为大肠杆菌核糖体结合位点和间隔区。
CF07-60(+)mvaEw/RBS+ATG起始密码子SacI起点
5’-GAGACATGAGCTCAGGAGGTAAAAAAACATGAAAACAGTAGTTATTATTG(SEQIDNO：34)
CF07-62(-)mvaE与mvaS融合，其间有RBS
5’-TTTATCAATCCCAATTGTCATGTTTTTTTACCTCCTTTATTGTTTTCTTAAATC(SEQIDNO：35)
使用下面的引物，从粪肠球菌基因组DNA(ATCC700802D-5)扩增mvaS基因，该基因前面为大肠杆菌RBS和间隔区：
CF07-61(+)mvaE与mvaS融合，其间有RBS
5’-GATTTAAGAAAACAATAAAGGAGGTAAAAAAACATGACAATTGGGATTGATAAA(SEQIDNO：36)C
F07-102(-)mvaS基因BglII末端
5’-GACATGACATAGATCTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT(SEQIDNO：37)。
使用下面的引物，用PCR将PCR片段融合在一起：
CF07-60(+)mvaEw/RBS+ATG起始密码子SacI的起点
5’-GAGACATGAGCTCAGGAGGTAAAAAAACATGAAAACAGTAGTTATTATTG(SEQIDNO：34)
CF07-102(-)mvaS基因BggII末端
5’-GACATGACATAGATCTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT(SEQIDNO：37)
融合PCR片段用Qiagen试剂盒纯化并用限制性内切酶SacI和BglII消化。使用Qiagen试剂盒对该消化的DNA片段进行凝胶纯化并将它连接到可商购的载体pTrcHis2A，该载体已经用SacI和BglII消化以及凝胶纯化。
将连接混合物转化大肠杆菌TOP10细胞并且在LA和50μg/ml羧苄青霉素板上筛选菌落。选择总共6个菌落并在LB和50μg/ml羧苄青霉素中过夜生长并使用Qiagen试剂盒分离质粒。用SacI和BglII消化质粒以检验插入片段并且用下面的引物对一个正确的质粒进行测序：
CF07-58(+)mvaE基因的起点
5’-ATGAAAACAGTAGTTATTATTGATGC(SEQIDNO：38)
CF07-59(-)mvaE基因的末端
5’-ATGTTATTGTTTTCTTAAATCATTTAAAATAGC(SEQIDNO：39)
CF07-82(+)mvaS基因起点
5’-ATGACAATTGGGATTGATAAAATTAG(SEQIDNO：40)
CF07-83(-)mvaS基因末端
5’-TTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT(SEQIDNO：41)
CF07-86(+)mvaE中的序列
5’-GAAATAGCCCCATTAGAAGTATC(SEQIDNO：42)
CF07-87(+)mvaE中的序列
5’-TTGCCAATCATATGATTGAAAATC(SEQIDNO：43)
CF07-88(+)mvaE中的序列
5’-GCTATGCTTCATTAGATCCTTATCG(SEQIDNO：44)
CF07-89(+)序列mvaS
5’-GAAACCTACATCCAATCTTTTGCCC(SEQIDNO：45)
通过测序确认命名为pTrcHis2AUpperPathway#1的质粒是正确的并将其转化到可商购的大肠杆菌菌株BL21中。在LA和50μg/ml羧苄青霉素上进行筛选。选择两个转化体并在LB和50μg/ml羧苄青霉素中生长至它们达到OD600为1.5。在甘油存在下，将两个菌株在-80℃下在瓶中冷冻。对于BL21中的pTrcHis2AUpperPathway#l，分离菌#1，将菌株命名为CF449，对于BL21中的pTrcHis2AUpperPathway#1，分离菌#2，命名为CF450。发现两个克隆在分析时表现相同。
V.UpperMVA途径在pCL1920中的克隆
用限制性内切核酸酶SspI消化质粒pTrcHis2AUpperPathway以释放含有pTrc-mvaE-mvaS-(His-标签)-终止子的片段。在这一片段中，his-标签并未被翻译。使用QiagenGelPurification试剂盒从1.2％E-凝胶纯化这一平末端4.5kbp片段。通过用限制性内切核酸酶PvuII消化载体，用SAP处理并使用QiagenGelPurification试剂盒从1.2％E-凝胶纯化而从pCL1920制备去磷酸化的平末端4.2kbp片段。使用RocheQuickLigationKit连接两个片段并将它转化到TOP10化学感受态细胞。在含有壮观霉素(50μg/ml)的LA上筛选转化体。通过利用PCR筛选插入片段的存在来鉴定正确菌落。将质粒命名为pCLPtrcUpperPathway(图26和27)。
VI.表达组合的上和下游甲羟戊酸途径的菌株
为了获得具有完整的甲羟戊酸途径加野葛异戊二烯合酶的菌株，将质粒pTrcKXDylkISkan和pCLpTrcUpperPathway都转化到BL21(λDE3)感受态细胞(Invitrogen)中并且在含有卡那霉素(50μg/ml)和壮观霉素(50μg/ml)的LA上筛选转化体。通过质粒制备来检查转化体以确保两种质粒都保留在宿主中。菌株命名为MCM127。
VII.在大肠杆菌/pUpperpathway中从葡萄糖生产甲羟戊酸
将BL21/pTrcHis2A-mvaE/mvaS或FM5/ppTrcHis2A-mvaE/mvaS的单菌落接种到LB和羧苄青霉素(100μg/ml)中并在37℃以200rpm振荡过夜生长。在250ml带挡板培养瓶中将这些培养物稀释到50ml培养基中至OD600为0.1。培养基为TM3，1或2％葡萄糖，羧苄青霉素(100ug/ml)或者TM3，1％葡萄糖，水解豆油，和羧苄青霉素(100ug/ml)或者TM3和生物量(制备的甘蔗渣、玉米秸秆或柳枝稷)。培养物在30℃以200rpm振荡生长约2-3小时至达到OD600为0.4。在该点，通过添加IPTG(400μM)来诱导从mvaEmvaS构建体的表达。进一步培育培养物20或40小时，以2小时间隔取样至诱导后6小时，然后按需要在24、36和48小时取样。通过取出1ml培养物完成取样，测量OD600，在微量离心机中沉淀细胞，除去上清液并分析它的甲羟戊酸。
用TM3培养基和2％葡萄糖作为细胞培养基，具有编码粪肠球菌AA-CoA硫解酶、HMG-CoA合酶和HMG-CoA还原酶多肽的核酸的大肠杆菌细胞的14升发酵产生22克甲羟戊酸。用LB培养基和1％葡萄糖作为细胞培养基，这些细胞的摇瓶产生2-4克甲羟戊酸/升。这些菌株中的甲羟戊酸生产表明MVA途径在大肠杆菌中是有功能的。
VIII.从含有上和下游MVA途径加野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌BL21生产异戊二烯
通过将含有上和下游MVA途径以及上述野葛异戊二烯合酶基因的质粒与含有实施例7所述的idi、dxs、和dxr以及异戊二烯合酶基因的质粒的多种组合来转化而产生下面的菌株。所用宿主细胞为化学感受态BL21(λDE3)并且通过标准方法进行转化。在含有卡那霉素(50μg/ml)或卡那霉素加壮观霉素(浓度均为50μg/ml)的L琼脂上筛选转化体。在37℃培养平板。得到的菌株按下面命名：
在卡那霉素加壮观霉素(各50μg/ml)上生长
MCM127-BL21(λDE3)中的pCLUpperMVA和pTrcKKDyIkIS(kan)
MCM131-BL21(λDE3)中的pCL1920和pTrcKKDyIkIS(kan)
MCM125-BL21(λDE3)中的pCLUpperMVA和pTrcHis2B(kan)
在卡那霉素(50μg/ml)上生长
MCM64-BL21(λDE3)中的pTrcKudzuyIDIDXS(kan)
MCM50-BL21(λDE3)中的pTrcKudzu(kan)
MCM123-BL21(λDE3)中的pTrcKudzuyIDIDXSDXR(kan)
上述菌株从冷冻母液在LA和适当抗生素上划线并在37℃过夜生长得到。每个板的单菌落用来接种摇瓶(25mlLB和适当抗生素)。将培养瓶在22℃以200rpm振荡过夜孵育。第二天早晨，将培养瓶转入37℃培养箱并以200rpm再振荡生长4.5小时。将25ml培养物离心以沉淀细胞并在5mlLB和适当抗生素中重悬细胞。将培养物稀释到25mlLB，％葡萄糖和适当抗生素中至OD600为0.1。每个菌株建立两个培养瓶，一套用IPTG(800μM)诱导，另一套不诱导。在37℃以250rpm振荡孵育培养物。一套培养物在1.50小时后诱导(紧接着取样时间点1)。在每个取样时间点，测量OD600并按实施例1所述测定异戊二烯的量。结果如表3所示。所生成的异戊二烯的量以特定菌株的峰值生产量来表示。
表3.在大肠杆菌菌株中的异戊二烯生产
ND：未检测到
痕量：存在峰值但不可积分。
IX.甲羟戊酸的分析
甲羟戊酸内酯(1.0g，7.7mmol)(CAS#503-48-0)由Sigma-Aldrich(WI，USA)提供，其溶解在水(7.7mL)中作为浆液并用氢氧化钾(7.7mmol)处理以产生甲羟戊酸的钾盐。向甲羟戊酸的转化通过1HNMR分析来确认。通过在14,000rpm下离心5分钟除去细胞，随后向900μl的H2O中添加300μl等份上清液来制备用于HPLC分析的样品。然后添加高氯酸(36μl的70％溶液)，接着混合并在冰上冷却5分钟。然后再次离心样品(14,000rpm，5分钟)并将上清液转入HPLC。以相同方式制备甲羟戊酸标准品(20，10，5，1和0.5g/L)。使用BioRadAminex87-H+柱(300mm×7.0mm)通过HPLC进行甲羟戊酸(20uL注射体积)的分析，该柱用5mM硫酸以0.6mL/min洗脱，以折射率(RI)检测。在这些条件下，在18.5分钟时，甲羟戊酸以内酯形式洗脱。
实施例9、用于整合到枯草杆菌中的上和下游MVA途径的构建
I.在枯草杆菌中上游MVA途径的构建
来自粪肠球菌的上游途径整合到枯草杆菌中处于aprE启动子控制下。上游途径由两种基因组成：编码AACT和HMGR的mvaE，以及编码HMGS的mvaS。这两种基因融合在一起，其间有终止密码子，RBS在mvaS前，并且在aprE启动子控制下。终止子位于mvaE基因后。在mvaE基因后克隆氯霉素抗性标记并且使用同源性侧翼区进行双交换而在aprE基因座处整合该构建体。
通过PCR扩增四个DNA片段以便它们含有使得它们通过PCR反应融合在一起的突出端序列。使用Herculase聚合酶按照生产商说明书进行PCR扩增。
1：PaprE
CF07-134(+)aprE启动子PstI的起点
5’-GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC(SEQIDNO：82)
CF07-94(-)PaprE与mvaE融合
5’-CAATAATAACTACTGTTTTCACTCTTTACCCTCTCCTTTTAA(SEQIDNO：83)
模板：枯草杆菌染色体DNA
2：mvaE
CF07-93(+)mvaE与aprE启动子融合(GTG起始密码子)
5’-TTAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGAAAACAGTAGTTATTATTG(SEQIDNO：84)
CF07-62(-)mvaE与mvaS融合，其间有RBS
5’-TTTATCAATCCCAATTGTCATGTTTTTTTACCTCCTTTATTGTTTTCTTAAATC(SEQIDNO：35)
模板：粪肠杆菌染色体DNA(来自ATCC)
3.mvaS
CF07-61(+)mvaE与mvaS融合，其间有RBS
5’-GATTTAAGAAAACAATAAAGGAGGTAAAAAAACATGACAATTGGGATTGATAAA(SEQIDNO：36)
CF07-124(-)mvaS末端与终止子融合
5’-CGGGGCCAAGGCCGGTTTTTTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT(SEQIDNO：85)
模板：粪肠杆菌染色体DNA
4.解淀粉芽孢杆菌碱性丝氨酸蛋白酶终止子
CF07-123(+)mvaS末端与终止子融合
5’-ACCGTTCGTTCTTATCGAAACTAAAAAAAACCGGCCTTGGCCCCG(SEQIDNO：86)
CF07-46(-)解淀粉芽孢杆菌终止子BamHI末端
5’-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC(SEQIDNO：63)
模板：解淀粉芽孢杆菌染色体DNA
PCR融合反应
5.mvaE与mvaS融合
CF07-93(+)mvaE与aprE启动子融合(GTG起始密码子)
5’-TTAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGAAAACAGTAGTTATTATTG(SEQIDNO：84)
CF07-124(-)mvaS末端与终止子融合
5’-CGGGGCCAAGGCCGGTTTTTTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT(SEQIDNO：85)
模板：上述#2和3
6.mvaE-mvaS与aprE启动子融合
CF07-134(+)aprE启动子PstI的起点
5’-GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC(SEQIDNO：82)
CF07-124(-)mvaS的末端与终止子融合
