JP2014502148A - イソプレン生産の向上を目的としたイソプレン合成酵素変異体 - Google Patents

イソプレン生産の向上を目的としたイソプレン合成酵素変異体 Download PDF

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Abstract

本発明は、比生産性の改良された少なくとも１つのイソプレン合成酵素を含む方法及び組成物を提供する。特に、本発明は、宿主細胞においてイソプレン生産を増加させる、変異型の植物イソプレン合成酵素を提供する。

Description

（関連出願の相互参照）
本出願は、米国仮特許出願第６１／４０７，４１５号（２０１０年１０月２７日出願）の優先権を主張し、この特許の内容は、参照により全体が本開示に援用される。
（発明の分野）
本発明は、イソプレン合成酵素変異体を含む方法及び組成物を提供する。特に、本発明は、宿主細胞においてイソプレン生産を増加させる、変異型の植物イソプレン合成酵素を提供する。
イソプレノイドは、医薬品、栄養補助食品、着香料、香水、及びゴム製品への使用が見出されているイソプレンポリマーである。しかしながら、天然由来のイソプレノイドの供給量には、環境上の懸念から制限がある。この理由から、並びに、より不純物が少なく、より均一なイソプレノイド組成物を提供する目的で、多くの場合、ゴムなどのイソプレノイドは化学合成により製造される。
イソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン）は、水不溶性でかつアルコール溶解性の揮発性炭化水素である。採算の合う量のイソプレンは、石油分解生成物中のＣ５留分から直接得ることができ、あるいはＣ５イソアルカン又はイソアルケンを脱水することにより得ることができる（Ｗｅｉｓｓｅｒｍｅｌ ａｎｄ Ａｒｐｅ，Ｉｎｄｕｓｔｒｉａｌ Ｏｒｇａｎｉｃ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，４ｔｈ ｅｄ．，Ｗｉｌｅｙ−ＶＣＨ，ｐｐ．１１７〜１２２，２００３）。Ｃ５骨格は、より小さなサブユニットから合成することもできる。しかしながら、再生不能資源に依存せずとも採算の合うイソプレン生産方法が所望されている。
イソプレンの生合成は、２つの別個の代謝経路により行われる（Ｊｕｌｓｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，７５：１３７７〜１３８４，２００７）。真核生物及び古細菌では、イソプレンはメバロン酸（ＭＶＡ）経路により生成されるのに対し、一部の真性細菌及び高等植物は、メチルエリスリトールリン酸（ＭＥＰ）経路によりイソプレンを生産する。植物は、光及び温度依存的にイソプレンを放出し、放出量は葉の成長に伴い増加する。イソプレンを生成する酵素であるイソプレン合成酵素はアスペンの木で同定されており（Ｓｉｌｖｅｒ ａｎｄ Ｆａｌｌ，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ，９７：１５８８〜１５９１，１９９１；及びＳｉｌｖｅｒ ａｎｄ Ｆａｌｌ，Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ，２７０：１３０１０〜１３０１６，１９９５）、全葉による、イソプレンのｉｎ ｖｉｖｏ生産に関与するものと考えられている。微生物によるイソプレン生産も報告されており（Ｋｕｚｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ，３０：９７〜１０３，１９９５；及びＷｉｌｋｉｎｓ，Ｃｈｅｍｏｓｐｈｅｒｅ，３２：１４２７〜１４３４，１９９６）、この場合、生産量は、微生物の増殖相及び培養培地に含まれる栄養分に応じ変化する（米国特許第５，８４９，９７０号（Ｆａｌｌ ｅｔ ａｌ．）；及びＷａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ，１８１：４７００〜４７０３，１９９９）。従来の微生物系を用いた場合に得られるイソプレン量は商用には不十分である。
したがって、当該技術分野では、イソプレノイドを製造する際の原料を提供するための、イソプレンの効率的で大規模な生物学的生産法が必要とされている。
本明細書で引用されるすべての特許、特許出願、論文及び刊行物は、参照により明示的に本案件に援用される。
本発明は、イソプレン合成酵素のポリペプチド変異体を少なくとも１つ含む組成物、並びにこのような変異体の製造法及び使用法を提供する。この変異体は、親イソプレン合成酵素ポリペプチドとは異なるアミノ酸残基置換を一箇所以上に含み、この場合の親イソプレン合成酵素は、野生型の配列であっても、あるいは野生型の配列でなくてよい。本発明は、ポリペプチド内の特定の位置でのアミノ酸残基置換を提供し、この置換により、少なくとも一つの特性が、親配列のものと比較して改良され得る。一部の特に好ましい実施形態では、改良される少なくとも一つの特性は、限定するものではないが次のものからなる群から選択される：比生産性、収率、細胞の性能指数（cellular performance index）、比活性、ポリペプチド変異体を発現している宿主細胞の増殖性、発現、安定性、及び溶解性。特に、本発明は、宿主細胞においてイソプレン生産を増加させる、変異型の植物イソプレン合成酵素を提供する。
一態様では、本発明は、イソプレン合成酵素活性の改良された単離ポリペプチドを提供し、このポリペプチドは、Ｎ末端領域、表面ループ、表面、活性部位、二量体界面、基質捕捉ループ、又は埋没領域の１つ以上の残基にて１つ以上の置換を含み、このポリペプチドは、配列番号１と比較して少なくとも３０％増加している。一部の実施形態では、Ｎ末端領域の置換は、Ｘ２，Ｘ２２，Ｘ３６，Ｘ４３，及びＸ５８からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は、Ｅ２，Ｓ２２，Ｋ３６，Ｒ４３，及びＥ５８からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は、Ｅ２Ｖ，Ｓ２２Ｋ，Ｓ２２Ｒ，Ｋ３６Ｄ，Ｋ３６Ｅ，Ｋ３６Ｈ，Ｋ３６Ｗ，Ｒ４３Ｅ，及びＥ５８Ｆからなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、埋没領域における置換は、Ｘ７１，Ｘ８９，Ｘ１１８，Ｘ１６１，Ｘ２２８，Ｘ２６８，Ｘ２８２，Ｘ２８８，Ｘ３３１，Ｘ３９１，Ｘ３９２，Ｘ４３７，Ｘ４６０，Ｘ４６１，Ｘ４８１，Ｘ４８８，及びＸ５０２からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は、Ｒ７１，Ｆ８９，Ａ１１８，Ｋ１６１，Ｍ２２８，Ｖ２６８，Ｓ２８２，Ｓ２８８，Ｃ３３１，Ａ３９１，Ｗ３９２，Ｃ４３７，Ｍ４６０，Ｒ４６１，Ｔ４８１，Ｅ４８８，及びＴ５０２からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は、Ｒ７１Ｉ，Ｆ８９Ｄ，Ｆ８９Ｅ，Ａ１１８Ｅ，Ａ１１８Ｐ，Ｋ１６１Ｃ，Ｍ２２８Ｙ，Ｖ２６８Ｉ，Ｓ２８２Ｈ，Ｓ２８２Ｗ，Ｓ２８８Ａ，Ｓ２８８Ｔ，Ｓ２８８Ｙ，Ｃ３３１Ｐ，Ａ３９１Ｇ，Ｗ３９２Ｃ，Ｗ３９２Ｆ，Ｗ３９２Ｍ，Ｗ３９２Ｓ，Ｗ３９２Ｖ，Ｗ３９２Ｙ，Ｃ４３７Ｌ，Ｃ４３７Ｍ，Ｍ４６０Ａ，Ｒ４６１Ａ，Ｒ４６１Ｙ，Ｔ４８１Ｙ，Ｅ４８８Ｌ，Ｔ５０２Ｆ及びＴ５０２Ｍからなる群から選択される。一部の実施形態では、表面ループにおける置換は、Ｘ１２０，Ｘ１５１，Ｘ１５３，Ｘ２５４，Ｘ３８０，及びＸ４０９からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は、Ｓ１２０，Ｌ１５１，Ｈ２５４，Ｓ３８０，及びＶ４０９からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は、Ｓ１２０Ｍ，Ｓ１２０Ｑ，Ｌ１５１Ｆ，Ｌ１５１Ｙ，Ｇ１５３Ｐ，Ｈ２５４Ｃ，Ｓ３８０Ｅ，及びＶ４０９Ｔからなる群から選択される。一部の実施形態では、二量体界面における置換はＸ２４７の置換である。一部の実施形態では、置換はＶ２４７の置換である。一部の実施形態では、置換はＶ２４７Ｍである。一部の実施形態では、表面における置換は、Ｘ３４８，Ｘ３７６，及びＸ３８９からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は、Ｋ３４８，Ｌ３７６，及びＧ３８９からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は、Ｋ３４８Ｙ，及びＧ３８９Ｄからなる群から選択される。一部の実施形態では、基質捕捉ループにおける置換は、Ｘ４４３，Ｘ４４４，Ｘ４４７及びＸ４４８からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換はＳ４４４，Ｉ４４７及びＡ４４８からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換はＳ４４４Ｓ，Ｉ４４７Ｔ及びＡ４４８Ｖからなる群から選択される。
他の態様では、本発明は、イソプレン合成酵素活性の改良された単離ポリペプチドを提供し、ポリペプチドは、配列番号１と対応する残基番号を付した次の不変の残基：Ｘ４，Ｘ９，Ｘ２４３，Ｘ２５８，Ｘ２５９，Ｘ２６２，Ｘ２６６，Ｘ２８０，Ｘ２９４，Ｘ２９５，Ｘ２９８，Ｘ３０５，Ｘ３８７，Ｘ３９６，Ｘ３９７，Ｘ４３５，Ｘ４３９，Ｘ４４６，Ｘ４４９，Ｘ４５０，Ｘ５１４，及びＸ５１８，を含み、かつポリペプチドは更に：Ｘ２，Ｘ２２，Ｘ３６，Ｘ４３，Ｘ５８，Ｘ７１，Ｘ８９，Ｘ１１８，Ｘ１２０，Ｘ１５１，Ｘ１５３，Ｘ１６１，Ｘ２２８，Ｘ２３４，Ｘ２４７，Ｘ２５４，Ｘ２６８，Ｘ２８２，Ｘ２８８，Ｘ３３１，Ｘ３４８，Ｘ３７６，Ｘ３８０，Ｘ３８９，Ｘ３９１，Ｘ３９２，Ｘ４０９，Ｘ４３７，Ｘ４４３，Ｘ４４４，Ｘ４４７，Ｘ４４８，Ｘ４６０，Ｘ４６１，Ｘ４８１，Ｘ４８８，及びＸ５０２，からなる群から選択される残基の１つ以上に置換を含み、ここで、ポリペプチドは、配列番号１の野生型イソプレン合成酵素と比較して、イソプレン合成酵素の比活性が少なくとも３０％上昇している。一部の実施形態では、置換は：Ｅ２，Ｓ２２，Ｋ３６，Ｒ４３，Ｅ５８，Ｒ７１，Ｆ８９，Ａ１１８，Ｓ１２０，Ｌ１５１，Ｋ１６１，Ｍ２２８，Ｑ２３４，Ｖ２４７，Ｈ２５４，Ｖ２６８，Ｓ２８２，Ｓ２８８，Ｃ３３１，Ｋ３４８，Ｌ３７６，Ｓ３８０，Ｇ３８９，Ａ３９１，Ｗ３９２，Ｖ４０９，Ｃ４３７，Ｓ４４４，Ｉ４４７，Ａ４４８，Ｍ４６０，Ｒ４６１，Ｔ４８１，Ｅ４８８，及びＴ５０２からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は：Ｅ２Ｖ，Ｓ２２Ｋ，Ｓ２２Ｒ，Ｋ３６Ｄ，Ｋ３６Ｅ，Ｋ３６Ｈ，Ｋ３６Ｗ，Ｒ４３Ｅ，Ｅ５８Ｆ，Ｒ７１Ｉ，Ｆ８９Ｄ，Ｆ８９Ｅ，Ａ１１８Ｅ，Ａ１１８Ｐ，Ｓ１２０Ｍ，Ｓ１２０Ｑ，Ｌ１５１Ｆ，Ｌ１５１Ｙ，Ｇ１５３Ｐ，Ｋ１６１Ｃ，Ｍ２２８Ｙ，Ｑ２３４Ｒ，Ｖ２４７Ｉ，Ｖ２４７Ｌ，Ｖ２４７Ｍ，Ｈ２５４Ｃ，Ｖ２６８Ｉ，Ｓ２８２Ｈ，Ｓ２８２Ｗ，Ｓ２８８Ａ，Ｓ２８８Ｔ，Ｓ２８８Ｙ，Ｃ３３１Ｐ，Ｋ３４８Ｙ，Ｓ３８０Ｅ，Ｇ３８９Ｄ，Ａ３９１Ｇ，Ｗ３９２Ｃ，Ｗ３９２Ｆ，Ｗ３９２Ｍ，Ｗ３９２Ｓ，Ｗ３９２Ｖ，Ｗ３９２Ｙ，Ｖ４０９Ｔ，Ｃ４３７Ｌ，Ｃ４３７Ｍ，Ｓ４４４Ｄ，Ｓ４４４Ｅ，Ｉ４４７Ｔ，Ｉ４４７Ｖ，Ａ４４８Ｖ，Ｍ４６０Ａ，Ｒ４６１Ａ，Ｔ４８１Ｙ，Ｅ４８８Ｌ，Ｔ５０２Ｆ及びＴ５０２Ｍからなる群から選択される。
他の態様では、本発明は、イソプレン合成酵素活性の改良された単離ポリペプチドを提供し、ポリペプチドは、配列番号１と対応する残基番号を付した次の不変の残基：Ｘ４，Ｘ９，Ｘ２４３，Ｘ２５８，Ｘ２５９，Ｘ２６２，Ｘ２６６，Ｘ２８０，Ｘ２９４，Ｘ２９５，Ｘ２９８，Ｘ３０５，Ｘ３８７，Ｘ３９６，Ｘ３９７，Ｘ４３５，Ｘ４３９，Ｘ４４６，Ｘ４４９，Ｘ４５０，Ｘ５１４，及びＸ５１８，を含み、かつポリペプチドは更に：Ｘ１３４，Ｘ１３８，Ｘ１４３，Ｘ１５６，Ｘ１５９，Ｘ１６３，Ｘ１６６，Ｘ１６７，Ｘ１７０，Ｘ４１４，Ｘ４２１，及びＸ４９１からなる群から選択される残基の１つ以上に置換を含み、ここで、ポリペプチドを発現している宿主細胞の増殖性は、同様の増殖条件下で配列番号１の野生型イソプレン合成酵素を発現している宿主細胞の増殖性と比較して、少なくとも５０％上昇している。一部の実施形態では、置換はＫ１３４，Ｋ１３８，Ｌ１４３，Ｉ１５６，Ｅ１５９，Ｆ１６３，Ｓ１６６，Ｈ１６７，Ｅ１７０，Ｋ４１４，及びＱ４２１からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は、Ｋ１３４Ｐ，Ｋ１３８Ｃ，Ｌ１４３Ｆ，Ｌ１４３Ｖ，Ｉ１５６Ｇ，Ｅ１５９Ｇ，Ｅ１５９Ｑ，Ｆ１６３Ｃ，Ｆ１６３Ｅ，Ｆ１６３Ｑ，Ｆ１６３Ｖ，Ｆ１６３Ｙ，Ｓ１６６Ｃ，Ｓ１６６Ｄ，Ｓ１６６Ｇ，Ｓ１６６Ｐ，Ｓ１６６Ｖ，Ｈ１６７Ｍ，Ｅ１７０Ｇ，Ｅ１７０Ｈ，Ｅ１７０Ｋ，Ｅ１７０Ｎ，Ｅ１７０Ｒ，Ｅ１７０Ｓ，Ｅ１７０Ｗ，Ｋ４１４Ｆ，Ｋ４１４Ｇ，Ｋ４１４Ｎ，Ｋ４１４Ｐ，及びＱ４２１Ｒからなる群から選択される。
他の態様では、本発明は、イソプレン合成酵素活性の改良された単離ポリペプチドを提供し、ポリペプチドは、配列番号１と対応する残基番号を付した次の不変の残基：Ｘ４，Ｘ９，Ｘ２４３，Ｘ２５８，Ｘ２５９，Ｘ２６２，Ｘ２６６，Ｘ２８０，Ｘ２９４，Ｘ２９５，Ｘ２９８，Ｘ３０５，Ｘ３８７，Ｘ３９６，Ｘ３９７，Ｘ４３５，Ｘ４３９，Ｘ４４６，Ｘ４４９，Ｘ４５０，Ｘ５１４，及びＸ５１８，を含み、かつポリペプチドは更に：Ｘ２９，Ｘ４７，Ｘ８６，Ｘ９４，Ｘ１３１，Ｘ１３４，Ｘ１５６，Ｘ１６２，Ｘ１６９，Ｘ１７８，Ｘ１７９，Ｘ２３１，Ｘ２４２，Ｘ３６９，Ｘ４１４，及びＸ４２１からなる群から選択される残基の１つ以上に置換を含み、ここで、ポリペプチドを発現している宿主細胞の増殖性は、同様の増殖条件下で配列番号１の野生型イソプレン合成酵素を発現している宿主細胞の増殖性と比較して、少なくとも５０％上昇している。一部の実施形態では、置換はＥ２９，Ｎ４７，Ｓ８６，Ｋ９４，Ｅ１３１，Ｋ１３４，Ｉ１５６，Ｖ１６２，Ｋ１６９，Ｋ１７８，Ｅ１７９，Ｓ２３１，Ｒ２４２，Ｆ３６９，Ｋ４１４，及びＱ４２１からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換はＥ２９Ｎ，Ｎ４７Ｖ，Ｓ８６Ｃ，Ｋ９４Ａ，Ｅ１３１Ｆ，Ｋ１３４Ｅ，Ｋ１３４Ｐ，Ｉ１５６Ｇ，Ｖ１６２Ｐ，Ｋ１６９Ｃ，Ｋ１７８Ｅ，Ｅ１７９Ｔ，Ｓ２３１Ｄ，Ｓ２３１Ｋ，Ｓ２３１Ｒ，Ｓ２３１Ｔ，Ｓ２３１Ｖ，Ｒ２４２Ｎ，Ｒ２４２Ｉ，Ｆ３６９Ｃ，Ｋ４１４Ｃ，Ｋ４１４Ｆ，Ｋ４１４Ｇ，Ｋ４１４Ｎ，及びＱ４２１Ｄからなる群から選択される。
他の態様では、本発明は、イソプレン合成酵素活性の改良された単離ポリペプチドを提供し、ポリペプチドは、配列番号１と対応する残基番号を付した次の不変の残基：Ｘ４，Ｘ９，Ｘ２４３，Ｘ２５８，Ｘ２５９，Ｘ２６２，Ｘ２６６，Ｘ２８０，Ｘ２９４，Ｘ２９５，Ｘ２９８，Ｘ３０５，Ｘ３８７，Ｘ３９６，Ｘ３９７，Ｘ４３５，Ｘ４３９，Ｘ４４６，Ｘ４４９，Ｘ４５０，Ｘ５１４，及びＸ５１８，を含み、かつポリペプチドは更に：Ｘ３０，Ｘ８４，Ｘ１３４，Ｘ１４０，Ｘ１４３，Ｘ１６３，Ｘ１６６，Ｘ１６９，Ｘ１７０及びＸ１７２からなる群から選択される残基の１つ以上に置換を含み、ここで、ポリペプチドは、配列番号１と比較して少なくとも２０％上昇しており、かつこのポリペプチドを発現している宿主細胞の増殖性は、同様の増殖条件下で配列番号１の野生型イソプレン合成酵素を発現している宿主細胞の増殖性と比較して、少なくとも２０％上昇している。一部の実施形態では、置換は、Ｖ８４，Ｋ１３４，Ｉ１４０，Ｌ１４３，Ｆ１６３，Ｓ１６６，Ｋ１６９，Ｅ１７０及びＳ１７２からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は、Ｖ３０Ｋ，Ｖ８４Ｔ，Ｋ１３４Ｃ，Ｋ１３４Ｄ，Ｋ１３４Ｅ，Ｉ１４０Ｓ，Ｉ１４０Ｔ，Ｌ１４３Ｆ，Ｌ１４３Ｉ，Ｌ１４３Ｍ，Ｌ１４３Ｖ，Ｆ１６３Ｉ，Ｆ１６３Ｍ，Ｓ１６６Ｐ，Ｓ１６６Ｖ，Ｋ１６９Ｑ，Ｅ１７０Ｈ，Ｅ１７０Ｋ，及びＳ１７２Ｖからなる群から選択される。
他の態様では、本発明は、イソプレン合成酵素活性の改良された単離ポリペプチドを提供し、ポリペプチドは、（ｉ）Ｎ末端、（ｉｉ）残基１３４〜１７９のＮ端末ヘリックス領域（この残基番号は配列番号１（野生型ＭＥＡイソプレン合成酵素）と一致する）、あるいは（ｉｉｉ）Ｎ端末ヘリックス領域と相互作用する、Ｎ端末ヘリックス領域以外の他の残基、の１つ以上にて置換を含み、ここで、ポリペプチドは、配列番号１と比較して少なくとも２０％上昇している。一部の実施形態では、置換は：Ｘ３０，Ｘ８４，Ｘ１３４，Ｘ１４０，Ｘ１４３，Ｘ１６３，Ｘ１６６，Ｘ１６９，Ｘ１７０及びＸ１７２からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は：Ｖ８４，Ｋ１３４，Ｉ１４０，Ｌ１４３，Ｆ１６３，Ｓ１６６，Ｋ１６９，Ｅ１７０及びＳ１７２からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は：Ｖ３０Ｋ，Ｖ８４Ｔ，Ｋ１３４Ｃ，Ｋ１３４Ｄ，Ｋ１３４Ｅ，Ｉ１４０Ｓ，Ｉ１４０Ｔ，Ｌ１４３Ｆ，Ｌ１４３Ｉ，Ｌ１４３Ｍ，Ｌ１４３Ｖ，Ｆ１６３Ｉ，Ｆ１６３Ｍ，Ｓ１６６Ｐ，Ｓ１６６Ｖ，Ｋ１６９Ｑ，Ｅ１７０Ｈ，Ｅ１７０Ｋ，及びＳ１７２Ｖからなる群から選択される。
他の態様では、本発明は、イソプレン合成酵素活性の改良された単離ポリペプチドを提供し、ポリペプチドは、配列番号１と対応する：Ｘ２，Ｘ２２，Ｘ３６，Ｘ４３，Ｘ５８，Ｘ７１，Ｘ８９，Ｘ１１８，Ｘ１２０，Ｘ１５１，Ｘ１５３，Ｘ１６１，Ｘ２２８，Ｘ２３４，Ｘ２４７，Ｘ２５４，Ｘ２６８，Ｘ２８２，Ｘ２８８，Ｘ３３１，Ｘ３４８，Ｘ３７６，Ｘ３８０，Ｘ３８９，Ｘ３９１，Ｘ３９２，Ｘ４０９，Ｘ４３７，Ｘ４４３，Ｘ４４４，Ｘ４４７，Ｘ４４８，Ｘ４６０，Ｘ４６１，Ｘ４８１，Ｘ４８８，及びＸ５０２，からなる群から選択される残基の１つ以上に置換を含み、かつここで、ポリペプチドは、配列番号１の野生型イソプレン合成酵素と比較して、イソプレン合成酵素の比活性が少なくとも３０％上昇している。一部の実施形態では、置換はＥ２，Ｓ２２，Ｋ３６，Ｒ４３，Ｅ５８，Ｒ７１，Ｆ８９，Ａ１１８，Ｓ１２０，Ｌ１５１，Ｋ１６１，Ｍ２２８，Ｑ２３４，Ｖ２４７，Ｈ２５４，Ｖ２６８，Ｓ２８２，Ｓ２８８，Ｃ３３１，Ｋ３４８，Ｌ３７６，Ｓ３８０，Ｇ３８９，Ａ３９１，Ｗ３９２，Ｖ４０９，Ｃ４３７，Ｓ４４４，Ｉ４４７，Ａ４４８，Ｍ４６０，Ｒ４６１，Ｔ４８１，Ｅ４８８，及びＴ５０２からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は、Ｅ２Ｖ，Ｓ２２Ｋ，Ｓ２２Ｒ，Ｋ３６Ｄ，Ｋ３６Ｅ，Ｋ３６Ｈ，Ｋ３６Ｗ，Ｒ４３Ｅ，Ｅ５８Ｆ，Ｒ７１Ｉ，Ｆ８９Ｄ，Ｆ８９Ｅ，Ａ１１８Ｅ，Ａ１１８Ｐ，Ｓ１２０Ｍ，Ｓ１２０Ｑ，Ｌ１５１Ｆ，Ｌ１５１Ｙ，Ｇ１５３Ｐ，Ｋ１６１Ｃ，Ｍ２２８Ｙ，Ｑ２３４Ｒ，Ｖ２４７Ｉ，Ｖ２４７Ｌ，Ｖ２４７Ｍ，Ｈ２５４Ｃ，Ｖ２６８Ｉ，Ｓ２８２Ｈ，Ｓ２８２Ｗ，Ｓ２８８Ａ，Ｓ２８８Ｔ，Ｓ２８８Ｙ，Ｃ３３１Ｐ，Ｋ３４８Ｙ，Ｓ３８０Ｅ，Ｇ３８９Ｄ，Ａ３９１Ｇ，Ｗ３９２Ｃ，Ｗ３９２Ｆ，Ｗ３９２Ｍ，Ｗ３９２Ｓ，Ｗ３９２Ｖ，Ｗ３９２Ｙ，Ｖ４０９Ｔ，Ｃ４３７Ｌ，Ｃ４３７Ｍ，Ｓ４４４Ｄ，Ｓ４４４Ｅ，Ｉ４４７Ｔ，Ｉ４４７Ｖ，Ａ４４８Ｖ，Ｍ４６０Ａ，Ｒ４６１Ａ，Ｔ４８１Ｙ，Ｅ４８８Ｌ，Ｔ５０２Ｆ及びＴ５０２Ｍからなる群から選択される。
他の態様では、本発明は、イソプレン合成酵素活性の改良された単離ポリペプチドを提供し、ポリペプチドは、Ｎ末端領域、Ｎ端末ヘリックス領域、表面ループ、表面、活性部位、二量体界面、基質捕捉ループ、又は埋没領域中の１つ以上の残基にて１つ以上の置換を含み、かつここでポリペプチドは、配列番号１と比較して少なくとも４０％上昇している。一部の実施形態では、Ｎ末端領域における置換は：Ｘ１８，Ｘ３６，及びＸ８２からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は、Ｙ１８，Ｋ３６，及びＲ８２からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は：Ｙ１８Ｅ，Ｙ１８Ｄ，Ｙ１８Ｓ，Ｋ３６Ｐ，及びＲ８２Ｑからなる群から選択される。一部の実施形態では、Ｎ末端ヘリックス領域における置換は：Ｘ１３７，Ｘ１４３，Ｘ１６３，及びＸ１７０からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は：Ｉ１３７，Ｌ１４３，Ｆ１６３，及びＥ１７０からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は：Ｉ１３７Ｃ，Ｌ１４３Ｎ，Ｆ１６３Ｉ，Ｆ１６３Ｑ，及びＥ１７０Ｇからなる群から選択される。一部の実施形態では、表面ループにおける置換は：Ｘ８７，Ｘ４０９，及びＸ５４２からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は：Ｇ８７，Ｖ４０９，及びＦ５４２からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は：Ｇ８７Ｓ，Ｇ８７Ｎ，Ｇ８７Ｒ，Ｖ４０９Ｓ，及びＦ５４２Ｎからなる群から選択される。一部の実施形態では、表面における置換は残基Ｘ２５１の置換である。一部の実施形態では、置換は残基Ｔ２５１の置換である。一部の実施形態では、置換はＴ２５１Ｅである。一部の実施形態では、二量体界面における置換は残基Ｘ２４２の置換である。一部の実施形態では、置換は残基Ｒ２４２の置換である。一部の実施形態では、置換はＲ２４２Ｔの置換である。一部の実施形態では、埋没領域における置換は：Ｘ４３７，Ｘ４６０，及びＸ４６１からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は：Ｃ４３７，Ｍ４６０，及びＲ４６１からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は：Ｃ４３７Ｍ，Ｃ４３７Ｋ，Ｍ４６０Ｑ，Ｍ４６０Ｇ，Ｍ４６０Ａ，Ｒ４６１Ｄ，Ｒ４６１Ｓ，Ｒ４６１Ｔ，及びＲ４６１からなる群から選択される。一部の実施形態では、基質捕捉ループにおける置換は：Ｘ４４３，Ｘ４４４，及びＸ４４７からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は：Ｓ４４４，及びＩ４４７からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は：Ｓ４４４Ｐ，Ｉ４４７Ｑ，Ｉ４４７Ｔ，Ｉ４４７Ｍ，Ｉ４４７Ｅ，Ｉ４４７Ｓ，及びＩ４４７Ｒからなる群から選択される。
他の態様では、本発明は、イソプレン合成酵素活性を有し、かつ宿主細胞で発現させた場合に宿主細胞の増殖活性が上昇する単離ポリペプチドを提供し、ここで、ポリペプチドは、配列番号１と対応する：Ｘ１３４，Ｘ１３８，Ｘ１４３，Ｘ１５６，Ｘ１５９，Ｘ１６３，Ｘ１６６，Ｘ１６７，Ｘ１７０，Ｘ４１４，Ｘ４２１，及びＸ４９１からなる群から選択される残基の１つ以上に置換を含み、かつここで、ポリペプチドを発現している宿主細胞の増殖性は、同様の増殖条件下で配列番号１の野生型イソプレン合成酵素を発現している宿主細胞の増殖性と比較して、少なくとも５０％上昇している。一部の実施形態では、置換はＫ１３４，Ｋ１３８，Ｌ１４３，Ｉ１５６，Ｅ１５９，Ｆ１６３，Ｓ１６６，Ｈ１６７，Ｅ１７０，Ｋ４１４，及びＱ４２１からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換はＫ１３４Ｐ，Ｋ１３８Ｃ，Ｌ１４３Ｆ，Ｌ１４３Ｖ，Ｉ１５６Ｇ，Ｅ１５９Ｇ，Ｅ１５９Ｑ，Ｆ１６３Ｃ，Ｆ１６３Ｅ，Ｆ１６３Ｑ，Ｆ１６３Ｖ，Ｆ１６３Ｙ，Ｓ１６６Ｃ，Ｓ１６６Ｄ，Ｓ１６６Ｇ，Ｓ１６６Ｐ，Ｓ１６６Ｖ，Ｈ１６７Ｍ，Ｅ１７０Ｇ，Ｅ１７０Ｈ，Ｅ１７０Ｋ，Ｅ１７０Ｎ，Ｅ１７０Ｒ，Ｅ１７０Ｓ，Ｅ１７０Ｗ，Ｋ４１４Ｆ，Ｋ４１４Ｇ，Ｋ４１４Ｎ，Ｋ４１４Ｐ，及びＱ４２１Ｒからなる群から選択される。
他の態様では、本発明は、イソプレン合成酵素活性を有し、かつ宿主細胞で発現させた場合に宿主細胞の増殖活性が上昇する単離ポリペプチドを提供し、ここで、ポリペプチドは、配列番号１と対応する：Ｘ２９，Ｘ４７，Ｘ８６，Ｘ９４，Ｘ１３１，Ｘ１３４，Ｘ１５６，Ｘ１６２，Ｘ１６９，Ｘ１７８，Ｘ１７９，Ｘ２３１，Ｘ２４２，Ｘ３６９，Ｘ４１４，及びＸ４２１からなる群から選択される残基の１つ以上に置換を含み、かつここで、ポリペプチドを発現している宿主細胞の増殖性は、同様の増殖条件下で配列番号１の野生型イソプレン合成酵素を発現している宿主細胞の増殖性と比較して、少なくとも５０％上昇している。一部の実施形態では、置換はＥ２９，Ｎ４７，Ｓ８６，Ｋ９４，Ｅ１３１，Ｋ１３４，Ｉ１５６，Ｖ１６２，Ｋ１６９，Ｋ１７８，Ｅ１７９，Ｓ２３１，Ｒ２４２，Ｆ３６９，Ｋ４１４，及びＱ４２１からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換はＥ２９Ｎ，Ｎ４７Ｖ，Ｓ８６Ｃ，Ｋ９４Ａ，Ｅ１３１Ｆ，Ｋ１３４Ｅ，Ｋ１３４Ｐ，Ｉ１５６Ｇ，Ｖ１６２Ｐ，Ｋ１６９Ｃ，Ｋ１７８Ｅ，Ｅ１７９Ｔ，Ｓ２３１Ｄ，Ｓ２３１Ｋ，Ｓ２３１Ｒ，Ｓ２３１Ｔ，Ｓ２３１Ｖ，Ｒ２４２Ｎ，Ｒ２４２Ｉ，Ｆ３６９Ｃ，Ｋ４１４Ｃ，Ｋ４１４Ｆ，Ｋ４１４Ｇ，Ｋ４１４Ｎ，及びＱ４２１Ｄからなる群から選択される。
他の態様では、本発明は、イソプレン合成酵素活性を有し、かつ宿主細胞で発現させた場合に宿主細胞の増殖活性が上昇する単離ポリペプチドを提供し、ここで、ポリペプチドは、配列番号１と対応する：Ｘ５０，Ｘ８１，Ｘ１３４，Ｘ１３７，Ｘ１４３，Ｘ１５６，Ｘ１５９，Ｘ１６６，Ｘ１６７，Ｘ１６９，Ｘ１７０，及びＸ４１４からなる群から選択される残基の１つ以上に置換を含み、かつここで、ポリペプチドを発現している宿主細胞の増殖性は、同様の増殖条件下で配列番号１の野生型イソプレン合成酵素を発現している宿主細胞の増殖性と比較して、少なくとも３０％上昇している。一部の実施形態では、置換はＫ５０，Ｄ８１，Ｋ１３４，Ｉ１３７，Ｌ１４３，Ｉ１５６，Ｅ１５９，Ｓ１６６，Ｈ１６７，Ｋ１６９，Ｅ１７０，及びＫ４１４からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換Ｋ５０Ｓ，Ｄ８１Ｆ，Ｋ１３４Ｅ，Ｋ１３４Ｐ，Ｉ１３７Ｎ，Ｌ１４３Ｖ，Ｉ１５６Ｇ，Ｅ１５９Ｄ，Ｅ１５９Ｇ，Ｅ１５９Ｑ，Ｓ１６６Ｃ，Ｓ１６６Ｗ，Ｈ１６７Ｍ，Ｈ１６７Ｎ，Ｋ１６９Ｃ，Ｅ１７０Ｈ，Ｅ１７０Ｋ，Ｅ１７０Ｗ，Ｋ４１４Ｃ，Ｋ４１４Ｆ，Ｋ４１４Ｇ，Ｋ４１４Ｎ，及びＫ４１４Ｐからなる群から選択される。
他の態様では、本発明は、イソプレン合成酵素活性が改良されており、かつ宿主細胞で発現させた場合に宿主細胞の増殖活性が上昇する単離ポリペプチドを提供し、ここで、ポリペプチドは、配列番号１と対応する：Ｘ３０，Ｘ８４，Ｘ１３４，Ｘ１４０，Ｘ１４３，Ｘ１６３，Ｘ１６６，Ｘ１６９，Ｘ１７０及びＸ１７２からなる群から選択される残基の１つ以上に置換を含み、ここで、ポリペプチドは、配列番号１と比較して少なくとも２０％上昇しており、かつこのポリペプチドを発現している宿主細胞の増殖性は、同様の増殖条件下で配列番号１の野生型イソプレン合成酵素を発現している宿主細胞の増殖性と比較して、少なくとも２０％上昇している。一部の実施形態では、置換は、Ｖ８４，Ｋ１３４，Ｉ１４０，Ｌ１４３，Ｆ１６３，Ｓ１６６，Ｋ１６９，Ｅ１７０及びＳ１７２からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は：Ｖ３０Ｋ，Ｖ８４Ｔ，Ｋ１３４Ｃ，Ｋ１３４Ｄ，Ｋ１３４Ｅ，Ｉ１４０Ｓ，Ｉ１４０Ｔ，Ｌ１４３Ｆ，Ｌ１４３Ｉ，Ｌ１４３Ｍ，Ｌ１４３Ｖ，Ｆ１６３Ｉ，Ｆ１６３Ｍ，Ｓ１６６Ｐ，Ｓ１６６Ｖ，Ｋ１６９Ｑ，Ｅ１７０Ｈ，Ｅ１７０Ｋ，及びＳ１７２Ｖからなる群から選択される。
他の態様では、本発明は、イソプレン合成酵素特性の改良された単離ポリペプチドを提供し、ここで、ポリペプチドは、配列番号１と対応する：Ｘ２２，Ｘ７１，Ｘ８７，Ｘ１６２，Ｘ２４２，Ｘ２８８，Ｘ４０９，Ｘ４１４，Ｘ４４３，Ｘ４４４，Ｘ４６０，及びＸ５０２からなる群から選択される残基にて２つ以上の置換を含み、ここで、残基の付番は配列番号１と対応し、ポリペプチドは、配列番号１の野生型イソプレン合成酵素と比較して、イソプレン合成酵素の比活性が少なくとも１６０％上昇している。一部の実施形態では、置換は、Ｓ２２，Ｒ７１，Ｇ８７，Ｖ１６２，Ｒ２４２，Ｓ２８８，Ｖ４０９，Ｋ４１４，Ｓ４４４，Ｍ４６０，及びＴ５０２からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換はＳ２２Ｒ，Ｒ７１Ｉ又はＲ，Ｇ８７Ｒ，Ｖ１６２Ｐ，Ｒ２４２Ｎ，Ｓ２８８Ｃ，Ｖ４０９Ｔ，ＫＸ４１４Ｆ，Ｓ４４４Ｄ，Ｍ４６０Ａ，及びＴ５０２Ｍからなる群から選択される。一部の実施形態では、置換は：ａ）Ｓ２２Ｒ，Ｒ７１Ｉ，Ｓ２８８Ｃ，Ｓ４４４Ｄ，Ｍ４６０Ａ，及びＴ５０２Ｍ；ｂ）Ｇ８７Ｒ，Ｖ１６２Ｐ，Ｒ２４２Ｎ，Ｓ２８８Ｃ，Ｖ４０９Ｔ，Ｋ４１４Ｒ，及びＳ４４４Ｄ，又はｃ）Ｇ８７Ｒ，Ｖ１６２Ｐ，Ｒ２４２Ｎ，Ｓ２８８Ｃ，Ｖ４０９Ｔ，及びＫ４１４Ｆからなる群から選択される。
他の態様では、本発明は、イソプレン合成酵素特性の改良された単離ポリペプチドを提供し、ポリペプチドは、配列番号１と対応する：Ｘ４７，Ｘ８７，Ｘ１５６，Ｘ１６２，Ｘ１７０，Ｘ２３１，Ｘ２４２，Ｘ２８８，Ｘ４０９，Ｘ４１４，及びＸ４４７からなる群から選択される残基の２つ以上に置換を含み、ここで、残基の付番は配列番号１と対応し、ポリペプチドは、配列番号１の野生型イソプレン合成酵素と比較して、イソプレン合成酵素の比活性が少なくとも３０％上昇しており、かつこのポリペプチドを発現している宿主細胞の増殖性は、同様の増殖条件下で配列番号１の野生型イソプレン合成酵素を発現している宿主細胞の増殖性と比較して、少なくとも３０％上昇している。一部の実施形態では、置換は：Ｎ４７，Ｇ８７，Ｉ１５６，Ｖ１６２，Ｅ１７０，Ｓ２３１，Ｒ２４２，Ｓ２８８，Ｖ４０９，Ｋ４１４，及びＩ４４７からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は：Ｎ４７Ｖ，Ｇ８７Ｒ，Ｉ１５６Ｇ，Ｖ１６２Ｐ，Ｅ１７０Ｈ，Ｓ２３１Ｔ，Ｒ２４２Ｎ，Ｓ２８８Ｃ，Ｓ２８８Ｔ，Ｖ４０９Ｔ，及びＫ４１４Ｆからなる群から選択される。一部の実施形態では、置換は：Ｎ４７Ｖ，Ｉ１５６Ｇ，Ｅ１７０Ｈ，Ｓ２３１Ｔ，Ｓ２８８Ｔ，及びＫ４１４Ｆからなる群から選択される。
他の態様では、本発明は、イソプレン合成酵素特性の改良された単離ポリペプチドを提供し、ポリペプチドは、配列番号１と対応する：Ｘ２，Ｘ１８，Ｘ１９，Ｘ２１，Ｘ２４，Ｘ２６，Ｘ２７，Ｘ２９，Ｘ３７，Ｘ４２，Ｘ４７，Ｘ４８，Ｘ４９，Ｘ５６，Ｘ８１，Ｘ８２，Ｘ８４，Ｘ９３，Ｘ９４，Ｘ９５，Ｘ１２０，Ｘ１２３，Ｘ１２６，Ｘ１３１，Ｘ１３２，Ｘ１３４，Ｘ１３７，Ｘ１３９，Ｘ１４３，Ｘ１５１，Ｘ１５５，Ｘ１６６，Ｘ１６７，Ｘ１６９，Ｘ１７０，Ｘ１７１，Ｘ１７５，Ｘ１７９，Ｘ１８０，Ｘ１９７，Ｘ２２９，Ｘ２３１，Ｘ２４０，Ｘ２４２，Ｘ２４５，Ｘ２４６，Ｘ２４７，Ｘ２５１，Ｘ２７１，Ｘ２８２，Ｘ３０６，Ｘ３１７，Ｘ３１９，Ｘ３６９，Ｘ３７１，Ｘ３７６，Ｘ３７９，Ｘ３８０，Ｘ３８９，Ｘ３９２，Ｘ３９３，Ｘ４０８，Ｘ４０９，Ｘ４２１，Ｘ４２２，Ｘ４２３，Ｘ４２９，Ｘ４３７，Ｘ４４３，Ｘ４４４，Ｘ４４７，Ｘ４５５，Ｘ４５８，Ｘ４６１，Ｘ４６４，Ｘ４６６，Ｘ４７０，Ｘ４７３，Ｘ５００，Ｘ５０２，Ｘ５０６，Ｘ５１３，Ｘ５２５及びＸ５３１からなる群から選択される残基の１つ以上に置換を含み、（ａ）配列番号１のポリペプチドに対する比活性及び発現性の最小性能指数（ＰＩ）は０．９以上であり、かつ配列番号１のポリペプチドに対する比活性又は増殖性のＰＩのうち少なくとも１つは１．０以上であり、（ｂ）配列番号１のポリペプチドに対する比活性及び発現性の最小性能指数（ＰＩ）は０．８以上であり、かつ配列番号１のポリペプチドに対する比活性又は増殖性のＰＩのうち少なくとも１つは１．２以上であり、並びに（ｃ）配列番号１のポリペプチドに対する比活性及び発現性の最小性能指数（ＰＩ）は０．５以上であり、かつ配列番号１のポリペプチドに対する比活性又は増殖性のＰＩのうち少なくとも１つは１．５以上である。
一部の実施形態では、置換はＥ２，Ｙ１８，Ｌ１９，Ｓ２１，Ｔ２４，Ｅ２６，Ｓ２７，Ｅ２９，Ｋ３７，Ｖ４２，Ｎ４７，Ｎ４８，Ｅ４９，Ｌ５６，Ｄ８１，Ｒ８２，Ｖ８４，Ｔ９３，Ｋ９４，Ｔ９５，Ｓ１２０，Ｋ１２３，Ｎ１２６，Ｅ１３１，Ｎ１３２，Ｋ１３４，Ｉ１３７，Ａ１３９，Ｌ１４３，Ｌ１５１，Ｎ１５５，Ｓ１６６，Ｈ１６７，Ｋ１６９，Ｅ１７０，Ｌ１７１，Ｋ１７５，Ｅ１７９，Ｌ１８０，Ｑ１９７，Ｉ２２９，Ｓ２３１，Ｔ２４０，Ｒ２４２，Ｒ２４５，Ｒ２４６，Ｖ２４７，Ｔ２５１，Ａ２７１，Ｓ２８２，Ｌ３０６，Ｄ３１７，Ｎ３１９，Ｆ３６９，Ｑ３７１，Ｌ３７６，Ｋ３７９，Ｓ３８０，Ｇ３８９，Ｗ３９２，Ｋ３９３，Ｖ４０８，Ｖ４０９，Ｑ４２１，Ｋ４２２，Ｙ４２３，Ｒ４２９，Ｃ４３７，Ｓ４４４，Ｉ４４７，Ｓ４５５，Ｃ４５８，Ｒ４６１，Ｇ４６４，Ｓ４６６，Ａ４７０，Ｓ４７３，Ｖ５００，Ｔ５０２，Ｌ５０６，Ｔ５１３，Ｅ５２５及びＶ５３１からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は、Ｅ２Ａ又はＫ又はＰ、Ｙ１８Ｄ又はＥ又はＫ又はＳ、Ｌ１９Ｙ、Ｓ２１Ｗ、Ｔ２４Ｌ又はＶ、Ｅ２６Ｃ、Ｓ２７Ｄ又はＮ、Ｅ２９Ｎ、Ｋ３７Ｃ又はＤ又はＰ又はＱ又はＳ、Ｖ４２Ｍ、Ｎ４７Ｄ又はＳ、Ｎ４８Ｄ又はＧ又はＴ、Ｅ４９Ｌ又はＶ、Ｌ５６Ｅ又はＦ又はＧ又はＩ又はＫ又はＴ又はＶ又はＹ、Ｄ８１Ｑ、Ｒ８２Ｎ又はＴ又はＶ又はＹ、Ｖ８４Ｍ、Ｔ９３Ｃ又はＦ又はＲ又はＳ、Ｋ９４Ｇ又はＰ、Ｔ９５Ｄ又はＦ又はＧ又はＩ又はＮ又はＷ、Ｓ１２０Ｃ又はＧ又はＭ又はＱ、Ｋ１２３Ｖ、Ｎ１２６Ｅ、Ｅ１３１Ｈ又はＫ又はＬ又はＭ又はＴ又はＷ又はＹ、Ｎ１３２Ｉ又はＰ、Ｋ１３４Ａ、Ｉ１３７Ｔ、Ａ１３９Ｃ又はＱ、Ｌ１４３Ｃ又はＤ又はＥ又はＨ又はＫ又はＭ又はＱ又はＴ又はＶ又はＹ、Ｌ１５１Ａ又はＦ、Ｎ１５５Ａ又はＣ又はＧ又はＨ又はＱ又はＲ又はＳ又はＷ、Ｓ１６６Ｎ、Ｈ１６７Ｆ又はＩ又はＮ又はＱ又はＶ、Ｋ１６９Ａ又はＣ又はＨ又はＮ又はＱ又はＶ、Ｅ１７０Ｌ又はＳ又はＷ又はＹ、Ｌ１７１Ａ又はＮ又はＱ又はＴ又はＶ又はＹ、Ｋ１７５Ｃ又はＦ又はＩ又はＱ又はＲ、Ｅ１７９Ｄ、Ｌ１８０Ａ又はＩ、Ｑ１９７Ｃ又はＤ又はＮ、Ｉ２２９Ｃ、Ｓ２３１Ａ、Ｔ２４０Ｃ、Ｒ２４２Ｇ、Ｒ２４５Ｃ又はＫ又はＭ又はＱ又はＴ又はＶ、Ｒ２４６Ｎ、Ｖ２４７Ｌ又はＭ、Ｔ２５１Ｄ又はＥ又はＮ又はＰ又はＱ又はＳ、Ａ２７１Ｔ、Ｓ２８２Ｙ、Ｌ３０６Ｃ、Ｄ３１７Ｎ、Ｎ３１９Ｍ、Ｆ３６９Ｃ又はＤ又はＥ又はＧ又はＳ、Ｑ３７１Ｆ、Ｌ３７６Ｉ又はＭ、Ｋ３７９Ｇ又はＱ、Ｓ３８０Ｅ、Ｇ３８９Ａ又はＤ又はＥ又はＫ又はＮ又はＱ又はＳ又はＶ、Ｗ３９２Ｙ、Ｋ３９３Ｃ又はＩ又はＴ又はＶ、Ｖ４０８Ｔ、Ｖ４０９Ｔ、Ｑ４２１Ｈ、Ｋ４２２Ｄ、Ｙ４２３Ｎ又はＳ、Ｒ４２９Ｅ又はＦ又はＱ，Ｃ４３７Ｍ、Ｓ４４４Ｄ又はＥ、Ｉ４４７Ｔ、Ｓ４５５Ａ、Ｃ４５８Ｔ、Ｒ４６１Ａ，Ｇ４６４Ｃ又はＭ又はＮ又はＱ又はＳ、Ｓ４６６Ｄ、Ａ４７０Ｉ又はＬ、Ｓ４７３Ｉ、Ｖ５００Ａ又はＣ、Ｔ５０２Ｍ，Ｌ５０６Ｍ，Ｔ５１３Ｃ又はＧ又はＫ又はＮ、Ｅ５２５Ｆ又はＲ、Ｖ５３１Ｅ又はＨ又はＫ又はＱ又はＲ又はＳからなる群から選択される。
他の態様では、本発明は、イソプレン合成酵素特性の改良された単離ポリペプチドを提供し、ポリペプチドは、配列番号１と対応する：Ｘ２，Ｘ６，Ｘ１８，Ｘ２０，Ｘ２２，Ｘ２３，Ｘ２４，Ｘ２５，Ｘ２６，Ｘ２７，Ｘ２８，Ｘ２９，Ｘ３０，Ｘ３１，Ｘ３２，Ｘ３６，Ｘ３７，Ｘ４２，Ｘ４４，Ｘ４７，Ｘ４８，Ｘ４９，Ｘ５０，Ｘ５３，Ｘ５４，Ｘ５５，Ｘ５６，Ｘ５８，Ｘ５９，Ｘ６８，Ｘ７１，Ｘ７４，Ｘ７７，Ｘ７８，Ｘ７９，Ｘ８１，Ｘ８２，Ｘ８３，Ｘ８４，Ｘ８６，Ｘ８７，Ｘ９１，Ｘ９３，Ｘ９４，Ｘ９５，Ｘ９７，Ｘ９８，Ｘ９９，Ｘ１０９，Ｘ１１５，Ｘ１１６，Ｘ１１７，Ｘ１１８，Ｘ１２０，Ｘ１２３，Ｘ１２５，Ｘ１２６，Ｘ１２７，Ｘ１２８，Ｘ１３０，Ｘ１３１，Ｘ１３２，Ｘ１３３，Ｘ１３４，Ｘ１３６，Ｘ１３７，Ｘ１３８，Ｘ１３９，Ｘ１４０，Ｘ１４３，Ｘ１５１，Ｘ１５３，Ｘ１５５，Ｘ１５６，Ｘ１５９，Ｘ１６０，Ｘ１６１，Ｘ１６２，Ｘ１６３，Ｘ１６４，Ｘ１６６，Ｘ１６７，Ｘ１６９，Ｘ１７０，Ｘ１７１，Ｘ１７２，Ｘ１７５，Ｘ１７６，Ｘ１７７，Ｘ１７８，Ｘ１７９，Ｘ１８０，Ｘ１８１，Ｘ１８２，Ｘ１９０，Ｘ１９４，Ｘ１９７，Ｘ２０４，Ｘ２１１，Ｘ２１５，Ｘ２１７，Ｘ２１９，Ｘ２２１，Ｘ２２８，Ｘ２２９，Ｘ２３１，Ｘ２３２，Ｘ２３５，Ｘ２４１，Ｘ２４２，Ｘ２４５，Ｘ２４６，Ｘ２４７，Ｘ２５１，Ｘ２５４，Ｘ２７１，Ｘ２７２，Ｘ２７８，Ｘ２７９，Ｘ２８２，Ｘ２９６，Ｘ３０２，Ｘ３１７，Ｘ３１９，Ｘ３２０，Ｘ３２７，Ｘ３３１，Ｘ３４８，Ｘ３５１，Ｘ３５７，Ｘ３６１，Ｘ３６４，Ｘ３６５，Ｘ３６８，Ｘ３６９，Ｘ３７０，Ｘ３７１，Ｘ３７３，Ｘ３７７，Ｘ３８０，Ｘ３８３，Ｘ３８６，Ｘ３８９，Ｘ３９２，Ｘ３９３，Ｘ４０７，Ｘ４０８，Ｘ４０９，Ｘ４１０，Ｘ４１１，Ｘ４１４，Ｘ４２２，Ｘ４２３，Ｘ４２４，Ｘ４２８，Ｘ４２９，Ｘ４３２，Ｘ４３６，Ｘ４３７，Ｘ４４０，Ｘ４４３，Ｘ４４４，Ｘ４４７，Ｘ４４８，Ｘ４５７，Ｘ４６０，Ｘ４６１，Ｘ４６２，Ｘ４６３，Ｘ４６４，Ｘ４６５，Ｘ４６６，Ｘ４６８，Ｘ４７０，Ｘ４７１，Ｘ４７２，Ｘ４７３，Ｘ４７５，Ｘ４８０，Ｘ４９０，Ｘ４９１，Ｘ４９２，Ｘ４９４，Ｘ４９６，Ｘ５００，Ｘ５０１，Ｘ５０２，Ｘ５０３，Ｘ５１０，Ｘ５１３，Ｘ５１５，Ｘ５１９，Ｘ５２５，Ｘ５３１，Ｘ５３６，Ｘ５３７，Ｘ５４０，Ｘ５４１，Ｘ５４２，及びＸ５４４からなる群から選択される残基の１つ以上に置換を含み、（ａ）配列番号１のポリペプチドに対する比活性及び発現性の最小性能指数は０．９以上であり、かつ配列番号１のポリペプチドに対する比活性又は増殖性のＰＩのうち少なくとも１つは１．０以上であり、（ｂ）配列番号１のポリペプチドに対する比活性及び発現性の最小性能指数（ＰＩ）は０．８以上であり、かつ配列番号１のポリペプチドに対する比活性又は増殖性のＰＩのうち少なくとも１つは１．２以上である。一部の実施形態では、置換は、Ｅ２，Ｓ６，Ｙ１８，Ｌ２０，Ｓ２２，Ｄ２３，Ｔ２４，Ｄ２５，Ｅ２６，Ｓ２７，Ｉ２８，Ｅ２９，Ｙ３１，Ｋ３２，Ｋ３６，Ｋ３７，Ｖ４２，Ｒ４４，Ｎ４７，Ｎ４８，Ｅ４９，Ｋ５０，Ｆ５３，Ｌ５４，Ｔ５５，Ｌ５６，Ｅ５８，Ｌ５９，Ｌ６８，Ｒ７１，Ｓ７４，Ｒ７７，Ｇ７８，Ａ７９，Ｄ８１，Ｒ８２，Ｆ８３，Ｖ８４，Ｓ８６，Ｇ８７，Ａ９１，Ｔ９３，Ｋ９４，Ｔ９５，Ｌ９７，Ｈ９８，Ｇ９９，Ｑ１０９，Ｓ１１５，Ｑ１１６，Ｅ１１７，Ａ１１８，Ｓ１２０，Ｋ１２３，Ｑ１２５，Ｎ１２６，Ｇ１２７，Ｎ１２８，Ｌ１３０，Ｅ１３１，Ｎ１３２，Ｌ１３３，Ｋ１３４，Ｄ１３６，Ｉ１３７，Ｋ１３８，Ａ１３９，Ｉ１４０，Ｌ１４３，Ｌ１５１，Ｎ１５５，Ｉ１５６，Ｅ１５９，Ａ１６０，Ｋ１６１，Ｖ１６２，Ｆ１６３，Ａ１６４，Ｓ１６６，Ｈ１６７，Ｋ１６９，Ｅ１７０，Ｌ１７１，Ｓ１７２，Ｋ１７５，Ｉ１７６，Ｇ１７７，Ｋ１７８，Ｅ１７９，Ｌ１８０，Ａ１８１，Ｅ１８２，Ｌ１９０，Ｒ１９４，Ｑ１９７，Ｓ２０４，Ｋ２１１，Ｎ２１５，Ｖ２１７，Ｌ２１９，Ｌ２２１，Ｍ２２８，Ｉ２２９，Ｓ２３１，Ｖ２３２，Ｒ２３５，Ｓ２４１，Ｒ２４２，Ｒ２４５，Ｒ２４６，Ｖ２４７，Ｔ２５１，Ｈ２５４，Ａ２７１，Ｆ２７２，Ｄ２７８，Ｃ２７９，Ｓ２８２，Ｉ２９６，Ｔ３０２，Ｄ３１７，Ｎ３１９，Ａ３２０，Ｙ３２７，Ｃ３３１，Ｋ３４８，Ｇ３５１，Ｙ３５７，Ａ３６１，Ｄ３６４，Ｌ３６５，Ａ３６８，Ｆ３６９，Ｌ３７０，Ｑ３７１，Ａ３７３，Ｙ３７７，Ｓ３８０，Ｔ３８３，Ｄ３８６，Ｇ３８９，Ｗ３９２，Ｋ３９３，Ａ４０７，Ｖ４０８，Ｖ４０９，Ｑ４１０，Ｎ４１１，Ｋ４１４，Ｋ４２２，Ｙ４２３，Ｈ４２４，Ｓ４２８，Ｒ４２９，Ｈ４３２，Ｌ４３６，Ｃ４３７，Ｌ４４０，Ｓ４４４，Ｉ４４７，Ａ４４８，Ｓ４５７，Ｍ４６０，Ｒ４６１，Ｔ４６２，Ｋ４６３，Ｇ４６４，Ｉ４６５，Ｓ４６６，Ｅ４６８，Ａ４７０，Ｔ４７１，Ｅ４７２，Ｓ４７３，Ｍ４７５，Ｅ４８０，Ｌ４９０，Ｇ４９２，Ｌ４９４，Ａ４９６，Ｖ５００，Ｅ５０１，Ｔ５０２，Ａ５０３，Ｓ５１０，Ｔ５１３，Ｈ５１５，Ａ５１９，Ｅ５２５，Ｖ５３１，Ｔ５３６，Ｅ５３７，Ｌ５４０，Ｐ５４１，Ｆ５４２，及びＲ５４４からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は、Ｅ２Ｃ又はＤ又はＮ又はＴ又はＶ、Ｓ６Ｎ又はＴ、Ｙ１８Ａ又はＱ又はＲ、Ｌ２０Ｔ，Ｓ２２Ｑ，Ｄ２３Ｎ，Ｔ２４Ｃ，Ｄ２５Ｔ，Ｅ２６Ｄ又はＨ又はＫ又はＭ又はＲ又はＳ又はＶ、Ｓ２７Ａ又はＣ又はＧ又はＨ又はＩ又はＬ又はＭ又はＰ又はＱ、Ｉ２８Ｄ又はＮ、Ｅ２９Ｑ，Ｖ３０Ａ又はＤ又はＥ又はＭ又はＲ又はＴ、Ｙ３１Ｎ，Ｋ３２Ｅ，Ｋ３６Ａ又はＣ又はＤ又はＥ又はＭ又はＮ又はＰ又はＱ、Ｋ３７Ａ又はＥ又はＧ又はＨ又はＭ又はＮ又はＲ又はＴ、Ｖ４２Ｆ又はＩ、Ｒ４４Ｎ又はＱ、Ｎ４７Ａ又はＧ又はＨ又はＭ又はＱ又はＴ又はＷ、Ｎ４８Ｈ又はＩ又はＫ、Ｅ４９Ａ又はＣ、Ｋ５０Ａ又はＤ又はＥ又はＦ又はＨ又はＳ又はＹ、Ｆ５３Ｅ又はＨ又はＮ又はＰ又はＱ又はＶ、Ｌ５４Ｍ，Ｔ５５Ｃ又はＤ又はＥ、Ｌ５６Ｃ又はＮ、Ｅ５８Ｎ，Ｌ５９Ｈ又はＴ、Ｌ６８Ｉ，Ｒ７１Ｋ又はＭ、Ｓ７４Ｄ又はＥ又はＮ又はＹ、Ｒ７７Ｌ，Ｇ７８Ａ又はＤ又はＦ又はＬ又はＭ、Ａ７９Ｑ又はＴ、Ｄ８１Ａ又はＦ又はＧ又はＭ又はＲ又はＳ又はＴ又はＶ、Ｒ８２Ａ又はＥ又はＨ又はＩ又はＫ又はＭ又はＱ又はＳ、Ｆ８３Ｗ，Ｖ８４Ａ，Ｓ８６Ａ又はＤ又はＭ、Ｇ８７Ｄ又はＰ、Ａ９１Ｋ又はＷ、Ｔ９３Ａ又はＤ又はＥ又はＧ又はＬ又はＮ又はＰ又はＹ、Ｋ９４Ａ又はＤ又はＥ又はＨ又はＩ又はＬ又はＭ又はＮ又はＲ又はＳ又はＴ、Ｔ９５Ａ又はＥ又はＰ又はＱ又はＳ又はＶ又はＹ、Ｌ９７Ｆ，Ｈ９８Ａ又はＤ又はＦ又はＧ又はＩ又はＬ又はＭ又はＮ又はＱ、Ｇ９９Ｅ又はＦ又はＭ、Ｑ１０９Ｅ，Ｓ１１５Ａ，Ｑ１１６Ａ又はＣ又はＤ又はＥ又はＩ又はＰ、Ｅ１１７Ｃ又はＦ又はＬ又はＭ又はＶ、Ａ１１８Ｍ，Ｓ１２０Ｈ又はＴ又はＶ、Ｋ１２３Ｌ又はＴ、Ｑ１２５Ｅ又はＩ又はＹ、Ｎ１２６Ａ又はＣ又はＤ又はＭ又はＴ又はＶ、Ｇ１２７Ｃ，Ｎ１２８Ｃ又はＤ又はＰ又はＱ、Ｌ１３０Ｅ，Ｅ１３１Ａ又はＣ又はＰ又はＱ又はＳ又はＶ、Ｎ１３２Ｃ又はＤ又はＦ又はＨ又はＬ又はＲ又はＷ又はＹ、Ｌ１３３Ｄ，Ｋ１３４Ｅ又はＭ又はＱ又はＳ又はＴ又はＶ、Ｄ１３６Ｅ，Ｉ１３７Ｅ又はＨ又はＮ、Ｋ１３８Ｉ又はＮ、Ａ１３９Ｎ，Ｉ１４０Ｍ又はＷ、Ｌ１４３Ｓ，Ｌ１５１Ｃ又はＨ又はＩ、Ｇ１５３Ｃ，Ｎ１５５Ｉ又はＴ又はＶ又はＹ、Ｉ１５６Ｄ又はＮ又はＴ、Ｅ１５９Ｍ，Ａ１６０Ｉ，Ｋ１６１Ａ又はＣ又はＮ又はＱ、Ｖ１６２Ｓ，Ｆ１６３Ｅ又はＱ、Ａ１６４Ｔ，Ｓ１６６Ａ又はＤ又はＧ、Ｈ１６７Ａ又はＥ又はＧ又はＫ又はＭ又はＲ又はＳ又はＴ又はＷ、Ｋ１６９Ｄ又はＩ又はＭ又はＳ又はＴ、Ｅ１７０Ｈ又はＫ又はＭ又はＱ又はＴ又はＶ、Ｌ１７１Ｈ又はＫ又はＲ又はＳ、Ｓ１７２Ａ又はＣ、Ｋ１７５Ｓ，Ｉ１７６Ｍ，Ｇ１７７Ａ又はＣ、Ｋ１７８Ａ又はＦ又はＲ又はＳ又はＴ、Ｅ１７９Ａ又はＣ又はＬ又はＭ又はＮ、Ｌ１８０Ｃ又はＱ又はＴ、Ａ１８１Ｈ又はＱ又はＳ又はＶ、Ｅ１８２Ｓ，Ｌ１９０Ｉ又はＭ、Ｒ１９４Ｌ，Ｑ１９７Ｓ，Ｓ２０４Ｃ，Ｋ２１１Ａ又はＮ又はＱ、Ｎ２１５Ｃ又はＨ、Ｖ２１７Ｉ，Ｌ２１９Ｃ，Ｌ２２１Ｍ，Ｍ２２８Ｆ又はＹ、Ｉ２２９Ｖ，Ｓ２３１Ｋ又はＱ又はＴ、Ｖ２３２Ｉ，Ｒ２３５Ｋ，Ｓ２４１Ａ又はＭ又はＴ、Ｒ２４２Ａ又はＤ又はＥ又はＨ又はＩ又はＭ又はＮ又はＱ又はＳ又はＴ、Ｒ２４５Ｉ又はＬ、Ｒ２４６Ｄ又はＫ、Ｖ２４７Ｔ，Ｔ２５１Ａ又はＧ又はＫ又はＲ、Ｈ２５４Ｄ，Ａ２７１Ｃ又はＶ、Ｆ２７２Ｄ又はＧ又はＰ又はＷ、Ｄ２７８Ａ又はＥ又はＮ又はＱ又はＳ又はＴ又はＶ又はＷ、Ｃ２７９Ａ，Ｓ２８２Ａ又はＱ、Ｉ２９６Ｖ，Ｔ３０２Ｈ，Ｄ３１７Ｅ又はＱ、Ｎ３１９Ｆ，Ａ３２０Ｃ，Ｙ３２７Ｍ，Ｃ３３１Ｐ，Ｋ３４８Ｒ又はＹ、Ｇ３５１Ｄ又はＮ、Ｙ３５７Ｍ，Ａ３６１Ｔ，Ｄ３６４Ｅ又はＶ、Ｌ３６５Ｃ又はＭ、Ａ３６８Ｎ，Ｆ３６９Ｍ又はＮ又はＲ又はＴ又はＶ、Ｌ３７０Ｇ又はＱ、Ｑ３７１Ｃ又はＳ、Ａ３７３Ｇ，Ｙ３７７Ｗ，Ｓ３８０Ａ又はＣ又はＤ又はＱ又はＴ又はＶ、Ｔ３８３Ｓ，Ｄ３８６Ｅ又はＮ、Ｇ３８９Ｈ又はＩ、Ｗ３９２Ｉ又はＳ又はＴ又はＶ、Ｋ３９３Ｑ，Ａ４０７Ｇ，Ｖ４０８Ｉ，Ｖ４０９Ｈ又はＩ、Ｑ４１０Ｃ又はＤ又はＫ又はＬ又はＭ又はＴ、Ｎ４１１Ｇ，Ｋ４１４Ｅ又はＧ又はＬ又はＮ又はＰ、Ｋ４２２Ａ又はＮ又はＴ、Ｙ４２３Ｑ，Ｈ４２４Ｅ又はＰ又はＱ又はＶ、Ｓ４２８Ｅ又はＱ、Ｒ４２９Ｉ又はＬ又はＴ又はＷ又はＹ、Ｈ４３２Ｅ，Ｌ４３６Ｍ又はＹ、Ｃ４３７Ｋ又はＴ、Ｌ４４０Ｉ，Ｓ４４４Ｐ，Ｉ４４７Ａ又はＥ又はＭ又はＱ又はＳ、Ａ４４８Ｅ又はＭ又はＮ又はＰ又はＱ又はＶ、Ｓ４５７Ｎ又はＴ、Ｍ４６０Ｑ又はＲ又はＳ、Ｒ４６１Ｄ又はＥ又はＧ又はＱ又はＳ又はＴ、Ｔ４６２Ｑ，Ｋ４６３Ａ又はＤ又はＥ、Ｇ４６４Ｌ又はＲ、Ｉ４６５Ａ又はＣ又はＧ又はＳ又はＴ、Ｓ４６６Ｐ，Ｅ４６８Ｄ，Ａ４７０Ｍ，Ｔ４７１Ｅ又はＨ又はＱ、Ｅ４７２Ｄ又はＳ、Ｓ４７３Ｌ又はＶ、Ｍ４７５Ｔ，Ｅ４８０Ｎ，Ｌ４９０Ａ又はＤ又はＥ又はＦ又はＨ又はＭ、Ｇ４９２Ｃ，Ｌ４９４Ｄ，Ａ４９６Ｐ又はＴ、Ｖ５００Ｌ又はＭ、Ｅ５０１Ｄ，Ｔ５０２Ａ又はＣ又はＲ又はＶ、Ａ５０３Ｉ，Ｓ５１０Ｃ又はＶ、Ｔ５１３Ｖ，Ｈ５１５Ｎ，Ａ５１９Ｓ又はＴ、Ｅ５２５Ａ又はＣ又はＰ又はＱ又はＳ、Ｖ５３１Ａ又はＭ又はＴ、Ｔ５３６Ａ又はＦ又はＧ、Ｅ５３７Ｋ又はＴ、Ｌ５４０Ａ又はＰ、Ｐ５４１Ｍ，Ｆ５４２Ｐ，及びＲ５４４Ｃからなる群から選択される残基の置換である。
他の態様では、本発明は、イソプレン合成酵素特性の改良された単離ポリペプチドを提供し、ポリペプチドは、配列番号１と対応する：Ｘ２，Ｘ３，Ｘ１３，Ｘ１７，Ｘ１８，Ｘ１９，Ｘ２０，Ｘ２３，Ｘ２５，Ｘ２６，Ｘ２７，Ｘ２８，Ｘ２９，Ｘ３０，Ｘ３１，Ｘ３２，Ｘ３３，Ｘ３４，Ｘ３６，Ｘ３７，Ｘ４０，Ｘ４１，Ｘ４２，Ｘ４３，Ｘ４４，Ｘ４５，Ｘ４６，Ｘ４７，Ｘ４８，Ｘ４９，Ｘ５０，Ｘ５１，Ｘ５３，Ｘ５４，Ｘ５５，Ｘ５６，Ｘ５７，Ｘ５９，Ｘ６０，Ｘ６２，Ｘ７１，Ｘ７３，Ｘ７４，Ｘ７５，Ｘ７７，Ｘ７８，Ｘ７９，Ｘ８１，Ｘ８２，Ｘ８３，Ｘ８４，Ｘ８５，Ｘ８６，Ｘ８７，Ｘ８８，Ｘ８９，Ｘ９１，Ｘ９２，Ｘ９３，Ｘ９４，Ｘ９５，Ｘ９７，Ｘ９８，Ｘ９９，Ｘ１００，Ｘ１０１，Ｘ１０２，Ｘ１０３，Ｘ１０７，Ｘ１０９，Ｘ１１１，Ｘ１１３，Ｘ１１４，Ｘ１１５，Ｘ１１６，Ｘ１１７，Ｘ１１８，Ｘ１１９，Ｘ１２０，Ｘ１２１，Ｘ１２３，Ｘ１２４，Ｘ１２５，Ｘ１２７，Ｘ１２８，Ｘ１２９，Ｘ１３０，Ｘ１３１，Ｘ１３３，Ｘ１３４，Ｘ１３５，Ｘ１３６，Ｘ１３７，Ｘ１３８，Ｘ１３９，Ｘ１４０，Ｘ１４３，Ｘ１４６，Ｘ１５１，Ｘ１５２，Ｘ１５３，Ｘ１５５，Ｘ１５６，Ｘ１５８，Ｘ１６０，Ｘ１６１，Ｘ１６２，Ｘ１６３，Ｘ１６６，Ｘ１６７，Ｘ１６９，Ｘ１７０，Ｘ１７１，Ｘ１７２，Ｘ１７５，Ｘ１７６，Ｘ１７７，Ｘ１７８，Ｘ１７９，Ｘ１８０，Ｘ１８１，Ｘ１８２，Ｘ１８３，Ｘ１８５，Ｘ１８７，Ｘ１９３，Ｘ１９４，Ｘ１９６，Ｘ１９７，Ｘ２０４，Ｘ２１０，Ｘ２１１，Ｘ２１２，Ｘ２１５，Ｘ２１６，Ｘ２１７，Ｘ２１８，Ｘ２１９，Ｘ２２０，Ｘ２２２，Ｘ２２３，Ｘ２２４，Ｘ２２６，Ｘ２２８，Ｘ２２９，Ｘ２３１，Ｘ２３２，Ｘ２３５，Ｘ２４０，Ｘ２４１，Ｘ２４２，Ｘ２４６，Ｘ２５１，Ｘ２５３，Ｘ２６０，Ｘ２６８，Ｘ２７０，Ｘ２７１，Ｘ２７２，Ｘ２７５，Ｘ２７６，Ｘ２７８，Ｘ２８２，Ｘ３０７，Ｘ３１４，Ｘ３１５，Ｘ３１７，Ｘ３２０，Ｘ３２１，Ｘ３２３，Ｘ３２８，Ｘ３２９，Ｘ３３１，Ｘ３３２，Ｘ３３３，Ｘ３４３，Ｘ３４５，Ｘ３４６，Ｘ３５０，Ｘ３５１，Ｘ３５２，Ｘ３５６，Ｘ３５７，Ｘ３６０，Ｘ３６１，Ｘ３６３，Ｘ３６４，Ｘ３６６，Ｘ３６７，Ｘ３６８，Ｘ３６９，Ｘ３７０，Ｘ３７１，Ｘ３７８，Ｘ３７９，Ｘ３８０，Ｘ３８３，Ｘ３８６，Ｘ３８９，Ｘ３９０，Ｘ３９２，Ｘ３９３，Ｘ４０２，Ｘ４０５，Ｘ４０８，Ｘ４０９，Ｘ４１０，Ｘ４１３，Ｘ４１４，Ｘ４１８，Ｘ４２２，Ｘ４２３，Ｘ４２４，Ｘ４２５，Ｘ４２６，Ｘ４２８，Ｘ４２９，Ｘ４３１，Ｘ４３２，Ｘ４３７，Ｘ４４４，Ｘ４４７，Ｘ４４８，Ｘ４５７，Ｘ４６０，Ｘ４６１，Ｘ４６２，Ｘ４６３，Ｘ４６４，Ｘ４６６，Ｘ４６７，Ｘ４６８，Ｘ４６９，Ｘ４７１，Ｘ４７２，Ｘ４７５，Ｘ４８４，Ｘ４８９，Ｘ４９０，Ｘ４９１，Ｘ４９２，Ｘ４９３，Ｘ４９４，Ｘ４９７，Ｘ５００，Ｘ５０１，Ｘ５０２，Ｘ５０３，Ｘ５０４，Ｘ５０６，Ｘ５０９，Ｘ５１０，Ｘ５１１，Ｘ５１３，Ｘ５１５，Ｘ５１７，Ｘ５１９，Ｘ５２２，Ｘ５２８，Ｘ５２９，Ｘ５３１，Ｘ５３４，Ｘ５３５，Ｘ５３６，Ｘ５３７，Ｘ５３９，Ｘ５４０，Ｘ５４２，及びＸ５４４からなる群から選択される残基の１つ以上に置換を含み、（ａ）配列番号１のポリペプチドに対する比活性及び発現性の最小性能指数（ＰＩ）は０．９以上であり、かつ配列番号１のポリペプチドに対する比活性又は増殖性のＰＩのうち少なくとも１つは１．０以上であり、あるいは（ｂ）配列番号１のポリペプチドに対する比活性及び発現性の最小性能指数（ＰＩ）は０．８以上であり、かつ配列番号１のポリペプチドに対する比活性又は増殖性のＰＩのうち少なくとも１つは１．２以上であり、並びに（ｃ）配列番号１のポリペプチドに対する比活性及び発現性の最小性能指数（ＰＩ）は０．５以上であり、かつ配列番号１のポリペプチドに対する比活性又は増殖性のＰＩのうち少なくとも１つは１．５以上である。一部の実施形態では、置換は、Ｅ２，Ａ３，Ｓ１３，Ｄ１７，Ｙ１８，Ｌ１９，Ｌ２０，Ｄ２３，Ｄ２５，Ｅ２６，Ｓ２７，Ｉ２８，Ｅ２９，Ｙ３１，Ｋ３２，Ｄ３３，Ｋ３４，Ｋ３６，Ｋ３７，Ａ４０，Ｅ４１，Ｖ４２，Ｒ４３，Ｒ４４，Ｅ４５，Ｉ４６，Ｎ４７，Ｎ４８，Ｅ４９，Ｋ５０，Ａ５１，Ｆ５３，Ｌ５４，Ｔ５５，Ｌ５６，Ｌ５７，Ｌ５９，Ｉ６０，Ｎ６２，Ｒ７１，Ｅ７３，Ｓ７４，Ｄ７５，Ｒ７７，Ｇ７８，Ａ７９，Ｄ８１，Ｒ８２，Ｆ８３，Ｖ８４，Ｓ８５，Ｓ８６，Ｇ８７，Ｇ８８，Ｆ８９，Ａ９１，Ｖ９２，Ｔ９３，Ｋ９４，Ｔ９５，Ｌ９７，Ｈ９８，Ｇ９９，Ｔ１００，Ａ１０１，Ｌ１０２，Ｓ１０３，Ｌ１０７，Ｑ１０９，Ｇ１１１，Ｅ１１３，Ｖ１１４，Ｓ１１５，Ｑ１１６，Ｅ１１７，Ａ１１８，Ｆ１１９，Ｓ１２０，Ｇ１２１，Ｋ１２３，Ｄ１２４，Ｑ１２５，Ｇ１２７，Ｎ１２８，Ｆ１２９，Ｌ１３０，Ｅ１３１，Ｌ１３３，Ｋ１３４，Ｅ１３５，Ｄ１３６，Ｉ１３７，Ｋ１３８，Ａ１３９，Ｉ１４０，Ｌ１４３，Ａ１４６，Ｌ１５１，Ｅ１５２，Ｎ１５５，Ｉ１５６，Ｄ１５８，Ａ１６０，Ｋ１６１，Ｖ１６２，Ｆ１６３，Ｓ１６６，Ｈ１６７，Ｋ１６９，Ｅ１７０，Ｌ１７１，Ｓ１７２，Ｋ１７５，Ｉ１７６，Ｇ１７７，Ｋ１７８，Ｅ１７９，Ｌ１８０，Ａ１８１，Ｅ１８２，Ｑ１８３，Ｎ１８５，Ａ１８７，Ｈ１９３，Ｒ１９４，Ｔ１９６，Ｑ１９７，Ｓ２０４，Ｋ２１０，Ｋ２１１，Ｅ２１２，Ｎ２１５，Ｑ２１６，Ｖ２１７，Ｌ２１８，Ｌ２１９，Ｅ２２０，Ａ２２２，Ｉ２２３，Ｌ２２４，Ｙ２２６，Ｍ２２８，Ｉ２２９，Ｓ２３１，Ｖ２３２，Ｒ２３５，Ｔ２４０，Ｓ２４１，Ｒ２４２，Ｒ２４６，Ｔ２５１，Ｌ２５３，Ｌ２６０，Ｖ２６８，Ｖ２７０，Ａ２７１，Ｆ２７２，Ｑ２７５，Ｙ２７６，Ｄ２７８，Ｓ２８２，Ｅ３０７，Ｅ３１４，Ｒ３１５，Ｄ３１７，Ａ３２０，Ｉ３２１，Ｄ３２３，Ｍ３２８，Ｋ３２９，Ｃ３３１，Ｆ３３２，Ｌ３３３，Ａ３４３，Ｄ３４５，Ｎ３４６，Ｋ３５０，Ｇ３５１，Ｅ３５２，Ｐ３５６，Ｙ３５７，Ｋ３６０，Ａ３６１，Ａ３６３，Ｄ３６４，Ｃ３６６，Ｎ３６７，Ａ３６８，Ｆ３６９，Ｌ３７０，Ｑ３７１，Ｎ３７８，Ｋ３７９，Ｓ３８０，Ｔ３８３，Ｄ３８６，Ｇ３８９，Ｎ３９０，Ｗ３９２，Ｋ３９３，Ｖ４０２，Ｙ４０５，Ｖ４０８，Ｖ４０９，Ｑ４１０，Ｋ４１３，Ｋ４１４，Ｅ４１８，Ｋ４２２，Ｙ４２３，Ｈ４２４，Ｄ４２５，Ｔ４２６，Ｓ４２８，Ｒ４２９，Ｓ４３１，Ｈ４３２，Ｃ４３７，Ｓ４４４，Ｉ４４７，Ａ４４８，Ｓ４５７，Ｍ４６０，Ｒ４６１，Ｔ４６２，Ｋ４６３，Ｇ４６４，Ｓ４６６，Ｅ４６７，Ｅ４６８，Ｌ４６９，Ｔ４７１，Ｅ４７２，Ｍ４７５，Ｋ４８４，Ｋ４８９，Ｌ４９０，Ｇ４９２，Ｓ４９３，Ｌ４９４，Ｋ４９７，Ｖ５００，Ｅ５０１，Ｔ５０２，Ａ５０３，Ｉ５０４，Ｌ５０６，Ｑ５０９，Ｓ５１０，Ｈ５１１，Ｔ５１３，Ｈ５１５，Ｇ５１７，Ａ５１９，Ｓ５２２，Ｒ５２８，Ｋ５２９，Ｖ５３１，Ｖ５３４，Ｉ５３５，Ｔ５３６，Ｅ５３７，Ｉ５３９，Ｌ５４０，Ｆ５４２，及びＲ５４４からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は、Ｅ２Ｈ又はＩ又はＳ、Ａ３Ｅ又はＧ又はＫ又はＮ又はＱ又はＲ又はＴ，Ｓ１３Ｑ又はＴ，Ｄ１７Ｅ，Ｙ１８Ｆ又はＭ又はＮ，Ｌ１９Ｆ，Ｌ２０Ｉ又はＶ，Ｄ２３Ｔ，Ｄ２５Ａ又はＥ又はＳ，Ｅ２６Ｇ又はＮ又はＱ又はＴ，Ｓ２７Ｅ又はＦ又はＫ又はＶ，Ｉ２８Ｅ又はＦ又はＭ又はＰ，Ｅ２９Ｄ又はＰ又はＲ又はＴ，Ｖ３０Ｎ又はＱ，Ｙ３１Ｑ又はＷ，Ｋ３２Ｄ又はＧ又はＮ又はＲ，Ｄ３３Ｎ，Ｋ３４Ｄ又はＥ又はＱ又はＳ，Ｋ３６Ｆ又はＲ，Ｋ３７Ｆ又はＩ，Ａ４０Ｃ又はＤ又はＥ又はＦ又はＭ又はＮ又はＰ又はＱ又はＶ，Ｅ４１Ｃ又はＤ又はＦ又はＮ又はＱ又はＳ又はＶ，Ｖ４２Ａ又はＳ又はＴ，Ｒ４３Ｉ又はＱ，Ｒ４４Ａ又はＤ又はＫ又はＭ又はＹ，Ｅ４５Ｃ又はＭ又はＮ又はＱ，Ｉ４６Ｆ又はＶ，Ｎ４７Ｅ又はＩ又はＫ又はＲ又はＶ，Ｎ４８Ａ又はＣ又はＥ又はＦ又はＬ又はＱ又はＲ又はＳ，Ｅ４９Ｇ又はＨ又はＩ又はＲ又はＳ又はＷ，Ｋ５０Ｃ又はＧ又はＭ又はＮ又はＰ又はＲ，Ａ５１Ｅ又はＧ又はＬ又はＱ又はＴ，Ｆ５３Ｄ，Ｌ５４Ａ又はＣ又はＥ又はＨ又はＩ又はＱ，Ｔ５５Ａ又はＨ又はＮ又はＱ又はＳ又はＹ，Ｌ５６Ｈ又はＱ又はＲ又はＳ，Ｌ５７Ｉ，Ｌ５９Ｆ又はＭ又はＳ又はＶ又はＹ，Ｉ６０Ｃ又はＶ，Ｎ６２Ｖ，Ｒ７１Ｉ，Ｅ７３Ｄ，Ｓ７４Ｇ又はＭ又はＰ，Ｄ７５Ｅ，Ｒ７７Ａ又はＮ又はＴ又はＶ，Ｇ７８Ｅ又はＩ又はＫ又はＮ又はＰ又はＱ又はＶ又はＷ，Ａ７９Ｍ又はＲ又はＹ，Ｄ８１Ｃ又はＥ又はＨ又はＬ又はＮ，Ｒ８２Ｃ又はＦ又はＧ又はＬ又はＷ，Ｆ８３Ｇ又はＨ又はＩ又はＬ又はＶ，Ｖ８４Ｆ又はＨ又はＬ又はＮ又はＱ又はＲ又はＳ又はＴ又はＷ又はＹ，Ｓ８５Ｃ又はＬ又はＮ又はＲ，Ｓ８６Ｃ又はＮ，Ｇ８７Ｃ又はＥ又はＦ又はＫ又はＬ又はＮ又はＴ，Ｇ８８Ｃ又はＤ又はＩ又はＶ又はＷ又はＹ，Ｆ８９Ｃ又はＩ，Ａ９１Ｃ又はＤ又はＥ又はＧ又はＨ又はＬ又はＲ又はＳ又はＴ又はＶ又はＹ，Ｖ９２Ａ又はＣ又はＥ又はＦ又はＧ又はＩ又はＬ又はＱ又はＷ，Ｔ９３Ｈ又はＩ又はＱ又はＶ又はＷ，Ｋ９４Ｃ又はＶ又はＹ，Ｔ９５Ｃ又はＨ又はＫ又はＭ，Ｌ９７Ａ又はＭ又はＰ，Ｈ９８Ｃ又はＳ又はＴ又はＶ又はＷ，Ｇ９９Ａ又はＣ又はＨ又はＰ又はＱ又はＴ，Ｔ１００Ａ又はＩ又はＬ又はＭ又はＶ，Ａ１０１Ｓ，Ｌ１０２Ｍ，Ｓ１０３Ａ又はＣ又はＧ又はＬ，Ｌ１０７Ｃ又はＦ，Ｑ１０９Ｃ又はＮ又はＳ，Ｇ１１１Ａ，Ｅ１１３Ｃ又はＨ又はＶ，Ｖ１１４Ｃ，Ｓ１１５Ｄ又はＹ，Ｑ１１６Ｇ又はＨ又はＬ又はＳ又はＴ又はＶ，Ｅ１１７Ａ又はＤ又はＩ，Ａ１１８Ｉ又はＶ，Ｆ１１９Ｌ又はＭ，Ｓ１２０Ａ又はＤ又はＥ又はＦ又はＫ又はＮ又はＲ又はＷ又はＹ，Ｇ１２１Ｄ又はＬ又はＶ又はＷ，Ｋ１２３Ｉ又はＳ又はＷ又はＹ，Ｄ１２４Ｃ又はＥ，Ｑ１２５Ａ又はＤ又はＧ又はＨ又はＫ又はＬ又はＮ又はＳ又はＴ又はＶ又はＷ，Ｇ１２７Ｄ又はＦ又はＷ，Ｎ１２８Ａ，Ｆ１２９Ｌ又はＹ，Ｌ１３０Ａ又はＣ又はＤ又はＱ又はＶ又はＹ，Ｅ１３１Ｄ又はＦ又はＧ又はＲ，Ｌ１３３Ｅ又はＧ又はＩ又はＰ又はＱ又はＴ又はＶ又はＹ，Ｋ１３４Ｄ又はＧ又はＨ又はＩ又はＬ又はＮ又はＲ又はＷ又はＹ，Ｅ１３５Ｈ又はＳ，Ｄ１３６Ｎ，Ｉ１３７Ａ又はＣ又はＤ又はＧ又はＰ又はＱ又はＳ又はＶ，Ｋ１３８Ｃ又はＤ又はＥ又はＰ又はＲ又はＳ又はＶ，Ａ１３９Ｐ又はＳ又はＴ又はＶ，Ｉ１４０Ｎ又はＱ又はＳ又はＴ又はＶ，Ｌ１４３Ａ又はＦ又はＧ又はＮ又はＲ又はＷ，Ａ１４６Ｍ，Ｌ１５１Ｅ又はＧ又はＭ又はＮ又はＱ又はＲ又はＳ又はＴ又はＶ又はＷ，Ｅ１５２Ａ又はＤ又はＩ又はＭ又はＰ，Ｇ１５３Ｄ，Ｎ１５５Ｅ又はＫ又はＭ，Ｉ１５６Ｅ又はＫ又はＬ又はＲ又はＹ，Ｄ１５８Ｅ，Ａ１６０Ｆ又はＨ又はＳ，Ｋ１６１Ｌ又はＲ又はＳ又はＹ，Ｖ１６２Ｄ又はＦ又はＮ又はＰ又はＴ，Ｆ１６３Ｃ又はＨ又はＩ又はＭ又はＶ又はＷ又はＹ，Ｓ１６６Ｃ又はＥ又はＨ又はＫ又はＰ又はＱ又はＶ又はＷ，Ｈ１６７Ｃ又はＬ又はＰ，Ｋ１６９Ｅ又はＧ又はＲ，Ｅ１７０Ｇ又はＩ又はＮ又はＲ，Ｌ１７１Ｃ又はＥ又はＧ又はＩ又はＭ又はＷ，Ｓ１７２Ｇ又はＮ又はＱ又はＲ，Ｋ１７５Ａ又はＧ又はＨ又はＮ又はＰ又はＴ又はＶ，Ｉ１７６Ａ又はＣ又はＮ又はＱ又はＶ，Ｇ１７７Ｄ又はＥ又はＨ又はＮ又はＰ又はＴ，Ｋ１７８Ｄ又はＥ又はＧ又はＩ又はＬ又はＭ又はＮ又はＰ又はＱ又はＶ又はＹ，Ｅ１７９Ｇ又はＩ又はＰ又はＱ又はＳ又はＴ又はＶ又はＷ又はＹ，Ｌ１８０Ｆ又はＨ又はＶ又はＷ，Ａ１８１Ｆ又はＭ又はＮ又はＷ，Ｅ１８２Ｈ又はＮ，Ｑ１８３Ａ又はＬ，Ｎ１８５Ｄ，Ａ１８７Ｃ又はＳ，Ｈ１９３Ｗ，Ｒ１９４Ｉ，Ｔ１９６Ｖ，Ｑ１９７Ｇ，Ｓ２０４Ａ又はＦ又はＭ又はＷ又はＹ，Ｋ２１０Ｍ，Ｋ２１１Ｄ又はＥ又はＦ又はＧ又はＨ又はＩ又はＭ又はＲ又はＳ又はＴ又はＶ，Ｅ２１２Ａ又はＤ又はＭ又はＰ又はＱ又はＴ，Ｎ２１５Ｄ又はＹ，Ｑ２１６Ａ又はＥ又はＮ，Ｖ２１７Ｃ又はＥ又はＫ又はＮ又はＰ又はＱ又はＴ，Ｌ２１８Ｖ，Ｌ２１９Ｉ又はＭ又はＶ，Ｅ２２０Ｄ又はＮ，Ａ２２２Ｓ，Ｉ２２３Ｃ，Ｌ２２４Ａ又はＣ又はＴ又はＶ，Ｙ２２６Ｆ，Ｍ２２８Ｈ又はＲ，Ｉ２２９Ａ，Ｓ２３１Ｄ又はＧ又はＨ又はＲ又はＶ，Ｖ２３２Ｑ，Ｒ２３５Ａ又はＤ又はＮ，Ｔ２４０Ｖ，Ｓ２４１Ｃ，Ｒ２４２Ｋ又はＬ，Ｒ２４６
Ｈ又はＱ，Ｔ２５１Ｈ，Ｌ２５３Ｍ，Ｌ２６０Ｍ，Ｖ２６８Ｉ，Ｖ２７０Ｉ，Ａ２７１Ｓ，Ｆ２７２Ｑ，Ｑ２７５Ｅ，Ｙ２７６Ｆ又はＨ又はＱ，Ｄ２７８Ｌ又はＭ又はＲ又はＹ，Ｓ２８２Ｃ，Ｅ３０７Ｑ又はＲ，Ｅ３１４Ｈ，Ｒ３１５Ｇ又はＫ，Ｄ３１７Ｓ，Ａ３２０Ｎ又はＴ，Ｉ３２１Ｌ又はＭ，Ｄ３２３Ｉ又はＴ，Ｍ３２８Ｌ，Ｋ３２９Ｇ又はＱ又はＲ，Ｃ３３１Ｔ，Ｆ３３２Ｙ，Ｌ３３３Ｆ，Ａ３４３Ｉ又はＶ，Ｄ３４５Ｙ，Ｎ３４６Ａ，Ｋ３５０Ｈ又はＷ又はＹ，Ｇ３５１Ｅ又はＭ，Ｅ３５２Ｆ又はＩ又はＭ又はＶ，Ｐ３５６Ｍ又はＳ，Ｙ３５７Ｅ，Ｋ３６０Ｑ，Ａ３６１Ｑ又はＳ又はＶ，Ａ３６３Ｓ，Ｄ３６４Ｎ又はＴ，Ｃ３６６Ａ，Ｎ３６７Ｄ又はＥ又はＭ，Ａ３６８Ｄ又はＱ，Ｆ３６９Ｈ又はＱ，Ｌ３７０Ａ又はＤ又はＥ又はＦ又はＨ又はＮ又はＲ又はＳ又はＴ又はＶ，Ｑ３７１Ｇ又はＨ又はＩ又はＮ又はＰ又はＲ又はＴ又はＷ又はＹ，Ｎ３７８Ｄ，Ｋ３７９Ｅ又はＲ又はＳ，Ｓ３８０Ｋ又はＮ，Ｔ３８３Ｑ，Ｄ３８６Ｋ又はＳ，Ｇ３８９Ｃ又はＭ又はＰ又はＲ又はＴ，Ｎ３９０Ｓ，Ｗ３９２Ｆ又はＭ，Ｋ３９３Ｈ又はＲ，Ｖ４０２Ｆ又はＩ又はＬ，Ｙ４０５Ｆ，Ｖ４０８Ｑ又はＳ，Ｖ４０９Ｃ又はＱ又はＳ，Ｑ４１０Ｅ又はＧ又はＨ又はＩ又はＲ，Ｋ４１３Ｐ，Ｋ４１４Ｃ又はＨ又はＩ又はＱ，Ｅ４１８Ｎ，Ｋ４２２Ｇ又はＨ又はＱ又はＲ，Ｙ４２３Ｇ，Ｈ４２４Ｄ又はＧ又はＩ又はＳ又はＴ，Ｄ４２５Ｐ，Ｔ４２６Ａ又はＭ又はＱ，Ｓ４２８Ｖ，Ｒ４２９Ａ又はＣ又はＤ又はＧ又はＨ又はＫ又はＮ，Ｓ４３１Ｇ，Ｈ４３２Ａ又はＭ，Ｃ４３７Ｎ，Ｓ４４４Ｎ又はＱ又はＴ，Ｉ４４７Ｋ又はＲ，Ａ４４８Ｈ又はＳ又はＴ，Ｓ４５７Ｄ，Ｍ４６０Ａ又はＥ又はＧ、Ｒ４６１Ｎ，Ｔ４６２Ｓ，Ｋ４６３Ｇ又はＮ，Ｇ４６４Ａ又はＤ又はＥ又はＦ又はＨ又はＶ又はＹ，Ｓ４６６Ｅ又はＧ又はＫ又はＮ又はＴ，Ｅ４６７Ｎ，Ｅ４６８Ａ又はＮ又はＰ又はＱ，Ｌ４６９Ａ又はＮ，Ｔ４７１Ｎ，Ｅ４７２Ａ又はＧ又はＮ，Ｍ４７５Ｉ，Ｋ４８４Ａ，Ｋ４８９Ｒ，Ｌ４９０Ｉ又はＹ，Ｇ４９２Ｔ又はＶ，Ｓ４９３Ｃ又はＧ又はＫ又はＶ，Ｌ４９４Ｇ又はＩ又はＱ又はＶ，Ｋ４９７Ｍ又はＴ，Ｖ５００Ｉ又はＹ，Ｅ５０１Ｎ，Ｔ５０２Ｈ，Ａ５０３Ｌ又はＭ，Ｉ５０４Ｌ，Ｌ５０６Ｉ又はＶ，Ｑ５０９Ａ，Ｓ５１０Ｔ，Ｈ５１１Ｉ又はＭ，Ｔ５１３Ｓ，Ｈ５１５Ｑ，Ｇ５１７Ｐ，Ａ５１９Ｃ，Ｓ５２２Ａ又はＫ，Ｒ５２８Ｋ，Ｋ５２９Ａ，Ｖ５３１Ｇ又はＮ，Ｖ５３４Ａ又はＳ，Ｉ５３５Ｃ又はＳ又はＴ，Ｔ５３６Ｍ，Ｅ５３７Ｈ又はＮ又はＱ，Ｉ５３９Ｖ，Ｌ５４０Ｅ又はＱ又はＲ又はＶ，Ｆ５４２Ｍ，並びにＲ５４４Ｇ又はＮ又はＰ又はＱ又はＳからなる群から選択される。
他の態様では、本発明は、イソプレン合成酵素活性の改良された単離ポリペプチドを提供し、ポリペプチドは、配列番号１と対応する：Ｘ２２，Ｘ３６，Ｘ４３，Ｘ５８，Ｘ８７，Ｘ８９，Ｘ１１８，Ｘ１５１，Ｘ２３４，Ｘ２４７，Ｘ２５４，Ｘ２８２，Ｘ２８８，Ｘ３９１，Ｘ３９２，Ｘ４３７，Ｘ４４３，Ｘ４４７，Ｘ４８１，Ｘ４８８，Ｘ５０２，及びＸ５４２からなる群から選択される残基の１つ以上に置換を含み、かつここで、ポリペプチドは、配列番号１の野生型イソプレン合成酵素と比較して、イソプレン合成酵素の比活性が少なくとも３０％上昇している。一部の実施形態では、置換はＳ２２，Ｋ３６，Ｒ４３，Ｅ５８，Ｇ８７，Ｆ８９，Ａ１１８，Ｌ１５１，Ｑ２３４，Ｖ２４７，Ｈ２５４，Ｓ２８２，Ｓ２８８，Ａ３９１，Ｗ３９２，Ｃ４３７，Ｉ４４７，Ｔ４８１，Ｅ４８８，Ｔ５０２及びＦ５４２からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換は、Ｓ２２Ｋ又はＲ，Ｋ３６Ｈ又はＷ，Ｒ４３Ｅ，Ｅ５８Ｆ，Ｇ８７Ｓ又はＲ，Ｆ８９Ｄ，Ａ１１８Ｅ，Ｌ１５１Ｙ，Ｇ１５３Ｐ，Ｑ２３４Ｒ，Ｖ２４７Ｉ，Ｈ２５４Ｃ，Ｓ２８２Ｈ又はＷ，Ｓ２８８Ａ又はＴ又はＹ，Ａ３９１Ｇ，Ｗ３９２Ｃ、Ｃ４３７Ｌ，Ｉ４４７Ｖ，Ｔ４８１Ｙ，Ｅ４８８Ｌ，Ｔ５０２Ｆ及びＦ５４２Ｎからなる群から選択される。
他の態様では、本発明は、イソプレン合成酵素活性を有し、かつ宿主細胞で発現させた場合に宿主細胞の増殖活性が上昇する単離ポリペプチドを提供し、ここで、ポリペプチドは、配列番号１と対応する：Ｘ３０，Ｘ１３４，Ｘ１４３，Ｘ１５６，Ｘ１５９，Ｘ１７２，Ｘ４１４，及びＸ４２１，からなる群から選択される残基の１つ以上に置換を含み、かつここで、ポリペプチドを発現している宿主細胞の増殖性は、同様の増殖条件下で配列番号１の野生型イソプレン合成酵素を発現している宿主細胞の増殖性と比較して、少なくとも２０％上昇している。一部の実施形態では、置換は、Ｋ１３４，Ｌ１４３，Ｉ１５６，Ｅ１５９，Ｓ１７２，Ｋ４１４，及びＱ４２１からなる群から選択される残基の置換である。一部の実施形態では、置換はＶ３０Ｋ，Ｋ１３４Ｃ又はＰ、Ｌ１４３Ｉ，Ｉ１５６Ｇ，Ｅ１５９Ｄ，Ｓ１７２Ｖ，Ｋ４１４Ｆ，及びＱ４２１Ｒ又はＤからなる群から選択される残基の置換である。
他の態様では、本発明は、本明細書に記載されるいずれかのポリペプチドを含む、組み換え宿主細胞を提供する。一部の実施形態では、宿主細胞は、バクテリア細胞、藻類細胞、真菌細胞、酵母細胞、ラン藻細胞、又はクロストリジウムからなる群から選択される。一部の実施形態では、宿主細胞はバクテリア細胞である。一部の実施形態では、バクテリア細胞はグラム陽性バクテリア細胞又はグラム陰性バクテリア細胞である。一部の実施形態では、バクテリア細胞は、大腸菌、Ｌ．アシドフィラス、Ｐ．シトレア、枯草菌、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．レンタス、Ｂ．ブレービス、Ｂ．ステアロサーモフィルス、Ｂ．アルカロフィルス（B. alkalophilus）、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．クラウシイ、Ｂ．ハロデュランス、Ｂ．メガテリウム、Ｂ．コアグランス、Ｂ．サークランス、Ｂ．ロータス、卒倒病菌、Ｓ．アルブス、Ｓ．リビダンス、Ｓ．コエリカラー、Ｓ．グリセウス、シュードモナス属、Ｐ．アルカリゲネス、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、及びＣ．グルタミクム（C. glutamicum）からなる群から選択される。一部の実施形態では、宿主細胞は藻類細胞である。一部の実施形態では、藻類細胞は緑藻類、紅藻類、灰色藻類、クロララクニオン藻類、ミドリムシ類、クロミスタ類、又は渦鞭毛藻類からなる群から選択される。一部の実施形態では、宿主細胞は真菌細胞である。一部の実施形態では、真菌細胞は糸状菌である。一部の実施形態では、宿主細胞は酵母細胞である。一部の実施形態では、酵母細胞は、酵母菌属、シゾサッカロミセス属、ピキア属、又はカンジダ属からなる群から選択される。一部の実施形態では、酵母細胞は出芽酵母細胞である。
他の態様では、本発明は、イソプレン合成酵素活性が改良されており、及び／又は宿主細胞に発現させた場合に増殖性が上昇するポリペプチドを同定する方法であって、配列番号１の野生型イソプレン合成酵素の比活性及び配列番号１の野生型イソプレン合成酵素を発現している宿主細胞の増殖性と比較した場合に、宿主細胞の比活性が改良される及び／又は宿主細胞の増殖性が上昇する、ポリペプチド中の１つ以上の置換について、部位評価ライブラリ（site evaluation library）又はコンビナトリアルライブラリをスクリーニングする工程を含む、方法を提供する。
他の態様では、本発明は：Ｘ００３Ｃ，Ｘ００３Ｄ，Ｘ００３Ｅ，Ｘ００３Ｆ，Ｘ００３Ｇ，Ｘ００３Ｈ，Ｘ００３Ｉ，Ｘ００３Ｋ，Ｘ００３Ｌ，Ｘ００３Ｍ，Ｘ００３Ｎ，Ｘ００３Ｐ，Ｘ００３Ｑ，Ｘ００３Ｒ，Ｘ００３Ｓ，Ｘ００３Ｔ，Ｘ００３Ｖ，Ｘ００３Ｗ，Ｘ００３Ｙ，Ｘ００７Ｃ，Ｘ００７Ｄ，Ｘ００７Ｅ，Ｘ００７Ｆ，Ｘ００７Ｇ，Ｘ００７Ｈ，Ｘ００７Ｉ，Ｘ００７Ｋ，Ｘ００７Ｌ，Ｘ００７Ｍ，Ｘ００７Ｎ，Ｘ００７Ｐ，Ｘ００７Ｑ，Ｘ００７Ｒ，Ｘ００７Ｓ，Ｘ００７Ｔ，Ｘ００７Ｖ，Ｘ００７Ｗ，Ｘ００７Ｙ，Ｘ００９Ａ，Ｘ００９Ｃ，Ｘ００９Ｄ，Ｘ００９Ｅ，Ｘ００９Ｆ，Ｘ００９Ｇ，Ｘ００９Ｈ，Ｘ００９Ｉ，Ｘ００９Ｋ，Ｘ００９Ｌ，Ｘ００９Ｍ，Ｘ００９Ｎ，Ｘ００９Ｐ，Ｘ００９Ｑ，Ｘ００９Ｒ，Ｘ００９Ｓ，Ｘ００９Ｔ，Ｘ００９Ｖ，Ｘ００９Ｗ，Ｘ０１２Ａ，Ｘ０１２Ｃ，Ｘ０１２Ｄ，Ｘ０１２Ｅ，Ｘ０１２Ｆ，Ｘ０１２Ｇ，Ｘ０１２Ｈ，Ｘ０１２Ｉ，Ｘ０１２Ｋ，Ｘ０１２Ｌ，Ｘ０１２Ｍ，Ｘ０１２Ｐ，Ｘ０１２Ｑ，Ｘ０１２Ｒ，Ｘ０１２Ｓ，Ｘ０１２Ｔ，Ｘ０１２Ｖ，Ｘ０１２Ｗ，Ｘ０１２Ｙ，Ｘ０１３Ａ，Ｘ０１３Ｃ，Ｘ０１３Ｄ，Ｘ０１３Ｅ，Ｘ０１３Ｆ，Ｘ０１３Ｇ，Ｘ０１３Ｈ，Ｘ０１３Ｉ，Ｘ０１３Ｋ，Ｘ０１３Ｌ，Ｘ０１３Ｍ，Ｘ０１３Ｎ，Ｘ０１Ｐ３、Ｘ０１３Ｑ，Ｘ０１３Ｒ，Ｘ０１３Ｔ，Ｘ０１３Ｖ，Ｘ０１３Ｗ，Ｘ０１３Ｙ，Ｘ０１６Ａ，Ｘ０１６Ｃ，Ｘ０１６Ｄ，Ｘ０１６Ｅ，Ｘ０１６Ｆ，Ｘ０１６Ｇ，Ｘ０１６Ｈ，Ｘ０１６Ｉ，Ｘ０１６Ｋ，Ｘ０１６Ｌ，Ｘ０１６Ｍ，Ｘ０１６Ｎ，Ｘ０１６Ｐ，Ｘ０１６Ｑ，Ｘ０１６Ｒ，Ｘ０１６Ｓ，Ｘ０１６Ｔ，Ｘ０１６Ｖ，Ｘ０１６Ｗ，Ｘ０１８Ａ，Ｘ０１８Ｃ，Ｘ０１８Ｄ，Ｘ０Ｅ１８、Ｘ０１８Ｆ，Ｘ０１８Ｇ，Ｘ０１８Ｈ，Ｘ０１８Ｉ，Ｘ０１８Ｋ，Ｘ０１８Ｌ，Ｘ０１８Ｍ，Ｘ０１８Ｎ，Ｘ０１８Ｐ，Ｘ０１８Ｑ，Ｘ０１８Ｒ，Ｘ０１８Ｓ，Ｘ０１８Ｔ，Ｘ０１８Ｖ，Ｘ０１８Ｗ，Ｘ０２０Ａ，Ｘ０２０Ｃ，Ｘ０２０Ｄ，Ｘ０２０Ｅ，Ｘ０２０Ｆ，Ｘ０２０Ｇ，Ｘ０２０Ｈ，Ｘ０２０Ｉ，Ｘ０２０Ｋ，Ｘ０２０Ｍ，Ｘ０２０Ｎ，Ｘ０２０Ｐ，Ｘ０２０Ｑ，Ｘ０２０Ｒ，Ｘ０２０Ｓ，Ｘ０２０Ｔ，Ｘ０２０Ｖ，Ｘ０２０Ｗ，Ｘ０２０Ｙ，Ｘ０２３Ａ，Ｘ０２３Ｃ，Ｘ０２３Ｅ，Ｘ０２３Ｆ，Ｘ０２３Ｇ，Ｘ０２３Ｈ，Ｘ０２３Ｉ，Ｘ０２３Ｋ，Ｘ０２３Ｌ，Ｘ０２３Ｍ，Ｘ０２３Ｎ，Ｘ０２３Ｐ，Ｘ０２３Ｑ，Ｘ０２３Ｒ，Ｘ０２３Ｓ，Ｘ０２３Ｔ，Ｘ０２３Ｖ，Ｘ０２３Ｗ，Ｘ０２３Ｙ，Ｘ０２５Ａ，Ｘ０２５Ｃ，Ｘ０２５Ｅ，Ｘ０２５Ｆ，Ｘ０２５Ｇ，Ｘ０２５Ｈ，Ｘ０２５Ｉ，Ｘ０２５Ｋ，Ｘ０２５Ｌ，Ｘ０２５Ｍ，Ｘ０２５Ｎ，Ｘ０２５Ｐ，Ｘ０２５Ｑ，Ｘ０２５Ｒ，Ｘ０２５Ｓ，Ｘ０２５Ｔ，Ｘ０２５Ｖ，Ｘ０２５Ｗ，Ｘ０２５Ｙ，Ｘ０２６Ａ，Ｘ０２６Ｃ，Ｘ０２６Ｄ，Ｘ０２６Ｆ，Ｘ０２６Ｇ，Ｘ０２６Ｈ，Ｘ０２６Ｉ，Ｘ０２６Ｋ，Ｘ０２６Ｌ，Ｘ０２６Ｍ，Ｘ０２６Ｎ，Ｘ０２６Ｐ，Ｘ０２６Ｑ，Ｘ０２６Ｒ，Ｘ０２６Ｓ，Ｘ０２６Ｔ，Ｘ０２６Ｖ，Ｘ０２６Ｗ，Ｘ０２６Ｙ，Ｘ０２７Ａ，Ｘ０２７Ｃ，Ｘ０２７Ｄ，Ｘ０２７Ｅ，Ｘ０２７Ｆ，Ｘ０２７Ｇ，Ｘ０２７Ｈ，Ｘ０２７Ｉ，Ｘ０２７Ｋ，Ｘ０２７Ｌ，Ｘ０２７Ｍ，Ｘ０２７Ｎ，Ｘ０２７Ｐ，Ｘ０２７Ｑ，Ｘ０Ｒ２７、Ｘ０２７Ｖ，Ｘ０２７Ｗ，Ｘ０２７Ｙ，Ｘ０３３Ａ，Ｘ０３３Ｃ，Ｘ０３３Ｅ，Ｘ０３３Ｆ，Ｘ０３３Ｇ，Ｘ０３３Ｈ，Ｘ０３３Ｉ，Ｘ０３３Ｋ，Ｘ０３３Ｌ，Ｘ０３３Ｍ，Ｘ０３３Ｎ，Ｘ０３３Ｐ，Ｘ０３３Ｑ，Ｘ０３３Ｒ，Ｘ０３３Ｓ，Ｘ０３３Ｔ，Ｘ０３３Ｖ，Ｘ０３３Ｗ，Ｘ０３３Ｙ，Ｘ０３６Ａ，Ｘ０３６Ｃ，Ｘ０３６Ｄ，Ｘ０３６Ｅ，Ｘ０３６Ｆ，Ｘ０３６Ｇ，Ｘ０３６Ｇ，Ｘ０３６Ｉ，Ｘ０３６Ｌ，Ｘ０３６Ｍ，Ｘ０３６Ｎ，Ｘ０３６Ｐ，Ｘ０３６Ｑ，Ｘ０３６Ｒ，Ｘ０３６Ｓ，Ｘ０３６Ｔ，Ｘ０３６Ｖ，Ｘ０３６Ｗ，Ｘ０３６Ｙ，Ｘ０４４Ａ，Ｘ０４４Ｃ，Ｘ０４４Ｄ，Ｘ０４４Ｅ，Ｘ０４４Ｆ，Ｘ０４４Ｇ，Ｘ０４４Ｈ，Ｘ０４４Ｉ，Ｘ０４４Ｋ，Ｘ０４４Ｌ，Ｘ０４４Ｍ，Ｘ０４４Ｎ，Ｘ０４４Ｐ，Ｘ０４４Ｑ，Ｘ０４４Ｓ，Ｘ０４４Ｔ，Ｘ０４４Ｖ，Ｘ０４４Ｗ，Ｘ０４４Ｙ，Ｘ０５０Ａ，Ｘ０５０Ｃ，Ｘ０５０Ｄ，Ｘ０５０Ｅ，Ｘ０５０Ｆ，Ｘ０５０Ｇ，Ｘ０５０Ｈ，Ｘ０５０Ｉ，Ｘ０５０Ｌ，Ｘ０５０Ｍ，Ｘ０５０Ｎ，Ｘ０５０Ｐ，Ｘ０５０Ｑ，Ｘ０５０Ｒ，Ｘ０５０Ｓ，Ｘ０５０Ｔ，Ｘ０５０Ｖ，Ｘ０５０Ｗ，Ｘ０５０Ｙ，Ｘ０５３Ａ，Ｘ０５３Ｃ，Ｘ０５３Ｄ，Ｘ０５３Ｅ，Ｘ０５３Ｇ，Ｘ０５３Ｈ，Ｘ０５３Ｉ，Ｘ０５３Ｋ，Ｘ０５３Ｌ，Ｘ０５３Ｍ，Ｘ０５３Ｎ，Ｘ０５３Ｐ，Ｘ０５３Ｑ，Ｘ０５３Ｒ，Ｘ０５３Ｓ，Ｘ０５３Ｔ，Ｘ０５３Ｖ，Ｘ０５３Ｗ，Ｘ０５３Ｙ，Ｘ０５９Ａ，Ｘ０５９Ｃ，Ｘ０５９Ｄ，Ｘ０５９Ｅ，Ｘ０５９Ｆ，Ｘ０５９Ｇ，Ｘ０５９Ｈ，Ｘ０５９Ｉ，Ｘ０５９Ｋ，Ｘ０５９Ｍ，Ｘ０５９Ｎ，Ｘ０５９Ｐ，Ｘ０５９Ｑ，Ｘ０５９Ｒ，Ｘ０５９Ｓ，Ｘ０５９Ｔ，Ｘ０５９Ｖ，Ｘ０５９Ｗ，Ｘ０５９Ｙ，Ｘ０６９Ａ，Ｘ０６９Ｃ，Ｘ０６９Ｄ，Ｘ０６９Ｅ，Ｘ０６９Ｆ，Ｘ０６９Ｈ，Ｘ０６９Ｉ，Ｘ０６９Ｋ，Ｘ０６９Ｌ，Ｘ０６９Ｍ，Ｘ０６９Ｎ，Ｘ０６９Ｐ，Ｘ０６９Ｑ，Ｘ０６９Ｒ，Ｘ０６９Ｓ，Ｘ０６９Ｔ，Ｘ０６９Ｖ，Ｘ０６９Ｗ，Ｘ０６９Ｙ，Ｘ０７４Ａ，Ｘ０７４Ｃ，Ｘ０７４Ｄ，Ｘ０７４Ｅ，Ｘ０７４Ｆ，Ｘ０７４Ｇ，Ｘ０７４Ｈ，Ｘ０７４Ｉ，Ｘ０７４Ｋ，Ｘ０７４Ｌ，Ｘ０７４Ｍ，Ｘ０７４Ｎ，Ｘ０７４Ｐ，Ｘ０７４Ｑ，Ｘ０７４Ｒ，Ｘ０７４Ｔ，Ｘ０７４Ｖ，Ｘ０７４Ｗ，Ｘ０７４Ｙ，Ｘ０７８Ａ，Ｘ０７８Ｃ，Ｘ０７８Ｄ，Ｘ０７８Ｅ，Ｘ０７８Ｆ，Ｘ０７８Ｈ，Ｘ０７８Ｉ，Ｘ０７８Ｋ，Ｘ０７８Ｌ，Ｘ０７８Ｍ，Ｘ０７８Ｎ，Ｘ０７８Ｐ，Ｘ０７８Ｑ，Ｘ０７８Ｒ，Ｘ０７８Ｓ，Ｘ０７８Ｔ，Ｘ０７８Ｖ，Ｘ０７８Ｗ，Ｘ０７８Ｙ，Ｘ０８１Ａ，Ｘ０８１Ｃ，Ｘ０８１Ｅ，Ｘ０８１Ｆ，Ｘ０８１Ｇ，Ｘ０８１Ｈ，Ｘ０８１Ｉ，Ｘ０８１Ｋ，Ｘ０８１Ｌ，Ｘ０８１Ｍ，Ｘ０８１Ｎ，Ｘ０８１Ｐ，Ｘ０８１Ｑ，Ｘ０８１Ｒ，Ｘ０８１Ｓ，Ｘ０８１Ｔ，Ｘ０８１Ｖ，Ｘ０８１Ｗ，Ｘ０８１Ｙ，Ｘ０８７Ａ，Ｘ０８７Ｃ，Ｘ０８７Ｄ，Ｘ０８７Ｅ，Ｘ０８７Ｆ，Ｘ０８７Ｈ，Ｘ０８７Ｉ，Ｘ０８７Ｋ，Ｘ０８７Ｌ，Ｘ０８７Ｍ，Ｘ０８７Ｎ，Ｘ０８７Ｐ，Ｘ０８７Ｑ，Ｘ０８７Ｒ，Ｘ０８７Ｓ，Ｘ０８７Ｔ，Ｘ０８７Ｖ，Ｘ０８７Ｗ，Ｘ０８７Ｙ，Ｘ０９９Ａ，Ｘ０９９Ｃ，Ｘ０９９Ｄ，Ｘ０９９Ｅ，Ｘ０９９Ｆ，Ｘ０９９Ｈ，Ｘ０９９Ｉ，Ｘ０９９Ｋ，Ｘ０９９Ｌ，Ｘ０９９Ｍ，Ｘ０９９Ｎ，Ｘ０９９Ｐ，Ｘ０９９Ｑ，Ｘ０９９Ｒ，Ｘ０９９Ｓ，Ｘ０９９Ｔ，Ｘ０９９Ｖ，Ｘ０９９Ｗ，Ｘ０９９Ｙ，Ｘ１１６Ａ，Ｘ１１６Ｃ，Ｘ１１６Ｄ，Ｘ１１６Ｅ，Ｘ１１６Ｆ，Ｘ１１６Ｇ，Ｘ１１６Ｈ，Ｘ１１６Ｉ，Ｘ１１６Ｋ，Ｘ１１６Ｌ，Ｘ１１６Ｍ，Ｘ１１６Ｎ，Ｘ１１６Ｐ，Ｘ１１６Ｒ，Ｘ１１６Ｓ，Ｘ１１６Ｔ，Ｘ１１６Ｖ，Ｘ１１６Ｗ，Ｘ１１６Ｙ，Ｘ１１７Ａ，Ｘ１１７Ｃ，Ｘ１１７Ｄ，Ｘ１１７Ｆ，Ｘ１１７Ｇ，Ｘ１１７Ｈ，Ｘ１１７Ｉ，Ｘ１１７Ｋ，Ｘ１１７Ｌ，Ｘ１１７Ｍ，Ｘ１１７Ｎ，Ｘ１１７Ｐ，Ｘ１１７Ｑ，Ｘ１１７Ｒ，Ｘ１１７Ｓ，Ｘ１１７Ｔ，Ｘ１１７Ｖ，Ｘ１１７Ｗ，Ｘ１１７Ｙ，Ｘ１２０Ａ，Ｘ１２０Ｃ，Ｘ１２０Ｄ，Ｘ１２０Ｅ，Ｘ１２０Ｆ，Ｘ１２０Ｇ，Ｘ１２０Ｈ，Ｘ１２０Ｉ，Ｘ１２０Ｋ，Ｘ１２０Ｌ，Ｘ１２０Ｍ，Ｘ１２０Ｎ，Ｘ１２０Ｐ，Ｘ１２０Ｑ，Ｘ１２０Ｒ，Ｘ１２０Ｔ，Ｘ１２０Ｖ，Ｘ１２０Ｗ，Ｘ１２０Ｙ，Ｘ１２１Ａ，Ｘ１２１Ｃ，Ｘ１２１Ｄ，Ｘ１２１Ｅ，Ｘ１２１Ｆ，Ｘ１２１Ｈ，Ｘ１２１Ｉ，Ｘ１２１Ｋ，Ｘ１２１Ｌ，Ｘ１２１Ｍ，Ｘ１２１Ｎ，Ｘ１２１Ｐ，Ｘ１２１Ｑ，Ｘ１２１Ｒ，Ｘ１２１Ｓ，Ｘ１２１Ｔ，Ｘ１２１Ｖ，Ｘ１２１Ｗ，Ｘ１２１Ｙ，Ｘ１２５Ａ，Ｘ１２５Ｃ，Ｘ１２５Ｄ，Ｘ１２５Ｅ，Ｘ１２５Ｆ，Ｘ１２５Ｇ，Ｘ１２５Ｈ，Ｘ１２５Ｉ，Ｘ１２５Ｋ，Ｘ１２５Ｌ，Ｘ１２５Ｍ，Ｘ１２５Ｎ，Ｘ１２５Ｐ，Ｘ１２５Ｒ，Ｘ１２５Ｓ，Ｘ１２５Ｔ，Ｘ１２５Ｖ，Ｘ１２５Ｗ，Ｘ１２５Ｙ，Ｘ１２７Ａ，Ｘ１２７Ｃ，Ｘ１２７Ｄ，Ｘ１２７Ｅ，Ｘ１２７Ｆ，Ｘ１２７Ｈ，Ｘ１２７Ｉ，Ｘ１２７Ｋ，Ｘ１２７Ｌ，Ｘ１２７Ｍ，Ｘ１２７Ｎ，Ｘ１２７Ｐ，Ｘ１２７Ｑ，Ｘ１２７Ｒ，Ｘ１２７Ｓ，Ｘ１２７Ｔ，Ｘ１２７Ｖ，Ｘ１２７Ｗ，Ｘ１２７Ｙ，Ｘ１３９Ｃ，Ｘ１３９Ｄ，Ｘ１３９Ｅ，Ｘ１３９Ｆ，Ｘ１３９Ｇ，Ｘ１３９Ｈ，Ｘ１３９Ｉ，Ｘ１３９Ｋ，Ｘ１３９Ｌ，Ｘ１３９Ｍ，Ｘ１３９Ｎ，Ｘ１３９Ｐ，Ｘ１３９Ｑ，Ｘ１３９Ｒ，Ｘ１３９Ｓ，Ｘ１３９Ｔ，Ｘ１３９Ｖ，Ｘ１３９Ｗ，Ｘ１３９Ｙ，Ｘ１６５Ａ，Ｘ１６５Ｃ，Ｘ１６５Ｄ，Ｘ１６５Ｅ，Ｘ１６５Ｆ，Ｘ１６５Ｇ，Ｘ１６５Ｈ，Ｘ１６５Ｋ，Ｘ１６５Ｌ，Ｘ１６５Ｍ，Ｘ１６５Ｎ，Ｘ１６５Ｐ，Ｘ１６５Ｑ，Ｘ１６５Ｒ，Ｘ１６５Ｓ，Ｘ１６５Ｔ，Ｘ１６５Ｖ，Ｘ１６５Ｗ，Ｘ１６５Ｙ，Ｘ１７３Ａ，Ｘ１７３Ｃ，Ｘ１７３Ｄ，Ｘ１７３Ｆ，Ｘ１７３Ｇ，Ｘ１７３Ｈ，Ｘ１７３Ｉ，Ｘ１７３Ｋ，Ｘ１７３Ｌ，Ｘ１７３Ｍ，Ｘ１７３Ｎ，Ｘ１７３Ｐ，Ｘ１７３Ｑ，Ｘ１７３Ｒ，Ｘ１７３Ｓ，Ｘ１７３Ｔ，Ｘ１７３Ｖ，Ｘ１７３Ｗ，Ｘ１７３Ｙ，Ｘ１７４Ａ，Ｘ１７４Ｃ，Ｘ１７４Ｄ，Ｘ１７４Ｆ，Ｘ１７４Ｇ，Ｘ１７４Ｈ，Ｘ１７４Ｉ，Ｘ１７４Ｋ，Ｘ１７４Ｌ，Ｘ１７４Ｍ，Ｘ１７４Ｎ，Ｘ１７４Ｐ，Ｘ１７４Ｑ，Ｘ１７４Ｒ，Ｘ１７４Ｓ，Ｘ１７４Ｔ，Ｘ１７４Ｖ，Ｘ１７４Ｗ，Ｘ１７４Ｙ，Ｘ１７７Ａ，Ｘ１７７Ｃ，Ｘ１７７Ｄ，Ｘ１７７Ｅ，Ｘ１７７Ｆ，Ｘ１７７Ｈ，Ｘ１７７Ｉ，Ｘ１７７Ｋ，Ｘ１７７Ｌ，Ｘ１７７Ｍ，Ｘ１７７Ｎ，Ｘ１７７Ｐ，Ｘ１７７Ｑ，Ｘ１７７Ｒ，Ｘ１７７Ｓ，Ｘ１７７Ｔ，Ｘ１７７Ｖ，Ｘ１７７Ｗ，Ｘ１７７Ｙ，Ｘ１７９Ａ，Ｘ１７９Ｃ，Ｘ１７９Ｄ，Ｘ１７９Ｆ，Ｘ１７９Ｇ，Ｘ１７９Ｈ，Ｘ１７９Ｉ，Ｘ１７９Ｋ，Ｘ１７９Ｌ，Ｘ１７９Ｍ，Ｘ１７９Ｎ，Ｘ１７９Ｐ，Ｘ１７９Ｑ，Ｘ１７９Ｒ，Ｘ１７９Ｓ，Ｘ１７９Ｔ，Ｘ１７９Ｖ，Ｘ１７９Ｗ，Ｘ１７９Ｙ，Ｘ１９４Ａ，Ｘ１９４Ｃ，Ｘ１９４Ｄ，Ｘ１９４Ｅ，Ｘ１９４Ｆ，Ｘ１９４Ｇ，Ｘ１９４Ｈ，Ｘ１９４Ｉ，Ｘ１９４Ｋ，Ｘ１９４Ｌ，Ｘ１９４Ｍ，Ｘ１９４Ｎ，Ｘ１９４Ｐ，Ｘ１９４Ｑ，Ｘ１９４Ｓ，Ｘ１９４Ｔ，Ｘ１９４Ｖ，Ｘ１９４Ｗ，Ｘ１９４Ｙ，Ｘ１９７Ａ，Ｘ１９７Ｃ，Ｘ１９７Ｄ，Ｘ１９７Ｅ，Ｘ１９７Ｆ，Ｘ１９７Ｇ，Ｘ１９７Ｈ，Ｘ１９７Ｉ，Ｘ１９７Ｋ，Ｘ１９７Ｌ，Ｘ１９７Ｍ，Ｘ１９７Ｎ，Ｘ１９７Ｐ，Ｘ１９７Ｒ，Ｘ１９７Ｓ，Ｘ１９７Ｔ，Ｘ１９７Ｖ，Ｘ１９７Ｗ，Ｘ１９７Ｙ，Ｘ２０２Ａ，Ｘ２０２Ｃ，Ｘ２０２Ｄ，Ｘ２０２Ｅ，Ｘ２０２Ｆ，Ｘ２０２Ｇ，Ｘ２０２Ｈ，Ｘ２０２Ｉ，Ｘ２０２Ｋ，Ｘ２０２Ｌ，Ｘ２０２Ｍ，Ｘ２０２Ｎ，Ｘ２０２Ｐ，Ｘ２０２Ｑ，Ｘ２０２Ｒ，Ｘ２０２Ｓ，Ｘ２０２Ｔ，Ｘ２０２Ｗ，Ｘ２０２Ｙ，Ｘ２１６Ａ，Ｘ２１６Ｃ，Ｘ２１６Ｄ，Ｘ２１６Ｅ，Ｘ２１６Ｆ，Ｘ２１６Ｇ，Ｘ２１６Ｈ，Ｘ２１６Ｉ，Ｘ２１６Ｋ，Ｘ２１６Ｌ，Ｘ２１６Ｍ，Ｘ２１６Ｎ，Ｘ２１６Ｐ，Ｘ２１６Ｒ，Ｘ２１６Ｓ，Ｘ２１６Ｔ，Ｘ２１６Ｖ，Ｘ２１６Ｗ，Ｘ２１６Ｙ，Ｘ２４０Ａ，Ｘ２４０Ｃ，Ｘ２４０Ｄ，Ｘ２４０Ｅ，Ｘ２４０Ｆ，Ｘ２４０Ｇ，Ｘ２４０Ｈ，Ｘ２４０Ｉ，Ｘ２４０Ｋ，Ｘ２４０Ｌ，Ｘ２４０Ｍ，Ｘ２４０Ｎ，Ｘ２４０Ｐ，Ｘ２４０Ｑ，Ｘ２４０Ｒ，Ｘ２４０Ｓ，Ｘ２４０Ｖ，Ｘ２４０Ｗ，Ｘ２４０Ｙ，Ｘ２４６Ａ，Ｘ２４６Ｃ，Ｘ２４６Ｄ，Ｘ２４６Ｅ，Ｘ２４６Ｆ，Ｘ２４６Ｇ，Ｘ２４６Ｈ，Ｘ２４６Ｉ，Ｘ２４６Ｋ，Ｘ２４６Ｌ，Ｘ２４６Ｍ，Ｘ２４６Ｎ，Ｘ２４６Ｐ，Ｘ２４６Ｑ，Ｘ２４６Ｓ，Ｘ２４６Ｔ，Ｘ２４６Ｖ，Ｘ２４６Ｗ，Ｘ２４６Ｙ，Ｘ２５１Ａ，Ｘ２５１Ｃ，Ｘ２５１Ｄ，Ｘ２５１Ｅ，Ｘ２５１Ｆ，Ｘ２５１Ｇ，Ｘ２５１Ｈ，Ｘ２５１Ｉ，Ｘ２５１Ｋ，Ｘ２５１Ｌ，Ｘ２５１Ｍ，Ｘ２５１Ｎ，Ｘ２５１Ｐ，Ｘ２５１Ｑ，Ｘ２５１Ｒ，Ｘ２５１Ｓ，Ｘ２５１Ｖ，Ｘ２５１Ｗ，Ｘ２５１Ｙ，Ｘ２５４Ａ，Ｘ２５４Ｃ，Ｘ２５４Ｄ，Ｘ２５４Ｅ，Ｘ２５４Ｆ，Ｘ２５４Ｇ，Ｘ２５４Ｉ，Ｘ２５４Ｋ，Ｘ２５４Ｌ，Ｘ２５４Ｍ，Ｘ２５４Ｎ，Ｘ２５４Ｐ，Ｘ２５４Ｑ，Ｘ２５４Ｒ，Ｘ２５４Ｓ，Ｘ２５４Ｔ，Ｘ２５４Ｖ，Ｘ２５４Ｗ，Ｘ２５４Ｙ，Ｘ２８７Ａ，Ｘ２８７Ｃ，Ｘ２８７Ｄ，Ｘ２８７Ｅ，Ｘ２８７Ｇ，Ｘ２８７Ｈ，Ｘ２８７Ｉ，Ｘ２８７Ｋ，Ｘ２８７Ｌ，Ｘ２８７Ｍ，Ｘ２８７Ｎ，Ｘ２８７Ｐ，Ｘ２８７Ｑ，Ｘ２８７Ｒ，Ｘ２８７Ｓ，Ｘ２８７Ｔ，Ｘ２
８７Ｖ，Ｘ２８７Ｗ，Ｘ２８７Ｙ，Ｘ２９０Ａ，Ｘ２９０Ｃ，Ｘ２９０Ｄ，Ｘ２９０Ｅ，Ｘ２９０Ｆ，Ｘ２９０Ｇ，Ｘ２９０Ｈ，Ｘ２９０Ｉ，Ｘ２９０Ｋ，Ｘ２９０Ｌ，Ｘ２９０Ｍ，Ｘ２９０Ｎ，Ｘ２９０Ｐ，Ｘ２９０Ｑ，Ｘ２９０Ｒ，Ｘ２９０Ｓ，Ｘ２９０Ｔ，Ｘ２９０Ｗ，Ｘ２９０Ｙ，Ｘ３０８Ａ，Ｘ３０８Ｃ，Ｘ３０８Ｄ，Ｘ３０８Ｅ，Ｘ３０８Ｆ，Ｘ３０８Ｇ，Ｘ３０８Ｈ，Ｘ３０８Ｉ，Ｘ３０８Ｋ，Ｘ３０８Ｍ，Ｘ３０８Ｎ，Ｘ３０８Ｐ，Ｘ３０８Ｑ，Ｘ３０８Ｒ，Ｘ３０８Ｓ，Ｘ３０８Ｔ，Ｘ３０８Ｖ，Ｘ３０８Ｗ，Ｘ３０８Ｙ，Ｘ３７６Ａ，Ｘ３７６Ｃ，Ｘ３７６Ｄ，Ｘ３７６Ｅ，Ｘ３７６Ｆ，Ｘ３７６Ｇ，Ｘ３７６Ｈ，Ｘ３７６Ｉ，Ｘ３７６Ｋ，Ｘ３７６Ｍ，Ｘ３７６Ｎ，Ｘ３７６Ｐ，Ｘ３７６Ｑ，Ｘ３７６Ｒ，Ｘ３７６Ｓ，Ｘ３７６Ｔ，Ｘ３７６Ｖ，Ｘ３７６Ｗ，Ｘ３７６Ｙ，Ｘ３７７Ａ，Ｘ３７７Ｃ，Ｘ３７７Ｄ，Ｘ３７７Ｅ，Ｘ３７７Ｆ，Ｘ３７７Ｇ，Ｘ３７７Ｈ，Ｘ３７７Ｉ，Ｘ３７７Ｋ，Ｘ３７７Ｌ，Ｘ３７７Ｍ，Ｘ３７７Ｎ，Ｘ３７７Ｐ，Ｘ３７７Ｑ，Ｘ３７７Ｒ，Ｘ３７７Ｓ，Ｘ３７７Ｔ，Ｘ３７７Ｖ，Ｘ３７７Ｗ，Ｘ３７９Ａ，Ｘ３７９Ｃ，Ｘ３７９Ｄ，Ｘ３７９Ｅ，Ｘ３７９Ｆ，Ｘ３７９Ｇ，Ｘ３７９Ｈ，Ｘ３７９Ｉ，Ｘ３７９Ｌ，Ｘ３７９Ｍ，Ｘ３７９Ｎ，Ｘ３７９Ｐ，Ｘ３７９Ｑ，Ｘ３７９Ｒ，Ｘ３７９Ｓ，Ｘ３７９Ｔ，Ｘ３７９Ｖ，Ｘ３７９Ｗ，Ｘ３７９Ｙ，Ｘ３８９Ａ，Ｘ３８９Ｃ，Ｘ３８９Ｄ，Ｘ３８９Ｅ，Ｘ３８９Ｆ，Ｘ３８９Ｈ，Ｘ３８９Ｉ，Ｘ３８９Ｋ，Ｘ３８９Ｌ，Ｘ３８９Ｍ，Ｘ３８９Ｎ，Ｘ３８９Ｐ，Ｘ３８９Ｑ，Ｘ３８９Ｒ，Ｘ３８９Ｓ，Ｘ３８９Ｔ，Ｘ３８９Ｖ，Ｘ３８９Ｗ，Ｘ３８９Ｙ，Ｘ３９７Ａ，Ｘ３９７Ｃ，Ｘ３９７Ｄ，Ｘ３９７Ｅ，Ｘ３９７Ｆ，Ｘ３９７Ｈ，Ｘ３９７Ｉ，Ｘ３９７Ｋ，Ｘ３９７Ｌ，Ｘ３９７Ｍ，Ｘ３９７Ｎ，Ｘ３９７Ｐ，Ｘ３９７Ｑ，Ｘ３９７Ｒ，Ｘ３９７Ｓ，Ｘ３９７Ｔ，Ｘ３９７Ｖ，Ｘ３９７Ｗ，Ｘ３９７Ｙ，Ｘ４００Ａ，Ｘ４００Ｃ，Ｘ４００Ｄ，Ｘ４００Ｅ，Ｘ４００Ｆ，Ｘ４００Ｇ，Ｘ４００Ｈ，Ｘ４００Ｉ，Ｘ４００Ｋ，Ｘ４００Ｌ，Ｘ４００Ｍ，Ｘ４００Ｎ，Ｘ４００Ｐ，Ｘ４００Ｒ，Ｘ４００Ｓ，Ｘ４００Ｔ，Ｘ４００Ｖ，Ｘ４００Ｗ，Ｘ４００Ｙ，Ｘ４０３Ａ，Ｘ４０３Ｃ，Ｘ４０３Ｄ，Ｘ４０３Ｅ，Ｘ４０３Ｇ，Ｘ４０３Ｈ，Ｘ４０３Ｉ，Ｘ４０３Ｋ，Ｘ４０３Ｌ，Ｘ４０３Ｍ，Ｘ４０３Ｎ，Ｘ４０３Ｐ，Ｘ４０３Ｑ，Ｘ４０３Ｒ，Ｘ４０３Ｓ，Ｘ４０３Ｔ，Ｘ４０３Ｖ，Ｘ４０３Ｗ，Ｘ４０３Ｙ，Ｘ４２１Ａ，Ｘ４２１Ｃ，Ｘ４２１Ｄ，Ｘ４２１Ｅ，Ｘ４２１Ｆ，Ｘ４２１Ｇ，Ｘ４２１Ｈ，Ｘ４２１Ｉ，Ｘ４２１Ｋ，Ｘ４２１Ｌ，Ｘ４２１Ｍ，Ｘ４２１Ｎ，Ｘ４２１Ｐ，Ｘ４２１Ｒ，Ｘ４２１Ｓ，Ｘ４２１Ｔ，Ｘ４２１Ｖ，Ｘ４２１Ｗ，Ｘ４２１Ｙ，Ｘ４２６Ａ，Ｘ４２６Ｃ，Ｘ４２６Ｄ，Ｘ４２６Ｅ，Ｘ４２６Ｆ，Ｘ４２６Ｇ，Ｘ４２６Ｈ，Ｘ４２６Ｉ，Ｘ４２６Ｋ，Ｘ４２６Ｌ，Ｘ４２６Ｍ，Ｘ４２６Ｎ，Ｘ４２６Ｐ，Ｘ４２６Ｑ，Ｘ４２６Ｒ，Ｘ４２６Ｓ，Ｘ４２６Ｖ，Ｘ４２６Ｗ，Ｘ４２６Ｙ，Ｘ４３０Ａ，Ｘ４３０Ｃ，Ｘ４３０Ｄ，Ｘ４３０Ｅ，Ｘ４３０Ｆ，Ｘ４３０Ｇ，Ｘ４３０Ｈ，Ｘ４３０Ｉ，Ｘ４３０Ｋ，Ｘ４３０Ｌ，Ｘ４３０Ｍ，Ｘ４３０Ｎ，Ｘ４３０Ｑ，Ｘ４３０Ｒ，Ｘ４３０Ｓ，Ｘ４３０Ｔ，Ｘ４３０Ｖ，Ｘ４３０Ｗ，Ｘ４３０Ｙ，Ｘ４３４Ａ，Ｘ４３４Ｃ，Ｘ４３４Ｄ，Ｘ４３４Ｅ，Ｘ４３４Ｇ，Ｘ４３４Ｈ，Ｘ４３４Ｉ，Ｘ４３４Ｋ，Ｘ４３４Ｌ，Ｘ４３４Ｍ，Ｘ４３４Ｎ，Ｘ４３４Ｐ，Ｘ４３４Ｑ，Ｘ４３４Ｒ，Ｘ４３４Ｓ，Ｘ４３４Ｔ，Ｘ４３４Ｖ，Ｘ４３４Ｗ，Ｘ４３４Ｙ，Ｘ４４５Ｃ，Ｘ４４５Ｄ，Ｘ４４５Ｅ，Ｘ４４５Ｆ，Ｘ４４５Ｇ，Ｘ４４５Ｈ，Ｘ４４５Ｉ，Ｘ４４５Ｋ，Ｘ４４５Ｌ，Ｘ４４５Ｍ，Ｘ４４５Ｎ，Ｘ４４５Ｐ，Ｘ４４５Ｑ，Ｘ４４５Ｒ，Ｘ４４５Ｓ，Ｘ４４５Ｔ，Ｘ４４５Ｖ，Ｘ４４５Ｗ，Ｘ４４５Ｙ，Ｘ４４８Ｃ，Ｘ４４８Ｄ，Ｘ４４８Ｅ，Ｘ４４８Ｆ，Ｘ４４８Ｇ，Ｘ４４８Ｈ，Ｘ４４８Ｉ，Ｘ４４８Ｋ，Ｘ４４８Ｌ，Ｘ４４８Ｍ，Ｘ４４８Ｎ，Ｘ４４８Ｐ，Ｘ４４８Ｑ，Ｘ４４８Ｒ，Ｘ４４８Ｓ，Ｘ４４８Ｔ，Ｘ４４８Ｖ，Ｘ４４８Ｗ，Ｘ４４８Ｙ，Ｘ４５７Ａ，Ｘ４５７Ｃ，Ｘ４５７Ｄ，Ｘ４５７Ｅ，Ｘ４５７Ｆ，Ｘ４５７Ｇ，Ｘ４５７Ｈ，Ｘ４５７Ｉ，Ｘ４５７Ｋ，Ｘ４５７Ｌ，Ｘ４５７Ｍ，Ｘ４５７Ｎ，Ｘ４５７Ｐ，Ｘ４５７Ｑ，Ｘ４５７Ｒ，Ｘ４５７Ｔ，Ｘ４５７Ｖ，Ｘ４５７Ｗ，Ｘ４５７Ｙ，Ｘ４６２Ａ，Ｘ４６２Ｃ，Ｘ４６２Ｄ，Ｘ４６２Ｅ，Ｘ４６２Ｆ，Ｘ４６２Ｇ，Ｘ４６２Ｈ，Ｘ４６２Ｉ，Ｘ４６２Ｋ，Ｘ４６２Ｌ，Ｘ４６２Ｍ，Ｘ４６２Ｎ，Ｘ４６２Ｐ，Ｘ４６２Ｑ，Ｘ４６２Ｒ，Ｘ４６２Ｓ，Ｘ４６２Ｖ，Ｘ４６２Ｗ，Ｘ４６２Ｙ，Ｘ４７６Ａ，Ｘ４７６Ｃ，Ｘ４７６Ｄ，Ｘ４７６Ｅ，Ｘ４７６Ｆ，Ｘ４７６Ｇ，Ｘ４７６Ｈ，Ｘ４７６Ｉ，Ｘ４７６Ｋ，Ｘ４７６Ｌ，Ｘ４７６Ｍ，Ｘ４７６Ｐ，Ｘ４７６Ｑ，Ｘ４７６Ｒ，Ｘ４７６Ｓ，Ｘ４７６Ｔ，Ｘ４７６Ｖ，Ｘ４７６Ｗ，Ｘ４７６Ｙ，Ｘ４８７Ａ，Ｘ４８７Ｃ，Ｘ４８７Ｄ，Ｘ４８７Ｅ，Ｘ４８７Ｆ，Ｘ４８７Ｇ，Ｘ４８７Ｈ，Ｘ４８７Ｉ，Ｘ４８７Ｌ，Ｘ４８７Ｍ，Ｘ４８７Ｎ，Ｘ４８７Ｐ，Ｘ４８７Ｑ，Ｘ４８７Ｒ，Ｘ４８７Ｓ，Ｘ４８７Ｔ，Ｘ４８７Ｖ，Ｘ４８７Ｗ，Ｘ４８７Ｙ，Ｘ４８８Ａ，Ｘ４８８Ｃ，Ｘ４８８Ｄ，Ｘ４８８Ｆ，Ｘ４８８Ｇ，Ｘ４８８Ｈ，Ｘ４８８Ｉ，Ｘ４８８Ｋ，Ｘ４８８Ｌ，Ｘ４８８Ｍ，Ｘ４８８Ｎ，Ｘ４８８Ｐ，Ｘ４８８Ｑ，Ｘ４８８Ｒ，Ｘ４８８Ｓ，Ｘ４８８Ｔ，Ｘ４８８Ｖ，Ｘ４８８Ｗ，Ｘ４８８Ｙ，Ｘ４８９Ａ，Ｘ４８９Ｃ，Ｘ４８９Ｄ，Ｘ４８９Ｅ，Ｘ４８９Ｆ，Ｘ４８９Ｇ，Ｘ４８９Ｈ，Ｘ４８９Ｉ，Ｘ４８９Ｌ，Ｘ４８９Ｍ，Ｘ４８９Ｎ，Ｘ４８９Ｐ，Ｘ４８９Ｑ，Ｘ４８９Ｒ，Ｘ４８９Ｓ，Ｘ４８９Ｔ，Ｘ４８９Ｖ，Ｘ４８９Ｗ，Ｘ４８９Ｙ，Ｘ４９０Ａ，Ｘ４９０Ｃ，Ｘ４９０Ｄ，Ｘ４９０Ｅ，Ｘ４９０Ｆ，Ｘ４９０Ｇ，Ｘ４９０Ｈ，Ｘ４９０Ｉ，Ｘ４９０Ｋ，Ｘ４９０Ｍ，Ｘ４９０Ｎ，Ｘ４９０Ｐ，Ｘ４９０Ｑ，Ｘ４９０Ｒ，Ｘ４９０Ｓ，Ｘ４９０Ｔ，Ｘ４９０Ｖ，Ｘ４９０Ｗ，Ｘ４９０Ｙ，Ｘ４９１Ａ，Ｘ４９１Ｃ，Ｘ４９１Ｄ，Ｘ４９１Ｅ，Ｘ４９１Ｆ，Ｘ４９１Ｈ，Ｘ４９１Ｉ，Ｘ４９１Ｋ，Ｘ４９１Ｌ，Ｘ４９１Ｍ，Ｘ４９１Ｎ，Ｘ４９１Ｐ，Ｘ４９１Ｑ，Ｘ４９１Ｒ，Ｘ４９１Ｓ，Ｘ４９１Ｔ，Ｘ４９１Ｖ，Ｘ４９１Ｗ，Ｘ４９１Ｙ，Ｘ４９２Ａ，Ｘ４９２Ｃ，Ｘ４９２Ｄ，Ｘ４９２Ｅ，Ｘ４９２Ｆ，Ｘ４９２Ｈ，Ｘ４９２Ｉ，Ｘ４９２Ｋ，Ｘ４９２Ｌ，Ｘ４９２Ｍ，Ｘ４９２Ｎ，Ｘ４９２Ｐ，Ｘ４９２Ｑ，Ｘ４９２Ｒ，Ｘ４９２Ｓ，Ｘ４９２Ｔ，Ｘ４９２Ｖ，Ｘ４９２Ｗ，Ｘ４９２Ｙ，Ｘ４９３Ａ，Ｘ４９３Ｃ，Ｘ４９３Ｄ，Ｘ４９３Ｅ，Ｘ４９３Ｆ，Ｘ４９３Ｇ，Ｘ４９３Ｈ，Ｘ４９３Ｉ，Ｘ４９３Ｋ，Ｘ４９３Ｌ，Ｘ４９３Ｍ，Ｘ４９３Ｎ，Ｘ４９３Ｐ，Ｘ４９３Ｑ，Ｘ４９３Ｒ，Ｘ４９３Ｔ，Ｘ４９３Ｖ，Ｘ４９３Ｗ，Ｘ４９３Ｙ，Ｘ４９５Ａ，Ｘ４９５Ｃ，Ｘ４９５Ｄ，Ｘ４９５Ｅ，Ｘ４９５Ｇ，Ｘ４９５Ｈ，Ｘ４９５Ｉ，Ｘ４９５Ｋ，Ｘ４９５Ｌ，Ｘ４９５Ｍ，Ｘ４９５Ｎ，Ｘ４９５Ｐ，Ｘ４９５Ｑ，Ｘ４９５Ｒ，Ｘ４９５Ｓ，Ｘ４９５Ｔ，Ｘ４９５Ｖ，Ｘ４９５Ｗ，Ｘ４９５Ｙ，Ｘ４９６Ｃ，Ｘ４９６Ｄ，Ｘ４９６Ｅ，Ｘ４９６Ｆ，Ｘ４９６Ｇ，Ｘ４９６Ｈ，Ｘ４９６Ｉ，Ｘ４９６Ｋ，Ｘ４９６Ｌ，Ｘ４９６Ｍ，Ｘ４９６Ｎ，Ｘ４９６Ｐ，Ｘ４９６Ｑ，Ｘ４９６Ｒ，Ｘ４９６Ｓ，Ｘ４９６Ｔ，Ｘ４９６Ｖ，Ｘ４９６Ｗ，Ｘ４９６Ｙ，Ｘ４９７Ａ，Ｘ４９７Ｃ，Ｘ４９７Ｄ，Ｘ４９７Ｅ，Ｘ４９７Ｆ，Ｘ４９７Ｇ，Ｘ４９７Ｈ，Ｘ４９７Ｉ，Ｘ４９７Ｌ，Ｘ４９７Ｍ，Ｘ４９７Ｎ，Ｘ４９７Ｐ，Ｘ４９７Ｑ，Ｘ４９７Ｒ，Ｘ４９７Ｓ，Ｘ４９７Ｔ，Ｘ４９７Ｖ，Ｘ４９７Ｗ，Ｘ４９７Ｙ，Ｘ４９８Ａ，Ｘ４９８Ｃ，Ｘ４９８Ｄ，Ｘ４９８Ｅ，Ｘ４９８Ｆ，Ｘ４９８Ｇ，Ｘ４９８Ｈ，Ｘ４９８Ｉ，Ｘ４９８Ｋ，Ｘ４９８Ｌ，Ｘ４９８Ｍ，Ｘ４９８Ｎ，Ｘ４９８Ｑ，Ｘ４９８Ｒ，Ｘ４９８Ｓ，Ｘ４９８Ｔ，Ｘ４９８Ｖ，Ｘ４９８Ｗ，Ｘ４９８Ｙ，Ｘ５０９Ａ，Ｘ５０９Ｃ，Ｘ５０９Ｄ，Ｘ５０９Ｅ，Ｘ５０９Ｆ，Ｘ５０９Ｇ，Ｘ５０９Ｈ，Ｘ５０９Ｉ，Ｘ５０９Ｋ，Ｘ５０９Ｌ，Ｘ５０９Ｍ，Ｘ５０９Ｎ，Ｘ５０９Ｐ，Ｘ５０９Ｒ，Ｘ５０９Ｓ，Ｘ５０９Ｔ，Ｘ５０９Ｖ，Ｘ５０９Ｗ，Ｘ５０９Ｙ，Ｘ５１４Ａ，Ｘ５１４Ｃ，Ｘ５１４Ｄ，Ｘ５１４Ｅ，Ｘ５１４Ｆ，Ｘ５１４Ｇ，Ｘ５１４Ｈ，Ｘ５１４Ｉ，Ｘ５１４Ｋ，Ｘ５１４Ｌ，Ｘ５１４Ｍ，Ｘ５１４Ｎ，Ｘ５１４Ｐ，Ｘ５１４Ｑ，Ｘ５１４Ｒ，Ｘ５１４Ｓ，Ｘ５１４Ｔ，Ｘ５１４Ｖ，Ｘ５１４Ｗ，Ｘ５２１Ａ，Ｘ５２１Ｃ，Ｘ５２１Ｄ，Ｘ５２１Ｅ，Ｘ５２１Ｆ，Ｘ５２１Ｇ，Ｘ５２１Ｈ，Ｘ５２１Ｉ，Ｘ５２１Ｋ，Ｘ５２１Ｌ，Ｘ５２１Ｍ，Ｘ５２１Ｎ，Ｘ５２１Ｐ，Ｘ５２１Ｑ，Ｘ５２１Ｒ，Ｘ５２１Ｓ，Ｘ５２１Ｖ，Ｘ５２１Ｗ，Ｘ５２１Ｙ，Ｘ５３９Ａ，Ｘ５３９Ｃ，Ｘ５３９Ｄ，Ｘ５３９Ｅ，Ｘ５３９Ｆ，Ｘ５３９Ｇ，Ｘ５３９Ｈ，Ｘ５３９Ｋ，Ｘ５３９Ｌ，Ｘ５３９Ｍ，Ｘ５３９Ｎ，Ｘ５３９Ｐ，Ｘ５３９Ｑ，Ｘ５３９Ｒ，Ｘ５３９Ｓ，Ｘ５３９Ｔ，Ｘ５３９Ｖ，Ｘ５３９Ｗ，Ｘ５３９Ｙ，Ｘ５４０Ａ，Ｘ５４０Ｃ，Ｘ５４０Ｄ，Ｘ５４０Ｅ，Ｘ５４０Ｆ，Ｘ５４０Ｇ，Ｘ５４０Ｈ，Ｘ５４０Ｉ，Ｘ５４０Ｋ，Ｘ５４０Ｍ，Ｘ５４０Ｎ，Ｘ５４０Ｐ，Ｘ５４０Ｑ，Ｘ５４０Ｒ，Ｘ５４０Ｓ，Ｘ５４０Ｔ，Ｘ５４０Ｖ，Ｘ５４０Ｗ，Ｘ５４０Ｙ，Ｘ５４４Ａ，Ｘ５４４Ｃ，Ｘ５４４Ｄ，Ｘ５４４Ｅ，Ｘ５４４Ｆ，Ｘ５４４Ｇ，Ｘ５４４Ｈ，Ｘ５４４Ｉ，Ｘ５４４Ｋ，Ｘ５４４Ｌ，Ｘ５４４Ｍ，Ｘ５４４Ｎ，Ｘ５４４Ｐ，Ｘ５４４Ｑ，Ｘ５４４Ｓ，Ｘ５４４Ｔ，Ｘ５４４Ｖ，Ｘ５４４Ｗ，及びＸ５４４Ｙからなる群から選択されるアミノ酸残基置換を含む、非天然に生じるイソプレン合成酵素変異体を提供し、
ここで、Ｘは任意のアミノ酸を表し、
各アミノ酸残基の位置は、図２０に示す通りのウラジロハコヤナギ（Ｐ．ａｌｂａ）イソプレン合成酵素配列中のアミノ酸残基の位置と対応させて付番する。
他の実施形態では、変異体は、アミノ酸残基：Ｎ４３８，Ｅ４５１，及びＹ５１４を含む。他の実施形態では、変異体は、アミノ酸残基：Ｆ２８７，Ｇ３９７，Ｎ４３８，Ｅ４５１，及びＹ５１４を含む。任意の実施形態では、変異体は：Ｘ００３Ｈ，Ｘ００３Ｔ，Ｘ０３３Ｈ，Ｘ０３３Ｉ，Ｘ０３３Ｋ，Ｘ０３３Ｓ，Ｘ０３３Ｔ，Ｘ０３３Ｖ，Ｘ０３３Ｗ，Ｘ０３３Ｙ，Ｘ０３６Ｌ，Ｘ０４４Ｆ，Ｘ０４４Ｈ，Ｘ０４４Ｔ，Ｘ０５０Ｉ，Ｘ０５０Ｌ，Ｘ０５０Ｗ，Ｘ０５３Ｉ，Ｘ０５３Ｌ，Ｘ０５３Ｔ，Ｘ０５３Ｖ，Ｘ０５３Ｗ，Ｘ０５３Ｙ，Ｘ０５９Ａ，Ｘ０５９Ｃ，Ｘ０５９Ｆ，Ｘ０５９Ｇ，Ｘ０５９Ｈ，Ｘ０５９Ｉ，Ｘ０５９Ｋ，Ｘ０５９Ｍ，Ｘ０５９Ｒ，Ｘ０６９Ｓ，Ｘ０７４Ｉ，Ｘ０７４Ｋ，Ｘ０７４Ｗ，Ｘ０７８Ｉ，Ｘ０７８Ｌ，Ｘ０７８Ｗ，Ｘ０７８Ｙ，Ｘ０８７Ｋ，Ｘ０８７Ｌ，Ｘ０８７Ｔ，Ｘ０９９Ｉ，Ｘ０９９Ｋ，Ｘ０９９Ｌ，Ｘ０９９Ｔ，Ｘ０９９Ｖ，Ｘ０９９Ｙ，Ｘ１１６Ｆ，Ｘ１１６Ｉ，Ｘ１１６Ｔ，Ｘ１１６Ｖ，Ｘ１１６Ｗ，Ｘ１１６Ｙ，Ｘ１１７Ｆ，Ｘ１１７Ｉ，Ｘ１１７Ｌ，Ｘ１１７Ｗ，Ｘ１２０Ｉ，Ｘ１２０Ｌ，Ｘ１３９Ｔ，Ｘ１６５Ｈ，Ｘ１６５Ｙ，Ｘ１７３Ｈ，Ｘ１７３Ｔ，Ｘ１７３Ｖ，Ｘ１７３Ｗ，Ｘ１７４Ｈ，Ｘ１７４Ｉ，Ｘ１７７Ｌ，Ｘ１７７Ｔ，Ｘ１７７Ｖ，Ｘ１７９Ｈ，Ｘ１７９Ｉ，Ｘ１７９Ｋ，Ｘ１７９Ｌ，Ｘ１７９Ｔ，Ｘ１７９Ｖ，Ｘ１７９Ｗ，Ｘ２０２Ｈ，Ｘ２５４Ｋ，Ｘ３７６Ｉ，Ｘ３７７Ｗ，Ｘ３８９Ｋ，Ｘ４２１Ｅ，Ｘ４２１Ｈ，Ｘ４２１Ｒ，Ｘ４４８Ｈ，Ｘ４４８Ｔ，Ｘ４４８Ｖ，Ｘ４６２Ｈ，Ｘ４６２Ｋ，Ｘ４６２Ｖ，Ｘ４７６Ｙ，Ｘ４８７Ｔ，Ｘ４８９Ｉ，Ｘ４８９Ｒ，Ｘ４８９Ｔ，Ｘ４８９Ｗ，Ｘ４９０Ｈ，Ｘ４９０Ｉ，Ｘ４９０Ｔ，Ｘ４９０Ｖ，Ｘ４９０Ｗ，Ｘ４９１Ｈ，Ｘ４９１Ｉ，Ｘ４９１Ｋ，Ｘ４９１Ｌ，Ｘ４９１Ｔ，Ｘ４９１Ｖ，Ｘ４９１Ｗ，Ｘ４９１Ｙ，Ｘ４９２Ａ，Ｘ４９２Ｄ，Ｘ４９２Ｅ，Ｘ４９２Ｈ，Ｘ４９２Ｉ，Ｘ４９２Ｋ，Ｘ４９２Ｔ，Ｘ４９２Ｖ，Ｘ４９３Ｅ，Ｘ４９３Ｇ，Ｘ４９３Ｉ，Ｘ４９３Ｋ，Ｘ４９３Ｌ，Ｘ４９３Ｒ，Ｘ４９３Ｔ，Ｘ４９３Ｖ，Ｘ４９３Ｗ，Ｘ４９５Ｈ，Ｘ４９５Ｋ，Ｘ４９５Ｌ，Ｘ４９５Ｍ，Ｘ４９５Ｒ，Ｘ４９５Ｓ，Ｘ４９５Ｔ，Ｘ４９５Ｖ，Ｘ４９５Ｗ，Ｘ４９５Ｙ，Ｘ４９６Ｈ，Ｘ４９８Ｈ，Ｘ５０９Ｉ，Ｘ５０９Ｔ，Ｘ５０９Ｖ，Ｘ５３９Ｌ，Ｘ５３９Ｔ，Ｘ５３９Ｖ，Ｘ５４０Ｈ，Ｘ５４０Ｉ，Ｘ５４０Ｋ，Ｘ５４０Ｔ，Ｘ５４０Ｖ，Ｘ５４０Ｙ，Ｘ５４４Ｓ，Ｘ５４４Ｔ，Ｘ５４４Ｖ，及びＸ５４４Ｗからなる群から選択される置換を含む。
本明細書の任意の実施形態では、変異体は：Ｘ００３Ｔ，Ｘ０１６Ｉ，Ｘ０３３Ｆ，Ｘ０３３Ｈ，Ｘ０３３Ｉ，Ｘ０３３Ｖ，Ｘ０３６Ｉ，Ｘ０４４Ｆ，Ｘ０４４Ｍ，Ｘ０５０Ｈ，Ｘ０５０Ｉ，Ｘ０５０Ｔ，Ｘ０５０Ｗ，Ｘ０５３Ｉ，Ｘ０５９Ｃ，Ｘ０５９Ｅ，Ｘ０５９Ｆ，Ｘ０５９Ｈ，Ｘ０５９Ｉ，Ｘ０５９Ｋ，Ｘ０５９Ｑ，Ｘ０５９Ｒ，Ｘ０５９Ｔ，Ｘ０６９Ｓ，Ｘ０６９Ｔ，Ｘ０７４Ｈ，Ｘ０７４Ｉ，Ｘ０７４Ｋ，Ｘ０７４Ｔ，Ｘ０７４Ｖ，Ｘ０７４Ｗ，Ｘ０７８Ｆ，Ｘ０７８Ｈ，Ｘ０７８Ｉ，Ｘ０７８Ｒ，Ｘ０７８Ｔ，Ｘ０７８Ｖ，Ｘ０７８Ｗ，Ｘ０７８Ｙ，Ｘ０９９Ｉ，Ｘ０９９Ｋ，Ｘ０９９Ｔ，Ｘ０９９Ｖ，Ｘ１１６Ｆ，Ｘ１１６Ｉ，Ｘ１１６Ｎ，Ｘ１１６Ｐ，Ｘ１１６Ｔ，Ｘ１１６Ｖ，Ｘ１１６Ｗ，Ｘ１１７Ｃ，Ｘ１１７Ｆ，Ｘ１１７Ｉ，Ｘ１１７Ｌ，Ｘ１１７Ｍ，Ｘ１１７Ｗ，Ｘ１２５Ｆ，Ｘ１２５Ｖ，Ｘ１２５Ｗ，Ｘ１２７Ｈ，Ｘ１２７Ｔ，Ｘ１３９Ｔ，Ｘ１６５Ｆ，Ｘ１６５Ｈ，Ｘ１６５Ｋ，Ｘ１６５Ｙ，Ｘ１７３Ｆ，Ｘ１７３Ｈ，Ｘ１７３Ｋ，Ｘ１７３Ｒ，Ｘ１７３Ｔ，Ｘ１７３Ｖ，Ｘ１７３Ｗ，Ｘ１７４Ｈ，Ｘ１７４Ｉ，Ｘ１７４Ｔ，Ｘ１７９Ｇ，Ｘ１７９Ｉ，Ｘ１７９Ｓ，Ｘ２１６Ａ，Ｘ４２１Ｒ，Ｘ４４８Ｒ，Ｘ４４８Ｔ，Ｘ４４８Ｖ，Ｘ４６２Ｈ，Ｘ４６２Ｉ，Ｘ４６２Ｋ，Ｘ４６２Ｖ，Ｘ４６２Ｗ，Ｘ４７６Ｒ，Ｘ４７６Ｖ，Ｘ４８７Ｆ，Ｘ４８７Ｈ，Ｘ４８７Ｔ，Ｘ４８７Ｗ，Ｘ４８９Ｒ，Ｘ４９０Ｆ，Ｘ４９０Ｈ，Ｘ４９０Ｉ，Ｘ４９０Ｖ，Ｘ４９０Ｗ，Ｘ４９１Ｃ，Ｘ４９１Ｈ，Ｘ４９１Ｉ，Ｘ４９１Ｌ，Ｘ４９１Ｔ，Ｘ４９１Ｖ，Ｘ４９１Ｗ，Ｘ４９２Ａ，Ｘ４９２Ｅ，Ｘ４９３Ｇ，Ｘ４９３Ｉ，Ｘ４９３Ｌ，Ｘ４９３Ｔ，Ｘ４９３Ｖ，Ｘ４９３Ｗ，Ｘ４９５Ｌ，Ｘ４９８Ｃ，Ｘ５４０Ｉ，Ｘ５４０Ｓ，Ｘ５４０Ｔ，Ｘ５４０Ｖ，及びＸ５４４Ｋからなる群から選択される置換を含む。
本明細書の任意の実施形態では、変異体は：Ｘ００３Ｔ，Ｘ０３３Ｈ，Ｘ０３３Ｉ，Ｘ０３３Ｖ，Ｘ０４４Ｆ，Ｘ０５０Ｉ，Ｘ０５０Ｗ，Ｘ０５３Ｉ，Ｘ０５９Ｃ，Ｘ０５９Ｆ，Ｘ０５９Ｈ，Ｘ０５９Ｉ，Ｘ０５９Ｋ，Ｘ０５９Ｒ，Ｘ０６９Ｓ，Ｘ０７４Ｉ，Ｘ０７４Ｋ，Ｘ０７４Ｗ，Ｘ０７８Ｉ，Ｘ０９９Ｉ，Ｘ０９９Ｋ，Ｘ０９９Ｔ，Ｘ０９９Ｖ，Ｘ１１６Ｆ，Ｘ１１６Ｉ，Ｘ１１６Ｔ，Ｘ１１６Ｖ，Ｘ１１６Ｗ，Ｘ１１７Ｆ，Ｘ１１７Ｉ，Ｘ１１７Ｌ，Ｘ１１７Ｗ，Ｘ１３９Ｔ，Ｘ１６５Ｈ，Ｘ１６５Ｙ，Ｘ１７３Ｈ，Ｘ１７３Ｔ，Ｘ１７３Ｖ，Ｘ１７３Ｗ，Ｘ１７４Ｈ，Ｘ１７４Ｉ，Ｘ０７８Ｗ，Ｘ０７８Ｙ，Ｘ１７９Ｉ，Ｘ４２１Ｒ，Ｘ４４８Ｔ，Ｘ４４８Ｖ，Ｘ４６２Ｈ，Ｘ４６２Ｋ，Ｘ４６２Ｖ，Ｘ４８７Ｔ，Ｘ４８９Ｒ，Ｘ４９０Ｈ，Ｘ４９０Ｉ，Ｘ４９０Ｖ，Ｘ４９０Ｗ，Ｘ４９１Ｉ，Ｘ４９１Ｈ，Ｘ４９１Ｌ，Ｘ４９１Ｔ，Ｘ４９１Ｖ，Ｘ４９１Ｗ，Ｘ４９２Ａ，Ｘ４９２Ｅ，Ｘ４９３Ｇ，Ｘ４９３Ｉ，Ｘ４９３Ｌ，Ｘ４９３Ｔ，Ｘ４９３Ｖ，Ｘ４９３Ｗ，Ｘ４９５Ｌ，Ｘ５４０Ｉ，Ｘ５４０Ｔ，Ｘ５４０Ｖからなる群から選択される置換を含む。
本明細書の任意の実施形態では、変異体は：Ｘ００３Ｆ，Ｘ００３Ｈ，Ｘ００３Ｉ，Ｘ００３Ｋ，Ｘ００３Ｒ，Ｘ００３Ｔ，Ｘ００３Ｙ，Ｘ０１３Ｌ，Ｘ０１６Ｉ，Ｘ０１６Ｌ，Ｘ０１６Ｍ，Ｘ０１８Ｃ，Ｘ０１８Ｇ，Ｘ０２０Ｍ，Ｘ０２０Ｓ，Ｘ０２０Ｔ，Ｘ０２０Ｖ，Ｘ０２０Ｙ，Ｘ０２３Ｈ，Ｘ０２５Ｈ，Ｘ０２５Ｉ，Ｘ０２５Ｋ，Ｘ０２５Ｌ，Ｘ０２５Ｔ，Ｘ０２５Ｖ，Ｘ０３３Ｆ，Ｘ０３３Ｈ，Ｘ０３３Ｉ，Ｘ０３３Ｋ，Ｘ０３３Ｌ，Ｘ０３３Ｑ，Ｘ０３３Ｒ，Ｘ０３３Ｓ，Ｘ０３３Ｔ，Ｘ０３３Ｖ，Ｘ０３３Ｗ，Ｘ０３３Ｙ，Ｘ０３６Ｉ，Ｘ０３６Ｌ，Ｘ０３６Ｒ，Ｘ０３６Ｔ，Ｘ０３６Ｖ，Ｘ０３６Ｗ，Ｘ０３６Ｙ，Ｘ０４４Ｃ，Ｘ０４４Ｆ，Ｘ０４４Ｈ，Ｘ０４４Ｉ，Ｘ０４４Ｋ，Ｘ０４４Ｔ，Ｘ０４４Ｖ，Ｘ０４４Ｙ，Ｘ０５０Ｈ，Ｘ０５０Ｉ，Ｘ０５０Ｌ，Ｘ０５０Ｔ，Ｘ０５０Ｖ，Ｘ０５０Ｗ，Ｘ０５０Ｙ，Ｘ０５３Ｇ，Ｘ０５３Ｈ，Ｘ０５３Ｉ，Ｘ０５３Ｋ，Ｘ０５３Ｌ，Ｘ０５３Ｒ，Ｘ０５３Ｓ，Ｘ０５３Ｔ，Ｘ０５３Ｖ，Ｘ０５３Ｗ，Ｘ０５３Ｙ，Ｘ０５９Ａ，Ｘ０５９Ｃ，Ｘ０５９Ｄ，Ｘ０５９Ｅ，Ｘ０５９Ｆ，Ｘ０５９Ｇ，Ｘ０５９Ｈ，Ｘ０５９Ｉ，Ｘ０５９Ｋ，Ｘ０５９Ｍ，Ｘ０５９Ｎ，Ｘ０５９Ｑ，Ｘ０５９Ｒ，Ｘ０５９Ｔ，Ｘ０５９Ｖ，Ｘ０５９Ｗ，Ｘ０６９Ａ，Ｘ０６９Ｈ，Ｘ０６９Ｉ，Ｘ０６９Ｋ，Ｘ０６９Ｌ，Ｘ０６９Ｍ，Ｘ０６９Ｎ，Ｘ０６９Ｑ，Ｘ０６９Ｒ，Ｘ０６９Ｓ，Ｘ０６９Ｔ，Ｘ０６９Ｖ，Ｘ０７４Ｈ，Ｘ０７４Ｉ，Ｘ０７４Ｋ，Ｘ０７４Ｌ，Ｘ０７４Ｔ，Ｘ０７４Ｖ，Ｘ０７４Ｗ，Ｘ０７４Ｙ，Ｘ０７８Ｆ，Ｘ０７８Ｈ，Ｘ０７８Ｉ，Ｘ０７８Ｋ，Ｘ０７８Ｌ，Ｘ０７８Ｔ，Ｘ０７８Ｖ，Ｘ０７８Ｗ，Ｘ０７８Ｙ，Ｘ０８７Ｈ，Ｘ０８７Ｉ，Ｘ０８７Ｋ，Ｘ０８７Ｌ，Ｘ０８７Ｍ，Ｘ０８７Ｒ，Ｘ０８７Ｔ，Ｘ０８７Ｖ，Ｘ０８７Ｗ，Ｘ０８７Ｙ，Ｘ０９９Ｆ，Ｘ０９９Ｉ，Ｘ０９９Ｋ，Ｘ０９９Ｌ，Ｘ０９９Ｒ，Ｘ０９９Ｓ，Ｘ０９９Ｔ，Ｘ０９９Ｖ，Ｘ０９９Ｗ，Ｘ０９９Ｙ，Ｘ１１６Ａ，Ｘ１１６Ｆ，Ｘ１１６Ｉ，Ｘ１１６Ｋ，Ｘ１１６Ｌ，Ｘ１１６Ｓ，Ｘ１１６Ｔ，Ｘ１１６Ｖ，Ｘ１１６Ｗ，Ｘ１１６Ｙ，Ｘ１１７Ｆ，Ｘ１１７Ｈ，Ｘ１１７Ｉ，Ｘ１１７Ｌ，Ｘ１１７Ｍ，Ｘ１１７Ｗ，Ｘ１２０Ｆ，Ｘ１２０Ｈ，Ｘ１２０Ｉ，Ｘ１２０Ｋ，Ｘ１２０Ｌ，Ｘ１２０Ｔ，Ｘ１２０Ｖ，Ｘ１２０Ｗ，Ｘ１２０Ｙ，Ｘ１２１Ｆ，Ｘ１２１Ｈ，Ｘ１２１Ｉ，Ｘ１２１Ｋ，Ｘ１２１Ｌ，Ｘ１２１Ｔ，Ｘ１２１Ｖ，Ｘ１２１Ｗ，Ｘ１２１Ｙ，Ｘ１２５Ｈ，Ｘ１２５Ｉ，Ｘ１２５Ｍ，Ｘ１２５Ｔ，Ｘ１２５Ｗ，Ｘ１２５Ｙ，Ｘ１２７Ｆ，Ｘ１２７Ｈ，Ｘ１２７Ｉ，Ｘ１２７Ｌ，Ｘ１２７Ｔ，Ｘ１２７Ｖ，Ｘ１２７Ｙ，Ｘ１３９Ｃ，Ｘ１３９Ｈ，Ｘ１３９Ｉ，Ｘ１３９Ｐ，Ｘ１３９Ｓ，Ｘ１３９Ｔ，Ｘ１３９Ｖ，Ｘ１６５Ａ，Ｘ１６５Ｄ，Ｘ１６５Ｆ，Ｘ１６５Ｈ，Ｘ１６５Ｋ，Ｘ１６５Ｌ，Ｘ１６５Ｒ，Ｘ１６５Ｔ，Ｘ１６５Ｙ，Ｘ１７３Ｆ，Ｘ１７３Ｇ，Ｘ１７３Ｈ，Ｘ１７３Ｉ，Ｘ１７３Ｋ，Ｘ１７３Ｌ，Ｘ１７３Ｍ，Ｘ１７３Ｒ，Ｘ１７３Ｓ，Ｘ１７３Ｔ，Ｘ１７３Ｖ，Ｘ１７３Ｗ，Ｘ１７３Ｙ，Ｘ１７４Ｆ，Ｘ１７４Ｈ，Ｘ１７４Ｉ，Ｘ１７４Ｋ，Ｘ１７４Ｌ，Ｘ１７４Ｒ，Ｘ１７４Ｔ，Ｘ１７４Ｖ，Ｘ１７４Ｗ，Ｘ１７４Ｙ，Ｘ１７７Ａ，Ｘ１７７Ｈ，Ｘ１７７Ｉ，Ｘ１７７Ｋ，Ｘ１７７Ｌ，Ｘ１７７Ｍ，Ｘ１７７Ｐ，Ｘ１７７Ｔ，Ｘ１７７Ｖ，Ｘ１７７Ｙ，Ｘ１７９Ｆ，Ｘ１７９Ｇ，Ｘ１７９Ｈ，Ｘ１７９Ｉ，Ｘ１７９Ｋ，Ｘ１７９Ｌ，Ｘ１７９Ｍ，Ｘ１７９Ｓ，Ｘ１７９Ｔ，Ｘ１７９Ｖ，Ｘ１７９Ｗ，Ｘ１７９Ｙ，Ｘ１９４Ｈ，Ｘ１９７Ｈ，Ｘ１９７Ｉ，Ｘ１９７Ｍ，Ｘ１９７Ｔ，Ｘ１９７Ｖ，Ｘ２０２Ｆ，Ｘ２０２Ｈ，Ｘ２０２Ｉ，Ｘ２０２Ｋ，Ｘ２０２Ｒ，Ｘ２０２Ｔ，Ｘ２０２Ｙ，Ｘ２４６Ｈ，Ｘ２４６Ｋ，Ｘ２４６Ｔ，Ｘ２５１Ｈ，Ｘ２５１Ｋ，Ｘ２５１Ｎ，Ｘ２５１Ｙ，Ｘ２５４Ｆ，Ｘ２５４Ｉ，Ｘ２５４Ｋ，Ｘ２５４Ｒ，Ｘ２５４Ｔ，Ｘ２５４Ｖ，Ｘ２５４Ｗ，Ｘ３０８Ｈ，Ｘ３０８Ｉ，Ｘ３０８Ｗ，Ｘ３７６Ｉ，Ｘ３７６Ｙ，Ｘ３７７Ｈ，Ｘ３７７Ｉ，Ｘ３７７Ｌ，Ｘ３７７Ｖ，Ｘ３７７Ｗ，Ｘ３７９Ｈ，Ｘ３７９Ｒ，Ｘ３７９Ｔ，Ｘ３７９Ｖ，Ｘ３８９Ｈ，Ｘ３８９Ｉ，Ｘ３８９Ｋ，Ｘ３８９Ｌ，Ｘ３８９Ｍ，Ｘ３８９Ｒ，Ｘ３８９Ｓ，Ｘ３８９Ｔ，Ｘ３８９Ｖ，Ｘ３８９Ｙ，Ｘ４０３Ｔ，Ｘ４０３Ｖ，Ｘ４２１Ｅ，Ｘ４２１Ｇ，Ｘ４２１Ｈ，Ｘ４２１Ｉ，Ｘ４２１Ｋ，Ｘ４２１Ｌ，Ｘ４２１Ｒ，Ｘ４２１Ｔ，Ｘ４２１Ｖ，Ｘ４２１Ｗ，Ｘ４２６Ｉ，Ｘ４２６Ｖ，Ｘ４３０Ｓ，Ｘ４３０Ｔ，Ｘ４３０Ｖ，Ｘ４４５Ｈ，Ｘ４４８Ｈ，Ｘ４４８Ｉ，Ｘ４４８Ｒ，Ｘ４４８Ｓ，Ｘ４４８Ｔ，Ｘ４４８Ｖ，Ｘ４５７Ｈ，Ｘ４５７Ｑ，Ｘ４５７Ｒ，Ｘ４５７Ｔ，Ｘ４６２Ｆ，Ｘ４６２Ｇ，Ｘ４６２Ｈ，Ｘ４６２Ｉ，Ｘ４６２Ｋ，Ｘ４６２Ｌ，Ｘ４６２Ｓ，Ｘ４６２Ｖ，Ｘ４６２Ｗ，Ｘ４６２Ｙ，Ｘ４７６Ｒ，Ｘ４７６Ｔ，Ｘ４７６Ｖ，Ｘ４７６Ｗ，Ｘ４７６Ｙ，Ｘ４８７Ａ，Ｘ４８７Ｃ，Ｘ４８７Ｆ，Ｘ４８７Ｇ，Ｘ４８７Ｈ，Ｘ４８７Ｌ，Ｘ４８７Ｍ，Ｘ４８７Ｒ，Ｘ４８７Ｓ，Ｘ４８７Ｔ，Ｘ４８７Ｖ，Ｘ４８７Ｗ，Ｘ４８９Ｈ，Ｘ４８９Ｉ，Ｘ４８９Ｌ，Ｘ４８９Ｒ，Ｘ４８９Ｔ，Ｘ４８９Ｖ，Ｘ４８９Ｗ，Ｘ４９０Ｆ，Ｘ４９０Ｈ，Ｘ４９０Ｉ，Ｘ４９０Ｍ，Ｘ４９０Ｔ，Ｘ４９０Ｖ，Ｘ４９０Ｗ，Ｘ４９１Ａ，Ｘ４９１Ｃ，Ｘ４９１Ｆ，Ｘ４９１Ｈ，Ｘ４９１Ｉ，Ｘ４９１Ｋ，Ｘ４９１Ｌ，Ｘ４９１Ｍ，Ｘ４９１Ｎ，Ｘ４９１Ｒ，Ｘ４９１Ｓ，Ｘ４９１Ｔ，Ｘ４９１Ｖ，Ｘ４９１Ｗ，Ｘ４９１Ｙ，Ｘ４９２Ａ，Ｘ４９２Ｃ，Ｘ４９２Ｄ，Ｘ４９２Ｅ，Ｘ４９２Ｈ，Ｘ４９２Ｉ，Ｘ４９２Ｋ，Ｘ４９２Ｌ，Ｘ４９２Ｒ，Ｘ４９２Ｔ，Ｘ４９２Ｖ，Ｘ４９２Ｗ，Ｘ４９２Ｙ，Ｘ４９３Ａ，Ｘ４９３Ｃ，Ｘ４９３Ｅ，Ｘ４９３Ｇ，Ｘ４９３Ｉ，Ｘ４９３Ｋ，Ｘ４９３Ｌ，Ｘ４９３Ｍ，Ｘ４９３Ｒ，Ｘ４９３Ｔ，Ｘ４９３Ｖ，Ｘ４９３Ｗ，Ｘ４９３Ｙ，Ｘ４９５Ａ，Ｘ４９５Ｇ，Ｘ４９５Ｈ，Ｘ４９５Ｉ，Ｘ４９５Ｋ，Ｘ４９５Ｌ，Ｘ４９５Ｍ，Ｘ４９５Ｑ，Ｘ４９５Ｒ，Ｘ４９５Ｓ，Ｘ４９５Ｔ，Ｘ４９５Ｖ，Ｘ４９５Ｗ，Ｘ４９５Ｙ，Ｘ４９６Ｈ，Ｘ４９６Ｉ，Ｘ４９６Ｋ，Ｘ４９６Ｌ，Ｘ４９６Ｒ，Ｘ４９６Ｔ，Ｘ４９６Ｖ，Ｘ４９６Ｙ，Ｘ４９７Ｈ，Ｘ４９７Ｉ，Ｘ４９７Ｌ，Ｘ４９７Ｔ，Ｘ４９７Ｖ，Ｘ４９８Ｆ，Ｘ４９８Ｇ，Ｘ４９８Ｈ，Ｘ４９８Ｉ，Ｘ４９８Ｋ，Ｘ４９８Ｌ，Ｘ４９８Ｒ，Ｘ４９８Ｓ，Ｘ４９８Ｔ，Ｘ４９８Ｖ，Ｘ４９８Ｙ，Ｘ５０９Ｉ，Ｘ５０９Ｍ，Ｘ５０９Ｓ，Ｘ５０９Ｔ，Ｘ５０９Ｖ，Ｘ５３９Ｋ，Ｘ５３９Ｌ，Ｘ５３９Ｔ，Ｘ５３９Ｖ，Ｘ５４０Ｅ，Ｘ５４０Ｆ，Ｘ５４０Ｇ，Ｘ５４０Ｈ，Ｘ５４０Ｉ，Ｘ５４０Ｋ，Ｘ５４０Ｍ，Ｘ５４０Ｑ，Ｘ５４０Ｒ，Ｘ５４０Ｓ，Ｘ５４０Ｔ，Ｘ５４０Ｖ，Ｘ５４０Ｗ，Ｘ５４０Ｙ，Ｘ５４４Ｃ，Ｘ５４４Ｈ，Ｘ５４４Ｉ，Ｘ５４４Ｋ，Ｘ５４４Ｌ，Ｘ５４４Ｓ，Ｘ５４４Ｔ，Ｘ５４４Ｖ，及びＸ５４４Ｗからなる群から選択される置換を含む。
本明細書の任意の実施形態では、変異体は：Ｘ００３Ｔ，Ｘ０１３Ｌ，Ｘ１１７Ｉ，Ｘ１６５Ｙ，Ｘ４２１Ｒ，Ｘ４９５Ｌ，Ｘ５０９Ｔ，及びＸ５４０Ｖからなる群から選択される置換を含む。本明細書の任意の実施形態では、変異体はＸ００３Ｔを含む。本明細書の任意の実施形態では、変異体はＸ４９５Ｌを含む。本明細書の任意の実施形態では、変異体はＸ５０９Ｔを含む。
本明細書の任意の実施形態では、表面の疎水性アミノ酸残基が置換される。本明細書の任意の実施形態では、対照的に接触するアミノ酸残基が置換される。本明細書の任意の実施形態では、保存的なアミノ酸残基が置換される。本明細書の任意の実施形態では、Ｎ端末ループのアミノ酸残基が置換される。本明細書の任意の実施形態では、表面の親水性アミノ酸残基が置換される。本明細書の任意の実施形態では、表面ループのアミノ酸残基が置換される。本明細書の任意の実施形態では、活性部位のアミノ酸残基が置換される。本明細書の任意の実施形態では、可動ループのアミノ酸残基が置換される。本明細書の任意の実施形態では、疎水性ポケットのアミノ酸残基が置換される。本明細書の任意の実施形態では、Ｃ末端のアミノ酸残基が置換される。
本明細書の任意の実施形態では、アミノ酸残基５０９はβ炭素が分岐している。本明細書の任意の実施形態では、変異体は、Ｎ端末にトランケーションを有する。
本明細書の任意の実施形態では、Ｎ端末のトランケーション部位は、図２１Ａ〜２１Ｂに示すものと一致するアミノ酸残基を含む。
本明細書の任意の実施形態では、変異体は、植物イソプレン合成酵素の変異体である。本明細書の任意の実施形態では、変異体は、ポプラ変異体である。本明細書の任意の実施形態では、変異体は、ウラジロハコヤナギ変異体である。本明細書の任意の実施形態では、変異体は、アメリカヤマナラシ変異体である。本明細書の任意の実施形態では、変異体は、Ｐ．トリコカルパ（P．trichocharpa）変異体である。本明細書の任意の実施形態では、変異体は、セイヨウハコヤナギ変異体である。本明細書の任意の実施形態では、変異体は、ウラジロハコヤナギｖ．アメリカヤマナラシ変異体である。本明細書の任意の実施形態では、変異体は、クズ変異体である。本明細書の任意の実施形態では、変異体は、アスペン変異体である。本明細書の任意の実施形態では、変異体は、ヨーロッパナラ変異体である。本明細書の任意の実施形態では、変異体は、ヤナギ変異体である。
本明細書の任意の実施形態では、変異体は、野生型イソプレン合成酵素と少なくとも４０％配列相同性であるアミノ酸配列を含む。本明細書の任意の実施形態では、変異体は、野生型イソプレン合成酵素と少なくとも６０％配列相同性であるアミノ酸配列を含む。本明細書の任意の実施形態では、変異体は、野生型イソプレン合成酵素と少なくとも８０％配列相同性であるアミノ酸配列を含む。本明細書の任意の実施形態では、変異体は、野生型イソプレン合成酵素と少なくとも９０％配列相同性であるアミノ酸配列を含む。
本明細書の任意の実施形態では、操作可能にプロモーターと組み合わせた変異体をコードしている異種ポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞は、ＭＥＡウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素をコードしている配列を含む宿主細胞と比べた場合に、少なくとも約０．８、０．９、１．０、１．１、１．２、１．３、又は１．４の増殖指数を有する。
他の態様では、本発明は、本開示に記載の任意の実施例に関するイソプレン合成酵素変異体を提供し、ここで、操作可能にプロモーターと組み合わせた変異体をコードしている異種ポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞は、ＭＥＡウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素をコードしている配列を含む宿主細胞と比べた場合に、少なくとも約０．８、０．９、１．０、又は１．１の増殖指数を有する。
他の態様では、本発明は、本開示に記載の任意の実施例に関するイソプレン合成酵素変異体を提供し、ここで、操作可能にプロモーターと組み合わせた変異体をコードしている異種ポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞は、ＭＥＡウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素をコードしている配列を含む宿主細胞と比べた場合に、次の特性：
比生産性が少なくとも約１０５％である、
収率が少なくとも約１０５％である、及び
細胞性能指数が少なくとも約１０５％である、を１つ以上有する。
他の態様では、本発明は、本開示に記載の任意の実施例に関するイソプレン合成酵素変異体を提供し、ここで、操作可能にプロモーターと組み合わせた変異体をコードしている異種ポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞は、ＭＥＡウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素をコードしている配列を含む宿主細胞と比べた場合に、次の特性：
比生産性が少なくとも約１１０％である、
収率が少なくとも約１１０％である、及び
細胞性能指数が少なくとも約１１０％である、を１つ以上有する。
他の態様では、本発明は、本開示に記載の任意の実施例に関するイソプレン合成酵素変異体を提供し、ここで、操作可能にプロモーターと組み合わせた変異体をコードしている異種ポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞は、ＭＥＡウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素をコードしている配列を含む宿主細胞と比べた場合に、次の特性：
比生産性が少なくとも約１２０％である、
収率が少なくとも約１２０％である、及び
細胞性能指数が少なくとも約１２０％である、を１つ以上有する。
他の態様では、本発明は、本開示に記載の任意の実施例に関するイソプレン合成酵素変異体を提供し、ここで、操作可能にプロモーターと組み合わせた変異体をコードしている異種ポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞は、ＭＥＡウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素をコードしている配列を含む宿主細胞と比べた場合に、次の特性：
比生産性が少なくとも約１５０％である、
収率が少なくとも約１５０％である、及び
細胞性能指数が少なくとも約１５０％である、を１つ以上有する。
他の態様では、本発明は、本開示に記載の任意の実施例に関するイソプレン合成酵素変異体を提供し、ここで、操作可能にプロモーターと組み合わせた変異体をコードしている異種ポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞は、ＭＥＡウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素をコードしている配列を含む宿主細胞と比べた場合に、次の特性：
比生産性が少なくとも約２００％である、
収率が少なくとも約２００％である、及び
細胞性能指数が少なくとも約２００％である、を１つ以上有する。
他の態様では、本発明は、置換Ｘ４９１Ｓを含み、本明細書の実施例のいずれかに関する、イソプレン合成酵素変異体を提供する。
他の態様では、本発明は、本明細書の実施例のいずれかに関する、イソプレン合成酵素変異体を提供し、ここで変異体は、表Ｄに記載のものからなる群から選択された置換は含まない。
他の態様では、本発明は、本明細書の実施例のいずれかに関する、イソプレン合成酵素変異体を提供、ここでこの変異体は、表Ｅ及び表Ｆには記載されていない。
他の態様では、本発明は、本開示に記載の任意のイソプレン合成酵素変異体及びキャリアを含む、組成物を提供する。
他の態様では、本発明は、本開示に記載の任意のイソプレン合成酵素変異体を容器に入れて含む、キットを提供する。
他の態様では、本発明は、本開示に記載の任意のイソプレン合成酵素変異体をコードしている核酸を提供する。
他の態様では、本発明は、本開示に記載の任意のイソプレン合成酵素変異体をコードしている核酸及びキャリアを含む組成物を提供する。
他の態様では、本発明は、本開示に記載の任意のイソプレン合成酵素変異体をコードしている核酸を容器に入れて含むキットを提供する。
他の態様では、本発明は、操作可能にプロモーターと組み合わせた、本開示に記載の任意のイソプレン合成酵素変異体をコードしている異種ポリヌクレオチド配列を含む、宿主細胞を提供する。一実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、プラスミド内に収容される。他の実施形態では、ポリヌクレオチド配列は、宿主細胞の染色体に組み込まれる。他の実施形態では、宿主細胞は、グラム陽性バクテリア細胞、グラム陰性バクテリア細胞、糸状菌細胞、又は酵母細胞からなる群から選択される。他の実施形態では、宿主細胞は、グラム陰性バクテリア細胞である。他の実施形態では、宿主細胞は、エシェリキア属（大腸菌）、パントエア属（Panteoa sp.）（Ｐ．シトレア）、バチルス属（枯草菌）、ヤロウイア属（Ｙ．リポリィティカ）、及びトリコデルマ属（Ｔ．リーゼイ（T．reesei））からなる群から選択される。他の実施形態では、宿主細胞は大腸菌である。
本明細書の任意の実施形態では、宿主細胞は、グルコース、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、酵母エキス、バイオマス、糖蜜、スクロース、及び油からなる群から選択される炭素源を含む培地で培養する。本明細書の任意の実施形態では、宿主細胞は、グルコースを含む培地で培養する。
本明細書の任意の実施形態では、宿主細胞は、所望により生得的ＤＸＰ経路と組み合わせて、ＩＤＩポリペプチドをコードしている異種又は生得的核酸並びに／あるいはＤＸＳポリペプチドをコードしている異種又は生得的核酸を更に含む。
本明細書の任意の実施形態では、宿主細胞は、イソプレン合成酵素変異体、ＩＤＩポリペプチド、及びＤＸＳポリペプチドをコードする１種のベクターを含む。
本明細書の任意の実施形態では、宿主細胞は、サッカロミセス・セレビシエ及び、エンテロコッカス・フェカリス由来のＭＶＡ経路関連性ポリペプチドからなる群から選択される、ＭＶＡ経路関連性ポリペプチドをコードしている異種核酸を更に含む。
本明細書の任意の実施形態では、宿主細胞は、ＭＶＡ経路関連性ポリペプチド及びＤＸＳポリペプチドをコードしている核酸を更に１つ以上含み、この場合ベクターは、イソプレン合成酵素変異体、ＭＶＡ経路関連性ポリペプチド、及びＤＸＳポリペプチドをコードしている。
本明細書の任意の実施形態では、宿主細胞は、ＤＸＳポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、ＤＸＰ経路に関係するその他の１つ以上のポリペプチド、及び／又はＭＶＡ経路に関係するポリペプチド、をコードしている核酸を更に１つ以上含む。
他の態様では、本発明は、イソプレン生産能をもつ宿主細胞を製造する方法を提供し、方法は、本開示に記載の任意のイソプレン合成酵素変異体をコードしている異種ポリヌクレオチド配列を、宿主細胞に導入する工程を含む。
他の態様では、本発明は、イソプレンを生産させる方法を提供し、方法は：（ａ）本開示に記載の任意のイソプレン合成酵素変異体をコードしている異種ポリヌクレオチド配列を含む宿主細胞を、イソプレンの生産に好適な条件下で培養する工程、並びに（ｂ）イソプレンを生産させる工程を含む。一実施形態では、方法は、（ｃ）イソプレンを回収する工程、を更に含む。
他の態様では、本発明は、イソプレンを生産させる方法を提供し、方法は：（ａ）（ｉ）宿主細胞；及び（ｉｉ）本開示に記載の任意のイソプレン合成酵素変異体を操作可能にプロモーターと組み合わせてコードしている核酸；を用意する工程、（ｂ）この核酸を宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換させる工程、並びに（ｃ）形質転換させた宿主細胞をイソプレンの生産に好適な条件下で培養する工程、を含む。一実施形態では、方法は更に、（ｄ）イソプレンを回収する工程、を含む。
他の態様では、本発明は、イソプレン合成酵素変異体を生産させる方法を提供し、方法は：（ａ）（ｉ）宿主細胞；及び（ｉｉ）本開示に記載の任意のイソプレン合成酵素変異体を操作可能にプロモーターと組み合わせてコードしている核酸；を用意する工程、（ｂ）この核酸を宿主細胞に導入して宿主細胞を形質転換させる工程、並びに（ｃ）形質転換させた宿主細胞をイソプレン合成酵素変異体の生産に好適な条件下で培養する工程、を含む。一実施形態では、方法は、イソプレン合成酵素変異体を単離する工程を更に含む。
他の態様では、本発明は、イソプレン合成酵素変異体をスクリーニングする方法を提供し、方法は、（ａ）宿主細胞を、約１０μＭ〜約７０μＭのＩＰＴＧと、約５ｍＭ〜約２０ｍＭのメバロン酸（ＭＶＡ）と、を含む培地と接触させる工程であって、ここで宿主細胞は、イソプレン合成酵素変異体を操作可能にプロモーターと組み合わせてコードしている核酸を含む、工程、並びに（ｂ）宿主細胞の増殖速度を測定する工程を含み、ここで増殖速度が増加した場合、イソプレン合成酵素変異体が、宿主細胞においてＤＭＡＰＰをイソプレンに変換する能力が向上していることが示される。一実施形態では、ＩＰＴＧが約１０μＭ〜約６０μＭの濃度で培地に含まれる。他の実施形態では、ＩＰＴＧが約２０μＭ〜約６０μＭの濃度で培地に含まれる。他の実施形態では、ＩＰＴＧが約４０μＭ〜約６０μＭの濃度で培地に含まれる。他の実施形態では、ＩＰＴＧが約５０μＭの濃度で培地に含まれる。他の実施形態では、ＭＶＡが約５ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度で培地に含まれる。他の実施形態では、ＭＶＡが約７ｍＭ〜約１５ｍＭの濃度で培地に含まれる。他の実施形態では、ＭＶＡが約８ｍＭ〜約１２ｍＭの濃度で培地に含まれる。他の実施形態では、ＭＶＡが約１０ｍＭの濃度で培地に含まれる。一実施形態では、宿主細胞はＭＤ０９−１７０である。
イソプレン合成酵素変異体を操作可能にプロモーターと組み合わせてコードしているポリヌクレオチド配列を含む発現ベクターも提供される。
宿主細胞の溶解液も提供し、この溶解液にはリゾチームが更に含まれる。一部の実施形態では、溶解液のｐＨが中性（ｐＨ６．５〜７．５）であるのに対し、他の実施形態では、溶解液のｐＨは塩基性（ｐＨ７．５〜９．５）である。本発明は、イソプレン合成酵素活性を検出する方法を更に提供し、方法は：（ａ）発現ベクターを含む宿主細胞を、イソプレン合成酵素変異体を生産させるのに好適な条件下で培養する工程、（ｂ）リゾチームを含む溶解緩衝液で宿主細胞を溶解させて、細胞溶解液を生成する工程、並びに（ｃ）ジメチルアリールジホスフェート（ＤＭＡＰＰ）から生成されるイソプレンを測定することにより、細胞溶解液に含まれるイソプレン合成酵素活性を検出する工程、を含む。
アッセイ株の増殖性及びＤＭＡＰＰ濃度の関係。ＤＷ４２５を、様々な濃度のメバロン酸（ｅｘｐ１では０、１０、２０、３０、４０、５０ｍＭのメバロン酸、及びｅｘｐ２では０、２．５、５、１０、２０ｍＭのメバロン酸）及びＩＰＴＧ（０μＭのＩＰＴＧ及び５０μＭのＩＰＴＧ）の存在下で、増殖した。増殖実験の完了時に、代謝生成物の解析のため、細胞を収集し、回収した。 様々な濃度のＩＰＴＧ（０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、及び７０μＭ）及びメバロン酸（０、５、７．５、１０、１５、２０ｍＭ）の存在下での、ＤＷ４２５の増殖。 ［ＩＰＴＧ］及び［メバロン酸塩］に応じた増殖。 ｐＣＬ２０１のプラスミドマップ。 Ｇｌｙ４９１及びＬｅｕ４９４に対するＰｈｅ４９５の配置が示されるよう野生型ＩｓｐＳを示す図。Ｇｌｙ４９１、Ｌｅｕ４９４、及びＰｈｅ４９５をいずれもスティックモデルにより表す。 活性部位に対するＧｌｎ５０９の配置が示されるよう野生型ＩｓｐＳを示す図。Ｇｌｎ５０９をスティックモデルにより表す。 残基Ｐｈｅ２８７が示されるよう野生型ＩｓｐＳを示す図。Ｐｈｅ２８７をスティックモデルにより表す。（＋）−ボルニル二リン酸（ＢＰ）は、ＰＤＢ １Ｎ２４との構造アラインメントをもとに配置した。 残基Ｇｌｙ３９７が示されるよう野生型ＩｓｐＳを示す図。Ｇｌｙ３９７をスティックモデルにより表す。 残基Ａｓｎ４３８が示されるよう活性型ＩｓｐＳの活性部位を示す図。ＰＤＢ １Ｎ２４との構造アラインメントをもとに（＋）−ボルニル二リン酸（ＢＰ）及びＭｇ２＋（球）を配置してある。 残基Ｇｌｕ４５１が示されるよう野生型ＩｓｐＳを示す図。残基Ｇｌｕ４５１をスティックモデルにより表す。 残基Ｔｙｒ５１４が示されるよう活性型ＩｓｐＳの活性部位を示す図。残基Ｔｙｒ５１４をスティックモデルにより表す。ＰＤＢ １Ｎ２４との構造アラインメントをもとに（＋）−ボルニル二リン酸（ＢＰ）及びＭｇ２＋（球）を配置してある。 変異Ｇ４９１Ｓをもつウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素を含有するｐＣＨＬ２４３のプラスミドマップ。 放出気体に含まれるイソプレン（％）及びＣＯ２（％）の濃度間の比。この比によると、イソプレン合成酵素のＧ４９１Ｓ変異を発現しているＤＷ４１５株では、発酵のほとんどを通して、呼吸速度と比較してイソプレン生産速度が増加していた。 イソプレン合成酵素変異Ｇ４９１Ｓの発現により、発酵時の生存能が増大したことを示すグラフ。ＤｉＢＡＣ４（３）により染色を行い、発酵ブロスに含まれる生細胞及び死細胞画分を膜電荷の有無に基づき判別した。 Ｇ４９１Ｓを含むＭＤ０９−１６３のプラスミドマップ。 異なる精製段階のＩｓｐＳ−Ｇ４９１Ｓを泳動したＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル。レーン１−分子量マーカー；レーン２−ＴｕｒｂｏＴＥＶにより消化処理を行ったＩｓｐＳ−Ｇ４９１Ｓ；レーン３〜５−第２ Ｎｉカラムを素通りさせた後のＩｓｐＳ−Ｇ４９１Ｓ；レーン６〜７−第２ Ｎｉカラムから得られたＩｓｐＳ−Ｇ４９１Ｓ画分。 二量体を形成しているＩｓｐＳ−Ｇ４９１Ｓを示す。モノマーＡは明るい灰色で示し、モノマーＢは暗い灰色で示す。 １−シグマに輪郭を付けた残基４９１での２ＦＯ−２ＦＣ電子密度マップ。Ａは４９１Ｇを示し、Ｂは４９１Ｓを示す。 残基４９１を含有しているループのアラインメント。野生型ＩｓｐＳは明るい灰色で示し、ＩｓｐＳ−Ｇ４９１Ｓは暗い灰色で示す。変異Ｇ４９１Ｓによりループ構造に変更が生じる。 ＭＥＡウラジロハコヤナギの配列。 ＭＥＡウラジロハコヤナギの配列。 Ｎ末端の切断されたウラジロハコヤナギＩｓｐＳ配列のアラインメント。 Ｎ末端の切断されたウラジロハコヤナギＩｓｐＳ配列のアラインメント。 イソプレンのＭＶＡ及びＤＸＰ代謝（Ｆ．Ｂｏｕｖｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｌｉｐｉｄ Ｒｅｓ．４４：３５７〜４２９，２００５に基づく）。以降に、経路に含まれる各ポリペプチドの別称を記載し、並びに記載のポリペプチドのもつ活性を測定する際のアッセイ法を開示している参照文献を記載する（これらの参照のそれぞれは、参照によりその全体が本開示に組み込まれ、特に、ＭＶＡ及びＤＸＰ経路に含まれるポリペプチドのもつポリペプチド活性に関するアッセイを対象として本開示に組み込まれる）。メバロン酸経路：ＡＡＣＴ；アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ，ＭｖａＥ，ＥＣ ２．３．１．９．アッセイ：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８４：２１１６〜２１２２，２００２；ＨＭＧＳ；ヒドロキシメチルグルタリル−ＣｏＡ合成酵素，ＭｖａＳ，ＥＣ ２．３．３．１０．アッセイ：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８４：４０６５〜４０７０，２００２；ＨＭＧＲ；３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ，ＭｖａＥ，ＥＣ １．１．１．３４．アッセイ：Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８４：２１１６〜２１２２，２００２；ＭＶＫ；メバロン酸キナーゼ，ＥＲＧ１２，ＥＣ ２．７．１．３６．アッセイ：Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ １９：９〜１４，１９９１．ＰＭＫ；ホスホメバロン酸キナーゼ，ＥＲＧ８，ＥＣ ２．７．４．２，アッセイ：Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．，１１：６２０〜６３１，１９９１；ＤＰＭＤＣ；ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ，ＭＶＤ１，ＥＣ ４．１．１．３３．アッセイ：Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３３：１３３５５〜１３３６２，１９９４；ＩＤＩ；イソペンテニル−ジホスフェートδ−イソメラーゼ，ＩＤＩ１，ＥＣ ５．３．３．２．アッセイ：Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６４：１９１６９〜１９１７５，１９８９．ＤＸＰ経路：ＤＸＳ；１−デオキシキシルロース−５−リン酸シンターゼ，ｄｘｓ，ＥＣ ２．２．１．７．アッセイ：ＰＮＡＳ，９４：１２８５７〜６２，１９９７；ＤＸＲ；１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸レダクトイソメラーゼ，ｄｘｒ，ＥＣ ２．２．１．７．アッセイ：Ｅｕｒ．Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２６９：４４４６〜４４５７，２００２；ＭＣＴ；４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールシンターゼ，ＩｓｐＤ，ＥＣ ２．７．７．６０．アッセイ：ＰＮＡＳ，９７：６４５１〜６４５６，２０００；ＣＭＫ；４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールキナーゼ，ＩｓｐＥ，ＥＣ ２．７．１．１４８．アッセイ：ＰＮＡＳ，９７：１０６２〜１０６７，２０００；ＭＣＳ；２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール２，４−シクロ二リン酸シンターゼ，ＩｓｐＦ，ＥＣ ４．６．１．１２．アッセイ：ＰＮＡＳ，９６：１１７５８〜１１７６３，１９９９；ＨＤＳ；１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸シンターゼ，ｉｓｐＧ，ＥＣ１．１７．４．３．アッセイ：Ｊ．Ｏｒｇ．Ｃｈｅｍ．，７０：９１６８〜９１７４，２００５；ＨＤＲ；１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル４−二リン酸レダクターゼ，ＩｓｐＨ，ＥＣ １．１７．１．２．アッセイ：ＪＡＣＳ，１２６：１２８４７〜１２８５５，２００４。 置換に耐性でない位置の配置が示されるよう野生型ＩｓｐＳの単量体を示す図。 ＩｓｐＳの活性部位に含まれる、置換に耐性でない残基の配置。ＰＤＢ １Ｎ２４との構造アラインメントをもとにＭｇ２＋（球）を配置した。 ＩｓｐＳに含まれる、置換に耐性でない埋没領域の配置。ＰＤＢ １Ｎ２４との構造アラインメントをもとにＭｇ２＋（球）を配置した。 ＩｓｐＳの二量体界面に配置された、置換に耐性でない残基。鎖Ａは明るい灰色で示し、鎖Ｂは暗い灰色で示す。 ＩｓｐＳのＮ末端に配置された、あるいはＩｓｐＳの相互作用部位に配置された、置換に耐性でない配置。ＰＤＢ １Ｎ２４との構造アラインメントをもとに、Ｍｇ２＋（球）及び残基１〜５０をモデル化した。 ＩｓｐＳのＮ末端に配置された、あるいはＩｓｐＳの相互作用部位に配置された、置換に耐性でない配置。ＰＤＢ １Ｎ２４との構造アラインメントをもとにＭｇ２＋（球）を配置した。 ＩｓｐＳに推定される基質捕捉ループの、置換に耐性でない位置。ＰＤＢ １Ｎ２４との構造アラインメントをもとにＭｇ２＋（球）を配置した。 変異により比活性の改良が見られる部位の配置が示されるよう、野生型ＩｓｐＳモノマーを示す図。 ＩｓｐＳのＮ末端に含まれる、又はＮ末端と相互作用する埋没領域の配置。これらの場所に変異が生じると比活性が増大する。 ＩｓｐＳのＣ末端に含まれる、又は末端と相互作用する埋没領域の配置。これらの場所に変異が生じると比活性が増大する。ＰＤＢ １Ｎ２４との構造アラインメントをもとにＭｇ２＋（球）を配置した。 ＩｓｐＳの二量体界面。鎖Ａは明るい灰色で示し、鎖Ｂは暗い灰色で示す。位置２４７に変異が生じると比活性は増大した。 ＩｓｐＳのＮ末端部位の配置。これらの部位の変異により、比活性は増大した。 ＩｓｐＳの表面ループの配向。これらの場所に変異が生じると比活性が増大した。ＰＤＢ １Ｎ２４との構造アラインメントをもとにＭｇ２＋（球）を配置した。 ＩｓｐＳの表面の位置。これらの場所に変異が生じると比活性が増大した。ＰＤＢ １Ｎ２４との構造アラインメントをもとにＭｇ２＋（球）を配置した。 ＩｓｐＳの基質捕捉ループであると推測される部位。これらの場所に変異が生じると比活性が増大した。ＰＤＢ １Ｎ２４との構造アラインメントをもとにＭｇ２＋（球）を配置した。 活性の改良されたＩｓｐＳの位置。ＰＤＢ １Ｎ２４との構造アラインメントをもとにＭｇ２＋（球）を配置した。 活性の改良されたＩｓｐＳの位置。ＰＤＢ １Ｎ２４との構造アラインメントをもとにＭｇ２＋（球）を配置した。 増殖性の改良されたＮ末端及び表面ループの位置が示されるようＩｓｐＳモノマーを示す図。ＰＤＢ １Ｎ２４との構造アラインメントをもとにＭｇ２＋（球）を配置した。 増殖性の改良されたＮ末端ヘリックスの位置が示されるようＩｓｐＳモノマーを示す図。 表２３（Ａ）の部位の配置が示されるよう野生型ＩｓｐＳのモノマー。ＰＤＢ １Ｎ２４との構造アラインメントをもとにＭｇ２＋（球）を配置した。Ｂ）Ａの部位の拡大図を示す。 部位の配置が示されるようＩｓｐＳモノマー。変異させることで増殖性の上昇する部位を暗い灰色で示した。ＰＤＢ １Ｎ２４との構造アラインメントをもとにＭｇ２＋（球）を配置した。 部位の配置が示されるようＩｓｐＳ。変異させることで増殖性の上昇する部位をスティックモデルで示した。Ａ及びＢは１８０°回転させた。 Ｎ末端をランケーションさせたウラジロハコヤナギＩｓｐＳ分子のアラインメント。 ウラジロハコヤナギＩｓｐＳのＭＡＲ変異体を包含しているｐＤＷ２０７のプラスミドマップ。 ウラジロハコヤナギＩｓｐＳのＭＲＲ変異体を包含しているｐＤＷ２０８のプラスミドマップ。