5’-CGGGGCCAAGGCCGGTTTTTTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT(SEQIDNO：85)
模板：上述#1和#4
7.PaprE-mvaE-mvaS与终止子融合
CF07-134(+)aprE启动子PstI的起点
5’-GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC(SEQIDNO：82)
CF07-46(-)解淀粉芽孢杆菌终止子BamHI的末端
5’-GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC(SEQIDNO：63)
模板：#4和#6
产物用限制性内切核酸酶PstI/BamHI消化并连接到用PstI/BamHI消化的pJM102(Perego，M.1993.IntegrationalvectorsforgeneticmanipulationinBacillussubtilis，p.615-624.A.L.Sonenshein，J.A.Hoch，以及R.Losick(编)，Bacillussubtilisandothergram-positivebacteria：biochemistry，physiology，andmoleculargenetics.AmericanSocietyforMicrobiology，Washington，D.C.)。连接物转化到大肠杆菌TOP10化学感受态细胞并且在含有羧苄青霉素(50μg/ml)的LA上筛选转化体。通过测序鉴定正确质粒并命名为pJMUpperpathway2(图50和51)。纯化后的质粒DNA转化到枯草杆菌aprEnprEPxyl-comK并且在含有氯霉素(50μg/ml)的L琼脂上筛选转化体。选择正确菌落并且在含有氯霉素10、15和25μg/ml的L琼脂顺序平板接种以扩增含有上游途径的表达盒的拷贝数。
通过在含有1％葡萄糖的LB中生长来检测得到的菌株的甲羟戊酸生产。通过GC分析培养物的甲羟戊酸生产。
顺序使用这一菌株作为宿主用于下游甲羟戊酸途径的整合。
使用下面的引物来测序上面的多个构建体。
测序引物：
CF07-134(-)aprE启动子PstI的起点
5’-GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC(SEQIDNO：82)
CF07-58(-)mvaE基因的起点
5’-ATGAAAACAGTAGTTATTATTGATGC(SEQIDNO：38)
CF07-59(-)mvaE基因的末端
5’-ATGTTATTGTTTTCTTAAATCATTTAAAATAGC(SEQIDNO：39)
CF07-82(-)mvaS基因的起点
5’-ATGACAATTGGGATTGATAAAATTAG(SEQIDNO：40)
CF07-83(-)mvaS基因的末端
5’-TTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT(SEQIDNO：41)
CF07-86(-)mvaE中的序列
5’-GAAATAGCCCCATTAGAAGTATC(SEQIDNO：42)
CF07-87(-)mvaE中的序列
5’-TTGCCAATCATATGATTGAAAATC(SEQIDNO：43)
CF07-88(-)mvaE中的序列
5’-GCTATGCTTCATTAGATCCTTATCG(SEQIDNO：44)
CF07-89(-)序列mvaS
5’-GAAACCTACATCCAATCTTTTGCCC(SEQIDNO：45)
在含有浓度为5μg/ml的氯霉素的LA上筛选转化体。通过测序确认一个菌落具有正确的整合，并将该菌落在若干天内平板接种在含有增加浓度至最终水平为25μg/ml的氯霉素的LA上。这导致含有目的基因的表达盒的扩增。得到的菌株命名为CF455：pJMupperpathway#lXBacillussubtilisaprEnprEPxylcomK(扩增以在含有氯霉素25μg/ml的LA上生长)。
II.下游MVA途径在枯草杆菌中的构建
由基因mvkl、pmk、mpd和idi组成的下游MVA途径组合在表达盒中，该表达盒由来自枯草杆菌染色体的nprE区域的侧翼DNA区域(整合位点)、aprE启动子、以及壮观霉素抗性标记组成(参见图28和29)。通过DNA2.0合成这一表达盒并将它整合到含有在aprE基因座处整合上游MVA途径的枯草杆菌的染色体中。从实施例4所述的复制质粒表达野葛异戊二烯合酶基因并将它转化到整合有上和下游途径的菌株中。
实施例10、在表达马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶和银白杨异戊二烯合酶的大肠杆菌中生产异戊二烯
I.编码马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶(MVK)和银白杨异戊二烯合酶的载体和菌株的构建
(i)菌株EWL201(BL21，Cm-GI1.2-KKDyI)的构建
大肠杆菌BL21(Novagen牌，EMDBiosciences，Inc.)是转导有MCM331P1裂解物(根据Ausubel等人，CurrentProtocolsinMolecularBiology.JohnWileyandSons，Inc.所述的方法制备的裂解物)的受体菌株。通过将细胞涂布于LAgar和20μg/μl氯霉素上筛选转导子。将板在30℃过夜孵育。对转导子的分析显示对照板(水+细胞对照板用于返回以及水和P1裂解物对照板用于裂解物污染)上没有菌落。
挑取4个转导子并用于接种5mLLBroth和20μg/μl氯霉素。在30℃以200rpm振荡过夜生长培养物。为了得到每个转导子的基因组DNA制备物用于PCR分析，将1.5mL过夜细胞培养物离心。用400μl重悬浮缓冲液(ResuspensionBuffer)(20mMTris，1mMEDTA，50mMNaCl，pH7.5)重悬细胞沉淀并加入4μlRNase，无DNase(Roche)。试管在37℃孵育30分钟，随后加入4μl10％SDS和4μl的10mg/mlProteinaseK母液(Sigma-Aldrich)。试管在37℃孵育1小时。将细胞裂解物转入2mlPhaseLockLightGel管(Eppendorf)并且加入各200μl饱和苯酚pH7.9(AmbionInc.)和氯仿。充分混合试管并微量离心5分钟。用400μl氯仿进行第二次萃取并将含水层转入新的离心管中。通过加入1ml的100％乙醇沉淀基因组DNA并离心5分钟。用1ml70％乙醇冲洗基因组DNA沉淀。除去乙醇并允许基因组DNA沉淀快速风干。将基因组DNA沉淀用200μlTE重悬浮。
使用PfuUltraIIDNA聚合酶(Stratagene)以及200ng/μl的基因组DNA作为模板，按照生产商的方法制备两套不同的PCR反应管。对于第1套，使用引物MCM130和GBCm-Rev(表4)以保证转导子成功地整合到attTn7基因座中。第1套的PCR参数为95℃持续2分钟(仅第一个循环)，95℃持续25秒，55℃持续25秒，72℃持续25秒(重复步骤2-4持续28个循环)，72℃持续1分钟。对于第2套，使用引物MVDFor和MVDRev(表4)以确保正确整合gi1.2-KKDyI操纵子。第2套的PCR参数为95℃持续2分钟(仅第一个循环)，95℃持续25秒，55℃持续25秒，72℃持续10秒(重复步骤2-4持续28个循环)，72℃持续1分钟。在1.2％E-gel(InvitrogenCorp.)上的PCR扩增子的分析表明所有4个转导子都是正确的(挑取一个并命名为菌株EWL201)。
ii)菌株EWL204(BL21，环出序列-GI1.2-KKDyI)的构建
使用质粒pCP20按照Datsenko和Wanner(2000)(Datsenko等人，ProcNati.Acad.SciUSA97：6640-6645，2000)所述从菌株环出氯霉素标记。使用PCR产物在大肠杆菌K-12中进行染色体基因的一步失活(Datsenko等人，PNAS，97：6640-6645，2000)。EWL201细胞在LBroth中生长至对数中期然后在冰预冷灭菌水中冲洗3次。将等份的50μl细胞悬浮液与1μl的pCP20混合并在2.5伏特和25uFd下使用GenePulserElectroporator(Bio-RadInc.)在2mm杯(InvitrogenCorp.)中对细胞悬浮混合物进行电穿孔。立即向细胞中加入1ml的LB，然后转入带金属盖的14ml聚丙烯管(Sarstedt)。允许在30℃生长细胞1小时来回收它。在LAgar和20μg/μl氯霉素和50μg/μl羧苄青霉素上筛选转化体并在30℃过夜孵育。第二天，于30℃下，在10ml的LBroth和50μg/μl羧苄青霉素中生长单个克隆直到早对数期。然后将生长培养物的温度转至42℃持续2小时。进行一系列稀释，然后将细胞涂布在LA板(无抗生素筛选)上并在30℃过夜孵育。第二天，挑取20个菌落并接种到LAgar(无抗生素)以及LA和20μg/μl氯霉素板上。然后在30℃过夜孵育平板。能够在LA板上生长，但不能在LA和20μg/μl氯霉素板上生长的细胞被认为环出了氯霉素标记(挑取一个并命名为菌株EWL204)。
iii)质粒pEWL230(pTrcP.alba)的构建
根据对大肠杆菌表达的密码子优化方法，由DNA2.0Inc.(MenloPark，CA)负责制备编码银白杨异戊二烯合酶(银白杨HGS)的合成基因。该合成基因被定制克隆到质粒pET24a(Novagen牌，EMDBiosciences，Inc.)中并冻干递送(图54、55A和55B)。
按照生产商的方案，使用pET24P.albaHGS作为模板，引物MCM182和MCM192，以及HerculaseIIFusionDNA聚合酶(Stratagene)，进行PCR反应来扩增银白杨异戊二烯合酶(银白杨HGS)。PCR条件如下：95℃持续2分钟(仅第一个循环)，95℃持续25秒，55℃持续20秒，72℃持续1分钟，重复25个循环，在72℃最终延伸3分钟。
使用QIAquickPCRPurificationKit(QiagenInc.)纯化银白杨异戊二烯合酶PCR产物
然后在20μl含有1μlBspHI内切核酸酶(NewEnglandBiolabs)以及2μl10xNEB缓冲液4的反应物中，消化银白杨异戊二烯合酶PCR产物。反应物在37℃孵育2小时。然后使用QIAquickPCRPurificationKit纯化经消化的PCR片段。在20μl含有1μlPstI内切核酸酶(Roche)的反应物中，用2μl10xBufferH进行第二次限制性消化。反应物在37℃孵育2小时。然后使用QIAquickPCRPurificationKit纯化经消化的PCR片段。在20μl含有1μlNcoI内切核酸酶(Roche)、1μlPstI内切核酸酶和2μl10xBufferH的反应物中消化质粒pTrcHis2B(InvitrogenCorp.)。反应物在37℃孵育2小时。使用1.2％E-gel(InvitrogenCorp.)凝胶纯化经消化的pTrcHis2B载体并使用QIAquickGelExtractionKit(Qiagen)提取(图56)。使用BspHI和NcoI位点的相容性粘性末端，制备含有5μl银白杨异戊二烯合酶插入片段，2μlpTrc载体，1μlT4DNA连接酶(NewEnglandBiolabs)，2μl10X连接酶缓冲液和10μlddH2O的20μl连接反应物。将连接混合物在室温孵育40分钟。通过使ddH2O流过培养皿中0.025μm硝酸纤维素滤膜(Millipore)并在室温下将连接混合物轻轻地放在硝酸纤维素滤膜上30分钟使连接混合物脱盐。MCM446细胞(参见第II部分)在LB中生长至对数中期然后在冰冷灭菌水中冲洗3次。将等份的50μl细胞悬浮液与5μl脱盐pTrc银白杨HGS连接混合物混合。使用GenePulserElectroporator以2.5伏特和25uFd在2mm杯中对细胞悬浮混合物进行电穿孔。立即向细胞中加入1ml的LB，然后转入带金属盖的14ml聚丙烯管(Sarstedt)。在30℃生长细胞2小时来回收它。在LAgar和50μg/μl羧苄青霉素和10mM甲羟戊酸上筛选转化体并在30℃孵育。第二天，挑取6个转化体并于30℃下，在5ml的LBroth和50μg/μl羧苄青霉素试管中过夜生长。使用QIAquickSpinMiniprepKit(Qiagen)对过夜培养物进行质粒制备。由于使用BL21细胞来繁殖质粒，对生产商标准方法进行用PBBuffer5X和PEBuffer3X冲洗离心柱的修改以实现高质量的质粒DNA。在20μl反应物中用PstI消化质粒以确保正确大小的线性片段。所有6个质粒都是正确的大小并且送至QuintaraBiosciences(Berkeley，CA)，用引物MCM65、MCM66、EL1000测序(表4)。DNA测序结果显示所有6个质粒都是正确的。挑取一个并命名质粒为EWL230(图57、58A和58B)。
iv)质粒pEWL244(pTrcP.alba-mMVK)的构建
按照生产商的方法，使用MCM376作为模板(见第v部分)，引物MCM165和MCM177(见表4)，以及PfuUltraIIFusionDNA聚合酶(Stratagene)，进行PCR反应来扩增马氏甲烷八叠球菌MVK基因。PCR条件如下：95℃持续2分钟(仅第一个循环)，95℃持续25秒，55℃持续25秒，72℃持续18秒，重复28个循环，在72℃最终延伸1分钟。使用QIAquickPCRPurificationKit(QiagenInc.，)纯化马氏甲烷八叠球菌MVKPCR产物。