本発明は、イソプレン合成酵素変異体を少なくとも１つ含む、方法及び組成物を提供する。この変異体は、親イソプレン合成酵素ポリペプチドとは異なるアミノ酸残基置換を一箇所以上に含み、この場合の親イソプレン合成酵素は、野生型の配列であってもあるいは野生型の配列でなくてよい。本発明は、ポリペプチド内の特定の位置でのアミノ酸残基の置換を提供し、この置換により、少なくとも１つの特性を、親配列又は参照配列よりも改良することができる。一部の特に好ましい実施形態では、改良される少なくとも一つの特性は、限定するものではないが次のものからなるから選択される：比生産性、収率、並びに細胞性能インデックス。特に、本発明は、宿主細胞においてイソプレン生産を増加させる、変異型の植物イソプレン合成酵素を提供する。生物生産により製造される本発明のイソプレンは、ゴム、ポリマー、及びエラストマーを製造する際の使用が見出される。
本発明の実施には、別途記載のない限り、当該技術分野の範囲内のものである、タンパク質化学、分子生物学（組み換え法など）、微生物学、細胞生物学、生物化学、核酸化学、及び酵素学に関係する従来法が、採用され得る。このような技術は、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第２版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，１９８９）並びにＭｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，第３版（Ｓａｍｂｒｏｏｋ及びＲｕｓｓｅｌ，２００１）（本明細書では、合わせて、並びに個々に「Ｓａｍｂｒｏｏｋ」と参照する）、Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ（Ｍ．Ｊ．Ｇａｉｔ，ｅｄ．，１９８４）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．，１９８７）；Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（Ｄ．Ｍ．Ｗｅｉｒ ＆ Ｃ．Ｃ．Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ，ｅｄｓ．）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ（Ｊ．Ｍ．Ｍｉｌｌｅｒ ＆ Ｍ．Ｐ．Ｃａｌｏｓ，ｅｄｓ．，１９８７）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９８７，２００１までの補足を含む）；ＰＣＲ：Ｔｈｅ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ Ｃｈａｉｎ Ｒｅａｃｔｉｏｎ，（Ｍｕｌｌｉｓ ｅｔ ａｌ．，ｅｄｓ．，１９９４）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，２０００）；並びにＡｇｒａｗａｌ，ｅｄ．，Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｆｏｒ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ａｎａｌｏｇｓ，Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ ａｎｄ Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ Ｈｕｍａｎａ Ｐｒｅｓｓ Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｊｅｒｓｅｙ，１９９３）などの文献中に十分に説明されている。したがって、以降で定義される用語は、総じて本明細書を参照することでより詳しく説明される。
更に、本開示で提供される表題は本発明の様々な態様又は実施形態を制限するものではなく、総じて本明細書において参照として用いられ得るものである。したがって、以降で定義される用語は、総じて本明細書を参照することでより詳しく定義される。それでもなお、本発明に対する理解を容易にさせる目的で、数多くの用語を以下に定義する。
用語の定義
本明細書において別途定義されない限り、本明細書で使用されるすべての技術及び科学用語は、本発明の属する技術分野の当業者により一般に理解される意味と同様の意味を持つ。本明細書において述べられるものと同様又は同等のあらゆる方法及び材料を本発明の実施において使用することができるが、好ましい方法及び材料については本明細書に述べる。したがって、以降で定義される用語は、総じて本明細書を参照することでより詳しく説明される。
「Ｘ」は、任意のアミノ酸残基を指す。しかしながら、アミノ酸置換（例えば、「Ｘ００３Ｃ」）の文脈において、「Ｘ」は、置換により生じるアミノ酸残基以外のアミノ酸残基を意味する（例えば、Ｘは、Ｃ以外のアミノ酸残基である）と理解される。一部の実施形態では、残基の位置の前の付加的な「０」は記載されず、したがって、例えば、残基位置３を参照する際、「Ｘ００３」は、「Ｘ３」として記載される場合もある。
「イソプレン」は、２−メチル−１，３−ブタジエン（ＣＡＳ＃ ７８−７９−５）を指す。３，３−ジメチルアリールピロリン酸（ＤＭＡＰＰ）からピロリン酸を除去することで得られる、直接的にかつ最終的に揮発性のＣ５炭化水素生成物であり得る。１つ以上のイソペンテニルジホスフェート（ＩＰＰ）分子の１つ以上のＤＭＡＰＰ分子への結合又は重合は包含されない。イソプレンは、製造方法により限定されない。
本明細書で使用するとき、用語「イソプレン合成酵素」、「イソプレン合成酵素変異体」及び「ＩｓｐＳ」は、ジメチルアリール二リン酸（ＤＭＡＰＰ）からピロリン酸を除去してイソプレンを生成する反応を触媒する酵素を指す。「イソプレン合成酵素」は、野生型配列であっても、あるいはイソプレン合成酵素変異体配列であってもよい。
「イソプレン合成酵素変異体」としては、イソプレン合成酵素活性を有する非野生型ポリペプチドが挙げられる。当業者は、既知の手法によりイソプレン合成酵素活性を測定することができる。例えば、ＧＣ−ＭＳ（例えば、国際公開第２００９／１３２２２０号，実施例３を参照されたい）又はＳｉｌｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３０１０〜１３０１６，１９９５を参照されたい。変異体は、野生型イソプレン合成酵素の配列に、置換、付加、欠失、及び／又はトランケーションが生じたものであってよい。変異体は、非野生型イソプレン合成酵素の配列に、置換、付加、欠失、及び／又はトランケーションが生じたものであってよい。本開示に記載の変異体は、親イソプレン合成酵素ポリペプチドと異なるアミノ酸残基置換を少なくとも１つ含有し得る。一部の実施形態では、親イソプレン合成酵素ポリペプチドは野生型配列である。一部の実施形態では、親イソプレン合成酵素ポリペプチドは非野生型配列である。各種実施形態では、変異体は、野生型イソプレン合成酵素の活性と比較して少なくとも約１０％、少なくとも約２０％、少なくとも約３０％、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約１００％、少なくとも約１１０％、少なくとも約１２０％、少なくとも約１３０％、少なくとも約１４０％、少なくとも約１５０％、少なくとも約１６０％、少なくとも約１７０％、少なくとも約１８０％、少なくとも約１９０％、少なくとも約２００％の活性を有し得る。各種実施形態では、変異体は、野生型イソプレン合成酵素の配列に対し、少なくとも約４０％、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％配列相同性であり得る。各種実施形態では、変異体及び野生体間では１つ以上のアミノ酸残基が異なっていてよく、例えば、１、２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０又は５０以上のアミノ酸残基が異なっていてよい。野生型イソプレン合成酵素としては、植物由来の任意のイソプレン合成酵素を挙げることができ、例えば、クズイソプレン合成酵素、ポプライソプレン合成酵素、ヨーロッパナライソプレン合成酵素、及びヤナギイソプレン合成酵素が挙げられる。
本明細書で使用するとき、用語、「天然に生じる」は、天然に見られる（例えば、組み換え法又は化学的方法により操作されていない）任意の対象（例えば、タンパク質、アミノ酸又は核酸配列）を指す。本明細書で使用するとき、用語「非天然に生じる」は、天然には見られない任意の対象（例えば、組み換えにより生成されたタンパク質又は化学合成されたタンパク質、アミノ酸、又は研究施設で作成された核酸配列）を指す。
対象とするアミノ酸配列に含まれるアミノ酸残基が、参照アミノ酸配列のアミノ酸残基と「対応する」又は「対応している」又は「対応した」とは、対象とする配列に含まれるアミノ酸残基が、参照アミノ酸配列中のアミノ酸残基の位置と相同である位置又は等しい位置に配置されていることを示す。当業者は、ポリペプチド中の特定のアミノ酸残基の位置が、相同な参照配列の位置に対応するかどうかを判定することができる。例えば、イソプレン合成酵素ポリペプチドの配列を、既知の手法（例えば、塩基の位置を整列し検索するツールであるＢＬＡＳＴ、ＣｌｕｓｔａｌＷ２、又は構造に基づき配列を整列するプログラムであるＳＴＲＡＰなど）により参照配列（例えば、配列番号１（図２０）と整列させることもできる。加えて、相同なポリペプチド残基の三次元構造を決定する際の補助として、参照配列の結晶構造座標を使用することもできる（例えば、ＰＣＴ出願／米国特許出願公開第２０１０／０３２１３４号（国際公開第２０１０／１２４１４６号）を参照されたい）。他の態様では、立体構造レベルでの相同性を決定することで等価な残基を同定することもできる。このような手法を用いる場合、イソプレン合成酵素ポリペプチド又はイソプレン合成酵素変異体のアミノ酸残基は、対応する参照配列のアミノ酸残基の位置番号に従い、番号付けすることもできる。例えば、対象とするイソプレン合成酵素変異体の、各アミノ酸残基の位置番号を決定するために、配列番号１のアミノ酸配列（図２０）を使用することもできる。
２つの核酸又はポリペプチド配列の文脈において、用語「同一」は、以下の配列比較又は解析アルゴリズムのうちの１つを用いて評価する際に、最も一致するようにアライメントしたときに、２つの配列中の残基が同じのものであることを指す。
本明細書で使用するとき、「相同性」は、配列類似性又は同一性を指し、同一性が好ましい。相同性は、当該技術分野で既知の標準法により決定することもできる（例えば、Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｗａｔｅｒｍａｎ，Ａｄｖ．Ａｐｐｌ．Ｍａｔｈ．２：４８２［１９８１］；Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ ａｎｄ Ｗｕｎｓｃｈ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４８：４４３［１９７０＼；Ｐｅａｒｓｏｎ ａｎｄ Ｌｉｐｍａｎ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８５：２４４４［１９８８］；Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓのソフトウェアパッケージに含まれるＧＡＰ、ＢＥＳＴＦＩＴ、ＦＡＳＴＡ、及びＴＦＡＳＴＡなどのソフトウェアプログラム（Ｇｅｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｇｒｏｕｐ，Ｍａｄｉｓｏｎ，ＷＩ）；並びにＤｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄ Ｒｅｓ．１２：３８７〜３９５［１９８４］を参照されたい）。有用なアルゴリズムの一例は、ＰＩＬＥＵＰである。ＰＩＬＥＵＰは、ペアワイズアラインメントのプログレッシブ法を用いて、一群の関連する配列から複数の配列のアラインメントを行う。ＰＩＬＥＵＰは、アラインメントを行うのに使用されるクラスタリング関係を示す系統樹をプロットすることもできる。ＰＩＬＥＵＰは、Ｆｅｎｇ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅのプログレッシブアラインメントを単純化させて用いる（Ｆｅｎｇ及びＤｏｏｌｉｔｔｌｅ、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｅｖｏｌ．３５：３５１〜３６０［１９８７］を参照されたい）。この方法は、Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐにより説明されるものと同様である（Ｈｉｇｇｉｎｓ及びＳｈａｒｐ、ＣＡＢＩＯＳ ５：１５１〜１５３［１９８９］を参照されたい）。有用なＰＩＬＥＵＰパラメーターとしては、３．００のデフォルトギャップ重みづけ（default gap weight）、０．１０のデフォルトギャップ伸長重みづけ（default gap length weight）及び重みつき末端ギャップ（weighted end gaps）が挙げられる。Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．により報告されているＢＬＡＳＴアルゴリズムもその他の有用なアルゴリズムの例である（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２１５：４０３〜４１０［１９９０］；並びにＫａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９０：５８７３〜５７８７［１９９３］を参照されたい）。特に有用なＢＬＡＳＴプログラムはＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２プログラムである（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６６：４６０〜４８０［１９９６］を参照されたい）。ＷＵ−ＢＬＡＳＴ−２は、複数の検索パラメーターを使用し、これらのうちのほとんどはデフォルト値に設定される。調製可能なパラメーターは以下の値に設定される：ｏｖｅｒｌａｐ ｓｐａｎ＝１、ｏｖｅｒｌａｐ ｆｒａｃｔｉｏｎ＝０．１２５、ｗｏｒｄ ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ（Ｔ）＝１１。ＨＳＰ Ｓ及びＨＳＰ Ｓ２パラメーターは、動的な値であり、検索対象となる配列に対し、特定のデータベースの特定の配列及び組成物の組成に基づきプログラム自体によって制定される。しかしながら、これらの値は、感受性を上昇させるように調整することができる。
参照配列と対象とする試験配列との配列相同性は、当業者により容易に判定することができる。ポリヌクレオチド又はポリペプチド配列により共有される相同性は、配列をアライメントし、当該技術分野において既知の方法により同一性を判定することによって分子間での配列情報を直接比較することにより、判定される。配列類似性を判定するのに好適なアルゴリズムの一例は、ＢＬＡＳＴアルゴリズムである（Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２１５：４０３〜４１０［１９９０］を参照されたい）。ＢＬＡＳＴ解析を行うためのソフトウェアは、米国立生物工学情報センター（National Center for Biotechnology Information）より公的に入手可能である。このアルゴリズムは、まず、データベース配列中の同じ長さのワードとアラインメントを行ったときに一致するか又はある程度ポジティブであると評価された（positive-valued）閾値スコアＴを満たすかのいずれかである問い合わせ配列中の長さＷの短いワードを同定することにより、高スコアの配列ペア（ＨＳＰ）を同定する。これらの最初にヒットした隣接ワードは、これらを含有するより長いＨＳＰを見つけるための開始点として機能する。ワードのヒットは、累積アラインメントスコアが増加し得る限り比較されている２つの配列の各々に沿って両方向に拡張される。ワードのヒットの拡張は、次の場合に止まる：累積アラインメントスコアが最大達成値から量Ｘだけ減少する、累積スコアがゼロ以下になる、又は、いずれかの配列の末端に到達する。ＢＬＡＳＴアルゴリズムパラメーターＷ、Ｔ及びＸは、感受性及びアラインメントの速度を決定する。ＢＬＡＳＴプログラムは、ワード長（Ｗ）：１１、ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（Ｈｅｎｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５［１９９２］を参照されたい）アラインメント（Ｂ）：５０、期待値（Ｅ）：１０、Ｍ’５、Ｎ’−４、並びに両鎖の比較をデフォルトとする。
次に、ＢＬＡＳＴアルゴリズムは、２つの配列間の類似性の統計分析を行う（例えば、上記Ｋａｒｌｉｎ ａｎｄ Ａｌｔｓｃｈｕｌを参照されたい）。ＢＬＡＳＴアルゴリズムにより提供される類似性の一つの尺度は、最小和確率（smallest sum probability）（Ｐ（Ｎ））であり、これは、２つのヌクレオチド又はアミノ酸配列間の一致が偶然により生じ得る確率の指標を提供する。例えば、試験核酸をイソプレン合成酵素の核酸と比較した際の最小和確率が、約０．１未満、より好ましくは約０．０１未満、及び最も好ましくは約０．００１未満である場合、核酸は本発明のイソプレン合成酵素の核酸と類似していると考えられる。イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている試験核酸は、最小和確率の比較結果が約０．５未満、及びより好ましくは約０．２未満である場合に、イソプレン合成酵素に関係している特定の核酸と類似していると考えられる。
２つ以上の核酸又はポリペプチド配列についての文脈において、「相同性（ｐｅｒｃｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｃａｌ又はｐｅｒｃｅｎｔ ｉｄｅｎｔｉｔｙ）」は、２つ以上の配列を最も一致するように比較及びアライメントし、配列比較アルゴリズムを用いて又は目視検査を用いて判定したときに、２つ以上の配列が、同一であるか、あるいは核酸残基又はアミノ酸残基と、表記される割合で相同であることを指すものである。参照アミノ酸配列に対する、対象とするアミノ酸配列の、「配列相同性」又は「相同（％）」又は「配列相同性（％）」又は「アミノ酸配列相同性（％）」は、対象とするアミノ酸配列が、配列を最適にアライメントした際の比較長さにわたって参照アミノ酸配列に対して表記される割合（すなわち、アミノ酸とアミノ酸を並べたときの一致度）だけ相同であることを意味する。したがって、２つのアミノ酸配列に対する、アミノ酸配列８０％相同性又は８０％相同性は、最適にアライメントした２つのアミノ酸配列中のアミノ酸残基のうち８０％が相同であることを意味する。
参照核酸配列に対する、対象とする核酸配列の、「配列相同性」又は「相同性（％）」又は「配列相同性（％）」は、対象とする核酸配列が、配列を最適にアライメントした際の比較長さにわたって参照配列に対して表記される割合（すなわち、ヌクレオチドとヌクレオチドを並べたときの一致度）だけ相同であることを意味する。したがって、２つの核酸配列に関しヌクレオチド配列の相同性が８０％であるか又は相同性が８０％であるとは、最適にアライメントした２つの核酸配列中のヌクレオチド残基のうち８０％が相同であることを意味する。
一態様では、参照配列に対する対象とする配列の「配列相同性」又は「配列相同性（％）」、又は「相同性（％）」は、２つの配列を最適にアライメントし、比較長さにわたって、２つの最適にアライメントした配列を比較することで、算出することができる。最適なアライメントにおいて両方の配列の残基が一致している位置の数は、一致する位置の数を求めて一致する位置の数を比較長さ（別途記載のない限り、参照配列の長さである）のうちの位置の合計数で除することで決定される。得られる数に１００を乗じることで、参照配列に対する対象とする配列の配列相同性を算出する。
「最適アラインメント」又は「最適アラインメントを行った」は、最高の相同性（％）スコアを与える２つ（以上）の配列のアラインメントを指す。例えば、２つのポリペプチド配列の最適アラインメントは、各配列中の同一のアミノ酸残基の最大数が共にアラインメントされているように手動で配列のアラインメントを行うことにより、あるいは、本開示に記載の又は当該技術分野において既知の、ソフトウェアプログラム又は手順を用いることにより、達成することができる。２つの核酸配列の最適アラインメントは、アラインメントされた各配列中で相同であるヌクレオチド残基が最大数になるように手動で配列のアラインメントを行うことにより、あるいは、本開示に記載の又は当該技術分野において既知の、ソフトウェアプログラム又は手順を用いることにより、達成することができる。
既定のアミノ酸置換マトリックス、ギャップ存在ペナルティ（ギャップオープンペナルティとも呼ばれる）及びギャップ伸張ペナルティなどの既定パラメーターを用い、２つの配列（例えば、ポリペプチド配列）がこのペアの配列について類似性スコアが最も高くなるようアラインメントされた場合、「最適アラインメントが行われた」とみなされ得る。ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス（上記Ｈｅｎｉｋｏｆｆ及びＨｅｎｉｋｏｆｆを参照されたい）は、多くの場合、ポリペプチド配列アラインメントアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴＰ）においてデフォルトのスコアリング置換マトリックスとして使用される。ギャップ存在ペナルティはアラインメントされた配列の１つにアミノ酸ギャップが１つ導入された際に課せられ、ギャップ伸張ペナルティはギャップ中の各残基位置に対して課される。用いられる代表的なアラインメントは以下のものである：ＢＬＯＳＵＭ６２スコアリングマトリックス、ギャップ存在ペナルティ＝１１、及びギャップ伸張ペナルティ＝１。アラインメントスコアは、アラインメントが開始及び終了する各配列のアミノ酸位置により（例えば、アラインメントウィンドウ）、並びに、場合によっては可能な限り最高の類似性スコアを達成するように一方若しくは両方の配列の中に１つ若しくは複数のギャップを挿入することにより、決定される。
２つ以上の配列間の最適アラインメントは、目視点検により手動で、あるいは、コンピュータ（例えば、アミノ酸配列に対するＢＬＡＳＴＰプログラム及び核酸に対するＢＬＡＳＴＮプログラム（例えば、Ａｌｔｓｃｈｕｌら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２５（１７）：３３８９〜３４０２（１９９７）を参照されたい。米国国立生物工学情報センター（ＮＣＢＩ）のウェブサイトも参照されたい。）又はＣＬＵＳＴＡＬＷプログラムが挙げられるがこれらに限定されない）を使用することにより、判定することができる。
対象とするポリペプチドは、対象とするポリペプチドが、参照ポリペプチドのアミノ酸配列と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．５％配列相同性であるアミノ酸配列を含む場合、参照ポリペプチドと「実質的に同一」である。２つのこのようなポリペプチド間の相同性（％）は、最適にアラインメントされた２つのポリペプチド配列を目視確認することにより、又は標準的なパラメーターを用いるソフトウェアプログラム又はアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ，ＡＬＩＧＮ，ＣＬＵＳＴＡＬ）を使用することで、手入力で判定することができる。２つのポリペプチドが実質的に同一であることの１つの指標としては、第１ポリペプチドが、第２ポリペプチドと免疫的に交差反応性であることが挙げられる。通常、保存的なアミノ酸置換により異なるポリペプチドは、免疫学的に交差反応性である。したがって、ポリペプチドは、例えば、２つのペプチドが１つの保存的アミノ酸置換又は１つ以上の保存的アミノ酸置換のみで異なる場合、第二ポリペプチドに対して実質的に同一である。
対象とする核酸は、対象とする核酸が、参照核酸のヌクレオチド配列と少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約７５％、少なくとも約８０％、少なくとも約８５％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％、又は少なくとも約９９．５％配列相同性であるヌクレオチド配列を含む場合、参照核酸と「実質的に同一」である。２つのこのような核酸間の相同性（％）は、最適にアラインメントされた２つの核酸配列を目視確認することにより、又は標準的なパラメーターを用いるソフトウェアプログラム又はアルゴリズム（例えば、ＢＬＡＳＴ、ＡＬＩＧＮ、ＣＬＵＳＴＡＬ）を使用することで、手入力で判定することができる。厳密な条件下（例えば、中程度に厳密〜非常に厳密という範囲）で、２つの核酸分子が互いにハイブリッド形成することは、核酸配列が実質的に同一であることの１つの指標になる。
「核酸」は、単鎖又は二本鎖のいずれかの形態をとっている２以上のデオキシリボヌクレオチド及び／又はリボヌクレオチドを指す。本明細書で定義される通りの核酸には、単一ヌクレオチド変異などの変異が生じ得ることは理解されるであろう。
「組み換え核酸」は、対象とする核酸が、１つ以上の核酸、すなわち、対象とする核酸の由来する生物において天然に生じるゲノムに含まれ、対象とする核酸に隣接する、１つ以上の核酸（例えば、遺伝子）、を含まないことを意味する。したがって、この用語には、例えば、ベクターに組み込まれた、プラスミド又はウィルスに自己複製的に組み込まれた、嫌気性微生物のゲノムＤＮＡに組み込まれた、又は他の配列とは独立して別個の分子（例えば、ｃＤＮＡ、ゲノムＤＮＡ断片、又はＰＣＲにより生産された若しくは制限エンドヌクレアーゼによる消化により生産されたｃＤＮＡ断片）として存在する、組み換えＤＮＡが包含される。組み換え核酸は、当該技術分野において既知である分子生物学的手法により得ることができ、あるいは、組み換え核酸の一部又は全長を化学合成することもできる。
「異種核酸」は、宿主細胞以外の他の種、又は宿主細胞と同種の他の株に由来している核酸配列であり得る。一部の実施形態では、配列は、同様の宿主細胞において天然に見られる他の核酸と同一ではない。一部の実施形態では、異種核酸は、同様の宿主細胞に天然に見られる野生型核酸と同一ではない。
「内在性の核酸」は、宿主細胞においてその核酸配列が天然に見られる核酸である。一部の実施形態では、内在性の核酸は、宿主細胞において天然に見られる野生型核酸と同一である。一部の実施形態では、内在性の核酸の１つ以上のコピーを宿主細胞に組み込む。
本発明の核酸又はタンパク質は、単離又は精製形態であってよい。本明細書で使用するとき、核酸又はタンパク質に対して「単離」とは、これらが、限定するものではないが、細胞又は細胞培養物などの他の成分から分離されていることを意味する。均一な状態が好ましいものの、乾燥形態又は水溶液形態のいずれかであってもよい。純度及び均一性は、典型的には、ポリアクリルアミドゲル電気泳動又は高速液体クロマトグラフィーなどの分析化学技術を用いて判定される。調製液中に存在する主要なタンパク質又は核酸が実質的に精製される。用語「精製」は、核酸又はタンパク質が、電気泳動ゲル中で基本的に１本のバンドとして検出されることを意味する。具体的には、「精製された」は、単離した際に、単離物が、単離物の少なくとも９０重量％、少なくとも９５重量％、少なくとも９８重量％、又はより好ましくは少なくとも９９重量％の核酸又はタンパク質を含有することを意味する。
精製ポリペプチドは、例えば、研究室での合成、クロマトグラフィー、分取用電気泳動、ゲル電気泳動、遠心分離、沈殿、親和的精製などの数多くの手法により得ることができる（一般的に、Ｒ Ｓｃｏｐｅｓ，Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ，Ｎ．Ｙ．（１９８２），Ｄｅｕｔｓｃｈｅｒ，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．１８２：Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．Ｎ．Ｙ．（１９９０）を参照されたい）。
「ポリペプチド」には、ポリペプチド、タンパク質、ペプチド、ポリペプチド断片、及び融合ポリペプチドが内含される。遺伝子暗号の縮重に起因し、ポリペプチドは１種以上のヌクレオチド配列によりコードされる場合があることも理解されたい。
「異種ポリペプチド」は、異種核酸によりコードされているポリペプチドである。一部の実施形態では、配列は、同様の宿主細胞において天然に見られる核酸によりコードされる他のポリペプチドと同一ではない。異種タンパク質の例としては、イソプレン合成酵素などの酵素が挙げられる。一部の実施形態では、タンパク質をコードしている遺伝子が天然に生じる遺伝子であるのに対し、他の実施形態では、変異の生じている及び／又は合成遺伝子が使用される。
「内在性ポリペプチド」は、宿主細胞においてそのアミノ酸配列が天然に見られるポリペプチドである。一部の実施形態では、内在性ポリペプチドは、宿主細胞において天然に見られる野生型ポリペプチドと同一である。
本明細書で使用するとき、用語「テルペノイド」又は「イソプレノイド」は、テルペンと類似する、天然に生じる幅広く多様な部類の有機化合物を指す。テルペノイドは、炭素数５のイソプレン単位を組み合わせ、かつ様々な方法で修飾することで誘導されるものであり、構成員として使用されるイソプレン単位の数に基づいて分類される。ヘミテルペノイドは、イソプレン単位を１つ有する。モノテルペノイドは、イソプレン単位を２つ有する。セスキテルペノイドは、イソプレン単位を３つ有する。ジテルペノイドは、イソプレン単位を４つ有する。セステルテルペノイドは、イソプレン単位を５つ有する。トリテルペノイドは、イソプレン単位を６つ有する。テトラテルペノイドは、イソプレン単位を８つ有する。ポリテルペノイドは、イソプレン単位を８つ超有する。
本明細書で使用するとき、用語「ヘッドスペース」は、密閉容器内で固体又は液体試料上にトラップされた蒸気／空気混合物を指す。
本明細書で使用するとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」には、文脈に明示されない限り、対象物が複数ある場合をも包含する。
別途記載のない限り、それぞれ、核酸は左から右に５’→３’の向きで記述され、アミノ酸は左から右にアミノ末端→カルボキシ末端の向きで記述される。
本明細書を通じて与えられるあらゆる最大数の限定は、あらゆるより小さい数値の限定を、あたかもそのようなより小さい数値の限定が明確に書かれているかのように包含するものと理解されることが意図される。本明細書の全体を通じて与えられるすべての最小の数値的限定には、これよりも大きいすべての数値的限定が、あたかもこうしたより大きい数値的限定が本明細書に明確に記載されているものと同様に含まれる。本明細書の全体を通じて与えられるすべての数値的範囲には、これよりも狭い数値的範囲が、あたかもこうしたより狭い数値的範囲がすべて本明細書に明確に記載されているものと同様に含まれる。
本開示において、実施形態に包含される（及び説明する）「約（about）」を付した値又はパラメーターについては、「約」を付したその値又はパラメーター自体を目的とする。
本開示に記載される本発明のすべての態様及び実施形態は、態様及び実施形態「を含む（comprising）」、態様及び実施形態「からなる（consisting）」、及び態様及び実施形態「から本質的になる（consisting essentially of）」を含むことが理解される。記載の要素から「本質的になる」方法又は組成物には、特定の工程又は材料のみが含まれ、かつこれらの工程又は材料は、方法及び組成物の基本特性及び新規特性に実質的に影響しないことは理解されるであろう。
本発明は記載される特定の方法論、プロトコール、及び試薬に制限されるものではなく、これらは当業者により使用される文脈に応じて変動し得ることが理解されるであろう。
発明の詳細な説明
ポリイソプレン及び多様なコポリマー（イソブチレン、ブタジエン、スチレン、又は他のモノマー）の製造にイソプレンモノマーを使用する。採算の合うレベルのイソプレンを生産し得る株（原核生物又は真核生物の株）を樹立するには、ＤＸＰ又はＭＶＡ経路の一部又は全体、あるいはＭＶＡ及びＤＸＰ経路の両方を最適化する必要がある。この経路において鍵となる酵素はイソプレン合成酵素（ＩｓｐＳ）であり、この酵素は前駆体であるＤＭＡＰＰをイソプレンに変換する。これまでに同定されているイソプレン合成酵素（ＩｓｐＳ）としては、ポプラ、ヨーロッパナラ及びクズなどの植物由来のものが挙げられる。同定されている植物ＩｓｐＳ酵素の一部は、これまでに、大腸菌で発現させることで、ある程度特性評価されており、これらの酵素の動態パラメーターは、精製タンパク質をもとにｉｎ ｖｉｔｒｏで決定されている。しかしながら、生得的ＩｓｐＳ酵素の動的パラメーター（Ｋｍ、速度定数など）は、イソプレンを宿主生物で商業的に生産するには不十分なものである。したがって、解決すべき課題のうち１つとしては、より多量のイソプレンを生物学的に製造することができるよう特性が改良されたイソプレン合成酵素変異体（例えば、特定の残基が置換されている変異体）の供給が挙げられる。
本明細書に記載されるような課題を解決するにあたり、イソプレン合成酵素を宿主で発現させることができる（例えば、宿主微生物）。更に、イソプレン合成酵素変異体は、対象とする特性に変化が生じるよう設計される。ＩｓｐＳ変異体の特性評価は、好適な任意の手法又は試験によりなされ、好ましくは対象とする特性の評価に基づくものである。これらの変異体は、宿主微生物におけるイソプレンの商業的生産に有用である。
対象とする特性としては、限定するものではないが、細胞内活性の上昇、ＩｓｐＳを発現している細胞の比生産性の上昇（ｇ／Ｌ／ＯＤ／時間）（以降により詳述する）、収率（ｇ／ｇグルコース）（例えば、下記等式２）、及び細胞性能指数（イソプレン重量（グラム）／乾燥細胞重量（グラム））が挙げられる。理論に束縛されるものではないが、これらの特性は、ＩｓｐＳに関係する次の特性：細胞生存能の増加（例えば、宿主細胞に対する基質（例えば、ＤＭＡＰＰ）毒性の除去による、あるいはイソプレン合成酵素の毒性を軽減させることによる、宿主細胞のより良好な増殖）、ｋｃａｔの増加、Ｋｍの減少、比活性の上昇、溶解度の上昇、不溶性の低下、リボソーム結合性の上昇、翻訳開始速度の増加、翻訳伸長速度の増加、転写開始速度の増加、転写伸長速度の増加、ＤＮＡの２次構造の減少、ＲＮＡの２次構造の減少、ＤＮＡの２次構造の増加、ＲＮＡの２次構造の増加、折りたたみ速度の増加、細胞内のシャペロンに対する親和性の上昇、安定性の増加、タンパク質の代謝回転の減少、細胞内プロテアーゼに対する暴露の減少、細胞内プロテアーゼに対する親和性の減少、周辺質への局在性の減少、細胞質への局在性の増加、封入体形成の減少、膜局在の減少、より望ましいコドンによる発現増加、ＤＮＡ安定性の増加、ＲＮＡ安定性の増加、並びにＲＮＡ分解の減少、のいずれかにより、あるいはこれらを組み合わせることにより得ることができる。簡潔には、ＩｓｐＳ変異体をコードしている、又はこの変異体を発現している核酸配列（ＤＮＡ及びＲＮＡ）の特性に、あるいはＩｓｐＳ酵素自体のもつ生化学的特性に好ましく作用する任意の変異により、細胞内部の活性をより向上させることができる。対象とする他の特性としては、至適ｐＨ、温度安定性（例えば、Ｔｍ値）、並びに基質阻害又は生成物阻害などを引き起こす可能性のあるインヒビターに対する感受性などが挙げられる。酸化安定性及びタンパク質分解安定性も対象とする。更に、金属イオンの作用及び金属イオンのイオン強度による活性化又は阻害も対象とする。
ＤＸＰ経路、ＭＶＡ経路、又はこれらの両方の経路を発現している大腸菌などの、宿主生物に関する文脈において、これらの特性及びパラメーターは、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの、精製イソプレン合成酵素又はある程度精製したイソプレン合成酵素によるＤＭＡＰＰのイソプレンへの変換をもとに評価することができる。多様な宿主においてイソプレンを生産させることを目的とした本発明において、１種以上の試験条件下で様々な程度の安定性、溶解度、活性、及び／又は発現レベルを示す酵素を使用することが見出されるものと企図される。
本発明は、イソプレンの生産量が増大する組成物及び方法を特徴とする。特に、これらの組成物及び方法は、イソプレンの生成速度を増加させ、かつ生成されるイソプレンの総量を増加させる。天然ゴムを用いる代わりに、本開示に記載のイソプレン生産に関する生合成工程を用いることは望ましい。以降に詳細に記載する通り、細胞のイソプレン生産量は、イソプレン合成酵素（ＩｓｐＳ）変異体をコードしている異種核酸を細胞に導入することで、非常に増加させることができる。
加えて、異種イソプレン合成酵素核酸を含有している細胞によるイソプレン生産は、細胞による１種以上のＤＸＰ経路に関係するポリペプチド（例えば、１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）ポリペプチド）及び／又はイソペンテニル二リン酸イソメラーゼ（ＩＤＩ）ポリペプチドの発現量を増加させることで増大させることができる。例えば、ＤＸＳ核酸及び／又はＩＤＩ核酸を細胞に導入できる。ＤＸＳ核酸は、異種核酸であっても、内在性の核酸の相補的な複製であってもよい。同様にして、ＩＤＩ核酸は、異種核酸であっても、内在性の核酸の相補的な複製であってもよい。一部の実施形態では、ＤＸＳ及び／又はＩＤＩポリペプチドの量は、内在性ＤＸＳ及び／又はＩＤＩプロモーターあるいは制御配列を、ＤＸＳ及び／又はＩＤＩ核酸の転写を増加させるその他のプロモーター及び／又は制御配列と置き換えることで、増大する。一部の実施形態では、細胞は、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている異種核酸（例えば、植物イソプレン合成酵素核酸）、並びにイソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている内在性の核酸の相補的コピー、のいずれをも含有する。
コードされているＤＸＳ及びＩＤＩポリペプチドは、イソプレンの生合成に関するＤＸＰ経路の一部をなす（図２２）。ＤＸＳポリペプチドは、ピルビン酸及びＤ−グリセルアルデヒド−３−リン酸を１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸へと変換する。任意の特定の理論に制限されることを意図するものではないが、ＤＸＳポリペプチド量を増加させることで、ＤＸＰ経路に取り込まれる炭素量が増加し、その結果イソプレン生産が増加することになるものと考えられる。ＩＤＩポリペプチドは、イソペンテニルジホスフェート（ＩＰＰ）及びジメチルアリールジホスフェート（ＤＭＡＰＰ）の相互変換を触媒する。任意の特定の理論に制限されることを意図するものではないが、細胞中のＩＤＩポリペプチド量を増加させることで、ＤＭＡＰＰに変換され、ひいてはイソプレンへと変換されるＩＰＰ量が増加するものと考えられる。
以降に詳細に記載する通り、一部の実施形態では、異種イソプレン合成酵素核酸を含有している細胞によるイソプレン生産は、細胞による１種以上のＭＶＡポリペプチドの発現を増大させることで増強できる（図２２）。ＭＶＡ経路に関係する代表的なポリペプチドには、次のポリペプチド、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ）ポリペプチド、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ）ポリペプチド、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡレダクターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡレダクターゼ）ポリペプチド、メバロン酸キナーゼ（ＭＶＫ）ポリペプチド、ホスホメバロン酸キナーゼ（ＰＭＫ）ポリペプチド、ジホスホメバロン酸デカルボキシラーゼ（ＭＶＤ）ポリペプチド、ＩＤＩポリペプチド、及びＭＶＡ経路に関係するポリペプチドの活性を２つ以上有するポリペプチド（例えば、融合ポリペプチド）のいずれかが含まれる。例えば、ＭＶＡ経路に関係する１種以上の核酸を細胞に導入できる。一部の実施形態では、細胞はＭＶＡ経路上流を含有し、このＭＶＡ経路上流には、ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素、及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の核酸が包含される。一部の実施形態では、細胞はＭＶＡ経路下流を含有し、このＭＶＡ経路下流には、ＭＶＫ、ＰＭＫ、ＭＶＤ、及びＩＤＩの核酸が包含される。一部の実施形態では、細胞はＭＶＡ経路全体を含有し、このＭＶＡ経路全体には、ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素、ＭＶＫ、ＰＭＫ、ＭＶＤ、及びＩＤＩの核酸が包含される。ＭＶＡ経路に関係する核酸は、異種核酸又は内在性核酸の相補的複製であってよい。一部の実施形態では、１種以上のＭＶＡ経路に関係するポリペプチドの量は、内在性プロモーター又はＭＶＡ経路に関係する核酸の制御配列を、ＭＶＡ経路に関係する核酸の転写を増加させるその他のプロモーター及び／又は制御配列と置き換えることで増大する。一部の実施形態では、細胞は、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている異種核酸（例えば、植物イソプレン合成酵素核酸）、並びにイソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている内在性の核酸の相補的コピー、のいずれをも含有する。
一部の実施形態では、少なくとも一部の細胞は、連続培養法（希釈を行わない連続培養など）で、少なくとも約５、１０、２０、５０、７５、１００、２００又は３００回以上分裂させた後も、異種イソプレン合成酵素の核酸、ＤＸＳ核酸、ＩＤＩ核酸、その他のＤＸＰ経路及び／又はＭＶＡ経路に関係する核酸を維持する。本発明の任意の態様に関する一部の実施例では、内在性イソプレン合成酵素、ＤＸＳ、ＩＤＩ、その他のＤＸＰ経路及び／又はＭＶＡ経路の、異種核酸又はこれらの核酸の相補的複製は、抗菌剤のカナマイシン、アンピシリン、カルベニシリン、ゲンタマイシン、ハイグロマイシン、フレオマイシン、ブレオマイシン、ネオマイシン、又はクロラムフェニコールなどの選択マーカーも含む。
イソプレン合成酵素ポリペプチドは、ジメチルアリールジホスフェート（ＤＭＡＰＰ）をイソプレンに変換する。代表的なイソプレン合成酵素ポリペプチドとしては、イソプレン合成酵素ポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、並びに融合ポリペプチドが挙げられる。インビトロで、細胞抽出物中で又はインビボで、ポリペプチドがＤＭＡＰＰをイソプレンへと変換する能力を測定して、ポリペプチドがイソプレン合成酵素ポリペプチド活性を有するか否かを判定する際には、標準法を使用できる。細胞抽出物中でのイソプレン合成酵素のポリペプチド活性は、例えば、Ｓｉｌｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７０：１３０１０〜１３０１６，１９９５、及びこの文献の参照文献に記載の通りに測定できる。
一実施形態では、ＤＭＡＰＰ（Ｓｉｇｍａ）は窒素流下で濃縮させ、乾燥させ、１００ｍＭリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ ８．２）を用い１００ｍＭに再水和し、−２０℃で保存する。アッセイを実施するために、金属製スクリューキャップと、テフロンコーティングのなされたシリコン製隔壁（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）とを取り付けた２０ｍＬヘッドスペースバイアル瓶内で、５μＬの１Ｍ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ（２５０μｇ／ｍｌ）ＤＭＡＰＰ、６５μＬの植物抽出緩衝液（ＰＥＢ）（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ ８．０）、２０ｍＭ ＭｇＣｌ２、５％グリセロール、及び２ｍＭ ＤＴＴ）を、２５μＬ細胞抽出物に加え、振盪させながら３７℃で１５分間培養した。２５０ｍＭ ＥＤＴＡ ２００μＬを加え、あるいは熱不活化によりこの反応をクエンチさせ、イソプレンをＧＣ／ＭＳによって定量化する。
イソプレン合成酵素親配列
親イソプレン合成酵素から、イソプレン合成酵素変異体を生成する。親イソプレン合成酵素は、野生型及び非野生型のイソプレン合成酵素などの、本明細書に記載される通りのイソプレン合成酵素である。代表的な親イソプレン合成酵素の核酸としては、イソプレン合成酵素ポリペプチドの活性を少なくとも１種有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又は融合ポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。代表的な親イソプレン合成酵素ポリペプチド及び核酸としては、本明細書に記載されるような任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸、並びに本明細書に記載されるような任意の生物資源から誘導されるポリペプチド及び核酸の変異体が挙げられる。
一部の実施形態では、親イソプレン合成酵素は、マメ科、ヤナギ科、又はブナ科のものである。一部の態様では、イソプレン合成酵素ポリペプチド又は核酸は、タイワンクズ（クズ）（Ｓｈａｒｋｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｙ １３７：７００〜７１２，２００５）、ポプラ（ウラジロハコヤナギ×トレムラＣＡＣ３５６９６，Ｍｉｌｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔａ ２１３：４８３〜４８７，２００１）又はウラジロハコヤナギ、アスペン（アメリカヤマナラシ（Populus tremuloides））Ｓｉｌｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ ２７０（２２）：１３０１０〜１３１６，１９９５）、又はヨーロッパナラ（Ｑｕｅｒｃｕｓ ｒｏｂｕｒ）（Ｚｉｍｍｅｒ ｅｔ ａｌ．、国際公開第９８／０２５５０号）から天然に生じるポリペプチド又は核酸である。好適な親イソプレン合成酵素としては、限定するものではないが、ＧｅｎＢａｎｋ受入番号ＡＹ３４１４３１、ＡＹ３１６６９１、ＡＢ１９８１８０、ＡＪ２９４８１９．１、ＥＵ６９３０２７．１、ＥＦ６３８２２４．１、ＡＭ４１０９８８．１、ＥＦ１４７５５５．１、ＡＹ２７９３７９、ＡＪ４５７０７０、及びＡＹ１８２２４１として定義されるものが挙げられる。その他の親配列は、ＰＣＴ出願／米国特許出願公開第２００９／０４１５８１号（国際公開第２００９／１３２２２０号）及びＰＣＴ出願／米国特許出願公開第２０１０／０３２１３４号（国際公開第２０１０／１２４１４６号）に記載される。
各種実施形態では、親イソプレン合成酵素は、ＭＥＡウラジロハコヤナギの配列に対して、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％配列相同性である。他の実施形態では、親イソプレン合成酵素は、全長のウラジロハコヤナギの配列又は完全なウラジロハコヤナギの配列に対して、少なくとも約５０％、少なくとも約６０％、少なくとも約７０％、少なくとも約８０％、少なくとも約９０％、少なくとも約９２％、少なくとも約９４％、少なくとも約９６％、少なくとも約９８％、少なくとも約９９％配列相同性である（例えば、図２１Ａ及び２１Ｂを参照されたい）。
本発明の酵素変異体を生成するのに好適な様々な方法が、当該技術分野において既知であり、限定するものではないが、例えば、部位飽和変異導入、系統的変異導入法、変異挿入、ランダム変異、部位特異的変異導入、及び定向進化、並びに様々な他の組み換え手法が挙げられる。
イソプレン合成酵素変異体
ポリペプチド、例えばイソプレン合成酵素は、一次構造（アミノ酸配列）及びポリペプチド周囲の環境により決定される三次構造を有する。この三次構造は、ポリペプチドの活性、安定性、結合親和性、結合特異性、及び他の生化学的特性を決定する。したがって、生物活性の改良（例えば、触媒活性及び／又は溶解度の増加など）を計画する際には、タンパク質の三次構造に関する情報から十分な指針を得ることができる。各種イソプレン合成酵素の結晶構造座標は国際公開第２００９／１３２２２０号及びＰＣＴ出願／米国特許出願公開第２０１０／０３２１３４号（国際公開第２０１０／１２４１４６号）に記載されている。
本発明者らは、変異体において１つ以上の特性を改良し得る変異（例えば、置換）位置を、親イソプレン合成酵素において同定した。本発明の一態様では、変異は、以下に記載の通りのＭＥＡウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素（配列番号１）中の位置に一致する位置における置換である。
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そのため、一態様では、これらの位置に１つ以上の置換を有するイソプレン変異体（例えば、実施例７〜９に記載の通りのもの）を製造し、かつ以降に詳細に記載するイソプレン合成酵素特性の改良について、スクリーニングすることができる。当業者が同定目的で使用することのできる代表的な特性としては、限定するものではないが、ＭＥＡウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素の比活性と比較した場合に比活性が増大していること、並びに同様の増殖条件下で、ＭＥＡウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素を発現している組み換え宿主細胞の増殖性と比較した場合に、イソプレン合成酵素変異体を発現させた組み換え宿主細胞の増殖性が増大していること、が挙げられる。
ＭＥＡウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素の配列は、次の通りである（並びに図２０にも示す）：ＭＥＡＲＲＳＡＮＹＥＰＮＳＷＤＹＤＹＬＬＳＳＤＴＤＥＳＩＥＶＹＫＤＫＡＫＫＬＥＡＥＶＲＲＥＩＮＮＥＫＡＥＦＬＴＬＬＥＬＩＤＮＶＱＲＬＧＬＧＹＲＦＥＳＤＩＲＧＡＬＤＲＦＶＳＳＧＧＦＤＡＶＴＫＴＳＬＨＧＴＡＬＳＦＲＬＬＲＱＨＧＦＥＶＳＱＥＡＦＳＧＦＫＤＱＮＧＮＦＬＥＮＬＫＥＤＩＫＡＩＬＳＬＹＥＡＳＦＬＡＬＥＧＥＮＩＬＤＥＡＫＶＦＡＩＳＨＬＫＥＬＳＥＥＫＩＧＫＥＬＡＥＱＶＮＨＡＬＥＬＰＬＨＲＲＴＱＲＬＥＡＶＷＳＩＥＡＹＲＫＫＥＤＡＮＱＶＬＬＥＬＡＩＬＤＹＮＭＩＱＳＶＹＱＲＤＬＲＥＴＳＲＷＷＲＲＶＧＬＡＴＫＬＨＦＡＲＤＲＬＩＥＳＦＹＷＡＶＧＶＡＦＥＰＱＹＳＤＣＲＮＳＶＡＫＭＦＳＦＶＴＩＩＤＤＩＹＤＶＹＧＴＬＤＥＬＥＬＦＴＤＡＶＥＲＷＤＶＮＡＩＮＤＬＰＤＹＭＫＬＣＦＬＡＬＹＮＴＩＮＥＩＡＹＤＮＬＫＤＫＧＥＮＩＬＰＹＬＴＫＡＷＡＤＬＣＮＡＦＬＱＥＡＫＷＬＹＮＫＳＴＰＴＦＤＤＹＦＧＮＡＷＫＳＳＳＧＰＬＱＬＶＦＡＹＦＡＶＶＱＮＩＫＫＥＥＩＥＮＬＱＫＹＨＤＴＩＳＲＰＳＨＩＦＲＬＣＮＤＬＡＳＡＳＡＥＩＡＲＧＥＴＡＮＳＶＳＣＹＭＲＴＫＧＩＳＥＥＬＡＴＥＳＶＭＮＬＩＤＥＴＷＫＫＭＮＫＥＫＬＧＧＳＬＦＡＫＰＦＶＥＴＡＩＮＬＡＲＱＳＨＣＴＹＨＮＧＤＡＨＴＳＰＤＥＬＴＲＫＲＶＬＳＶＩＴＥＰＩＬＰＦＥＲ（配列番号１）。
本開示に記載の置換を組み合わせ、イソプレン合成酵素特性の改良についてスクリーニングすることができる。置換を組み合わせで含み、イソプレン合成酵素特性が１つ以上改良されたイソプレン合成酵素変異体の非限定例としては、表２５（変異体１〜２７）及び表２６（変異体１〜１２）に記載の変異体が挙げられる。
一態様では、ＭＥＡウラジロハコヤナギの変異として同定された残基を表Ａに掲載する。表Ａ中の残基及び残基番号は、配列番号１に示すＭＥＡウラジロハコヤナギの残基番号と一致する（図２０）。
表Ａ．変異導入部位
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表Ａで使用されるとき、「表面疎水性」は、疎水性アミノ酸残基がタンパク質の表面に存在することを意味し、「表面親水性」は、親水性アミノ酸残基がタンパク質の表面に存在することを意味し、「対称的に接触」は、イソプレン合成酵素分子の表面上の残基が、他のイソプレン合成酵素分子の表面上の残基と、結晶構造を形成するよう接触していることを意味し、「保存性」は、残基が、大部分のテルペン合成酵素で共通していることを意味し、「Ｎ末端ループ」は、残基が、タンパク質のＮ末端ループに存在していることを意味し、「表面ループ」は、残基が、タンパク質の表面ループに存在することを意味し、「活性部位」は、残基が、タンパク質の活性部位に存在していることを意味し、「可動性ループ」は、残基が、タンパク質の可動性ループに存在していることを意味し、「疎水性ポケット」は、残基が、タンパク質の疎水性ポケットに存在することを意味し、並びに「Ｃ末端」は、残基が、タンパク質のＣ末端領域に存在することを意味する。
以降の実施例において更に記載する通り、表Ａに示す残基位置で置換を行い、様々なイソプレン合成酵素変異体を製造した。本開示（表Ａ、Ｂ、特許請求の範囲、又は実施例を包含する）に記載の任意の変異体を本発明の組成物及び方法に使用できる。ＭＥＡウラジロハコヤナギ変異体において生成した具体的な置換を表Ｂに示す。
表Ｂ．ＭＥＡウラジロハコヤナギの代表的なアミノ酸置換
Figure 2014502148
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表Ｂは、ＭＥＡウラジロハコヤナギにおける具体的な置換を示す。他の親イソプレン合成酵素において、対応する残基を同様に変異させて、本発明のイソプレン合成酵素変異体を生成することもできる。表Ｃは、本発明の代表的な置換を示し、「Ｘ」は任意のアミノ酸残基を指す。しかしながら、「Ｘ」は置換により生じるアミノ酸残基以外のアミノ酸残基を指すことは理解されるであろう（例えば、「Ｘ３Ｃ」では、ＸはＣ以外のアミノ酸残基である）。表Ｃ中の残基の付番は、ＭＥＡウラジロハコヤナギ配列のものと一致する。したがって、異なる親配列（例えば、野生型アメリカヤマナラシ）に関し、残基「００３」は、ＭＥＡウラジロハコヤナギの残基００３に相当するアメリカヤマナラシ配列中の残基を示し、かつアメリカヤマナラシ配列の残基「００３」は、アメリカヤマナラシのアミノ酸配列において、必ずしも配列中の第３番目の残基である必要はないということが理解されるであろう。
表Ｃ．代表的なアミノ酸残基置換
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Figure 2014502148
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一部の実施形態では、変異体は、Ｘ００３Ｔ，Ｘ０１３Ｌ，Ｘ１６５Ｙ，Ｘ４２１Ｒ，Ｘ４９５Ｌ，Ｘ５０９Ｔ，及びＸ５４０Ｖからなる群から選択された置換を含む。一部の実施形態では、変異体はＸ００３Ｔを含む。一部の実施形態では、変異体はＸ０１３Ｌを含む。一部の実施形態では、変異体はＸ１６５Ｙを含む。一部の実施形態では、変異体はＸ４２１Ｒを含む。一部の実施形態では、変異体はＸ４９５Ｌを含む。一部の実施形態では、変異体はＸ５０９Ｔを含む。一部の実施形態では、変異体はＸ５４０Ｖを含む。一部の実施形態では、変異体は置換Ｘ４９１Ｓを含む。一部の実施形態では、変異体は更に置換Ｘ４９１Ｓ，に加えて、Ｘ００３Ｃ，Ｘ００３Ｄ，Ｘ００３Ｅ，Ｘ００３Ｆ，Ｘ００３Ｇ，Ｘ００３Ｈ，Ｘ００３Ｉ，Ｘ００３Ｋ，Ｘ００３Ｌ，Ｘ００３Ｍ，Ｘ００３Ｎ，Ｘ００３Ｐ，Ｘ００３Ｑ，Ｘ００３Ｒ，Ｘ００３Ｓ，Ｘ００３Ｔ，Ｘ００３Ｖ，Ｘ００３Ｗ，Ｘ００３Ｙ，Ｘ００７Ｃ，Ｘ００７Ｄ，Ｘ００７Ｅ，Ｘ００７Ｆ，Ｘ００７Ｇ，Ｘ００７Ｈ，Ｘ００７Ｉ，Ｘ００７Ｋ，Ｘ００７Ｌ，Ｘ００７Ｍ，Ｘ００７Ｎ，Ｘ００７Ｐ，Ｘ００７Ｑ，Ｘ００７Ｒ，Ｘ００７Ｓ，Ｘ００７Ｔ，Ｘ００７Ｖ，Ｘ００７Ｗ，Ｘ００７Ｙ，Ｘ００９Ａ，Ｘ００９Ｃ，Ｘ００９Ｄ，Ｘ００９Ｅ，Ｘ００９Ｆ，Ｘ００９Ｇ，Ｘ００９Ｈ，Ｘ００９Ｉ，Ｘ００９Ｋ，Ｘ００９Ｌ，Ｘ００９Ｍ，Ｘ００９Ｎ，Ｘ００９Ｐ，Ｘ００９Ｑ，Ｘ００９Ｒ，Ｘ００９Ｓ，Ｘ００９Ｔ，Ｘ００９Ｖ，Ｘ００９Ｗ，Ｘ０１２Ａ，Ｘ０１２Ｃ，Ｘ０１２Ｄ，Ｘ０１２Ｅ，Ｘ０１２Ｆ，Ｘ０１２Ｇ，Ｘ０１２Ｈ，Ｘ０１２Ｉ，Ｘ０１２Ｋ，Ｘ０１２Ｌ，Ｘ０１２Ｍ，Ｘ０１２Ｐ，Ｘ０１２Ｑ，Ｘ０１２Ｒ，Ｘ０１２Ｓ，Ｘ０１２Ｔ，Ｘ０１２Ｖ，Ｘ０１２Ｗ，Ｘ０１２Ｙ，Ｘ０１３Ａ，Ｘ０１３Ｃ，Ｘ０１３Ｄ，Ｘ０１３Ｅ，Ｘ０１３Ｆ，Ｘ０１３Ｇ，Ｘ０１３Ｈ，Ｘ０１３Ｉ，Ｘ０１３Ｋ，Ｘ０１３Ｌ，Ｘ０１３Ｍ，Ｘ０１３Ｎ，Ｘ０１Ｐ３、Ｘ０１３Ｑ，Ｘ０１３Ｒ，Ｘ０１３Ｔ，Ｘ０１３Ｖ，Ｘ０１３Ｗ，Ｘ０１３Ｙ，Ｘ０１６Ａ，Ｘ０１６Ｃ，Ｘ０１６Ｄ，Ｘ０１６Ｅ，Ｘ０１６Ｆ，Ｘ０１６Ｇ，Ｘ０１６Ｈ，Ｘ０１６Ｉ，Ｘ０１６Ｋ，Ｘ０１６Ｌ，Ｘ０１６Ｍ，Ｘ０１６Ｎ，Ｘ０１６Ｐ，Ｘ０１６Ｑ，Ｘ０１６Ｒ，Ｘ０１６Ｓ，Ｘ０１６Ｔ，Ｘ０１６Ｖ，Ｘ０１６Ｗ，Ｘ０１８Ａ，Ｘ０１８Ｃ，Ｘ０１８Ｄ，Ｘ０Ｅ１８、Ｘ０１８Ｆ，Ｘ０１８Ｇ，Ｘ０１８Ｈ，Ｘ０１８Ｉ，Ｘ０１８Ｋ，Ｘ０１８Ｌ，Ｘ０１８Ｍ，Ｘ０１８Ｎ，Ｘ０１８Ｐ，Ｘ０１８Ｑ，Ｘ０１８Ｒ，Ｘ０１８Ｓ，Ｘ０１８Ｔ，Ｘ０１８Ｖ，Ｘ０１８Ｗ，Ｘ０２０Ａ，Ｘ０２０Ｃ，Ｘ０２０Ｄ，Ｘ０２０Ｅ，Ｘ０２０Ｆ，Ｘ０２０Ｇ，Ｘ０２０Ｈ，Ｘ０２０Ｉ，Ｘ０２０Ｋ，Ｘ０２０Ｍ，Ｘ０２０Ｎ，Ｘ０２０Ｐ，Ｘ０２０Ｑ，Ｘ０２０Ｒ，Ｘ０２０Ｓ，Ｘ０２０Ｔ，Ｘ０２０Ｖ，Ｘ０２０Ｗ，Ｘ０２０Ｙ，Ｘ０２３Ａ，Ｘ０２３Ｃ，Ｘ０２３Ｅ，Ｘ０２３Ｆ，Ｘ０２３Ｇ，Ｘ０２３Ｈ，Ｘ０２３Ｉ，Ｘ０２３Ｋ，Ｘ０２３Ｌ，Ｘ０２３Ｍ，Ｘ０２３Ｎ，Ｘ０２３Ｐ，Ｘ０２３Ｑ，Ｘ０２３Ｒ，Ｘ０２３Ｓ，Ｘ０２３Ｔ，Ｘ０２３Ｖ，Ｘ０２３Ｗ，Ｘ０２３Ｙ，Ｘ０２５Ａ，Ｘ０２５Ｃ，Ｘ０２５Ｅ，Ｘ０２５Ｆ，Ｘ０２５Ｇ，Ｘ０２５Ｈ，Ｘ０２５Ｉ，Ｘ０２５Ｋ，Ｘ０２５Ｌ，Ｘ０２５Ｍ，Ｘ０２５Ｎ，Ｘ０２５Ｐ，Ｘ０２５Ｑ，Ｘ０２５Ｒ，Ｘ０２５Ｓ，Ｘ０２５Ｔ，Ｘ０２５Ｖ，Ｘ０２５Ｗ，Ｘ０２５Ｙ，Ｘ０２６Ａ，Ｘ０２６Ｃ，Ｘ０２６Ｄ，Ｘ０２６Ｆ，Ｘ０２６Ｇ，Ｘ０２６Ｈ，Ｘ０２６Ｉ，Ｘ０２６Ｋ，Ｘ０２６Ｌ，Ｘ０２６Ｍ，Ｘ０２６Ｎ，Ｘ０２６Ｐ，Ｘ０２６Ｑ，Ｘ０２６Ｒ，Ｘ０２６Ｓ，Ｘ０２６Ｔ，Ｘ０２６Ｖ，Ｘ０２６Ｗ，Ｘ０２６Ｙ，Ｘ０２７Ａ，Ｘ０２７Ｃ，Ｘ０２７Ｄ，Ｘ０２７Ｅ，Ｘ０２７Ｆ，Ｘ０２７Ｇ，Ｘ０２７Ｈ，Ｘ０２７Ｉ，Ｘ０２７Ｋ，Ｘ０２７Ｌ，Ｘ０２７Ｍ，Ｘ０２７Ｎ，Ｘ０２７Ｐ，Ｘ０２７Ｑ，Ｘ０Ｒ２７、Ｘ０２７Ｖ，Ｘ０２７Ｗ，Ｘ０２７Ｙ，Ｘ０３３Ａ，Ｘ０３３Ｃ，Ｘ０３３Ｅ，Ｘ０３３Ｆ，Ｘ０３３Ｇ，Ｘ０３３Ｈ，Ｘ０３３Ｉ，Ｘ０３３Ｋ，Ｘ０３３Ｌ，Ｘ０３３Ｍ，Ｘ０３３Ｎ，Ｘ０３３Ｐ，Ｘ０３３Ｑ，Ｘ０３３Ｒ，Ｘ０３３Ｓ，Ｘ０３３Ｔ，Ｘ０３３Ｖ，Ｘ０３３Ｗ，Ｘ０３３Ｙ，Ｘ０３６Ａ，Ｘ０３６Ｃ，Ｘ０３６Ｄ，Ｘ０３６Ｅ，Ｘ０３６Ｆ，Ｘ０３６Ｇ，Ｘ０３６Ｇ，Ｘ０３６Ｉ，Ｘ０３６Ｌ，Ｘ０３６Ｍ，Ｘ０３６Ｎ，Ｘ０３６Ｐ，Ｘ０３６Ｑ，Ｘ０３６Ｒ，Ｘ０３６Ｓ，Ｘ０３６Ｔ，Ｘ０３６Ｖ，Ｘ０３６Ｗ，Ｘ０３６Ｙ，Ｘ０４４Ａ，Ｘ０４４Ｃ，Ｘ０４４Ｄ，Ｘ０４４Ｅ，Ｘ０４４Ｆ，Ｘ０４４Ｇ，Ｘ０４４Ｈ，Ｘ０４４Ｉ，Ｘ０４４Ｋ，Ｘ０４４Ｌ，Ｘ０４４Ｍ，Ｘ０４４Ｎ，Ｘ０４４Ｐ，Ｘ０４４Ｑ，Ｘ０４４Ｓ，Ｘ０４４Ｔ，Ｘ０４４Ｖ，Ｘ０４４Ｗ，Ｘ０４４Ｙ，Ｘ０５０Ａ，Ｘ０５０Ｃ，Ｘ０５０Ｄ，Ｘ０５０Ｅ，Ｘ０５０Ｆ，Ｘ０５０Ｇ，Ｘ０５０Ｈ，Ｘ０５０Ｉ，Ｘ０５０Ｌ，Ｘ０５０Ｍ，Ｘ０５０Ｎ，Ｘ０５０Ｐ，Ｘ０５０Ｑ，Ｘ０５０Ｒ，Ｘ０５０Ｓ，Ｘ０５０Ｔ，Ｘ０５０Ｖ，Ｘ０５０Ｗ，Ｘ０５０Ｙ，Ｘ０５３Ａ，Ｘ０５３Ｃ，Ｘ０５３Ｄ，Ｘ０５３Ｅ，Ｘ０５３Ｇ，Ｘ０５３Ｈ，Ｘ０５３Ｉ，Ｘ０５３Ｋ，Ｘ０５３Ｌ，Ｘ０５３Ｍ，Ｘ０５３Ｎ，Ｘ０５３Ｐ，Ｘ０５３Ｑ，Ｘ０５３Ｒ，Ｘ０５３Ｓ，Ｘ０５３Ｔ，Ｘ０５３Ｖ，Ｘ０５３Ｗ，Ｘ０５３Ｙ，Ｘ０５９Ａ，Ｘ０５９Ｃ，Ｘ０５９Ｄ，Ｘ０５９Ｅ，Ｘ０５９Ｆ，Ｘ０５９Ｇ，Ｘ０５９Ｈ，Ｘ０５９Ｉ，Ｘ０５９Ｋ，Ｘ０５９Ｍ，Ｘ０５９Ｎ，Ｘ０５９Ｐ，Ｘ０５９Ｑ，Ｘ０５９Ｒ，Ｘ０５９Ｓ，Ｘ０５９Ｔ，Ｘ０５９Ｖ，Ｘ０５９Ｗ，Ｘ０５９Ｙ，Ｘ０６９Ａ，Ｘ０６９Ｃ，Ｘ０６９Ｄ，Ｘ０６９Ｅ，Ｘ０６９Ｆ，Ｘ０６９Ｈ，Ｘ０６９Ｉ，Ｘ０６９Ｋ，Ｘ０６９Ｌ，Ｘ０６９Ｍ，Ｘ０６９Ｎ，Ｘ０６９Ｐ，Ｘ０６９Ｑ，Ｘ０６９Ｒ，Ｘ０６９Ｓ，Ｘ０６９Ｔ，Ｘ０６９Ｖ，Ｘ０６９Ｗ，Ｘ０６９Ｙ，Ｘ０７４Ａ，Ｘ０７４Ｃ，Ｘ０７４Ｄ，Ｘ０７４Ｅ，Ｘ０７４Ｆ，Ｘ０７４Ｇ，Ｘ０７４Ｈ，Ｘ０７４Ｉ，Ｘ０７４Ｋ，Ｘ０７４Ｌ，Ｘ０７４Ｍ，Ｘ０７４Ｎ，Ｘ０７４Ｐ，Ｘ０７４Ｑ，Ｘ０７４Ｒ，Ｘ０７４Ｔ，Ｘ０７４Ｖ，Ｘ０７４Ｗ，Ｘ０７４Ｙ，Ｘ０７８Ａ，Ｘ０７８Ｃ，Ｘ０７８Ｄ，Ｘ０７８Ｅ，Ｘ０７８Ｆ，Ｘ０７８Ｈ，Ｘ０７８Ｉ，Ｘ０７８Ｋ，Ｘ０７８Ｌ，Ｘ０７８Ｍ，Ｘ０７８Ｎ，Ｘ０７８Ｐ，Ｘ０７８Ｑ，Ｘ０７８Ｒ，Ｘ０７８Ｓ，Ｘ０７８Ｔ，Ｘ０７８Ｖ，Ｘ０７８Ｗ，Ｘ０７８Ｙ，Ｘ０８１Ａ，Ｘ０８１Ｃ，Ｘ０８１Ｅ，Ｘ０８１Ｆ，Ｘ０８１Ｇ，Ｘ０８１Ｈ，Ｘ０８１Ｉ，Ｘ０８１Ｋ，Ｘ０８１Ｌ，Ｘ０８１Ｍ，Ｘ０８１Ｎ，Ｘ０８１Ｐ，Ｘ０８１Ｑ，Ｘ０８１Ｒ，Ｘ０８１Ｓ，Ｘ０８１Ｔ，Ｘ０８１Ｖ，Ｘ０８１Ｗ，Ｘ０８１Ｙ，Ｘ０８７Ａ，Ｘ０８７Ｃ，Ｘ０８７Ｄ，Ｘ０８７Ｅ，Ｘ０８７Ｆ，Ｘ０８７Ｈ，Ｘ０８７Ｉ，Ｘ０８７Ｋ，Ｘ０８７Ｌ，Ｘ０８７Ｍ，Ｘ０８７Ｎ，Ｘ０８７Ｐ，Ｘ０８７Ｑ，Ｘ０８７Ｒ，Ｘ０８７Ｓ，Ｘ０８７Ｔ，Ｘ０８７Ｖ，Ｘ０８７Ｗ，Ｘ０８７Ｙ，Ｘ０９９Ａ，Ｘ０９９Ｃ，Ｘ０９９Ｄ，Ｘ０９９Ｅ，Ｘ０９９Ｆ，Ｘ０９９Ｈ，Ｘ０９９Ｉ，Ｘ０９９Ｋ，Ｘ０９９Ｌ，Ｘ０９９Ｍ，Ｘ０９９Ｎ，Ｘ０９９Ｐ，Ｘ０９９Ｑ，Ｘ０９９Ｒ，Ｘ０９９Ｓ，Ｘ０９９Ｔ，Ｘ０９９Ｖ，Ｘ０９９Ｗ，Ｘ０９９Ｙ，Ｘ１１６Ａ，Ｘ１１６Ｃ，Ｘ１１６Ｄ，Ｘ１１６Ｅ，Ｘ１１６Ｆ，Ｘ１１６Ｇ，Ｘ１１６Ｈ，Ｘ１１６Ｉ，Ｘ１１６Ｋ，Ｘ１１６Ｌ，Ｘ１１６Ｍ，Ｘ１１６Ｎ，Ｘ１１６Ｐ，Ｘ１１６Ｒ，Ｘ１１６Ｓ，Ｘ１１６Ｔ，Ｘ１１６Ｖ，Ｘ１１６Ｗ，Ｘ１１６Ｙ，Ｘ１１７Ａ，Ｘ１１７Ｃ，Ｘ１１７Ｄ，Ｘ１１７Ｆ，Ｘ１１７Ｇ，Ｘ１１７Ｈ，Ｘ１１７Ｉ，Ｘ１１７Ｋ，Ｘ１１７Ｌ，Ｘ１１７Ｍ，Ｘ１１７Ｎ，Ｘ１１７Ｐ，Ｘ１１７Ｑ，Ｘ１１７Ｒ，Ｘ１１７Ｓ，Ｘ１１７Ｔ，Ｘ１１７Ｖ，Ｘ１１７Ｗ，Ｘ１１７Ｙ，Ｘ１２０Ａ，Ｘ１２０Ｃ，Ｘ１２０Ｄ，Ｘ１２０Ｅ，Ｘ１２０Ｆ，Ｘ１２０Ｇ，Ｘ１２０Ｈ，Ｘ１２０Ｉ，Ｘ１２０Ｋ，Ｘ１２０Ｌ，Ｘ１２０Ｍ，Ｘ１２０Ｎ，Ｘ１２０Ｐ，Ｘ１２０Ｑ，Ｘ１２０Ｒ，Ｘ１２０Ｔ，Ｘ１２０Ｖ，Ｘ１２０Ｗ，Ｘ１２０Ｙ，Ｘ１２１Ａ，Ｘ１２１Ｃ，Ｘ１２１Ｄ，Ｘ１２１Ｅ，Ｘ１２１Ｆ，Ｘ１２１Ｈ，Ｘ１２１Ｉ，Ｘ１２１Ｋ，Ｘ１２１Ｌ，Ｘ１２１Ｍ，Ｘ１２１Ｎ，Ｘ１２１Ｐ，Ｘ１２１Ｑ，Ｘ１２１Ｒ，Ｘ１２１Ｓ，Ｘ１２１Ｔ，Ｘ１２１Ｖ，Ｘ１２１Ｗ，Ｘ１２１Ｙ，Ｘ１２５Ａ，Ｘ１２５Ｃ，Ｘ１２５Ｄ，Ｘ１２５Ｅ，Ｘ１２５Ｆ，Ｘ１２５Ｇ，Ｘ１２５Ｈ，Ｘ１２５Ｉ，Ｘ１２５Ｋ，Ｘ１２５Ｌ，Ｘ１２５Ｍ，Ｘ１２５Ｎ，Ｘ１２５Ｐ，Ｘ１２５Ｒ，Ｘ１２５Ｓ，Ｘ１２５Ｔ，Ｘ１２５Ｖ，Ｘ１２５Ｗ，Ｘ１２５Ｙ，Ｘ１２７Ａ，Ｘ１２７Ｃ，Ｘ１２７Ｄ，Ｘ１２７Ｅ，Ｘ１２７Ｆ，Ｘ１２７Ｈ，Ｘ１２７Ｉ，Ｘ１２７Ｋ，Ｘ１２７Ｌ，Ｘ１２７Ｍ，Ｘ１２７Ｎ，Ｘ１２７Ｐ，Ｘ１２７Ｑ，Ｘ１２７Ｒ，Ｘ１２７Ｓ，Ｘ１２７Ｔ，Ｘ１２７Ｖ，Ｘ１２７Ｗ，Ｘ１２７Ｙ，Ｘ１３９Ｃ，Ｘ１３９Ｄ，Ｘ１３９Ｅ，Ｘ１３９Ｆ，Ｘ１３９Ｇ，Ｘ１３９Ｈ，Ｘ１３９Ｉ，Ｘ１３９Ｋ，Ｘ１３９Ｌ，Ｘ１３９Ｍ，Ｘ１３９Ｎ，Ｘ１３９Ｐ，Ｘ１３９Ｑ，Ｘ１３９Ｒ，Ｘ１３９Ｓ，Ｘ１３９Ｔ，Ｘ１３９Ｖ，Ｘ１３９Ｗ，Ｘ１３９Ｙ，Ｘ１６５Ａ，Ｘ１６５Ｃ，Ｘ１６５Ｄ，Ｘ１６５Ｅ，Ｘ１６５Ｆ，Ｘ１６５Ｇ，Ｘ１６５Ｈ，Ｘ１６５Ｋ，Ｘ１６５Ｌ，Ｘ１６５Ｍ，Ｘ１６５Ｎ，Ｘ１６５Ｐ，Ｘ１６５Ｑ，Ｘ１６５Ｒ，Ｘ１６５Ｓ，Ｘ１６５Ｔ，Ｘ１６５Ｖ，Ｘ１６５Ｗ，Ｘ１６５Ｙ，Ｘ１７３Ａ，Ｘ１７３Ｃ，Ｘ１７３Ｄ，Ｘ１７３Ｆ，Ｘ１７３Ｇ，Ｘ１７３Ｈ，Ｘ１７３Ｉ，Ｘ１７３Ｋ，Ｘ１７３Ｌ，Ｘ１７３Ｍ，Ｘ１７３Ｎ，Ｘ１７３Ｐ，Ｘ１７３Ｑ，Ｘ１７３Ｒ，Ｘ１７３Ｓ，Ｘ１７３Ｔ，Ｘ１７３Ｖ，Ｘ１７３Ｗ，Ｘ１７３Ｙ，Ｘ１７４Ａ，Ｘ１７４Ｃ，Ｘ１７４Ｄ，Ｘ１７４Ｆ，Ｘ１７４Ｇ，Ｘ１７４Ｈ，Ｘ１７４Ｉ，Ｘ１７４Ｋ，Ｘ１７４Ｌ，Ｘ１７４Ｍ，Ｘ１７４Ｎ，Ｘ１７４Ｐ，Ｘ１７４Ｑ，Ｘ１７４Ｒ，Ｘ１７４Ｓ，Ｘ１７４Ｔ，Ｘ１７４Ｖ，Ｘ１７４Ｗ，Ｘ１７４Ｙ，Ｘ１７７Ａ，Ｘ１７７Ｃ，Ｘ１７７Ｄ，Ｘ１７７Ｅ，Ｘ１７７Ｆ，Ｘ１７７Ｈ，Ｘ１７７Ｉ，Ｘ１７７Ｋ，Ｘ１７７Ｌ，Ｘ１７７Ｍ，Ｘ１７７Ｎ，Ｘ１７７Ｐ，Ｘ１７７Ｑ，Ｘ１７７Ｒ，Ｘ１７７Ｓ，Ｘ１７７Ｔ，Ｘ１７７Ｖ，Ｘ１７７Ｗ，Ｘ１７７Ｙ，Ｘ１７９Ａ，Ｘ１７９Ｃ，Ｘ１７９Ｄ，Ｘ１７９Ｆ，Ｘ１７９Ｇ，Ｘ１７９Ｈ，Ｘ１７９Ｉ，Ｘ１７９Ｋ，Ｘ１７９Ｌ，Ｘ１７９Ｍ，Ｘ１７９Ｎ，Ｘ１７９Ｐ，Ｘ１７９Ｑ，Ｘ１７９Ｒ，Ｘ１７９Ｓ，Ｘ１７９Ｔ，Ｘ１７９Ｖ，Ｘ１７９Ｗ，Ｘ１７９Ｙ，Ｘ１９４Ａ，Ｘ１９４Ｃ，Ｘ１９４Ｄ，Ｘ１９４Ｅ，Ｘ１９４Ｆ，Ｘ１９４Ｇ，Ｘ１９４Ｈ，Ｘ１９４Ｉ，Ｘ１９４Ｋ，Ｘ１９４Ｌ，Ｘ１９４Ｍ，Ｘ１９４Ｎ，Ｘ１９４Ｐ，Ｘ１９４Ｑ，Ｘ１９４Ｓ，Ｘ１９４Ｔ，Ｘ１９４Ｖ，Ｘ１９４Ｗ，Ｘ１９４Ｙ，Ｘ１９７Ａ，Ｘ１９７Ｃ，Ｘ１９７Ｄ，Ｘ１９７Ｅ，Ｘ１９７Ｆ，Ｘ１９７Ｇ，Ｘ１９７Ｈ，Ｘ１９７Ｉ，Ｘ１９７Ｋ，Ｘ１９７Ｌ，Ｘ１９７Ｍ，Ｘ１９７Ｎ，Ｘ１９７Ｐ，Ｘ１９７Ｒ，Ｘ１９７Ｓ，Ｘ１９７Ｔ，Ｘ１９７Ｖ，Ｘ１９７Ｗ，Ｘ１９７Ｙ，Ｘ２０２Ａ，Ｘ２０２Ｃ，Ｘ２０２Ｄ，Ｘ２０２Ｅ，Ｘ２０２Ｆ，Ｘ２０２Ｇ，Ｘ２０２Ｈ，Ｘ２０２Ｉ，Ｘ２０２Ｋ，Ｘ２０２Ｌ，Ｘ２０２Ｍ，Ｘ２０２Ｎ，Ｘ２０２Ｐ，Ｘ２０２Ｑ，Ｘ２０２Ｒ，Ｘ２０２Ｓ，Ｘ２０２Ｔ，Ｘ２０２Ｗ，Ｘ２０２Ｙ，Ｘ２１６Ａ，Ｘ２１６Ｃ，Ｘ２１６Ｄ，Ｘ２１６Ｅ，Ｘ２１６Ｆ，Ｘ２１６Ｇ，Ｘ２１６Ｈ，Ｘ２１６Ｉ，Ｘ２１６Ｋ，Ｘ２１６Ｌ，Ｘ２１６Ｍ，Ｘ２１６Ｎ，Ｘ２１６Ｐ，Ｘ２１６Ｒ，Ｘ２１６Ｓ，Ｘ２１６Ｔ，Ｘ２１６Ｖ，Ｘ２１６Ｗ，Ｘ２１６Ｙ，Ｘ２４０Ａ，Ｘ２４０Ｃ，Ｘ２４０Ｄ，Ｘ２４０Ｅ，Ｘ２４０Ｆ，Ｘ２４０Ｇ，Ｘ２４０Ｈ，Ｘ２４０Ｉ，Ｘ２４０Ｋ，Ｘ２４０Ｌ，Ｘ２４０Ｍ，Ｘ２４０Ｎ，Ｘ２４０Ｐ，Ｘ２４０Ｑ，Ｘ２４０Ｒ，Ｘ２４０Ｓ，Ｘ２４０Ｖ，Ｘ２４０Ｗ，Ｘ２４０Ｙ，Ｘ２４６Ａ，Ｘ２４６Ｃ，Ｘ２４６Ｄ，Ｘ２４６Ｅ，Ｘ２４６Ｆ，Ｘ２４６Ｇ，Ｘ２４６Ｈ，Ｘ２４６Ｉ，Ｘ２４６Ｋ，Ｘ２４６Ｌ，Ｘ２４６Ｍ，Ｘ２４６Ｎ，Ｘ２４６Ｐ，Ｘ２４６Ｑ，Ｘ２４６Ｓ，Ｘ２４６Ｔ，Ｘ２４６Ｖ，Ｘ２４６Ｗ，Ｘ２４６Ｙ，Ｘ２５１Ａ，Ｘ２５１Ｃ，Ｘ２５１Ｄ，Ｘ２５１Ｅ，Ｘ２５１Ｆ，Ｘ２５１Ｇ，Ｘ２５１Ｈ，Ｘ２５１Ｉ
，Ｘ２５１Ｋ，Ｘ２５１Ｌ，Ｘ２５１Ｍ，Ｘ２５１Ｎ，Ｘ２５１Ｐ，Ｘ２５１Ｑ，Ｘ２５１Ｒ，Ｘ２５１Ｓ，Ｘ２５１Ｖ，Ｘ２５１Ｗ，Ｘ２５１Ｙ，Ｘ２５４Ａ，Ｘ２５４Ｃ，Ｘ２５４Ｄ，Ｘ２５４Ｅ，Ｘ２５４Ｆ，Ｘ２５４Ｇ，Ｘ２５４Ｉ，Ｘ２５４Ｋ，Ｘ２５４Ｌ，Ｘ２５４Ｍ，Ｘ２５４Ｎ，Ｘ２５４Ｐ，Ｘ２５４Ｑ，Ｘ２５４Ｒ，Ｘ２５４Ｓ，Ｘ２５４Ｔ，Ｘ２５４Ｖ，Ｘ２５４Ｗ，Ｘ２５４Ｙ，Ｘ２８７Ａ，Ｘ２８７Ｃ，Ｘ２８７Ｄ，Ｘ２８７Ｅ，Ｘ２８７Ｇ，Ｘ２８７Ｈ，Ｘ２８７Ｉ，Ｘ２８７Ｋ，Ｘ２８７Ｌ，Ｘ２８７Ｍ，Ｘ２８７Ｎ，Ｘ２８７Ｐ，Ｘ２８７Ｑ，Ｘ２８７Ｒ，Ｘ２８７Ｓ，Ｘ２８７Ｔ，Ｘ２８７Ｖ，Ｘ２８７Ｗ，Ｘ２８７Ｙ，Ｘ２９０Ａ，Ｘ２９０Ｃ，Ｘ２９０Ｄ，Ｘ２９０Ｅ，Ｘ２９０Ｆ，Ｘ２９０Ｇ，Ｘ２９０Ｈ，Ｘ２９０Ｉ，Ｘ２９０Ｋ，Ｘ２９０Ｌ，Ｘ２９０Ｍ，Ｘ２９０Ｎ，Ｘ２９０Ｐ，Ｘ２９０Ｑ，Ｘ２９０Ｒ，Ｘ２９０Ｓ，Ｘ２９０Ｔ，Ｘ２９０Ｗ，Ｘ２９０Ｙ，Ｘ３０８Ａ，Ｘ３０８Ｃ，Ｘ３０８Ｄ，Ｘ３０８Ｅ，Ｘ３０８Ｆ，Ｘ３０８Ｇ，Ｘ３０８Ｈ，Ｘ３０８Ｉ，Ｘ３０８Ｋ，Ｘ３０８Ｍ，Ｘ３０８Ｎ，Ｘ３０８Ｐ，Ｘ３０８Ｑ，Ｘ３０８Ｒ，Ｘ３０８Ｓ，Ｘ３０８Ｔ，Ｘ３０８Ｖ，Ｘ３０８Ｗ，Ｘ３０８Ｙ，Ｘ３７６Ａ，Ｘ３７６Ｃ，Ｘ３７６Ｄ，Ｘ３７６Ｅ，Ｘ３７６Ｆ，Ｘ３７６Ｇ，Ｘ３７６Ｈ，Ｘ３７６Ｉ，Ｘ３７６Ｋ，Ｘ３７６Ｍ，Ｘ３７６Ｎ，Ｘ３７６Ｐ，Ｘ３７６Ｑ，Ｘ３７６Ｒ，Ｘ３７６Ｓ，Ｘ３７６Ｔ，Ｘ３７６Ｖ，Ｘ３７６Ｗ，Ｘ３７６Ｙ，Ｘ３７７Ａ，Ｘ３７７Ｃ，Ｘ３７７Ｄ，Ｘ３７７Ｅ，Ｘ３７７Ｆ，Ｘ３７７Ｇ，Ｘ３７７Ｈ，Ｘ３７７Ｉ，Ｘ３７７Ｋ，Ｘ３７７Ｌ，Ｘ３７７Ｍ，Ｘ３７７Ｎ，Ｘ３７７Ｐ，Ｘ３７７Ｑ，Ｘ３７７Ｒ，Ｘ３７７Ｓ，Ｘ３７７Ｔ，Ｘ３７７Ｖ，Ｘ３７７Ｗ，Ｘ３７９Ａ，Ｘ３７９Ｃ，Ｘ３７９Ｄ，Ｘ３７９Ｅ，Ｘ３７９Ｆ，Ｘ３７９Ｇ，Ｘ３７９Ｈ，Ｘ３７９Ｉ，Ｘ３７９Ｌ，Ｘ３７９Ｍ，Ｘ３７９Ｎ，Ｘ３７９Ｐ，Ｘ３７９Ｑ，Ｘ３７９Ｒ，Ｘ３７９Ｓ，Ｘ３７９Ｔ，Ｘ３７９Ｖ，Ｘ３７９Ｗ，Ｘ３７９Ｙ，Ｘ３８９Ａ，Ｘ３８９Ｃ，Ｘ３８９Ｄ，Ｘ３８９Ｅ，Ｘ３８９Ｆ，Ｘ３８９Ｈ，Ｘ３８９Ｉ，Ｘ３８９Ｋ，Ｘ３８９Ｌ，Ｘ３８９Ｍ，Ｘ３８９Ｎ，Ｘ３８９Ｐ，Ｘ３８９Ｑ，Ｘ３８９Ｒ，Ｘ３８９Ｓ，Ｘ３８９Ｔ，Ｘ３８９Ｖ，Ｘ３８９Ｗ，Ｘ３８９Ｙ，Ｘ３９７Ａ，Ｘ３９７Ｃ，Ｘ３９７Ｄ，Ｘ３９７Ｅ，Ｘ３９７Ｆ，Ｘ３９７Ｈ，Ｘ３９７Ｉ，Ｘ３９７Ｋ，Ｘ３９７Ｌ，Ｘ３９７Ｍ，Ｘ３９７Ｎ，Ｘ３９７Ｐ，Ｘ３９７Ｑ，Ｘ３９７Ｒ，Ｘ３９７Ｓ，Ｘ３９７Ｔ，Ｘ３９７Ｖ，Ｘ３９７Ｗ，Ｘ３９７Ｙ，Ｘ４００Ａ，Ｘ４００Ｃ，Ｘ４００Ｄ，Ｘ４００Ｅ，Ｘ４００Ｆ，Ｘ４００Ｇ，Ｘ４００Ｈ，Ｘ４００Ｉ，Ｘ４００Ｋ，Ｘ４００Ｌ，Ｘ４００Ｍ，Ｘ４００Ｎ，Ｘ４００Ｐ，Ｘ４００Ｒ，Ｘ４００Ｓ，Ｘ４００Ｔ，Ｘ４００Ｖ，Ｘ４００Ｗ，Ｘ４００Ｙ，Ｘ４０３Ａ，Ｘ４０３Ｃ，Ｘ４０３Ｄ，Ｘ４０３Ｅ，Ｘ４０３Ｇ，Ｘ４０３Ｈ，Ｘ４０３Ｉ，Ｘ４０３Ｋ，Ｘ４０３Ｌ，Ｘ４０３Ｍ，Ｘ４０３Ｎ，Ｘ４０３Ｐ，Ｘ４０３Ｑ，Ｘ４０３Ｒ，Ｘ４０３Ｓ，Ｘ４０３Ｔ，Ｘ４０３Ｖ，Ｘ４０３Ｗ，Ｘ４０３Ｙ，Ｘ４２１Ａ，Ｘ４２１Ｃ，Ｘ４２１Ｄ，Ｘ４２１Ｅ，Ｘ４２１Ｆ，Ｘ４２１Ｇ，Ｘ４２１Ｈ，Ｘ４２１Ｉ，Ｘ４２１Ｋ，Ｘ４２１Ｌ，Ｘ４２１Ｍ，Ｘ４２１Ｎ，Ｘ４２１Ｐ，Ｘ４２１Ｒ，Ｘ４２１Ｓ，Ｘ４２１Ｔ，Ｘ４２１Ｖ，Ｘ４２１Ｗ，Ｘ４２１Ｙ，Ｘ４２６Ａ，Ｘ４２６Ｃ，Ｘ４２６Ｄ，Ｘ４２６Ｅ，Ｘ４２６Ｆ，Ｘ４２６Ｇ，Ｘ４２６Ｈ，Ｘ４２６Ｉ，Ｘ４２６Ｋ，Ｘ４２６Ｌ，Ｘ４２６Ｍ，Ｘ４２６Ｎ，Ｘ４２６Ｐ，Ｘ４２６Ｑ，Ｘ４２６Ｒ，Ｘ４２６Ｓ，Ｘ４２６Ｖ，Ｘ４２６Ｗ，Ｘ４２６Ｙ，Ｘ４３０Ａ，Ｘ４３０Ｃ，Ｘ４３０Ｄ，Ｘ４３０Ｅ，Ｘ４３０Ｆ，Ｘ４３０Ｇ，Ｘ４３０Ｈ，Ｘ４３０Ｉ，Ｘ４３０Ｋ，Ｘ４３０Ｌ，Ｘ４３０Ｍ，Ｘ４３０Ｎ，Ｘ４３０Ｑ，Ｘ４３０Ｒ，Ｘ４３０Ｓ，Ｘ４３０Ｔ，Ｘ４３０Ｖ，Ｘ４３０Ｗ，Ｘ４３０Ｙ，Ｘ４３４Ａ，Ｘ４３４Ｃ，Ｘ４３４Ｄ，Ｘ４３４Ｅ，Ｘ４３４Ｇ，Ｘ４３４Ｈ，Ｘ４３４Ｉ，Ｘ４３４Ｋ，Ｘ４３４Ｌ，Ｘ４３４Ｍ，Ｘ４３４Ｎ，Ｘ４３４Ｐ，Ｘ４３４Ｑ，Ｘ４３４Ｒ，Ｘ４３４Ｓ，Ｘ４３４Ｔ，Ｘ４３４Ｖ，Ｘ４３４Ｗ，Ｘ４３４Ｙ，Ｘ４４５Ｃ，Ｘ４４５Ｄ，Ｘ４４５Ｅ，Ｘ４４５Ｆ，Ｘ４４５Ｇ，Ｘ４４５Ｈ，Ｘ４４５Ｉ，Ｘ４４５Ｋ，Ｘ４４５Ｌ，Ｘ４４５Ｍ，Ｘ４４５Ｎ，Ｘ４４５Ｐ，Ｘ４４５Ｑ，Ｘ４４５Ｒ，Ｘ４４５Ｓ，Ｘ４４５Ｔ，Ｘ４４５Ｖ，Ｘ４４５Ｗ，Ｘ４４５Ｙ，Ｘ４４８Ｃ，Ｘ４４８Ｄ，Ｘ４４８Ｅ，Ｘ４４８Ｆ，Ｘ４４８Ｇ，Ｘ４４８Ｈ，Ｘ４４８Ｉ，Ｘ４４８Ｋ，Ｘ４４８Ｌ，Ｘ４４８Ｍ，Ｘ４４８Ｎ，Ｘ４４８Ｐ，Ｘ４４８Ｑ，Ｘ４４８Ｒ，Ｘ４４８Ｓ，Ｘ４４８Ｔ，Ｘ４４８Ｖ，Ｘ４４８Ｗ，Ｘ４４８Ｙ，Ｘ４５７Ａ，Ｘ４５７Ｃ，Ｘ４５７Ｄ，Ｘ４５７Ｅ，Ｘ４５７Ｆ，Ｘ４５７Ｇ，Ｘ４５７Ｈ，Ｘ４５７Ｉ，Ｘ４５７Ｋ，Ｘ４５７Ｌ，Ｘ４５７Ｍ，Ｘ４５７Ｎ，Ｘ４５７Ｐ，Ｘ４５７Ｑ，Ｘ４５７Ｒ，Ｘ４５７Ｔ，Ｘ４５７Ｖ，Ｘ４５７Ｗ，Ｘ４５７Ｙ，Ｘ４６２Ａ，Ｘ４６２Ｃ，Ｘ４６２Ｄ，Ｘ４６２Ｅ，Ｘ４６２Ｆ，Ｘ４６２Ｇ，Ｘ４６２Ｈ，Ｘ４６２Ｉ，Ｘ４６２Ｋ，Ｘ４６２Ｌ，Ｘ４６２Ｍ，Ｘ４６２Ｎ，Ｘ４６２Ｐ，Ｘ４６２Ｑ，Ｘ４６２Ｒ，Ｘ４６２Ｓ，Ｘ４６２Ｖ，Ｘ４６２Ｗ，Ｘ４６２Ｙ，Ｘ４７６Ａ，Ｘ４７６Ｃ，Ｘ４７６Ｄ，Ｘ４７６Ｅ，Ｘ４７６Ｆ，Ｘ４７６Ｇ，Ｘ４７６Ｈ，Ｘ４７６Ｉ，Ｘ４７６Ｋ，Ｘ４７６Ｌ，Ｘ４７６Ｍ，Ｘ４７６Ｐ，Ｘ４７６Ｑ，Ｘ４７６Ｒ，Ｘ４７６Ｓ，Ｘ４７６Ｔ，Ｘ４７６Ｖ，Ｘ４７６Ｗ，Ｘ４７６Ｙ，Ｘ４８７Ａ，Ｘ４８７Ｃ，Ｘ４８７Ｄ，Ｘ４８７Ｅ，Ｘ４８７Ｆ，Ｘ４８７Ｇ，Ｘ４８７Ｈ，Ｘ４８７Ｉ，Ｘ４８７Ｌ，Ｘ４８７Ｍ，Ｘ４８７Ｎ，Ｘ４８７Ｐ，Ｘ４８７Ｑ，Ｘ４８７Ｒ，Ｘ４８７Ｓ，Ｘ４８７Ｔ，Ｘ４８７Ｖ，Ｘ４８７Ｗ，Ｘ４８７Ｙ，Ｘ４８８Ａ，Ｘ４８８Ｃ，Ｘ４８８Ｄ，Ｘ４８８Ｆ，Ｘ４８８Ｇ，Ｘ４８８Ｈ，Ｘ４８８Ｉ，Ｘ４８８Ｋ，Ｘ４８８Ｌ，Ｘ４８８Ｍ，Ｘ４８８Ｎ，Ｘ４８８Ｐ，Ｘ４８８Ｑ，Ｘ４８８Ｒ，Ｘ４８８Ｓ，Ｘ４８８Ｔ，Ｘ４８８Ｖ，Ｘ４８８Ｗ，Ｘ４８８Ｙ，Ｘ４８９Ａ，Ｘ４８９Ｃ，Ｘ４８９Ｄ，Ｘ４８９Ｅ，Ｘ４８９Ｆ，Ｘ４８９Ｇ，Ｘ４８９Ｈ，Ｘ４８９Ｉ，Ｘ４８９Ｌ，Ｘ４８９Ｍ，Ｘ４８９Ｎ，Ｘ４８９Ｐ，Ｘ４８９Ｑ，Ｘ４８９Ｒ，Ｘ４８９Ｓ，Ｘ４８９Ｔ，Ｘ４８９Ｖ，Ｘ４８９Ｗ，Ｘ４８９Ｙ，Ｘ４９０Ａ，Ｘ４９０Ｃ，Ｘ４９０Ｄ，Ｘ４９０Ｅ，Ｘ４９０Ｆ，Ｘ４９０Ｇ，Ｘ４９０Ｈ，Ｘ４９０Ｉ，Ｘ４９０Ｋ，Ｘ４９０Ｍ，Ｘ４９０Ｎ，Ｘ４９０Ｐ，Ｘ４９０Ｑ，Ｘ４９０Ｒ，Ｘ４９０Ｓ，Ｘ４９０Ｔ，Ｘ４９０Ｖ，Ｘ４９０Ｗ，Ｘ４９０Ｙ，Ｘ４９１Ａ，Ｘ４９１Ｃ，Ｘ４９１Ｄ，Ｘ４９１Ｅ，Ｘ４９１Ｆ，Ｘ４９１Ｈ，Ｘ４９１Ｉ，Ｘ４９１Ｋ，Ｘ４９１Ｌ，Ｘ４９１Ｍ，Ｘ４９１Ｎ，Ｘ４９１Ｐ，Ｘ４９１Ｑ，Ｘ４９１Ｒ，Ｘ４９１Ｓ，Ｘ４９１Ｔ，Ｘ４９１Ｖ，Ｘ４９１Ｗ，Ｘ４９１Ｙ，Ｘ４９２Ａ，Ｘ４９２Ｃ，Ｘ４９２Ｄ，Ｘ４９２Ｅ，Ｘ４９２Ｆ，Ｘ４９２Ｈ，Ｘ４９２Ｉ，Ｘ４９２Ｋ，Ｘ４９２Ｌ，Ｘ４９２Ｍ，Ｘ４９２Ｎ，Ｘ４９２Ｐ，Ｘ４９２Ｑ，Ｘ４９２Ｒ，Ｘ４９２Ｓ，Ｘ４９２Ｔ，Ｘ４９２Ｖ，Ｘ４９２Ｗ，Ｘ４９２Ｙ，Ｘ４９３Ａ，Ｘ４９３Ｃ，Ｘ４９３Ｄ，Ｘ４９３Ｅ，Ｘ４９３Ｆ，Ｘ４９３Ｇ，Ｘ４９３Ｈ，Ｘ４９３Ｉ，Ｘ４９３Ｋ，Ｘ４９３Ｌ，Ｘ４９３Ｍ，Ｘ４９３Ｎ，Ｘ４９３Ｐ，Ｘ４９３Ｑ，Ｘ４９３Ｒ，Ｘ４９３Ｔ，Ｘ４９３Ｖ，Ｘ４９３Ｗ，Ｘ４９３Ｙ，Ｘ４９５Ａ，Ｘ４９５Ｃ，Ｘ４９５Ｄ，Ｘ４９５Ｅ，Ｘ４９５Ｇ，Ｘ４９５Ｈ，Ｘ４９５Ｉ，Ｘ４９５Ｋ，Ｘ４９５Ｌ，Ｘ４９５Ｍ，Ｘ４９５Ｎ，Ｘ４９５Ｐ，Ｘ４９５Ｑ，Ｘ４９５Ｒ，Ｘ４９５Ｓ，Ｘ４９５Ｔ，Ｘ４９５Ｖ，Ｘ４９５Ｗ，Ｘ４９５Ｙ，Ｘ４９６Ｃ，Ｘ４９６Ｄ，Ｘ４９６Ｅ，Ｘ４９６Ｆ，Ｘ４９６Ｇ，Ｘ４９６Ｈ，Ｘ４９６Ｉ，Ｘ４９６Ｋ，Ｘ４９６Ｌ，Ｘ４９６Ｍ，Ｘ４９６Ｎ，Ｘ４９６Ｐ，Ｘ４９６Ｑ，Ｘ４９６Ｒ，Ｘ４９６Ｓ，Ｘ４９６Ｔ，Ｘ４９６Ｖ，Ｘ４９６Ｗ，Ｘ４９６Ｙ，Ｘ４９７Ａ，Ｘ４９７Ｃ，Ｘ４９７Ｄ，Ｘ４９７Ｅ，Ｘ４９７Ｆ，Ｘ４９７Ｇ，Ｘ４９７Ｈ，Ｘ４９７Ｉ，Ｘ４９７Ｌ，Ｘ４９７Ｍ，Ｘ４９７Ｎ，Ｘ４９７Ｐ，Ｘ４９７Ｑ，Ｘ４９７Ｒ，Ｘ４９７Ｓ，Ｘ４９７Ｔ，Ｘ４９７Ｖ，Ｘ４９７Ｗ，Ｘ４９７Ｙ，Ｘ４９８Ａ，Ｘ４９８Ｃ，Ｘ４９８Ｄ，Ｘ４９８Ｅ，Ｘ４９８Ｆ，Ｘ４９８Ｇ，Ｘ４９８Ｈ，Ｘ４９８Ｉ，Ｘ４９８Ｋ，Ｘ４９８Ｌ，Ｘ４９８Ｍ，Ｘ４９８Ｎ，Ｘ４９８Ｑ，Ｘ４９８Ｒ，Ｘ４９８Ｓ，Ｘ４９８Ｔ，Ｘ４９８Ｖ，Ｘ４９８Ｗ，Ｘ４９８Ｙ，Ｘ５０９Ａ，Ｘ５０９Ｃ，Ｘ５０９Ｄ，Ｘ５０９Ｅ，Ｘ５０９Ｆ，Ｘ５０９Ｇ，Ｘ５０９Ｈ，Ｘ５０９Ｉ，Ｘ５０９Ｋ，Ｘ５０９Ｌ，Ｘ５０９Ｍ，Ｘ５０９Ｎ，Ｘ５０９Ｐ，Ｘ５０９Ｒ，Ｘ５０９Ｓ，Ｘ５０９Ｔ，Ｘ５０９Ｖ，Ｘ５０９Ｗ，Ｘ５０９Ｙ，Ｘ５１４Ａ，Ｘ５１４Ｃ，Ｘ５１４Ｄ，Ｘ５１４Ｅ，Ｘ５１４Ｆ，Ｘ５１４Ｇ，Ｘ５１４Ｈ，Ｘ５１４Ｉ，Ｘ５１４Ｋ，Ｘ５１４Ｌ，Ｘ５１４Ｍ，Ｘ５１４Ｎ，Ｘ５１４Ｐ，Ｘ５１４Ｑ，Ｘ５１４Ｒ，Ｘ５１４Ｓ，Ｘ５１４Ｔ，Ｘ５１４Ｖ，Ｘ５１４Ｗ，Ｘ５２１Ａ，Ｘ５２１Ｃ，Ｘ５２１Ｄ，Ｘ５２１Ｅ，Ｘ５２１Ｆ，Ｘ５２１Ｇ，Ｘ５２１Ｈ，Ｘ５２１Ｉ，Ｘ５２１Ｋ，Ｘ５２１Ｌ，Ｘ５２１Ｍ，Ｘ５２１Ｎ，Ｘ５２１Ｐ，Ｘ５２１Ｑ，Ｘ５２１Ｒ，Ｘ５２１Ｓ，Ｘ５２１Ｖ，Ｘ５２１Ｗ，Ｘ５２１Ｙ，Ｘ５３９Ａ，Ｘ５３９Ｃ，Ｘ５３９Ｄ，Ｘ５３９Ｅ，Ｘ５３９Ｆ，Ｘ５３９Ｇ，Ｘ５３９Ｈ，Ｘ５３９Ｋ，Ｘ５３９Ｌ，Ｘ５３９Ｍ，Ｘ５３９Ｎ，Ｘ５３９Ｐ，Ｘ５３９Ｑ，Ｘ５３９Ｒ，Ｘ５３９Ｓ，Ｘ５３９Ｔ，Ｘ５３９Ｖ，Ｘ５３９Ｗ，Ｘ５３９Ｙ，Ｘ５４０Ａ，Ｘ５４０Ｃ，Ｘ５４０Ｄ，Ｘ５４０Ｅ，Ｘ５４０Ｆ，Ｘ５４０Ｇ，Ｘ５４０Ｈ，Ｘ５４０Ｉ，Ｘ５４０Ｋ，Ｘ５４０Ｍ，Ｘ５４０Ｎ，Ｘ５４０Ｐ，Ｘ５４０Ｑ，Ｘ５４０Ｒ，Ｘ５４０Ｓ，Ｘ５４０Ｔ，Ｘ５４０Ｖ，Ｘ５４０Ｗ，Ｘ５４０Ｙ，Ｘ５４４Ａ，Ｘ５４４Ｃ，Ｘ５４４Ｄ，Ｘ５４４Ｅ，Ｘ５４４Ｆ，Ｘ５４４Ｇ，Ｘ５４４Ｈ，Ｘ５４４Ｉ，Ｘ５４４Ｋ，Ｘ５４４Ｌ，Ｘ５４４Ｍ，Ｘ５４４Ｎ，Ｘ５４４Ｐ，Ｘ５４４Ｑ，Ｘ５４４Ｓ，Ｘ５４４Ｔ，Ｘ５４４Ｖ，Ｘ５４４Ｗ，及びＸ５４４Ｙからなる群から選択された別の置換も含み、ここで、Ｘは任意のアミン酸を意味し、各アミノ酸残基の位置は、図２０に示す通りのウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素配列中のアミノ酸残基の位置と対応させて付番される。置換Ｘ４９１Ｓは、表Ｂ又はＣに記載の任意の他の置換と組み合わせてもよい。
一部の実施形態では、変異体は、アミノ酸残基：Ｎ４３８，Ｅ４５１，及びＹ５１４を含む。一部の実施形態では、変異体は、アミノ酸残基：Ｆ２８７，Ｇ３９７，Ｎ４３８，Ｅ４５１，及びＹ５１４を含む。一部の実施形態では、変異体はＳ４９１を含む。一部の実施形態では、変異体は、Ｓ４９１に加えて、Ｘ００３Ｃ，Ｘ００３Ｄ，Ｘ００３Ｅ，Ｘ００３Ｆ，Ｘ００３Ｇ，Ｘ００３Ｈ，Ｘ００３Ｉ，Ｘ００３Ｋ，Ｘ００３Ｌ，Ｘ００３Ｍ，Ｘ００３Ｎ，Ｘ００３Ｐ，Ｘ００３Ｑ，Ｘ００３Ｒ，Ｘ００３Ｓ，Ｘ００３Ｔ，Ｘ００３Ｖ，Ｘ００３Ｗ，Ｘ００３Ｙ，Ｘ００７Ｃ，Ｘ００７Ｄ，Ｘ００７Ｅ，Ｘ００７Ｆ，Ｘ００７Ｇ，Ｘ００７Ｈ，Ｘ００７Ｉ，Ｘ００７Ｋ，Ｘ００７Ｌ，Ｘ００７Ｍ，Ｘ００７Ｎ，Ｘ００７Ｐ，Ｘ００７Ｑ，Ｘ００７Ｒ，Ｘ００７Ｓ，Ｘ００７Ｔ，Ｘ００７Ｖ，Ｘ００７Ｗ，Ｘ００７Ｙ，Ｘ００９Ａ，Ｘ００９Ｃ，Ｘ００９Ｄ，Ｘ００９Ｅ，Ｘ００９Ｆ，Ｘ００９Ｇ，Ｘ００９Ｈ，Ｘ００９Ｉ，Ｘ００９Ｋ，Ｘ００９Ｌ，Ｘ００９Ｍ，Ｘ００９Ｎ，Ｘ００９Ｐ，Ｘ００９Ｑ，Ｘ００９Ｒ，Ｘ００９Ｓ，Ｘ００９Ｔ，Ｘ００９Ｖ，Ｘ００９Ｗ，Ｘ０１２Ａ，Ｘ０１２Ｃ，Ｘ０１２Ｄ，Ｘ０１２Ｅ，Ｘ０１２Ｆ，Ｘ０１２Ｇ，Ｘ０１２Ｈ，Ｘ０１２Ｉ，Ｘ０１２Ｋ，Ｘ０１２Ｌ，Ｘ０１２Ｍ，Ｘ０１２Ｐ，Ｘ０１２Ｑ，Ｘ０１２Ｒ，Ｘ０１２Ｓ，Ｘ０１２Ｔ，Ｘ０１２Ｖ，Ｘ０１２Ｗ，Ｘ０１２Ｙ，Ｘ０１３Ａ，Ｘ０１３Ｃ，Ｘ０１３Ｄ，Ｘ０１３Ｅ，Ｘ０１３Ｆ，Ｘ０１３Ｇ，Ｘ０１３Ｈ，Ｘ０１３Ｉ，Ｘ０１３Ｋ，Ｘ０１３Ｌ，Ｘ０１３Ｍ，Ｘ０１３Ｎ，Ｘ０１Ｐ３、Ｘ０１３Ｑ，Ｘ０１３Ｒ，Ｘ０１３Ｔ，Ｘ０１３Ｖ，Ｘ０１３Ｗ，Ｘ０１３Ｙ，Ｘ０１６Ａ，Ｘ０１６Ｃ，Ｘ０１６Ｄ，Ｘ０１６Ｅ，Ｘ０１６Ｆ，Ｘ０１６Ｇ，Ｘ０１６Ｈ，Ｘ０１６Ｉ，Ｘ０１６Ｋ，Ｘ０１６Ｌ，Ｘ０１６Ｍ，Ｘ０１６Ｎ，Ｘ０１６Ｐ，Ｘ０１６Ｑ，Ｘ０１６Ｒ，Ｘ０１６Ｓ，Ｘ０１６Ｔ，Ｘ０１６Ｖ，Ｘ０１６Ｗ，Ｘ０１８Ａ，Ｘ０１８Ｃ，Ｘ０１８Ｄ，Ｘ０Ｅ１８、Ｘ０１８Ｆ，Ｘ０１８Ｇ，Ｘ０１８Ｈ，Ｘ０１８Ｉ，Ｘ０１８Ｋ，Ｘ０１８Ｌ，Ｘ０１８Ｍ，Ｘ０１８Ｎ，Ｘ０１８Ｐ，Ｘ０１８Ｑ，Ｘ０１８Ｒ，Ｘ０１８Ｓ，Ｘ０１８Ｔ，Ｘ０１８Ｖ，Ｘ０１８Ｗ，Ｘ０２０Ａ，Ｘ０２０Ｃ，Ｘ０２０Ｄ，Ｘ０２０Ｅ，Ｘ０２０Ｆ，Ｘ０２０Ｇ，Ｘ０２０Ｈ，Ｘ０２０Ｉ，Ｘ０２０Ｋ，Ｘ０２０Ｍ，Ｘ０２０Ｎ，Ｘ０２０Ｐ，Ｘ０２０Ｑ，Ｘ０２０Ｒ，Ｘ０２０Ｓ，Ｘ０２０Ｔ，Ｘ０２０Ｖ，Ｘ０２０Ｗ，Ｘ０２０Ｙ，Ｘ０２３Ａ，Ｘ０２３Ｃ，Ｘ０２３Ｅ，Ｘ０２３Ｆ，Ｘ０２３Ｇ，Ｘ０２３Ｈ，Ｘ０２３Ｉ，Ｘ０２３Ｋ，Ｘ０２３Ｌ，Ｘ０２３Ｍ，Ｘ０２３Ｎ，Ｘ０２３Ｐ，Ｘ０２３Ｑ，Ｘ０２３Ｒ，Ｘ０２３Ｓ，Ｘ０２３Ｔ，Ｘ０２３Ｖ，Ｘ０２３Ｗ，Ｘ０２３Ｙ，Ｘ０２５Ａ，Ｘ０２５Ｃ，Ｘ０２５Ｅ，Ｘ０２５Ｆ，Ｘ０２５Ｇ，Ｘ０２５Ｈ，Ｘ０２５Ｉ，Ｘ０２５Ｋ，Ｘ０２５Ｌ，Ｘ０２５Ｍ，Ｘ０２５Ｎ，Ｘ０２５Ｐ，Ｘ０２５Ｑ，Ｘ０２５Ｒ，Ｘ０２５Ｓ，Ｘ０２５Ｔ，Ｘ０２５Ｖ，Ｘ０２５Ｗ，Ｘ０２５Ｙ，Ｘ０２６Ａ，Ｘ０２６Ｃ，Ｘ０２６Ｄ，Ｘ０２６Ｆ，Ｘ０２６Ｇ，Ｘ０２６Ｈ，Ｘ０２６Ｉ，Ｘ０２６Ｋ，Ｘ０２６Ｌ，Ｘ０２６Ｍ，Ｘ０２６Ｎ，Ｘ０２６Ｐ，Ｘ０２６Ｑ，Ｘ０２６Ｒ，Ｘ０２６Ｓ，Ｘ０２６Ｔ，Ｘ０２６Ｖ，Ｘ０２６Ｗ，Ｘ０２６Ｙ，Ｘ０２７Ａ，Ｘ０２７Ｃ，Ｘ０２７Ｄ，Ｘ０２７Ｅ，Ｘ０２７Ｆ，Ｘ０２７Ｇ，Ｘ０２７Ｈ，Ｘ０２７Ｉ，Ｘ０２７Ｋ，Ｘ０２７Ｌ，Ｘ０２７Ｍ，Ｘ０２７Ｎ，Ｘ０２７Ｐ，Ｘ０２７Ｑ，Ｘ０Ｒ２７、Ｘ０２７Ｖ，Ｘ０２７Ｗ，Ｘ０２７Ｙ，Ｘ０３３Ａ，Ｘ０３３Ｃ，Ｘ０３３Ｅ，Ｘ０３３Ｆ，Ｘ０３３Ｇ，Ｘ０３３Ｈ，Ｘ０３３Ｉ，Ｘ０３３Ｋ，Ｘ０３３Ｌ，Ｘ０３３Ｍ，Ｘ０３３Ｎ，Ｘ０３３Ｐ，Ｘ０３３Ｑ，Ｘ０３３Ｒ，Ｘ０３３Ｓ，Ｘ０３３Ｔ，Ｘ０３３Ｖ，Ｘ０３３Ｗ，Ｘ０３３Ｙ，Ｘ０３６Ａ，Ｘ０３６Ｃ，Ｘ０３６Ｄ，Ｘ０３６Ｅ，Ｘ０３６Ｆ，Ｘ０３６Ｇ，Ｘ０３６Ｇ，Ｘ０３６Ｉ，Ｘ０３６Ｌ，Ｘ０３６Ｍ，Ｘ０３６Ｎ，Ｘ０３６Ｐ，Ｘ０３６Ｑ，Ｘ０３６Ｒ，Ｘ０３６Ｓ，Ｘ０３６Ｔ，Ｘ０３６Ｖ，Ｘ０３６Ｗ，Ｘ０３６Ｙ，Ｘ０４４Ａ，Ｘ０４４Ｃ，Ｘ０４４Ｄ，Ｘ０４４Ｅ，Ｘ０４４Ｆ，Ｘ０４４Ｇ，Ｘ０４４Ｈ，Ｘ０４４Ｉ，Ｘ０４４Ｋ，Ｘ０４４Ｌ，Ｘ０４４Ｍ，Ｘ０４４Ｎ，Ｘ０４４Ｐ，Ｘ０４４Ｑ，Ｘ０４４Ｓ，Ｘ０４４Ｔ，Ｘ０４４Ｖ，Ｘ０４４Ｗ，Ｘ０４４Ｙ，Ｘ０５０Ａ，Ｘ０５０Ｃ，Ｘ０５０Ｄ，Ｘ０５０Ｅ，Ｘ０５０Ｆ，Ｘ０５０Ｇ，Ｘ０５０Ｈ，Ｘ０５０Ｉ，Ｘ０５０Ｌ，Ｘ０５０Ｍ，Ｘ０５０Ｎ，Ｘ０５０Ｐ，Ｘ０５０Ｑ，Ｘ０５０Ｒ，Ｘ０５０Ｓ，Ｘ０５０Ｔ，Ｘ０５０Ｖ，Ｘ０５０Ｗ，Ｘ０５０Ｙ，Ｘ０５３Ａ，Ｘ０５３Ｃ，Ｘ０５３Ｄ，Ｘ０５３Ｅ，Ｘ０５３Ｇ，Ｘ０５３Ｈ，Ｘ０５３Ｉ，Ｘ０５３Ｋ，Ｘ０５３Ｌ，Ｘ０５３Ｍ，Ｘ０５３Ｎ，Ｘ０５３Ｐ，Ｘ０５３Ｑ，Ｘ０５３Ｒ，Ｘ０５３Ｓ，Ｘ０５３Ｔ，Ｘ０５３Ｖ，Ｘ０５３Ｗ，Ｘ０５３Ｙ，Ｘ０５９Ａ，Ｘ０５９Ｃ，Ｘ０５９Ｄ，Ｘ０５９Ｅ，Ｘ０５９Ｆ，Ｘ０５９Ｇ，Ｘ０５９Ｈ，Ｘ０５９Ｉ，Ｘ０５９Ｋ，Ｘ０５９Ｍ，Ｘ０５９Ｎ，Ｘ０５９Ｐ，Ｘ０５９Ｑ，Ｘ０５９Ｒ，Ｘ０５９Ｓ，Ｘ０５９Ｔ，Ｘ０５９Ｖ，Ｘ０５９Ｗ，Ｘ０５９Ｙ，Ｘ０６９Ａ，Ｘ０６９Ｃ，Ｘ０６９Ｄ，Ｘ０６９Ｅ，Ｘ０６９Ｆ，Ｘ０６９Ｈ，Ｘ０６９Ｉ，Ｘ０６９Ｋ，Ｘ０６９Ｌ，Ｘ０６９Ｍ，Ｘ０６９Ｎ，Ｘ０６９Ｐ，Ｘ０６９Ｑ，Ｘ０６９Ｒ，Ｘ０６９Ｓ，Ｘ０６９Ｔ，Ｘ０６９Ｖ，Ｘ０６９Ｗ，Ｘ０６９Ｙ，Ｘ０７４Ａ，Ｘ０７４Ｃ，Ｘ０７４Ｄ，Ｘ０７４Ｅ，Ｘ０７４Ｆ，Ｘ０７４Ｇ，Ｘ０７４Ｈ，Ｘ０７４Ｉ，Ｘ０７４Ｋ，Ｘ０７４Ｌ，Ｘ０７４Ｍ，Ｘ０７４Ｎ，Ｘ０７４Ｐ，Ｘ０７４Ｑ，Ｘ０７４Ｒ，Ｘ０７４Ｔ，Ｘ０７４Ｖ，Ｘ０７４Ｗ，Ｘ０７４Ｙ，Ｘ０７８Ａ，Ｘ０７８Ｃ，Ｘ０７８Ｄ，Ｘ０７８Ｅ，Ｘ０７８Ｆ，Ｘ０７８Ｈ，Ｘ０７８Ｉ，Ｘ０７８Ｋ，Ｘ０７８Ｌ，Ｘ０７８Ｍ，Ｘ０７８Ｎ，Ｘ０７８Ｐ，Ｘ０７８Ｑ，Ｘ０７８Ｒ，Ｘ０７８Ｓ，Ｘ０７８Ｔ，Ｘ０７８Ｖ，Ｘ０７８Ｗ，Ｘ０７８Ｙ，Ｘ０８１Ａ，Ｘ０８１Ｃ，Ｘ０８１Ｅ，Ｘ０８１Ｆ，Ｘ０８１Ｇ，Ｘ０８１Ｈ，Ｘ０８１Ｉ，Ｘ０８１Ｋ，Ｘ０８１Ｌ，Ｘ０８１Ｍ，Ｘ０８１Ｎ，Ｘ０８１Ｐ，Ｘ０８１Ｑ，Ｘ０８１Ｒ，Ｘ０８１Ｓ，Ｘ０８１Ｔ，Ｘ０８１Ｖ，Ｘ０８１Ｗ，Ｘ０８１Ｙ，Ｘ０８７Ａ，Ｘ０８７Ｃ，Ｘ０８７Ｄ，Ｘ０８７Ｅ，Ｘ０８７Ｆ，Ｘ０８７Ｈ，Ｘ０８７Ｉ，Ｘ０８７Ｋ，Ｘ０８７Ｌ，Ｘ０８７Ｍ，Ｘ０８７Ｎ，Ｘ０８７Ｐ，Ｘ０８７Ｑ，Ｘ０８７Ｒ，Ｘ０８７Ｓ，Ｘ０８７Ｔ，Ｘ０８７Ｖ，Ｘ０８７Ｗ，Ｘ０８７Ｙ，Ｘ０９９Ａ，Ｘ０９９Ｃ，Ｘ０９９Ｄ，Ｘ０９９Ｅ，Ｘ０９９Ｆ，Ｘ０９９Ｈ，Ｘ０９９Ｉ，Ｘ０９９Ｋ，Ｘ０９９Ｌ，Ｘ０９９Ｍ，Ｘ０９９Ｎ，Ｘ０９９Ｐ，Ｘ０９９Ｑ，Ｘ０９９Ｒ，Ｘ０９９Ｓ，Ｘ０９９Ｔ，Ｘ０９９Ｖ，Ｘ０９９Ｗ，Ｘ０９９Ｙ，Ｘ１１６Ａ，Ｘ１１６Ｃ，Ｘ１１６Ｄ，Ｘ１１６Ｅ，Ｘ１１６Ｆ，Ｘ１１６Ｇ，Ｘ１１６Ｈ，Ｘ１１６Ｉ，Ｘ１１６Ｋ，Ｘ１１６Ｌ，Ｘ１１６Ｍ，Ｘ１１６Ｎ，Ｘ１１６Ｐ，Ｘ１１６Ｒ，Ｘ１１６Ｓ，Ｘ１１６Ｔ，Ｘ１１６Ｖ，Ｘ１１６Ｗ，Ｘ１１６Ｙ，Ｘ１１７Ａ，Ｘ１１７Ｃ，Ｘ１１７Ｄ，Ｘ１１７Ｆ，Ｘ１１７Ｇ，Ｘ１１７Ｈ，Ｘ１１７Ｉ，Ｘ１１７Ｋ，Ｘ１１７Ｌ，Ｘ１１７Ｍ，Ｘ１１７Ｎ，Ｘ１１７Ｐ，Ｘ１１７Ｑ，Ｘ１１７Ｒ，Ｘ１１７Ｓ，Ｘ１１７Ｔ，Ｘ１１７Ｖ，Ｘ１１７Ｗ，Ｘ１１７Ｙ，Ｘ１２０Ａ，Ｘ１２０Ｃ，Ｘ１２０Ｄ，Ｘ１２０Ｅ，Ｘ１２０Ｆ，Ｘ１２０Ｇ，Ｘ１２０Ｈ，Ｘ１２０Ｉ，Ｘ１２０Ｋ，Ｘ１２０Ｌ，Ｘ１２０Ｍ，Ｘ１２０Ｎ，Ｘ１２０Ｐ，Ｘ１２０Ｑ，Ｘ１２０Ｒ，Ｘ１２０Ｔ，Ｘ１２０Ｖ，Ｘ１２０Ｗ，Ｘ１２０Ｙ，Ｘ１２１Ａ，Ｘ１２１Ｃ，Ｘ１２１Ｄ，Ｘ１２１Ｅ，Ｘ１２１Ｆ，Ｘ１２１Ｈ，Ｘ１２１Ｉ，Ｘ１２１Ｋ，Ｘ１２１Ｌ，Ｘ１２１Ｍ，Ｘ１２１Ｎ，Ｘ１２１Ｐ，Ｘ１２１Ｑ，Ｘ１２１Ｒ，Ｘ１２１Ｓ，Ｘ１２１Ｔ，Ｘ１２１Ｖ，Ｘ１２１Ｗ，Ｘ１２１Ｙ，Ｘ１２５Ａ，Ｘ１２５Ｃ，Ｘ１２５Ｄ，Ｘ１２５Ｅ，Ｘ１２５Ｆ，Ｘ１２５Ｇ，Ｘ１２５Ｈ，Ｘ１２５Ｉ，Ｘ１２５Ｋ，Ｘ１２５Ｌ，Ｘ１２５Ｍ，Ｘ１２５Ｎ，Ｘ１２５Ｐ，Ｘ１２５Ｒ，Ｘ１２５Ｓ，Ｘ１２５Ｔ，Ｘ１２５Ｖ，Ｘ１２５Ｗ，Ｘ１２５Ｙ，Ｘ１２７Ａ，Ｘ１２７Ｃ，Ｘ１２７Ｄ，Ｘ１２７Ｅ，Ｘ１２７Ｆ，Ｘ１２７Ｈ，Ｘ１２７Ｉ，Ｘ１２７Ｋ，Ｘ１２７Ｌ，Ｘ１２７Ｍ，Ｘ１２７Ｎ，Ｘ１２７Ｐ，Ｘ１２７Ｑ，Ｘ１２７Ｒ，Ｘ１２７Ｓ，Ｘ１２７Ｔ，Ｘ１２７Ｖ，Ｘ１２７Ｗ，Ｘ１２７Ｙ，Ｘ１３９Ｃ，Ｘ１３９Ｄ，Ｘ１３９Ｅ，Ｘ１３９Ｆ，Ｘ１３９Ｇ，Ｘ１３９Ｈ，Ｘ１３９Ｉ，Ｘ１３９Ｋ，Ｘ１３９Ｌ，Ｘ１３９Ｍ，Ｘ１３９Ｎ，Ｘ１３９Ｐ，Ｘ１３９Ｑ，Ｘ１３９Ｒ，Ｘ１３９Ｓ，Ｘ１３９Ｔ，Ｘ１３９Ｖ，Ｘ１３９Ｗ，Ｘ１３９Ｙ，Ｘ１６５Ａ，Ｘ１６５Ｃ，Ｘ１６５Ｄ，Ｘ１６５Ｅ，Ｘ１６５Ｆ，Ｘ１６５Ｇ，Ｘ１６５Ｈ，Ｘ１６５Ｋ，Ｘ１６５Ｌ，Ｘ１６５Ｍ，Ｘ１６５Ｎ，Ｘ１６５Ｐ，Ｘ１６５Ｑ，Ｘ１６５Ｒ，Ｘ１６５Ｓ，Ｘ１６５Ｔ，Ｘ１６５Ｖ，Ｘ１６５Ｗ，Ｘ１６５Ｙ，Ｘ１７３Ａ，Ｘ１７３Ｃ，Ｘ１７３Ｄ，Ｘ１７３Ｆ，Ｘ１７３Ｇ，Ｘ１７３Ｈ，Ｘ１７３Ｉ，Ｘ１７３Ｋ，Ｘ１７３Ｌ，Ｘ１７３Ｍ，Ｘ１７３Ｎ，Ｘ１７３Ｐ，Ｘ１７３Ｑ，Ｘ１７３Ｒ，Ｘ１７３Ｓ，Ｘ１７３Ｔ，Ｘ１７３Ｖ，Ｘ１７３Ｗ，Ｘ１７３Ｙ，Ｘ１７４Ａ，Ｘ１７４Ｃ，Ｘ１７４Ｄ，Ｘ１７４Ｆ，Ｘ１７４Ｇ，Ｘ１７４Ｈ，Ｘ１７４Ｉ，Ｘ１７４Ｋ，Ｘ１７４Ｌ，Ｘ１７４Ｍ，Ｘ１７４Ｎ，Ｘ１７４Ｐ，Ｘ１７４Ｑ，Ｘ１７４Ｒ，Ｘ１７４Ｓ，Ｘ１７４Ｔ，Ｘ１７４Ｖ，Ｘ１７４Ｗ，Ｘ１７４Ｙ，Ｘ１７７Ａ，Ｘ１７７Ｃ，Ｘ１７７Ｄ，Ｘ１７７Ｅ，Ｘ１７７Ｆ，Ｘ１７７Ｈ，Ｘ１７７Ｉ，Ｘ１７７Ｋ，Ｘ１７７Ｌ，Ｘ１７７Ｍ，Ｘ１７７Ｎ，Ｘ１７７Ｐ，Ｘ１７７Ｑ，Ｘ１７７Ｒ，Ｘ１７７Ｓ，Ｘ１７７Ｔ，Ｘ１７７Ｖ，Ｘ１７７Ｗ，Ｘ１７７Ｙ，Ｘ１７９Ａ，Ｘ１７９Ｃ，Ｘ１７９Ｄ，Ｘ１７９Ｆ，Ｘ１７９Ｇ，Ｘ１７９Ｈ，Ｘ１７９Ｉ，Ｘ１７９Ｋ，Ｘ１７９Ｌ，Ｘ１７９Ｍ，Ｘ１７９Ｎ，Ｘ１７９Ｐ，Ｘ１７９Ｑ，Ｘ１７９Ｒ，Ｘ１７９Ｓ，Ｘ１７９Ｔ，Ｘ１７９Ｖ，Ｘ１７９Ｗ，Ｘ１７９Ｙ，Ｘ１９４Ａ，Ｘ１９４Ｃ，Ｘ１９４Ｄ，Ｘ１９４Ｅ，Ｘ１９４Ｆ，Ｘ１９４Ｇ，Ｘ１９４Ｈ，Ｘ１９４Ｉ，Ｘ１９４Ｋ，Ｘ１９４Ｌ，Ｘ１９４Ｍ，Ｘ１９４Ｎ，Ｘ１９４Ｐ，Ｘ１９４Ｑ，Ｘ１９４Ｓ，Ｘ１９４Ｔ，Ｘ１９４Ｖ，Ｘ１９４Ｗ，Ｘ１９４Ｙ，Ｘ１９７Ａ，Ｘ１９７Ｃ，Ｘ１９７Ｄ，Ｘ１９７Ｅ，Ｘ１９７Ｆ，Ｘ１９７Ｇ，Ｘ１９７Ｈ，Ｘ１９７Ｉ，Ｘ１９７Ｋ，Ｘ１９７Ｌ，Ｘ１９７Ｍ，Ｘ１９７Ｎ，Ｘ１９７Ｐ，Ｘ１９７Ｒ，Ｘ１９７Ｓ，Ｘ１９７Ｔ，Ｘ１９７Ｖ，Ｘ１９７Ｗ，Ｘ１９７Ｙ，Ｘ２０２Ａ，Ｘ２０２Ｃ，Ｘ２０２Ｄ，Ｘ２０２Ｅ，Ｘ２０２Ｆ，Ｘ２０２Ｇ，Ｘ２０２Ｈ，Ｘ２０２Ｉ，Ｘ２０２Ｋ，Ｘ２０２Ｌ，Ｘ２０２Ｍ，Ｘ２０２Ｎ，Ｘ２０２Ｐ，Ｘ２０２Ｑ，Ｘ２０２Ｒ，Ｘ２０２Ｓ，Ｘ２０２Ｔ，Ｘ２０２Ｗ，Ｘ２０２Ｙ，Ｘ２１６Ａ，Ｘ２１６Ｃ，Ｘ２１６Ｄ，Ｘ２１６Ｅ，Ｘ２１６Ｆ，Ｘ２１６Ｇ，Ｘ２１６Ｈ，Ｘ２１６Ｉ，Ｘ２１６Ｋ，Ｘ２１６Ｌ，Ｘ２１６Ｍ，Ｘ２１６Ｎ，Ｘ２１６Ｐ，Ｘ２１６Ｒ，Ｘ２１６Ｓ，Ｘ２１６Ｔ，Ｘ２１６Ｖ，Ｘ２１６Ｗ，Ｘ２１６Ｙ，Ｘ２４０Ａ，Ｘ２４０Ｃ，Ｘ２４０Ｄ，Ｘ２４０Ｅ，Ｘ２４０Ｆ，Ｘ２４０Ｇ，Ｘ２４０Ｈ，Ｘ２４０Ｉ，Ｘ２４０Ｋ，Ｘ２４０Ｌ，Ｘ２４０Ｍ，Ｘ２４０Ｎ，Ｘ２４０Ｐ，Ｘ２４０Ｑ，Ｘ２４０Ｒ，Ｘ２４０Ｓ，Ｘ２４０Ｖ，Ｘ２４０Ｗ，Ｘ２４０Ｙ，Ｘ２４６Ａ，Ｘ２４６Ｃ，Ｘ２４６Ｄ，Ｘ２４６Ｅ，Ｘ２４６Ｆ，Ｘ２４６Ｇ，Ｘ２４６Ｈ，Ｘ２４６Ｉ，Ｘ２４６Ｋ，Ｘ２４６Ｌ，Ｘ２４６Ｍ，Ｘ２４６Ｎ，Ｘ２４６Ｐ，Ｘ２４６Ｑ，Ｘ２４６Ｓ，Ｘ２４６Ｔ，Ｘ２４６Ｖ，Ｘ２４６Ｗ，Ｘ２４６Ｙ，Ｘ２５１Ａ，Ｘ２５１Ｃ，Ｘ２５１Ｄ，Ｘ２５１Ｅ，Ｘ２５１Ｆ，Ｘ２５１Ｇ，Ｘ２５１Ｈ，Ｘ２５１Ｉ，Ｘ２５１Ｋ，Ｘ２５１Ｌ，Ｘ２５１Ｍ，Ｘ２５１Ｎ，Ｘ２５１Ｐ，Ｘ２５１Ｑ，Ｘ２５１Ｒ，Ｘ２５１Ｓ，Ｘ２５１Ｖ，Ｘ２５１Ｗ，Ｘ２５１Ｙ，Ｘ２５４Ａ，Ｘ２５４Ｃ，Ｘ２５４Ｄ，Ｘ２５４Ｅ，Ｘ２５４Ｆ，Ｘ２５４Ｇ，Ｘ２５４Ｉ，Ｘ２５４Ｋ，Ｘ２５４Ｌ，Ｘ２５４Ｍ，Ｘ２５４Ｎ，Ｘ２５４Ｐ，Ｘ２５４Ｑ，Ｘ２５４Ｒ，
Ｘ２５４Ｓ，Ｘ２５４Ｔ，Ｘ２５４Ｖ，Ｘ２５４Ｗ，Ｘ２５４Ｙ，Ｘ２８７Ａ，Ｘ２８７Ｃ，Ｘ２８７Ｄ，Ｘ２８７Ｅ，Ｘ２８７Ｇ，Ｘ２８７Ｈ，Ｘ２８７Ｉ，Ｘ２８７Ｋ，Ｘ２８７Ｌ，Ｘ２８７Ｍ，Ｘ２８７Ｎ，Ｘ２８７Ｐ，Ｘ２８７Ｑ，Ｘ２８７Ｒ，Ｘ２８７Ｓ，Ｘ２８７Ｔ，Ｘ２８７Ｖ，Ｘ２８７Ｗ，Ｘ２８７Ｙ，Ｘ２９０Ａ，Ｘ２９０Ｃ，Ｘ２９０Ｄ，Ｘ２９０Ｅ，Ｘ２９０Ｆ，Ｘ２９０Ｇ，Ｘ２９０Ｈ，Ｘ２９０Ｉ，Ｘ２９０Ｋ，Ｘ２９０Ｌ，Ｘ２９０Ｍ，Ｘ２９０Ｎ，Ｘ２９０Ｐ，Ｘ２９０Ｑ，Ｘ２９０Ｒ，Ｘ２９０Ｓ，Ｘ２９０Ｔ，Ｘ２９０Ｗ，Ｘ２９０Ｙ，Ｘ３０８Ａ，Ｘ３０８Ｃ，Ｘ３０８Ｄ，Ｘ３０８Ｅ，Ｘ３０８Ｆ，Ｘ３０８Ｇ，Ｘ３０８Ｈ，Ｘ３０８Ｉ，Ｘ３０８Ｋ，Ｘ３０８Ｍ，Ｘ３０８Ｎ，Ｘ３０８Ｐ，Ｘ３０８Ｑ，Ｘ３０８Ｒ，Ｘ３０８Ｓ，Ｘ３０８Ｔ，Ｘ３０８Ｖ，Ｘ３０８Ｗ，Ｘ３０８Ｙ，Ｘ３７６Ａ，Ｘ３７６Ｃ，Ｘ３７６Ｄ，Ｘ３７６Ｅ，Ｘ３７６Ｆ，Ｘ３７６Ｇ，Ｘ３７６Ｈ，Ｘ３７６Ｉ，Ｘ３７６Ｋ，Ｘ３７６Ｍ，Ｘ３７６Ｎ，Ｘ３７６Ｐ，Ｘ３７６Ｑ，Ｘ３７６Ｒ，Ｘ３７６Ｓ，Ｘ３７６Ｔ，Ｘ３７６Ｖ，Ｘ３７６Ｗ，Ｘ３７６Ｙ，Ｘ３７７Ａ，Ｘ３７７Ｃ，Ｘ３７７Ｄ，Ｘ３７７Ｅ，Ｘ３７７Ｆ，Ｘ３７７Ｇ，Ｘ３７７Ｈ，Ｘ３７７Ｉ，Ｘ３７７Ｋ，Ｘ３７７Ｌ，Ｘ３７７Ｍ，Ｘ３７７Ｎ，Ｘ３７７Ｐ，Ｘ３７７Ｑ，Ｘ３７７Ｒ，Ｘ３７７Ｓ，Ｘ３７７Ｔ，Ｘ３７７Ｖ，Ｘ３７７Ｗ，Ｘ３７９Ａ，Ｘ３７９Ｃ，Ｘ３７９Ｄ，Ｘ３７９Ｅ，Ｘ３７９Ｆ，Ｘ３７９Ｇ，Ｘ３７９Ｈ，Ｘ３７９Ｉ，Ｘ３７９Ｌ，Ｘ３７９Ｍ，Ｘ３７９Ｎ，Ｘ３７９Ｐ，Ｘ３７９Ｑ，Ｘ３７９Ｒ，Ｘ３７９Ｓ，Ｘ３７９Ｔ，Ｘ３７９Ｖ，Ｘ３７９Ｗ，Ｘ３７９Ｙ，Ｘ３８９Ａ，Ｘ３８９Ｃ，Ｘ３８９Ｄ，Ｘ３８９Ｅ，Ｘ３８９Ｆ，Ｘ３８９Ｈ，Ｘ３８９Ｉ，Ｘ３８９Ｋ，Ｘ３８９Ｌ，Ｘ３８９Ｍ，Ｘ３８９Ｎ，Ｘ３８９Ｐ，Ｘ３８９Ｑ，Ｘ３８９Ｒ，Ｘ３８９Ｓ，Ｘ３８９Ｔ，Ｘ３８９Ｖ，Ｘ３８９Ｗ，Ｘ３８９Ｙ，Ｘ３９７Ａ，Ｘ３９７Ｃ，Ｘ３９７Ｄ，Ｘ３９７Ｅ，Ｘ３９７Ｆ，Ｘ３９７Ｈ，Ｘ３９７Ｉ，Ｘ３９７Ｋ，Ｘ３９７Ｌ，Ｘ３９７Ｍ，Ｘ３９７Ｎ，Ｘ３９７Ｐ，Ｘ３９７Ｑ，Ｘ３９７Ｒ，Ｘ３９７Ｓ，Ｘ３９７Ｔ，Ｘ３９７Ｖ，Ｘ３９７Ｗ，Ｘ３９７Ｙ，Ｘ４００Ａ，Ｘ４００Ｃ，Ｘ４００Ｄ，Ｘ４００Ｅ，Ｘ４００Ｆ，Ｘ４００Ｇ，Ｘ４００Ｈ，Ｘ４００Ｉ，Ｘ４００Ｋ，Ｘ４００Ｌ，Ｘ４００Ｍ，Ｘ４００Ｎ，Ｘ４００Ｐ，Ｘ４００Ｒ，Ｘ４００Ｓ，Ｘ４００Ｔ，Ｘ４００Ｖ，Ｘ４００Ｗ，Ｘ４００Ｙ，Ｘ４０３Ａ，Ｘ４０３Ｃ，Ｘ４０３Ｄ，Ｘ４０３Ｅ，Ｘ４０３Ｇ，Ｘ４０３Ｈ，Ｘ４０３Ｉ，Ｘ４０３Ｋ，Ｘ４０３Ｌ，Ｘ４０３Ｍ，Ｘ４０３Ｎ，Ｘ４０３Ｐ，Ｘ４０３Ｑ，Ｘ４０３Ｒ，Ｘ４０３Ｓ，Ｘ４０３Ｔ，Ｘ４０３Ｖ，Ｘ４０３Ｗ，Ｘ４０３Ｙ，Ｘ４２１Ａ，Ｘ４２１Ｃ，Ｘ４２１Ｄ，Ｘ４２１Ｅ，Ｘ４２１Ｆ，Ｘ４２１Ｇ，Ｘ４２１Ｈ，Ｘ４２１Ｉ，Ｘ４２１Ｋ，Ｘ４２１Ｌ，Ｘ４２１Ｍ，Ｘ４２１Ｎ，Ｘ４２１Ｐ，Ｘ４２１Ｒ，Ｘ４２１Ｓ，Ｘ４２１Ｔ，Ｘ４２１Ｖ，Ｘ４２１Ｗ，Ｘ４２１Ｙ，Ｘ４２６Ａ，Ｘ４２６Ｃ，Ｘ４２６Ｄ，Ｘ４２６Ｅ，Ｘ４２６Ｆ，Ｘ４２６Ｇ，Ｘ４２６Ｈ，Ｘ４２６Ｉ，Ｘ４２６Ｋ，Ｘ４２６Ｌ，Ｘ４２６Ｍ，Ｘ４２６Ｎ，Ｘ４２６Ｐ，Ｘ４２６Ｑ，Ｘ４２６Ｒ，Ｘ４２６Ｓ，Ｘ４２６Ｖ，Ｘ４２６Ｗ，Ｘ４２６Ｙ，Ｘ４３０Ａ，Ｘ４３０Ｃ，Ｘ４３０Ｄ，Ｘ４３０Ｅ，Ｘ４３０Ｆ，Ｘ４３０Ｇ，Ｘ４３０Ｈ，Ｘ４３０Ｉ，Ｘ４３０Ｋ，Ｘ４３０Ｌ，Ｘ４３０Ｍ，Ｘ４３０Ｎ，Ｘ４３０Ｑ，Ｘ４３０Ｒ，Ｘ４３０Ｓ，Ｘ４３０Ｔ，Ｘ４３０Ｖ，Ｘ４３０Ｗ，Ｘ４３０Ｙ，Ｘ４３４Ａ，Ｘ４３４Ｃ，Ｘ４３４Ｄ，Ｘ４３４Ｅ，Ｘ４３４Ｇ，Ｘ４３４Ｈ，Ｘ４３４Ｉ，Ｘ４３４Ｋ，Ｘ４３４Ｌ，Ｘ４３４Ｍ，Ｘ４３４Ｎ，Ｘ４３４Ｐ，Ｘ４３４Ｑ，Ｘ４３４Ｒ，Ｘ４３４Ｓ，Ｘ４３４Ｔ，Ｘ４３４Ｖ，Ｘ４３４Ｗ，Ｘ４３４Ｙ，Ｘ４４５Ｃ，Ｘ４４５Ｄ，Ｘ４４５Ｅ，Ｘ４４５Ｆ，Ｘ４４５Ｇ，Ｘ４４５Ｈ，Ｘ４４５Ｉ，Ｘ４４５Ｋ，Ｘ４４５Ｌ，Ｘ４４５Ｍ，Ｘ４４５Ｎ，Ｘ４４５Ｐ，Ｘ４４５Ｑ，Ｘ４４５Ｒ，Ｘ４４５Ｓ，Ｘ４４５Ｔ，Ｘ４４５Ｖ，Ｘ４４５Ｗ，Ｘ４４５Ｙ，Ｘ４４８Ｃ，Ｘ４４８Ｄ，Ｘ４４８Ｅ，Ｘ４４８Ｆ，Ｘ４４８Ｇ，Ｘ４４８Ｈ，Ｘ４４８Ｉ，Ｘ４４８Ｋ，Ｘ４４８Ｌ，Ｘ４４８Ｍ，Ｘ４４８Ｎ，Ｘ４４８Ｐ，Ｘ４４８Ｑ，Ｘ４４８Ｒ，Ｘ４４８Ｓ，Ｘ４４８Ｔ，Ｘ４４８Ｖ，Ｘ４４８Ｗ，Ｘ４４８Ｙ，Ｘ４５７Ａ，Ｘ４５７Ｃ，Ｘ４５７Ｄ，Ｘ４５７Ｅ，Ｘ４５７Ｆ，Ｘ４５７Ｇ，Ｘ４５７Ｈ，Ｘ４５７Ｉ，Ｘ４５７Ｋ，Ｘ４５７Ｌ，Ｘ４５７Ｍ，Ｘ４５７Ｎ，Ｘ４５７Ｐ，Ｘ４５７Ｑ，Ｘ４５７Ｒ，Ｘ４５７Ｔ，Ｘ４５７Ｖ，Ｘ４５７Ｗ，Ｘ４５７Ｙ，Ｘ４６２Ａ，Ｘ４６２Ｃ，Ｘ４６２Ｄ，Ｘ４６２Ｅ，Ｘ４６２Ｆ，Ｘ４６２Ｇ，Ｘ４６２Ｈ，Ｘ４６２Ｉ，Ｘ４６２Ｋ，Ｘ４６２Ｌ，Ｘ４６２Ｍ，Ｘ４６２Ｎ，Ｘ４６２Ｐ，Ｘ４６２Ｑ，Ｘ４６２Ｒ，Ｘ４６２Ｓ，Ｘ４６２Ｖ，Ｘ４６２Ｗ，Ｘ４６２Ｙ，Ｘ４７６Ａ，Ｘ４７６Ｃ，Ｘ４７６Ｄ，Ｘ４７６Ｅ，Ｘ４７６Ｆ，Ｘ４７６Ｇ，Ｘ４７６Ｈ，Ｘ４７６Ｉ，Ｘ４７６Ｋ，Ｘ４７６Ｌ，Ｘ４７６Ｍ，Ｘ４７６Ｐ，Ｘ４７６Ｑ，Ｘ４７６Ｒ，Ｘ４７６Ｓ，Ｘ４７６Ｔ，Ｘ４７６Ｖ，Ｘ４７６Ｗ，Ｘ４７６Ｙ，Ｘ４８７Ａ，Ｘ４８７Ｃ，Ｘ４８７Ｄ，Ｘ４８７Ｅ，Ｘ４８７Ｆ，Ｘ４８７Ｇ，Ｘ４８７Ｈ，Ｘ４８７Ｉ，Ｘ４８７Ｌ，Ｘ４８７Ｍ，Ｘ４８７Ｎ，Ｘ４８７Ｐ，Ｘ４８７Ｑ，Ｘ４８７Ｒ，Ｘ４８７Ｓ，Ｘ４８７Ｔ，Ｘ４８７Ｖ，Ｘ４８７Ｗ，Ｘ４８７Ｙ，Ｘ４８８Ａ，Ｘ４８８Ｃ，Ｘ４８８Ｄ，Ｘ４８８Ｆ，Ｘ４８８Ｇ，Ｘ４８８Ｈ，Ｘ４８８Ｉ，Ｘ４８８Ｋ，Ｘ４８８Ｌ，Ｘ４８８Ｍ，Ｘ４８８Ｎ，Ｘ４８８Ｐ，Ｘ４８８Ｑ，Ｘ４８８Ｒ，Ｘ４８８Ｓ，Ｘ４８８Ｔ，Ｘ４８８Ｖ，Ｘ４８８Ｗ，Ｘ４８８Ｙ，Ｘ４８９Ａ，Ｘ４８９Ｃ，Ｘ４８９Ｄ，Ｘ４８９Ｅ，Ｘ４８９Ｆ，Ｘ４８９Ｇ，Ｘ４８９Ｈ，Ｘ４８９Ｉ，Ｘ４８９Ｌ，Ｘ４８９Ｍ，Ｘ４８９Ｎ，Ｘ４８９Ｐ，Ｘ４８９Ｑ，Ｘ４８９Ｒ，Ｘ４８９Ｓ，Ｘ４８９Ｔ，Ｘ４８９Ｖ，Ｘ４８９Ｗ，Ｘ４８９Ｙ，Ｘ４９０Ａ，Ｘ４９０Ｃ，Ｘ４９０Ｄ，Ｘ４９０Ｅ，Ｘ４９０Ｆ，Ｘ４９０Ｇ，Ｘ４９０Ｈ，Ｘ４９０Ｉ，Ｘ４９０Ｋ，Ｘ４９０Ｍ，Ｘ４９０Ｎ，Ｘ４９０Ｐ，Ｘ４９０Ｑ，Ｘ４９０Ｒ，Ｘ４９０Ｓ，Ｘ４９０Ｔ，Ｘ４９０Ｖ，Ｘ４９０Ｗ，Ｘ４９０Ｙ，Ｘ４９１Ａ，Ｘ４９１Ｃ，Ｘ４９１Ｄ，Ｘ４９１Ｅ，Ｘ４９１Ｆ，Ｘ４９１Ｈ，Ｘ４９１Ｉ，Ｘ４９１Ｋ，Ｘ４９１Ｌ，Ｘ４９１Ｍ，Ｘ４９１Ｎ，Ｘ４９１Ｐ，Ｘ４９１Ｑ，Ｘ４９１Ｒ，Ｘ４９１Ｓ，Ｘ４９１Ｔ，Ｘ４９１Ｖ，Ｘ４９１Ｗ，Ｘ４９１Ｙ，Ｘ４９２Ａ，Ｘ４９２Ｃ，Ｘ４９２Ｄ，Ｘ４９２Ｅ，Ｘ４９２Ｆ，Ｘ４９２Ｈ，Ｘ４９２Ｉ，Ｘ４９２Ｋ，Ｘ４９２Ｌ，Ｘ４９２Ｍ，Ｘ４９２Ｎ，Ｘ４９２Ｐ，Ｘ４９２Ｑ，Ｘ４９２Ｒ，Ｘ４９２Ｓ，Ｘ４９２Ｔ，Ｘ４９２Ｖ，Ｘ４９２Ｗ，Ｘ４９２Ｙ，Ｘ４９３Ａ，Ｘ４９３Ｃ，Ｘ４９３Ｄ，Ｘ４９３Ｅ，Ｘ４９３Ｆ，Ｘ４９３Ｇ，Ｘ４９３Ｈ，Ｘ４９３Ｉ，Ｘ４９３Ｋ，Ｘ４９３Ｌ，Ｘ４９３Ｍ，Ｘ４９３Ｎ，Ｘ４９３Ｐ，Ｘ４９３Ｑ，Ｘ４９３Ｒ，Ｘ４９３Ｔ，Ｘ４９３Ｖ，Ｘ４９３Ｗ，Ｘ４９３Ｙ，Ｘ４９５Ａ，Ｘ４９５Ｃ，Ｘ４９５Ｄ，Ｘ４９５Ｅ，Ｘ４９５Ｇ，Ｘ４９５Ｈ，Ｘ４９５Ｉ，Ｘ４９５Ｋ，Ｘ４９５Ｌ，Ｘ４９５Ｍ，Ｘ４９５Ｎ，Ｘ４９５Ｐ，Ｘ４９５Ｑ，Ｘ４９５Ｒ，Ｘ４９５Ｓ，Ｘ４９５Ｔ，Ｘ４９５Ｖ，Ｘ４９５Ｗ，Ｘ４９５Ｙ，Ｘ４９６Ｃ，Ｘ４９６Ｄ，Ｘ４９６Ｅ，Ｘ４９６Ｆ，Ｘ４９６Ｇ，Ｘ４９６Ｈ，Ｘ４９６Ｉ，Ｘ４９６Ｋ，Ｘ４９６Ｌ，Ｘ４９６Ｍ，Ｘ４９６Ｎ，Ｘ４９６Ｐ，Ｘ４９６Ｑ，Ｘ４９６Ｒ，Ｘ４９６Ｓ，Ｘ４９６Ｔ，Ｘ４９６Ｖ，Ｘ４９６Ｗ，Ｘ４９６Ｙ，Ｘ４９７Ａ，Ｘ４９７Ｃ，Ｘ４９７Ｄ，Ｘ４９７Ｅ，Ｘ４９７Ｆ，Ｘ４９７Ｇ，Ｘ４９７Ｈ，Ｘ４９７Ｉ，Ｘ４９７Ｌ，Ｘ４９７Ｍ，Ｘ４９７Ｎ，Ｘ４９７Ｐ，Ｘ４９７Ｑ，Ｘ４９７Ｒ，Ｘ４９７Ｓ，Ｘ４９７Ｔ，Ｘ４９７Ｖ，Ｘ４９７Ｗ，Ｘ４９７Ｙ，Ｘ４９８Ａ，Ｘ４９８Ｃ，Ｘ４９８Ｄ，Ｘ４９８Ｅ，Ｘ４９８Ｆ，Ｘ４９８Ｇ，Ｘ４９８Ｈ，Ｘ４９８Ｉ，Ｘ４９８Ｋ，Ｘ４９８Ｌ，Ｘ４９８Ｍ，Ｘ４９８Ｎ，Ｘ４９８Ｑ，Ｘ４９８Ｒ，Ｘ４９８Ｓ，Ｘ４９８Ｔ，Ｘ４９８Ｖ，Ｘ４９８Ｗ，Ｘ４９８Ｙ，Ｘ５０９Ａ，Ｘ５０９Ｃ，Ｘ５０９Ｄ，Ｘ５０９Ｅ，Ｘ５０９Ｆ，Ｘ５０９Ｇ，Ｘ５０９Ｈ，Ｘ５０９Ｉ，Ｘ５０９Ｋ，Ｘ５０９Ｌ，Ｘ５０９Ｍ，Ｘ５０９Ｎ，Ｘ５０９Ｐ，Ｘ５０９Ｒ，Ｘ５０９Ｓ，Ｘ５０９Ｔ，Ｘ５０９Ｖ，Ｘ５０９Ｗ，Ｘ５０９Ｙ，Ｘ５１４Ａ，Ｘ５１４Ｃ，Ｘ５１４Ｄ，Ｘ５１４Ｅ，Ｘ５１４Ｆ，Ｘ５１４Ｇ，Ｘ５１４Ｈ，Ｘ５１４Ｉ，Ｘ５１４Ｋ，Ｘ５１４Ｌ，Ｘ５１４Ｍ，Ｘ５１４Ｎ，Ｘ５１４Ｐ，Ｘ５１４Ｑ，Ｘ５１４Ｒ，Ｘ５１４Ｓ，Ｘ５１４Ｔ，Ｘ５１４Ｖ，Ｘ５１４Ｗ，Ｘ５２１Ａ，Ｘ５２１Ｃ，Ｘ５２１Ｄ，Ｘ５２１Ｅ，Ｘ５２１Ｆ，Ｘ５２１Ｇ，Ｘ５２１Ｈ，Ｘ５２１Ｉ，Ｘ５２１Ｋ，Ｘ５２１Ｌ，Ｘ５２１Ｍ，Ｘ５２１Ｎ，Ｘ５２１Ｐ，Ｘ５２１Ｑ，Ｘ５２１Ｒ，Ｘ５２１Ｓ，Ｘ５２１Ｖ，Ｘ５２１Ｗ，Ｘ５２１Ｙ，Ｘ５３９Ａ，Ｘ５３９Ｃ，Ｘ５３９Ｄ，Ｘ５３９Ｅ，Ｘ５３９Ｆ，Ｘ５３９Ｇ，Ｘ５３９Ｈ，Ｘ５３９Ｋ，Ｘ５３９Ｌ，Ｘ５３９Ｍ，Ｘ５３９Ｎ，Ｘ５３９Ｐ，Ｘ５３９Ｑ，Ｘ５３９Ｒ，Ｘ５３９Ｓ，Ｘ５３９Ｔ，Ｘ５３９Ｖ，Ｘ５３９Ｗ，Ｘ５３９Ｙ，Ｘ５４０Ａ，Ｘ５４０Ｃ，Ｘ５４０Ｄ，Ｘ５４０Ｅ，Ｘ５４０Ｆ，Ｘ５４０Ｇ，Ｘ５４０Ｈ，Ｘ５４０Ｉ，Ｘ５４０Ｋ，Ｘ５４０Ｍ，Ｘ５４０Ｎ，Ｘ５４０Ｐ，Ｘ５４０Ｑ，Ｘ５４０Ｒ，Ｘ５４０Ｓ，Ｘ５４０Ｔ，Ｘ５４０Ｖ，Ｘ５４０Ｗ，Ｘ５４０Ｙ，Ｘ５４４Ａ，Ｘ５４４Ｃ，Ｘ５４４Ｄ，Ｘ５４４Ｅ，Ｘ５４４Ｆ，Ｘ５４４Ｇ，Ｘ５４４Ｈ，Ｘ５４４Ｉ，Ｘ５４４Ｋ，Ｘ５４４Ｌ，Ｘ５４４Ｍ，Ｘ５４４Ｎ，Ｘ５４４Ｐ，Ｘ５４４Ｑ，Ｘ５４４Ｓ，Ｘ５４４Ｔ，Ｘ５４４Ｖ，Ｘ５４４Ｗ，及びＸ５４４Ｙからなる群から選択される置換を含み、ここで、Ｘは任意のアミン酸を意味し、各アミノ酸残基の位置は、図２０に示す通りのウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素配列中のアミノ酸残基の位置と対応させて付番される。
一部の実施形態では、イソプレン合成酵素変異体の配列は、野生型イソプレン合成酵素の配列とは異なる。一部の実施形態では、イソプレン合成酵素変異体の配列は、ＰＣＴ出願／米国特許出願公開第２００９／０４１５８１号（国際公開第２００９／１３２２２０号）又はＰＣＴ出願／米国特許出願公開第２０１０／０３２１３４号（国際公開第２０１０／１２４１４６号）に記載の配列とは異なる。
一部の実施形態では、イソプレン合成酵素変異体は、ＰＣＴ出願／米国特許出願公開第２００９／０４１５８１号（国際公開第２００９／１３２２２０号）に開示のアミノ酸残基置換を含まない。
一部の実施形態では、イソプレン合成酵素変異体は、表Ｄに示すアミノ酸残基置換を含まない。
Figure 2014502148
Figure 2014502148

Figure 2014502148

一部の実施形態では、イソプレン合成酵素変異体は、表Ｅに記載の配列を含まない。一部の実施形態では、表Ｅ及びＦに記載の配列は、これらの表に記載のものから選択される置換を１つ以上有し得る。
Figure 2014502148
Figure 2014502148

Figure 2014502148
一部の実施形態では、イソプレン合成酵素変異体は、表Ｆに記載の配列を含まない。
Figure 2014502148
Figure 2014502148

表４〜６に記載の配列及び置換に関する残基付番は、ＰＣＴ出願／米国特許出願公開第２００９／０４１５８１号（国際公開第２００９／１３２２２０号）又はＰＣＴ出願／米国特許出願公開第２０１０／０３２１３４号（国際公開第２０１０／１２４１４６号）に定義の通りのものである。当業者は、表４〜６に記載の残基をＭＥＡウラジロハコヤナギなどの参照配列（図２０）（配列番号１）と対応させる方法を決定することができる。
Ｎ端末トランケーション
一部の実施形態では、変異体は、Ｎ端末領域の１つ以上のアミノ酸残基のトランケーションを含むＮ端末領域のトランケーションを含む。例えば、実施例１０を参照されたい。Ｎ端末トランケーションの例は、ＰＣＴ出願／米国特許出願公開第２００９／０４１５８１号（国際公開第２００９／１３２２２０号）に記載されている。一部の実施形態では、Ｎ端末トランケーションを含むイソプレン合成酵素変異体は、完全長のイソプレン合成酵素と比較して比活性が増加している。例えば、Ｎ端末トランケーションの例としては、ウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素の：ＭＥＡ変異体、ＭＳＶ変異体、ＭＶＳ変異体、ＭＴＥ変異体、ＭＮＶ変異体、ＴＲＣ（−３）変異体、ＴＲＣ（−４）変異体、ＴＲＣ（−５）変異体、ＴＲＣ（−６）変異体及びＴＲＣ（−７）変異体；アメリカヤマナラシイソプレン合成酵素：ＭＥＴ変異体；及びＰ．トリコカルパイソプレン合成酵素の、Ｎ端末でトランケートされた残基と対応する残基が挙げられる。ＭＥＴ変異体の配列は、ＰＣＴ出願／米国特許出願公開第２００９／０４１５８１号（国際公開第２００９／１３２２２０号）に記載される。一部の実施形態では、変異体においてトランケーションの生じた残基は、ウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素ＭＥＡ変異体においてトランケーションの生じた残基と一致する（図２１Ａ〜２１Ｂを参照されたい）。
イソプレン合成酵素変異体の特性
一部の実施形態では、変異体は、参照配列と比べ少なくとも一つの特性が改良されている。一部の実施形態では、参照配列は親配列である。一部の実施形態では、参照配列は野生型イソプレン合成酵素である。一部の実施形態では、参照配列はＭＥＡウラジロハコヤナギ（配列番号１）のものであり、図２０にも示す、
対象とする特性としては、限定するものではないが、細胞内活性の増加、比生産性の増加、収率の増加、及び細胞性能指数の増加が挙げられる。一部の実施形態では、比生産性は、少なくとも約２、３、４、５、６ ７、８、９、１０倍以上に増加する。一実施形態では、比生産性は約２０ｍｇ／Ｌ／ＯＤ／ｈｒである。他の実施形態では、収率は、少なくとも約２、３、４、５倍以上に増加する。他の実施形態では、細胞性能指数は、少なくとも約２、３、４、５倍以上に増加する。他の実施形態では、細胞内活性は少なくとも約２、３、４、５、６、７、８、９、１０倍以上に増加する。
理論に束縛されるものではないが、これらの特性は、ＩｓｐＳに関係する次の特性：細胞生存能の増加、ｋｃａｔの増加、Ｋｍの減少、比活性の増加、溶解度の増加、不溶性の低下、リボソーム結合性の増加、翻訳開始速度の増加、翻訳伸長速度の増加、転写開始速度の増加、転写伸長速度の増加、ＤＮＡの２次構造の減少、ＲＮＡの２次構造の減少、ＤＮＡの２次構造の増加、ＲＮＡの２次構造の増加、折りたたみ速度の増加、細胞内のシャペロンに対する親和性の増加、安定性の増加、タンパク質の代謝回転の減少、細胞内プロテアーゼに対する暴露の減少、細胞内プロテアーゼに対する親和性の減少、周辺質への局在性の減少、細胞質への局在性の増加、封入体形成の減少、膜局在の減少、より望ましいコドンによる発現増加、ＤＮＡ安定性の増加、ＲＮＡ安定性の増加並びにＲＮＡ分解の減少、のいずれかにより、あるいはこれらを組み合わせることにより得ることができる。簡潔には、ＩｓｐＳ変異体をコードしている、又はこの変異体を発現している核酸配列（ＤＮＡ及びＲＮＡ）の特性に、あるいはＩｓｐＳ酵素自体のもつ生化学的特性に好ましく作用する任意の変異により、細胞内部の活性をより向上させることができる。対象とするその他の特性としては、至適ｐＨ、温度安定性（例えば、Ｔｍ値）、並びに基質阻害又は生成物阻害を含む存在し得るインヒビターに対する感受性が挙げられる。酸化安定性及びタンパク質分解安定性も対象とする。更に、金属イオンの作用及び金属イオンのイオン強度による活性化又は阻害も対象とする。
一実施形態では、比活性の値は、所定の時間で製造されたイソプレンモル量を、各試料に含まれるタンパク質の具体的な量で除算することにより、ＳＥＬのすべての組み合わせに含まれる各変異体毎に算出することができる。性能指数（ＰＩ）は、任意の所定の変異体の比活性を、同一のマイクロタイタープレートで得られたいくつかの野生型の比活性測定値の平均により除算することにより算出することができる。例えば、比活性のＰＩ値が１．５である変異体は、野生型と比べ、性能が５０％向上されている。タンパク質濃度に関するＰＩ及び生産されるイソプレンに関するＰＩも、同様の方法で算出することができる。これらの測定値を用い、実施例に示す通りの詳細なデータ解析を行った。
イソプレン合成酵素変異体をコードしている核酸を含む宿主細胞の増殖指数又は性能指数を使用して、個々の変異体が対象とする特性を有するか否かを示すこともできる。増殖指数及び性能指数は、当業者に既知の手法、及び／又は本開示に教示される通りの手法に従い測定することもできる。増殖及び性能指数は、参照配列と比較することにより、個々の変異体に関し測定できる。一部の実施形態では、参照配列は、変異体の親配列である。一部の実施形態では、参照配列は野生型配列である。一部の実施形態では、参照配列は、ＭＥＡウラジロハコヤナギである。一部の実施形態では、増殖指数は、実施例２に記載の方法に従って測定する。一部の実施形態では、増殖指数は、実施例４に記載の方法に従って測定する。各種実施形態では、変異体の増殖指数は、参照配列と比較した場合に、少なくとも約０．８、少なくとも約０．９、少なくとも約１．０、少なくとも約１．１、少なくとも約１．２、少なくとも約１．３である。各種実施形態では、変異体の性能指数は、参照配列と比較した場合に、少なくとも約０．７、少なくとも約０．８、少なくとも約０．９、少なくとも約１．０、少なくとも約１．１、少なくとも約１．２である。
対象とする特性を測定する手法は当業者に既知である。いくつかの手法を実施例において更に記載する。改良する所望の結果又は特性に基づき変異体を評価することができる。例えば、比活性が増大するよう設計したイソプレン合成酵素変異体は、精製又は一部精製したイソプレン合成酵素変異体を用いｉｎ ｖｉｔｒｏで、又は大腸菌などの宿主生物に関する文脈においてｉｎ ｖｉｖｏで、ＤＭＡＰＰのイソプレンへの変換について試験することができる。場合により、大腸菌は、ＤＸＰ経路、ＭＶＡ経路、又はこれらの両方を発現し得る。改良した活性は、他のイソプレン合成酵素、例えば、野生型イソプレン合成酵素、親イソプレン合成酵素、又は他の参照ポリペプチドと比較して評価する。多様な宿主においてイソプレンを生産させることを目的とした本発明において、１種以上の試験条件下で、例えば、様々な程度の安定性、溶解度、活性、及び／又は発現レベルを示す酵素を使用することが見出されるものと企図される。ハイスループットな手法を用いると、効率的な方法でこれらの特性を評価することができる。
細胞内ＤＭＡＰＰ濃度の増加と、ウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素（ＩｓｐＳ）を発現させることで軽減され得る大腸菌の増殖阻害との間には、強い相関がある。理論に束縛されるものではないが、ＩｓｐＳ活性が増強されると、ＤＭＡＰＰは、より迅速にイソプレンへと変換されるようになり、その結果増殖性が更に良好になるはずである。これらの条件下でＩｓｐＳ変異体を発現する大腸菌の増殖速度をモニターすることで、本発明者らは、細胞内でＤＭＡＰＰをイソプレンへと変換する能力が増強されている、ＩｓｐＳ酵素変異体を同定した。
本発明は、また、イソプレン合成酵素変異体をスクリーニングする方法を企図し、方法は、（ａ）宿主細胞を、約１０μＭ〜約７０μＭのＩＰＴＧと、約５ｍＭ〜約２０ｍＭのメバロン酸（ＭＶＡ）と、を含む培地と接触させる工程であって、ここで宿主細胞は、イソプレン合成酵素変異体を操作可能にプロモーターと組み合わせてコードしている核酸を含む、工程、並びに（ｂ）宿主細胞の増殖速度を測定する工程を含む。変異体の増殖速度は、参照イソプレン合成酵素（例えば、親イソプレン合成酵素、野生型イソプレン合成酵素、又はＭＥＡウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素）の増殖速度と比較することができる。この手法を、対象とする特定の性質をもつ変異体、例えば、本開示に記載の１つ以上の性質をもつ変異体の、スクリーニングに使用することができる。一部の実施形態では、増殖速度の増加は、宿主細胞の合成酵素のもつ、ＭＡＰＰをイソプレンに変換する能力が、イソプレン合成酵素変異体では増強されていることを意味する。例えば、増殖速度は、当該技術分野で既知の手法により、あるいは以降の実施例において例示される通りに解析することができる。一部の実施形態では、手法は、変異体の増殖指数を測定する工程を更に含む。一部の実施形態では、手法は、変異体の性能指数を測定する工程を更に含む。変異体を選別する際、対数増殖期での及び／又は最終的な細胞密度での、細胞の増殖速度を、要素として考慮にいれることもできる。以降、実施例において示す変異体に関し例示する通り、対数増殖期の細胞増殖速度を考慮に入れた。更に、本開示に記載の変異体を選別する際、増殖速度及び最終密度も考慮に入れた。
一部の実施形態では、ＩＰＴＧは、約１０μＭ〜約６０μＭの濃度で培地中に存在する。一部の実施形態では、ＩＰＴＧは、約１０μＭ〜約２００μＭの濃度で培地中に存在する。一部の実施形態では、ＩＰＴＧは、約２０μＭ〜約６０μＭの濃度で培地中に存在する。一部の実施形態では、ＩＰＴＧは、約２０μＭ〜約１２０μＭの濃度で培地中に存在する。一部の実施形態では、ＩＰＴＧは、約４０μＭ〜約６０μＭの濃度で培地中に存在する。一部の実施形態では、ＩＰＴＧは、約４０μＭ〜約１００μＭの濃度で培地中に存在する。一部の実施形態では、ＩＰＴＧは、約４０μＭの濃度で培地中に存在する。一部の実施形態では、ＩＰＴＧは、約５０μＭ、６０μＭ、７０μＭ、８０μＭ、９０μＭ、１００μＭ、１１０μＭ、１２０μＭ、１３０μＭ、１４０μＭ、１５０μＭ、１６０μＭ、１７０μＭ、１８０μＭ、１９０μＭ、又は２００μＭの濃度で培地中に存在する。
一部の実施形態では、ＭＶＡは、約５ｍＭ〜約２０ｍＭの濃度で培地中に存在する。一部の実施形態では、ＭＶＡは、約７ｍＭ〜約１５ｍＭの濃度で培地中に存在する。一部の実施形態では、ＭＶＡは、約８ｍＭ〜約１２ｍＭの濃度で培地中に存在する。一部の実施形態では、ＭＶＡは、約１０ｍＭの濃度で培地中に存在する。一部の実施形態では、宿主細胞はＭＤ０９−１７０である。
他の態様では、１つ以上の改良した特性は、以降の実施例において、更に記載され、例示される通りに、生産性に関係する位置を解析することで観察され得る。生産性に関係する位置は、特性の改良されたコンビナトリアルな変異体を製造するのに最も有用な、これらの分子（例えば、イソプレン合成酵素などの酵素）内位置として記載することができ、この位置により、少なくとも１つの変異を組み合わせることができる。組み合わせることのできる変異は、コンビナトリアルな変異体を選別するのに使用することのできる、これらの分子内の置換として記載され得る。組み合わせることのできる変異は、発現、比活性又は増殖性を著しく低下させることなく、なおかつ、増殖性又は比活性などといった、分子に関する少なくとも１つの所望の特性を改良するものである。ＩｓｐＳ内の、組み合わせることのできる変異の存在しているすべての位置を、実施例１及び実施例２に例示される通りの、比活性に関するＤＭＡＰＰ解析、記載のＩｓｐＳ変異体を発現しているＭＥＡウラジロハコヤナギの増殖曲線、並びにタンパク質の定量から得られる、性能指数（ＰＩ）値を用い、決定することができる。生産性に関係する位置は、複数の置換にある程度耐性を示し、なおかつ以降に示す通りのコンビナトリアルさに関する一群の基準を満たす位置であってよい。
データ群を評価する際、生産性に関係するほとんどの位置を以降の基準に当てはめて評価した。野生型ＩｓｐＳと比較した場合に、比活性及び発現についての性能指数（ＰＩ）が最小になるような位置に置換のなされた場合に、ＰＩが０．９以上であり、かつ野生型ＩｓｐＳと比較した場合に比活性又は増殖性についての少なくとも１つのＰＩが１．０以上である場合、これらの位置は第Ａ群として分類する。野生型ＩｓｐＳと比較した場合に、比活性及び発現についての性能指数（ＰＩ）が最小になるような位置に置換のなされた場合に、ＰＩが０．８以上であり、かつ野生型ＩｓｐＳと比較した場合に比活性又は増殖性についての少なくとも１つのＰＩが１．２以上である場合、これらの位置は第Ｂ群として分類する。野生型ＩｓｐＳと比較した場合に、比活性及び発現についての性能指数（ＰＩ）が最小になるような位置に置換のなされた場合に、ＰＩが０．５以上であり、かつ野生型ＩｓｐＳと比較した場合に比活性又は増殖性についての少なくとも１つのＰＩが１．５以上である場合、これらの位置は第Ｃ群として分類する。
第Ａ、Ｂ、及びＣ群は、複数置換に対する許容度の異なる位置を更に含有し得る。この置換許容度を測定するために、各位置に等級を割り当てることができる。この等級は、第Ａ、Ｂ、又はＣ群に当てはまる各位置の置換率に従って割り当てることができる。組み合わせ可能な代表的な位置及び置換を表３１に示す。
増殖性に関与する位置の等級を決定するための基準は次の通りのものである：所定の位置での置換の０％超１５％未満が第Ａ、Ｂ、又はＣ群にあてはまる場合、等級は「１」に割り当てられる。所定の位置での置換の１５％以上３０％未満が第Ａ、Ｂ、又はＣ群に当てはまる場合、等級は「２」に割り当てられる。所定の位置での置換の３０％以上５０％未満が第Ａ、Ｂ、又はＣ群に当てはまる場合、等級は「３」に割り当てられる。所定の位置での置換の５０％以上が第Ａ、Ｂ、又はＣ群に当てはまる場合、等級は「４」に割り当てられる。
基質には、置換が属する群をもとに、更に好適なスコアを割り当てることができる。スコアが高くなるほど、その置換が、コンビナトリアルな変異体を製造する際に使用するのにより好適なものであることを意味する。代表的な安定性スコア（適性スコア）を表３０に示し、記載する。上記基準に当てはまるＩｓｐＳのそれぞれの置換に関する安定性スコア及び等級を表３１に記載する。
表３０．既定された群の適性スコア
Figure 2014502148
したがって、本発明の一態様では、イソプレン合成酵素変異体は、実施例に例示する通りに＋＋＋＋＋と評価される改良されたイソプレン合成酵素特性を有するポリペプチド（例えば、単離ポリペプチド）であり得る。実施例に例示する通りに＋＋＋＋＋とカラムに表記されたこれらのポリペプチドは、配列番号１（ＭＥＡウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素）と対応させて付番した残基位置に１つ以上の置換を有し得る。一部の非限定例では、改良されたイソプレン合成酵素特性を有する単離ポリペプチドは、配列番号１に対応する：Ｘ２，Ｘ１８，Ｘ１９，Ｘ２１，Ｘ２４，Ｘ２６，Ｘ２７，Ｘ２９，Ｘ３７，Ｘ４２，Ｘ４７，Ｘ４８，Ｘ４９，Ｘ５６，Ｘ８１，Ｘ８２，Ｘ８４，Ｘ９３，Ｘ９４，Ｘ９５，Ｘ１２０，Ｘ１２３，Ｘ１２６，Ｘ１３１，Ｘ１３２，Ｘ１３４，Ｘ１３７，Ｘ１３９，Ｘ１４３，Ｘ１５１，Ｘ１５５，Ｘ１６６，Ｘ１６７，Ｘ１６９，Ｘ１７０，Ｘ１７１，Ｘ１７５，Ｘ１７９，Ｘ１８０，Ｘ１９７，Ｘ２２９，Ｘ２３１，Ｘ２４０，Ｘ２４２，Ｘ２４５，Ｘ２４６，Ｘ２４７，Ｘ２５１，Ｘ２７１，Ｘ２８２，Ｘ３０６，Ｘ３１７，Ｘ３１９，Ｘ３６９，Ｘ３７１，Ｘ３７６，Ｘ３７９，Ｘ３８０，Ｘ３８９，Ｘ３９２，Ｘ３９３，Ｘ４０８，Ｘ４０９，Ｘ４２１，Ｘ４２２，Ｘ４２３，Ｘ４２９，Ｘ４３７，Ｘ４４３，Ｘ４４４，Ｘ４４７，Ｘ４５５，Ｘ４５８，Ｘ４６１，Ｘ４６４，Ｘ４６６，Ｘ４７０，Ｘ４７３，Ｘ５００，Ｘ５０２，Ｘ５０６，Ｘ５１３，Ｘ５２５，及びＸ５３１からなる群から選択される残基のうちの１つ以上が置換されている。一部の実施形態では、これらの置換は、Ｅ２，Ｙ１８，Ｌ１９，Ｓ２１，Ｔ２４，Ｅ２６，Ｓ２７，Ｅ２９，Ｋ３７，Ｖ４２，Ｎ４７，Ｎ４８，Ｅ４９，Ｌ５６，Ｄ８１，Ｒ８２，Ｖ８４，Ｔ９３，Ｋ９４，Ｔ９５，Ｓ１２０，Ｋ１２３，Ｎ１２６，Ｅ１３１，Ｎ１３２，Ｋ１３４，Ｉ１３７，Ａ１３９，Ｌ１４３，Ｌ１５１，Ｎ１５５，Ｓ１６６，Ｈ１６７，Ｋ１６９，Ｅ１７０，Ｌ１７１，Ｋ１７５，Ｅ１７９，Ｌ１８０，Ｑ１９７，Ｉ２２９，Ｓ２３１，Ｔ２４０，Ｒ２４２，Ｒ２４５，Ｒ２４６，Ｖ２４７，Ｔ２５１，Ａ２７１，Ｓ２８２，Ｌ３０６，Ｄ３１７，Ｎ３１９，Ｆ３６９，Ｑ３７１，Ｌ３７６，Ｋ３７９，Ｓ３８０，Ｇ３８９，Ｗ３９２，Ｋ３９３，Ｖ４０８，Ｖ４０９，Ｑ４２１，Ｋ４２２，Ｙ４２３，Ｒ４２９，Ｃ４３７，Ａ４４３，Ｓ４４４，Ｉ４４７，Ｓ４５５，Ｃ４５８，Ｒ４６１，Ｇ４６４，Ｓ４６６，Ａ４７０，Ｓ４７３，Ｖ５００，Ｔ５０２，Ｌ５０６，Ｔ５１３，Ｅ５２５，及びＶ５３１からなる群から選択される残基に生じ得る。一部の実施形態では、置換は、Ｅ２Ａ又はＫ又はＰ、Ｙ１８Ｄ又はＥ又はＫ又はＳ、Ｌ１９Ｙ、Ｓ２１Ｗ、Ｔ２４Ｌ又はＶ、Ｅ２６Ｃ、Ｓ２７Ｄ又はＮ、Ｅ２９Ｎ、Ｋ３７Ｃ又はＤ又はＰ又はＱ又はＳ、Ｖ４２Ｍ、Ｎ４７Ｄ又はＳ、Ｎ４８Ｄ又はＧ又はＴ、Ｅ４９Ｌ又はＶ、Ｌ５６Ｅ又はＦ又はＧ又はＩ又はＫ又はＴ又はＶ又はＹ、Ｄ８１Ｑ、Ｒ８２Ｎ又はＴ又はＶ又はＹ、Ｖ８４Ｍ、Ｔ９３Ｃ又はＦ又はＲ又はＳ、Ｋ９４Ｇ又はＰ、Ｔ９５Ｄ又はＦ又はＧ又はＩ又はＮ又はＷ、Ｓ１２０Ｃ又はＧ又はＭ又はＱ、Ｋ１２３Ｖ、Ｎ１２６Ｅ、Ｅ１３１Ｈ又はＫ又はＬ又はＭ又はＴ又はＷ又はＹ、Ｎ１３２Ｉ又はＰ、Ｋ１３４Ａ、Ｉ１３７Ｔ、Ａ１３９Ｃ又はＱ、Ｌ１４３Ｃ又はＤ又はＥ又はＨ又はＫ又はＭ又はＱ又はＴ又はＶ又はＹ、Ｌ１５１Ａ又はＦ、Ｎ１５５Ａ又はＣ又はＧ又はＨ又はＱ又はＲ又はＳ又はＷ、Ｓ１６６Ｎ、Ｈ１６７Ｆ又はＩ又はＮ又はＱ又はＶ、Ｋ１６９Ａ又はＣ又はＨ又はＮ又はＱ又はＶ、Ｅ１７０Ｌ又はＳ又はＷ又はＹ、Ｌ１７１Ａ又はＮ又はＱ又はＴ又はＶ又はＹ、Ｋ１７５Ｃ又はＦ又はＩ又はＱ又はＲ、Ｅ１７９Ｄ、Ｌ１８０Ａ又はＩ、Ｑ１９７Ｃ又はＤ又はＮ、Ｉ２２９Ｃ、Ｓ２３１Ａ、Ｔ２４０Ｃ、Ｒ２４２Ｇ、Ｒ２４５Ｃ又はＫ又はＭ又はＱ又はＴ又はＶ、Ｒ２４６Ｎ、Ｖ２４７Ｌ又はＭ、Ｔ２５１Ｄ又はＥ又はＮ又はＰ又はＱ又はＳ、Ａ２７１Ｔ、Ｓ２８２Ｙ、Ｌ３０６Ｃ、Ｄ３１７Ｎ、Ｎ３１９Ｍ、Ｆ３６９Ｃ又はＤ又はＥ又はＧ又はＳ、Ｑ３７１Ｆ、Ｌ３７６Ｉ又はＭ、Ｋ３７９Ｇ又はＱ、Ｓ３８０Ｅ、Ｇ３８９Ａ又はＤ又はＥ又はＫ又はＮ又はＱ又はＳ又はＶ、Ｗ３９２Ｙ、Ｋ３９３Ｃ又はＩ又はＴ又はＶ、Ｖ４０８Ｔ、Ｖ４０９Ｔ、Ｑ４２１Ｈ、Ｋ４２２Ｄ、Ｙ４２３Ｎ又はＳ、Ｒ４２９Ｅ又はＦ又はＱ，Ｃ４３７Ｍ，Ａ４４３Ｑ，Ｓ４４４Ｄ又はＥ、Ｉ４４７Ｔ、Ｓ４５５Ａ、Ｃ４５８Ｔ、Ｒ４６１Ａ，Ｇ４６４Ｃ又はＭ又はＮ又はＱ又はＳ、Ｓ４６６Ｄ、Ａ４７０Ｉ又はＬ、Ｓ４７３Ｉ、Ｖ５００Ａ又はＣ、Ｔ５０２Ｍ，Ｌ５０６Ｍ，Ｔ５１３Ｃ又はＧ又はＫ又はＮ、Ｅ５２５Ｆ又はＲ、Ｖ５３１Ｅ又はＨ又はＫ又はＱ又はＲ又はＳからなる群から選択される。