然后在40μl含有8μl的PCR产物，2μlPmeI内切核酸酶(NewEnglandBiolabs)，4μl10xNEB缓冲液4，4μl10xNEBBSA和22μl的ddH2O的反应物中，消化马氏甲烷八叠球菌MVKPCR产物。反应物在37℃孵育3小时。然后使用QIAquickPCRPurificationKit纯化经消化的PCR片段。在47μl含有2μlNsiI内切核酸酶(Roche)，4.7μl10x缓冲液H和40μl的PmeI消化的马氏甲烷八叠球菌MVK片段的反应物中，进行第二次限制酶消化。反应物在37℃孵育3小时。然后使用1.2％E-gel凝胶纯化经消化的PCR片段并使用QIAquickGelExtractionKit提取。在40μl含有10μl质粒，2μlPmeI内切核酸酶，4μl10xNEB缓冲液4，4μl10xNEB缓冲液4，4μl10xNEBBSA和20μl的ddH2O的反应物中，消化质粒EWL230。反应物在37℃孵育3小时。然后使用QIAquickPCRPurificationKit纯化经消化的PCR片段。在47μl含有2μlPstI内切核酸酶，4.7μl10x缓冲液H和40μl的PmeI消化的EWL230线性片段的反应物中，进行第二次限制性消化。反应物在37℃孵育3小时。然后使用1.2％E-gel凝胶纯化经消化的PCR片段并使用QIAquickGelExtractionKit提取(图59)。使用NsiI和PstI位点的相容性粘性末端，制备含有8μl马氏甲烷八叠球菌MVK插入片段，3μlEWL230质粒，1μlT4DNA连接酶，2μl10X连接缓冲液和6μlddH2O的20μl连接反应物。将连接混合物在16℃过夜孵育。第二天，通过使ddH2O流过培养皿中0.025μm硝酸纤维素滤膜并在室温下将连接混合物轻轻地放在硝酸纤维素滤膜上面30分钟使连接混合物脱盐。MCM446细胞在LB中生长至对数中期然后在冰冷灭菌水中冲洗3次。将等份的50μl细胞悬浮液与5μl脱盐pTrcP.alba-mMVK连接混合物混合。使用GenePulserElectroporator以2.5伏特和25uFd在2mm杯中对细胞悬浮混合物进行电穿孔。立即向细胞中加入1ml的LB，然后将细胞转入带金属盖的14ml聚丙烯管。在30℃生长细胞2小时来回收它。在LA和50μg/μl羧苄青霉素和5mM甲羟戊酸板上筛选转化体并在30℃孵育。第二天，挑取6个转化体并于30℃下，在5ml的LB和50μg/μl羧苄青霉素试管中过夜生长。使用QIAquickSpinMiniprepKit对过夜培养物进行质粒制备。由于使用BL21细胞来繁殖质粒，向标准生产商方法中加入用PB缓冲液5X和PE缓冲液3X冲洗旋转柱的修改以实现高质量的质粒DNA。在20μl反应物中用PstI消化质粒以确保正确大小的线性片段。6个质粒中的3个是正确的大小并且送至QuintaraBiosciences，以用引物MCM65、MCM66、EL1000、EL1003和EL1006测序(表4)。DNA测序结果表明所有3个质粒都是正确的。取一个并命名为质粒为EWL244(图60和61A-B)。
v)在pET200D中来自马氏甲烷八叠球菌古细菌Lower的质粒MCM376-MVK的构建
使用InvitrogenPlatinumHiFiPCR混合物，用引物MCM161和MCM162(表4)对来自马氏甲烷八叠球菌古细菌LowerPathway操纵子的MVKORF(图73A-C)进行PCR扩增。将45uL的PCR混合物与1uL模板，1uL的10uM各引物，以及2uL水组合。反应循环如下：94℃持续2:00分钟；94℃持续0:30分钟，55℃持续0:30分钟，和68℃持续1:15分钟，30个循环；以及随后在72℃持续7:00分钟，并置于4℃至冷却。按照生产商的方法，将3uL的这一PCR反应物与InvitrogenpET200D质粒相连。将3uL这一连接物导入InvitrogenTOP10细胞，然后在LA/kan50上筛选转化体。分离来自转化体的质粒并对插入片段测序，得到MCM376(图74A-C)。
vi)菌株EWL251(BL21(DE3)，Cm-GI1.2-KKDyI，pTrcP.alba-mMVK)的构建
将MCM331细胞(含有编码酿酒酵母甲羟戊酸激酶、甲羟戊酸磷酸酶激酶、甲羟戊酸焦磷酸脱羧酶、和IPP异构酶的染色体构建体gi1.2KKDyI)在LB中生长至对数中期然后在冰冷灭菌水中冲洗3次。混合50μl的细胞悬浮物和1μl的质粒EWL244。使用GenePulserElectroporator以2.5伏特和25uFd在2mm杯中对细胞悬浮混合物进行电穿孔。立即向细胞中加入1ml的LB，然后转入带金属盖的14ml聚丙烯管。在30℃生长细胞2小时来回收它。在LA和50μg/μl羧苄青霉素和5mM甲羟戊酸板上筛选转化体并在37℃孵育。选择一个菌落并命名为菌株EWL251。
vii)菌株EWL256(BL21(DE3)，Cm-GI1.2-KKDyI，pTrc P.alba-mMVK，pCLUpperMVA)的构建
将EWL251细胞在LB中生长至对数中期然后在冰冷灭菌水中冲洗3次。混合50μl的细胞悬浮物和1μl的质粒MCM82(它是编码粪肠球菌mvaE和mvaS的pCLPtrcUpperPathway)。使用GenePulserElectroporator以2.5伏特和25uFd在2mm杯中对细胞悬浮混合物进行电穿孔。立即向细胞中加入1ml的LB，然后转入带金属盖的14ml聚丙烯管。在30℃生长细胞2小时来回收它。在LA和50μg/μl羧苄青霉素和50μg/μl壮观霉素板上筛选转化体并在37℃孵育。挑取一个菌落并命名为EWL256。
表4：引物序列
II.构建具有FRT-cmR-FRT-gi1.x-mKKDyI的MCM442-449：BL21和BL21(DE3)
I)重组模板的构建
基于FRT-的重组盒，以及用于Red/ET-介导的整合的质粒以及抗生素标记环出序列获自GeneBridgesGmbH(Germany)。按照GeneBridges方法进行使用这些材料的步骤。使用StratageneHerculaseIIFusion试剂盒，按照生产商方法，使用引物MCM193和MCM195从FRT-gb2-Cm-FRT模板扩增抗性盒。50μl反应物循环如下：95℃，2分钟；(95℃，20秒，55℃，20秒，72℃，1分钟)×5，(95℃，20秒，60℃，20秒，72℃，1分钟)×25；72℃，3分钟，4℃至冷却。通过QiagenPCR柱，按照制造商方法纯化扩增子并在30uLEB(ElutionBuffer)中洗脱。在具有1xRocheH缓冲液和0.5uLBSA的20uL反应物中将DNA用NdeI和PciI消化。在各含有1uL的NdeI，NcoI，和RocheH缓冲液的10uL反应物中，消化质粒MCM376。在37℃过夜进行反应，然后在QiagenPCR柱上纯化切下的DNA并在30uL的EB中洗脱。在含有1uL载体，3uLPCR产物，1uLRocheQuickLigase缓冲液2，5uL缓冲液1以及1uL连接酶的反应物中，将PCR产物连接到MCM376中。反应在室温进行3小时然后按照生产商的方法将5uL转化到InvitrogenTOP10细胞。于37℃在L琼脂(LA)和氯霉素(10ug/mLO)上筛选转化体过夜。
将转化体菌落铺到含氯霉素(30ug/mL)和卡那霉素(50ug/ml)的LA上用于储存并送至Quintara(Berkeley，CA)测序。发现四个克隆具有对于插入的启动子的正确序列，该四个克隆中每个在引物MCM195的“N”处具有四个不同的核苷酸。克隆在5mL含有氯霉素(30ug/mL)和卡那霉素(50ug/ml)的LB中生长并用于制备质粒DNA。这一质粒再转化到TOP10细胞并且冷冻菌株：
表5：MCM484-487
MCM484 cmR-gi1.6-MVK(mazei)in pET(克隆A1-3，可变nt A)
MCM485 cmR-gi1.0-MVK(mazei)in pET(克隆B4-6，可变nt C)
MCM486 cmR-gi1.2-MVK(mazei)in pET(克隆C1-5，可变nt G)
MCM487 cmR-gi1.5-MVK(mazei)in pET(克隆C3-3，可变nt T)
ii)重组靶菌株MCM349和MCM441的产生
使用质粒pGB706按照制造商的说明书从菌株MCM331环出氯霉素抗性(cmR)标记。MCM331细胞在LB中生长至对数中期然后在冰冷灭菌水中冲洗3次。将等份的1μlpGB706DNA加入50μl的细胞悬浮物中并在2.5伏特和25uFd下在2mm杯(InvitrogenCorp.)中对这一混合物进行电穿孔，随后立即在30℃下在500μl的LB中回收1小时。于30℃下，在含有四环素(5ug/ml)的LB中筛选转化体。第二天，将一个克隆在30℃下在含有四环素(5ug/ml)的LB中生长直到可见的浑浊(OD600～0.5-0.8)。将这一培养物划线到LB上并在37℃过夜生长。将不能在含有氯霉素(10ug/mL)的LB或含有四环素(5ug/mL)的LB上生长的克隆冷冻为MCM348。按上述对质粒MCM356(pRedET羧苄青霉素；GeneBridges)进行电穿孔并且在30℃下在含有羧苄青霉素(50ug/mL)的LB上筛选转化体。在30℃下在LB羧苄青霉素(50ug/mL)上生长克隆并冷冻为MCM349。
通过按上述将质粒MCM356电转化到EWL204中产生菌株MCM441。
iii)FRT-cmR-FRT-gi1.x-mMVK向MCM349和MCM441中的重组
按照生产商方法，使用质粒MCM484-487作为模板，以引物MCM120和MCM196和HerculaseIIFusion试剂盒进行PCR扩增。每个模板以0、1、或3uLDMSO进行三个反应。50μl反应循环如下：95℃，2分钟；(95℃，20秒，55℃，20秒，72℃，1.5分钟)进行5个循环；(95℃，20秒，60℃，20秒，72℃，1.5分钟)进行25个循环；72℃，3分钟，4℃过夜。合并来自给定模板的三个反应物并在QiagenPCR柱上纯化以及在60℃下用30uL的EB洗脱。在37℃用1uL在1xRocheBufferA中的DpnI消化5uLDNA3小时。然后对过量水微透析这一DNA30分钟。
来自新划线的菌株在5mL含有羧苄青霉素(50ug/mL)的LB中于30℃生长至OD600为～0.5。加入40mM的L-阿拉伯糖并在37℃孵育培养物1.5小时。收集细胞并用3uL上述透析的扩增子进行电穿孔，然后在37℃下在500uLSOC中回收1.5-3小时。在37℃下，在含有氯霉素(5ug/mL)的LB板上筛选转化体。
通过PCR筛选卡那霉素抗性克隆的扩增子插入。对来自阳性克隆的PCR产物测序以验证插入的DNA的序列。扩增子与在MCM441attTn7处FRT-gi1.2-yKKDyI一致并且348个被FRT-cmR-FRT-gi1.x-mKKDyI代替(yK和mK指分别来自酿酒酵母和马氏甲烷八叠球菌的甲羟戊酸激酶)。
表6A：下列菌株在含氯霉素(5ug/mL)的LB中生长并冷冻
表6B：引物
III.酵母提取物对表达来自甲羟戊酸途径的基因并且以15-L规模在补料-分批培养中生长的大肠杆菌中异戊二烯生产的影响
培养基配方(每升发酵培养基)：
K2HPO47.5g，MgSO4＊7H2O2g，一水合柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物0.5g，1000X改良的微量金属溶液1ml。所有组分一起添加并溶解在diH2O中。对这一溶液高压灭菌。用氢氧化铵(30％)调节pH至7.0并定容至体积。灭菌以及调整pH后，添加葡萄糖10g，硫胺素＊HCl0.1g以及抗生素。
1000X改良的微量金属溶液：
柠檬酸＊H2O40g，MnSO4＊H2O30g，NaCl10g，FeSO4＊7H2O1g，CoCl2＊6H2O1g，ZnSO4＊7H2O1g，CuSO4＊5H2O100mg，H3BO3100mg，NaMoO4＊2H2O100mg。以每次在DiH2O中溶解一种来溶解每一组分，用HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容至体积并用0.22微米过滤器过滤灭菌。
在15-L生物反应器中，用含有上游甲羟戊酸(MVA)途径(pCLUpper)，整合的下游MVA途径(gi1.2KXDyI)和高表达的来自马氏甲烷八叠球菌的甲羟戊酸激酶以及来自银白杨(pTrcAlba-mMVK)的异戊二烯合酶的BL21(DE3)大肠杆菌细胞进行发酵。进行这一实验来监控在期望的发酵pH7.0以及温度30℃下从葡萄糖形成的异戊二烯。解冻冷冻瓶的大肠杆菌菌株并接种到大豆胨-酵母提取物培养基中。当接种物生长至在550nm处测量的OD为1.0后，使用500ml接种15-L生物反应器，使初始体积达到5-L。
i)在没有酵母提取物加料的补料-分批培养中生长的大肠杆菌细胞(EL256)的异戊二烯生产
以指数速率供料葡萄糖直到细胞达到稳定期。这一时间后，葡萄糖加料减少以满足代谢要求。在67小时发酵期间，送至生物反应器的葡萄糖总量为3.9kg。通过添加异丙基-β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG)完成诱导。当在550nm的光密度(OD550)达到数值9时，IPTG浓度达到102uM。当OD550达到140时，IPTG浓度升至192uM。图67A显示了生物反应器中随着时间的OD550谱。使用Hiden质谱仪测定生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯的滴定度随着发酵进程增加至终值为35.6g/L(图67B)。在67小时发酵期间所产生的异戊二烯的总量为320.6g而生产的时间进程如图67C所示。如TCER所测量的代谢活性谱如图67D所示。在发酵期间进入到生产异戊二烯所利用碳的摩尔产率为17.9％。来自葡萄糖的异戊二烯的质量百分产率为8.1％。
在具有酵母提取物加料的补料-分批培养中生长的大肠杆菌细胞(EL256)中的异戊二烯生产