本発明の他の態様では、イソプレン合成酵素変異体は、実施例に例示する通りに＋＋＋＋と評価される改良されたイソプレン合成酵素特性を有するポリペプチド（例えば、単離ポリペプチド）であってよい。実施例に例示する通りに＋＋＋＋とカラムに表記されたこれらのポリペプチドは、配列番号１（ＭＥＡウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素）
と対応させて付番した残基位置に１つ以上の置換を有し得る。一部の非限定例では、改良されたイソプレン合成酵素特性を有する単離ポリペプチドは、配列番号１に対応する：Ｘ２，Ｘ６，Ｘ１８，Ｘ２０，Ｘ２２，Ｘ２３，Ｘ２４，Ｘ２５，Ｘ２６，Ｘ２７，Ｘ２８，Ｘ２９，Ｘ３０，Ｘ３１，Ｘ３２，Ｘ３６，Ｘ３７，Ｘ４２，Ｘ４４，Ｘ４７，Ｘ４８，Ｘ４９，Ｘ５０，Ｘ５３，Ｘ５４，Ｘ５５，Ｘ５６，Ｘ５８，Ｘ５９，Ｘ６８，Ｘ７１，Ｘ７４，Ｘ７７，Ｘ７８，Ｘ７９，Ｘ８１，Ｘ８２，Ｘ８３，Ｘ８４，Ｘ８６，Ｘ８７，Ｘ９１，Ｘ９３，Ｘ９４，Ｘ９５，Ｘ９７，Ｘ９８，Ｘ９９，Ｘ１０９，Ｘ１１５，Ｘ１１６，Ｘ１１７，Ｘ１１８，Ｘ１２０，Ｘ１２３，Ｘ１２５，Ｘ１２６，Ｘ１２７，Ｘ１２８，Ｘ１３０，Ｘ１３１，Ｘ１３２，Ｘ１３３，Ｘ１３４，Ｘ１３６，Ｘ１３７，Ｘ１３８，Ｘ１３９，Ｘ１４０，Ｘ１４３，Ｘ１５１，Ｘ１５３，Ｘ１５５，Ｘ１５６，Ｘ１５９，Ｘ１６０，Ｘ１６１，Ｘ１６２，Ｘ１６３，Ｘ１６４，Ｘ１６６，Ｘ１６７，Ｘ１６９，Ｘ１７０，Ｘ１７１，Ｘ１７２，Ｘ１７５，Ｘ１７６，Ｘ１７７，Ｘ１７８，Ｘ１７９，Ｘ１８０，Ｘ１８１，Ｘ１８２，Ｘ１９０，Ｘ１９４，Ｘ１９７，Ｘ２０４，Ｘ２１１，Ｘ２１５，Ｘ２１７，Ｘ２１９，Ｘ２２１，Ｘ２２８，Ｘ２２９，Ｘ２３１，Ｘ２３２，Ｘ２３５，Ｘ２４１，Ｘ２４２，Ｘ２４５，Ｘ２４６，Ｘ２４７，Ｘ２５１，Ｘ２５４，Ｘ２７１，Ｘ２７２，Ｘ２７８，Ｘ２７９，Ｘ２８２，Ｘ２９６，Ｘ３０２，Ｘ３１７，Ｘ３１９，Ｘ３２０，Ｘ３２７，Ｘ３３１，Ｘ３４８，Ｘ３５１，Ｘ３５７，Ｘ３６１，Ｘ３６４，Ｘ３６５，Ｘ３６８，Ｘ３６９，Ｘ３７０，Ｘ３７１，Ｘ３７３，Ｘ３７７，Ｘ３８０，Ｘ３８３，Ｘ３８６，Ｘ３８９，Ｘ３９２，Ｘ３９３，Ｘ４０７，Ｘ４０８，Ｘ４０９，Ｘ４１０，Ｘ４１１，Ｘ４１４，Ｘ４２２，Ｘ４２３，Ｘ４２４，Ｘ４２８，Ｘ４２９，Ｘ４３２，Ｘ４３６，Ｘ４３７，Ｘ４４０，Ｘ４４３，Ｘ４４４，Ｘ４４７，Ｘ４４８，Ｘ４５７，Ｘ４６０，Ｘ４６１，Ｘ４６２，Ｘ４６３，Ｘ４６４，Ｘ４６５，Ｘ４６６，Ｘ４６８，Ｘ４７０，Ｘ４７１，Ｘ４７２，Ｘ４７３，Ｘ４７５，Ｘ４８０，Ｘ４９０，Ｘ４９１，Ｘ４９２，Ｘ４９４，Ｘ４９６，Ｘ５００，Ｘ５０１，Ｘ５０２，Ｘ５０３，Ｘ５１０，Ｘ５１３，Ｘ５１５，Ｘ５１９，Ｘ５２５，Ｘ５３１，Ｘ５３６，Ｘ５３７，Ｘ５４０，Ｘ５４１，Ｘ５４２，及びＸ５４４からなる群から選択される残基のうちの１つ以上が置換されている。
一部の実施形態では、これらの置換は：Ｅ２，Ｓ６，Ｙ１８，Ｌ２０，Ｓ２２，Ｄ２３，Ｔ２４，Ｄ２５，Ｅ２６，Ｓ２７，Ｉ２８，Ｅ２９，Ｖ３０，Ｙ３１，Ｋ３２，Ｋ３６，Ｋ３７，Ｖ４２，Ｒ４４，Ｎ４７，Ｎ４８，Ｅ４９，Ｋ５０，Ｆ５３，Ｌ５４，Ｔ５５，Ｌ５６，Ｅ５８，Ｌ５９，Ｌ６８，Ｒ７１，Ｓ７４，Ｒ７７，Ｇ７８，Ａ７９，Ｄ８１，Ｒ８２，Ｆ８３，Ｖ８４，Ｓ８６，Ｇ８７，Ａ９１，Ｔ９３，Ｋ９４，Ｔ９５，Ｌ９７，Ｈ９８，Ｇ９９，Ｑ１０９，Ｓ１１５，Ｑ１１６，Ｅ１１７，Ａ１１８，Ｓ１２０，Ｋ１２３，Ｑ１２５，Ｎ１２６，Ｇ１２７，Ｎ１２８，Ｌ１３０，Ｅ１３１，Ｎ１３２，Ｌ１３３，Ｋ１３４，Ｄ１３６，Ｉ１３７，Ｋ１３８，Ａ１３９，Ｉ１４０，Ｌ１４３，Ｌ１５１，Ｇ１５３，Ｎ１５５，Ｉ１５６，Ｅ１５９，Ａ１６０，Ｋ１６１，Ｖ１６２，Ｆ１６３，Ａ１６４，Ｓ１６６，Ｈ１６７，Ｋ１６９，Ｅ１７０，Ｌ１７１，Ｓ１７２，Ｋ１７５，Ｉ１７６，Ｇ１７７，Ｋ１７８，Ｅ１７９，Ｌ１８０，Ａ１８１，Ｅ１８２，Ｌ１９０，Ｒ１９４，Ｑ１９７，Ｓ２０４，Ｋ２１１，Ｎ２１５，Ｖ２１７，Ｌ２１９，Ｌ２２１，Ｍ２２８，Ｉ２２９，Ｓ２３１，Ｖ２３２，Ｒ２３５，Ｓ２４１，Ｒ２４２，Ｒ２４５，Ｒ２４６，Ｖ２４７，Ｔ２５１，Ｈ２５４，Ａ２７１，Ｆ２７２，Ｄ２７８，Ｃ２７９，Ｓ２８２，Ｉ２９６，Ｔ３０２，Ｄ３１７，Ｎ３１９，Ａ３２０，Ｙ３２７，Ｃ３３１，Ｋ３４８，Ｇ３５１，Ｙ３５７，Ａ３６１，Ｄ３６４，Ｌ３６５，Ａ３６８，Ｆ３６９，Ｌ３７０，Ｑ３７１，Ａ３７３，Ｙ３７７，Ｓ３８０，Ｔ３８３，Ｄ３８６，Ｇ３８９，Ｗ３９２，Ｋ３９３，Ａ４０７，Ｖ４０８，Ｖ４０９，Ｑ４１０，Ｎ４１１，Ｋ４１４，Ｋ４２２，Ｙ４２３，Ｈ４２４，Ｓ４２８，Ｒ４２９，Ｈ４３２，Ｌ４３６，Ｃ４３７，Ｌ４４０，Ａ４４３，Ｓ４４４，Ｉ４４７，Ａ４４８，Ｓ４５７，Ｍ４６０，Ｒ４６１，Ｔ４６２，Ｋ４６３，Ｇ４６４，Ｉ４６５，Ｓ４６６，Ｅ４６８，Ａ４７０，Ｔ４７１，Ｅ４７２，Ｓ４７３，Ｍ４７５，Ｅ４８０，Ｌ４９０，Ｇ４９１，Ｇ４９２，Ｌ４９４，Ａ４９６，Ｖ５００，Ｅ５０１，Ｔ５０２，Ａ５０３，Ｓ５１０，Ｔ５１３，Ｈ５１５，Ａ５１９，Ｅ５２５，Ｖ５３１，Ｔ５３６，Ｅ５３７，Ｌ５４０，Ｐ５４１，Ｆ５４２，及びＲ５４４からなる群から選択される残基に生じ得る。
他の実施形態では、置換は，Ｅ２Ｃ又はＤ又はＮ又はＴ又はＶ，Ｓ６Ｎ又はＴ，Ｙ１８Ａ又はＱ又はＲ，Ｌ２０Ｔ，Ｓ２２Ｑ，Ｄ２３Ｎ，Ｔ２４Ｃ，Ｄ２５Ｔ，Ｅ２６Ｄ又はＨ又はＫ又はＭ又はＲ又はＳ又はＶ，Ｓ２７Ａ又はＣ又はＧ又はＨ又はＩ又はＬ又はＭ又はＰ又はＱ，Ｉ２８Ｄ又はＮ，Ｅ２９Ｑ，Ｖ３０Ａ又はＤ又はＥ又はＭ又はＲ又はＴ，Ｙ３１Ｎ，Ｋ３２Ｅ，Ｋ３６Ａ又はＣ又はＤ又はＥ又はＭ又はＮ又はＰ又はＱ，Ｋ３７Ａ又はＥ又はＧ又はＨ又はＭ又はＮ又はＲ又はＴ，Ｖ４２Ｆ又はＩ，Ｒ４４Ｎ又はＱ，Ｎ４７Ａ又はＧ又はＨ又はＭ又はＱ又はＴ又はＷ，Ｎ４８Ｈ又はＩ又はＫ，Ｅ４９Ａ又はＣ，Ｋ５０Ａ又はＤ又はＥ又はＦ又はＨ又はＳ又はＹ，Ｆ５３Ｅ又はＨ又はＮ又はＰ又はＱ又はＶ，Ｌ５４Ｍ，Ｔ５５Ｃ又はＤ又はＥ，Ｌ５６Ｃ又はＮ，Ｅ５８Ｎ，Ｌ５９Ｈ又はＴ，Ｌ６８Ｉ，Ｒ７１Ｋ又はＭ，Ｓ７４Ｄ又はＥ又はＮ又はＹ，Ｒ７７Ｌ，Ｇ７８Ａ又はＤ又はＦ又はＬ又はＭ，Ａ７９Ｑ又はＴ，Ｄ８１Ａ又はＦ又はＧ又はＭ又はＲ又はＳ又はＴ又はＶ，Ｒ８２Ａ又はＥ又はＨ又はＩ又はＫ又はＭ又はＱ又はＳ，Ｆ８３Ｗ，Ｖ８４Ａ，Ｓ８６Ａ又はＤ又はＭ，Ｇ８７Ｄ又はＰ，Ａ９１Ｋ又はＷ，Ｔ９３Ａ又はＤ又はＥ又はＧ又はＬ又はＮ又はＰ又はＹ，Ｋ９４Ａ又はＤ又はＥ又はＨ又はＩ又はＬ又はＭ又はＮ又はＲ又はＳ又はＴ，Ｔ９５Ａ又はＥ又はＰ又はＱ又はＳ又はＶ又はＹ，Ｌ９７Ｆ，Ｈ９８Ａ又はＤ又はＦ又はＧ又はＩ又はＬ又はＭ又はＮ又はＱ，Ｇ９９Ｅ又はＦ又はＭ、Ｑ１０９Ｅ，Ｓ１１５Ａ，Ｑ１１６Ａ又はＣ又はＤ又はＥ又はＩ又はＰ、Ｅ１１７Ｃ又はＦ又はＬ又はＭ又はＶ、Ａ１１８Ｍ，Ｓ１２０Ｈ又はＴ又はＶ、Ｋ１２３Ｌ又はＴ、Ｑ１２５Ｅ又はＩ又はＹ、Ｎ１２６Ａ又はＣ又はＤ又はＭ又はＴ又はＶ、Ｇ１２７Ｃ，Ｎ１２８Ｃ又はＤ又はＰ又はＱ、Ｌ１３０Ｅ，Ｅ１３１Ａ又はＣ又はＰ又はＱ又はＳ又はＶ、Ｎ１３２Ｃ又はＤ又はＦ又はＨ又はＬ又はＲ又はＷ又はＹ、Ｌ１３３Ｄ，Ｋ１３４Ｅ又はＭ又はＱ又はＳ又はＴ又はＶ、Ｄ１３６Ｅ，Ｉ１３７Ｅ又はＨ又はＮ、Ｋ１３８Ｉ又はＮ、Ａ１３９Ｎ，Ｉ１４０Ｍ又はＷ、Ｌ１４３Ｓ，Ｌ１５１Ｃ又はＨ又はＩ、Ｇ１５３Ｃ，Ｎ１５５Ｉ又はＴ又はＶ又はＹ、Ｉ１５６Ｄ又はＮ又はＴ、Ｅ１５９Ｍ，Ａ１６０Ｉ，Ｋ１６１Ａ又はＣ又はＮ又はＱ、Ｖ１６２Ｓ，Ｆ１６３Ｅ又はＱ、Ａ１６４Ｔ，Ｓ１６６Ａ又はＤ又はＧ、Ｈ１６７Ａ又はＥ又はＧ又はＫ又はＭ又はＲ又はＳ又はＴ又はＷ、Ｋ１６９Ｄ又はＩ又はＭ又はＳ又はＴ、Ｅ１７０Ｈ又はＫ又はＭ又はＱ又はＴ又はＶ、Ｌ１７１Ｈ又はＫ又はＲ又はＳ、Ｓ１７２Ａ又はＣ、Ｋ１７５Ｓ，Ｉ１７６Ｍ，Ｇ１７７Ａ又はＣ、Ｋ１７８Ａ又はＦ又はＲ又はＳ又はＴ、Ｅ１７９Ａ又はＣ又はＬ又はＭ又はＮ、Ｌ１８０Ｃ又はＱ又はＴ、Ａ１８１Ｈ又はＱ又はＳ又はＶ、Ｅ１８２Ｓ，Ｌ１９０Ｉ又はＭ、Ｒ１９４Ｌ，Ｑ１９７Ｓ，Ｓ２０４Ｃ，Ｋ２１１Ａ又はＮ又はＱ、Ｎ２１５Ｃ又はＨ、Ｖ２１７Ｉ，Ｌ２１９Ｃ，Ｌ２２１Ｍ，Ｍ２２８Ｆ又はＹ、Ｉ２２９Ｖ，Ｓ２３１Ｋ又はＱ又はＴ、Ｖ２３２Ｉ，Ｒ２３５Ｋ，Ｓ２４１Ａ又はＭ又はＴ、Ｒ２４２Ａ又はＤ又はＥ又はＨ又はＩ又はＭ又はＮ又はＱ又はＳ又はＴ、Ｒ２４５Ｉ又はＬ、Ｒ２４６Ｄ又はＫ、Ｖ２４７Ｔ，Ｔ２５１Ａ又はＧ又はＫ又はＲ、Ｈ２５４Ｄ，Ａ２７１Ｃ又はＶ、Ｆ２７２Ｄ又はＧ又はＰ又はＷ、Ｄ２７８Ａ又はＥ又はＮ又はＱ又はＳ又はＴ又はＶ又はＷ、Ｃ２７９Ａ，Ｓ２８２Ａ又はＱ、Ｉ２９６Ｖ，Ｔ３０２Ｈ，Ｄ３１７Ｅ又はＱ、Ｎ３１９Ｆ，Ａ３２０Ｃ，Ｙ３２７Ｍ，Ｃ３３１Ｐ，Ｋ３４８Ｒ又はＹ、Ｇ３５１Ｄ又はＮ、Ｙ３５７Ｍ，Ａ３６１Ｔ，Ｄ３６４Ｅ又はＶ、Ｌ３６５Ｃ又はＭ、Ａ３６８Ｎ，Ｆ３６９Ｍ又はＮ又はＲ又はＴ又はＶ、Ｌ３７０Ｇ又はＱ、Ｑ３７１Ｃ又はＳ、Ａ３７３Ｇ，Ｙ３７７Ｗ，Ｓ３８０Ａ又はＣ又はＤ又はＱ又はＴ又はＶ、Ｔ３８３Ｓ，Ｄ３８６Ｅ又はＮ、Ｇ３８９Ｈ又はＩ、Ｗ３９２Ｉ又はＳ又はＴ又はＶ、Ｋ３９３Ｑ，Ａ４０７Ｇ，Ｖ４０８Ｉ，Ｖ４０９Ｈ又はＩ、Ｑ４１０Ｃ又はＤ又はＫ又はＬ又はＭ又はＴ、Ｎ４１１Ｇ，Ｋ４１４Ｅ又はＧ又はＬ又はＮ又はＰ、Ｋ４２２Ａ又はＮ又はＴ、Ｙ４２３Ｑ，Ｈ４２４Ｅ又はＰ又はＱ又はＶ、Ｓ４２８Ｅ又はＱ、Ｒ４２９Ｉ又はＬ又はＴ又はＷ又はＹ、Ｈ４３２Ｅ，Ｌ４３６Ｍ又はＹ、Ｃ４３７Ｋ又はＴ、Ｌ４４０Ｉ，Ａ４４３Ｒ，Ｓ４４４Ｐ，Ｉ４４７Ａ又はＥ又はＭ又はＱ又はＳ、Ａ４４８Ｅ又はＭ又はＮ又はＰ又はＱ又はＶ、Ｓ４５７Ｎ又はＴ、Ｍ４６０Ｑ又はＲ又はＳ、Ｒ４６１Ｄ又はＥ又はＧ又はＱ又はＳ又はＴ、Ｔ４６２Ｑ，Ｋ４６３Ａ又はＤ又はＥ、Ｇ４６４Ｌ又はＲ、Ｉ４６５Ａ又はＣ又はＧ又はＳ又はＴ、Ｓ４６６Ｐ，Ｅ４６８Ｄ，Ａ４７０Ｍ，Ｔ４７１Ｅ又はＨ又はＱ、Ｅ４７２Ｄ又はＳ、Ｓ４７３Ｌ又はＶ、Ｍ４７５Ｔ，Ｅ４８０Ｎ，Ｌ４９０Ａ又はＤ又はＥ又はＦ又はＨ又はＭ、Ｇ４９１Ｅ又はＫ又はＳ又はＴ又はＶ又はＹ、Ｇ４９２Ｃ，Ｌ４９４Ｄ，Ａ４９６Ｐ又はＴ、Ｖ５００Ｌ又はＭ、Ｅ５０１Ｄ，Ｔ５０２Ａ又はＣ又はＲ又はＶ、Ａ５０３Ｉ，Ｓ５１０Ｃ又はＶ、Ｔ５１３Ｖ，Ｈ５１５Ｎ，Ａ５１９Ｓ又はＴ、Ｅ５２５Ａ又はＣ又はＰ又はＱ又はＳ、Ｖ５３１Ａ又はＭ又はＴ、Ｔ５３６Ａ又はＦ又はＧ、Ｅ５３７Ｋ又はＴ、Ｌ５４０Ａ又はＰ、Ｐ５４１Ｍ，Ｆ５４２Ｐ，及びＲ５４４Ｃからなる群から選択される残基の置換である。
本発明の他の態様では、イソプレン合成酵素変異体は、実施例に例示する通りに＋＋＋と評価される改良されたイソプレン合成酵素特性を有するポリペプチド（例えば、単離ポリペプチド）であってよい。実施例に例示する通りに＋＋＋とカラムに表記されたこれらのポリペプチドは、配列番号１（ＭＥＡウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素と対応させて付番した残基位置に１つ以上の置換を有し得る。一部の非限定例では、改良されたイソプレン合成酵素特性を有する単離ポリペプチドは、配列番号１に対応する：Ｘ２，Ｘ３，Ｘ１３，Ｘ１７，Ｘ１８，Ｘ１９，Ｘ２０，Ｘ２３，Ｘ２５，Ｘ２６，Ｘ２７，Ｘ２８，Ｘ２９，Ｘ３０，Ｘ３１，Ｘ３２，Ｘ３３，Ｘ３４，Ｘ３６，Ｘ３７，Ｘ４０，Ｘ４１，Ｘ４２，Ｘ４３，Ｘ４４，Ｘ４５，Ｘ４６，Ｘ４７，Ｘ４８，Ｘ４９，Ｘ５０，Ｘ５１，Ｘ５３，Ｘ５４，Ｘ５５，Ｘ５６，Ｘ５７，Ｘ５９，Ｘ６０，Ｘ６２，Ｘ７１，Ｘ７３，Ｘ７４，Ｘ７５，Ｘ７７，Ｘ７８，Ｘ７９，Ｘ８１，Ｘ８２，Ｘ８３，Ｘ８４，Ｘ８５，Ｘ８６，Ｘ８７，Ｘ８８，Ｘ８９，Ｘ９１，Ｘ９２，Ｘ９３，Ｘ９４，Ｘ９５，Ｘ９７，Ｘ９８，Ｘ９９，Ｘ１００，Ｘ１０１，Ｘ１０２，Ｘ１０３，Ｘ１０７，Ｘ１０９，Ｘ１１１，Ｘ１１３，Ｘ１１４，Ｘ１１５，Ｘ１１６，Ｘ１１７，Ｘ１１８，Ｘ１１９，Ｘ１２０，Ｘ１２１，Ｘ１２３，Ｘ１２４，Ｘ１２５，Ｘ１２７，Ｘ１２８，Ｘ１２９，Ｘ１３０，Ｘ１３１，Ｘ１３３，Ｘ１３４，Ｘ１３５，Ｘ１３６，Ｘ１３７，Ｘ１３８，Ｘ１３９，Ｘ１４０，Ｘ１４３，Ｘ１４６，Ｘ１５１，Ｘ１５２，Ｘ１５３，Ｘ１５５，Ｘ１５６，Ｘ１５８，Ｘ１６０，Ｘ１６１，Ｘ１６２，Ｘ１６３，Ｘ１６６，Ｘ１６７，Ｘ１６９，Ｘ１７０，Ｘ１７１，Ｘ１７２，Ｘ１７５，Ｘ１７６，Ｘ１７７，Ｘ１７８，Ｘ１７９，Ｘ１８０，Ｘ１８１，Ｘ１８２，Ｘ１８３，Ｘ１８５，Ｘ１８７，Ｘ１９３，Ｘ１９４，Ｘ１９６，Ｘ１９７，Ｘ２０４，Ｘ２１０，Ｘ２１１，Ｘ２１２，Ｘ２１５，Ｘ２１６，Ｘ２１７，Ｘ２１８，Ｘ２１９，Ｘ２２０，Ｘ２２２，Ｘ２２３，Ｘ２２４，Ｘ２２６，Ｘ２２８，Ｘ２２９，Ｘ２３１，Ｘ２３２，Ｘ２３５，Ｘ２４０，Ｘ２４１，Ｘ２４２，Ｘ２４６，Ｘ２５１，Ｘ２５３，Ｘ２６０，Ｘ２６８，Ｘ２７０，Ｘ２７１，Ｘ２７２，Ｘ２７５，Ｘ２７６，Ｘ２７８，Ｘ２８２，Ｘ３０７，Ｘ３１４，Ｘ３１５，Ｘ３１７，Ｘ３２０，Ｘ３２１，Ｘ３２３，Ｘ３２８，Ｘ３２９，Ｘ３３１，Ｘ３３２，Ｘ３３３，Ｘ３４３，Ｘ３４５，Ｘ３４６，Ｘ３５０，Ｘ３５１，Ｘ３５２，Ｘ３５６，Ｘ３５７，Ｘ３６０，Ｘ３６１，Ｘ３６３，Ｘ３６４，Ｘ３６６，Ｘ３６７，Ｘ３６８，Ｘ３６９，Ｘ３７０，Ｘ３７１，Ｘ３７８，Ｘ３７９，Ｘ３８０，Ｘ３８３，Ｘ３８６，Ｘ３８９，Ｘ３９０，Ｘ３９２，Ｘ３９３，Ｘ４０２，Ｘ４０５，Ｘ４０８，Ｘ４０９，Ｘ４１０，Ｘ４１３，Ｘ４１４，Ｘ４１８，Ｘ４２２，Ｘ４２３，Ｘ４２４，Ｘ４２５，Ｘ４２６，Ｘ４２８，Ｘ４２９，Ｘ４３１，Ｘ４３２，Ｘ４３７，Ｘ４４４，Ｘ４４７，Ｘ４４８，Ｘ４５７，Ｘ４６０，Ｘ４６１，Ｘ４６２，Ｘ４６３，Ｘ４６４，Ｘ４６６，Ｘ４６７，Ｘ４６８，Ｘ４６９，Ｘ４７１，Ｘ４７２，Ｘ４７５，Ｘ４８４，Ｘ４８９，Ｘ４９０，Ｘ４９１，Ｘ４９２，Ｘ４９３，Ｘ４９４，Ｘ４９７，Ｘ５００，Ｘ５０１，Ｘ５０２，Ｘ５０３，Ｘ５０４，Ｘ５０６，Ｘ５０９，Ｘ５１０，Ｘ５１１，Ｘ５１３，Ｘ５１５，Ｘ５１７，Ｘ５１９，Ｘ５２２，Ｘ５２８，Ｘ５２９，Ｘ５３１，Ｘ５３４，Ｘ５３５，Ｘ５３６，Ｘ５３７，Ｘ５３９，Ｘ５４０，Ｘ５４２，及びＸ５４４からなる群から選択される残基のうちの１つ以上が置換されている。
一部の実施形態では、これらの置換は、Ｅ２，Ａ３，Ｓ１３，Ｄ１７，Ｙ１８，Ｌ１９，Ｌ２０，Ｄ２３，Ｄ２５，Ｅ２６，Ｓ２７，Ｉ２８，Ｅ２９，Ｖ３０，Ｙ３１，Ｋ３２，Ｄ３３，Ｋ３４，Ｋ３６，Ｋ３７，Ａ４０，Ｅ４１，Ｖ４２，Ｒ４３，Ｒ４４，Ｅ４５，Ｉ４６，Ｎ４７，Ｎ４８，Ｅ４９，Ｋ５０，Ａ５１，Ｆ５３，Ｌ５４，Ｔ５５，Ｌ５６，Ｌ５７，Ｌ５９，Ｉ６０，Ｎ６２，Ｒ７１，Ｅ７３，Ｓ７４，Ｄ７５，Ｒ７７，Ｇ７８，Ａ７９，Ｄ８１，Ｒ８２，Ｆ８３，Ｖ８４，Ｓ８５，Ｓ８６，Ｇ８７，Ｇ８８，Ｆ８９，Ａ９１，Ｖ９２，Ｔ９３，Ｋ９４，Ｔ９５，Ｌ９７，Ｈ９８，Ｇ９９，Ｔ１００，Ａ１０１，Ｌ１０２，Ｓ１０３，Ｌ１０７，Ｑ１０９，Ｇ１１１，Ｅ１１３，Ｖ１１４，Ｓ１１５，Ｑ１１６，Ｅ１１７，Ａ１１８，Ｆ１１９，Ｓ１２０，Ｇ１２１，Ｋ１２３，Ｄ１２４，Ｑ１２５，Ｇ１２７，Ｎ１２８，Ｆ１２９，Ｌ１３０，Ｅ１３１，Ｌ１３３，Ｋ１３４，Ｅ１３５，Ｄ１３６，Ｉ１３７，Ｋ１３８，Ａ１３９，Ｉ１４０，Ｌ１４３，Ａ１４６，Ｌ１５１，Ｅ１５２，Ｇ１５３，Ｎ１５５，Ｉ１５６，Ｄ１５８，Ａ１６０，Ｋ１６１，Ｖ１６２，Ｆ１６３，Ｓ１６６，Ｈ１６７，Ｋ１６９，Ｅ１７０，Ｌ１７１，Ｓ１７２，Ｋ１７５，Ｉ１７６，Ｇ１７７，Ｋ１７８，Ｅ１７９，Ｌ１８０，Ａ１８１，Ｅ１８２，Ｑ１８３，Ｎ１８５，Ａ１８７，Ｈ１９３，Ｒ１９４，Ｔ１９６，Ｑ１９７，Ｓ２０４，Ｋ２１０，Ｋ２１１，Ｅ２１２，Ｎ２１５，Ｑ２１６，Ｖ２１７，Ｌ２１８，Ｌ２１９，Ｅ２２０，Ａ２２２，Ｉ２２３，Ｌ２２４，Ｙ２２６，Ｍ２２８，Ｉ２２９，Ｓ２３１，Ｖ２３２，Ｒ２３５，Ｔ２４０，Ｓ２４１，Ｒ２４２，Ｒ２４６，Ｔ２５１，Ｌ２５３，Ｌ２６０，Ｖ２６８，Ｖ２７０，Ａ２７１，Ｆ２７２，Ｑ２７５，Ｙ２７６，Ｄ２７８，Ｓ２８２，Ｅ３０７，Ｅ３１４，Ｒ３１５，Ｄ３１７，Ａ３２０，Ｉ３２１，Ｄ３２３，Ｍ３２８，Ｋ３２９，Ｃ３３１，Ｆ３３２，Ｌ３３３，Ａ３４３，Ｄ３４５，Ｎ３４６，Ｋ３５０，Ｇ３５１，Ｅ３５２，Ｐ３５６，Ｙ３５７，Ｋ３６０，Ａ３６１，Ａ３６３，Ｄ３６４，Ｃ３６６，Ｎ３６７，Ａ３６８，Ｆ３６９，Ｌ３７０，Ｑ３７１，Ｎ３７８，Ｋ３７９，Ｓ３８０，Ｔ３８３，Ｄ３８６，Ｇ３８９，Ｎ３９０，Ｗ３９２，Ｋ３９３，Ｖ４０２，Ｙ４０５，Ｖ４０８，Ｖ４０９，Ｑ４１０，Ｋ４１３，Ｋ４１４，Ｅ４１８，Ｋ４２２，Ｙ４２３，Ｈ４２４，Ｄ４２５，Ｔ４２６，Ｓ４２８，Ｒ４２９，Ｓ４３１，Ｈ４３２，Ｃ４３７，Ｓ４４４，Ｉ４４７，Ａ４４８，Ｓ４５７，Ｍ４６０，Ｒ４６１，Ｔ４６２，Ｋ４６３，Ｇ４６４，Ｓ４６６，Ｅ４６７，Ｅ４６８，Ｌ４６９，Ｔ４７１，Ｅ４７２，Ｍ４７５，Ｋ４８４，Ｋ４８９，Ｌ４９０，Ｇ４９１，Ｇ４９２，Ｓ４９３，Ｌ４９４，Ｋ４９７，Ｖ５００，Ｅ５０１，Ｔ５０２，Ａ５０３，Ｉ５０４，Ｌ５０６，Ｑ５０９，Ｓ５１０，Ｈ５１１，Ｔ５１３，Ｈ５１５，Ｇ５１７，Ａ５１９，Ｓ５２２，Ｒ５２８，Ｋ５２９，Ｖ５３１，Ｖ５３４，Ｉ５３５，Ｔ５３６，Ｅ５３７，Ｉ５３９，Ｌ５４０，Ｆ５４２，及びＲ５４４からなる群から選択される残基に生じさせてよい。
他の実施形態では置換は、Ｅ２Ｈ又はＩ又はＳ、Ａ３Ｅ又はＧ又はＫ又はＮ又はＱ又はＲ又はＴ，Ｓ１３Ｑ又はＴ，Ｄ１７Ｅ，Ｙ１８Ｆ又はＭ又はＮ、Ｌ１９Ｆ，Ｌ２０Ｉ又はＶ、Ｄ２３Ｔ，Ｄ２５Ａ又はＥ又はＳ，Ｅ２６Ｇ又はＮ又はＱ又はＴ，Ｓ２７Ｅ又はＦ又はＫ又はＶ、Ｉ２８Ｅ又はＦ又はＭ又はＰ、Ｅ２９Ｄ又はＰ又はＲ又はＴ，Ｖ３０Ｎ又はＱ，Ｙ３１Ｑ又はＷ，Ｋ３２Ｄ又はＧ又はＮ又はＲ，Ｄ３３Ｎ，Ｋ３４Ｄ又はＥ又はＱ又はＳ，Ｋ３６Ｆ又はＲＫ３７Ｆ又はＩ、Ａ４０Ｃ又はＤ又はＥ又はＦ又はＭ又はＮ又はＰ又はＱ又はＶ、Ｅ４１Ｃ又はＤ又はＦ又はＮ又はＱ又はＳ又はＶ、Ｖ４２Ａ又はＳ又はＴ，Ｒ４３Ｉ又はＱ，Ｒ４４Ａ又はＤ又はＫ又はＭ又はＹ，Ｅ４５Ｃ又はＭ又はＮ又はＱ，Ｉ４６Ｆ又はＶ、Ｎ４７Ｅ又はＩ又はＫ又はＲ又はＶ、Ｎ４８Ａ又はＣ又はＥ又はＦ又はＬ又はＱ又はＲ又はＳ，Ｅ４９Ｇ又はＨ又はＩ又はＲ又はＳ又はＷ、Ｋ５０Ｃ又はＧ又はＭ又はＮ又はＰ又はＲ，Ａ５１Ｅ又はＧ又はＬ又はＱ又はＴ，Ｆ５３Ｄ，Ｌ５４Ａ又はＣ又はＥ又はＨ又はＩ又はＱ，Ｔ５５Ａ又はＨ又はＮ又はＱ又はＳ又はＹ，Ｌ５６Ｈ又はＱ又はＲ又はＳ，Ｌ５７Ｉ，Ｌ５９Ｆ又はＭ又はＳ又はＶ又はＹ，Ｉ６０Ｃ又はＶ、Ｎ６２Ｖ，Ｒ７１Ｉ，Ｅ７３Ｄ，Ｓ７４Ｇ又はＭ又はＰ、Ｄ７５Ｅ，Ｒ７７Ａ又はＮ又はＴ又はＶ、Ｇ７８Ｅ又はＩ又はＫ又はＮ又はＰ又はＱ又はＶ又はＷ、Ａ７９Ｍ又はＲ又はＹ，Ｄ８１Ｃ又はＥ又はＨ又はＬ又はＮ、Ｒ８２Ｃ又はＦ又はＧ又はＬ又はＷ、Ｆ８３Ｇ又はＨ又はＩ又はＬ又はＶ、Ｖ８４Ｆ又はＨ又はＬ又はＮ又はＱ又はＲ又はＳ又はＴ又はＷ又はＹ，Ｓ８５Ｃ又はＬ又はＮ又はＲ，Ｓ８６Ｃ又はＮ、Ｇ８７Ｃ又はＥ又はＦ又はＫ又はＬ又はＮ又はＴ，Ｇ８８Ｃ又はＤ又はＩ又はＶ又はＷ又はＹ，又はＹ、又はＩ、Ａ９１Ｃ又はＤ又はＥ又はＧ又はＨ又はＬ又はＲ又はＳ又はＴ又はＶ又はＹ，Ｖ９２Ａ又はＣ又はＥ又はＦ又はＧ又はＩ又はＬ又はＱ又はＷ、Ｔ９３Ｈ又はＩ又はＱ又はＶ又はＷ、Ｋ９４Ｃ又はＶ又はＹ，Ｔ９５Ｃ又はＨ又はＫ又はＭ，Ｌ９７Ａ又はＭ又はＰ、Ｈ９８Ｃ又はＳ又はＴ又はＶ又はＷ、Ｇ９９Ａ又はＣ又はＨ又はＰ又はＱ又はＴ，Ｔ１００Ａ又はＩ又はＬ又はＭ又はＶ、Ａ１０１Ｓ，Ｌ１０２Ｍ，Ｓ１０３Ａ又はＣ又はＧ又はＬ，Ｌ１０７Ｃ又はＦ，Ｑ１０９Ｃ又はＮ又はＳ，Ｇ１１１Ａ，Ｅ１１３Ｃ又はＨ又はＶ、Ｖ１１４Ｃ，Ｓ１１５Ｄ又はＹ，Ｑ１１６Ｇ又はＨ又はＬ又はＳ又はＴ又はＶ、Ｅ１１７Ａ又はＤ又はＩ、Ａ１１８Ｉ又はＶ、Ｆ１１９Ｌ又はＭ，Ｓ１２０Ａ又はＤ又はＥ又はＦ又はＫ又はＮ又はＲ又はＷ又はＹ，Ｇ１２１Ｄ又はＬ又はＶ又はＷ、Ｋ１２３Ｉ又はＳ又はＷ又はＹ，Ｄ１２４Ｃ又はＥ，Ｑ１２５Ａ又はＤ又はＧ又はＨ又はＫ又はＬ又はＮ又はＳ又はＴ又はＶ又はＷ、Ｇ１２７Ｄ又はＦ又はＷ、Ｎ１２８Ａ，Ｆ１２９Ｌ又はＹ，Ｌ１３０Ａ又はＣ又はＤ又はＱ又はＶ又はＹ，Ｅ１３１Ｄ又はＦ又はＧ又はＲ，Ｌ１３３Ｅ又はＧ又はＩ又はＰ又はＱ又はＴ又はＶ又はＹ，Ｋ１３４Ｄ又はＧ又はＨ又はＩ又はＬ又はＮ又はＲ又はＷ又はＹ，Ｅ１３５Ｈ又はＳ，Ｄ１３６Ｎ，Ｉ１３７Ａ又はＣ又はＤ又はＧ又はＰ又はＱ又はＳ又はＶ、Ｋ１３８Ｃ又はＤ又はＥ又はＰ又はＲ又はＳ又はＶ、Ａ１３９Ｐ又はＳ又はＴ又はＶ、Ｉ１４０Ｎ又はＱ又はＳ又はＴ又はＶ、Ｌ１４３Ａ又はＦ又はＧ又はＮ又はＲ又はＷ、Ａ１４６Ｍ，Ｌ１５１Ｅ又はＧ又はＭ又はＮ又はＱ又はＲ又はＳ又はＴ又はＶ又はＷ、Ｅ１５２Ａ又はＤ又はＩ又はＭ又はＰ、Ｇ１５３Ｄ，Ｎ１５５Ｅ又はＫ又はＭ，Ｉ１５６Ｅ又はＫ又はＬ又はＲ又はＹ，Ｄ１５８Ｅ，Ａ１６０Ｆ又はＨ又はＳ，Ｋ１６１Ｌ又はＲ又はＳ又はＹ，Ｖ１６２Ｄ又はＦ又はＮ又はＰ又はＴ，Ｆ１６３Ｃ又はＨ又はＩ又はＭ又はＶ又はＷ又はＹ，Ｓ１６６Ｃ又はＥ又はＨ又はＫ又はＰ又はＱ又はＶ又はＷ、Ｈ１６７Ｃ又はＬ又はＰ、Ｋ１６９Ｅ又はＧ又はＲ，Ｅ１７０Ｇ又はＩ又はＮ又はＲ，Ｌ１７１Ｃ又はＥ又はＧ又はＩ又はＭ又はＷ、Ｓ１７２Ｇ又はＮ又はＱ又はＲ、Ｋ１７５Ａ又はＧ又はＨ又はＮ又はＰ又はＴ又はＶ、Ｉ１７６Ａ又はＣ又はＮ又はＱ又はＶ、Ｇ１７７Ｄ又はＥ又はＨ又はＮ又はＰ又はＴ，Ｋ１７８Ｄ又はＥ又はＧ又はＩ又はＬ又はＭ又はＮ又はＰ又はＱ又はＶ又はＹ，Ｅ１７９Ｇ又はＩ又はＰ又はＱ又はＳ又はＴ又はＶ又はＷ又はＹ，Ｌ１８０Ｆ又はＨ又はＶ又はＷ、Ａ１８１Ｆ又はＭ又はＮ又はＷ、Ｅ１８２Ｈ又はＮ、Ｑ１８３Ａ又はＬ，Ｎ１８５Ｄ，Ａ１８７Ｃ又はＳ，Ｈ１９３Ｗ，Ｒ１９４Ｉ，Ｔ１９６Ｖ，Ｑ１９７Ｇ，Ｓ２０４Ａ又はＦ又はＭ又はＷ又はＹ，Ｋ２１０Ｍ，Ｋ２１１Ｄ又はＥ又はＦ又はＧ又はＨ又はＩ又はＭ又はＲ又はＳ又はＴ又はＶ、Ｅ２１２Ａ又はＤ又はＭ又はＰ又はＱ又はＴ，Ｎ２１５Ｄ又はＹ，Ｑ２１６Ａ又はＥ又はＮ、Ｖ２１７Ｃ又はＥ又はＫ又はＮ又はＰ又はＱ又はＴ，Ｌ２１８Ｖ，Ｌ２１９Ｉ又はＭ又はＶ、Ｅ２２０Ｄ又はＮ、Ａ２２２Ｓ，Ｉ２２３Ｃ，Ｌ２２４Ａ又はＣ又はＴ又はＶ、Ｙ２２６Ｆ，Ｍ２２８Ｈ又はＲ，Ｉ２２９Ａ，Ｓ２３１Ｄ又はＧ又はＨ又はＲ又はＶ、Ｖ２３２Ｑ，Ｒ２３５Ａ又はＤ又はＮ、Ｔ２４０Ｖ，Ｓ２４１Ｃ，Ｒ２４２Ｋ又はＬ，Ｒ２４６Ｈ又はＱ，Ｔ２５１Ｈ，Ｌ２５３Ｍ，Ｌ２６０Ｍ，Ｖ２６８Ｉ，Ｖ２７０Ｉ，Ａ２７１Ｓ，Ｆ２７２Ｑ，Ｑ２７５Ｅ，Ｙ２７６Ｆ又はＨ又はＱ，Ｄ２７８Ｌ又はＭ又はＲ又はＹ，Ｓ２８２Ｃ，Ｅ３０７Ｑ又はＲ，Ｅ３１４Ｈ，Ｒ３１５Ｇ又はＫ，Ｄ３１７Ｓ，Ａ３２０Ｎ又はＴ，Ｉ３２１Ｌ又はＭ，Ｄ３２３Ｉ又はＴ，Ｍ３２８Ｌ，Ｋ３２９Ｇ又はＱ又はＲ、Ｃ３３１Ｔ，Ｆ３３２Ｙ，Ｌ３３３Ｆ，Ａ３４３Ｉ又はＶ、Ｄ３４５Ｙ，Ｎ３４６Ａ，Ｋ３５０Ｈ又はＷ又はＹ，Ｇ３５１Ｅ又はＭ，Ｅ３５２Ｆ又はＩ又はＭ又はＶ、Ｐ３５６Ｍ又はＳ，Ｙ３５７Ｅ，Ｋ３６０Ｑ，Ａ３６１Ｑ又はＳ又はＶ、Ａ３６３Ｓ，Ｄ３６４Ｎ又はＴ，Ｃ３６６Ａ，Ｎ３６７Ｄ又はＥ又はＭ，Ａ３６８Ｄ又はＱ，Ｆ３６９Ｈ又はＱ，Ｌ３７０Ａ又はＤ又はＥ又はＦ又はＨ又はＮ又はＲ又はＳ又はＴ又はＶ、Ｑ３７１Ｇ又はＨ又はＩ又はＮ又はＰ又はＲ又はＴ又はＷ又はＹ，Ｎ３７８Ｄ，Ｋ３７９Ｅ又はＲ又はＳ，Ｓ３８０Ｋ又はＮ、Ｔ３８３Ｑ，Ｄ３８６Ｋ又はＳ，Ｇ３８９Ｃ又はＭ又はＰ又はＲ又はＴ，Ｎ３９０Ｓ，Ｗ３９２Ｆ又はＭ，Ｋ３９３Ｈ又はＲ，Ｖ４０２Ｆ又はＩ又はＬ，Ｙ４０５Ｆ，Ｖ４０８Ｑ又はＳ，Ｖ４０９Ｃ又はＱ又はＳ，Ｑ４１０Ｅ又はＧ又はＨ又はＩ又はＲ，Ｋ４１３Ｐ，Ｋ４１４Ｃ又はＨ又はＩ又はＱ，Ｅ４１８Ｎ，Ｋ４２２Ｇ又はＨ又はＱ又はＲ、Ｙ４２３Ｇ，Ｈ４２４Ｄ又はＧ又はＩ又はＳ又はＴ，Ｄ４２５Ｐ，Ｔ４２６Ａ又はＭ又はＱ，Ｓ４２８Ｖ，Ｒ４２９Ａ又はＣ又はＤ又はＧ又はＨ又はＫ又はＮ、Ｓ４３１Ｇ，Ｈ４３２Ａ又はＭ，Ｃ４３７Ｎ，Ｓ４４４Ｎ又はＱ又はＴ，Ｉ４４７Ｋ又はＲ，Ａ４４８Ｈ又はＳ又はＴ，Ｓ４５７Ｄ，Ｍ４６０Ａ又はＥ又はｇ、Ｒ４６１Ｎ，Ｔ４６２Ｓ，Ｋ４６３Ｇ又はＮ、Ｇ４６４Ａ又はＤ又はＥ又はＦ又はＨ又はＶ又はＹ，Ｓ４６６Ｅ又はＧ又はＫ又はＮ又はＴ，Ｅ４６７Ｎ，Ｅ４６８Ａ又はＮ又はＰ又はＱ，Ｌ４６９Ａ又はＮ、Ｔ４７１Ｎ，Ｅ４７２Ａ又はＧ又はＮ、Ｍ４７５Ｉ，Ｋ４８４Ａ，Ｋ４８９Ｒ，Ｌ４９０Ｉ又はＹ，Ｇ４９１Ａ又はＣ又はＭ又はＮ又はＱ，Ｇ４９２Ｔ又はＶ、Ｓ４９３Ｃ又はＧ又はＫ又はＶ、Ｌ４９４Ｇ又はＩ又はＱ又はＶ、Ｋ４９７Ｍ又はＴ，Ｖ５００Ｉ又はＹ，Ｅ５０１Ｎ，Ｔ５０２Ｈ，Ａ５０３Ｌ又はＭ，Ｉ５０４Ｌ，Ｌ５０６Ｉ又はＶ、Ｑ５０９Ａ，Ｓ５１０Ｔ，Ｈ５１１Ｉ又はＭ，Ｔ５１３Ｓ，Ｈ５１５Ｑ，Ｇ５１７Ｐ，Ａ５１９Ｃ，Ｓ５２２Ａ又はＫ，Ｒ５２８Ｋ，Ｋ５２９Ａ，Ｖ５３１Ｇ又はＮ、Ｖ５３４Ａ又はＳ，Ｉ５３５Ｃ又はＳ又はＴ，Ｔ５３６Ｍ，Ｅ５３７Ｈ又はＮ又はＱ，Ｉ５３９Ｖ，Ｌ５４０Ｅ又はＱ又はＲ又はＶ、Ｆ５４２Ｍ，及びＲ５４４Ｇ又はＮ又はＰ又はＱ又はＳからなる群から選択される。
本発明の他の態様では、イソプレン合成酵素変異体は、実施例に例示する通りに＋＋と評価される改良されたイソプレン合成酵素特性を有するポリペプチドポリペプチド（例えば、単離ポリペプチド）であってよい。実施例に例示する通りに＋＋とカラムに表記されたこれらのポリペプチドは、配列番号１（ＭＥＡウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素）と対応させて付番した残基位置に１つ以上の置換を有し得る。本発明の他の態様では、イソプレン合成酵素変異体は、実施例に例示する通りに＋と評価される改良されたイソプレン合成酵素特性を有するポリペプチド（例えば、単離ポリペプチド）であってよい。実施例に例示する通りに＋とカラムに表記されたこれらのポリペプチドは、配列番号１（ＭＥＡウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素）と対応させて付番した残基位置に１つ以上の置換を有し得る。
本発明の他の態様では、イソプレン合成酵素変異体は、イソプレン合成酵素特性が改良されており、配列番号１（ＭＥＡウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素）に対応させて付番した残基位置の１箇所以上に置換を有し、実施例１１の表３１に示す通り、４と評価されるポリペプチド（例えば、単離ポリペプチド）であってよい。他の態様では、イソプレン合成酵素変異体は、イソプレン合成酵素特性が改良されており、配列番号１（ＭＥＡウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素）に対応させて付番した残基位置の３箇所以上に置換を有し、実施例１１の表３１に示す通り、３と評価されるポリペプチド（例えば、単離ポリペプチド）であってよい。他の態様では、イソプレン合成酵素変異体は、イソプレン合成酵素特性が改良されており、配列番号１（ＭＥＡウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素）に対応させて付番した残基位置の１箇所以上に置換を有し、実施例１１の表３１に示す通り、２と評価されるポリペプチド（例えば、単離ポリペプチド）であってよい。他の態様では、イソプレン合成酵素変異体は、イソプレン合成酵素特性が改良されており、配列番号１（ＭＥＡウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素）に対応させて付番した残基位置の１箇所以上に置換を有し、実施例１１の表３１に示す通り、１と評価されるポリペプチド（例えば、単離ポリペプチド）であってよい。
代表的な核酸
本発明のイソプレン合成酵素変異体をコードしている核酸は、本発明の範囲内で提供され、企図される。各種実施形態では、核酸は組み換え核酸である。例えば、一部の実施形態では、イソプレン合成酵素変異体の核酸は、組み換え核酸が、イソプレン合成酵素変異体と、別のポリペプチド（例えば、融合ポリペプチドの精製又は検出を容易にする、Ｈｉｓ−タグなどといった、ペプチド）の全て又は一部とを含む融合ポリペプチドをコードするよう、他のポリペプチドの全て又は一部をコードしている他の核酸に操作可能に連結させる。一部の実施形態では、組み換え核酸の一部又は全ては化学的に合成される。一部の態様では、核酸は異種核酸である。「異種核酸」とは、その核酸配列が同じホスト細胞内に自然に見出される別の核酸の配列と同一ではない核酸のことを意味する。
一部の実施形態では、核酸は、天然に生じるイソプレン合成酵素核酸に由来する少なくとも約５０、１００、１５０、２００、３００、４００、５００、６００、７００、又は８００以上連続する核酸を含む。一部の態様では、核酸は、野生型（すなわち、天然に生じる配列）イソプレン合成酵素核酸の配列と比較して１つ以上の変異を有する。一部の実施形態では、核酸は、イソプレン合成酵素の核酸の転写又は翻訳を増加させる変異（例えば、サイレント変異）を１箇所以上に有する。一部の実施形態では、核酸は、イソプレン合成酵素ポリペプチドをコードしている任意の核酸を縮重させた変異体である。
イソプレン合成酵素の核酸は、当業者に既知の標準法により、発現ベクターなどのベクターに組み込むことができる。イソプレン合成酵素、プロモーター、ターミネーター、並びに他の配列などの対象とする核酸を含むＤＮＡコンストラクトを連結し、これらを好適なベクターに挿入するのに使用される手法は、当該技術分野において周知である。加えて、ベクターは、既知の組み換え法（例えば、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのＧａｔｅｗａｙ法）により構築することができる。
一部の実施形態では、現在、天然に生じる細胞において観察されるよりもはるかに高濃度でイソプレン合成酵素の核酸を過剰発現させることが望ましい場合がある。核酸の過剰発現は、ポリペプチドをコードしている核酸を、マルチコピープラスミドに選択的にクローニングすることで、あるいはこれらの核酸を強誘導型の又は常時発現型のプロモータの制御下に配置することで、誘導することができる。所望のポリペプチドを過剰発現させる手法は、分子生物学領域で一般的で、かつ周知のものであり、その例は、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，２００１に見出すことができる。
経路に関係するポリペプチド例
上記の通り、ＤＸＰ経路及び／又はＭＶＡ経路の１つ以上のポリペプチドを、本開示に記載のイソプレン合成酵素変異体と組み合わせて使用して、イソプレン生産を増加させることができる。したがって、特定の態様では、ＭＶＡ経路に関係する１つ以上のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸は異種核酸である。他の態様では、ＭＶＡ経路に関係する１つ以上のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸は、内在性の核酸の複製である。本開示における任意の態様では、１つ以上のＭＶＡ経路に関係するポリペプチドは、（ａ）２分子のアセチル−ＣｏＡを縮合させてアセトアセチル−ＣｏＡを生成する酵素、（ｂ）アセトアセチル−ＣｏＡをアセチル−ＣｏＡと縮合させてＨＭＧ−ＣｏＡを生成する酵素（例えば、ＨＭＧシンターゼ）、（ｃ）ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸に変換する酵素、（ｄ）メバロン酸をしてリン酸化してメバロン酸５−リン酸を生成する酵素、（ｅ）メバロン酸５−リン酸をメバロン酸５−ピロリン酸に変換する酵素、（ｆ）メバロン酸５−リン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素、並びに（ｇ）イソペンテニルピロリン酸をジメチルアリールジホスフェートへと変換する酵素、から選択できる。本開示における任意の態様では、１つ以上のＭＶＡ経路に関係するポリペプチドは、（ａ）アセトアセチル−ＣｏＡをアセチル−ＣｏＡと縮合させてＨＭＧ−ＣｏＡを生成する酵素（例えば、ＨＭＧシンターゼ）、（ｂ）ＨＭＧ−ＣｏＡをメバロン酸へと変換する酵素、（ｃ）メバロン酸リン酸をメバロン酸５−リン酸に変換する酵素、（ｄ）メバロン酸５−リン酸をメバロン酸５−ピロリン酸に変換する酵素、並びに（ｅ）メバロン酸５−ピロリン酸をイソペンテニルピロリン酸に変換する酵素、から選択される。
本開示における任意の態様では、メバロン酸をリン酸化してメバロン酸５−リン酸を生成する酵素は、Ｍ．マゼイ・メバロン酸キナーゼ、ラクトバチルス・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ラクトバチルス・サケイ・メバロン酸キナーゼポリペプチド、酵母・メバロン酸キナーゼポリペプチド、サッカロミセス・セレビシエ・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス・メバロン酸キナーゼポリペプチド、ストレプトコッカス・ニューモニアエ・メバロン酸キナーゼポリペプチド、及びストレプトマイセス・メバロン酸キナーゼポリペプチド、又はストレプトマイセス・ＣＬ１９０メバロン酸キナーゼポリペプチドからなる群から選択できる。本開示における任意の態様では、メバロン酸をメバロン酸５−リン酸へとリン酸化する酵素はＭ．マゼイ・メバロン酸キナーゼである。
ＭＶＡ経路上流に関係するポリペプチド
ＭＶＡ経路の上流は、細胞内代謝により生産されるアセチルＣｏ−Ａを、（ａ）（ｉ）チオラーゼ活性又は（ｉｉ）アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素活性、（ｂ）ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素、及び（ｃ）ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素活性のいずれかの活性をもつポリペプチドの作用によりメバロン酸に変換する際の開始基質として利用する。まず始めに、チオラーゼ又はアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素（アセチル−ＣｏＡ及びマロニル−ＣｏＡを利用する）の作用によりアセチルＣｏ−ＡをアセトアセチルＣｏＡに変換する。次に、アセトアセチル−ＣｏＡは、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素の酵素作用により、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ（ＨＭＧ−ＣｏＡ）へと変換される。このＣｏ−Ａ誘導体をＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素により還元してメバロン酸を生成する。この反応は、メバロン酸経路によるイソプレノイド生産の律速段階となる。
ＭＶＡ経路上流に関係するポリペプチドの非限定例としては、アセチル−ＣｏＡアセチルトランスフェラーゼ（ＡＡ−ＣｏＡチオラーゼ）ポリペプチド、アセトアセチル−ＣｏＡシンターゼポリペプチド、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡシンターゼ（ＨＭＧ−ＣｏＡシンターゼ）ポリペプチド、３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素）ポリペプチドが挙げられる。ＭＶＡ経路上流のポリペプチドには、ＭＶＡ経路上流のポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド及び融合ポリペプチドが含まれる。ＭＶＡ経路上流に関係する代表的な核酸としては、ＭＶＡ経路上流に関係するポリペプチドの活性を少なくとも１つ有するポリペプチド、ポリペプチド断片、ペプチド、又は融合ポリペプチドをコードしている核酸が挙げられる。ＭＶＡ経路に関係する代表的なポリペプチド及び核酸としては、本明細書に記載されるような任意の生物資源から天然に生じるポリペプチド及び核酸が挙げられる。したがって、本開示では、ＭＶＡ経路上流関連性ポリペプチドをコードしている任意の遺伝子は、本発明において使用できることを企図する。
特定の実施形態では、Ｌ．グレイー、Ｅ．フェシウム、Ｅ．ガリナルム、Ｅ．カセリフラブス及び／又はＥ．フェーカリス由来の様々なｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子を、単独で、あるいはＭＶＡ経路上流関連性タンパク質をコードしている１つ以上の他のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子と組み合わせて選択することが、本発明の範囲内のものとして企図される。他の実施形態では、アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素の遺伝子は、（ｉ）３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ合成酵素（ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素）ポリペプチド及び３−ヒドロキシ−３−メチルグルタリル−ＣｏＡ還元酵素（ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素）ポリペプチドをコードしている１つ以上の他の遺伝子との組み合わせで本発明の範囲内のものとして企図される。したがって、特定の態様では、企図される遺伝子の任意の組み合わせを、本開示に記載される任意の手法により、組み換え細胞で発現させることができる。
国際公開出願第２００９／０７６６７６号、同第２０１０／００３００７号、及び同第２０１０／１４８１５０号に記載の、ＭＶＡ経路上流に関係するポリペプチドのその他の非限定例を、本開示に使用できる。
ｍｖａＥ及びｍｖａＳポリペプチドをコードしている遺伝子
特定の実施形態では、Ｌ．グレイー、Ｅ．フェシウム、Ｅ．ガリナルム、Ｅ．カセリフラブス及び／又はＥ．フェーカリス由来の様々なｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子を、単独で、あるいはＭＶＡ経路上流関連性タンパク質をコードしている１つ以上の他のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子と組み合わせて選択することが、本発明の範囲内のものとして企図される。Ｌ．グレイー、Ｅ．フェシウム、Ｅ．ガリナルム、Ｅ．カセリフラブス、及びＥ．フェーカリスでは、ｍｖａＥ遺伝子は、チオラーゼ及びＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の活性のいずれをも保有しているポリペプチドをコードする。実際に、ｍｖａＥ遺伝子産物は、真性細菌で見られる、ＩＰＰ生合成に関係する最初の二機能性酵素となるものであり、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素の第一例は、天然において他のタンパク質と融合していた（Ｈｅｄｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．２００２ Ａｐｒｉｌ；１８４（８）：２１１６〜２１２２）。それに対しｍｖａＳ遺伝子は、ＨＭＧ−ＣｏＡ合成酵素活性を有するポリペプチドをコードする。
したがって、組み換え細胞（例えば、大腸菌）は、Ｌ．グレイー、Ｅ．フェシウム、Ｅ．ガリナルム、Ｅ．カセリフラブス及び／又はＥ．フェーカリス由来のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子を１つ以上発現してメバロン酸を生成するよう設計することができる。１つ以上のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子をマルチコピープラスミドで発現させることもできる。プラスミドは高コピー数プラスミド、低コピー数プラスミド又は中程度コピー数プラスミドであってよい。あるいは、１つ以上のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子を宿主細胞の染色体に組み込むことができる。プラスミド上の、あるいは宿主細胞染色体の一部に組み込まれた、１つ以上のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子のいずれもの異種発現に際し、遺伝子発現は、誘導型プロモーター又は常時発現型プロモーターのいずれかにより駆動できる。プロモーターは、１つ以上のｍｖａＥ及びｍｖａＳ遺伝子の発現を強力に駆動することができ、弱く駆動することができ、あるいは中程度に駆動することができる。
本開示における任意の態様では、組み換え宿主細胞は、１種以上の１−デオキシ−Ｄ−キシルロース５−リン酸（ＤＸＰ）経路に関係するポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸を更に含み得る。一態様では、ＤＸＰ経路に関係するポリペプチドを１つ以上コードしている１つ以上の核酸は、異種核酸である。他の態様では、ＤＸＰ経路に関係する１種以上のポリペプチドをコードしている１つ以上の核酸は、内在性の核酸の複製である。特定の態様では、ＤＸＰ経路に関係するポリペプチドは、（ａ）１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸シンターゼ（ＤＸＳ）、（ｂ）１−デオキシ−Ｄ−キシルロース−５−リン酸リダクトイソメラーゼ（ＤＸＲ）、（ｃ）４−ジホスホシチジル−２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールシンターゼ（ＭＣＴ）、（ｄ）４−ジホスホシチジル−２−Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトールキナーゼ（ＣＭＫ）、（ｅ）２Ｃ−メチル−Ｄ−エリスリトール−２，４−シクロ二リン酸シンターゼ（ＭＣＳ）、（ｆ）１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−二リン酸シンターゼ（ＨＤＳ）、及び（ｇ）１−ヒドロキシ−２−メチル−２−（Ｅ）−ブテニル−４−二リン酸レダクターゼ（ＨＤＲ）からなる群から選択される。他の態様では、ＤＸＰ経路関連性ポリペプチドはＤＸＳである。
他の態様では、当業者は、Ｗｏｏｄ−Ｌｊｕｎｇｄａｈｌ経路の酵素を利用しない経路により、１分子のグルコースから３分子のアセチル−ＣｏＡを生成し得る、代替的な代謝過程を使用できる。その代わりに、特定の生物、特にビフィドバクテリウム属において見出されるホスホケトラーぜを使用する［例えば、Ｂｉｏｌｏｇｙ ｏｆ ｔｈｅ Ｐｒｏｋａｒｙｏｔｅｓ（ｅｄ．Ｌｅｎｇｅｌｅｒ，Ｄｒｅｗｓ ａｎｄ Ｓｃｈｌｅｇｅｌ）；Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９９９，ｐ．２９９〜３０１；Ｍｅｉｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．ｏｆ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，２００１，１８３：９，２９２９〜３６；Ｊｅｏｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２００７，１７：５，８２２〜８２９を参照されたい］。ホスホケトラーゼ酵素は、典型的な代謝で用いられるピルビン酸の酸化以外の経路により、キシルロース５−リン酸又はフルクトース６−リン酸からのアセチル−ＣｏＡ（リン酸アセチルを介する）の生成を行うことができる。ホスホケトラーゼポリペプチドを用いアセチルＣｏＡの生合成を増加させることで、メバロン酸経路上流に依存する生合成経路の生産性が向上し、メバロン酸の生合成が大幅に増加し、結果として、ＤＭＡＰＰ及びＩＰＰなどの下流のイソプレノイド前駆体分子の生合成を増加させることができる。標準法を使用し、ペプチドがＤ−フルクトース６−リン酸又はＤ−キシルロース５−リン酸をアセチル−Ｐへと変換する能力を測定することで、ポリペプチドがホスホケトラーゼペプチド活性を有するかを判断できる。次に、アセチル−Ｐはフェリルアセチルヒドロキサム酸（ferryl acetyl hydroxamate）へと変換され得る。この変換は、分光測定により検出可能である（Ｍｅｉｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔ．１８３：２９２９〜２９３６，２００１）。ペプチド活性を有するものとして同定されたポリペプチドであれば、本発明に使用するのに好適である。代表的なホスホケトラーゼ核酸としては、限定するものではないが、ラクトバチルス・ロイテリ、ビフィオバクテリアム・ロンガム、フェリモナス・バレアリカ、ペドバクター・サルタンス、ストレプトマイセス・グリセウス、及び／又はノカルディオプシス・ダッソンビレイから単離したホスホケトラーゼが挙げられる。
アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子
他の態様では、アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素の遺伝子（ａｋａ ｎｐｈＴ７）を使用できる。アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子は、マロニル−ＣｏＡ及びアセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡを合成する活性を有し、かつ２分子のアセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡを合成する活性は最小限である（例えば、非活性である）酵素をコードしている遺伝子である。例えば、Ｏｋａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ Ｖｏｌ １０７，Ｎｏ．２５，ｐｐ．１１２６５〜１１２７０（２０１０）を参照されたい。この文献中のｎｐｈＴ７に関する教示は、本開示に明確に援用される。日本国特許公開第２００８−６１５０６（Ａ）号及び米国特許出願公開第２０１０／０２８５５４９号には、放線菌のストレプトマイセス属ＣＬ１９０株のアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子が記載されている。アセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素も、アセチルＣｏＡ：マロニルＣｏＡアシル基転移酵素として参照され得る。使用することのできる代表的なアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素（又はアセチルＣｏＡ：マロニルＣｏＡアシル基転移酵素）としては、Ｇｅｎｂａｎｋ ＡＢ５４０１３１．１が挙げられる。
本開示に記載の任意の態様又は実施例では、マロニル−ＣｏＡ及びアセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡを合成する能力を有する酵素を使用できる。本開示に記載の特定の実施形態では、マロニル−ＣｏＡ及びアセチル−ＣｏＡからアセトアセチル−ＣｏＡを合成する能力を有する放線菌のストレプトマイセス属から誘導されるアセトアセチル−ＣｏＡ合成酵素遺伝子を使用できる。
代表的な宿主細胞
本開示において請求される手法により、各種宿主細胞を用い、イソプレン合成酵素変異体を発現することのできる組み換え宿主細胞を生成し、イソプレンを生産することができる。宿主細胞は、天然にイソプレンを生産する細胞であっても、あるいは天然には生産しない細胞であってもよい。一部の実施形態では、宿主細胞はＤＸＰ経路を使用して天然にイソプレンを生成する細胞であり、この経路を使用したイソプレンの生成を促進するために、イソプレン合成酵素、ＤＸＰ経路ポリペプチド（例えば、ＤＸＳ）、及び／又はＩＤＩ核酸が加えられる。一部の実施形態では、宿主細胞はＭＶＡ経路を使用して天然にイソプレンを生成する細胞であり、この経路を使用したイソプレンの生成を促進するために、イソプレン合成酵素及び／又はＭＶＡ経路に関係する核酸が１つ以上加えられる。一部の実施形態では、宿主細胞はＤＸＰ経路を使用して天然にイソプレンを生成する細胞であり、ＭＶＡ経路及びＤＸＰ経路の一部又は全体を使用してイソプレンを生成するために、ＭＶＡ経路に関係した核酸が１つ以上加えられる。一部の実施形態では、宿主細胞は、ＤＸＰ及びＭＶＡ経路の両方を使用して天然にイソプレンを生成する細胞であり、これらの経路の一方又は両方によるイソプレンの生成を促進するために、イソプレンシンターゼ核酸、ＤＸＳ核酸、ＩＤＩ核酸、又はＭＶＡ経路に関係する核酸が１つ以上加えられる。
一部の実施形態では、宿主細胞は、サッカロミセス属、シゾサッカロミセス属、ピキア属、カンジダ属又はＹ．リポリィティカなどの酵母である。
一部の実施形態では、宿主細胞は、Ｂ．リケノフォルミス（B. lichenoformis）又は枯草菌などのバチルス株、Ｐ．シトレアなどのパントエア株、Ｐ．アルカリゲネスなどのシュードモナス属株、Ｓ．リビダンス又はＳ．ルビギノーサスなどのストレプトマイセス株、大腸菌などのエシェリキア株、エンテロバクター株、ストレプトコッカス株、メタノサルシナ・マゼイなどの古細菌株、又はＣ．グルタニカムなどのコリネバクテリウム株である。
本明細書で使用するとき、「バチルス」属としては、当業者に既知の「バチルス属」のすべての種を包含し、限定するものではないが、例えば、枯草菌、Ｂ．リケニフォルミス、Ｂ．レンタス、Ｂ．ブレービス、Ｂ．ステアロサーモフィルス、Ｂ．アルカロフィルス（B. alkalophilus）、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．クラウシイ、Ｂ．ハロデュランス、Ｂ．メガテリウム、Ｂ．コアグランス、Ｂ．サークランス、Ｂ．ロータス、及びＢ．チューリンゲンシスが挙げられる。バチルス属は分類上の再編成を受け続けるものと認識される。したがって、再分類された種を含む属としては、限定するものではないが、現在「ゲオバチルス・ステアロサーモフィルス」として命名されているＢ．ステアロサーモフィルスなどの生物が包含されるものと意図する。酸素の存在下での耐性内生胞子の生産を行うという特徴は、バチルス属を定義する特徴であると考えられるものの、この特徴は、近年アリサイクロバチルス、アムピバチルス、アネウリニバチルス、アノキシバチルス、ブレビバチルス、フィロバチルス、グラシリバチルス、ハロバチルス、パエニバチルス、サリバチルス（Salibacillus）、サーモバチルス、ウレイバチルス、及びバルジバチルスと呼ばれる微生物にも当てはまる。
一部の実施形態では、宿主細胞は、グラム陽性細菌である。非限定的な例としては、ストレプトマイセス株（例えば、Ｓ．リビダンス、Ｓ．コエリカラー、又はＳ．グリセウス）及びバチルス株が挙げられる。一部の実施形態では、生物資源は、大腸菌又はシュードモナス属などのグラム陰性細菌である。
一部の態様では、宿主細胞は植物であり、例えば、マメ科、例えばマメ亜科（Faboideae）などの植物である。一部の態様では、生物資源はクズ、ポプラ（例えば、ウラジロハコヤナギ又はウラジロハコヤナギｘトレムラＣＡＣ３５６９６など）、ヤマナラシ（例えば、アメリカヤマナラシ）、又はヨーロッパナラである。
一部の態様では、宿主細胞は、藻類、例えば緑藻、紅藻、灰色藻、クロララクニオン藻、ミドリムシ目、クロミスタ、又は渦鞭毛藻類である。
一部の実施形態では、宿主細胞はラン藻であり、例えば、形態学的に次の群：クロオコッカス、プレウロカプサ、オスシラトリアルス（Oscillatoriales）、ネンジュモ、又はスティゴネマのいずれかに分類されるラン藻などが挙げられる。
一部の実施形態では、宿主細胞は嫌気性細菌である。「嫌気性細菌」は増殖の際に酸素を必要としない微生物である。嫌気性微生物は、偏性嫌気性細菌、通性嫌気性細菌、又は耐気性細菌であり得る。これらの微生物は、上掲のバクテリア、及び酵母などの任意の微生物であり得る。「偏性嫌気性細菌」は、大気中酸素濃度で死に至る、嫌気性細菌である。「偏性嫌気性細菌」の例としては、限定するものではないが、クロストリジウム、ユーロバクテリウム（Eurobacterium）、バクテロイデス、ペプトストレプトコッカス、ブチリバクテリウム（Butyribacterium）、ベイロネラ、及びアクチノマイセスが挙げられる。一実施形態では、「偏性嫌気性細菌」はクロストリジウム・リュングダリイ、クロストリジウム・オートエタノジナム（Clostridium autoethanogenum）、ユウバクテリウム・リモサム、クロストリジウム・カルボキシジボランス（Clostridium carboxydivorans）、ペプトストレプトコッカス・プロダクツス（Peptostreptococcus productus）、及びブチルバクテリウム・メチロトロフィカム（Butyribacterium methylotrophicum）からなる群から選択されるいずれか１種、あるいはこれらの組み合わせであってよい。「通性嫌気性細菌」は、酸素の存在下で好気性呼吸を行うことができ、かつ酸素の制限下又は酸素非存在下では嫌気性の発酵を行うことのできる嫌気性細菌である。通性嫌気性細菌の例としては、限定するものではないが、エシェリキア、パントエア、酵母、並びにヤロウイアが挙げられる。
一部の実施形態では、宿主細胞は光合成細菌である。他の実施形態では、宿主細胞は非光合成細菌である。
使用することのできる他の代表的な宿主細胞は、米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号、国際公開第２００９／０７６６７６号、同第２０１０／００３００７号、同第２００９／１３２２２０号、同第２０１０／０３１０６２号、同第２０１０／０３１０６８号、同第２０１０／０３１０７６号、同第２０１０／０３１０７７号、及び国同第２０１０／０３１０７９号に記載されている。
代表的な形質転換方法
イソプレン合成酵素、ＤＸＳ、ＩＤＩ、及び／又はＭＶＡ経路の核酸又はこれらの核酸を収容しているベクターは、これらの核酸にコードされているイソプレン合成酵素、ＤＸＳ、ＩＤＩ、及び／又はＭＶＡ経路に関係するポリペプチドを発現させる際、標準的な発現法を用い、宿主細胞（例えば、バクテリア細胞）に挿入することができる。宿主細胞へのＤＮＡコンストラクト又はベクターの導入は、形質転換、電気穿孔法、核酸のマイクロインジェクション、形質導入、形質移入（例えば、リポフェクションを利用した又はＤＥＡＥ−デキストリンを利用した形質移入、あるいは組み換えファージウイルスを用いた形質移入）、リン酸カルシウムＤＮＡ沈殿法を用いるインキュベーション、ＤＮＡコートした微粒子銃による高速導入、及びプロトプラストの融合などの手法により実施できる。一般的な形質転換法は、当該技術分野において既知である（例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（ｅｄｓ）Ｃｈａｐｔｅｒ ９，１９８７；Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，３ｒｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，２００１；並びにＣａｍｐｂｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒ Ｇｅｎｅｔ，１６：５３〜５６，１９８９を参照されたい。これらの開示は、それぞれ参照によりその全体が組み込まれ、特に形質転換法に関して組み込まれる）。導入された核酸は、染色体ＤＮＡに組み込むことができ、又は染色体外の複製配列として維持することができる。
使用することのできる他の代表的な形質転換法は、米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号、国際公開第２００９／０７６６７６号、同第２０１０／００３００７号、同第２００９／１３２２２０号、同第２０１０／０３１０６２号、同第２０１０／０３１０６８号、同第２０１０／０３１０７６号、同第２０１０／０３１０７７号、及び国際公開第２０１０／０３１０７９号に記載されている。
代表的な細胞培養培地
宿主細胞を培養するにあたり任意の炭素源を使用することができる。用語「炭素源」は、宿主細胞又は生物により代謝することのできる、１つ以上の炭素を含有している化合物を指す。例えば、宿主細胞を培養するにあたり使用される細胞培地には、宿主細胞の生存能を維持させる又は宿主細胞を増殖させるのに好適な任意の炭素源を包含させることができる。
一部の実施形態では、炭素源は炭水化物（単糖、二糖、オリゴ糖、又は多糖など）、転化糖（例えば、酵素により処理したスクロースシロップ）、グリセロール、グリセリン（例えば、バイオディーゼル又は石鹸の製造工程で生成される副産物のグリセリン）、ジヒドロキシアセトン、Ｃ１化合物からなる炭素源、脂肪酸（例えば、飽和脂肪酸、不飽和脂肪酸、又は多価不飽和脂肪酸）、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、ポリペプチド（例えば、微生物又は植物タンパク質又はペプチド）、再生可能な炭素源（例えば、加水分解したバイオマス由来の炭素源、甜菜糖又はサトウキビ廃糖蜜などのバイオマスに由来する炭素源）、酵母エキス、酵母エキス由来の成分、ポリマー、酸、アルコール、アルデヒド、ケトン、アミノ酸、コハク酸エステル、乳酸塩、酢酸塩、エタノール、又はこれらのうちの任意の２つ以上の組み合わせである。一部の実施形態では、炭素源は、限定するものではないが、グルコースなどの光合成生成物である。
単糖の例としては、グルコース及びフルクトースが挙げられ、オリゴ糖の一例としては、ラクトース及びスクロースが挙げられ、並びに多糖の例としては、デンプン及びセルロースが挙げられる。代表的な糖としては、六炭糖（例えば、フルクトース、マンノース、ガラクトース、又はグルコース）及び五炭糖（例えば、キシロース又はアラビノース）が挙げられる。一部の実施形態では、細胞培地は、糖、並びに糖以外の炭素源（例えば、グリセロール、グリセリン、ジヒドロキシアセトン、Ｃ１化合物、脂肪酸、脂質、リン脂質、グリセロ脂質、モノグリセリド、ジグリセリド、トリグリセリド、再生可能な炭素源、又は酵母エキス由来の成分）を含有する。一部の実施形態では、細胞培地は、糖、並びにポリペプチド（例えば、微生物由来又は植物由来タンパク質又はペプチド）を含有する。一部の実施形態では、微生物由来ポリペプチドは、酵母又はバクテリア由来のポリペプチドである。一部の実施形態では、植物ポリペプチドは、大豆、トウモロコシ、セイヨウアブラナ、タイワンアブラギリ、パーム、落花生、ヒワマリ、ココナツ、カラシナ、ナタネ、綿実、パーム核、オリーブ、ベニバナ、胡麻、又は亜麻仁由来のポリペプチドである。
一部の実施形態では、糖濃度は、ブロス１Ｌ当たり、少なくとも約５グラム以上であり（５ｇ／Ｌ、ここで、ブロスの体積には、細胞培地の体積及び細胞体積を包含する）、例えば、少なくとも約１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、１５０、２００、３００、又は４００ｇ／Ｌ以上である。一部の実施形態では、糖濃度は、約５０〜約４００ｇ／Ｌであり、例えば、約１００〜約３６０ｇ／Ｌ、約１２０〜約３６０ｇ／Ｌ、又は約２００〜約３００ｇ／Ｌである。一部の実施形態では、この糖濃度には、宿主細胞の培養前及び／又は培養中に添加された糖の総量が含まれる。
代表的な脂質は、Ｃ４脂肪酸を１つ以上含有している任意の物質であり、なかでも飽和、不飽和、又は分岐型脂肪酸である。
代表的な脂肪酸としては、式Ｒ−ＣＯＯＨの化合物が挙げられ、ここで、「Ｒ」は炭化水素である。代表的な不飽和脂肪酸としては、「Ｒ」が炭素−炭素二重結合を少なくとも１つ含有する化合物が挙げられる。代表的な不飽和脂肪酸としては、限定するものではないが、オレイン酸、バクセン酸、リノール酸、パルミトエライジン酸、及びアラキドン酸が挙げられる。代表的なポリ不飽和脂肪酸としては、「Ｒ」が炭素−炭素二重結合を複数含有する化合物が挙げられる。代表的な飽和脂肪酸としては、「Ｒ」が飽和脂肪族基である化合物が挙げられる。一部の実施形態では、炭素源には、Ｃ１２飽和脂肪酸、Ｃ１４飽和脂肪酸、Ｃ１６飽和脂肪酸、Ｃ１８飽和脂肪酸、Ｃ２０飽和脂肪酸、又はＣ２２飽和脂肪酸などのＣ１２〜Ｃ２２脂肪酸が１種以上含有される。代表的な実施形態では、脂肪酸はパルミチン酸である。一部の実施形態では、炭素源は脂肪酸塩（例えば、不飽和脂肪酸）、脂肪酸誘導体（例えば、不飽和脂肪酸）、又は脂肪酸誘導体の塩（例えば、不飽和脂肪酸）である。好適な塩としては、限定するものではないが、リチウム塩、カリウム塩、ナトリウム塩、及びこれに類するものなどが挙げられる。ジ−及びトリグリセロールはグリセロールの脂肪酸エステルである。
一部の実施形態では、脂質、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリド、又はトリグリセリド濃度は、ブロス１Ｌ当たり、少なくとも約１グラム以上であり（１ｇ／Ｌ、ここで、ブロスの体積には、細胞培地の体積及び細胞体積を包含する）、例えば、少なくとも約５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、１５０、２００、３００、又は４００ｇ／Ｌ以上である。一部の実施形態では、脂質、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリド、又はトリグリセリドの濃度は、約１０〜約４００ｇ／Ｌであり、例えば、約２５〜約３００ｇ／Ｌ、約６０〜約１８０ｇ／Ｌ、又は約７５〜約１５０ｇ／Ｌである。一部の実施形態では、濃度には、宿主細胞の培養前及び／又は培養中に添加した脂質、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリド、又はトリグリセリドの総量が含まれる。一部の実施形態では、炭素源は、（ｉ）脂質、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリド、又はトリグリセリド、及び（ｉｉ）グルコースなどの糖を両方含有する。一部の実施形態では、脂質、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリド、又はトリグリセリドの、糖に対する比率は、炭素基準で約１：１（すなわち、脂質、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリド、又はトリグリセリドは糖炭素毎に１つずつ）である。特定の実施形態では、脂質、脂肪酸、モノグリセリド、ジグリセリド、又はトリグリセリドの量は、約６０〜１８０ｇ／Ｌ、糖質の量は約１２０〜３６０ｇ／Ｌである。
代表的な微生物ポリペプチド炭素源としては、酵母又はバクテリア由来の１種以上のポリペプチドが挙げられる。代表的な植物ポリペプチドの炭素源としては、大豆、トウモロコシ、キャノーラ、タイワンアブラギリ、パーム、落花生、ヒワマリ、ココナツ、カラシナ、ナタネ、綿実、パーム核、オリーブ、ベニバナ、胡麻又は亜麻仁由来の一種以上のポリペプチドが挙げられる。
代表的な再生可能な炭素源としては、乳清浸透液、コーンスティープリカー、甜菜廃糖蜜、大麦モルト、及び前述のいずれか由来の成分が挙げられる。また、代表的な再生可能な炭素源としては、トウモロコシ、スイッチグラス、サトウキビ、発酵工程に関係する細胞廃棄物、及び大豆、トウモロコシ、若しくは小麦の粉砕に由来するタンパク質副生成物などのバイオマス中に存在する、グルコース、ヘキソース、ペントース及びキシロースも挙げられる。いくつかの実施形態では、バイオマス炭素源はリグノセルロース、ヘミセルロース、又はセルロース材料であり、例えば、草、小麦、小麦わら、バガス、サトウキビバガス、軟質木材パルプ、トウモロコシ、トウモロコシの芯又は皮、トウモロコシ穀粒、トウモロコシ穀粒の繊維、トウモロコシ茎葉、スイッチグラス、籾殻製品、又は穀粒（トウモロコシ、ソルガム、ライ麦、ライ小麦、大麦、小麦、及び／又は醸造かす）の湿式若しくは乾式粉砕による副生成物が挙げられるが、これらに限定されない。代表的なセルロース材料には、木、紙及びパルプ廃棄物、草質植物、及び果実パルプが挙げられる。いくつかの実施形態では、炭素源には、茎、穀粒、根、又は塊茎などの任意の植物部分が挙げられる。一部の実施形態では、次のいずれかの植物：トウモロコシ、小麦、ライ麦、ソルガム、ライ小麦、米、キビ、大麦、キャッサバ、マメ科植物、例えば、豆及び豌豆、ジャガイモ、サツマイモ、バナナ、サトウキビ、及び／又はタピオカの、一部又は全体を炭素源として使用する。いくつかの実施形態では、炭素源は、キシロースとグルコースの両方を含むか、スクロースとグルコースの両方を含むバイオマス加水分解産物などの、バイオマス加水分解産物である。
一部の実施形態では、細胞培養培地に加える前に、再生可能な炭素源（バイオマスなど）を前処理する。一部の実施形態では、前処理としては、酵素処理、化学処理、あるいは酵素及び化学処理の両方の組み合わせが挙げられる（例えば、Ｆａｒｚａｎｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９６（１８）：２０１４〜２０１８，２００５；米国特許第６，１７６，１７６号；同第６，１０６，８８８号を参照されたい）。一部の実施形態では、再生可能な炭素源は、細胞培養培地に加える前に一部又は完全に加水分解する。
一部の実施形態では、再生可能な炭素源（トウモロコシ茎葉など）は、細胞培養培地に加える前に、アンモニア爆砕（ＡＦＥＸ）による前処理を行う（例えば、Ｆａｒｚａｎｅｈ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ９６（１８）：２０１４〜２０１８，２００５を参照されたい）。ＡＦＥＸ前処理時には、再生可能な炭素源を、温和な温度（約６０〜約１００℃）、及び高圧（約２５０〜約３００ｐｓｉ（約１．７２〜約２．０７ＭＰａ））で液体無水アンモニアにより約５分処理する。次に、圧を急速に開放する。この手法では、リグニン可溶化、ヘミセルロース加水分解、セルロースの脱結晶化などの化学作用及び物理作用を組み合わせ、表面積を増大させることで、酵素によるセルロース及びヘミセルロースの発酵糖へのほぼ完全な変換を可能にする。ＡＦＥＸ前処理は、ほとんどすべてのアンモニアを回収し、再利用することができ、なおかつ残余は下流工程において微生物用の窒素源として役立つという利点を有する。同様に、洗浄流にはＡＦＥＸ前処理は必要とされない。したがって、ＡＦＥＸ処理後の乾燥物質の回収率は実質的に１００％である。ＡＦＥＸは、乾燥対乾燥プロセスを基本とする。処理後の再生可能な炭素源は、長期にわたって安定であり、酵素加水分解又は発酵工程時に固体充填量を非常に多くして供給できる。セルロース及びヘミセルロースは、ＡＦＥＸ工程でほとんど又は全く分解されずに良好に保存される。ＡＦＥＸ前処理後の再生可能な炭素源は、酵素加水分解する前に中和する必要はない。ＡＦＥＸ処理後に炭素源を酵素加水分解し、混じりけのない糖ストリームを生成し、続いてこれを発酵に使用する。
一部の実施形態では、炭素源（例えば、再生可能な炭素源）濃度は、少なくとも又は約０．１、０．５、１、１．５ ２、３、４、５、１０、１５、２０、３０、４０、又は５０％グルコース（ｗ／ｖ）に相当する。グルコース等量は、参照としてグルコースを用い、炭素源から生成されたグルコース量を測定する、標準的ＨＰＬＣ法によって割り出すことができる。一部の実施形態では、炭素源（例えば、再生可能な炭素源）濃度は、約０．１〜約２０％グルコース、例えば、約０．１〜約１０％グルコース、０．５〜約１０％グルコース、約１〜約１０％グルコース、約１〜約５％グルコース、又は約１〜約２％グルコースに相当する。
一部の実施形態では、炭素源には、酵母エキス又は酵母エキスに含まれる１種以上の成分が含まれる。一部の実施形態では、糖濃度は、ブロス１Ｌ当たり、少なくとも約１グラム以上であり（１ｇ／Ｌ、ここで、ブロスの体積には、細胞培地の体積及び細胞体積を包含する）、例えば、少なくとも約５、１０、１５、２０、３０、４０、５０、６０、８０、１００、１５０、２００、又は３００／Ｌ以上である。一部の実施形態では、酵母エキスの濃度は約１〜約３００ｇ／Ｌであり、例えば、約１〜約２００ｇ／Ｌ、約５〜約２００ｇ／Ｌ、約５〜約１００ｇ／Ｌ、又は約５〜約６０ｇ／Ｌである。一部の実施形態では、この酵母エキス濃度には、宿主細胞の培養前及び／又は培養中に添加された酵母エキスの総量が含まれる。一部の実施形態では、炭素源には、酵母エキス（又は酵母エキスに含まれる１種以上の成分）及び他の炭素源、例えばグルコースの両方を含む。一部の実施形態では、酵母エキス対他の炭素源の比は、約１：５、約１：１０、又は約１：２０（ｗ／ｗ）である。
これに加え、炭素源には、炭酸ガス、又はメタノールなどのＣ１化合物からなる基質も含まれる。メチロトローフ酵母（Ｙａｍａｄａ ｅｔ ａｌ．，Ａｇｒｉｃ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，５３（２）５４１〜５４３，１９８９）及びバクテリア（Ｈｕｎｔｅｒ ｅｔ．ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，２４，４１４８〜４１５５，１９８５）により、Ｃ１化合物基質（例えば、メタノール、ホルムアルデヒド、又はギ酸）からグリセロールが生成されることも報告されている。これらの生物は、メタンをギ酸に酸化して、Ｃ１化合物を同化し、グリセロールを生成できる。炭素の同化経路は、リブロースモノリン酸、セリン、又はキシルロース−モノリン酸を介するものであり得る（Ｇｏｔｔｓｃｈａｌｋ，Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｍｅｔａｂｏｌｉｓｍ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ｓｐｒｉｎｇｅｒ−Ｖｅｒｌａｇ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８６，参照により全体を、特に炭素源に関する記載を本開示に組み込む）。リブロースモノリン酸経路は、ギ酸をリブロース−５−リン酸と縮合させて、六炭糖のフルクトースを生成し、最終的には、三炭糖生成物であるグリセルアルデヒド−３−リン酸を生成する。同様に、セリン経路では、Ｃ１化合物をメチレンテトラヒドロ葉酸により同化し、解糖系に送り込む。
メチロトローフは、Ｃ１及びＣ２基質に加え、数多くのその他の炭素含有化合物を、例えば、メチルアミン、グルコサミン、及び代謝活性に関係する数多くのアミノ酸を利用することも知られている。例えば、メチロトローフ酵母は、メチルアミンに含まれる炭素を利用し、トレハロース又はグリセロールを生成することが知られている（Ｂｅｌｌｉｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｉｃｒｏｂ．Ｇｒｏｗｔｈ Ｃｌ Ｃｏｍｐｄ．，Ｉｎｔ．Ｓｙｍｐ．，７ｔｈ ｅｄ．，４１５〜３２．Ｅｄｉｔｏｒｓ：Ｍｕｒｒｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，Ｐｕｂｌｉｓｈｅｒ：Ｉｎｔｅｒｃｅｐｔ，Ａｎｄｏｖｅｒ，ＵＫ，１９９３）。同様にして、数多くの種類のカンジダが、アラニン又はオレイン酸を代謝する（Ｓｕｌｔｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ａｒｃｈ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１５３（５），４８５〜９，１９９０）。
一部の実施形態では、細胞は、生理的塩類及び栄養分を含有している標準培地で培養する（例えば、Ｐｏｕｒｑｕｉｅ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ ｏｆ Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ，ｅｄｓ．Ａｕｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，ｐｐ．７１〜８６，１９８８；ａｎｄ Ｉｌｍｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ａｐｐｌ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．６３：１２９８〜１３０６，１９９７を参照されたい）。代表的な増殖培地は、ルリア−ベルターニ（ＬＢ）ブロス、サブローデキストロース（ＳＤ）ブロス、又は酵素培地（ＹＭ）ブロスなどの一般的な商業的に製造された培地である。微生物学又は発酵科学に関係する当業者には、使用することのできるその他の制限培地又は合成増殖培地、並びに特定の宿主細胞の増殖に好適な培地は知られているであろう。
細胞培地は、適当な炭素源以外に、適当なミネラル、塩類、補因子、バッファー、及び培養の増殖又はイソプレン生成の促進に適した当業者には周知の他の成分を含むことが望ましい（例えば、国際特許出願公開第２００４／０３３６４６号及び当該明細書の引用文献、並びに国際特許出願公開第９６／３５７９６号及び当該明細書の引用文献を参照）。イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、及び／又はＭＶＡ経路の核酸が誘導性プロモーターの制御下にあるような一部の実施形態では、イソプレンシンターゼ、ＤＸＳ、ＩＤＩ、及び／又はＭＶＡ経路ポリペプチドの発現を誘導するうえで有効な濃度で、誘導剤（例えば、糖、金属塩又は抗微生物剤など）を培地に加えることが望ましい。一部の実施形態では、細胞培地には、ＤＸＳ、ＩＤＩ、又はＭＶＡ経路に関係する１つ以上の核酸を有するベクター上の抗生物質耐性核酸（カナマイシン耐性核酸など）に対応した抗生物質（カナマイシンなど）を含有させる。
使用することのできる他の代表的な細胞培養培地は、米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号、国際公開第２００９／０７６６７６号、同第２０１０／００３００７号、同第２００９／１３２２２０号、同第２０１０／０３１０６２号、同第２０１０／０３１０６８号、同第２０１０／０３１０７６号、同第２０１０／０３１０７７号、同第２０１０／０３１０７９号に記載されている。
代表的なイソプレン生産法
一部の実施形態では、イソプレン生産条件下で細胞を培養培地で培養する。一部の実施形態では、培養時に細胞が生産するイソプレン量は、１時間につき、細胞の湿潤重量１ｇ当たり、約１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、又は５，０００ナノモル（ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ）以上である。一部の実施形態では、イソプレンの量は、約２〜約５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、例えば、約２〜約１００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約１００〜約５００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約１５０〜約５００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約５００〜約１，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、約１，０００〜約２，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ、又は約２，０００〜約５，０００ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒである。ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ単位のイソプレンの量は、米国特許第５，８４９，９７０号に開示の通りに測定できる。例えば、ヘッドスペース２ｍＬに含まれるイソプレン（例えば、密閉したバイアル瓶で、３２℃、２００ｒｐｍで振盪させながら約３時間培養した２ｍＬ培養物などの培養物から、ヘッドスペースに放出されたイソプレン）は、ｎ−オクタン／ｐｏｒａｓｉｌ Ｃカラム（Ａｌｌｔｅｃｈ Ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、Ｉｎｃ．（Ｄｅｅｒｆｉｅｌｄ、ＩＬ））を取り付け、ＲＧＤ２酸化水銀還元ガス検出器（Ｔｒａｃｅ Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ（Ｍｅｎｌｏ Ｐａｒｋ、ＣＡ））に連結させた等温操作系（８５℃）などの、一般的なガスクロマトグラフィー系を用い測定する（例えば、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ，Ａｔｍｏｓ．Ｅｎｖｉｒｏｎ．２７Ａ：２６８９〜２６９２，１９９３；Ｓｉｌｖｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｌａｎｔ Ｐｈｙｓｉｏｌ．９７：１５８８〜１５９１，１９９１を参照されたい）。標準イソプレン濃度をもとにした検量線により、ガスクロマトグラフィーの面積単位をイソプレン量（ｎｍｏｌ）に変換する。一部の実施形態では、細胞の湿潤重量（ｇ）当たりの値は、細胞培養物サンプルのＡ６００値を得、次に、Ａ６００値が既知である細胞培養物の湿潤重量に関する検量線をもとにＡ６００値を細胞重量（ｇ）に変換することで算出する。一部の実施形態では、細胞重量（ｇ）は、ブロス１Ｌ（細胞培地及び細胞を含む）のＡ６００値が１である場合、湿潤細胞が１ｇ含まれているものと仮定し、概算する。この値を、培養物をインキュベートした時間数（例えば３時間）で除算する。
一部の実施形態では、培養時に細胞が生産するイソプレン量は、１時間につき、細胞の湿潤重量１ｇ当たり、約１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、又は１００，０００ｎｇ（ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ）以上である。一部の実施形態では、イソプレン量は、約２〜約５，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、例えば、約２〜約１００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約１００〜約５００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約５００〜約１，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、約１，０００〜約２，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ、又は約２，０００〜約５，０００ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈである。イソプレン量（ｉｎ ｎｇ／ｇｗｃｍ／ｈ）は、上記のイソプレン生産量（ｎｍｏｌｅ／ｇｗｃｍ／ｈｒ）に６８．１を乗じることで算出できる（以下の式５に記載の通り）。
一部の実施形態では、細胞は、培養時に累積力価（総量）約１、１０、２５、５０、１００、１５０、２００、２５０、３００、４００、５００、６００、７００、８００、９００、１，０００、１，２５０、１，５００、１，７５０、２，０００、２，５００、３，０００、４，０００、５，０００、１０，０００、５０，０００、１００，０００ｍｇ／Ｌ（ブロス１Ｌ当たりの生産量（ｍｇ）。ここで、ブロス体積には、細胞体積及び細胞培地の体積を含む）以上のイソプレンを生産する。一部の実施形態では、イソプレン量は約２〜約５，０００ｍｇ／Ｌ、例えば、約２〜約１００ｍｇ／Ｌ、約１００〜約５００ｍｇ／Ｌ、約５００〜約１，０００ｍｇ／Ｌ、約１，０００〜約２，０００ｍｇ／Ｌ、又は約２，０００〜約５，０００ｍｇ／Ｌである。振盪フラスコ又は同様の培養装置におけるイソプレンの比生産量（ｍｇ／Ｌ）は、ＯＤ６００が約１．０の細胞培養物から試料を１ｍＬ採取し、２０ｍＬバイアル瓶に移し入れ、３０分インキュベートした後に、ヘッドスペース中のイソプレン量を測定することで、測定できる。ＯＤ６００が１．０でない場合、測定値は、ＯＤ６００により除算して、ＯＤ６００が１．０になるよう標準化できる。ヘッドスペースに含まれるイソプレン量（ｍｇ／Ｌ）に係数３８を乗じ、培養培地のＯＤ６００値をもとにした、１時間当たりのイソプレン生産量（ｍｇ／Ｌ（ブロス）／ｈｒ／ＯＤ６００）に変換することもできる。単位「ｍｇ／Ｌ（ブロス）／ｈｒ／ＯＤ６００」の値に、時間数とＯＤ６００値を乗じ、イソプレンｍｇ／Ｌ（ブロス）単位での累積力価を得ることもできる。
発酵槽の瞬間イソプレン生産速度（ｍｇ／Ｌ（ブロス）／ｈｒ）は、発酵槽で放出された気体試料を採取し、イソプレン量（気体１Ｌ当たりのイソプレン重量（ｍｇ）などの単位）を解析し、この値に、ブロス１Ｌにつき放出される気体速度（例えば、１時間当たりに６０Ｌの気体が放出されることを意味する１ｖｖｍ（気体体積／ブロス体積／分））を乗じることで測定することができる。したがって、気体の放出濃度が１ｍｇ／Ｌである場合、空気流１ｖｖｍ下での瞬間生産速度は６０ｍｇ／Ｌ（ブロス）／ｈｒに相当する。必要に応じて、単位ｍｇ／Ｌ（ブロス）／ｈｒの値をＯＤ６００により除算することで、ｍｇ／Ｌ（ブロス）／ｈｒ／ＯＤ単位で比速度を得ることもできる。イソプレンの平均放出濃度に、発酵時の発酵ブロス１Ｌ当たりの放出気体総量（off-gas sparged）を乗じることで、イソプレン／Ｌ（気体）の平均値を総生産物の生産性（発酵ブロス１Ｌ当たりのイソプレン重量，ｍｇ／（ブロス）Ｌ）に変換することもできる。したがって、イソプレンの平均放出濃度が０．５ｍｇ／（ブロス）Ｌ／ｈｒである場合、１ｖｖｍ下１０時間経過時の総生成物濃度は３００ｍｇ／（ブロス）Ｌに相当する。
一部の実施形態では、細胞は、培養時に、細胞培養培地に含まれる炭素の約０．００１５、０．００２、０．００５、０．０１、０．０２、０．０５、０．１、０．１２、０．１４、０．１６、０．２、０．３、０．４、０．５、０．６、０．７、０．８、０．９、１．０、１．２、１．４、又は１．６％以上をイソプレンに変換する。一部の実施形態では、炭素のイソプレンへの変換率は約０．００２〜約１．６％であり、例えば、約０．００２〜約０．００５％、約０．００５〜約０．０１％、約０．０１〜約０．０５％、約０．０５〜約０．１５％、０．１５〜約０．２％、約０．２〜約０．３％、約０．３〜約０．５％、約０．５〜約０．８％、約０．８〜約１．０％、又は約１．０〜約１．６％である。炭素のイソプレンへの変換率（「炭素収率（％）」とも呼ばれる）は、生産されたイソプレンに含まれる炭素原子のモル数を、炭素源（バッチ中の並びに供給したグルコース及び酵母エキスに含まれる炭素モル濃度）に含まれる炭素原子のモル数により除算することで測定できる。この数に１００％を乗じ、百分率を生成する（式１に示す通り）。
式１
炭素収率（％）＝（生産されたイソプレンに含まれる炭素のモル数）／（炭素源に含まれる炭素のモル数）＊１００
この計算式では、酵母エキスには５０重量％の炭素が含有されるものと仮定することができる。
式２
炭素収率（％）＝（３９．１ｇイソプレン＊１／６８．１ｍｏｌ／ｇ＊５Ｃ／ｍｏｌ）／［（１８１２２１ｇグルコース＊１／１８０ｍｏｌ／ｇ＊６Ｃ／ｍｏｌ）＋（１７７８０ｇ酵母エキス＊０．５＊１／１２ｍｏｌ／ｇ）］＊１００＝０．０４２％
当業者であれば、イソプレン生産速度又は生産されたイソプレン量は、容易に任意の単位に変換できる。単位を相互変換するための代表的な等式を以下に掲載する。
イソプレン生産速度単位（総生産量及び比生産量）
式３
１ｇイソプレン／Ｌブロス／ｈｒ＝１４．７ｍｍｏｌイソプレン／Ｌブロス／ｈｒ（合計容積流量）
式４
１ｎｍｏｌイソプレン／ｇｗｃｍ／ｈｒ＝１ｎｍｏｌイソプレン／Ｌブロス／ｈｒ／ＯＤ６００（この変換式では、ＯＤ６００の値が１のブロス１Ｌには、１ｇの湿潤細胞が含まれているものと仮定する）。
式５
１ｎｍｏｌイソプレン／ｇｗｃｍ／ｈｒ＝６８．１ｎｇイソプレン／ｇｗｃｍ／ｈｒ（イソプレンの分子量）
式６
１ｎｍｏｌイソプレン／Ｌガス中Ｏ２／ｈｒ＝９０ｎｍｏｌイソプレン／Ｌブロス／ｈｒ（培養ブロス１Ｌ当たりのＯ２流速９０Ｌ／ｈｒ）
式７
１μｇイソプレン／Ｌ放出ガス中イソプレン量＝６０μｇイソプレン／Ｌブロス／ｈｒ（流速６０Ｌガス／Ｌブロス）（１ｖｖｍ）
力価単位（合計単位及び比単位）
式８
１ｎｍｏｌイソプレン／１ｍｇ細胞タンパク質＝１５０ｎｍｏｌイソプレン／Ｌブロス／ＯＤ６００（この変換式では、ＯＤ６００値が１のブロス１Ｌに含まれる合計タンパク質量は約１５０ｍｇであると仮定する）（比生産性）
式９
１ｇイソプレン／Ｌブロス＝１４．７ｍｍｏｌイソプレン／Ｌブロス（合計力価）
必要に応じて、細胞の湿潤重量単位を細胞の乾燥重量単位へと変換する際に、式１０を使用することができる。
式１０
細胞乾燥重量＝（細胞湿潤重量）／３．３
本発明に包含される一部の実施例では、イソプレン合成酵素変異体のポリペプチドをコードしている異種核酸を含む細胞は、本質的に同様の条件下で、イソプレン合成酵素変異体ポリペプチドをコードしている核酸を含まない細胞を増殖させた場合の生産量の、少なくとも約２倍、３倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、又は４００倍以上の量に相当するイソプレンを生産する。
本発明に包含される一部の実施例では、イソプレン合成酵素変異体のポリペプチドと、ＤＸＳ、ＩＤＩ、及び／又はＭＶＡ経路関連性ポリペプチドのうちの１つ以上とをコードしている異種核酸を含む細胞は、本質的に同様の条件下で、異種核酸を含まない細胞を増殖させた場合の生産量の、少なくとも約２倍、３倍、５倍、１０倍、２５倍、５０倍、１００倍、１５０倍、２００倍、又は４００倍以上の量に相当するイソプレンを生産する。
代表的なイソプレン精製法
一部の実施形態では、本開示の任意の方法は、イソプレンを回収する工程を更に包含する。例えば、本発明の組成物及び方法を用い生産させたイソプレンを、ガス・ストリッピング、分画、吸着／脱着、浸透気化法、固相からのイソプレンの熱又は減圧脱着、又は固相に不動化又は吸収させたイソプレンの溶媒による抽出などの標準法を用い回収することができる（例えば、米国特許第４，７０３，００７号及び同第４，５７０，０２９号を参照されたい）。一部の実施形態では、イソプレンの回収には、液体イソプレン（イソプレンの未希釈溶液又はイソプレンの溶媒希釈液など）の単離を包含する。ガス・ストリッピングには、連続的な様式で、発酵による放出気流からイソプレン蒸気を除去することを包含する。このような除去は、いくつかの異なる方法で達成することができ、これには、固相への吸着、液相への分割、又は直接凝縮が挙げられるが、これらに限定されない。いくつかの実施形態では、蒸気の露点を上回る温度で希釈イソプレン蒸気ストリームの膜濃縮により、液体イソプレンの凝縮がもたらされる。一部の実施形態では、回収は、米国仮出願特許第６１／２８８，１４２号（２００９年１２月１８日出願）に記載の通りに実施する。
イソプレンの回収には、一工程又は複数工程を包含し得る。一部の実施形態では、発酵により生じた気体からのイソプレン蒸気の回収、及びイソプレンの液相への転換は同時に行う。例えば、放出される気体流から、イソプレンを直接液体へと凝縮させることができる。一部の実施形態では、発酵により生じた気体からのイソプレン蒸気の回収、及びイソプレンの液相への転換は連続的に行う。例えば、イソプレンを、固相に吸着させ、次に溶媒を用い固相から抽出することができる。
一部の実施形態では、本開示の任意の方法は、イソプレンの精製を更に包含する。例えば、本発明の組成物及び方法を用い生成したイソプレンを、標準法により精製することができる。精製とは、イソプレンを生成した際に存在している１種以上の成分から、イソプレンを分離する手法を指す。一部の実施形態では、イソプレンは実質的に純粋な液体として得られる。精製法の例としては（ｉ）抽出溶媒からの蒸留、及び（ｉｉ）クロマトグラフィーが挙げられる。本明細書で使用するとき、「精製イソプレン」は、イソプレンを生成した際に存在している１種以上の成分から分離したイソプレンを意味する。例えば、米国特許出願公開第２００９／０２０３１０２号、ＰＣＴ出願国際公開第２００９／０７６６７６号、米国特許出願第１２／４９６，５７３号を参照されたい。一部の実施形態では、イソプレンはイソプレンの生産時に存在する他の成分を少なくとも約２０重量％含んでいない。各種実施形態では、イソプレンの純度は、少なくとも又は約２５重量％、３０重量％、４０重量％、５０重量％、６０重量％、７０重量％、７５重量％、８０重量％、９０重量％、９５重量％、重量％又は９９重量％である。純度は、例えば、カラムクロマトグラフィー、ＨＰＬＣ分析、又はＧＣ−ＭＳ分析等の任意の適切な方法で分析することができる。
本明細書の上記のすべての刊行物及び特許は、参照により本開示に組み込まれる。本発明の範囲及び精神から逸脱せずとも、本発明に記載の方法及び系の様々な修正及び改変が、当業者には明白であろう。これまでに、本発明を、特定の実施形態に関連付けて記載したが、本発明は、特定の実施形態に不当に制限されるよう請求されるものではないことは理解されるべきである。本明細書に記載の各種実施形態に関する１つの、幾つかの、又は全ての特性は、本発明の他の実施形態と組み合わせることができることも理解されるであろう。本発明のこれらの態様及び他の態様は、当業者にとっては容易に理解されるであろう。
実験
以降の実施例は例示目的で提供され、更に特定の好ましい実施形態及び本発明の態様を示すものであり、発明の範囲を制限するよう解釈されるものではない。
以降の実験に関する記載では、次の略号を用いる：℃（セ氏温度）；ｒｐｍ（毎分回転）；Ｈ２Ｏ（水）；ｄｉＨ２Ｏ（脱イオン水）；ａａ及びＡＡ（アミノ酸）；ｂｐ（塩基対）；ｋｂ（キロ塩基対）；ｋＤ（キロダルトン）；ｇｍ（グラム）；μｇ及びｕｇ（マイクログラム）；ｍｇ（ミリグラム）；ｎｇ（ナノグラム）；μＬ及びｕＬ（マイクロリットル）；ｍＬ（ミリリットル）；ｍｍ（ミリメートル）；ｑｓ（十分な数量）；ｎｍ（ナノメートル）；μｍ及びｕｍ（マイクロメートル）；Ｍ（モル濃度）；ｍＭ（ミリモル濃度）；μＭ及びｕＭ（マイクロモル濃度）；ｐＭ（ピコモル濃度）；Ｕ（単位）；ＭＷ（分子量）；ｓｅｃ（秒）；ｍｉｎ（分）；ｈｒ（時間）；ＯＤ６００（６００ｎｍでの吸光度）；ＢＳＡ（ウシ血清アルブミン）；ＤＭＡＰＰ（ジメチルアリールジホスフェート）；ＤＴＴ（ジチオスレイトール）；ＥｔＯＨ（エタノール）；ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド）；イソプレン（２−メチル−１，３−ブタジエン）；ＩｓｐＳ（イソプレン合成酵素）；ＰＡＧＥ（ポリアクリルアミドゲル電気泳動）；ＰＢＳ（リン酸緩衝食塩水［１５０ｍＭ ＮａＣｌ、１０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ ７．２）］）；及びＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）。
以降の実験例で参照されることになる製品又はサービスを提供している企業に対し、次の略号を用いる：Ａｇｉｌｅｎｔ（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ、ＣＡ））；Ｂｅｃｔｏｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ，Ｉｎｃ．（Ｆｕｌｌｅｒｔｏｎ、ＣＡ））；Ｂｉｏ−Ｒａｄ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｈｅｒｃｕｌｅｓ、ＣＡ））；Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏ．（Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ））；ＣＴＣ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ（ＣＴＣ Ａｎａｌｙｔｉｃｓ Ａ．Ｇ．（Ｚｗｉｎｇｅｎ、Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ））；ＥＭＳ（Ｅｌｅｃｔｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｙ Ｓｕｐｐｌｙ（Ｈａｔｆｉｅｌｄ、ＰＡ））；Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ（Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））；Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｃｏｒａｌｖｉｌｌｅ、ＩＡ））；Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ．（Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ））；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ（Ｓｕｎｎｙｖａｌｅ、ＣＡ））；Ｎｏｖａｇｅｎ（Ｎｏｖａｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））；Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（Ｐｅｒｋｉｎ Ｅｌｍｅｒ（Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ））；Ｒｏｃｈｅ（Ｒｏｃｈｅ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｉｎｄｉａｎｏｐｏｌｉｓ、ＩＮ））；Ｓｉｇｍａ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ））；Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ））；Ｑｉａｇｅｎ（Ｑｉａｇｅｎ，Ｉｎｃ．（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ））；Ｔａｋａｒａ（Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ ＵＳＡ（Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ））；Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ（Ｔｈｏｍｓｏｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔ Ｃｏ．（Ｏｃｅａｎｓｉｄｅ、ＣＡ））；Ｖ＆Ｐ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ（Ｖ＆Ｐ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ，Ｉｎｃ．（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ））；ａｎｄ Ｚｉｎｓｓｅｒ（Ｚｉｎｓｓｅｒ Ｎｏｒｔｈ Ａｍｅｒｉｃａ（Ｎｏｒｔｈｒｉｄｇｅ、ＣＡ））。
以降の実施例は例示目的で提供するものであり、いかなる方法によっても本発明を制限することを意図しない。
実施例１．イソプレン合成酵素の増殖性スクリーニング：検証、最適化及び制限
本例は、改良されたイソプレン合成酵素変異体を選択するための、ｉｎ ｖｉｖｏスクリーニングの開発を記載する。本発明者らは、ｉｎ ｖｉｖｏでのスクリーニングを用いることで、対照（我々の場合、最も有効なイソプレン合成酵素ＭＥＡ−ポプラ・アルバ（Poplar Alba））と比べイソプレン合成酵素活性が劣る細胞を選別することができることを見出した。加えて、ｉｎ ｖｉｖｏでのスクリーニングを用いることで、対照（我々の場合、最も有効なイソプレン合成酵素ＭＥＡ−ポプラ・アルバ）と比べイソプレン合成酵素活性が優れている細胞を選別することもできる。
方法
細胞株：下流経路を常時発現しており、ｐＥＴプラスミドからイソプレン合成酵素変異体を発現している株をスクリーニングした。スクリーニングした株は、ＤＷ４２５陽性対照であった。
アッセイ条件：５０ｕＭカナマイシンを含有させたＬＢ培地で、細胞株を３４℃にて一晩増殖させた。１％グルコース、０．１％酵母エキス及び、８ｍＭ ＭｇＳＯ４、並びに次の濃度：０、１０、２０、３０、４０、５０、６０、又は７０ｕＭのうちのいずれかの濃度のＩＰＴＧを含有させたＴＭ３培地に、ＯＤ６００が約０．２になるよう、一晩培養物を希釈した。誘導後に細胞を約２時間増殖させ、各種濃度のメバロン酸（０、５、７．５、１０、１５、２０ｍＭ）と一晩培養に使用したものと同様の培地を含有させた９６ウェル透明底マイクロタイタープレートに移し、最終的にＯＤ６００が０．２〜０．３になるまで１日培養した。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ ＵＶ−Ｖｉｓ分光光度計を用い、動態解析モードでプレートを監視した。各測定（５分間隔）前に１分間振盪を行い、３４℃で３時間実験を監視した。
データ解析：すべてのデータはエクセルに移行した。吸光度の測定値を自然対数に変換した。「ＬＩＮＥＳＴ」関数を用い、連続的な曲線を作成し、対数増殖速度定数（増殖速度）を生成した。
代謝産物の解析は、以降に記載する、代謝産物（ＭＶＡ、ＤＸＰ）の小規模メタノール／水抽出プロトコルを用い実施した：
１．小規模実験に由来する試料をクエンチする；通常、１ｍＬ試料をスピンダウンし、上清を廃棄し、１００μＬ純メタノールをペレットに加え、代謝産物の抽出及び解析までの間、試料を−８０℃で保存した。
２．−８０℃の冷凍庫から試料を取り出した；ペレットを再懸濁した（ガラス製のキャピラリ管でペレットを破壊しておくことが推奨された）。
３．試料を、微量高速冷却遠心機で１４０００ｇ（ｒｆｃ）で４分スピンダウンした。
４．上清をきれいな１．５ｍＬエッペンドルフチューブに移した。
５．ペレットを１００μＬの６：１ＭｅＯＨ／５ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ（ｐＨ ８．０）に再懸濁した。１４０００ｇ（ｒｆｃ）で４分遠心した。対象とする代謝産物がｐＨ８．０で安定でない場合（例えば、ＤＸＰ代謝産物、又はＣｏＡ含有代謝産物）、試料は６：１ＭｅＯＨ／５ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ（ｐＨ ７．０）で抽出してもよい。
６．上清を、工程４より得た上清と組み合わせた。
７．工程５〜６を繰り返し、１００μＬ １：１ＭｅＯＨ／５ｍＭ ＮＨ４ＯＡｃ（ｐＨ８．０）（又は上記のように場合によりｐＨ７．０）で抽出する。上清を回収後、試料のペレットは廃棄してもよい。上清画分を集めた１．５ｍＬエッペンドルフチューブの蓋を閉め、抽出物をボルテックス処理し混合した。
８．懸濁されている細片を除去する目的で、１．５ｍＬエッペンドルフチューブを１４０００ｇ（ｒｆｃ）で４分遠心分離した。
９．円錐形の挿入口を備えるＬＣ／ＭＳバイアル瓶に、約２００μＬ抽出物を入れた。残りの抽出物を−２０℃で貯蔵した。
理論に束縛されるものではないが、２％ギ酸を分散させる際にはリピートピペットを使用することが推奨される（迅速にピペッティングし、容量を一定に保つため）。リピートピペットは、一般的なピペットと比べ時間効率に非常に優れており、かつ非常に正確であることから（かつ良好な目盛りを持ち適切に維持するものと考えられ、精密である）技術的に積極的に置き換えられている。更なる推奨としては、限定するものではないが、エッペンドルフチューブは可能な限り氷上（０℃）で保管し、微量遠心機は、遠心分離するサンプルを冷却するために、−９℃に設定し約２０分予冷却し、ペレットを再懸濁する際には、ガラス製キャピラリ管を使用すべきである。細胞ペレットの機械的破壊は、ほんの僅かに物理的補助を用い、非常に手早く行う。細胞塊が簡単にチューブの蓋の裏に貼り付いてしまい、試料の量が減ってしまい、有意な実験誤差を引き起こす可能性があることから、再懸濁したペレットをボルテックスにかけることは推奨されない。
理論に束縛されるものではないが、ＬＣ／ＭＳ解析の実施には以降の操作を推奨する：
１．ＬＣ／ＭＳバイアル瓶は、解析中４℃にてトレイに保管する。カラムは室温のものを用いる。Ｘｃａｌｉｂｕｒの手順開始後に、トレイ／カラム温度は自動的に設定され得るものの、トレイ温度は前もって設定しておくほうが好ましい。
２．スプレッドシートに記載の通りに調製した標準を較正用に使用する。標準を調製した日付を各チューブのラベルに記録する。
３．イソプレノイド及びＭＶＡ経路代謝産物を解析するＬＣ／ＭＳ法（現在では新製品のＴＳＱ Ｑｕａｎｔｕｍ Ａｃｃｅｓｓで行う）−方法ファイル：ＩＰＳ＿ＢｉｏＢａｓｉｃ１００＿０９０３１６（又は同様に、最新のデータ拡張を参照されたい）；ＨＰＬＣカラム：Ｍａｃｈｅｒｅｙ−Ｎａｇｅｌ Ｎｕｃｌｅｏｄｅｘ β−ＯＨ ＥＣ ２ｍｍ×１００ｍｍ（粒径５μｍ、粒径１００Å）、Ｃ／Ｎ ７２０３５１．２０；ガードカラム：７２１４６０．４０（現在では２ｍｍガードカラムは入手不可）。ＤＸＰ経路代謝産物用のＬＣ／ＭＳ法：Ｍｅｔｈｏｄ ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ Ｃ１８−ｉｏｎ ｐａｉｒ＼Ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ＿Ｃ１８＿ＴＢＡｉｐ＿１１、トリブチルアンモニウム・アセタートをイオン対試薬として用いる；ＨＰＬＣカラム：Ｃ１８ Ｐｈｅｎｏｍｅｎｅｘ Ｓｙｎｅｒｇｉ ４μ Ｈｙｄｒｏ−ＲＰ ８０Ａ １５０×２．０ｍｍ、Ｃ／Ｎ ００Ｆ−４３７５−Ｂ０；ガードカラム：セキュリティ・ガード・カートリッジＡＱ Ｃ１８ ４×２．０ｍｍ、Ｃ／Ｎ ＡＪ０−７５１０。ＣｏＡ含有代謝産物を検出するためのＬＣ／ＭＳ法については、「Ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ａｃｉｄｉｃ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｅｔａｂｏｌｉｔｅｓ ａｔ ｓｍａｌｌ−ｓｃａｌｅ（ＣｏＡｓ，ｅｔｃ．）．」を参照されたい。
４．解析後、試料は−２０℃で保管し、標準は−８０℃で保管する。
５．代謝産物の定量は、ＬＣＱｕａｎソフトウェア・パッケージにより容易に行うことができる。すべての希釈試料（最初のメタノールクエンチを含む）から逆算を行い、濃度はＯＤに対し基準化し、２００ ＯＤの発酵ブロス１Ｌに含まれる細胞内容積は約５０ｍＬであると仮定し、細胞内濃度に変換する。
結果
未知のタンパク質を発現するプラスミドプールから、ＤＭＡＰＰ利用酵素を選択するための系は、すでに開発されている（Ａｐｐｌ Ｅｎｖｉｒｏｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２００７ Ｏｃｔｏｂｅｒ；７３（１９）：６２７７〜６２８３）。本発明者らは、イソプレン合成酵素活性をもつ細胞を選別することのできるスクリーニングプロトコルを改良し、最適化した。選別は、大腸菌中のＤＭＡＰＰ濃度は細胞増殖速度に相関するとの結論を示す実験結果に基づくものである（図１）。したがって、理論に束縛されるものではないが、これらの細胞の増殖速度は、細胞内ＤＭＡＰＰ濃度についてのバイオセンサーと考えることができる。理論に束縛されるものではないが、この選別の原理は、ＤＭＡＰＰを消費する酵素（イソプレン合成酵素）の酵素活性を増加させることで、細胞内ＤＭＡＰＰ濃度が減少し、ひいては増殖速度が増加することになるというものである。
この仮説を試験するため、ＤＷ４２５細胞を、ＩＰＴＧ及びメバロン酸マトリックスを各種濃度で含有させた培地で増殖させた（図２及び図３）。ＩＰＴＧ濃度６０ｕＭ以上で増殖させた細胞は、メバロン酸を添加しなくとも増殖が減弱した（誘導を行なっていない細胞と比較）。ＩＰＴＧ濃度０〜５０μＭでは、誘導を行なっていない細胞と比較して増殖は減弱した。誘導を行なっていない細胞において、すべての濃度のメバロン酸で、細胞増殖は阻害された。選別したいずれかの所定のメバロン酸濃度に関し、ＩＰＴＧ濃度を増加させると、増殖速度が増加した（図２及び図３）。細胞の発現している酵素濃度が、ＩＰＴＧ添加濃度に相関するか判断するために、以前の研究を実施した。その結果、これらの株においてイソプレン合成酵素の発現／活性の増加により増殖性が改良された。
実施例２ ＤＭＡＰＰ毒性除去によるウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素ＳＥＬの解析
細胞内ＤＭＡＰＰ濃度の上昇と、大腸菌の増殖阻害との間には強い相関があり、この相関は、ウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素（ＩｓｐＳ）を発現させることで減弱させることができる。理論に束縛されるものではないが、ＩｓｐＳ活性が増強されると、ＤＭＡＰＰは、より迅速にイソプレンへと変換されるようになり、その結果増殖性が更に良好になるはずである。本発明者らは、これらの条件下で、ＩｓｐＳ変異体を発現している大腸菌の増殖速度を監視することで、細胞内でのＤＭＡＰＰのイソプレンへの変換能が改良されたＩｓｐＳ変異体を同定することができる。
方法：
１）プラスミド及び株の構築：
ＳＥＬプラスミド骨格−テンプレートｐＤｕ３９を用い、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ＰＣＲを行い、ＳＥＬ生成に使用するプラスミド骨格を構築した（プライマー配列については表１を参照されたい）。ＰＣＲ産物を１μＬ ＤｐｎＩ（Ｒｏｃｈｅ）で３時間処理し、次に製造元の推奨するプロトコルに従い、１μＬの全反応物を用い、化学的な形質転換に対し受容能のある大腸菌Ｔｏｐ１０ ｃｅｌｌｓ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換させた。細胞を回収し、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有させたＬＢ培地に播種した。翌日、増殖性が陽性のコロニーを選別し、プラスミド精製（Ｑｉａｇｅｎ）及び配列決定（Ｑｕｉｎｔａｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を行った。翻訳領域全長を配列決定し、コード配列の完全性を確認して、正しい塩基変化を保有するプラスミドを選別した。これらのプラスミドのうちｐＣＬ２０１（図４を参照されたい）は、ＳＥＬ（Ｖｅｒｄｅｚｙｎｅ及びＤＮＡ２．０）を構築する際の骨格として選別した。
表１．ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ及び配列決定プライマー
Figure 2014502148
ＰＣＲ及びサイクリングパラメーター：
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ ＰＣＲ：
１ｕＬ ｐＤｕ３９
５ｕＬ １０Ｘ ＰｆｕＵｌｔｒａ ＨＦ緩衝液
１ｕＬ ｄＮＴＰｓ
１ｕＬ（５０ｕＭ）ＭＥＡヘアピン破壊（ｐＥＴ）Ｆ
１ｕＬ（５０ｕＭ）ＭＥＡヘアピン破壊（ｐＥＴ）Ｒ
２ｕＬ ＤＭＳＯ
３９ｕＬ ｄｉＨ２Ｏ
１ｕＬ ＰｆｕＵｌｔｒａ ＨＦポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ用のＰＣＲサイクリングパラメーター：
１．９５℃ １分
２．９５℃ ５０秒
３．６０℃ ５０秒
４．６８℃ ７分
５．工程２に戻る（１８サイクル繰り返す）
６．６８℃ ７分
ｐＣＬ２０１の配列：
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ウラジロハコヤナギＩｓｐＳのアミノ酸配列：
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ＳＥＬ発現宿主−ＭＣＭ５２１のＰ１可溶化液（本明細書に記載）を調製し、分子生物学領域で一般的な手法（Ｍｉｌｌｅｒ，Ａ Ｓｈｏｒｔ Ｃｏｕｒｓｅ ｉｎ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ）に従ってＢＬ２１（ＤＥ３）に形質導入した。２０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有させたＬＢプレートで、形質導入体を選別した。陽性コロニーを更にＰＣＲにより検証し、ＢＬ２１ ＤＥ３株においてＰＬ．２−ｍＫＫＤｙＩの存在を確認した。次に、１μＬ ｐＣＰ２０プラスミドによりこの株を形質転換させ、５０μｇ／ｍＬカルベニシリンを含有させたＬＢで陽性コロニーを選別し、３０℃で一晩インキュベートした。陽性形質転換体をＬＢプレートに画線し、３７℃でインキュベートしてｐＣＰ２０プラスミドを欠損させた。ネオマイシン（カナマイシン）耐性マーカーの欠損を確認するため、３７℃で増殖させたコロニーを、２０μｇ／ｍＬカナマイシン、５０μｇ／ｍＬカルベニシリン、又は抗生物質不含有のいずれかのＬＢ培地に播種した。ｐＣＰ２０を欠損させ、カナマイシン耐性マーカーは含有させずにＰＬ．２ｍＫＫＤｙＩを組み込んだ株は、カナマイシン及びカルベニシリンに対し感受性になる。対照として親ＢＬ２１（ＤＥ３）株を用い、カナマイシン及びカルベニシリンに対し感受性を示す４種のコロニーにおいて、ＢＬ２１（ＤＥ３）にｍＫＫＤｙＩが存在しているかＰＣＲにより確認した。これにより得られた株、ＭＤ０９−１７０を、以下に記載のＳＥＬに対する増殖アッセイ時に、ＩｓｐＳ変異体を発現させるのに用いた。増殖アッセイの対照株には、ＩｓｐＳ発現に関する陰陰性及び陽性対照として、空のｐＥＴ２４ａ＋ベクター又はｐＣＬ２０１のいずれかを保有させた（表２を参照されたい）。
表２．株
Figure 2014502148
２）ＳＥＬの構築：
ＩｓｐＳの２５種の部位評価ライブラリ（ＳＥＬ）を、比活性に関し予め解析しておいてた。表３に、これらのライブラリに含有させた残基を示す。増殖アッセイに関し、これらのライブラリ中にＩｓｐＳ変異体を保有しているプラスミドを精製し、発現宿主ＭＤ０９−１７０を形質転換した：グリセロールストックから、元のライブラリを直接複製し、９６ウェルディープウェルプレート（ＶＷＲ）を用い、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有させたＬＢで３０℃で一晩増殖させた。一晩増殖させた細胞を遠心沈降（Ｅｐｐｅｎｄｏｒｆ ５８０４ Ｒ）により回収し、上清を廃棄した。製造元の推奨するプロトコルに従って、Ｎｕｃｌｅｏｓｐｉｎ Ｍｕｌｔｉ−９６ Ｐｌｕｓプラスミド精製キット（Ｍａｃｈｅｒｅｙ Ｎａｇｅｌ）を用い、Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｍｉｃｒｏｌａｂ ＳＴＡＲロボットにより、細胞ペレットからプラスミドを精製した。４２℃に設定したＥｐｐｅｎｄｏｒｆ Ｔｈｅｒｍｏｍｉｘｅｒ Ｒセットを使用し、各変異体について得られたプラスミドＤＮＡ ３μＬを用い、平底９６ウェルポリスチレンプレート（Ｆａｌｃｏｎ）で、化学的な形質転換に対し受容能のあるＭＤ０９−１７０細胞を形質転換した。２時間後に細胞をＬＢ培地に回収し、希釈し、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有させたＬＢ培地で一晩インキュベートした。全２５種のオリジナルのライブラリ由来の変異体を包含するＭＤ０９−１７０細胞を含有させたプレートのグリセロールストックを作製し、増殖アッセイによる解析前に−８０℃で保管した。
第２組の８０のＳＥＬをＤＮＡ２．０に外注し、作成した。これらのライブラリを用い、スクリーニング宿主ＭＤ０９−１７０を直接形質転換させた。表４に、第２組用に選別した全８０の残基を示す。まず現在判明しているウラジロハコヤナギＩｓｐＳ結晶構造における位置に基づいて部位を選択した。ＤＷ４２５及びＤＷ４２４株（表２を参照されたい）を、それぞれ野生型及び陰性対照として９６ウェルプレートに巻き戻した。
表３．２５種のＳＥＬ用に選別した部位
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表４．８０種のＳＥＬ用に選別した部位
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３）ＩｓｐＳ活性の増大に関係する増殖アッセイ
増殖アッセイの際、平底マイクロタイタープレート（Ｃｅｌｌｓｔａｒ）を用い、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有させた２００μＬ ＬＢ培地に、ＳＥＬのグリセロールストックを播種し、Ｓｙｓｔｅｍ Ｄｕｅｔｚ（Ｅｎｚｙｓｃｒｅｅｎ ＢＶ）により３０℃にて一晩増殖させた。誘導前に、各ウェル由来の一晩培養物７μＬを、５０μＭのＩＰＴＧと５０μｇ／ｍＬカナマイシンとを含有しているＴＭ３培地１００μＬに播種し、プレートを３０℃にて２時間増殖させた。次に、ガラス底四角型９６ウェルマイクロタイタープレート（Ｍａｔｒｉｃａｌ）において、１１ｍＭメバロン酸、５０μＭ ＩＰＴＧ及び５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有させたＴＭ３培地に、誘導前の培養物を１：１０希釈した。培養物を３４℃で増殖させ、Ｇｒｏｗｔｈ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ １１５２（Ｅｎｚｙｓｃｒｅｅｎ）で２２５ｒｐｍで約１０時間振盪させた。製造元の推奨するプロトコルに従って、各ＩｓｐＳ変異体に関し増殖曲線を生成した。空のｐＥＴ２４ａ＋ベクター（ＤＷ４２４）を保有している株を陰性対照とし、野生型ウラジロハコヤナギＩｓｐＳ（ＤＷ４２５）を発現している株を陽性対照として、ＭＶＡの存在下又は非存在下のいずれかで増殖させた。
データ解析の際、野生型対照と比較した場合の各変異体の比増殖速度を所定の時間にわたって測定した。具体的には、マイクロソフトのエクセルで「ＬＩＮＥＳＴ」関数を用い、連続的な曲線を作成し、対数増殖速度定数（増殖速度）を生成した。これらの値を、陽性対照由来の４つ（殆どの場合）の増殖定数の平均により除算し、各変異体の「増殖指数」を生成した。全１０５種のＳＥＬライブラリに含まれる変異体についての増殖指数値を表５に示す。一部の場合では、特定の変異体はグリセロールストックに存在していないか、ＬＢ培地での一晩培養で増殖しなかったか、あるいは増殖アッセイの際に最終的なプレートに移行されていない場合があった。これらの特定のウェルの値は、ＮＤ（未検出）として掲載する。ウラジロハコヤナギＩｓｐＳの初回変異導入では特定の変異は生成されずに、野生型残基が置換された。
表５．プレート００１の増殖指数順位
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表５．プレート００２の増殖指数順位
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表５．プレート００３の増殖指数順位
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表５．プレート００４の増殖指数順位
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表５．プレート００５の増殖指数順位
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表５．プレート００６の増殖指数順位
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表５．プレート００７の増殖指数順位
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表５．プレート００８の増殖指数順位
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表５．プレート００９の増殖指数順位
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表５．プレート０１０の増殖指数順位
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表５．プレート０１１の増殖指数順位
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表５．プレート０１２の増殖指数順位
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表５．プレート０１３の増殖指数順位
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表５．プレート０１４の増殖指数順位
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表５．プレート０１５の増殖指数順位
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表５．プレート０１６の増殖指数順位
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表５．プレート０１７の増殖指数順位
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表５．プレート０１８の増殖指数順位
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表５．プレート０１９の増殖指数順位
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表５．プレート０２０の増殖指数順位
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表５．プレート０２１の増殖指数順位
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表５．プレート０２２の増殖指数順位
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表５．プレート０２３の増殖指数順位
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表５．プレート０２４の増殖指数順位
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表５．プレート０２５の増殖指数順位
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表５．プレート０２６の増殖指数順位