以指数速率供料葡萄糖直到细胞达到稳定期。这一时间后，葡萄糖加料减少以满足代谢要求。在68小时发酵期间，送至生物反应器的葡萄糖总量为7.1kg。发酵期间也加料总计1.06kg的酵母提取物。通过添加IPTG完成诱导。当在550nm的光密度(OD550)达到数值7时，IPTG浓度达到208uM。当OD550达到180时，IPTG浓度升至193uM。图68A显示了生物反应器中随着时间的OD550谱。使用Hiden质谱仪测定生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯的滴定度随着发酵进程增加至最大值为32.2g/L(图68B)。在68小时发酵期间所产生的异戊二烯的总量为395.5g而生产的时间进程如图68C所示。图68D示出体积生产率的时间进程并且示出在23和63小时之间，维持平均速率为1.1g/L/hr。如CER所测量的代谢活性谱如图68E所示。在发酵期间进入到生产异戊二烯所利用碳的摩尔产率为10.3％。来自葡萄糖的异戊二烯的质量百分产率为5.2％。
IV.在含有甲羟戊酸(MVA)途径和异戊二烯合酶(EWL256)的大肠杆菌中从不同碳源生产异戊二烯
培养基配方(每升发酵培养基)：
K2HPO413.6g，KH2PO413.6g，MgSO4＊7H2O2g，一水合柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，(NH4)2SO43.2g，酵母提取物0.2g，1000X改良的微量金属溶液1ml。所有组分顺序溶解在diH2O中。用氢氧化铵(30％)调节pH至6.8并定容至体积。用0.22微米过滤器过滤灭菌培养基。添加碳源至终浓度为1％。在灭菌以及调整pH后，添加所需的抗生素。
1000X改良的微量金属溶液：
柠檬酸＊H2O40g，MnSO4＊H2O30g，NaCl10g，FeSO4＊7H2O1g，CoCl2＊6H2O1g，ZnSO4＊7H2O1g，CuSO4＊5H2O100mg，H3BO3100mg，NaMoO4＊2H2O100mg。以每次在diH2O中溶解一种来溶解每一组分，用HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容至体积并用0.22微米过滤器过滤灭菌。
i)AFEX生物量水解物的制备
水解AFEX预处理玉米秸秆来制备含有木糖、葡萄糖和乙酸的生物量水解物。
使用获自MichiganBiotechnologyInstitute的AFEX预处理玉米秸秆。预处理条件为60％湿度，1∶1氨负载，以及90℃持续30分钟，然后风干。AFEX预处理玉米秸秆的水分含量为21.27％。在AFEX预处理玉米秸秆中的葡聚糖和木聚糖含量分别是31.7％和19.1％(基于干物质)。所用酶为Accellerase1000，GrindamylH121(来自用于面包制造工业的黑曲霉的Danisco木聚糖酶产物)。
对于糖化，将20g的AFEX预处理玉米秸秆与5ml的1M柠檬酸钠缓冲液，pH4.8，2.25ml的Accellerase1000，0.1ml的GrindamylH121，以及72.65ml的DI水加入500ml培养瓶。将培养瓶放入定轨摇床并在50℃孵育96小时。
为了分析，从摇床取一个样品并使用HPLC分析。水解物含有37.2g/l的葡萄糖，24.3g/L的木糖，和7.6g/L葡萄糖和/或木糖的寡聚物。此外，水解物也含有1.17g/L乙酸盐。
ii)实验方法
含有MVA途径和异戊二烯合酶的大肠杆菌菌株EWL256的接种物取自冷冻瓶并划线到含有壮观霉素(50ug/mL)和羧苄青霉素(50ug/mL)的LB液体培养基琼脂板上并在30℃过夜培养。将单菌落接种到含有葡萄糖、木糖、丙三醇、乙酸盐或生物量作为唯一碳源的TM3培养基中并在30℃过夜生长。在乙酸盐上生长的细胞达到了明显更低的光密度。将在葡萄糖、丙三醇、生物量水解物或乙酸盐上生长的细胞稀释成20mL含有各自碳源的TM3培养基以达到在600nM处测量的光密度为0.1之间。从葡萄糖过夜培养物来制备不含有任何碳源的阴性对照。用葡萄糖和木糖进行单独的实验，其中培养物都稀释到光密度为0.05。所有培养条件(除了乙酸盐和丙三醇)都一式两份检测并且呈现的结果是这些培养物之间的平均值。从实验开始，由200μMIPTG诱导异戊二烯的生产。培养瓶在定轨摇床(200rpm)中在30℃孵育并生长，随后测量光密度。当葡萄糖供料培养物达到光密度接近0.4后，对所有检测的碳源每小时分析样品的异戊二烯生产，持续3小时。将100μL样品一式两份转入2mL玻璃瓶中，密封并在30℃孵育30min。然后通过在80℃孵育8分钟来热处死细菌。使用GC-MS测量产生的异戊二烯的量并计算比生产率(μg/L＊hr)。
iii)结果
在所有检测碳源上生长期间，可以阐明显著的异戊二烯生产。这些碳源是含有5或6个碳单元(C5或C6)的常用醇、有机酸、糖，以及生物量水解物的实例。
在生物量水解物上的初始生长速率与在葡萄糖上的生长速率是相当的(图69A)。生物量水解物上生长期间的初始比生产率明显比在葡萄糖上生长期间的要高。这证明生物量水解物可以用作有效的碳源来生产异戊二烯。在生长255分钟后，在生物量水解物上的比生产率下降(图69B)。相比于葡萄糖，以木糖作为唯一碳源的细菌具有较低的生长速率(图69C)，但是测量到明显的比异戊二烯生产力(图69D)。这表明可以利用C5和C6糖来通过甲羟戊酸途径生产异戊二烯。
出人意料地，在乙酸盐作为唯一碳源上生长的细菌的异戊二烯比生产率为在葡萄糖上生长期间的约两倍高(图69A)。当相比于葡萄糖，在乙酸盐上的细菌生长较慢(图69B)，但是所进行的实验表明乙酸盐也可以用作碳源来生产异戊二烯。如由HPLC所测量，乙酸盐也存在于生物量水解物中。
以丙三醇作为唯一碳源的细菌生长良好(图69A)并且示出了显著的异戊二烯生产(图69B)。这表明常用醇也可用作碳源来通过甲羟戊酸途径生产异戊二烯。
实施例11、来自植物的异戊二烯合酶在链霉菌属中的表达
异戊二烯合酶Kudzu的基因获自质粒pJ201：19813。质粒pJ201：19813编码来自葛(Pueraialobata)(葛植物)的异戊二烯合酶并且是对于荧光假单胞菌(Pseudomonasfluorescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonasputida)、金红红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)和棒杆菌(Corynebacterium)进行密码子优化的(图9A-79C(SEQIDNO：123))。用限制性内切核酸酶NdeI和BamHI对质粒pJ201：19813的消化释放了基因iso19813，它连接到链霉菌-大肠杆菌穿梭载体pUWL201PW(Doumith等，Mol.Gen.Genet.264：477-485，2000；图71)以产生pUWL201_iso。通过对pUWL201_iso的限制性分析来验证成功的克隆。异戊二烯合酶iso19813的表达在erm-启动子控制下，该启动子允许在链霉菌种中的组成型表达而不在大肠杆菌中表达。
通过如Hopwood等人，TheJohninnesfoundation，Norwich，1985所述的原生质体转化将PUWL201PW(无插入片段)和pUWL201_iso导入白色链霉菌(Streptomycesalbus)J1074(Sanchez等人，Chem.Biol.9：519-531，2002)。
用1.9μgpUWL201PW或2.9μgpUWL201_iso转化200μl等份原生质体悬液。在非选择性R5-琼脂板上于28℃过夜孵育后，通过进一步在含有硫链丝菌肽(250μg/ml)的覆盖R3的琼脂中孵育4天来筛选阳性转化体。使用PlasmidMiniKit(Qiagen)通过质粒制备来检验硫链丝菌肽抗性转化体中pUWL-质粒的存在。将制备的质粒再导入大肠杆菌DH5α以产生足量待通过限制性分析来分析的质粒DNA。在含有氨苄青霉素的L-琼脂板上筛选阳性转化体并通过由NdeI和BamHI内切核酸酶消化质粒DNA来进行插入片段的分析。在阳性pUWL201iso克隆中鉴定的异戊二烯合酶为1.7kb片段，而在对照菌株(pUWL201PW)中，没有观察到此片段。
分析白色链霉菌野生型菌株和含有对照质粒pUWL201PW或异戊二烯合酶编码pUWL201_iso的转化体的异戊二烯形成。在硫链丝菌肽(200μg/ml)存在或不存在下，在固体培养基(胰蛋白胨大豆肉汤琼脂，TSB；2.5ml)上一式两份培养菌株并在28℃下在密封顶空瓶(总体积20ml)中孵育4天。通过GC-MS以SIM-模式分析500μl顶空样品(终点测量)并根据参考保留时间和分子量(67m/z)来鉴定异戊二烯。通过之前产生的校准曲线来量化存在于顶空样品中的异戊二烯。虽然野生型白色链霉菌和带有pUWL201PW的对照菌株产生的异戊二烯的浓度略高于检测极限(0.04-0.07ppm)，但是带有pUWL201_iso的白色链霉菌产生的异戊二烯相比于对照(0.75ppm；图72)超出至少10倍。结果表明植物来源的异戊二烯合酶在放线菌组中的原核生物中成功表达。
实施例12、在含有上游或上和下游甲羟戊酸途径加野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌fadRatoCLS5218中从脂肪酸或棕榈油生产异戊二烯或甲羟戊酸
大肠杆菌fadRatoC菌株LS5218(#6966)获自ColiGeneticStockCenter。FadR编码转录抑制物，该转录抑制物负调控编码脂肪酸降解酶的基因的表达(Campbell等人，J.Bacteriol.183：5982-5990，2001)。AtoC是双组分调控系统中的应答调控子，而AtoS调控乙酰乳酸代谢。fadRatoC菌株允许脂肪酸降解基因的组成型表达并且将长链脂肪酸掺入长链长度的多羟基链烷酸。当将棕榈油用作碳源来生产甲羟戊酸或异戊二烯时，棕榈油转化成丙三醇加脂肪酸。用于此的方法是本领域公知的，并且它可以通过由脂肪酶(例如猪胰脂肪酶、皱褶假丝酵母脂肪酶或其他类似脂肪酶)孵育来酶促完成或这通过用诸如氢氧化钠的碱来皂化而化学完成。
i)表达上游甲羟戊酸途径的大肠杆菌fadRatoC菌株
使用标准方法(Sambrooke等人，MolecularCloning：ALaboratoryManual，2ed.，ColdSpringHarbor，1989)将pCLPtrcUpperPathway电穿孔到LS5218来产生菌株WW4。通过在补充有C12脂肪酸(FA)或棕榈油作为碳源的TM3培养基中培养细胞时甲羟戊酸(MVA)的生产来证明质粒的掺入。为了证明由WWC从脂肪酸生产MVA，将来自过夜培养物的细胞在5mL补充有0.25％C12FA(Sigma目录号#L9755)的改良TM3培养基(没有酵母提取物的TM3)中稀释1至100倍。在30℃过夜孵育IPTG诱导的培养物后，MVA生产的第一个标志(24mg/L)是明显的。生产在3天的时间内增加，产生的MVA的最终水平为194mg/L。为了证明WW4从油生产MVA，将来自过夜培养物的细胞在改良TM3培养基中稀释1至100倍，该TM3培养基每5mL补充有200mg经消化的棕榈油。在30℃过夜孵育IPTG诱导的培养物后，MVA生产的第一个标志(50mg/L)是明显的。生产在3天的时间内增加，生产的MVA的最终水平为500mg/L。
ii)表达上和下甲羟戊酸途径加野葛异戊二烯合酶的大肠杆菌fadRatoC菌株
用pMCM118[pTrcKKDyIkIS]转化大肠杆菌菌株WW4(LS5218fadRatoCpCLPtrcUpperPathway)以得到WW10。当菌株在TM3和葡萄糖中培养并用IPTG(100，300或900uM)诱导时产生异戊二烯的证据证明了质粒的掺入。菌株对于IPTG是相对敏感的并且即使在100uMIPTG时都显示了明显的生长缺陷。这些结果如图70A所示。
为了检测从十二烷酸的异戊二烯生产，于37℃在含有壮观霉素(50ug/ml)和卡那霉素(50ug/ml)的L液体培养基中以200rpm振荡过夜培养WW10。通过离心用改良的TM3培养基冲洗细胞并用这一培养基以它们的原始培养体积重悬细胞。将来自这一初始培养物的经冲洗和重悬的细胞以1∶100和1∶10稀释到5mL含有0.125％C12FA(Sigma目录号#L9755)的改良TM3培养基中。
为了阐明来自棕榈油的甲羟戊酸的生产，将油在37℃和250rpm用脂肪酶预消化若干天以释放脂肪酸(水解证据由振荡试管时形成的泡沫来判断)。
此外，通过将冲洗过的细胞在具有棕榈油的检测管中所含的改良TM3培养基中稀释10倍来建立培养物。通过向冲洗过的细胞的剩余物(2.5mL)加入0.125％C12FA而不进一步稀释(生物转化)而建立又一个管。在30℃以250rpm振荡生长3.75小时后，通过添加50uMIPTG来诱导所有培养物。继续孵育4小时，此后，用改良的顶空检测法(在30℃以500rpm振荡下的1小时累积)检测200uL每种培养基的异戊二烯累积。在GCMS分析前，通过12小时孵育测定玻璃组(assayglassblock)来进行其它异戊二烯检测法。继续对该诱导的培养物的过夜孵育并且于第二天早晨，再次对200uL等份试样进行异戊二烯生产的测定(1小时，30摄氏度，500rpmShel-Lab摇床)。这些培养物的分析显示出显著水平的异戊二烯生产。在过夜起始培养物经孵育并过夜诱导后，将它以1/10稀释接种，在培养物中观察到最高水平的异戊二烯。这一结果表明这一培养物继续生长并且细胞密度增加。这些结果示出于图70B。由于脂肪酸悬液具有浑浊的外观，因而不能直接测量细胞密度。因此通过将等份培养物铺板来测定这一培养物的细胞密度，并且显示为8x107个菌落形成单位。这几乎对应于OD600为0.1。然而，这一培养物提供了显著的异戊二烯生产；在没有这一实例中所述途径的类似菌株中没有观察到异戊二烯。
实施例13、通过ybhE在大肠杆菌中的组成型表达改善异戊二烯生产