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表５．プレート０２７の増殖指数順位
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結果／考察
表６に、１．２以上の増殖指数を示したすべての変異体を示す。理論に束縛されるものではないが、これらの位置に変異が生じることで、幾つかの異なる経路により、ＩｓｐＳの細胞内活性が増加される場合がある。理論に束縛されるものではないが、細胞内活性は、ＩｓｐＳに関係する次のいずれかの特性：細胞生存能の上昇、ｋｃａｔの上昇、Ｋｍの低下、比活性の増大、溶解性の増大、不溶性の低下、リボソーム結合性の向上、翻訳開始速度の増加、翻訳伸長速度の増加、転写開始速度の増加、転写伸長速度の増加、ＤＮＡの２次構造の減少、ＲＮＡの２次構造の減少、ＤＮＡの２次構造の増加、ＲＮＡの２次構造の増加、折り畳み速度の増加、細胞内シャペロンとの親和性の上昇、安定性の増加、タンパク質の代謝回転の減少、細胞内プロテアーゼに対する曝露の減少、細胞内プロテアーゼに対する親和性の減少、周辺質への局在の減少、細胞質に対する局在の改良、封入体形成の減少、膜局在の減少、より望ましいコドンによる発現の増加、ＤＮＡ安定性の上昇、ＲＮＡ安定性の上昇、及びＲＮＡ分解性の低下により、あるいはこれらの特性を組み合わせることにより増加する場合がある。
理論に束縛されるものではないが、ＩｓｐＳをコードしている又は発現している核酸配列（ＤＮＡ及びＲＮＡ）の特性、あるいはＩｓｐＳそのものの生化学的特性に対し正の効果を示す任意の変異により、細胞内活性を増大させることができる。１．２以上の増殖指数を有するすべての変異体に、メバロン酸及びＩＰＴＧマトリックスを用い第２増殖アッセイを行う。競合実験において最良の増殖性を示し得る酵素を判別するために、これらの変異体も併せてプールし、ＩＰＴＧ誘導下かつメバロン酸経路作動下で複数回濃縮した。最も有望な変異体を、イソプレン生産株において比生産性に及ぼす効果について更に評価する。
対象とする一部の変異としては、限定するものではないが、Ａ３Ｔ，Ｓ１３Ｌ，Ｉ１６５Ｙ，Ｑ４２１Ｒ，Ｆ４９５Ｌ，Ｑ５０９Ｔ，及びＬ５４０Ｖが挙げられる。これらの変異体はすべて、ＩＰＴＧ／メバロン酸マトリックスを用いる第２アッセイ時に、野生型と比較して増殖性に利点を示した。関連するセイヨウハコヤナギ、アメリカヤマナラシ及びＰ．トリコカルパ種由来の同種イソプレン合成酵素においてもこの部位にスレオニンが見られることから、Ａ３Ｔ変異体を特に対象とする。ヤマナラシ種由来のＩｓｐＳの共通配列に変更を加えることで、酵素の活性をより増大させることができる。
Ｆ４９５Ｌは、残基Ｋ４８７〜Ｋ４９７からなる暴露表面ループ（暴露表面ループ）中に位置することから、Ｆ４９５Ｌ変異は特に対象となる。図５は、それぞれｉｎ ｖｉｖｏにおいて細胞生存率に正の効果を示し、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてＩｓｐＳ比活性を示す、Ｇ４９１Ｓ及びＬ４９４Ｐ，の両方の近位に存在することを示す。加えて、この表面ループには高い増殖率を示すその他の変異が複数存在する。総合して、このループに変異を生じさせると、細胞内酵素活性において重要な役割が示される場合がある。Ｑ５０９Ｉ及びＱ５０９Ｖ変異はいずれも増殖性の向上を示し、かつこれらのみがβ炭素で分岐しているアミノ酸残基であることから、Ｑ５０９Ｔ変異は特に対象となる。図６は、Ｑ５０９が、ＩｓｐＳ活性部位の近傍に位置する（活性部位内には位置していない）ことを示す。この特定のアミノ酸のβ炭素に分岐構造を存在させると、酵素活性に対し効果が付与され得る。
表７に示す残基は、高ＤＭＡＰＰ圧下で増殖させる場合に必須のものであり、したがって、一実施形態では、不変の残基として見なすことができる。任意の他の残基により野生型のアミノ酸を置換した場合、増殖速度アッセイ条件下での増殖が最小限になるか又は増殖しなくなる。各位置についての増殖指数値を表７に示す。フェニルアラニン２８７（Ｆ２８７）は活性部位に位置し、活性部位キャビティの底部を構成する（図７）。他のテルペン合成酵素Ｆ２８７との構造アラインメントに基づき、炭素原子を５つ以上含有するイソプレノイドにより活性部位への接近を妨害することで、活性部位に収容され得る基質長を決定する。
グリシン３９７（Ｇ３９７）は、活性部位キャビティの側面に位置する（図８）。この残基はα−ヘリックス中のねじれ部位に存在し、ヘリックスを曲げる際にねじれ部位に必要とされる、グリシン（及び他の低分子アミノ酸）に特有の構造的柔軟性を示す。ヘリックス中の折り曲げは、活性部位中に推定される基質結合位置に隣接する。
アスパラギン４３８（Ｎ４３８）は、活性部位の頂部に位置する（図９）。他のテルペン合成酵素との構造アラインメントによると、Ｎ４２８は、マグネシウムイオンとの直接的な協調に関与し得ること、並びに基質と相互作用する可能性があることが示される。
グルタミン酸４５１（Ｅ４５１）は、活性部位上に位置する基質アクセスループに存在する（図１０）。ホモロジーモデリング及び他のテルペン合成酵素との構造アラインメントに基づくと、これらのループは、基質を補足する際の開口部位となり、基質が活性部位に結合した後に、活性部位を覆って空間を閉鎖する。残基Ｅ４５１は、この工程中に、１つ以上のマグネシウムイオンと協調して働くものと想定される。
チロシン５１４（Ｙ５１４）は、Ｎ４３８下の活性部位に存在する（図１１）。Ｙ５１４は基質との結合に関与し、あるいは触媒作用に直接関与し得る。
表６．増殖指数が１．２以上の変異体
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表７．不変部位の増殖指数
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実施例３増殖率に関係する位置分析
本例は、ＳＥＬデータの解析結果を位置を用い例示する。特定の変異に対応させた増殖指数を、次に表８として示す。
表８
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実施例４イソプレン合成酵素の単一部位変異を発現している大腸菌クローンの増殖データの解析
本例は、増殖率の代わりに性能指数をもとに増殖データの解析を示す。Ｅｎｚｙｓｃｒｅｅｎ Ｇｒｏｗｔｈ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ １１５２を用い、一定時間ごとにＧ値を決定した。エクセルを用い、線形回帰により、各試料の増殖速度を算出した。時間に対するＧ値（ΔＧ／Δｔ）の増加により与えられる。この値を「スロープ」と呼ぶ。最終Ｇ値から初期Ｇ値を除算し、各試料の最終細胞密度を概算した。この数を「δ」と呼ぶ。
各９６ウェルプレートに関し、各「スロープ」及び「δ」値を、野生型対照を含有しているウェルの平均値により除算することで、正規化した。算出の際には、野生型の示したいくつかの明らかな外れ値を除外した。正規化値を、「性能指数」又は「Ｐ．Ｉ．」と呼ぶ。
「スロープＰＩ」及び「δＰＩ」は非常に相関性が高く、これらの値から、「平均ＰＩ」と呼ばれるＰＩを更に算出した。この値は、単に２つのＰＩ値の平均値である。表９は、解析したすべての位置におけるすべての変異についての各種ＰＩ値を示し、表１０は、平均正規化ＰＩに関し高い値を有していた上位１５０種の変異を示す。
表９．
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表１０．標準平均ＰＩ値が上位１５０位に入る変異体
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実施例５ Ｇ４９１Ｓイソプレン合成酵素変異体のもつ生存能の上昇
次の例は、イソプレン合成酵素のＧ４９１Ｓ変異体を発現し、野生型イソプレン合成酵素を発現している細胞と比較した場合に発酵時の生存能が増加しているイソプレン生産大腸菌を示す。この実験は、１４Ｌフェドバッチスケールで実施した。
株構築
ＢＬ２１（Ｎｏｖａｇｅｎ）中のクエン酸合成酵素遺伝子（ｇｌｔＡ）前に位置するプロモーターを、常時発現型低発現プロモーター、すなわちＧＩ１．２（米国特許第７，３７１，５５８号）により置き換えた。ｇｌｔＡ（Ｗｉｌｄｅ，Ｒ，ａｎｄ Ｊ．Ｇｕｅｓｔ．１９８６．Ｊ．Ｇｅｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．１３２：３２３９〜３２５１）については２つの野生型プロモーターが報告されており、合成プロモーターを、遠位プロモーターの−３５領域の直後に挿入した。プライマーＵｐｇｌｔＡＣｍ−Ｆ及びＤｎｇｌｔＡ１．ｘｇｉＣｍ−Ｒ（表１１を参照されたい）、並びにテンプレートとしてＧｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ（Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）由来のプラスミドＦＲＴ−ｇｂ２−Ｃｍ−ＦＲＴを用い、ＰＣＲ産物を得たＰＣＲ産物を精製し、λ ｒｅｄを用いる組み換えに製造元（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）による記載の通りに使用した。更なる評価にあたって、複数種のコロニーを選別した。プロモーター領域は、プライマーｇｌｔＡＰｒｏｍＳｅｑＦ及びｇｌｔＡｐｒｏｍＳｅｑＲ（表１１を参照されたい）を用い増幅し、及びＤＮＡを抽出した。水３０ｕＬにコロニーを再懸濁し、９５℃で４分間加熱し、この試料のうち２ｕＬをテンプレートとして５０ｕＬ反応液に使用した。得られたＰＣＲ産物の配列決定結果を観察した後、３種の異なるプロモーラーＧＩ１．２、ＧＩ１．５及びＧＩ１．６（米国特許第７，３７１，５５８号）を保有しているコロニーを更なる使用のため保存した（表１１）。
株ＭＣＭ５２１由来のＰ１可溶化液によりＣＭＰ２５８を形質導入し、２０ｕｇ／ｍＬカナマイシンを含有させたＬＢプレートでコロニーを選別し、株ＭＤ０９−３１３を構築した。以下に記載の通りにＣＭＰ２５８及びＭＣＭ５２１を製造できる。Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ．Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ，Ｉｎｃ．に記載の方法に従って、Ｐ１可溶化液を調製した。製造元により推奨されるプロトコルを用い、株ＭＤ０９−３１４からカナマイシンマーカーを除去した（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）。
株ＣＭＰ１４１、ＣＭＰ１４２、及びＣＭＰ１４３からＰ１可溶化液を生成し、これらを株ＭＤ０９−３１４に形質導入し、それぞれＣＭＰ４４０、ＣＭＰ４４１、及びＣＭＰ４４２を生成した（表１１）。製造元（Ｇｅｎｅ Ｂｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により推奨されるプロトコルを用い、クロラムフェニコールマーカーを除去し、それぞれ株ＣＭＰ４５１、ＣＭＰ４５２、及びＣＭＰ４５３を生成した（表１１）。
イソプレン生産株の構築の際、電気穿孔法を用い、ＭＶＡ経路上流関連性プラスミド、及びｐＤＷ３４（野生型イソプレン合成酵素を含有）又はｐＣＨＬ２４３（イソプレン合成酵素のＧ４９１Ｓ変異体、以降を参照のこと）のいずれかを用い株ＣＭＰ４５１を形質転換した。３７℃で１時間かけて株を液体ＬＢ培地に回収し、５０μｇ／ｍＬカルベニシリン及び５０μｇ／ｍＬスペクチノマイシンを含有させた選択的固体寒天培地のプレートに播種し、３７℃で一晩インキュベートした。これらの抗生物質に耐性を示し、野生型ＩｓｐＳ（株ＣＭＰ４５７、遺伝子型については表１２を参照されたい）又はＧ４９１Ｓ ＩｓｐＳ（株ＤＷ４１５、遺伝子型については表１２を参照されたい）のいずれかのプラスミドを保有している単離株を、以降の試験のために選別した。
株ＭＣＭ５１８−５２１及び５２８−５３１の構築：組み込みしたｍＫＫＤｙＩを駆動するλプロモーター
Ｐ１形質導入により、１００ｋｂまでのＤＮＡをバクテリア株間で移動させることができる（Ｔｈｏｍａｓｏｎら、２００７）。Ｐ１形質導入を行い、バクテリア染色体の一部を大腸菌Ｋ１２ ＭＧ１６５５から大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）へと移動させ、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）における１７，２５７ｂｐの欠失箇所を置き換えた。
２つのストラテジーを使用し、異なる選択マーカーを用い、組み換えられたバクテリア染色体を含有しているクローンを同定した。第１に、出願人らは、その欠失が菌株に悪影響を与えないような、導入しようとする１７，２５７ｂｐの配列に近い遺伝子に抗生物質マーカーを挿入した。その抗生物質マーカーを含む菌株は、マーカーと同時に形質導入される１７，２５７ｂｐの細菌染色体の小片を有している可能性が高い。この場合では、出願人らは、カナマイシン耐性遺伝子（「ｋａｎＲ」）をコードした遺伝子を、１２６のアミノ酸からなる機能が不明なタンパク質をコードしているｙｂｇＳ遺伝子に挿入した。第２に、ガラクトースの利用に関与している多くの遺伝子が、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に形質導入する１７，２５７ｂｐの断片内で、ｐｇｌの近くに位置することが知られていることから、大腸菌Ｋ１２ ＭＧ１６５５（大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）において欠失させた１７，２５７ｂｐの配列を含有する）から得られたＰ１ライセートにより形質導入され、０．４％（ｗ／ｖ）ガラクトースを含むＭ９培地（６ｇ／Ｌ Ｎａ２ＨＰＯ４、３ｇ／Ｌ ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ／Ｌ ＮａＣｌ、０．５ｇ／Ｌ ＮＨ４Ｃｌ、０．１ｍＭ ＣａＣｌ２、２ｍＭ ＭｇＳＯ４）で単離されたコロニーは、この細菌染色体の１７，２５７ｂｐの断片を含有している可能性が高い。
プライマーＭＣＭ１２０及びＭＣＭ２２４を用い、製造元のプロトコルに従ってＳｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｈｅｒｃｕｌａｓｅ（商標）ＩＩ融合キット（Ａｇｉｌｅｎｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ Ｄｉｖｉｓｉｏｎ，Ｌａ Ｊｏｌｌａ，Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用し、ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ ＦＲＴ−ｇｂ２−Ｃｍ−ＦＲＴテンプレートからクロラムフェニコール耐性（「ＣｍＲ」）のカセットを増幅させた。４つの５０μＬ ＰＣＲ反応物を以下のようにサイクルさせた：９５℃／２分；９５℃／２０秒、５５℃／２０秒、７２℃／１分を３０サイクル；及び７２℃／３分。反応物を次に４℃に冷却した。４つの反応物をプールし、製造元のプロトコルに従ってＱｉａｇｅｎ ＰＣＲカラムに装填し、５５℃にて６０μＬの溶出緩衝液（「ＥＢ」）により溶出した。
標準的な手順を用いて、電気穿孔法により、プラスミドｐＲｅｄＥＴ−カルベニシリンＲ（ＧｅｎｅＢｒｉｄｇｅｓ，Ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）を、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）ＭＣＭ４４６株（ＣｍＲ，ｇｉ１．６ｍＫＫＤｙＩ Ａ１−３）に導入した。３０℃にてＳＯＣ培地で１時間振盪して形質転換体を回復させ、次にＬＢ＋５０μｇ／ｍＬカルベニシリン（「ＬＢ／ｃａｒｂ５０」）プレートで３０℃にて一晩選別した。カルベニシリン耐性コロニーをＭＣＭ５０８株として凍結した。
５ｍＬのＬＢ／ｃａｒｂ５０に新たに画線し、３０℃にてＯＤ６００が約０．５になるまでＭＣＭ５０８株を増殖させた。約０．５になった時点で４０ｍＭのＬ−アラビノースを添加し、培養物を３７℃にて１．５時間インキュベートした。次いで遠心分離により細胞を回収し、上記のように精製した増幅産物３μＬを電気穿孔し、５００μＬのＳＯＣ培地で３７℃にて１．５〜３時間回復させた。形質転換体を３７℃にてＬＢ＋１０μｇ／ｍＬのカナマイシン（ＬＢ／ｋａｎ１０）プレートで選別した。
標的座への増幅産物の組み込みを、プライマーＧＢ−ＤＷ（配列番号）及びＭＣＭ２０８（配列番号）を用いＰＣＲにより確認した。配列決定した結果、得られた増幅産物は以下に列挙する配列を有する４つのクローンと同一であった。４つのカルベニシリン感受性クローンをＭＣＭ５１８−ＭＣＭ５２１株として凍結した。
ＭＣＭ５１８−ＭＣＭ５２１株をＬＢ／ｋａｎ１０に再画線し、３７℃で一晩増殖させた。ＭＣＭ５１８−ＭＣＭ５２１株のコロニーを回収し、３７℃にてＬＢ／ｋａｎ１０で培養し、酵母Ｆｌｐリコンビナーゼ、クロラムフェニコール及びアンピシリン耐性遺伝子をコードしかつ宿主細胞に温度感受性の複製を付与するｐＣＰ２０プラスミドを用い電気的に形質転換した（Ｃｈｅｒｅｐａｎｏｖ，Ｐ．Ｐ．ら、Ｇｅｎｅ １５８（１）：９〜１４（１９９５））。細胞を、５００μＬのＳＯＣ培地で振盪しながら３０℃で１時間回復させた。形質転換体を３０℃で一晩ＬＢ／ｃａｒｂ５０プレートで選別した。各プレート由来のコロニーを３０℃にてＬＢ／ｃａｒｂ５０培地で増殖させ、視覚的に濁りが観察されるまでモニターした。培養を次に３７℃で少なくとも３時間行った。培養物から細胞をＬＢプレートに画線し、３７℃で一晩増殖させた。
翌日、コロニーをＬＢ、ＬＢ／ｃａｒｂ５０及びＬＢ／ｋａｎ１０に植えた。カルベニシリン及びカナマイシンの両方に感受性であるコロニー（すなわち、ｃａｒｂ５０及びｋａｎ１０で増殖できない）を液体ＬＢで培養し、ＭＣＭ５２８−ＭＣＭ５３１株として凍結した。
大腸菌株
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プライマー配列
Figure 2014502148
プロモーター／ｍＭＶＫアセンブリの上流に組み込まれた、Ｇｅｎｅ ＢｒｉｄｇｅｓのＦＲＴ−ｇｂ２−Ｃｍ−ＦＲＴカセット由来の配列を有する、バクテリオファージラムダ（λ）由来の新しいＰＬプロモーター及びｍＭＶＫ翻訳領域のごく初めの配列、並びにＭＣＭ５０８株由来のＭＶＡ経路下流のインテグロンの残りが後に続くｍＭＶＫ翻訳領域の残部、を含有する、ＭＣＭ５１８−ＭＣＭ５２１株の染色体にアセンブリを組み込んだ。
ＭＣＭ５１８に組み込んだプロモーター／ｍＭＮＫ配列ａａａｇａｃｃｇａｃｃａａｇｃｇａｃｇｔｃｔｇａｇａｇｃｔｃｃｃｔｇｇｃｇａａｔｔｃｇｇｔａｃｃａａｔａａａａｇａｇｃｔｔｔａｔｔｔｔｃａｔｇａｔｃｔｇｔｇｔｇｔｔｇｇｔｔｔｔｔｇｔｇｔｇｃｇｇｃｇｃｇｇａａｇｔｔｃｃｔａｔｔｃｔｃｔａｇａａａｇｔａｔａｇｇａａｃｔｔｃｃｔｃｇａｇｃｃｃｔａｔａｇｔｇａｇｔｃｇｔａｔｔａａａｔｔｃａｔａｔａａａａａａｃａｔａｃａｇａｔａａｃｃａｔｃｔｇｃｇｇｔｇａｔａａａｔｔａｔｃｔｃｔｇｇｃｇｇｔｇｔｔｇａｃａｔａａａｔａｃｃａｃｔｇｇｃｇｇｔｇａｔａｃｔｇａｇｃａｃａｔｃａｇｃａｇｇａｃｇｃａｃｔｇａｃｃａｃｃａｔｇａａｇｇｔｇｃａａａｇｇａｇｇｔａａａａａａａｃａｔｇｇｔａｔｃｃｔｇｔｔｃｔｇｃｇｃｃｇｇｇｔａａｇａｔｔｔａｃｃｔｇｔｔｃｇｇｔｇａａｃａｃｇｃｃｇｔａｇｔｔｔａｔｇｇｃｇａａａｃｔｇｃａａｔｔｇｃｇｔｇｔｇｃｇｇｔｇｇａａｃｔｇｃｇｔａｃｃｃｇｔｇｔｔｃｇｃｇｃｇｇａａｃｔｃａａｔｇａｃｔｃｔａｔｃａｃｔａｔｔｃａｇａｇｃ
ＭＣＭ５１９に組み込んだプロモーター／ｍＭＶＫ配列ａａａｇａｃｃｇａｃｃａａｇｃｇａｃｇｔｃｔｇａｇａｇｃｔｃｃｃｔｇｇｃｇａａｔｔｃｇｇｔａｃｃａａｔａａａａｇａｇｃｔｔｔａｔｔｔｔｃａｔｇａｔｃｔｇｔｇｔｇｔｔｇｇｔｔｔｔｔｇｔｇｔｇｃｇｇｃｇｃｇｇａａｇｔｔｃｃｔａｔｔｃｔｃｔａｇａａａｇｔａｔａｇｇａａｃｔｔｃｃｔｃｇａｇｃｃｃｔａｔａｇｔｇａｇｔｃｇｔａｔｔａａａｔｔｃａｔａｔａａａａａａｃａｔａｃａｇａｔａａｃｃａｔｃｔｇｃｇｇｔｇａｔａａａｔｔａｔｃｔｃｔｇｇｃｇｇｔｇｔｔｇａｃｃｔａａａｔａｃｃａｃｔｇｇｃｇｇｔｇａｔａｃｔｇａｇｃａｃａｔｃａｇｃａｇｇａｃｇｃａｃｔｇａｃｃａｃｃａｔｇａａｇｇｔｇｃａａａｇｇａｇｇｔａａａａａａａｃａｔｇｇｔａｔｃｃｔｇｔｔｃｔｇｃｇｃｃｇｇｇｔａａｇａｔｔｔａｃｃｔｇｔｔｃｇｇｔｇａａｃａｃｇｃｃｇｔａｇｔｔｔａｔｇｇｃｇａａａｃｔｇｃａａｔｔｇｃｇｔｇｔｇｃｇｇｔｇｇａａｃｔｇｃｇｔａｃｃｃｇｔｇｔｔｃｇｃｇｃｇｇａａｃｔｃａａｔｇａｃｔｃｔａｔｃａｃｔａｔｔｃａｇａｇｃ
ＭＣＭ５２０に組み込んだプロモーター／ｍＭＶＫ配列ａａａｇａｃｃｇａｃｃａａｇｃｇａｃｇｔｃｔｇａｇａｇｃｔｃｃｃｔｇｇｃｇａａｔｔｃｇｇｔａｃｃａａｔａａａａｇａｇｃｔｔｔａｔｔｔｔｃａｔｇａｔｃｔｇｔｇｔｇｔｔｇｇｔｔｔｔｔｇｔｇｔｇｃｇｇｃｇｃｇｇａａｇｔｔｃｃｔａｔｔｃｔｃｔａｇａａａｇｔａｔａｇｇａａｃｔｔｃｃｔｃｇａｇｃｃｃｔａｔａｇｔｇａｇｔｃｇｔａｔｔａａａｔｔｃａｔａｔａａａａａａｃａｔａｃａｇａｔａａｃｃａｔｃｔｇｃｇｇｔｇａｔａａａｔｔａｔｃｔｃｔｇｇｃｇｇｔｇｔｔｇａｃｃｔａａａｔａｃｃａｃｔｇｇｃｇｇｔｇａｔａｃｔｇａｇｃａｃａｔｃａｇｃａｇｇａｃｇｃａｃｔｇａｃｃａｃｃａｔｇａａｇｇｔｇｃａａａｇｇｔａａａａａａａｃａｔｇｇｔａｔｃｃｔｇｔｔｃｔｇｃｇｃｃｇｇｇｔａａｇａｔｔｔａｃｃｔｇｔｔｃｇｇｔｇａａｃａｃｇｃｃｇｔａｇｔｔｔａｔｇｇｃｇａａａｃｔｇｃａａｔｔｇｃｇｔｇｔｇｃｇｇｔｇｇａａｃｔｇｃｇｔａｃｃｃｇｔｇｔｔｃｇｃｇｃｇｇａａｃｔｃａａｔｇａｃｔｃｔａｔｃａｃｔａｔｔｃａｇａｇｃ
ＭＣＭ５２１に組み込んだプロモーター／ｍＭＶＫ配列ａａａｇａｃｃｇａｃｃａａｇｃｇａｃｇｔｃｔｇａｇａｇｃｔｃｃｃｔｇｇｃｇａａｔｔｃｇｇｔａｃｃａａｔａａａａｇａｇｃｔｔｔａｔｔｔｔｃａｔｇａｔｃｔｇｔｇｔｇｔｔｇｇｔｔｔｔｔｇｔｇｔｇｃｇｇｃｇｃｇｇａａｇｔｔｃｃｔａｔｔｃｔｃｔａｇａａａｇｔａｔａｇｇａａｃｔｔｃｃｔｃｇａｇｃｃｃｔａｔａｇｔｇａｇｔｃｇｔａｔｔａａａｔｔｃａｔａｔａａａａａａｃａｔａｃａｇａｔａａｃｃａｔｃｔｇｃｇｇｔｇａｔａａａｔｔａｔｃｔｃｔｇｇｃｇｇｔｇｔｔｇａｃｇｔａａａｔａｃｃａｃｔｇｇｃｇｇｔｇａｔａｃｔｇａｇｃａｃａｔｃａｇｃａｇｇａｃｇｃａｃｔｇａｃｃａｃｃａｔｇａａｇｇｔｇｃａａａｇｇａｇｇｔａａａａａａａｃａｔｇｇｔａｔｃｃｔｇｔｔｃｔｇｃｇｃｃｇｇｇｔａａｇａｔｔｔａｃｃｔｇｔｔｃｇｇｔｇａａｃａｃｇｃｃｇｔａｇｔｔｔａｔｇｇｃｇａａａｃｔｇｃａａｔｔｇｃｇｔｇｔｇｃｇｇｔｇｇａａｃｔｇｃｇｔａｃｃｃｇｔｇｔｔｃｇｃｇｃｇｇａａｃｔｃａａｔｇａｃｔｃｔａｔｃａｃｔａｔｔｃａｇａｇｃ
ｐＴｒｃ−ＭＥＡ−Ａｌｂａ（Ｇ４９１Ｓ）−ｍＭＶＫの構築：
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）変異導入（ＰＣＲのサイクルパラメーターについては以降を参照されたい）により、変異Ｇ４９１ＳをｐＤＷ３４（ｐＴｒｃ−ＭＥＡ−Ａｌｂａ−ｍＭＶＫ）に導入した。次に、ＰＣＲ産物を、１μＬ ＤｐｎＩ（Ｒｏｃｈｅ）により処理し、３７℃でインキュベートして親ＤＮＡテンプレートを消化した。次に、この溶液のうち１μＬを用い、準的な分子生物学的手法により電気穿孔法を行い、ＭＣＭ５３１を形質転換した。１時間かけて液体ＬＢ培地に形質転換細胞を回収し、次に５０μｇ／ｍＬカルベニシリン及び５ｍＭメバロン酸を含有させたＬＢ固体寒天プレートに播種した。単離コロニーからプラスミドを精製し、配列決定（Ｑｕｉｎｔａｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を完了させ、変異Ｇ４９１Ｓ（ｐＣＨＬ２４３中、図１２を参照されたい）の存在の有無を確認した。
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ反応用のＰＣＲ混合物
Figure 2014502148
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ反応用のＰＣＲサイクルパラメーター
９５℃−１分
（９５℃ ５０秒、６０℃ ５０秒、６８℃ ３分）１８回
６８℃−１０分
表１１．プライマー
Figure 2014502148
表１２：大腸菌株
Figure 2014502148
ｐＣＨＬ２４３配列
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発酵番号２０１００３０７及び２０１００４３６の発酵条件
発酵：
発酵番号２０１００３０７：ＣＭＰ４３７
発酵番号２０１００４３７：ＤＷ４１５
培地組成（発酵培地１Ｌ当たり）：
Ｋ２ＨＰＯ４（７．５ｇ）、ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２ｇ）、クエン酸一水和物（２ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（０．３ｇ）、酵母エキス（０．５ｇ）、１０００×改変微量金属溶液（１ｍＬ）。すべての成分を脱イオン水に加え、溶解させた。この溶液を加熱滅菌した（１２３℃で２０分）。水酸化アンモニウム（２８％）によりｐＨを７．０に調整し、容量を適量に調整した。滅菌及びｐＨ調製後にグルコース１０ｇ、ビタミン溶液８ｍＬ、及び抗生物質を加えた。
１０００×改変微量金属溶液（１Ｌ当たり）：
クエン酸＊Ｈ２Ｏ（４０ｇ）、ＭｎＳＯ４＊Ｈ２Ｏ（３０ｇ）、ＮａＣｌ（１０ｇ）、ＦｅＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｏＣｌ２＊６Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＺｎＳＯ＊７Ｈ２Ｏ（１ｇ）、ＣｕＳＯ４＊５Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）、Ｈ３ＢＯ３（１００ｍｇ）、ＮａＭｏＯ４＊２Ｈ２Ｏ（１００ｍｇ）。各成分を一度に脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次いで液量を適量に合わせ、０．２２マイクロメートルフィルタを用い、ろ過滅菌した。
ビタミン溶液（１Ｌ当たり）：
塩酸チアミン（１．０ｇ）、Ｄ−（＋）−ビオチン（１．０ｇ）、ニコチン酸（１．０ｇ）、Ｄ−パントテン酸（４．８ｇ）、塩酸ピリドキシン（４．０ｇ）。各成分を一度に脱イオン水に溶解させ、ＨＣｌ／ＮａＯＨによりｐＨを３．０に調整し、次いで液量を適量に合わせ、０．２２マイクロメートルフィルタを用い、ろ過滅菌した。
供給液（１ｋｇ当たり）：
グルコース（０．５７ｋｇ）、脱イオン水（０．３８ｋｇ）、Ｋ２ＨＰＯ４（７．５ｇ）、及び１００％ Ｆｏａｍｂｌａｓｔ（１０ｇ）。すべての成分を合わせて混合し、オートクレーブ処理した。溶液を２５℃に冷却した後、マクロ塩溶液（３．４ｍＬ）、１０００×改変微量金属溶液（０．８ｍＬ）、及びビタミン溶液（６．７ｍＬ）を加えた。
マクロ塩溶液（１Ｌ当たり）：
ＭｇＳＯ４＊７Ｈ２Ｏ（２９６ｇ）、クエン酸一水和物（２９６ｇ）、クエン酸鉄アンモニウム（４９．６ｇ）。すべての成分を水に溶解させ、適量に合わせ、０．２２マイクロメートルのフィルタを用い、ろ過滅菌した。
２つの株に対し、１５Ｌの生物反応器で、ｐＨ ７．０、３４℃下で発酵を行った。凍結させた大腸菌株を解凍し、トリプトンと酵母エキスを加えた生物反応器の培地（ＬＢ）に摂種した。摂取した大腸菌を、５５０ｎｍ（ＯＤ５５０）での吸光度測定値が１．０になるまで増殖させ、５００ｍＬを１５Ｌ生物反応器に摂種し、初期槽容量を５Ｌに合わせた。１０時間にわたって供給液を漸増させて（最大４．５ｇ／分）供給し、次にパルス供給を開始した。パルス供給は３０分行い、ｐＨを７．０４超に上昇させた。パルス供給の速度は調整可能であり、ＴＣＥＲ／３００と同等であった。供給するパルスの最大速度は１３．５ｇ／分を超過させなかった。発酵中の生物反応器には、グルコースを総重量で７．４〜７．５ｋｇ供給した。細胞のＯＤ５５０が６になった時点で、濃度２００ｕＭになるようＩＰＴＧを発酵槽に加え、誘導を実施した。
生物反応器から発生した気体に含まれるイソプレン濃度を、ｉＳＣＡＮ（Ｈａｍｉｌｔｏｎ Ｓｕｎｄｓｔｒａｎｄ）質量分析計を用い測定した。
膜電位の測定及び生存能判定のための実験手順
膜電位を利用して、発酵時のバクテリアの生存能を評価した。発酵槽からブロスを回収し、ＰＢＳ緩衝液を用い直ちに１５０倍希釈した。次いで、１μＭビス−（１，３−ジブチルバルビツル酸）トリメチンオキソノール（ＤｉＢＡＣ４（３）、（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カタログ番号Ｂ−４３８）を含有させたＰＢＳ緩衝液を用い細胞を更に１５０倍希釈した。試料を１０分間染色し、フローサイトメトリー（ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ，Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）により単個細胞の緑色蛍光を定量した。４８８ｎｍの励起波長と、５３０ｎｍの発光波長を用いた。
まず始めに、対数増殖期の大腸菌ＢＬ２１の培養液及び加熱殺菌した大腸菌ＢＬ２１の培養液をＤｉＢＡＣ４（３）で染色し、生菌及び死菌の緑色蛍光強度をそれぞれ測定した。この情報を利用して、フローサイトメトリーデータを解析する際のゲーティングを行い、膜電位をもつ細胞画分及び膜電位をもたない細胞画分を判別した。無傷なバクテリアのみを識別するために、適切な細胞の大きさ（４８８ｎｍにて前方散乱対側方散乱を測定）についてもゲーティングを行った。次に、これらの基準のもと、通過する細胞が発する緑色蛍光強度を利用し、発酵試料中に含まれる正常な膜電位をもつ細胞画分と、膜電位をもたない細胞画分とを判別した。正常な膜電位をもつ細胞は生細胞であり、かつ代謝活性をもつものであると仮定し、それに対し、膜電位をもたない細胞は視細胞であり、代謝活性をもたないものであると仮定する。
結果：
メバロン酸経路によりイソプレンを生産している２株（ＣＭＰ４３７及びＤＷ４１５）を、フェドバッチ条件下での生存能について解析した。ＤＷ４１５株がイソプレン合成酵素に変異Ｇ４９１Ｓを有していたことを除き、２株は同質遺伝子を有していた。２株は発酵時に同様の増殖性を示し、相当量のイソプレンを生産した。放出気体に含まれるイソプレン（％）及びＣＯ２（％）の濃度間の比によると、イソプレン合成酵素のＧ４９１Ｓ変異体を発現しているＤＭ４１５株では、図１３に示す通り、ほとんどの時点で、呼吸速度と比較してイソプレン生産速度が増加していた。ＤｉＢＡＣ４（３）染料によりバクテリアを染色し、フローサイトメトリーを用い緑色蛍光の発光強度を解析することで、発酵時の個々のバクテリアの膜電位を更に測定した。ＤｉＢＡＣ４（３）染料は膜電位の損なわれたバクテリアに浸透する。膜電位をもたないバクテリアは、一般的に死細胞であるものと見なされる。イソプレン合成酵素の対立遺伝子であるＧ４９１Ｓを発現しているＤＷ４１５株では、図１４に示す通り、発酵期間のほとんどで生存能が有意に増大した。
実施例６ ６×Ｈｉｓタグを付加し、結晶化を目的とした、ウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素Ｇ４９１Ｓ変異体の構築
本例は、結晶化を目的とした、ウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素のＧ４９１Ｓ変異体の構築例を示す。
大腸菌宿主細胞内でのＭＶＡ経路への暴露に対し良好な耐性を示す変異体を濃縮し、変異Ｇ４９１Ｓ（これまでに、非切断型ＩｓｐＳ配列においてＧ５０７Ｓとして参照）を保有しているウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素（ＩｓｐＳ）を同定した。Ｇ４９１Ｓ，の有益な特性をより正確に判断するために、酵素変異体を精製し、その結晶構造を解像度２．６Åで解析し、次に未改変の野生型親酵素の構造と比較した。
方法
ＴＥＶプロテアーゼ認識部位と、ＩｓｐＳのＣ末端に６×Ｈｉｓタグとを保有している、ベクター骨格ＭＤ０９−１６３（野生型酵素をコードしている。図１を参照されたい）を用い、Ｇ４９１Ｓ変異体を構築した。製造元の推奨するプロトコルに従って、ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ変異導入キット（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）を用い、Ｇ４９１Ｓ変異体を生成した（以下のＰＣＲの反応及びサイクルパラメーターを参照されたい）。ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅにより反応させ、製造元の推奨するプロトコルに従って、化学的な形質転換に対し受容能のある大腸菌ＴＯＰ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換し、ＬＢ Ｋａｎ５０選択培地プレートに播種した。カナマイシンに耐性を示したコロニーをＰＣＲ法により直接的に選別し、プライマーＱＢ１４９３及びＴ７ Ｒｅｖｅｒｓｅ（Ｑｕｉｎｔａｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を用い配列決定を行い、配列を確認した。ＴＯＰ１０細胞を選択培地で増殖させ、プラスミドを精製（Ｑｉａｇｅｎ）し、次にこのプラスミドを用い、製造元の推奨するプロトコルに従って、ＩｓｐＳ変異体を発現させる前に化学的な形質転換に対し受容能のあるＢＬ２１ ＤＥ３ ｐＬｙｓＳ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換した。
ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ変異導入
３５μＬ Ｈ２Ｏ
５μＬ １０Ｘ Ｐｆｕ Ｕｌｔｒａ ＩＩ ｒｘｎ緩衝液
６μＬ ２．５ｍＭ ｄＮＴＰｓ（Ｒｏｃｈｅ）
１μＬ ２０μＭ Ｇ５０７Ｓ ＱＣ ２ Ｆｏｒ
１μＬ ２０μＭ Ｇ５０７Ｓ ＱＣ ２ Ｒｅｖ
１μＬ Ｐｆｕ Ｕｌｔｒａ ＩＩ ＨＳポリメラーゼ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）
１μＬ ＤＮＡテンプレート（ＭＤ０９−１６３）
ＱｕｉｃｋＣｈａｎｇｅ変異導入−サイクルパラメーター
１）９５℃−４分
２）９５℃−２０秒
３）５２℃−２０秒
４）６８℃−７分
５）工程２へ戻る（５回繰り返す）
６）９５℃−２０秒
７）５５℃−２０秒
８）６８℃−７分
９）工程２へ戻る（２０回繰り返す）
１０）６８℃−１０分
１１）４℃−停止
表１３．ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ及び配列決定プライマー
Figure 2014502148
表１４．プラスミド：
Figure 2014502148
表１５．株：
Figure 2014502148
１）ウラジロハコヤナギＭＥＡ（＋）ＴＥＶ−ＭＤ０９−１６３（ＷＴ）のアミノ酸配列
ＭＥＡＲＲＳＡＮＹＥＰＮＳＷＤＹＤＹＬＬＳＳＤＴＤＥＳＩＥＶＹＫＤＫＡＫＫＬＥＡＥＶＲＲＥＩＮＮＥＫＡＥＦＬＴＬＬＥＬＩＤＮＶＱＲＬＧＬＧＹＲＦＥＳＤＩＲＧＡＬＤＲＦＶＳＳＧＧＦＤＡＶＴＫＴＳＬＨＧＴＡＬＳＦＲＬＬＲＱＨＧＦＥＶＳＱＥＡＦＳＧＦＫＤＱＮＧＮＦＬＥＮＬＫＥＤＩＫＡＩＬＳＬＹＥＡＳＦＬＡＬＥＧＥＮＩＬＤＥＡＫＶＦＡＩＳＨＬＫＥＬＳＥＥＫＩＧＫＥＬＡＥＱＶＮＨＡＬＥＬＰＬＨＲＲＴＱＲＬＥＡＶＷＳＩＥＡＹＲＫＫＥＤＡＮＱＶＬＬＥＬＡＩＬＤＹＮＭＩＱＳＶＹＱＲＤＬＲＥＴＳＲＷＷＲＲＶＧＬＡＴＫＬＨＦＡＲＤＲＬＩＥＳＦＹＷＡＶＧＶＡＦＥＰＱＹＳＤＣＲＮＳＶＡＫＭＦＳＦＶＴＩＩＤＤＩＹＤＶＹＧＴＬＤＥＬＥＬＦＴＤＡＶＥＲＷＤＶＮＡＩＮＤＬＰＤＹＭＫＬＣＦＬＡＬＹＮＴＩＮＥＩＡＹＤＮＬＫＤＫＧＥＮＩＬＰＹＬＴＫＡＷＡＤＬＣＮＡＦＬＱＥＡＫＷＬＹＮＫＳＴＰＴＦＤＤＹＦＧＮＡＷＫＳＳＳＧＰＬＱＬＶＦＡＹＦＡＶＶＱＮＩＫＫＥＥＩＥＮＬＱＫＹＨＤＴＩＳＲＰＳＨＩＦＲＬＣＮＤＬＡＳＡＳＡＥＩＡＲＧＥＴＡＮＳＶＳＣＹＭＲＴＫＧＩＳＥＥＬＡＴＥＳＶＭＮＬＩＤＥＴＷＫＫＭＮＫＥＫＬＧＧＳＬＦＡＫＰＦＶＥＴＡＩＮＬＡＲＱＳＨＣＴＹＨＮＧＤＡＨＴＳＰＤＥＬＴＲＫＲＶＬＳＶＩＴＥＰＩＬＰＦＥＲＥＮＬＹＦＱＧＬＥＨＨＨＨＨＨ
ＭＤ０９−１６３のＤＮＡ配列
ｔｇｇｃｇａａｔｇｇｇａｃｇｃｇｃｃｃｔｇｔａｇｃｇｇｃｇｃａｔｔａａｇｃｇｃｇｇｃｇｇｇｔｇｔｇｇｔｇｇｔｔａｃｇｃｇｃａｇｃｇｔｇａｃｃｇｃｔａｃａｃｔｔｇｃｃａｇｃｇｃｃｃｔａｇｃｇｃｃｃｇｃｔｃｃｔｔｔｃｇｃｔｔｔｃｔｔｃｃｃｔｔｃｃｔｔｔｃｔｃｇｃｃａｃｇｔｔｃｇｃｃｇｇｃｔｔｔｃｃｃｃｇｔｃａａｇｃｔｃｔａａａｔｃｇｇｇｇｇｃｔｃｃｃｔｔｔａｇｇｇｔｔｃｃｇａｔｔｔａｇｔｇｃｔｔｔａｃｇｇｃａｃｃｔｃｇａｃｃｃｃａａａａａａｃｔｔｇａｔｔａｇｇｇｔｇａｔｇｇｔｔｃａｃｇｔａｇｔｇｇｇｃｃａｔｃｇｃｃｃｔｇａｔａｇａｃｇｇｔｔｔｔｔｃｇｃｃｃｔｔｔｇａｃｇｔｔｇｇａｇｔｃｃａｃｇｔｔｃｔｔｔａａｔａｇｔｇｇａｃｔｃｔｔｇｔｔｃｃａａａｃｔｇｇａａｃａａｃａｃｔｃａａｃｃｃｔａｔｃｔｃｇｇｔｃｔａｔｔｃｔｔｔｔｇａｔｔｔａｔａａｇｇｇａｔｔｔｔｇｃｃｇａｔｔｔｃｇｇｃｃｔａｔｔｇｇｔｔａａａａａａｔｇａｇｃｔｇａｔｔｔａａｃａａａａａｔｔｔａａｃｇｃｇａａｔｔｔｔａａｃａａａａｔａｔｔａａｃｇｔｔｔａｃａａｔｔｔｃａｇｇｔｇｇｃａｃｔｔｔｔｃｇｇｇｇａａａｔｇｔｇｃｇｃｇｇａａｃｃｃｃｔａｔｔｔｇｔｔｔａｔｔｔｔｔｃｔａａａｔａｃａｔｔｃａａａｔａｔｇｔａｔｃｃｇｃｔｃａｔｇａａｔｔａａｔｔｃｔｔａｇａａａａａｃｔｃａｔｃｇａｇｃａｔｃａａａｔｇａａａｃｔｇｃａａｔｔｔａｔｔｃａｔａｔｃａｇｇａｔｔａｔｃａａｔａｃｃａｔａｔｔｔｔｔｇａａａａａｇｃｃｇｔｔｔｃｔｇｔａａｔｇａａｇｇａｇａａａａｃｔｃａｃｃｇａｇｇｃａｇｔｔｃｃａｔａｇｇａｔｇｇｃａａｇａｔｃｃｔｇｇｔａｔｃｇｇｔｃｔｇｃｇａｔｔｃｃｇａｃｔｃｇｔｃｃａａｃａｔｃａａｔａｃａａｃｃｔａｔｔａａｔｔｔｃｃｃｃｔｃｇｔｃａａａａａｔａａｇｇｔｔａｔｃａａｇｔｇａｇａａａｔｃａｃｃａｔｇａｇｔｇａｃｇａｃｔｇａａｔｃｃｇｇｔｇａｇａａｔｇｇｃａａａａｇｔｔｔａｔｇｃａｔｔｔｃｔｔｔｃｃａｇａｃｔｔｇｔｔｃａａｃａｇｇｃｃａｇｃｃａｔｔａｃｇｃｔｃｇｔｃａｔｃａａａａｔｃａｃｔｃｇｃａｔｃａａｃｃａａａｃｃｇｔｔａｔｔｃａｔｔｃｇｔｇａｔｔｇｃｇｃｃｔｇａｇｃｇａｇａｃｇａａａｔａｃｇｃｇａｔｃｇｃｔｇｔｔａａａａｇｇａｃａａｔｔａｃａａａｃａｇｇａａｔｃｇａａｔｇｃａａｃｃｇｇｃｇｃａｇｇａａｃａｃｔｇｃｃａｇｃｇｃａｔｃａａｃａａｔａｔｔｔｔｃａｃｃｔｇａａｔｃａｇｇａｔａｔｔｃｔｔｃｔａａｔａｃｃｔｇｇａａｔｇｃｔｇｔｔｔｔｃｃｃｇｇｇｇａｔｃｇｃａｇｔｇｇｔｇａｇｔａａｃｃａｔｇｃａｔｃａｔｃａｇｇａｇｔａｃｇｇａｔａａａａｔｇｃｔｔｇａｔｇｇｔｃｇｇａａｇａｇｇｃａｔａａａｔｔｃｃｇｔｃａｇｃｃａｇｔｔｔａｇｔｃｔｇａｃｃａｔｃｔｃａｔｃｔｇｔａａｃａｔｃａｔｔｇｇｃａａｃｇｃｔａｃｃｔｔｔｇｃｃａｔｇｔｔｔｃａｇａａａｃａａｃｔｃｔｇｇｃｇｃａｔｃｇｇｇｃｔｔｃｃｃａｔａｃａａｔｃｇａｔａｇａｔｔｇｔｃｇｃａｃｃｔｇａｔｔｇｃｃｃｇａｃａｔｔａｔｃｇｃｇａｇｃｃｃａｔｔｔａｔａｃｃｃａｔａｔａａａｔｃａｇｃａｔｃｃａｔｇｔｔｇｇａａｔｔｔａａｔｃｇｃｇｇｃｃｔａｇａｇｃａａｇａｃｇｔｔｔｃｃｃｇｔｔｇａａｔａｔｇｇｃｔｃａｔａａｃａｃｃｃｃｔｔｇｔａｔｔａｃｔｇｔｔｔａｔｇｔａａｇｃａｇａｃａｇｔｔｔｔａｔｔｇｔｔｃａｔｇａｃｃａａａａｔｃｃｃｔｔａａｃｇｔｇａｇｔｔｔｔｃｇｔｔｃｃａｃｔｇａｇｃｇｔｃａｇａｃｃｃｃｇｔａｇａａａａｇａｔｃａａａｇｇａｔｃｔｔｃｔｔｇａｇａｔｃｃｔｔｔｔｔｔｔｃｔｇｃｇｃｇｔａａｔｃｔｇｃｔｇｃｔｔｇｃａａａｃａａａａａａａｃｃａｃｃｇｃｔａｃｃａｇｃｇｇｔｇｇｔｔｔｇｔｔｔｇｃｃｇｇａｔｃａａｇａｇｃｔａｃｃａａｃｔｃｔｔｔｔｔｃｃｇａａｇｇｔａａｃｔｇｇｃｔｔｃａｇｃａｇａｇｃｇｃａｇａｔａｃｃａａａｔａｃｔｇｔｃｃｔｔｃｔａｇｔｇｔａｇｃｃｇｔａｇｔｔａｇｇｃｃａｃｃａｃｔｔｃａａｇａａｃｔｃｔｇｔａｇｃａｃｃｇｃｃｔａｃａｔａｃｃｔｃｇｃｔｃｔｇｃｔａａｔｃｃｔｇｔｔａｃｃａｇｔｇｇｃｔｇｃｔｇｃｃａｇｔｇｇｃｇａｔａａｇｔｃｇｔｇｔｃｔｔａｃｃｇｇｇｔｔｇｇａｃｔｃａａｇａｃｇａｔａｇｔｔａｃｃｇｇａｔａａｇｇｃｇｃａｇｃｇｇｔｃｇｇｇｃｔｇａａｃｇｇｇｇｇｇｔｔｃｇｔｇｃａｃａｃａｇｃｃｃａｇｃｔｔｇｇａｇｃｇａａｃｇａｃｃｔａｃａｃｃｇａａｃｔｇａｇａｔａｃｃｔａｃａｇｃｇｔｇａｇｃｔａｔｇａｇａａａｇｃｇｃｃａｃｇｃｔｔｃｃｃｇａａｇｇｇａｇａａａｇｇｃｇｇａｃａｇｇｔａｔｃｃｇｇｔａａｇｃｇｇｃａｇｇｇｔｃｇｇａａｃａｇｇａｇａｇｃｇｃａｃｇａｇｇｇａｇｃｔｔｃｃａｇｇｇｇｇａａａｃｇｃｃｔｇｇｔａｔｃｔｔｔａｔａｇｔｃｃｔｇｔｃｇｇｇｔｔｔｃｇｃｃａｃｃｔｃｔｇａｃｔｔｇａｇｃｇｔｃｇａｔｔｔｔｔｇｔｇａｔｇｃｔｃｇｔｃａｇｇｇｇｇｇｃｇｇａｇｃｃｔａｔｇｇａａａａａｃｇｃｃａｇｃａａｃｇｃｇｇｃｃｔｔｔｔｔａｃｇｇｔｔｃｃｔｇｇｃｃｔｔｔｔｇｃｔｇｇｃｃｔｔｔｔｇｃｔｃａｃａｔｇｔｔｃｔｔｔｃｃｔｇｃｇｔｔａｔｃｃｃｃｔｇａｔｔｃｔｇｔｇｇａｔａａｃｃｇｔａｔｔａｃｃｇｃｃｔｔｔｇａｇｔｇａｇｃｔｇａｔａｃｃｇｃｔｃｇｃｃｇｃａｇｃｃｇａａｃｇａｃｃｇａｇｃｇｃａｇｃｇａｇｔｃａｇｔｇａｇｃｇａｇｇａａｇｃｇｇａａｇａｇｃｇｃｃｔｇａｔｇｃｇｇｔａｔｔｔｔｃｔｃｃｔｔａｃｇｃａｔｃｔｇｔｇｃｇｇｔａｔｔｔｃａｃａｃｃｇｃａｔａｔａｔｇｇｔｇｃａｃｔｃｔｃａｇｔａｃａａｔｃｔｇｃｔｃｔｇａｔｇｃｃｇｃａｔａｇｔｔａａｇｃｃａｇｔａｔａｃａｃｔｃｃｇｃｔａｔｃｇｃｔａｃｇｔｇａｃｔｇｇｇｔｃａｔｇｇｃｔｇｃｇｃｃｃｃｇａｃａｃｃｃｇｃｃａａｃａｃｃｃｇｃｔｇａｃｇｃｇｃｃｃｔｇａｃｇｇｇｃｔｔｇｔｃｔｇｃｔｃｃｃｇｇｃａｔｃｃｇｃｔｔａｃａｇａｃａａｇｃｔｇｔｇａｃｃｇｔｃｔｃｃｇｇｇａｇｃｔｇｃａｔｇｔｇｔｃａｇａｇｇｔｔｔｔｃａｃｃｇｔｃａｔｃａｃｃｇａａａｃｇｃｇｃｇａｇｇｃａｇｃｔｇｃｇｇｔａａａｇｃｔｃａｔｃａｇｃｇｔｇｇｔｃｇｔｇａａｇｃｇａｔｔｃａｃａｇａｔｇｔｃｔｇｃｃｔｇｔｔｃａｔｃｃｇｃｇｔｃｃａｇｃｔｃｇｔｔｇａｇｔｔｔｃｔｃｃａｇａａｇｃｇｔｔａａｔｇｔｃｔｇｇｃｔｔｃｔｇａｔａａａｇｃｇｇｇｃｃａｔｇｔｔａａｇｇｇｃｇｇｔｔｔｔｔｔｃｃｔｇｔｔｔｇｇｔｃａｃｔｇａｔｇｃｃｔｃｃｇｔｇｔａａｇｇｇｇｇａｔｔｔｃｔｇｔｔｃａｔｇｇｇｇｇｔａａｔｇａｔａｃｃｇａｔｇａａａｃｇａｇａｇａｇｇａｔｇｃｔｃａｃｇａｔａｃｇｇｇｔｔａｃｔｇａｔｇａｔｇａａｃａｔｇｃｃｃｇｇｔｔａｃｔｇｇａａｃｇｔｔｇｔｇａｇｇｇｔａａａｃａａｃｔｇｇｃｇｇｔａｔｇｇａｔｇｃｇｇｃｇｇｇａｃｃａｇａｇａａａａａｔｃａｃｔｃａｇｇｇｔｃａａｔｇｃｃａｇｃｇｃｔｔｃｇｔｔａａｔａｃａｇａｔｇｔａｇｇｔｇｔｔｃｃａｃａｇｇｇｔａｇｃｃａｇｃａｇｃａｔｃｃｔｇｃｇａｔｇｃａｇａｔｃｃｇｇａａｃａｔａａｔｇｇｔｇｃａｇｇｇｃｇｃｔｇａｃｔｔｃｃｇｃｇｔｔｔｃｃａｇａｃｔｔｔａｃｇａａａｃａｃｇｇａａａｃｃｇａａｇａｃｃａｔｔｃａｔｇｔｔｇｔｔｇｃｔｃａｇｇｔｃｇｃａｇａｃｇｔｔｔｔｇｃａｇｃａｇｃａｇｔｃｇｃｔｔｃａｃｇｔｔｃｇｃｔｃｇｃｇｔａｔｃｇｇｔｇａｔｔｃａｔｔｃｔｇｃｔａａｃｃａｇｔａａｇｇｃａａｃｃｃｃｇｃｃａｇｃｃｔａｇｃｃｇｇｇｔｃｃｔｃａａｃｇａｃａｇｇａｇｃａｃｇａｔ
[配列表１]
Figure 2014502148
３）ウラジロハコヤナギＭＥＡ Ｇ４９１Ｓ（＋）ＴＥＶ−ｐＤＷ１００（Ｇ４９１Ｓ）のアミノ酸配列
ＭＥＡＲＲＳＡＮＹＥＰＮＳＷＤＹＤＹＬＬＳＳＤＴＤＥＳＩＥＶＹＫＤＫＡＫＫＬＥＡＥＶＲＲＥＩＮＮＥＫＡＥＦＬＴＬＬＥＬＩＤＮＶＱＲＬＧＬＧＹＲＦＥＳＤＩＲＧＡＬＤＲＦＶＳＳＧＧＦＤＡＶＴＫＴＳＬＨＧＴＡＬＳＦＲＬＬＲＱＨＧＦＥＶＳＱＥＡＦＳＧＦＫＤＱＮＧＮＦＬＥＮＬＫＥＤＩＫＡＩＬＳＬＹＥＡＳＦＬＡＬＥＧＥＮＩＬＤＥＡＫＶＦＡＩＳＨＬＫＥＬＳＥＥＫＩＧＫＥＬＡＥＱＶＮＨＡＬＥＬＰＬＨＲＲＴＱＲＬＥＡＶＷＳＩＥＡＹＲＫＫＥＤＡＮＱＶＬＬＥＬＡＩＬＤＹＮＭＩＱＳＶＹＱＲＤＬＲＥＴＳＲＷＷＲＲＶＧＬＡＴＫＬＨＦＡＲＤＲＬＩＥＳＦＹＷＡＶＧＶＡＦＥＰＱＹＳＤＣＲＮＳＶＡＫＭＦＳＦＶＴＩＩＤＤＩＹＤＶＹＧＴＬＤＥＬＥＬＦＴＤＡＶＥＲＷＤＶＮＡＩＮＤＬＰＤＹＭＫＬＣＦＬＡＬＹＮＴＩＮＥＩＡＹＤＮＬＫＤＫＧＥＮＩＬＰＹＬＴＫＡＷＡＤＬＣＮＡＦＬＱＥＡＫＷＬＹＮＫＳＴＰＴＦＤＤＹＦＧＮＡＷＫＳＳＳＧＰＬＱＬＶＦＡＹＦＡＶＶＱＮＩＫＫＥＥＩＥＮＬＱＫＹＨＤＴＩＳＲＰＳＨＩＦＲＬＣＮＤＬＡＳＡＳＡＥＩＡＲＧＥＴＡＮＳＶＳＣＹＭＲＴＫＧＩＳＥＥＬＡＴＥＳＶＭＮＬＩＤＥＴＷＫＫＭＮＫＥＫＬＳＧＳＬＦＡＫＰＦＶＥＴＡＩＮＬＡＲＱＳＨＣＴＹＨＮＧＤＡＨＴＳＰＤＥＬＴＲＫＲＶＬＳＶＩＴＥＰＩＬＰＦＥＲＥＮＬＹＦＱＧＬＥＨＨＨＨＨＨ
ｐＤＷ１００のＤＮＡ配列
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[配列表２]
Figure 2014502148
ＩｓｐＳ−Ｇ４９１Ｓの発現及び精製
６×Ｈｉｓタグ付与したＩｓｐＳ−Ｇ４９１Ｓの発現
Ｎ末端に６×Ｈｉｓタグ付与したＩｓｐＳをＤＷ３９８株で発現させ、これを精製した。増殖法は、ＢＬ２１（λＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞で発現させたヒスチジンタグ付加酵素に好適なものである。各１Ｌの予定していた増殖用に、１０ｍＬの一晩培養物を調製した。２５ｍＬフラスコを用い、１０ｍＬ ＬＢ培地に適切な抗生物質（５０ｍｇ／ｍＬカナマイシン、２５ｍｇ／ｍＬクロラムフェニコール）を加え、新しい細胞プレートから１コロニーを接種し、あるいは凍結させたグリセロールストックを直接摂取した。約２２０ｒｐｍで振盪させながら、培養物を３０℃で一晩増殖させた。一日培養物は、各培養時に適切な抗生物質を添加した１Ｌ ＬＢ培地で調製した。各１Ｌの一日培養物に１０ｍＬの一晩培養物を接種し、ＯＤ６００が約０．４〜０．６に到達するまで、約２２０ｒｐｍで振盪しながら３０〜３７℃で増殖させた。次に、４００μＭのＩＰＴＧにより１日培養物に発現誘導を行い、２２０ｒｐｍで振盪しながら３０℃にて５〜６時間増殖させた。次に、４℃にて１０，０００×ｇで１０分間遠心沈降し、細胞を回収した。回収後、細胞は次工程に直接用いるか、あるいは使用までの間−８０℃で保存した。
６×Ｈｉｓタグ付加したＩｓｐＳの精製
ヒスチジンタグ付加した酵素をＢＬ２１（λＤＥ３）ｐＬｙｓＳ細胞から精製するにあたって、細胞を新鮮な溶解緩衝液（溶解緩衝液（ｐＨ ８．０）：Ｎｉ洗浄緩衝液＋０．５ｍＭ ＰＭＳＴ、０．０１％ Ｔｗｅｅｎ−２０、１ｍｇ／ｍＬリゾチーム、０．２ｍｇ／ｍＬ ＤＮａｓｅＩ、Ｎｉ洗浄緩衝液：５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール）に穏やかに再懸濁した。細胞ペレットに対し、培養培地１Ｌにつき約４０〜５０ｍＬ溶解緩衝液を使用した。次に細胞を氷上で約３０分インキュベートした。次に、可溶化液が透明になり始めるまで、フレンチプレスのセルを２〜３回通過させて（１２００ｐｓｉ／Ｈｉｇｈ ｓｅｔｔｉｎｇ（８．２７ＭＰａ／Ｈｉｇｈ ｓｅｔｔｉｎｇ）に設定して大型フレンチプレスセルを使用）、細胞懸濁液を完全に可溶化させた。活性解析及びゲル解析（約１００μＬ）のため可溶化液を保存した。次に、Ｓｏｒｖａｌｌ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ９０ＳＥ超遠心機により、４℃にて３０，０００ｘｇで３０分遠心分離し、可溶化液を清澄化させた。上清を回収し、維持した。「清澄化させた可溶化液」試料を、活性解析及びゲル解析のため保存した（約１００μＬ）。
清澄化させた可溶化液を、０〜１００％ Ｎｉ緩衝液Ｂを用い、ＨｉｓＴｒａｐ ＨＰカラム（ＧＥ ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）に充填した。カラムに可溶化液を充填した後、このカラムをＮｉ洗浄緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍｍ ＮａＣｌ、２０ｍＭイミダゾール（ｐＨ ８．０））により洗浄した。次に、０〜１００％ Ｎｉ溶出緩衝液（５０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、３００ｍＭ ＮａＣｌ、５００ｍＭイミダゾール（ｐＨ ８．０））を用い、カラムからｈｉｓタグ付加ＩｓｐＳを溶出させ、ｈｉｓタグ付加ＩｓｐＳを含有している画分を回収した。次にカラムをＮｉ脱着緩衝液（２０ｍＭ ＮａＨ２ＰＯ４、０．５ｍ ＮａＣｌ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ ７．４））で洗浄した。次に、製造元の指示に従い、試料をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（４〜１２％ゲルＮＵＰＡＧＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により解析した。所望の画分をスピンフィルタ（Ｖｉｖａｓｐｉｎ−２０、Ｓａｒｔｏｒｉｓ）で濃縮し、次に、Ｓｅｐｈａｄｅｘ Ｇ２５樹脂を装填したＨｉ Ｐｒｅｐ ２６／１０脱塩カラム（ＧＥ ｈｅａｔｈｃａｒｅ）で脱塩した。Ｇ−２５緩衝液は、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、及び１ｍＭ ＤＴＴからなり、ｐＨ ７．４であった。次に画分を解析し、濃縮した。次に試料を−８０℃で保存した。
ＴＥＶ切断（ＤＷ３９８株由来のＩｓｐＳ−Ｇ４９１Ｓ）
ＤＷ３９８株については上記のとおりである。消化にはＴｕｒｂｏＴＥＶプロテアーゼ（Ｅｔｏｎ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ Ｉｎｃ．）を用いた。精製タンパク質１０μｇにつき１単位のＴｕｒｂｏＴＥＶを使用した。消化は４℃で一晩行った。試料をＮｉ緩衝液で平衡化させた他のＮｉカラムに素通りさせ、未切断の酵素、タグ、ＴｕｒｂｏＴＥＶプロテアーゼ（同様にタグ付加されている）、及び不純物を除去した。Ｎｉカラムを素通りさせ、洗浄液をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル（ＮＵＰＡＧＥ、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ；図１６）を用い解析し、及びＤＭＡＰＰ活性を解析した。高純度の酵素を含油している試料をプールし、１ｍＭ ＤＴＴを含有している５０ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ ７．４）緩衝液で脱塩し、−８０℃で保存した。
結晶構造の決定
構造物ＤＷ３９８を記載の通りに生成し、次に、可能性のある結晶化条件を検討するためにタンパク質濃縮液を調製した。構造物を精製し、以下に記載の通りに別個に結晶化条件を検討した。研究室内で行ったすべての結晶化スクリーニングには、ハンギングドロップ蒸気拡散法を採用し、設定を行った。最小限に、市販のスクリーニングキット：Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社（Ａｌｉｓｏ Ｖｉｅｊｏ、ＣＡ）のＣｒｙｓｔａｌ Ｓｃｒｅｅｎ及びＱｉａｇｅｎ社（Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）のＪＣＳＧ＋Ｓｕｉｔｅを用い、構造物を調査した。
Ｈａｍｐｔｏｎ Ｒｅｓｅａｒｃｈ社のＣｒｙｓｔａｌ Ｓｃｒｅｅｎ及びＱｉａｇｅｎ社のＪＣＳＧ＋Ｓｕｉｔｅを用い、最初の結晶化スクリーニングを設定した。数多くの条件でこの構造物から結晶の生成が観察された；条件の最適化には、ｐＨ、沈殿剤、濃度、及びインヒビターの１００通りもの調整が包含された。最適化実験により、回折用に１０種の異なるＤＷ３９８結晶を選別した。ＩｓｐＳ−Ｇ４９１Ｓタンパク質からなり、３．５Åの分解能で回折する結晶を得た。大きな、棒状の結晶は正方形の空間群Ｐ４３２１２に属し、格子定数はａ＝１５４．７５、ｂ＝１５４．７５、ｃ＝１４２．２０である。２．５μＬタンパク質（１０ｍｇ／ｍＬタンパク質）を２．５μＬ沈殿剤［０．１Ｍマロン酸ナトリウム（ｐＨ ７．０）、１８％（重量／体積）ポリエチレングリコール３３５０、０．２Ｍチオシアン酸ナトリウム］と混合し、５００μＬ沈殿剤に対し平衡化させ、結晶を成長させた。液体窒素による結晶の急速凍結前に、結晶は０．１Ｍマロン酸ナトリウム（ｐＨ ７．０）、１８％（重量／体積）ポリエチレングリコール３３５０、０．２Ｍチオシアン酸ナトリウム、及び２５％（重量／体積）エチレングリコールに通し、凍結保護した。
結晶をスタンフォード・シンクロトロン放射光研究所に送付し、ビームライン７−１でデータを回収し、解像度２．６Åの回折像を得た。Ｍｏｓｆｌｍ（Ｌｅｓｌｉｅ，Ａ．（１９９８）Ｊ．ｏｆ Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ ３０，１０３６〜１０４０）によりデータを統合し、ＳＣＡＬＡ（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ，Ｎ．（１９９４）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｄ ５０，７６０〜７６３）によりスケーリングした。国際公開第２００９／１３２２２０号に記載の通りの開始モデルとして、事前に構造決定していたウラジロハコヤナギ由来のＩｓｐＳ構造を用い、データを段階的にＭＯＬＲＥＰ（Ｖａｇｉｎ，Ａ．，ａｎｄ Ｔｅｐｌｙａｋｏｖ，Ａ．（１９９７）Ｊ．ｏｆ Ａｐｐｌ．Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｙ ３０，１０２２〜１０２５）解析した。結晶は、溶媒含量６３％で、単位が非対称の二量体を１つ含有していた。
可視化プログラムのＣｏｏｔ（Ｅｍｓｌｅｙ，Ｐ．，ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｄ ６６，４８６〜５０１）を用い、マニュアルで再構築を繰り返す工程では、Ｒｅｆｍａｃ５（Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｃｏｍｐｕｔａｔｉｏｎａｌ Ｐｒｏｊｅｃｔ，Ｎ．（１９９４）Ａｃｔａ Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃａ Ｓｅｃｔｉｏｎ Ｄ ５０，７６０〜７６３）により微調整を行った。微調整の間、Ｍｏｌｐｒｏｂｉｔｙを用いタンパク質の幾何を確認した（Ｄａｖｉｓ，Ｉ．Ｗ．，ｅｔ ａｌ．（２００７）Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．，３５：Ｗ３７５〜Ｗ３８３）。現行モデルではＲＷｏｒｋ値は２３．５％であり、ＲＦｒｅｅ値は２８．６％である。
構造体は二量体から構成されていた（図１７）。各モノマーは２つのらせん状のドメイン、活性部位を含むＣ末端ドメイン、及び機能未知のＮ端末ドメインから構成される。電子密度により、株ＤＷ３９８の位置４９１にはセリンが存在することが明確に示された（図１８）。野生型ＩｓｐＳ及びＩｓｐＳ−Ｇ４９１Ｓの構造アラインメントにより、全体的な折りたたみには変化が見られないものの、残基４９０〜４９７を含有しているループの立体構造は、野生型タンパク質及び変異体タンパク質の間で異なっていることが示される（図１９）。座標を付属書１に掲載する。
実施例７：ウラジロハコヤナギＩｓｐＳの完全な部位評価ライブラリ（ＳＥＬ）の主要な比活性の解析
親ベクターｐＣＬ２０１に完全なウラジロハコヤナギイソプレン合成酵素（ＭＥＡウラジロハコヤナギ）骨格鎖（５４４アミノ酸）の部位評価ライブラリ（ＳＥＬ）を構築し（図４）、比活性についてスクリーニングして、特性の改良されたイソプレン合成酵素（ＩｓｐＳ）分子を同定した。ほとんどの場合、所定の位置のＳＥＬは、野生型を含む全２０種の可能性のあるアミノ酸を含有していた。各ライブラリの付番はＭＥＡウラジロハコヤナギ（図２０）のＯＲＦに対応させ、開始メチオニンを位置１とする。ＭＤ０９−１７０細胞に、発現させる変異体を含有させた個々の株を、各ウェルが、ＭＥＡウラジロハコヤナギの所定の位置での特異的なアミノ酸置換に対応するよう、マイクロタイタープレートに整列させた。マイクロタイタープレートには、可能性のある置換を全て組み込んだ４種のＳＥＬ、すなわちＭＥＡウラジロハコヤナギの４箇所の位置を収容させた。残りのウェルには対照株を用いた。各試料に含まれるＩｓｐＳタンパク質の一定量ごとに生産されたイソプレンの量を測定するために、プレートで株を増殖させ、発現誘導し、可溶化させた。ＳＥＬのすべての組み合わせに含まれる全ての変異体について比活性を算出した。
方法
細胞増殖及び可溶化
ＭＥＡウラジロハコヤナギＩｓｐＳライブラリのグリセロールストックを短時間で解凍し、カナマイシンを２０ｕｇ／ｍＬで添加した液体ＬＢ培地を含有させたマイクロタイタープレート（Ｃｅｌｌｓｔａｒ）に播種した。Ｅｎｚｙｓｃｒｅｅｎ ｃｌａｍｐシステム（Ｅｎｚｙｓｃｒｅｅｎ）を用い、培養物を、振盪インキュベータ内で、飽和するまで２５０ｒｐｍ、３０℃で一晩増殖させた。翌日、培養物を回収し、５０ｕｇ／ｍＬカナマイシン及び５０ｕＭ ＩＰＴＧを含有させたＴＭ３−グルコース培地に、Ｌｉｑｕｉｄａｔｏｒ９６ピペット（Ｒａｉｎｉｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用い１：１０比で接種した。野生型対照をそれぞれ増殖させ、ＴＭ３−グルコースを含有させた各マイクロタイタープレートに接種した。それぞれのウェルには３０ｕＭ〜６５ｕＭのＩＰＴＧを用い誘導強度を測定した。プレートを振盪インキュベータに戻し、２５０ｒｐｍ、３０℃で発現誘導を５時間行った。次にインキュベータからプレートを取り出し、卓上遠心機で３７００ｒｐｍ、４℃で２０分遠心沈降させ、培養物をポリプロピレン製マイクロタイタープレート（Ｎｕｎｃ）に播種した。上清を除去し、溶解、ＤＭＡＰＰアッセイ、及びタンパク質の定量までの間、ペレットは−８０℃で保存した。
細胞の溶解前に、プレートは−８０℃の冷凍庫から取り出し、卓上で１０分間解凍した。Ｂｉｏｍｅｋ自動化ワークステーション（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）により、ペレットを２００ｕＬ溶解緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ、１００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ ７．６）緩衝液、１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、５０Ｕ／ｕＬ Ｅｐｉｃｅｎｔｒｅ ｒｅａｄｙｌｙｓｅリゾチーム、０．１ｍｇ／ｍＬ ＤＮａｓｅ、０．５ｍＭ ＰＭＳＦ／ＡＥＢＳＦ、５ｍＭ ＭｇＣｌ２）に十分再懸濁し、除去し、室温で４５０ｒｐｍで３０分振盪した。次に溶解液を３２００ｒｐｍ、４℃で１０分遠心処理し、ＤＭＡＰＰ及びドット・ブロット・アッセイのため、Ｂｉｏｍｅｋにより１５０ｕＬ上清を新しいマイクロタイタープレートに分取した。
ＤＭＡＰＰアッセイ