这一实例示出相比于具有野生型ybhE的对照菌株，在组成型表达ybhE(pgl)的菌株中的异戊二烯生产。基因ybhE(pgl)编码6-磷酸葡糖酸内酯酶，该酶抑制异源表达的蛋白的翻译后葡糖酸化并提高产物可溶性和产量，同时也提高通过磷酸戊糖途径的生物量产量和流量(Aon等人，AppliedandEnvironmentalMicrobiology，74(4)：950-958，2008)。
用ybhE基因在复制质粒pBBR1MCS5(Gentamycin)(获自Dr.K.Peterson，LouisianaStateUniversity)上的组成型表达来构建产生异戊二烯的大肠杆菌BL21菌株(EWL256)。
基于FRT-的重组表达盒，以及用于Red/ET-介导的整合的质粒以及抗生素标记环出序列获自GeneBridgesGmbH(Germany)。按照GeneBridges方法进行使用这些材料的步骤。使用StratageneHerculaseIIFusion试剂盒，按照生产商方法，使用引物Pgl-F和Pg1GI1.5-R从FRT-gb2-Cm-FRT模板扩增抗性盒。PCR反应物(50uL终体积)包括：5uL缓冲液，1uL模板DNA(来自GeneBridges的FRT-gb2-Cm-F)，10pmol每种引物和1.5uL25mMdNTP混合物，以dH2O制成50uL。反应循环如下：1x2分钟，95℃，然后30个循环(95℃，30秒，63℃，30秒，72℃，3分钟)。
使用QiaQickPCR纯化试剂盒(Qiagen)对得到的PCR产物进行纯化并将其如下电穿孔到携带含pRed-ET重组酶的质粒的电感受态MG1655细胞。通过在30℃生长于5mL的L液体培养基中至OD600～0.6而制备细胞。通过向细胞加入4％阿拉伯糖并允许在30℃生长30分钟随后在37℃生长30分钟来诱导重组酶表达。在冰预冷dH2O中将等份的1.5mL细胞冲洗3-4次。将最终的细胞沉淀在40uL的冰预冷dH2O中重悬浮并加入2-5uL的PCR产物。在GenePulserElectroporator(Bio-RadInc.)中以1.3kV在1-mm通道杯中进行电穿孔。在30℃回收细胞1-2小时并在含有氯霉素(5ug/mL)的L琼脂上铺板。通过PCR分析5个转化体并使用整合位点侧翼的引物来测序(2个引物对：pgl和49rev以及3’EcoRV-pglstop；BottomPgb2和TopGB’sCMP(946))。筛选正确的转化体并将这一菌株命名为MG1655GI1.5-pgl::CMP。
将MG1655GI1.5-pgl::CMP的染色体DNA用作模板来产生含有FRT-CMP-FRT-GI1.5-ybhE构建体的PCR片段。如下将这一构建体克隆到pBBR1MCS5(Gentamycin)中。该片段，在此称作CMPGI1.5-pgl，是使用5’引物Pglconfirm-F和3’引物3’Ec0RV-pglstop来扩增的。使用InvitrogenTOPO-Blunt克隆试剂盒，按照生产商的建议，将得到的片段克隆到质粒载体pCR-BluntII-TOPO。将含有CMP-GI1.5-pgl片段的NsiI片段克隆到pBBR1MCS5(Gentamycin)的PstI位点。制备20μl连接反应物，其包含5μlCMP-GI1.5-pgl插入片段，2μlpBBR1MCS5(Gentamycin)载体，1μlT4DNA连接酶(NewEnglandBiolabs)，2μl10x连接酶缓冲液，和10μlddH2O。室温孵育连接混合物40分钟然后使用上面公开的参数将2-4uL电穿孔到电感受态Top10细胞(Invitrogen)。在含有10ug/ml氯霉素和5ug/ml庆大霉素的L琼脂上筛选转化体。使用上述多个引物以及由Sequetech，CA提供的内部T3和反向引物，测定所筛选克隆的序列。这一质粒命名为pBBRCMPGI1.5-pgl(图77A-B和SEQIDNO：122)。
按上面在实施例10中所述，将质粒pBBRCMPGI1.5-pgl电穿孔到EWL256并且将转化体在含有氯霉素(10ug/mL)、庆大霉素(5ug/mL)、壮观霉素(50ug/mL)和羧苄青霉素(50ug/mL)的L琼脂上铺板。筛选一个转化体并命名为RM11608-2。
引物：
Pgl-F
5’-ACCGCCAAAAGCGACTAATTTTAGCTGTTACAGTCAGTTGAATTAACCCTCACTAAAGGGCGGCCGC-3’(SEQIDNO：115)
PglGI1.5-R
5’-GCTGGCGATATAAACTGTTTGCTTCATGAATGCTCCTTTGGGTTACCTCCGGGAAACGCGGTTGATTTGTTTAGTGGTTGAATTATTTGCTCAGGATGTGGCATAGTCAAGGGCGTGACGGCTCGCTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAG-3’(SEQIDNO：116)
3′EcoRV-pglstop：
5’-CTTGATATCTTAGTGTGCGTTAACCACCAC(SEQIDNO：117)
pgl+49rev：CGTGAATTTGCTGGCTCTCAG(SEQIDNO：118)
BottomPgb2：GGTTTAGTTCCTCACCTTGTC(SEQIDNO：119)
TopGB’sCMP(946)：ACTGAAACGTTTTCATCGCTC(SEQIDNO：120)
Pglconfirm-F
5’-ACCGCCAAAGCGACTAATTTTAGCT-3’(SEQIDNO：121)
i)小规模分析
培养基配方(每升发酵培养基)：
K2HPO413.6g，KH2PO413.6g，MgSO4＊7H2O2g，一水合柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，(NH4)2SO43.2g，酵母提取物1g，1000X微量金属溶液1ml。所有组分一起添加并溶解在diH2O中。用氢氧化铵(30％)调节pH至6.8并定容至体积。用0.22微米过滤器过滤灭菌培养基。在灭菌以及调整pH后，添加葡萄糖5.0g和抗生素。
1000X微量金属溶液：
柠檬酸＊H2O40g，MnSO4＊H2O30g，NaCl10g，FeSO4＊7H2O1g，CoCl2＊6H2O1g，ZnSO4＊7H2O1g，CuSO4＊5H2O100mg，H3BO3100mg，NaMoO4＊2H2O100mg。以每次在diH2O中溶解一种组分来溶解每一组分，用HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容至体积并用0.22微米过滤器过滤灭菌。
a)实验步骤
通过在来自MicroReactorTechnologies，Inc.的CelleratorTM中生长菌株来分析异戊二烯生产。24孔中每孔的工作体积为4.5mL。温度维持在30℃，pH设定点为7.0，氧气流设定点为20sccm并且搅拌速率为800rpm。将取自冷冻瓶的大肠杆菌菌株接种物划线到LB液体培养基琼脂板上(具有抗生素)并在30℃培养。将单菌落接种到含有抗生素的培养基并过夜生长。将细菌稀释到4.5mL的带抗生素的培养基中至达到在550nm处测量的光密度为0.05。
使用气相色谱-质谱仪(GC-MS)(Agilent)顶空检测法进行异戊二烯的废气分析。如下制备样品：将100μL的整个液体培养基至于密封GC瓶中并在30℃孵育固定时间30分钟。在由70℃温育5分钟的热处死步骤后，将样品装载到GC。
在运行期间，使用微板读数器获得在550nm波长下的光密度(OD)。通过将异戊二烯浓度(μg/L)除以OD读数和时间(小时)来获得比生产力。
在200和400uMIPTG诱导水平下评估两菌株EWL256和RM11608-2。在诱导后1、2.5、4.75和8小时分析样品的异戊二烯生产和细胞生长(OD550)。样品一式两份进行。
b)结果
实验表明在2种不同IPTG浓度下，表达ybhE(pgl)的菌株相比于对照菌株的异戊二烯比生产率显著增加了2-3倍。
ii)来自表达马氏甲烷八叠球菌甲羟戊酸激酶、银白杨异戊二烯合酶和pgl过表达(RHM111608-2)并且在15-L规模下于补料分批培养中生长的大肠杆菌的异戊二烯发酵
培养基配方(每升发酵培养基)：
K2HPO47.5g，MgSO4＊7H2O2g，一水合柠檬酸2g，柠檬酸铁铵0.3g，酵母提取物0.5g，1000X改良的微量金属溶液1ml。所有组分一起添加并溶解在diH2O中。对这一溶液高压灭菌。用氢氧化铵(30％)调节pH至7.0并定容至体积。灭菌以及调整pH后，添加葡萄糖10g，硫胺素＊HCl0.1g以及抗生素。
1000X改良的微量金属溶液：
柠檬酸＊H2O40g，MnSO4＊H2O30g，NaCl10g，FeSO4＊7H2O1g，CoCl2＊6H2O1g，ZnSO4＊7H2O1g，CuSO4＊5H2O100mg，H3BO3100mg，NaMoO4＊2H2O100mg。以每次在DiH2O中溶解一种组分来溶解每一组分，用HCl/NaOH调节pH至3.0，然后定容至体积并用0.22微米过滤器过滤灭菌。
在15-L生物反应器中用含有上游甲羟戊酸(MVA)途径(pCLUpper)，整合的下游MVA途径(gi1.2KXDyI)，高表达的来自马氏甲烷八叠球菌的甲羟戊酸激酶以及来自银白杨(pTrcAlba-mMVK)的异戊二烯合酶以及高表达pgl(pBBR-pgl)的BL21(DE3)大肠杆菌细胞进行发酵。进行这一实验来监测在期望的发酵pH7.0以及温度34℃下从葡萄糖形成的异戊二烯。解冻冷冻瓶的大肠杆菌菌株并接种到大豆胨-酵母提取物培养基中。在接种物生长至在550nm处测量的OD为1.0后，使用500mL接种15-L生物反应器，使初始体积达到5-L。
以指数速率供料葡萄糖直到细胞达到稳定期。这一时间后，葡萄糖加料减少以满足代谢要求。在40小时(59小时)发酵期间，送至生物反应器的葡萄糖总量为3.1kg(在59小时为4.2kg)。通过添加IPTG完成诱导。当在550nm的光密度(OD550)达到数值4时，IPTG浓度达到110uM。当OD550达到150时，IPTG浓度升至192uM。图78A显示了生物反应器中随着时间的OD550谱。使用Hiden质谱仪测定生物反应器的废气中的异戊二烯水平。异戊二烯的滴定度随着发酵进程增加至在40小时的最大值为33.2g/L(在59小时为48.6g/L)(图78B)。异戊二烯的滴定度随着发酵进程增加至在40小时的最大值为40.0g/L(在59小时为60.5g/L)(图78C)。在40小时(59小时)发酵期间所产生的异戊二烯的总量为281.3g(在59小时为451.0g)，生产的时间进程如图78D所示。体积生产力的时间进程如图78E所示并且示出在0和40小时之间维持平均速率在1.0g/L/hr(在19和59小时之间为1.4g/L/hr)。如通过CER所测量的代谢活性谱如图78F所示。在40小时发酵期间进入到生产异戊二烯的所利用碳的摩尔产率为19.6％(在59小时为23.6％)。在40小时来自葡萄糖的异戊二烯的重量百分产率为8.9％(在59小时为10.7％)。
除非另有说明，否则在此使用的所有科技术语的含义是本发明所属领域的技术人员通常所理解的。Singleton等人，DictionaryofMicrobiologyandMolecularBiology，第二版，JohnWiley和Sons，NewYork(1994)，以及Hale&Marham，TheHarperCollinsDictionaryofBiology，HarperPerennial，N.Y.(1991)为熟练技术人员提供了在本发明中使用的许多术语的一般词典。应理解的是，本发明不限于所述的具体方法学、方案和试剂，因为它们可以改变。本领域熟练技术人员也将理解，也可以将与在此所述的任何方法和材料相似或等同的那些用于实施或测试本发明。
在此提供的标题不限于本发明多个方面或实施方式，可以通过参考作为整体的说明书来得到它们。
对于在此所使用，除非另有明确指示，否则术语“一个”或类似术语的使用指一个或多个。
在此所指的“约”某数值或参数包括(并且描述了)涉及该数值或参数本身的实施方式。例如，涉及“约X”的描述包括对“X”的描述。数字范围包括定义该范围的数字。
应理解的是，在此所述的本发明的方面和实施方式包括“包括”该方面和实施方式、“由该方面和实施方式组成”和“基本上由该方面和实施方式组成”。
附录1
示例性1-脱氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶核酸和多肽
ATH：AT3G21500(DXPS1)AT4G15560(CLA1)AT5G11380(DXPS3)
OSA：433876843400904342614
CME：CMF089C
PFA：MAL13P1.186
TAN：TA20470
TPV：TP01_0516
ECO：b0420(dxs)
ECJ：JW0410(dxs)
ECE：Z0523(dxs)
ECS：ECs0474
ECC：c0531(dxs)
ECI：UTI89_C0443(dxs)
ECP：ECP_0479
ECV：APECO1_1590(dxs)
ECW：EcE24377A_0451(dxs)
ECX：EcHS_A0491
STY：STY0461(dxs)
STT：t2441(dxs)
SPT：SPA2301(dxs)
SEC：SC0463(dxs)
STM：STM0422(dxs)
YPE：YPO3177(dxs)
YPK：y1008(dxs)
YPM：YP_0754(dxs)
YPA：YPA_2671
YPN：YPN_0911
YPP：YPDSF_2812
YPS：YPTB0939(dxs)
YPI：YpsIP31758_3112(dxs)
SFL：SF0357(dxs)
SFX：S0365(dxs)
SFV：SFV_0385(dxs)
SSN：SSON_0397(dxs)
SBO：SBO_0314(dxs)
SDY：SDY_0310(dxs)
ECA：ECA1131(dxs)
PLU：plu3887(dxs)
BUC：BU464(dxs)
BAS：BUsg448(dxs)
WBR：WGLp144(dxs)
SGL：SG0656
KPN：KPN_00372(dxs)
BFL：Bfl238(dxs)
BPN：BPEN_244(dxs)
HIN：HI1439(dxs)
HIT：NTHI1691(dxs)
HIP：CGSHiEE_04795
HIQ：CGSHiGG_01080
HDU：HD0441(dxs)
HSO：HS_0905(dxs)
PMU：PM0532(dxs)
MSU：MS1059(dxs)
APL：APL_0207(dxs)
XFA：XF2249
XFT：PD1293(dxs)
XCC：XCC2434(dxs)
XCB：XC_1678
XCV：XCV2764(dxs)
XAC：XAC2565(dxs)
XOO：XOO2017(dxs)
XOM：XOO_1900(XOO1900)
VCH：VC0889
VVU：VV1_0315
VVY：VV0868
VPA：VP0686
VFI：VF0711
PPR：PBPRA0805
PAE：PA4044(dxs)
PAU：PA14_11550(dxs)
PAP：PSPA7_1057(dxs)
PPU：PP_0527(dxs)
PST：PSPTO_0698(dxs)
PSB：Psyr_0604
PSP：PSPPH_0599(dxs)
PFL：PFL_5510(dxs)
PFO：Pfl_5007
PEN：PSEEN0600(dxs)
PMY：Pmen_3844
PAR：Psyc_0221(dxs)
PCR：Pcryo_0245
ACI：ACIAD3247(dxs)
SON：SO_1525(dxs)
SDN：Sden_2571
SFR：Sfri_2790
SAZ：Sama_2436
SBL：Sbal_1357
SLO：Shew_2771
SHE：Shewmr4_2731
SHM：Shewmr7_2804
SHN：Shewana3_2901
SHW：Sputw3181_2831
ILO：IL2138(dxs)
CPS：CPS_1088(dxs)
PHA：PSHAa2366(dxs)
PAT：Patl_1319
SDE：Sde_3381
PIN：Ping_2240
MAQ：Maqu_2438
MCA：MCA0817(dxs)
FTU：FTT1018c(dxs)
FTF：FTF1018c(dxs)
FTW：FTW_0925(dxs)
FTL：FTL_1072
FTH：FTH_1047(dxs)
FTA：FTA_1131(dxs)
FTN：FTN_0896(dxs)
NOC：Noc_1743
AEH：Mlg_1381
HCH：HCH_05866(dxs)
CSA：Csal_0099
ABO：ABO_2166(dxs)
AHA：AHA_3321(dxs)
BCI：BCI_0275(dxs)
RMA：Rmag_0386
VOK：COSY_0360(dxs)
NME：NMB1867
NMA：NMA0589(dxs)
NMC：NMC0352(dxs)
NGO：NGO0036
CVI：CV_2692(dxs)
RSO：RSc2221(dxs)
REU：Reut_A0882
REH：H16_A2732(dxs)
RME：Rmet_2615
BMA：BMAA0330(dxs)
BMV：BMASAVP1_1512(dxs)
BML：BMA10299_1706(dxs)
BMN：BMA10247_A0364(dxs)
BXE：Bxe_B2827
BUR：Bcep18194_B2211
BCN：Bcen_4486
BCH：Bcen2424_3879
BAM：Bamb_3250
BPS：BPSS1762(dxs)
BPM：BURPS1710b_A0842(dxs)
BPL：BURPS1106A_A2392(dxs)
BPD：BURPS668_A2534(dxs)
BTE：BTH_II0614(dxs)
BPE：BP2798(dxs)
BPA：BPP2464(dxs)
BBR：BB1912(dxs)
RFR：Rfer_2875
POL：Bpro_1747
PNA：Pnap_1501
AJS：Ajs_1038
MPT：Mpe_A2631
HAR：HEAR0279(dxs)
MMS：mma_0331
NEU：NE1161(dxs)
NET：Neut_1501
NMU：Nmul_A0236
EBA：ebA4439(dxs)
AZO：azo1198(dxs)
DAR：Daro_3061
TBD：Tbd_0879
MFA：Mfla_2133
HPY：HP0354(dxs)
HPJ：jhp0328(dxs)
HPA：HPAG1_0349
HHE：HH0608(dxs)
HAC：Hac_0968(dxs)
WSU：WS1996
TDN：Tmden_0475
CJE：Cj0321(dxs)
CJR：CJE0366(dxs)
CJJ：CJJ81176_0343(dxs)
CJU：C8J_0298(dxs)
CJD：JJD26997_1642(dxs)
CFF：CFF8240_0264(dxs)
CCV：CCV52592_1671(dxs)CCV52592_1722
CHA：CHAB381_1297(dxs)
CCO：CCC13826_1594(dxs)
ABU：Abu_2139(dxs)
NIS：NIS_0391(dxs)
SUN：SUN_2055(dxs)
GSU：GSU0686(dxs-1)GSU1764(dxs-2)
GME：Gmet_1934Gmet_2822
PCA：Pcar_1667
PPD：Ppro_1191Ppro_2403
DVU：DVU1350(dxs)
DVL：Dvul_1718
DDE：Dde_2200
LIP：LI0408(dsx)
DPS：DP2700
ADE：Adeh_1097
MXA：MXAN_4643(dxs)
SAT：SYN_02456
SFU：Sfum_1418
PUB：SAR11_0611(dxs)
MLO：mlr7474
MES：Meso_0735
SME：SMc00972(dxs)
ATU：Atu0745(dxs)
ATC：AGR_C_1351
RET：RHE_CH00913(dxs)
RLE：RL0973(dxs)
BME：BMEI1498
BMF：BAB1_0462(dxs)
BMS：BR0436(dxs)
BMB：BruAb1_0458(dxs)
BOV：BOV_0443(dxs)
BJA：bll2651(dxs)
BRA：BRADO2161(dxs)
BBT：BBta_2479(dxs)
RPA：RPA0952(dxs)
RPB：RPB_4460
RPC：RPC_1149
RPD：RPD_4305
RPE：RPE_1067
NWI：Nwi_0633
NHA：Nham_0778
BHE：BH04350(dxs)
BQU：BQ03540(dxs)
BBK：BARBAKC583_0400(dxs)
CCR：CC_2068
SIL：SPO0247(dxs)
SIT：TM1040_2920
RSP：RSP_0254(dxsA)RSP_1134(dxs)
JAN：Jann_0088Jann_0170
RDE：RD1_0101(dxs)RD1_0548(dxs)
MMR：Mmar10_0849
HNE：HNE_1838(dxs)
ZMO：ZMO1234(dxs)ZMO1598(dxs)
NAR：Saro_0161
SAL：Sala_2354
ELI：ELI_12520
GOX：GOX0252
GBE：GbCGDNIH1_0221GbCGDNIH1_2404
RRU：Rru_A0054Rru_A2619
MAG：amb2904
MGM：Mmc1_1048
SUS：Acid_1783
BSU：BG11715(dxs)
BHA：BH2779
BAN：BA4400(dxs)
BAR：GBAA4400(dxs)
BAA：BA_4853
BAT：BAS4081
BCE：BC4176(dxs)
BCA：BCE_4249(dxs)
BCZ：BCZK3930(dxs)
BTK：BT9727_3919(dxs)
BTL：BALH_3785(dxs)
BLI：BL01523(dxs)
BLD：BLi02598(dxs)
BCL：ABC2462(dxs)
BAY：RBAM_022600
BPU：BPUM_2159
GKA：GK2392
GTN：GTNG_2322
LMO：lmo1365(tktB)
LMF：LMOf2365_1382(dxs)
LIN：lin1402(tktB)
LWE：lwe1380(tktB)
LLA：L108911(dxsA)L123365(dxsB)
LLC：LACR_1572LACR_1843
LLM：llmg_0749(dxsB)
SAK：SAK_0263
LPL：lp_2610(dxs)
LJO：LJ0406
LAC：LBA0356
LSL：LSL_0209(dxs)
LGA：LGAS_0350
STH：STH1842
CAC：CAC2077CA_P0106(dxs)
CPE：CPE1819
CPF：CPF_2073(dxs)
CPR：CPR_1787(dxs)
CTC：CTC01575
CNO：NT01CX_1983
CTH：Cthe_0828
CDF：CD1207(dxs)
CBO：CBO1881(dxs)
CBA：CLB_1818(dxs)
CBH：CLC_1825(dxs)
CBF：CLI_1945(dxs)
CKL：CKL_1231(dxs)
CHY：CHY_1985(dxs)
DSY：DSY2348
DRM：Dred_1078
PTH：PTH_1196(dxs)
SWO：Swol_0582
CSC：Csac_1853
TTE：TTE1298(dxs)
MTA：Moth_1511
MPE：MYPE730
MGA：MGA_1268(dxs)
MTU：Rv2682c(dxs1)Rv3379c(dxs2)
MTC：MT2756(dxs)
MBO：Mb2701c(dxs1)Mb3413c(dxs2)
MLE：ML1038(dxs)
MPA：MAP2803c(dxs)
MAV：MAV_3577(dxs)
MSM：MSMEG_2776(dxs)
MMC：Mmcs_2208
CGL：NCgl1827(cgl1902)
CGB：cg2083(dxs)
CEF：CE1796
CDI：DIP1397(dxs)
CJK：jk1078(dxs)
NFA：nfa37410(dxs)
RHA：RHA1_ro06843
SCO：SCO6013(SC1C3.01)SCO6768(SC6A5.17)
SMA：SAV1646(dxs1)SAV2244(dxs2)
TWH：TWT484
TWS：TW280(Dxs)
LXX：Lxx10450(dxs)
CMI：CMM_1660(dxsA)
AAU：AAur_1790(dxs)
PAC：PPA1062
TFU：Tfu_1917
FRA：Francci3_1326
FAL：FRAAL2088(dxs)
ACE：Acel_1393
SEN：SACE_1815(dxs)SACE_4351
BLO：BL1132(dxs)
BAD：BAD_0513(dxs)
FNU：FN1208FN1464
RBA：RB2143(dxs)
CTR：CT331(dxs)
CTA：CTA_0359(dxs)
CMU：TC0608
CPN：CPn1060(tktB_2)
CPA：CP0790
CPJ：CPj1060(tktB_2)
CPT：CpB1102
CCA：CCA00304(dxs)
CAB：CAB301(dxs)
CFE：CF0699(dxs)
PCU：pc0619(dxs)
TPA：TP0824
TDE：TDE1910(dxs)
LIL：LA3285(dxs)
LIC：LIC10863(dxs)
LBJ：LBJ_0917(dxs)
LBL：LBL_0932(dxs)
SYN：sll1945(dxs)
SYW：SYNW1292(Dxs)
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MBB：BCG_1197BCG_1385(fadA4)BCG_3610(fadA5)BCG_3620c(fadA6)
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TAC：Ta0582
TVO：TVN0649
PTO：PTO1505
APE：APE_2108
SSO：SSO2377(acaB_4)
STO：ST0514
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MSE：Msed_0656
PAI：PAE1220
PIS：Pisl_0029Pisl_1301
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PAS：Pars_0309Pars_1071
CMA：Cmaq_1941
示例性HMG-CoA合酶核酸和多肽
HSA：3157(HMGCS1)3158(HMGCS2)
PTR：457169(HMGCS2)461892(HMGCS1)
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MMU：15360(Hmgcs2)208715(Hmgcs1)
RNO：24450(Hmgcs2)29637(Hmgcs1)
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BTA：407767(HMGCS1)
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GGA：396379(HMGCS1)
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DME：Dmel_CG4311(Hmgs)
CEL：F25B4.6
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PIC：PICST_83020
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SAH：SaurJH1_2622
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SPI：MGAS10750_Spy0779(mvaS1)
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TCX：Tcr_1717
DNO：DNO_0797
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SUS：Acid_5728Acid_6132
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SPJ：MGAS2096_Spy0758
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SPA：M6_Spy0703
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SPK：MGAS9429_Spy0737(mvaK1)
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LSL：LSL_0685(eRG)
LDB：Ldb0999(mvk)
LBU：LBUL_0906
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LRE：Lreu_0915
PPE：PEPE_0927
EFA：EF0904(mvk)
OOE：OEOE_1100
LME：LEUM_1385
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BGA：BG0711
BAF：BAPKO_0732
FPS：FP0313
MMP：MMP1335
MAE：Maeo_0775
MAC：MA0602(mvk)
MBA：Mbar_A1421
MMA：MM_1762
MBU：Mbur_2395
MHU：Mhun_2890
MEM：Memar_1812
MBN：Mboo_2213
MST：Msp_0858(mvk)
MSI：Msm_1439
MKA：MK0993(ERG12)
HAL：VNG1145G(mvk)
HMA：rrnAC0077(mvk)
HWA：HQ2925A(mvk)
NPH：NP2850A(mvk)
PTO：PTO1352
PHO：PH1625
PAB：PAB0372(mvk)
PFU：PF1637(mvk)
TKO：TK1474
RCI：LRC399(mvk)
APE：APE_2439
HBU：Hbut_0877
SSO：SSO0383
STO：ST2185
SAI：Saci_2365(mvk)
MSE：Msed_1602
PAI：PAE3108
PIS：Pisl_0467
PCL：Pcal_1835
示例性磷酸甲羟戊酸激酶核酸和多肽
HSA：10654(PMVK)
PTR：457350(PMVK)
MCC：717014(PMVK)
MMU：68603(Pmvk)
CFA：612251(PMVK)
BTA：513533(PMVK)
DME：Dmel_CG10268
ATH：AT1G31910
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SCE：YMR220W(ERG8)
AGO：AGOS_AER354W
PIC：PICST_52257(ERG8)
CGR：CAGL0F03993g
SPO：SPAC343.01c
MGR：MGG_05812
ANI：AN2311.2
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AOR：AO090010000471
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UMA：UM00760.1
DDI：DDBDRAFT_0184512
TBR：Tb09.160.3690
TCR：507913.20508277.140
LMA：LmjF15.1460
MXA：MXAN_5017
OIH：OB0227
SAU：SA0549(mvaK2)
SAV：SAV0592(mvaK2)
SAM：MW0547(mvaK2)
SAR：SAR0598(mvaK2)
SAS：SAS0551
SAC：SACOL0638
SAB：SAB0542(mvaK2)
SAA：SAUSA300_0574
SAO：SAOUHSC_00579
SAJ：SaurJH9_0615
SEP：SE0363
SER：SERP0240
SHA：SH2400(mvaK2)
SSP：SSP2120
LMO：lmo0012
LMF：LMOf2365_0013
LIN：lin0012
LWE：lwe0013
LLA：L10014(yebA)
LLC：LACR_0456
LLM：llmg_0427
SPY：SPy_0878(mvaK2)
SPZ：M5005_Spy_0684(mvaK2)
SPM：spyM18_0939
SPG：SpyM3_0597(mvaK2)
SPS：SPs1256
SPH：MGAS10270_Spy0742(mvaK2)
SPI：MGAS10750_Spy0776(mvaK2)
SPJ：MGAS2096_Spy0755(mvaK2)
SPK：MGAS9429_Spy0739(mvaK2)
SPF：SpyM51124(mvaK2)
SPA：M6_Spy0701
SPB：M28_Spy0664(mvaK2)
SPN：SP_0383
SPR：spr0340(mvaK2)
SPD：SPD_0348(mvaK2)
SAG：SAG1324
SAN：gbs1394
SAK：SAK_1355
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STC：str0561(mvaK2)
STL：stu0561(mvaK2)
STE：STER_0600
SSA：SSA_0335(mvaK2)
SSU：SSU05_0291
SSV：SSU98_0287
SGO：SGO_0241
LPL：lp_1733(mvaK2)
LJO：LJ1207
LAC：LBA1169
LSA：LSA0906(mvaK2)
LSL：LSL_0683
LDB：Ldb0997(mvaK)
LBU：LBUL_0904
LBR：LVIS_0860
LCA：LSEI_1092
LGA：LGAS_1035
LRE：Lreu_0913
PPE：PEPE_0925
EFA：EF0902
NFA：nfa22090
BGA：BG0710
BAF：BAPKO_0731
NPH：NP2852A
SSO：SSO2988
STO：ST0978
SAI：Saci_1244
示例性二磷酸甲羟戊酸脱羧酶核酸和多肽
HSA：4597(MVD)
PTR：468069(MVD)
MCC：696865(MVD)
MMU：192156(Mvd)
RNO：81726(Mvd)
CFA：489663(MVD)
GGA：425359(MVD)
DME：Dmel_CG8239
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OIH：OB0226
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SAR：SAR0597(mvaD)
SAS：SAS0550
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SPY：SPy_0877(mvaD)
SPZ：M5005_Spy_0683(mvaD)
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SPG：SpyM3_0596(mvaD)
SPS：SPs1257
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SPI：MGAS10750_Spy0775(mvaD)
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SPF：SpyM51125(mvaD)
SPA：M6_Spy0700
SPB：M28_Spy0663(mvaD)
SPN：SP_0382
SPR：spr0339(mvd1)
SPD：SPD_0347(mvaD)
SAG：SAG1325(mvaD)
SAN：gbs1395
SAK：SAK_1356(mvaD)
SMU：SMU.937
STC：str0560(mvaD)
STL：stu0560(mvaD)
STE：STER_0599
SSA：SSA_0334(mvaD)
SSU：SSU05_0290
SSV：SSU98_0286
SGO：SGO_0240(mvaD)
LPL：lp_1734(mvaD)
LJO：LJ1206
LAC：LBA1168(mvaD)
LSA：LSA0907(mvaD)
LSL：LSL_0684
LDB：Ldb0998(mvaD)
LBU：LBUL_0905
LBR：LVIS_0859
LCA：LSEI_1492
LGA：LGAS_1034
LRE：Lreu_0914
PPE：PEPE_0926
EFA：EF0903(mvaD)
LME：LEUM_1386
NFA：nfa22080
BBU：BB0686
BGA：BG0709
BAF：BAPKO_0730
GFO：GFO_3632
FPS：FP0310(mvaD)
HAU：Haur_1612
HAL：VNG0593G(dmd)
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HWA：HQ1525A(mvaD)
NPH：NP1580A(mvaD)
PTO：PTO0478PTO1356
SSO：SSO2989
STO：ST0977
SAI：Saci_1245(mvd)
MSE：Msed_1576
示例性异戊烯磷酸激酶(IPK)核酸和多肽
Methanobacteriumthermoautotrophicumgi|2621082
MethanococcusjannaschiiDSM2661gi|1590842；
Methanocaldococcusjannaschiigi|1590842
Methanothermobacterthermautotrophicusgi|2621082
PicrophilustorridusDSM9790(IG-57)gi|48477569
Pyrococcusabyssigi|14520758
PyrococcushorikoshiiOT3gi|3258052
ArchaeoglobusfulgidusDSM4304gi|2648231
示例性异戊烯基二磷酸δ异构酶(IDI)核酸和多肽
HSA：3422(IDI1)91734(IDI2)
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MCC：710052(LOC710052)721730(LOC721730)
MMU：319554(Idi1)
RNO：89784(Idi1)
GGA：420459(IDI1)
XLA：494671(LOC494671)
XTR：496783(idi2)
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CEL：K06H7.9(idi-1)
ATH：AT3G02780(IPP2)
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SCE：YPL117C(IDI1)
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SPO：SPBC106.15(idi1)
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ECI：UTI89_C3274
ECP：ECP_2882
ECV：APECO1_3638
ECW：EcE24377A_3215(idi)
ECX：EcHS_A3048
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STT：t2957
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SEC：SC2979(idi)
STM：STM3039(idi)
SFL：SF2875(idi)
SFX：S3074
SFV：SFV_2937
SSN：SSON_3042SSON_3489(yhfK)
SBO：SBO_3103
SDY：SDY_3193
ECA：ECA2789
PLU：plu3987
ENT：Ent638_3307
SPE：Spro_2201
VPA：VPA0278
VFI：VF0403
PPR：PBPRA0469(mvaD)
PEN：PSEEN4850
CBU：CBU_0607(mvaD)
CBD：COXBU7E912_0619(mvaD)
LPN：lpg2051
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TCX：Tcr_1718
HHA：Hhal_1623
DNO：DNO_0798
EBA：ebA5678p2A143
DVU：DVU1679(idi)
DDE：Dde_1991
LIP：LI1134
BBA：Bd1626
AFW：Anae109_4082
MXA：MXAN_5021(fni)
RPR：RP452
RTY：RT0439(idi)
RCO：RC0744
RFE：RF_0785(fni)
RBE：RBE_0731(fni)
RAK：A1C_04190
RBO：A1I_04755
RCM：A1E_02555
RRI：A1G_04195
MLO：mlr6371
RET：RHE_PD00245(ypd00046)
XAU：Xaut_4134
SIL：SPO0131
SIT：TM1040_3442
RSP：RSP_0276
RSH：Rsph17029_1919
RSQ：Rsph17025_1019
JAN：Jann_0168
RDE：RD1_0147(idi)
DSH：Dshi_3527
BSU：BG11440(ypgA)
BAN：BA1520
BAR：GBAA1520
BAA：BA_2041
BAT：BAS1409
BCE：BC1499
BCA：BCE_1626
BCZ：BCZK1380(fni)
BCY：Bcer98_1222
BTK：BT9727_1381(fni)
BTL：BALH_1354
BLI：BL02217(fni)
BLD：BLi02426
BAY：RBAM_021020(fni)
BPU：BPUM_2020(fni)
OIH：OB0537
SAU：SA2136(fni)
SAV：SAV2346(fni)
SAM：MW2267(fni)
SAR：SAR2431(fni)
SAS：SAS2237
SAC：SACOL2341(fni)
SAB：SAB2225c(fni)
SAA：SAUSA300_2292(fni)
SAO：SAOUHSC_02623
SEP：SE1925
SER：SERP1937(fni-2)
SHA：SH0712(fni)
SSP：SSP0556
LMO：lmo1383
LMF：LMOf2365_1402(fni)
LIN：lin1420
LWE：lwe1399(fni)
LLA：L11083(yebB)
LLC：LACR_0457
LLM：llmg_0428(fni)
SPY：SPy_0879
SPZ：M5005_Spy_0685
SPM：spyM18_0940
SPG：SpyM3_0598
SPS：SPs1255
SPH：MGAS10270_Spy0743
SPI：MGAS10750_Spy0777
SPJ：MGAS2096_Spy0756
SPK：MGAS9429_Spy0740
SPF：SpyM51123(fni)
SPA：M6_Spy0702
SPB：M28_Spy0665
SPN：SP_0384
SPR：spr0341(fni)
SPD：SPD_0349(fni)
SAG：SAG1323
SAN：gbs1393
SAK：SAK_1354(fni)
SMU：SMU.939
STC：str0562(idi)
STL：stu0562(idi)
STE：STER_0601
SSA：SSA_0336
SGO：SGO_0242
LPL：lp_1732(idi1)
LJO：LJ1208
LAC：LBA1171
LSA：LSA0905(idi)
LSL：LSL_0682
LDB：Ldb0996(fni)
LBU：LBUL_0903
LBR：LVIS_0861
LCA：LSEI_1493
LGA：LGAS_1036
LRE：Lreu_0912
EFA：EF0901
OOE：OEOE_1103
STH：STH1674
CBE：Cbei_3081
DRM：Dred_0474
SWO：Swol_1341
MTA：Moth_1328
MTU：Rv1745c(idi)
MTC：MT1787(idi)
MBO：Mb1774c(idi)
MBB：BCG_1784c(idi)
MPA：MAP3079c
MAV：MAV_3894(fni)
MSM：MSMEG_1057(fni)MSMEG_2337(fni)
MUL：MUL_0380(idi2)
MVA：Mvan_1582Mvan_2176
MGI：Mflv_1842Mflv_4187
MMC：Mmcs_1954
MKM：Mkms_2000
MJL：Mjls_1934
CGL：NCgl2223(cgl2305)
CGB：cg2531(idi)
CEF：CE2207
CDI：DIP1730(idi)
NFA：nfa19790nfa22100
RHA：RHA1_ro00239
SCO：SCO6750(SC5F2A.33c)
SMA：SAV1663(idi)
LXX：Lxx23810(idi)
CMI：CMM_2889(idiA)
AAU：AAur_0321(idi)
PAC：PPA2115
FRA：Francci3_4188
FRE：Franean1_5570
FAL：FRAAL6504(idi)
KRA：Krad_3991
SEN：SACE_2627(idiB_2)SACE_5210(idi)
STP：Strop_4438
SAQ：Sare_4564Sare_4928
RXY：Rxyl_0400
BBU：BB0684
BGA：BG0707
SYN：sll1556
SYC：syc2161_c
SYF：Synpcc7942_1933
CYA：CYA_2395(fni)
CYB：CYB_2691(fni)
TEL：tll1403
ANA：all4591
AVA：Ava_2461Ava_B0346
TER：Tery_1589
SRU：SRU_1900(idi)
CHU：CHU_0674(idi)
GFO：GFO_2363(idi)
FJO：Fjoh_0269
FPS：FP1792(idi)
CTE：CT0257
CCH：Cag_1445
CPH：Cpha266_0385
PVI：Cvib_1545
PLT：Plut_1764
RRS：RoseRS_2437
RCA：Rcas_2215
HAU：Haur_4687
DRA：DR_1087
DGE：Dgeo_1381
TTH：TT_P0067
TTJ：TTHB110
MJA：MJ0862
MMP：MMP0043
MMQ：MmarC5_1637
MMX：MmarC6_0906
MMZ：MmarC7_1040
MAE：Maeo_1184
MVN：Mevan_1058
MAC：MA0604(idi)
MBA：Mbar_A1419
MMA：MM_1764
MBU：Mbur_2397
MTP：Mthe_0474
MHU：Mhun_2888
MLA：Mlab_1665
MEM：Memar_1814
MBN：Mboo_2211
MTH：MTH48
MST：Msp_0856(fni)
MSI：Msm_1441
MKA：MK0776(lldD)
AFU：AF2287
HAL：VNG1818G(idi)VNG6081G(crt_1)VNG6445G(crt_2)VNG7060VNG7149
HMA：rrnAC3484(idi)
HWA：HQ2772A(idiA)HQ2847A(idiB)
NPH：NP0360A(idiB_1)NP4826A(idiA)NP5124A(idiB_2)
TAC：Ta0102
TVO：TVN0179
PTO：PTO0496
PHO：PH1202
PAB：PAB1662
PFU：PF0856
TKO：TK1470
RCI：LRC397(fni)
APE：APE_1765.1
SMR：Smar_0822
IHO：Igni_0804
HBU：Hbut_0539
SSO：SSO0063
STO：ST2059
SAI：Saci_0091
MSE：Msed_2136
PAI：PAE0801
PIS：Pisl_1093
PCL：Pcal_0017
PAS：Pars_0051
TPE：Tpen_0272
示例性异戊二烯合酶核酸和多肽
Genbank登录号
AY341431
AY316691
AY279379
AJ457070
AY182241

Claims (24)

1.重组细菌或真菌细胞，其能够增加异戊二烯生产，所述细胞包含一种或多种核酸，所述核酸编码：
(a)异戊二烯合酶多肽，其中该异戊二烯合酶多肽由异源核酸编码，
(b)异戊烯二磷酸δ异构酶(IDI)多肽，和
(c)(i)1-脱氧木酮糖-5-磷酸合酶(DXS)多肽，和/或
(ii)甲羟戊酸(MVA)途径多肽，所述甲羟戊酸途径多肽选自乙酰-CoA乙酰转移酶(AA-CoA硫解酶)、3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA合酶(HMG-CoA合酶)、3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA还原酶(HMG-CoA还原酶)、甲羟戊酸激酶(MVK)、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)和二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)多肽，
其中所述细胞
(d)产生大于400纳摩尔/gwcm/hr的异戊二烯；
(e)将细胞从细胞培养基中消耗的碳中大于0.002摩尔％的碳转化成异戊二烯；
(f)具有大于0.1mg/L培养液/hr的异戊二烯平均体积生产力；或
(g)其中细胞产生至少0.0037克异戊二烯/克干细胞质量(gdcm)。
2.权利要求1的细胞，其中所述细胞产生至少500、600、700、800、900、1,000、1,250、1,500、1,750、2,000、2,500、3,000、4,000、5,000、10,000或12,500纳摩尔/gwcm/hr的异戊二烯。
3.权利要求1的细胞，其中所述细胞产生400纳摩尔/gwcm/hr到2.0x105纳摩尔/gwcm/hr的异戊二烯。
4.权利要求1的细胞，其中所述异戊二烯合酶多肽是植物异戊二烯合酶多肽。
5.权利要求4的细胞，其中所述植物异戊二烯合酶多肽是杨异戊二烯合酶多肽。
6.权利要求4的细胞，其中所述异戊二烯合酶多肽是葛异戊二烯合酶多肽。
7.权利要求1的细胞，其中编码(b)的IDI多肽的核酸是编码IDI多肽的异源核酸。
8.权利要求7的细胞，其中所述IDI多肽是酵母IDI多肽。
9.权利要求1的细胞，其中编码(b)的IDI多肽的核酸是编码IDI多肽的内源核酸的拷贝。
10.权利要求1的细胞，其中编码(c)的DXS多肽的核酸是编码DXS多肽的异源核酸。
11.权利要求1的细胞，其中编码(c)的DXS多肽的核酸是编码DXS多肽的内源核酸的拷贝。
12.权利要求1的细胞，其包含编码MVA途径多肽的一种或多种异源核酸，所述MVA途径多肽选自乙酰-CoA乙酰转移酶(AA-CoA硫解酶)、3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA合酶(HMG-CoA合酶)、3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA还原酶(HMG-CoA还原酶)、甲羟戊酸激酶(MVK)、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)和二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)多肽。
13.权利要求1的细胞，其中编码(a)、(b)、或(c)任一种的多肽的一种或多种核酸的至少一种过表达。
14.权利要求13的细胞，其中所述过表达的核酸被克隆到多拷贝质粒中。
15.权利要求13的细胞，其中所述过表达的核酸被置于诱导型启动子或组成型启动子下。
16.权利要求1的细胞，其中所述细胞是革兰氏阳性细菌细胞或革兰氏阴性细菌细胞。
17.权利要求1的细胞，其中所述细胞选自大肠杆菌、柠檬泛菌、枯草杆菌、地衣芽孢杆菌、迟缓芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱性芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、克劳氏芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、凝固芽孢杆菌、环状芽孢杆菌、灿烂芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、白色链霉菌、浅青紫链霉菌、天蓝色链霉菌、灰色链霉菌、假单胞菌和产碱假单胞菌细胞。
18.权利要求1的细胞，其中所述细胞是真菌细胞。
19.权利要求18的细胞，其中所述真菌细胞是曲霉属、酵母、木霉属或耶氏酵母属细胞。
20.权利要求19的细胞，其中所述酵母细胞是酵母属、裂殖酵母(Schizosaccharomycessp.)、毕氏酵母(Pichiasp.)或假丝酵母(Candidasp.)细胞。
21.权利要求18的细胞，其中所述真菌细胞选自米曲霉、黑曲霉、酿酒酵母、粟酒裂殖酵母、里氏木霉、特异腐质霉、疏毛腐质霉、灰色腐质霉、C.iucknowense、酱油曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、棘孢曲霉、泡盛曲霉、粉红镰孢、赤禾镰孢、F.cerealis、尖镰孢、F.venenatum、粗糙脉胞菌、米黑毛霉、绿色木霉、尖镰孢和腐皮镰孢细胞。
22.权利要求1的细胞，其中所述编码(a)、(b)、或(c)的多肽的一种或多种核酸的至少一种在载体上。
23.权利要求1的细胞，其中所述编码(a)、(b)、或(c)的多肽的一种或多种核酸的至少一种整合到细胞的染色体中。
24.权利要求1的细胞，其中所述细胞包含一种或多种核酸，所述核酸编码：
(c)(i)DXS多肽和
(ii)MVA途径多肽，所述MVA途径多肽选自乙酰-CoA乙酰转移酶(AA-CoA硫解酶)、3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA合酶(HMG-CoA合酶)、3-羟基-3-甲基戊二酰基-CoA还原酶(HMG-CoA还原酶)、甲羟戊酸激酶(MVK)、磷酸甲羟戊酸激酶(PMK)和二磷酸甲羟戊酸脱羧酶(MVD)多肽。
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