ＤＭＡＰＰアッセイに際し、Ｌｉｑｕｉｄａｔｏｒ９６ピペット（Ｒａｉｎｉｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）を用い、９６ウェルガラスブロック（Ｚｉｎｓｅｒ）中の７５ｕＬ ＤＭＡＰＰアッセイ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ／１００ｍＭ ＮａＣｌ（ｐＨ ７．６）、１ｍｇ／ｍＬ ＢＳＡ、５０ｍＭ ＭｇＣｌ２、１ｍＭ ＤＭＡＰＰ）に２５ｕＬ 可溶化液を添加した。ガラスブロックをアルミホイルシール（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）で密閉し、室温で４５０ｒｐｍで１分インキュベートした。ガラスブロックを次に３４℃の水浴で３０分インキュベートした後、７０℃で２分インキュベートし反応を停止させた。ＧＣ−ＭＳに充填する前にＢｌｏｃｋｓを短時間冷却させた。
密閉したガラスブロックを、水素炎イオン化検出器（ＦＩＤ）と、ＣＴＣ ＣｏｍｂｉＰＡＬオートサンプラーとを取り付けたＡｇｉｌｅｎｔ ７８９０ａガスクロマトグラフィー（ＧＣ）システムに充填した。ＧＣ ＦＩＤ法に用いたパラメーターを以下に記載する。
カラム：ＺＢ−５ｍｓ
寸法：１５ｍｘ０．２５ｍｍ×０．２５μｍ
オーブン：
Figure 2014502148
ＧＣはＣｈｅｍｓｔａｔｉｏｎソフトウェア（バージョンＥ．０２．００．４９３）を使用して制御し、ＣＴＣオートサンプラーはＣｙｃｌｅ Ｃｏｍｐｏｓｅｒソフトウェア（バージョン１．５．２）を使用して制御した。Ｃｙｃｌｅ Ｃｏｍｐｏｓｅｒソフトウェアは、連続的に１つの試料を注入した後に他の試料を順に注入するという作業を合計で４８回行うようプログラムした。較正に応答する因子を測定するため、０．２％（体積／体積）イソプレン／窒素ガス（Ａｉｒ Ｌｉｑｕｉｄｅ）を標準として使用した。３つの別個の２ｍＬバイアル瓶に較正ガスを充填し、上記の方法により解析して、応答因子の平均量を定量した。算出した応答因子量をもとに、マイクロソフトエクセルにより、個々の試料のピーク面積をイソプレン濃度の計算値に変換した。
タンパク質定量
タンパク質定量アッセイ前に、各プレート由来の複数の野生型試料をＧＣ−ＭＳによりイソプレンについて解析し、比活性が既知のＭＥＡウラジロハコヤナギをもとにタンパク質濃度を逆算し、マイクロタイタープレート中の全ての試料の平均ＩｓｐＳ量を定量した。ドット・ブロット・アッセイを実施する際、ニトロセルロース膜（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を、１Ｘ ＰＢＳ緩衝液（１０ｍＭリン酸ナトリウム、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（ＰＨ７．８＋／−０．２））に浸し、少なくとも５分平衡化させた。次に、Ｈａｍｉｌｔｏｎ ＭｉｃｒｏＬａｂ ＳＴＡＲ液体操作ワークステーションにより、ウラジロハコヤナギＩｓｐＳの充填濃度が０．０２５〜０．５ｕｇになるよう可溶化液を１Ｘ ＰＢＳで希釈した。精製した標準を濃度０．０２５〜１ｕｇで添加した。ブロッティングユニット（Ｍｉｎｉｆｏｌｄ−１、Ｗｈａｔｍａｎ）を、製造元の推奨するプロトコルに従って組み立てた。陰圧を短時間加え、過剰な１Ｘ ＰＢＳ緩衝液を除去した。試料（各約２００ｕＬ）をＭｉｎｉｆｏｌｄ−１に分取し、２０ｋＰａで陰圧を加えた。試料を完全に濾過した後、ウェルを１Ｘ ＰＢＳ緩衝液２００ｕＬで一回洗浄した。洗浄緩衝液を膜から完全に除去してから真空を解除し、ピンセットを使用して膜を注意深く取り外し、ラベリングし、きれいなろ紙上で乾燥させた。
ニトロセルロース膜上の各位置にブロットされたウラジロハコヤナギＩｓｐＳ分子を、ＷｅｓｔｅｒｎＢｒｅｅｚｅキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）により免疫検出した。一次モノクローナル又はポリクローナル抗体（抗精製ウラジロハコヤナギＩｓｐＳマウス抗体、Ｐｒｏｓｃｉ Ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｅｄ）はブロッキング溶液により１：５０００希釈し、二次抗体（Ａｌｅｘａ Ｆｌｕｏｒ ４８８抗マウスヤギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）、Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）はブロッキング溶液により２ｕｇ／ｍＬに希釈した。製造元の推奨するプロトコルに従って、Ｓｔｏｒｍ ８６０分子イメージャー（ＧＭＩ，Ｉｎｃ．）及びＩｍａｇｅＱｕａｎｔソフトウェア（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）により蛍光スポットを定量し、マイクロソフト・エクセルにより既知の標準と比較することで各試料の比タンパク質濃度を測定した。
結果
ＳＥＬのすべての組み合わせに含まれる各変異体毎に、所定の時間で製造されたイソプレンモル量を、各試料に含まれるタンパク質の具体的な量で除算することにより、比活性値を算出した。性能指数（ＰＩ）は、任意の所定の変異体の比活性を、同一のマイクロタイタープレートで得られたいくつかの野生型の比活性測定値の平均により除算することにより算出した。例えば、比活性のＰＩ値が１．５である変異体は、野生型と比較して活性が５０％増大している。同様の手法で、タンパク質濃度及びイソプレン生産のＰＩも算出し、これらの値を、より詳細なデータ解析に利用した。
表１６に、表１７及び１８に掲載する残基の配置に関し正確な定義を提供する。例えば、表１７又は１８で「Ｎ−末端」として掲載する残基は、参照配列ＭＥＡウラジロハコヤナギＩｓｐＳ（配列番号１）の残基１〜２１５である。
表１６．ＭＥＡウラジロハコヤナギＩｓｐＳアミノ酸位置の配置に関する定義
Figure 2014502148
ＭＥＡウラジロハコヤナギ構造内の対象とするアミノ酸の表面接近性及び推定機能も表１７及び１８に掲載する。Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐｕｔｉｎｇ Ｇｒｏｕｐ，Ｉｎｃ．により作成され、保守されているＭＯＥプログラムにより表面接近性を算出した。各残基の親水性表面領域を推定し、特定の半径を有するプローブを用い評価した。次に、推定データをペプチドライブラリと比較し、これらのデータ間の比を表面接近性（％）として記録した。表１７及び１８にも各残基に推定される機能を掲載する。例えば、機能としては、限定するものではないが、金属の結合（活性部位）、基質の捕捉、ループ形状の変形、ポット内でのその他の相互作用、及び二量体形成などが挙げられる。
一次データをもとに、ＭＥＡウラジロハコヤナギ内の、野生型残基から変えるのに向かない残基位置を同定した（表１７、図２３〜２９を参照されたい）。これらの位置に野生型のものとは異なるアミノ酸置換をもつＭＥＡウラジロハコヤナギ変異体は、３０％（ＰＩ≦０．３）以下の非活性を示し、すなわち機能的に不活性であった。これはつまり、ＭＥＡウラジロハコヤナギによりＤＭＡＰＰをイソプレンへと効率的に変換するにあたり、最低限これらの位置に野生型残基が存在する必要があることを意味する。これらの位置の多くはＭＥＡウラジロハコヤナギの活性部位に、又は活性部位近傍（図２４を参照されたい）に位置し、限定するものではないが、金属の結合（基質の配向に関係）、基質の捕捉、基質の結合、及び触媒に関与するものと推定される。例えば、図２５は、酵素機能における役割が未知である残基位置を示す。図２６は、ＩｓｐＳ二量体形成に関与し得る残基位置を示し、図２７及び２８はＮ末端に含まれ、又はＮ末端と相互作用し、ループによる遮蔽又は活性部位の機能に関与し得る残基位置を示す。図２９は、基質捕捉ループ内に存在する、置換に耐性のない（tolerate no substitutions）残基位置を示す。
再試験に当たり、最初のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ時に野生型よりも高い比活性を示す変異体を選別した。上記の方法に従い、但し、免疫検出の際に、標準的な生化学的実施法に従って、ポリクローナル抗体に加えてモノクローナル抗体を使用して、変異体を試験した。表１８に、再試験を行った変異体のうち、野生型よりも比活性の高かった（ＰＩ＞１．３）変異体の一覧を掲載する。図３０は、再試験時に変異体が比活性の増大を示した、ＩｓｐＳの結晶構造中の全ての位置を示す。これらの変異により、表１８に掲載する推定上の機能を変更／増感させることで、ＩｓｐＳに対し、野生型酵素と比べ比活性上の利益が付与される。図３１は、変異体が比活性の増大を示すことになる、ＩｓｐＳのＮ末端内に埋め込まれている又はＩｓｐＳのＮ末端と相互作用する残基位置を示す。図３２は、変異体が比活性の増大を示すことになる、ＩｓｐＳのＣ末端内に埋め込まれている又はＩｓｐＳのＣ末端と相互作用する残基位置を示す。図３３は、ＩｓｐＳ変異体の二量体形成に正に作用する位置２４７を示し、図３４は、変異体の比活性に明らかに有益である、Ｎ末端中のその他の残基位置を示す。図３５は、変異体の比活性が高くなる、表面ループ上の残基配置を示し、図３６は、変異体の比活性が高くなる、酵素表面上のループ以外の場所の残基配置を示す。図３７は、変異体の比活性が野生型と比較して高くなる、基質捕捉ループ（推定）における残基配置を示す。この領域の特定の残基位置に、活性が増大する変異を有するものの、隣接する位置に変化はない（表１７及び図２９を参照されたい）。これにより、ＩｓｐＳにおいて「基質捕捉ループ」であると推定された部位は、酵素作用によりＤＭＡＰＰをイソプレンに変換するにあたって重要な部位であり、変化による影響を受けやすく、この部位を変化させることで、活性には負の又は正の作用のいずれかが生じ得ることが示される。表１８に掲載し、図３０〜３７に示したすべての変異体、又はこれらの変異体の組み合わせにより、酵素に更に効率的にＤＭＡＰＰをイソプレンに変換させるＩｓｐＳ変異が示される。
Figure 2014502148
表１８．ＭＥＡウラジロハコヤナギの再試験した変異体のうち比活性のＰＩが
１．３以下であるもの
Figure 2014502148
Figure 2014502148
実施例８：一次スクリーニングにより得られた１０２４の変異体に対する増殖アッセイ
ＤＭＡＰＰのイソプレンへの変換を触媒する酵素能を増大させるＭＥＡウラジロハコヤナギ変異体を、ｉｎ ｖｉｔｒｏでの一次比活性スクリーニングにより同定した。ＩｓｐＳは生細胞内で機能すべき酵素であることから、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて酵素の示すＤＭＡＰＰのイソプレンへの変換能を測定する必要もあった。実施例１及び２は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＩｓｐＳの有効性を評価するための方法論を示す。本質的に、ＤＭＡＰＰのイソプレンへの変換により、ＩｓｐＳは、大腸菌の増殖に対するＤＭＡＰＰの毒性効果を軽減する。増殖曲線において野生型と比較して性能が増大しているということは、所定の株内でイソプレン合成酵素の機能が向上していることを意味する。ＩｓｐＳ変異体が、比活性の向上と、最良の増殖性能のいずれをも示すことは、発酵時のイソプレン生産を向上させるのに最も合う酵素の指標になる。
方法
増殖アッセイ及び比活性の測定
増殖性を試験し、野生型ＭＥＡウラジロハコヤナギ酵素に対して比活性が増大していることを確認するため、一次比活性スクリーニングから得られた１０２４の変異体を選別した。本試験の実施にあたり、変異性の高い（変異忍容性）位置に変異をもち、比活性及び発現性のいずれもが野生型と比較して優位に低下していない変異体を選別した。増殖アッセイ用に、もとのグリセロールストックプレートから個々の変異体を単離し、再配置した。メバロン酸（ＭＶＡ）の存在下で、変異体に対し低濃度及び高濃度のＩＰＴＧにより誘導を行い、増殖曲線を生成した。これらの株では、ＭＶＡが取り込まれ、かつ細胞増殖に対し毒性を示すＤＭＡＰＰがメバロン酸経路に積極的に取り込まれる。機能性のウラジロハコヤナギＩｓｐＳ分子を発現させることで、ＤＭＡＰＰのイソプレンへの変換と、増殖阻害の緩和が得られる。これらのアッセイでは、良好に機能するＩｓｐＳ分子ほどＤＭＡＰＰをイソプレンへと効果的に変換し、結果として増殖性が向上する。
ＭＥＡウラジロハコヤナギＩｓｐＳライブラリのグリセロールストックを短時間で解凍し、カナマイシンを２０μｇ／ｍＬで添加した液体ＬＢ培地を含有させたマイクロタイタープレートに播種した。培養物を、振盪インキュベータ内で、飽和するまで２５０ｒｐｍ、３０℃で一晩増殖させた。翌日、培養物を回収し、５０ｕｇ／ｍＬカナマイシン、及び４０又は１００ｕＭ ＩＰＴＧ（Ｓｉｇｍａ）を含有させたＴＭ３−グルコース培地に、１：１０比で接種した。野生型対照を別個に増殖させ、ＩＰＴＧの用量決定を行うためそれぞれ３０ｕＭ〜６５μＭ（培養時には４０μＭで誘導）の、又は４０〜２００μＭ（培養時には１００μＭで誘導）のＴＭ３グルコースを含有させた各マイクロタイタープレートに接種した。プレートを振盪インキュベータに戻し、２５０ｒｐｍ、３０℃で前誘導を２時間行った。次に、マイクロタイタープレート（Ｍａｔｒｉｃａｌ）中で、５０μｇ／ｍＬカナマイシン、４０又は１００μＭのＩＰＴＧ、及び２０ｍＭ ＭＶＡを含有させたＴＭ３グルコース培地により培養物を１：１０比で希釈した。ＭＶＡを添加し、又は添加せずに野生型対照に誘導を行い、並びに必要に応じてＩＰＴＧを用い、対照の誘導応答性を計測した。プレートをＧｒｏｗｔｈ Ｐｒｏｆｉｌｅｒ １１５２（Ｅｎｚｙｓｃｒｅｅｎ）に移し、製造元の推奨に従って、１０時間の時間経過にわたって増殖曲線及び光学密度（ＯＤ）を測定した。４０又は１００μＭのいずれかの濃度でＩＰＴＧによる誘導を行った、野生型株の４つの複製と比較して、各株の増殖に関係する性能指数（ＰＩ）を算出した。３００分経過時点でのＯＤに関係するＰＩ値、最大ＯＤ、及び曲線下面積を算出した。本試験において、４０μＭのＩＰＴＧにより誘導を行ったすべての変異体の比活性も、これまでの実施例に記載の方法に従って求めた。同様の前誘導プレートから、増殖アッセイに使用する試料として試料を単離した。
結果
表１６に、表１９及び２３に掲載する残基の配置に関し正確な定義を提供する。表１９に、比活性のＰＩ値が１．４以上であるすべての変異体を掲載する。配置、表面への接近し易さ、及び推定される機能も掲載する。表１９に、単独で又は組み合わせによりＩｓｐＳの反応効率を向上させる数種類の変異体を掲載する。図３８及び３９に、変異体が比活性の増大を示した残基配置を示す。比活性の増大した変異体では、ＤＭＡＰＰのイソプレンへのより効率的な変換が可能になり、かつ細胞による、発酵時のイソプレン生産量が増大することになる。
表２０及び２１に、それぞれ誘導濃度４０ｕＭ及び１００ｕＭでの増殖性の向上した変異体を掲載する。いくつかの異なる増殖性パラメーターを測定した結果、すべて互いに良好に相関していたものの、表２０及び２１に掲載する変異体の、最大ＯＤのＰＩ値のみを試験した。掲載した変異体は、所定の誘導濃度下で、野生型よりも５０％良好（ＰＩ＝１．５以上）な最大ＯＤ値を示した。４０ｕＭ及び１００ｕＭ ＩＰＴＧによる誘導条件下のいずれもで増殖性の向上した変異体（最大ＯＤでのＰＩ値＝１．３以上）を表２２に掲載し、図４０及び４１に示す。これらの変異により、総合的な増殖性を最も高く、かつＩｓｐＳを発現している細胞におけるＤＭＡＰＰのイソプレンへの変換効率が最も高い変異体を示す。これらの変異体のうちいくつかのものは、ＭＥＡウラジロハコヤナギの残基１３４〜１７９にまたがる、特定のＮ端末へリックス領域付近又は領域内に存在する。この位置又はこの位置付近（表１６、２０〜２３に示す「Ｎ末端へリックス」）でのいくつかの変更により、いずれかの又は両方の増殖条件にて増殖性の向上が示された。ＭＥＡウラジロハコヤナギ内のこの位置に複数の変異体をマップするだけでなく、増殖性に対し最も有効性を示す変異体をヘリックスから外側に向け、かつ酵素表面上に配置する（図４１、４３、及び４４を参照されたい）。
表２３に、３つのパラメーター、すなわち比活性、４０ｕＭ及び１００ｕＭ ＩＰＴＧによる誘導下での最大ＯＤのすべてについて、性能の向上が示された（ＰＩ＝１．２以上）変異体を掲載する。これらの変異体のうちいくつかの物を表２２に掲載する。Ｖ３０Ｋ及びＶ８４Ｔを除き、これらの変異体のうち大部分のものは、上記Ｎ端末へリックス内又はヘリックス近傍にも位置する（図４２を参照されたい）。これにより、残基１５０〜１７２にまたがるへリックスにおける変異は、宿主細胞の増殖性の向上のみならす、酵素活性の向上にも重要であることが示される。Ｎ端末へリックス（図４３を参照されたい）が触媒機能を持つことは明瞭には示されていないものの、これらの変異体は、ＩｓｐＳ活性、すなわち酵素の立体構造の変更による分子内相互作用、あるいは同定されていない酵素、細胞内プロセス、又は構造との上記相互作用を介した分子間相互作用、のいずれかに影響し得る。単独で、又は触媒速度の増加などの有益な特性を付与する他の変異との組み合わせで、特定の位置に変異を包含しているＭＥＡウラジロハコヤナギ酵素は、宿主株の増殖速度を増大させ、かつ発酵時のイソプレン生産性を向上させ得るようである。
表１９．再試験したＭＥＡウラジロハコヤナギ変異体のうち比活性のＰＩ値が
１．４以上である変異体
Figure 2014502148

Figure 2014502148
表２０．４０ｍＭ ＩＰＴＧ下、最大ＯＤでのＰＩ値が１．５以下であるＭＥＡ
ウラジロハコヤナギ変異体
Figure 2014502148

Figure 2014502148
表２１．１００ｍＭ ＩＰＴＧ下、最大ＯＤでのＰＩ値が１．５以下であるＭＥＡ
ウラジロハコヤナギ変異体
Figure 2014502148
表２２．４０ｍＭ及び１００ｍＭ ＩＰＴＧ下、最大ＯＤでのＰＩ値が１．３以下で
あるＭＥＡウラジロハコヤナギ変異体
Figure 2014502148
表２３．４０μＭのＩＰＴＧ、及び１００μＭのＩＰＴＧ下、最大ＯＤでの比活性の
ＰＩが１．２以下であるＭＥＡウラジロハコヤナギ変異体
Figure 2014502148
実施例９：コンビナトリアルライブラリに対する比活性及び増殖アッセイ
３つの７員ライブラリに組み込むために、比活性、増殖性、又はいずれもの形質の改良されたＭＥＡウラジロハコヤナギＩｓｐＳの単一の変異体を選別した。
方法
ｐＣＬ２０１ベクターを用いライブラリを構築し、ＭＤ０９−１７０スクリーニング株を形質転換した（ＤＮＡ２．０）。ライブラリにおいて、それぞれ１２８の可能性のある組み合わせのうちの約８０〜９０％を示す１６０の変異体を、これまでの実施例に記載の方法に従い、比活性及び増殖性をもとにスクリーニングした。表２４に、コンビナトリアルライブラリ用に選別した変異、結晶構造中の位置、表面への接近性、及び選別基準（比活性、増殖性、又はこれらの両方）を掲載する。実施例７及び８に、これらの位置のアミノ酸に推定される機能を掲載する。
表２４．コンビナトリアルライブラリ用に選別した変異体
Figure 2014502148
結果
比活性及び／又は増殖性能が大幅に改良されたコンビナトリアルな変異体を同定した。表２５は、比活性の性能指数（ＰＩ）が２．６以上であるコンビナトリアルな変異体の一覧を包含する。左端のカラムは変異体番号を掲載し、続くカラムはライブラリ中の７つの異なる位置に関する遺伝子型を掲載する。比活性の向上した変異体において、酵素作用によるＤＭＡＰＰのイソプレンへの変換がより効率的に行われるのは、動態パラメーターの改良によるものであるように思われる。表２６は、比活性、４０ｕＭでの最大ＯＤ、及び１００ｕＭでの最大ＯＤのＰＩ値が１．３以上であるコンビナトリアルな変異体の一覧を包含する。比活性及び増殖パラメーターのいずれもが向上したＩｓｐＳ変異体は、野生型酵素と比較してＤＭＡＰＰのイソプレンへの変換もより効率的に行い、また、宿主内でのＩｓｐＳの有害な作用を軽減することから、宿主株の増殖に有益であるようである。
各ライブラリメンバーは、可能性のある７つの変異が任意の組み合わせで含有するものであり、変異のもたらす効果は、異なる構成において複数回観察された。この観察結果は、各ライブラリにおいて最も効果的な組み合わせを同定する助けとなる、信頼性の高い内部対照となった。例えば、比活性の高いコンビナトリアル変異体では変異Ｓ４４４Ｄが存在していたため、この変異は、他の改良型変異と組み合わせることで、ｉｎ ｖｉｔｒｏ活性に特に効果的に作用することが示唆される。Ｍ４６０Ａ，Ａ４４３Ｇ，及びＩ４４７Ｔもこの種類の効果を示した。同様にして、変異Ｖ１６２Ｐは、比活性及び増殖性のいずれについても特性の改良されたすべてのコンビナトリアル変異体に存在していたため、前段に記載の理由から、Ｖ１６２Ｐは他の変異との組み合わせで良好に機能し、宿主細胞内でＤＭＡＰＰをイソプレンにより効率的に変換させるのに理想的な変異であり得ることが示唆された。Ｉ１５６Ｇ及びＥ１７０Ｈもこの作用を示した。変異Ｇ０８７Ｒ，Ｒ２４２Ｎ，及びＳ２８８Ｔも、他の変異と組み合わせた場合に比活性を改良したが、アッセイで常に最も高い性能を示したわけではなかった。表２５及び２６に示したコンビナトリアル変異は、宿主細胞による発酵時に、ＤＭＡＰＰをイソプレンへと最適に変換させるようＩｓｐＳ酵素を大幅に改良した。これらの特定のコンビナトリアル変異体に生じさせた個々の変異の有無をもとに、微生物における発酵によるイソプレン生産を最適化するのに必要とされる最終的なＩｓｐＳ変異体に組み合わせることのできるすべての変異のうち、最も良好な変異を示すことができる。
表２５．ＭＥＡウラジロハコヤナギのコンビナトリアル変異体のうち比活性のＰＩが
２．６以下であるもの
Figure 2014502148
表２６．ＭＥＡウラジロハコヤナギのコンビナトリアル変異体のうち、比活性、４０μＭのＩＰＴＧ下での最大ＯＤ、及び１００μＭのＩＰＴＧ下での最大ＯＤのＰＩが１．３以下である変異体
Figure 2014502148
実施例１０：ＭＥＡウラジロハコヤナギＩｓｐＳのＮ端末トランケーションの判定
イソプレン合成酵素は、Ｎ末端に、適切な酵素作用によるＤＭＡＰＰのイソプレンへの変換に必要とされるタンデムアルギニン残基を含有する。トランケーションの結果、ＭＥＡウラジロハコヤナギは、よりＮ端末領域が長い酵素と比較した場合に、最大で、天然に生じる、葉緑体を標的とするペプチドと高い比活性を示す。ＭＥＡウラジロハコヤナギ酵素は、アルギニン残基（図４５を参照されたい）の上流にはただ２残基のみをもつが、これらの残基が酵素活性に関してもつ機能は報告されていなかった。したがって、ＭＥＡウラジロハコヤナギ酵素のＮ端末をトランケーションさせ、トランケーションにより更にＩｓｐＳの比活性に対し効果が付与されるか否かを評価するアッセイを行った。
方法
これまでに示した通り、製造元の推奨するプロトコルに従ってテンプレートｐＣＬ２０１（プライマー配列については表２７を参照されたい）に対しＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）ＰＣＲを行い、ＭＥＡウラジロハコヤナギの２つのトランケーションを構築した。ＰＣＲ産物を１μＬ ＤｐｎＩ（Ｒｏｃｈｅ）で３時間処理し、次に製造元の推奨するプロトコルに従って、１μＬの完全反応液を用い、化学的な形質転換に対し受容能のある大腸菌Ｔｏｐ１０細胞（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を形質転換した。細胞を回収し、５０μｇ／ｍＬカナマイシンを含有させたＬＢ培地に播種した。翌日、増殖性が陽性のコロニーを選別し、プラスミド精製（Ｑｉａｇｅｎ）及び配列決定（Ｑｕｉｎｔａｒａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を行った。翻訳領域全長を配列決定し、コード配列の完全性を確認して、正しいトランケーションを保有するプラスミドを選別した。電気穿孔法を用い、発現株ＭＤ０９−１７０を、プラスミド、ｐＤＷ２０７（図４６を参照されたい）及びｐＤＷ２０８（図４７を参照されたい）により形質転換し、非活性を測定した（表２８を参照されたい）。比活性はこれまでに示した通りに測定した。各トランケーション体に関し少なくとも３０の複製をＭＥＡウラジロハコヤナギと比較して解析した。
表２７．ＱｕｉｋＣｈａｎｇｅ変異導入に使用したプライマー
Figure 2014502148
表２８．Ｎ端末トランケーションをもつ株
Figure 2014502148
結果
株ＤＷ６１８（ＭＡＲ）又はＤＷ６１９（ＭＲＲ）で発現させた、トランケートされているウラジロハコヤナギＩｓｐＳの比活性は、それぞれ親ＭＥＡウラジロハコヤナギ酵素と比較して改良されておらず、あるいはわずかに低かった。表２９は、ウラジロハコヤナギＩｓｐＳのＭＡＲ及びＭＲＲトランケーション体の両方の性能指数を示す。ＭＡＲトランケーション体は、対照ＭＥＡウラジロハコヤナギ分子とほぼ等しい比活性を示し、ＭＲＲトランケーション体は、対照のおよそ８１％の比活性を示した。これらのトランケーション体の比活性は、ＭＥＡウラジロハコヤナギと比較して増大していなかったものの、これらは、アルギニン残基以外のＮ末端をすべて除去する必要がある場合に、将来的に、ＩｓｐＳ酵素によりＤＭＡＰＰをイソプレンに変換する発酵株に使用できそうな程度の十分な活性を保有していた。
表２９．トランケートしたウラジロハコヤナギＩｓｐＳ変異体の性能指数
Figure 2014502148
ウラジロハコヤナギＩｓｐＳ ＭＡＲのアミノ酸配列
ＭＡＲＲＳＡＮＹＥＰＮＳＷＤＹＤＹＬＬＳＳＤＴＤＥＳＩＥＶＹＫＤＫＡＫＫＬＥＡＥＶＲＲＥＩＮＮＥＫＡＥＦＬＴＬＬＥＬＩＤＮＶＱＲＬＧＬＧＹＲＦＥＳＤＩＲＧＡＬＤＲＦＶＳＳＧＧＦＤＡＶＴＫＴＳＬＨＧＴＡＬＳＦＲＬＬＲＱＨＧＦＥＶＳＱＥＡＦＳＧＦＫＤＱＮＧＮＦＬＥＮＬＫＥＤＩＫＡＩＬＳＬＹＥＡＳＦＬＡＬＥＧＥＮＩＬＤＥＡＫＶＦＡＩＳＨＬＫＥＬＳＥＥＫＩＧＫＥＬＡＥＱＶＮＨＡＬＥＬＰＬＨＲＲＴＱＲＬＥＡＶＷＳＩＥＡＹＲＫＫＥＤＡＮＱＶＬＬＥＬＡＩＬＤＹＮＭＩＱＳＶＹＱＲＤＬＲＥＴＳＲＷＷＲＲＶＧＬＡＴＫＬＨＦＡＲＤＲＬＩＥＳＦＹＷＡＶＧＶＡＦＥＰＱＹＳＤＣＲＮＳＶＡＫＭＦＳＦＶＴＩＩＤＤＩＹＤＶＹＧＴＬＤＥＬＥＬＦＴＤＡＶＥＲＷＤＶＮＡＩＮＤＬＰＤＹＭＫＬＣＦＬＡＬＹＮＴＩＮＥＩＡＹＤＮＬＫＤＫＧＥＮＩＬＰＹＬＴＫＡＷＡＤＬＣＮＡＦＬＱＥＡＫＷＬＹＮＫＳＴＰＴＦＤＤＹＦＧＮＡＷＫＳＳＳＧＰＬＱＬＶＦＡＹＦＡＶＶＱＮＩＫＫＥＥＩＥＮＬＱＫＹＨＤＴＩＳＲＰＳＨＩＦＲＬＣＮＤＬＡＳＡＳＡＥＩＡＲＧＥＴＡＮＳＶＳＣＹＭＲＴＫＧＩＳＥＥＬＡＴＥＳＶＭＮＬＩＤＥＴＷＫＫＭＮＫＥＫＬＧＧＳＬＦＡＫＰＦＶＥＴＡＩＮＬＡＲＱＳＨＣＴＹＨＮＧＤＡＨＴＳＰＤＥＬＴＲＫＲＶＬＳＶＩＴＥＰＩＬＰＦＥＲ
ｐＤＷ２０７のプラスミドＤＮＡ配列
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ウラジロハコヤナギＩｓｐＳ ＭＲＲアミノ酸配列
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ｐＤＷ２０８のプラスミド配列
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実施例１１：増殖性の変異、組み合わせ可能な変異、及び適性スコア
生産性に関係する位置は、特性の改良されたコンビナトリアルな変異体を製造するのに最も有用な、これらの分子内位置として記載することができ、この位置により、少なくとも１つの変異を組み合わせることができる。組み合わせることのできる変異は、コンビナトリアルな変異体を選別するのに使用することのできる、これらの分子内の置換として記載され得る。組み合わせることのできる変異は、発現、比活性又は増殖性を著しく低下させることなく、なおかつ、増殖性又は比活性などといった、分子に関する少なくとも１つの所望の特性を改良するものである。組み合わせ可能な変異をすべて含有しているＩｓｐＳ中の位置を、実施例７に記載の通り、比活性についてのＤＭＡＰＰアッセイ、及びタンパク質定量により得られた性能指数（ＰＩ）により決定した。増殖性に関与する位置は、複数の置換にある程度耐性を示し、なおかつ以降に示す通りのコンビナトリアルさに関する一群の基準を満たす位置である。
データ群を評価するとき、次の基準を適用した場合に最も増殖性が高く位置を決定した：
野生型ＩｓｐＳと比較した場合に、比活性及び発現についての性能指数（ＰＩ）が最小になるような位置に置換のなされた場合に、ＰＩが０．９以上であり、かつ野生型ＩｓｐＳと比較した場合に比活性又は増殖性についての少なくとも１つのＰＩが１．０以上である（第Ａ群）。
野生型ＩｓｐＳと比較した場合に、比活性及び発現についての性能指数（ＰＩ）が最小になるような位置に置換のなされた場合に、ＰＩが０．８以上であり、かつ野生型ＩｓｐＳと比較した場合に比活性又は増殖性についての少なくとも１つのＰＩが１．２以上である（第Ｂ群）。
野生型ＩｓｐＳと比較した場合に、比活性及び発現についての性能指数（ＰＩ）が最小になるような位置に置換のなされた場合に、ＰＩが０．５以上であり、かつ野生型ＩｓｐＳと比較した場合に比活性又は増殖性についての少なくとも１つのＰＩが１．５以上である（第Ｃ群）。
第Ａ、Ｂ、及びＣ群は、複数置換に対する許容度の異なる位置を更に含有する。この置換許容度を測定するために、各位置に等級を割り当てた。この等級は、第Ａ、Ｂ、又はＣ群に当てはまる各位置の置換率に従って割り当てた。組み合わせ可能な位置及び置換を表３１に示す。
増殖性に関与する位置についての等級を判定するための定義は次の通りのものである：
所定の位置での置換の０％以上１５％未満が第Ａ、Ｂ、又はＣ群に当てはまる場合、等級は「１」に割り当てられる。
所定の位置での置換の１５％以上３０％未満が第Ａ、Ｂ、又はＣ群に当てはまる場合、等級は「２」に割り当てられる。
所定の位置での置換の３０％以上５０％未満が第Ａ、Ｂ、又はＣ群に当てはまる場合、等級は「３」に割り当てられる。
所定の位置での置換の５０％以上が第Ａ、Ｂ、又はＣ群に当てはまる場合、等級は「４」に割り当てられる。
基質には、置換が属する群をもとに、更に適性スコアを割り当てる。スコアが高くなるほど、その置換が、コンビナトリアルな変異体を製造する際に使用するのにより好適なものであることを意味する。表３０に適性スコアを示し、定義する。上記基準に当てはまるＩｓｐＳのそれぞれの置換に関する安定性スコア及び等級を表３１に記載する。
表３０．既定された群の適性スコア
Figure 2014502148
表３１．組み合わせのできる位置に置換を含むＩｓｐＳ中の位置に対する適性
スコア及び等級
Figure 2014502148
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実施例１２：組み合わせるのにあまり向かないものの比活性又は増殖活性を改良する変異
表３２に、適性群Ｂ又はＣのいずれかに当てはまる、又は表３１には掲載されていない変異を掲載する。これらの「組み合わせにあまり向かない」変異は、上記の組み合わせについての基準に当てはまらなかったものの、再試験時に比活性又は増殖性のいずれかの性能が改良されていた。
表３２．組み合わせるのにあまり向かないものの、性能が改良され、比活性のＰＩが１．３以下である変異を持つＭＥＡウラジロハコヤナギ
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表３３．組み合わせるのにあまり向かないものの、性能が改良され、４０ｕＭ及び１００ｕＭ ＩＰＴＧ下での最大ＯＤのＰＩが１．３以下である変異を持つＭＥＡウラジロハコヤナギ
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本発明の方法及び系に関し、本発明の範囲及び精神から逸脱することのない様々な修正及び変形が当業者には明白であろう。本発明は、特定の実施形態に関連付けて記載したが、本発明は、特定の好ましい実施形態に不当に制限されるよう請求されるものではないことは明白である。実際に、本発明の実施に関し記載される態様に関し、関連技術分野に属する当業者に明白である様々な修正が、以降の特許請求の範囲内にあるものとして意図される。
添付書類１
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Claims (124)

  1. イソプレン合成酵素活性の改良された単離ポリペプチドであって、Ｎ末端領域、表面ループ、表面、活性部位、二量体界面、基質捕捉ループ、又は埋没領域中の１つ以上の残基にて１つ以上の置換を含み、かつここで前記ポリペプチドは、配列番号１の野生型イソプレン合成酵素と比較して、イソプレン合成酵素の比活性が少なくとも３０％増加している、単離ポリペプチド。
  2. 前記Ｎ末端領域における置換が、Ｘ２，Ｘ２２，Ｘ３６，Ｘ４３，及びＸ５８からなる群から選択される残基の置換である、請求項１に記載のポリペプチド。
  3. 前記置換が、Ｅ２，Ｓ２２，Ｋ３６，Ｒ４３，及びＥ５８からなる群から選択される残基の置換である、請求項２に記載のポリペプチド。
  4. 前記置換が、Ｅ２Ｖ，Ｓ２２Ｋ，Ｓ２２Ｒ，Ｋ３６Ｄ，Ｋ３６Ｅ，Ｋ３６Ｈ，Ｋ３６Ｗ，Ｒ４３Ｅ，及びＥ５８Ｆからなる群から選択される、請求項３に記載のポリペプチド。
  5. 前記埋没領域における前記置換が、Ｘ７１，Ｘ８９，Ｘ１１８，Ｘ１６１，Ｘ２２８，Ｘ２６８，Ｘ２８２，Ｘ２８８，Ｘ３３１，Ｘ３９１，Ｘ３９２，Ｘ４３７，Ｘ４６０，Ｘ４６１，Ｘ４８１，Ｘ４８８，及びＸ５０２からなる群から選択される残基の置換である、請求項１に記載のポリペプチド。
  6. 前記置換が、Ｒ７１，Ｆ８９，Ａ１１８，Ｋ１６１，Ｍ２２８，Ｖ２６８，Ｓ２８２，Ｓ２８８，Ｃ３３１，Ａ３９１，Ｗ３９２，Ｃ４３７，Ｍ４６０，Ｒ４６１，Ｔ４８１，Ｅ４８８，及びＴ５０２からなる群から選択される残基の置換である、請求項５に記載のポリペプチド。
  7. 前記置換が、Ｒ７１Ｉ，Ｆ８９Ｄ，Ｆ８９Ｅ，Ａ１１８Ｅ，Ａ１１８Ｐ，Ｋ１６１Ｃ，Ｍ２２８Ｙ，Ｖ２６８Ｉ，Ｓ２８２Ｈ，Ｓ２８２Ｗ，Ｓ２８８Ａ，Ｓ２８８Ｔ，Ｓ２８８Ｙ，Ｃ３３１Ｐ，Ａ３９１Ｇ，Ｗ３９２Ｃ，Ｗ３９２Ｆ，Ｗ３９２Ｍ，Ｗ３９２Ｓ，Ｗ３９２Ｖ，Ｗ３９２Ｙ，Ｃ４３７Ｌ，Ｃ４３７Ｍ，Ｍ４６０Ａ，Ｒ４６１Ａ，Ｒ４６１Ｙ，Ｔ４８１Ｙ，Ｅ４８８Ｌ，Ｔ５０２Ｆ及びＴ５０２Ｍからなる群から選択される、請求項６に記載のポリペプチド。
  8. 前記表面ループにおける前記置換が、Ｘ１２０，Ｘ１５１，Ｘ１５３，Ｘ２５４，Ｘ３８０，及びＸ４０９からなる群から選択される残基の置換である、請求項１に記載のポリペプチド。
  9. 前記置換が、Ｓ１２０，Ｌ１５１，Ｈ２５４，Ｓ３８０，及びＶ４０９からなる群から選択される残基の置換である、請求項８に記載のポリペプチド。
  10. 前記置換が、Ｓ１２０Ｍ，Ｓ１２０Ｑ，Ｌ１５１Ｆ，Ｌ１５１Ｙ，Ｇ１５３Ｐ，Ｈ２５４Ｃ，Ｓ３８０Ｅ，及びＶ４０９Ｔからなる群から選択される、請求項９に記載のポリペプチド。
  11. 前記二量体界面における前記置換が残基Ｘ２４７のものである、請求項１に記載のポリペプチド。
  12. 前記置換が残基Ｖ２４７のものである、請求項１１に記載のポリペプチド。
  13. 前記置換がＶ２４７Ｍである、請求項１２に記載のポリペプチド。
  14. 前記表面における置換が、Ｘ３４８，Ｘ３７６，及びＸ３８９からなる群から選択される残基の置換である、請求項１に記載のポリペプチド。
  15. 前記置換が、Ｋ３４８，Ｌ３７６，及びＧ３８９からなる群から選択される残基の置換である、請求項１４に記載のポリペプチド。
  16. 前記置換が、Ｋ３４８Ｙ，及びＧ３８９Ｄからなる群から選択される、請求項１５に記載のポリペプチド。
  17. 前記基質捕捉ループにおける置換が、Ｘ４４３，Ｘ４４４，Ｘ４４７及びＸ４４８からなる群から選択される残基の置換である、請求項１に記載のポリペプチド。
  18. 前記置換が、Ｓ４４４，Ｉ４４７及びＡ４４８からなる群から選択される残基の置換である、請求項１７に記載のポリペプチド。
  19. 前記置換が、Ｓ４４４Ｓ，Ｉ４４７Ｔ及びＡ４４８Ｖからなる群から選択される、請求項１８に記載のポリペプチド。
  20. イソプレン合成酵素活性の改良された単離ポリペプチドであって、配列番号１と対応する残基番号を付した次の不変の残基：Ｘ４，Ｘ９，Ｘ２４３，Ｘ２５８，Ｘ２５９，Ｘ２６２，Ｘ２６６，Ｘ２８０，Ｘ２９４，Ｘ２９５，Ｘ２９８，Ｘ３０５，Ｘ３８７，Ｘ３９６，Ｘ３９７，Ｘ４３５，Ｘ４３９，Ｘ４４６，Ｘ４４９，Ｘ４５０，Ｘ５１４，及びＸ５１８，を含み、かつ更に：Ｘ２，Ｘ２２，Ｘ３６，Ｘ４３，Ｘ５８，Ｘ７１，Ｘ８９，Ｘ１１８，Ｘ１２０，Ｘ１５１，Ｘ１５３，Ｘ１６１，Ｘ２２８，Ｘ２３４，Ｘ２４７，Ｘ２５４，Ｘ２６８，Ｘ２８２，Ｘ２８８，Ｘ３３１，Ｘ３４８，Ｘ３７６，Ｘ３８０，Ｘ３８９，Ｘ３９１，Ｘ３９２，Ｘ４０９，Ｘ４３７，Ｘ４４３，Ｘ４４４，Ｘ４４７，Ｘ４４８，Ｘ４６０，Ｘ４６１，Ｘ４８１，Ｘ４８８，及びＸ５０２，からなる群から選択される残基の１つ以上に置換を含み、ここで、前記ポリペプチドは、配列番号１の野生型イソプレン合成酵素と比較して、イソプレン合成酵素の比活性が少なくとも３０％上昇している、単離ポリペプチド。
  21. 前記置換が、Ｅ２，Ｓ２２，Ｋ３６，Ｒ４３，Ｅ５８，Ｒ７１，Ｆ８９，Ａ１１８，Ｓ１２０，Ｌ１５１，Ｋ１６１，Ｍ２２８，Ｑ２３４，Ｖ２４７，Ｈ２５４，Ｖ２６８，Ｓ２８２，Ｓ２８８，Ｃ３３１，Ｋ３４８，Ｌ３７６，Ｓ３８０，Ｇ３８９，Ａ３９１，Ｗ３９２，Ｖ４０９，Ｃ４３７，Ｓ４４４，Ｉ４４７，Ａ４４８，Ｍ４６０，Ｒ４６１，Ｔ４８１，Ｅ４８８，及びＴ５０２からなる群から選択される残基の置換である、請求項２０に記載のポリペプチド。
  22. 前記置換が、Ｅ２Ｖ，Ｓ２２Ｋ，Ｓ２２Ｒ，Ｋ３６Ｄ，Ｋ３６Ｅ，Ｋ３６Ｈ，Ｋ３６Ｗ，Ｒ４３Ｅ，Ｅ５８Ｆ，Ｒ７１Ｉ，Ｆ８９Ｄ，Ｆ８９Ｅ，Ａ１１８Ｅ，Ａ１１８Ｐ，Ｓ１２０Ｍ，Ｓ１２０Ｑ，Ｌ１５１Ｆ，Ｌ１５１Ｙ，Ｇ１５３Ｐ，Ｋ１６１Ｃ，Ｍ２２８Ｙ，Ｑ２３４Ｒ，Ｖ２４７Ｉ，Ｖ２４７Ｌ，Ｖ２４７Ｍ，Ｈ２５４Ｃ，Ｖ２６８Ｉ，Ｓ２８２Ｈ，Ｓ２８２Ｗ，Ｓ２８８Ａ，Ｓ２８８Ｔ，Ｓ２８８Ｙ，Ｃ３３１Ｐ，Ｋ３４８Ｙ，Ｓ３８０Ｅ，Ｇ３８９Ｄ，Ａ３９１Ｇ，Ｗ３９２Ｃ，Ｗ３９２Ｆ，Ｗ３９２Ｍ，Ｗ３９２Ｓ，Ｗ３９２Ｖ，Ｗ３９２Ｙ，Ｖ４０９Ｔ，Ｃ４３７Ｌ，Ｃ４３７Ｍ，Ｓ４４４Ｄ，Ｓ４４４Ｅ，Ｉ４４７Ｔ，Ｉ４４７Ｖ，Ａ４４８Ｖ，Ｍ４６０Ａ，Ｒ４６１Ａ，Ｔ４８１Ｙ，Ｅ４８８Ｌ，Ｔ５０２Ｆ及びＴ５０２Ｍからなる群から選択される、請求項２１に記載のポリペプチド。
  23. イソプレン合成酵素活性の改良された単離ポリペプチドであって、配列番号１と対応する残基番号を付した次の不変の残基：Ｘ４，Ｘ９，Ｘ２４３，Ｘ２５８，Ｘ２５９，Ｘ２６２，Ｘ２６６，Ｘ２８０，Ｘ２９４，Ｘ２９５，Ｘ２９８，Ｘ３０５，Ｘ３８７，Ｘ３９６，Ｘ３９７，Ｘ４３５，Ｘ４３９，Ｘ４４６，Ｘ４４９，Ｘ４５０，Ｘ５１４，及びＸ５１８，を含み、かつ更に：Ｘ１３４，Ｘ１３８，Ｘ１４３，Ｘ１５６，Ｘ１５９，Ｘ１６３，Ｘ１６６，Ｘ１６７，Ｘ１７０，Ｘ４１４，Ｘ４２１，及びＸ４９１からなる群から選択される残基の１つ以上に置換を含み、ここで、前記ポリペプチドを発現している宿主細胞の増殖性は、同様の増殖条件下で配列番号１の野生型イソプレン合成酵素を発現している宿主細胞の増殖性と比較して、少なくとも５０％上昇している、単離ポリペプチド。
  24. 前記置換がＫ１３４，Ｋ１３８，Ｌ１４３，Ｉ１５６，Ｅ１５９，Ｆ１６３，Ｓ１６６，Ｈ１６７，Ｅ１７０，Ｋ４１４，及びＱ４２１からなる群から選択される残基の置換である、請求項２３に記載のポリペプチド。
  25. 前記置換が、Ｋ１３４Ｐ，Ｋ１３８Ｃ，Ｌ１４３Ｆ，Ｌ１４３Ｖ，Ｉ１５６Ｇ，Ｅ１５９Ｇ，Ｅ１５９Ｑ，Ｆ１６３Ｃ，Ｆ１６３Ｅ，Ｆ１６３Ｑ，Ｆ１６３Ｖ，Ｆ１６３Ｙ，Ｓ１６６Ｃ，Ｓ１６６Ｄ，Ｓ１６６Ｇ，Ｓ１６６Ｐ，Ｓ１６６Ｖ，Ｈ１６７Ｍ，Ｅ１７０Ｇ，Ｅ１７０Ｈ，Ｅ１７０Ｋ，Ｅ１７０Ｎ，Ｅ１７０Ｒ，Ｅ１７０Ｓ，Ｅ１７０Ｗ，Ｋ４１４Ｆ，Ｋ４１４Ｇ，Ｋ４１４Ｎ，Ｋ４１４Ｐ，及びＱ４２１Ｒからなる群から選択される、請求項２４に記載のポリペプチド。
  26. イソプレン合成酵素活性の改良された単離ポリペプチドであって、配列番号１と対応する残基番号を付した次の不変の残基：Ｘ４，Ｘ９，Ｘ２４３，Ｘ２５８，Ｘ２５９，Ｘ２６２，Ｘ２６６，Ｘ２８０，Ｘ２９４，Ｘ２９５，Ｘ２９８，Ｘ３０５，Ｘ３８７，Ｘ３９６，Ｘ３９７，Ｘ４３５，Ｘ４３９，Ｘ４４６，Ｘ４４９，Ｘ４５０，Ｘ５１４，及びＸ５１８，を含み、かつ更に：Ｘ２９，Ｘ４７，Ｘ８６，Ｘ９４，Ｘ１３１，Ｘ１３４，Ｘ１５６，Ｘ１６２，Ｘ１６９，Ｘ１７８，Ｘ１７９，Ｘ２３１，Ｘ２４２，Ｘ３６９，Ｘ４１４，及びＸ４２１からなる群から選択される残基の１つ以上に置換を含み、ここで、前記ポリペプチドを発現している宿主細胞の増殖性は、同様の増殖条件下で配列番号１の野生型イソプレン合成酵素を発現している宿主細胞の増殖性と比較して、少なくとも５０％上昇している、単離ポリペプチド。
  27. 前記置換が、Ｅ２９，Ｎ４７，Ｓ８６，Ｋ９４，Ｅ１３１，Ｋ１３４，Ｉ１５６，Ｖ１６２，Ｋ１６９，Ｋ１７８，Ｅ１７９，Ｓ２３１，Ｒ２４２，Ｆ３６９，Ｋ４１４，及びＱ４２１からなる群から選択される残基の置換である、請求項２６に記載のポリペプチド。
  28. 前記置換が、Ｅ２９Ｎ，Ｎ４７Ｖ，Ｓ８６Ｃ，Ｋ９４Ａ，Ｅ１３１Ｆ，Ｋ１３４Ｅ，Ｋ１３４Ｐ，Ｉ１５６Ｇ，Ｖ１６２Ｐ，Ｋ１６９Ｃ，Ｋ１７８Ｅ，Ｅ１７９Ｔ，Ｓ２３１Ｄ，Ｓ２３１Ｋ，Ｓ２３１Ｒ，Ｓ２３１Ｔ，Ｓ２３１Ｖ，Ｒ２４２Ｎ，Ｒ２４２Ｉ，Ｆ３６９Ｃ，Ｋ４１４Ｃ，Ｋ４１４Ｆ，Ｋ４１４Ｇ，Ｋ４１４Ｎ，及びＱ４２１Ｄからなる群から選択される、請求項２７に記載のポリペプチド。
  29. イソプレン合成酵素活性の改良された単離ポリペプチドであって、配列番号１と対応する残基番号を付した次の不変の残基：Ｘ４，Ｘ９，Ｘ２４３，Ｘ２５８，Ｘ２５９，Ｘ２６２，Ｘ２６６，Ｘ２８０，Ｘ２９４，Ｘ２９５，Ｘ２９８，Ｘ３０５，Ｘ３８７，Ｘ３９６，Ｘ３９７，Ｘ４３５，Ｘ４３９，Ｘ４４６，Ｘ４４９，Ｘ４５０，Ｘ５１４，及びＸ５１８，を含み、かつ更に：Ｘ３０，Ｘ８４，Ｘ１３４，Ｘ１４０，Ｘ１４３，Ｘ１６３，Ｘ１６６，Ｘ１６９，Ｘ１７０及びＸ１７２からなる群から選択される残基の１つ以上に置換を含み、ここで前記ポリペプチドは、配列番号１の野生型イソプレン合成酵素と比較して、イソプレン合成酵素の比活性が少なくとも２０％上昇しており、かつ前記ポリペプチドを発現している宿主細胞の増殖性は、同様の増殖条件下で配列番号１の野生型イソプレン合成酵素を発現している宿主細胞の増殖性と比較して、少なくとも２０％上昇している、単離ポリペプチド。
  30. 前記置換が、Ｖ８４，Ｋ１３４，Ｉ１４０，Ｌ１４３，Ｆ１６３，Ｓ１６６，Ｋ１６９，Ｅ１７０及びＳ１７２からなる群から選択される残基の置換である、請求項２９に記載のポリペプチド。
  31. 前記置換が、Ｖ３０Ｋ，Ｖ８４Ｔ，Ｋ１３４Ｃ，Ｋ１３４Ｄ，Ｋ１３４Ｅ，Ｉ１４０Ｓ，Ｉ１４０Ｔ，Ｌ１４３Ｆ，Ｌ１４３Ｉ，Ｌ１４３Ｍ，Ｌ１４３Ｖ，Ｆ１６３Ｉ，Ｆ１６３Ｍ，Ｓ１６６Ｐ，Ｓ１６６Ｖ，Ｋ１６９Ｑ，Ｅ１７０Ｈ，Ｅ１７０Ｋ，及びＳ１７２Ｖからなる群から選択される、請求項３０に記載のポリペプチド。
  32. イソプレン合成酵素活性の改良された単離ポリペプチドであって、（ｉ）Ｎ末端、（ｉｉ）残基１３４〜１７９のＮ端末ヘリックス領域（該残基番号は配列番号１（野生型ＭＥＡイソプレン合成酵素）と一致する）、あるいは（ｉｉｉ）Ｎ端末ヘリックス領域と相互作用する、Ｎ端末ヘリックス領域以外の他の残基、の１つ以上にて置換を含み、ここで前記ポリペプチドは、配列番号１の野生型イソプレン合成酵素と比較して、イソプレン合成酵素の比活性が少なくとも２０％上昇している、単離ポリペプチド。
  33. 前記置換が、Ｘ３０，Ｘ８４，Ｘ１３４，Ｘ１４０，Ｘ１４３，Ｘ１６３，Ｘ１６６，Ｘ１６９，Ｘ１７０及びＸ１７２からなる群から選択される残基の置換である、請求項３２に記載のポリペプチド。
  34. 前記置換が、Ｖ８４，Ｋ１３４，Ｉ１４０，Ｌ１４３，Ｆ１６３，Ｓ１６６，Ｋ１６９，Ｅ１７０及びＳ１７２からなる群から選択される残基の置換である、請求項３３に記載のポリペプチド。
  35. 前記置換が、Ｖ３０Ｋ，Ｖ８４Ｔ，Ｋ１３４Ｃ，Ｋ１３４Ｄ，Ｋ１３４Ｅ，Ｉ１４０Ｓ，Ｉ１４０Ｔ，Ｌ１４３Ｆ，Ｌ１４３Ｉ，Ｌ１４３Ｍ，Ｌ１４３Ｖ，Ｆ１６３Ｉ，Ｆ１６３Ｍ，Ｓ１６６Ｐ，Ｓ１６６Ｖ，Ｋ１６９Ｑ，Ｅ１７０Ｈ，Ｅ１７０Ｋ，及びＳ１７２Ｖからなる群から選択される残基の置換である、請求項３４に記載のポリペプチド。
  36. イソプレン合成酵素活性の改良された単離ポリペプチドであって、配列番号１と対応する：Ｘ２，Ｘ２２，Ｘ３６，Ｘ４３，Ｘ５８，Ｘ７１，Ｘ８９，Ｘ１１８，Ｘ１２０，Ｘ１５１，Ｘ１５３，Ｘ１６１，Ｘ２２８，Ｘ２３４，Ｘ２４７，Ｘ２５４，Ｘ２６８，Ｘ２８２，Ｘ２８８，Ｘ３３１，Ｘ３４８，Ｘ３７６，Ｘ３８０，Ｘ３８９，Ｘ３９１，Ｘ３９２，Ｘ４０９，Ｘ４３７，Ｘ４４３，Ｘ４４４，Ｘ４４７，Ｘ４４８，Ｘ４６０，Ｘ４６１，Ｘ４８１，Ｘ４８８，及びＸ５０２，からなる群から選択される残基の１つ以上に置換を含み、かつここで前記ポリペプチドは、配列番号１の野生型イソプレン合成酵素と比較して、イソプレン合成酵素の比活性が少なくとも３０％上昇している、単離ポリペプチド。
  37. 前記置換が、Ｅ２，Ｓ２２，Ｋ３６，Ｒ４３，Ｅ５８，Ｒ７１，Ｆ８９，Ａ１１８，Ｓ１２０，Ｌ１５１，Ｋ１６１，Ｍ２２８，Ｑ２３４，Ｖ２４７，Ｈ２５４，Ｖ２６８，Ｓ２８２，Ｓ２８８，Ｃ３３１，Ｋ３４８，Ｌ３７６，Ｓ３８０，Ｇ３８９，Ａ３９１，Ｗ３９２，Ｖ４０９，Ｃ４３７，Ｓ４４４，Ｉ４４７，Ａ４４８，Ｍ４６０，Ｒ４６１，Ｔ４８１，Ｅ４８８，及びＴ５０２からなる群から選択される残基の置換である、請求項３６に記載のポリペプチド。
  38. 前記置換が、Ｅ２Ｖ，Ｓ２２Ｋ，Ｓ２２Ｒ，Ｋ３６Ｄ，Ｋ３６Ｅ，Ｋ３６Ｈ，Ｋ３６Ｗ，Ｒ４３Ｅ，Ｅ５８Ｆ，Ｒ７１Ｉ，Ｆ８９Ｄ，Ｆ８９Ｅ，Ａ１１８Ｅ，Ａ１１８Ｐ，Ｓ１２０Ｍ，Ｓ１２０Ｑ，Ｌ１５１Ｆ，Ｌ１５１Ｙ，Ｇ１５３Ｐ，Ｋ１６１Ｃ，Ｍ２２８Ｙ，Ｑ２３４Ｒ，Ｖ２４７Ｉ，Ｖ２４７Ｌ，Ｖ２４７Ｍ，Ｈ２５４Ｃ，Ｖ２６８Ｉ，Ｓ２８２Ｈ，Ｓ２８２Ｗ，Ｓ２８８Ａ，Ｓ２８８Ｔ，Ｓ２８８Ｙ，Ｃ３３１Ｐ，Ｋ３４８Ｙ，Ｓ３８０Ｅ，Ｇ３８９Ｄ，Ａ３９１Ｇ，Ｗ３９２Ｃ，Ｗ３９２Ｆ，Ｗ３９２Ｍ，Ｗ３９２Ｓ，Ｗ３９２Ｖ，Ｗ３９２Ｙ，Ｖ４０９Ｔ，Ｃ４３７Ｌ，Ｃ４３７Ｍ，Ｓ４４４Ｄ，Ｓ４４４Ｅ，Ｉ４４７Ｔ，Ｉ４４７Ｖ，Ａ４４８Ｖ，Ｍ４６０Ａ，Ｒ４６１Ａ，Ｔ４８１Ｙ，Ｅ４８８Ｌ，Ｔ５０２Ｆ及びＴ５０２Ｍからなる群から選択される、請求項３７に記載のポリペプチド。
  39. イソプレン合成酵素活性の改良された単離ポリペプチドであって、Ｎ末端領域、Ｎ末端ヘリックス領域、表面ループ、表面、活性部位、二量体界面、基質捕捉ループ、又は埋没領域中の１つ以上の残基にて１つ以上の置換を含み、かつここで前記ポリペプチドは、配列番号１の野生型イソプレン合成酵素と比較して、イソプレン合成酵素の比活性が少なくとも４０％上昇している、単離ポリペプチド。
  40. 前記Ｎ末端領域における置換が、Ｘ１８，Ｘ３６，及びＸ８２からなる群から選択される残基の置換である、請求項３９に記載のポリペプチド。
  41. 前記置換が、Ｙ１８，Ｋ３６，及びＲ８２からなる群から選択される残基の置換である、請求項４０に記載のポリペプチド。
  42. 前記置換が、Ｙ１８Ｅ，Ｙ１８Ｄ，Ｙ１８Ｓ，Ｋ３６Ｐ，及びＲ８２Ｑからなる群から選択される、請求項４１に記載のポリペプチド。
  43. 前記Ｎ末端ヘリックス領域における置換が、Ｘ１３７，Ｘ１４３，Ｘ１６３，及びＸ１７０からなる群から選択される残基の置換である、請求項３９に記載のポリペプチド。
  44. 前記置換が、Ｉ１３７，Ｌ１４３，Ｆ１６３，及びＥ１７０からなる群から選択される残基の置換である、請求項４３に記載のポリペプチド。
  45. 前記置換が、Ｉ１３７Ｃ，Ｌ１４３Ｎ，Ｆ１６３Ｉ，Ｆ１６３Ｑ，及びＥ１７０Ｇからなる群から選択される、請求項４４に記載のポリペプチド。
  46. 前記表面ループにおける前記置換が、Ｘ８７，Ｘ４０９，及びＸ５４２からなる群から選択される残基の置換である、請求項３９に記載のポリペプチド。
  47. 前記置換が、Ｇ８７，Ｖ４０９，及びＦ５４２からなる群から選択される残基の置換である、請求項４６に記載のポリペプチド。
  48. 前記置換が、Ｇ８７Ｓ，Ｇ８７Ｎ，Ｇ８７Ｒ，Ｖ４０９Ｓ，及びＦ５４２Ｎからなる群から選択される、請求項４７に記載のポリペプチド。
  49. 前記表面における前記置換が残基Ｘ２５１のものである、請求項３９に記載のポリペプチド。
  50. 前記置換が残基Ｔ２５１のものである、請求項４９に記載のポリペプチド。
  51. 前記置換がＴ２５１Ｅである、請求項４９に記載のポリペプチド。
  52. 前記二量体界面における前記置換が残基Ｘ２４２のものである、請求項３９に記載のポリペプチド。
  53. 前記置換が残基Ｒ２４２のものである、請求項５２に記載のポリペプチド。
  54. 前記置換がＲ２４２Ｔである、請求項５３に記載のポリペプチド。
  55. 前記埋没領域における前記置換が、Ｘ４３７，Ｘ４６０，及びＸ４６１からなる群から選択される残基の置換である、請求項３９に記載のポリペプチド。
  56. 前記置換が、Ｃ４３７，Ｍ４６０，及びＲ４６１からなる群から選択される残基の置換である、請求項５５に記載のポリペプチド。
  57. 前記置換が、Ｃ４３７Ｍ，Ｃ４３７Ｋ，Ｍ４６０Ｑ，Ｍ４６０Ｇ，Ｍ４６０Ａ，Ｒ４６１Ｄ，Ｒ４６１Ｓ，Ｒ４６１Ｔ，及びＲ４６１からなる群から選択される、請求項５６に記載のポリペプチド。
  58. 前記基質捕捉ループにおける置換が、Ｘ４４３，Ｘ４４４，及びＸ４４７からなる群から選択される残基の置換である、請求項３９に記載のポリペプチド。
  59. 前記置換が、Ｓ４４４，及びＩ４４７からなる群から選択される残基の置換である、請求項５８に記載のポリペプチド。
  60. 前記置換が、Ｓ４４４Ｐ，Ｉ４４７Ｑ，Ｉ４４７Ｔ，Ｉ４４７Ｍ，Ｉ４４７Ｅ，Ｉ４４７Ｓ，及びＩ４４７Ｒからなる群から選択される、請求項５６に記載のポリペプチド。
  61. イソプレン合成酵素活性を有し、かつ宿主細胞で発現させた場合に宿主細胞の増殖活性が上昇する単離ポリペプチドであって、配列番号１と対応する：Ｘ１３４，Ｘ１３８，Ｘ１４３，Ｘ１５６，Ｘ１５９，Ｘ１６３，Ｘ１６６，Ｘ１６７，Ｘ１７０，Ｘ４１４，Ｘ４２１，及びＸ４９１からなる群から選択される残基の１つ以上に置換を含み、かつここで、前記ポリペプチドを発現している宿主細胞の増殖性は、同様の増殖条件下で配列番号１の野生型イソプレン合成酵素を発現している宿主細胞の増殖性と比較して、少なくとも５０％上昇している、単離ポリペプチド。
  62. 前記置換が、Ｋ１３４，Ｋ１３８，Ｌ１４３，Ｉ１５６，Ｅ１５９，Ｆ１６３，Ｈ１６７，Ｅ１７０，Ｋ４１４，及びＱ４２１からなる群から選択される残基の置換である、請求項６１に記載のポリペプチド。
  63. 前記置換が、Ｋ１３４Ｐ，Ｋ１３８Ｃ，Ｌ１４３Ｆ，Ｌ１４３Ｖ，Ｉ１５６Ｇ，Ｅ１５９Ｇ，Ｅ１５９Ｑ，Ｆ１６３Ｃ，Ｆ１６３Ｅ，Ｆ１６３Ｑ，Ｆ１６３Ｖ，Ｆ１６３Ｙ，Ｓ１６６Ｃ，Ｓ１６６Ｄ，Ｓ１６６Ｇ，Ｓ１６６Ｐ，Ｓ１６６Ｖ，Ｈ１６７Ｍ，Ｅ１７０Ｇ，Ｅ１７０Ｈ，Ｅ１７０Ｋ，Ｅ１７０Ｎ，Ｅ１７０Ｒ，Ｅ１７０Ｓ，Ｅ１７０Ｗ，Ｋ４１４Ｆ，Ｋ４１４Ｇ，Ｋ４１４Ｎ，Ｋ４１４Ｐ，及びＱ４２１Ｒからなる群から選択される、請求項６２に記載のポリペプチド。
  64. イソプレン合成酵素活性を有し、かつ宿主細胞で発現させた場合に宿主細胞の増殖活性が上昇する単離ポリペプチドであって、配列番号１と対応する：Ｘ２９，Ｘ４７，Ｘ８６，Ｘ９４，Ｘ１３１，Ｘ１３４，Ｘ１５６，Ｘ１６２，Ｘ１６９，Ｘ１７８，Ｘ１７９，Ｘ２３１，Ｘ２４２，Ｘ３６９，Ｘ４１４，及びＸ４２１からなる群から選択される残基の１つ以上に置換を含み、かつここで、前記ポリペプチドを発現している宿主細胞の増殖性は、同様の増殖条件下で配列番号１の野生型イソプレン合成酵素を発現している宿主細胞の増殖性と比較して、少なくとも５０％上昇している、単離ポリペプチド。
  65. 前記置換が、Ｅ２９，Ｎ４７，Ｓ８６，Ｋ９４，Ｅ１３１，Ｋ１３４，Ｉ１５６，Ｖ１６２，Ｋ１６９，Ｋ１７８，Ｅ１７９，Ｓ２３１，Ｒ２４２，Ｆ３６９，Ｋ４１４，及びＱ４２１からなる群から選択される残基の置換である、請求項６４に記載のポリペプチド。
  66. 前記置換が、Ｅ２９Ｎ，Ｎ４７Ｖ，Ｓ８６Ｃ，Ｋ９４Ａ，Ｅ１３１Ｆ，Ｋ１３４Ｅ，Ｋ１３４Ｐ，Ｉ１５６Ｇ，Ｖ１６２Ｐ，Ｋ１６９Ｃ，Ｋ１７８Ｅ，Ｅ１７９Ｔ，Ｓ２３１Ｄ，Ｓ２３１Ｋ，Ｓ２３１Ｒ，Ｓ２３１Ｔ，Ｓ２３１Ｖ，Ｒ２４２Ｎ，Ｒ２４２Ｉ，Ｆ３６９Ｃ，Ｋ４１４Ｃ，Ｋ４１４Ｆ，Ｋ４１４Ｇ，Ｋ４１４Ｎ，及びＱ４２１Ｄからなる群から選択される、請求項６５に記載のポリペプチド。
  67. イソプレン合成酵素活性を有し、かつ宿主細胞で発現させた場合に宿主細胞の増殖活性が上昇する単離ポリペプチドであって、配列番号１と対応する：Ｘ５０，Ｘ８１，Ｘ１３４，Ｘ１３７，Ｘ１４３，Ｘ１５６，Ｘ１５９，Ｘ１６６，Ｘ１６７，Ｘ１６９，Ｘ１７０，及びＸ４１４からなる群から選択される残基の１つ以上に置換を含み、かつここで、前記ポリペプチドを発現している宿主細胞の増殖性は、同様の増殖条件下で配列番号１の野生型イソプレン合成酵素を発現している宿主細胞の増殖性と比較して、少なくとも３０％上昇している、単離ポリペプチド。
  68. 前記置換が、Ｋ５０，Ｄ８１，Ｋ１３４，Ｉ１３７，Ｌ１４３，Ｉ１５６，Ｅ１５９，Ｓ１６６，Ｈ１６７，Ｋ１６９，Ｅ１７０，及びＫ４１４からなる群から選択される、請求項６７に記載のポリペプチド。
  69. 前記置換が、Ｋ５０Ｓ，Ｄ８１Ｆ，Ｋ１３４Ｅ，Ｋ１３４Ｐ，Ｉ１３７Ｎ，Ｌ１４３Ｖ，Ｉ１５６Ｇ，Ｅ１５９Ｄ，Ｅ１５９Ｇ，Ｅ１５９Ｑ，Ｓ１６６Ｃ，Ｓ１６６Ｗ，Ｈ１６７Ｍ，Ｈ１６７Ｎ，Ｋ１６９Ｃ，Ｅ１７０Ｈ，Ｅ１７０Ｋ，Ｅ１７０Ｗ，Ｋ４１４Ｃ，Ｋ４１４Ｆ，Ｋ４１４Ｇ，Ｋ４１４Ｎ，及びＫ４１４Ｐからなる群から選択される、請求項６８に記載のポリペプチド。
  70. イソプレン合成酵素活性が改良されており、かつ宿主細胞で発現させた場合に宿主細胞の増殖活性が上昇する単離ポリペプチドであって、配列番号１と対応する：Ｘ３０，Ｘ８４，Ｘ１３４，Ｘ１４０，Ｘ１４３，Ｘ１６３，Ｘ１６６，Ｘ１６９，Ｘ１７０及びＸ１７２からなる群から選択される残基の１つ以上に置換を含み、ここで、前記ポリペプチドは、配列番号１の野生型イソプレン合成酵素と比較して、イソプレン合成酵素の比活性が少なくとも２０％上昇しており、かつ前記ポリペプチドを発現している宿主細胞の増殖性は、同様の増殖条件下で配列番号１の野生型イソプレン合成酵素を発現している宿主細胞の増殖性と比較して、少なくとも２０％上昇している、単離ポリペプチド。
  71. 前記置換が、Ｖ８４，Ｋ１３４，Ｉ１４０，Ｌ１４３，Ｆ１６３，Ｓ１６６，Ｋ１６９，Ｅ１７０及びＳ１７２からなる群から選択される残基の置換である、請求項７０に記載のポリペプチド。
  72. 前記置換が、Ｖ３０Ｋ，Ｖ８４Ｔ，Ｋ１３４Ｃ，Ｋ１３４Ｄ，Ｋ１３４Ｅ，Ｉ１４０Ｓ，Ｉ１４０Ｔ，Ｌ１４３Ｆ，Ｌ１４３Ｉ，Ｌ１４３Ｍ，Ｌ１４３Ｖ，Ｆ１６３Ｉ，Ｆ１６３Ｍ，Ｓ１６６Ｐ，Ｓ１６６Ｖ，Ｋ１６９Ｑ，Ｅ１７０Ｈ，Ｅ１７０Ｋ，及びＳ１７２Ｖからなる群から選択される、請求項７１に記載のポリペプチド。
  73. イソプレン合成酵素特性の改良された単離ポリペプチドであって、配列番号１と対応する：Ｘ２２，Ｘ７１，Ｘ８７，Ｘ１６２，Ｘ２４２，Ｘ２８８，Ｘ４０９，Ｘ４１４，Ｘ４４３，Ｘ４４４，Ｘ４６０，及びＸ５０２からなる群から選択される残基にて２つ以上の置換を含み、ここで、ポリペプチドは、配列番号１の野生型イソプレン合成酵素と比較して、イソプレン合成酵素の比活性が少なくとも１６０％上昇している、単離ポリペプチド。
  74. 前記置換が、Ｓ２２，Ｒ７１，Ｇ８７，Ｖ１６２，Ｒ２４２，Ｓ２８８，Ｖ４０９，Ｋ４１４，Ｓ４４４，Ｍ４６０，及びＴ５０２からなる群から選択される残基の置換である、請求項７３に記載のポリペプチド。
  75. 前記置換が、Ｓ２２Ｒ，Ｒ７１Ｉ又はＲ、Ｇ８７Ｒ，Ｖ１６２Ｐ，Ｒ２４２Ｎ，Ｓ２８８Ｃ，Ｖ４０９Ｔ，ＫＸ４１４Ｆ，Ｓ４４４Ｄ，Ｍ４６０Ａ，及びＴ５０２Ｍからなる群から選択される、請求項７４に記載のポリペプチド。
  76. 前記置換が、
    ａ）Ｓ２２Ｒ，Ｒ７１Ｉ，Ｓ２８８Ｃ，Ｓ４４４Ｄ，Ｍ４６０Ａ，及びＴ５０２Ｍ；
    ｂ）Ｇ８７Ｒ，Ｖ１６２Ｐ，Ｒ２４２Ｎ，Ｓ２８８Ｃ，Ｖ４０９Ｔ，Ｋ４１４Ｒ，及びＳ４４４Ｄ；又は
    ｃ）Ｇ８７Ｒ，Ｖ１６２Ｐ，Ｒ２４２Ｎ，Ｓ２８８Ｃ，Ｖ４０９Ｔ，及びＫ４１４Ｆ，からなる群から選択される、請求項７３に記載のポリペプチド。
  77. イソプレン合成酵素特性の改良された単離ポリペプチドであって、配列番号１と対応する：Ｘ４７，Ｘ８７，Ｘ１５６，Ｘ１６２，Ｘ１７０，Ｘ２３１，Ｘ２４２，Ｘ２８８，Ｘ４０９，Ｘ４１４，及びＸ４４７からなる群から選択される残基の２つ以上に置換を含み、ここで、残基の付番は配列番号１と対応し、前記ポリペプチドは、配列番号１の野生型イソプレン合成酵素と比較して、イソプレン合成酵素の比活性が少なくとも３０％上昇しており、かつ前記ポリペプチドを発現している宿主細胞の増殖性は、同様の増殖条件下で配列番号１の野生型イソプレン合成酵素を発現している宿主細胞の増殖性と比較して、少なくとも３０％上昇している、単離ポリペプチド。
  78. 前記置換が、Ｎ４７，Ｇ８７，Ｉ１５６，Ｖ１６２，Ｅ１７０，Ｓ２３１，Ｒ２４２，Ｓ２８８，Ｖ４０９，Ｋ４１４，及びＩ４４７からなる群から選択される残基の置換である、請求項７７に記載のポリペプチド。
  79. 前記置換が、Ｎ４７Ｖ，Ｇ８７Ｒ，Ｉ１５６Ｇ，Ｖ１６２Ｐ，Ｅ１７０Ｈ，Ｓ２３１Ｔ，Ｒ２４２Ｎ，Ｓ２８８Ｃ，Ｓ２８８Ｔ，Ｖ４０９Ｔ，及びＫ４１４Ｆからなる群から選択される、請求項７８に記載のポリペプチド。
  80. 前記置換が、Ｎ４７Ｖ，Ｉ１５６Ｇ，Ｅ１７０Ｈ，Ｓ２３１Ｔ，Ｓ２８８Ｔ，及びＫ４１４Ｆからなる群から選択される残基の置換である、請求項７７に記載のポリペプチド。
  81. イソプレン合成酵素特性の改良された単離ポリペプチドであって、配列番号１と対応する：Ｘ２，Ｘ１８，Ｘ１９，Ｘ２１，Ｘ２４，Ｘ２６，Ｘ２７，Ｘ２９，Ｘ３７，Ｘ４２，Ｘ４７，Ｘ４８，Ｘ４９，Ｘ５６，Ｘ８１，Ｘ８２，Ｘ８４，Ｘ９３，Ｘ９４，Ｘ９５，Ｘ１２０，Ｘ１２３，Ｘ１２６，Ｘ１３１，Ｘ１３２，Ｘ１３４，Ｘ１３７，Ｘ１３９，Ｘ１４３，Ｘ１５１，Ｘ１５５，Ｘ１６６，Ｘ１６７，Ｘ１６９，Ｘ１７０，Ｘ１７１，Ｘ１７５，Ｘ１７９，Ｘ１８０，Ｘ１９７，Ｘ２２９，Ｘ２３１，Ｘ２４０，Ｘ２４２，Ｘ２４５，Ｘ２４６，Ｘ２４７，Ｘ２５１，Ｘ２７１，Ｘ２８２，Ｘ３０６，Ｘ３１７，Ｘ３１９，Ｘ３６９，Ｘ３７１，Ｘ３７６，Ｘ３７９，Ｘ３８０，Ｘ３８９，Ｘ３９２，Ｘ３９３，Ｘ４０８，Ｘ４０９，Ｘ４２１，Ｘ４２２，Ｘ４２３，Ｘ４２９，Ｘ４３７，Ｘ４４３，Ｘ４４４，Ｘ４４７，Ｘ４５５，Ｘ４５８，Ｘ４６１，Ｘ４６４，Ｘ４６６，Ｘ４７０，Ｘ４７３，Ｘ５００，Ｘ５０２，Ｘ５０６，Ｘ５１３，Ｘ５２５、及びＸ５３１からなる群から選択される残基の１つ以上に置換を含み、（ａ）配列番号１のポリペプチドに対する比活性及び発現性の最小性能指数（ＰＩ）は０．９以上であり、かつ配列番号１のポリペプチドに対する比活性又は増殖性のＰＩのうち少なくとも１つは１．０以上であり、（ｂ）配列番号１のポリペプチドに対する比活性及び発現性の最小性能指数（ＰＩ）は０．８以上であり、かつ配列番号１のポリペプチドに対する比活性又は増殖性のＰＩのうち少なくとも１つは１．２以上であり、並びに（ｃ）配列番号１のポリペプチドに対する比活性及び発現性の最小性能指数（ＰＩ）は０．５以上であり、かつ配列番号１のポリペプチドに対する比活性又は増殖性のＰＩのうち少なくとも１つは１．５以上である、単離ポリペプチド。
  82. 前記置換が、Ｅ２，Ｙ１８，Ｌ１９，Ｓ２１，Ｔ２４，Ｅ２６，Ｓ２７，Ｅ２９，Ｋ３７，Ｖ４２，Ｎ４７，Ｎ４８，Ｅ４９，Ｌ５６，Ｄ８１，Ｒ８２，Ｖ８４，Ｔ９３，Ｋ９４，Ｔ９５，Ｓ１２０，Ｋ１２３，Ｎ１２６，Ｅ１３１，Ｎ１３２，Ｋ１３４，Ｉ１３７，Ａ１３９，Ｌ１４３，Ｌ１５１，Ｎ１５５，Ｓ１６６，Ｈ１６７，Ｋ１６９，Ｅ１７０，Ｌ１７１，Ｋ１７５，Ｅ１７９，Ｌ１８０，Ｑ１９７，Ｉ２２９，Ｓ２３１，Ｔ２４０，Ｒ２４２，Ｒ２４５，Ｒ２４６，Ｖ２４７，Ｔ２５１，Ａ２７１，Ｓ２８２，Ｌ３０６，Ｄ３１７，Ｎ３１９，Ｆ３６９，Ｑ３７１，Ｌ３７６，Ｋ３７９，Ｓ３８０，Ｇ３８９，Ｗ３９２，Ｋ３９３，Ｖ４０８，Ｖ４０９，Ｑ４２１，Ｋ４２２，Ｙ４２３，Ｒ４２９，Ｃ４３７，Ｓ４４４，Ｉ４４７，Ｓ４５５，Ｃ４５８，Ｒ４６１，Ｇ４６４，Ｓ４６６，Ａ４７０，Ｓ４７３，Ｖ５００，Ｔ５０２，Ｌ５０６，Ｔ５１３，Ｅ５２５，及びＶ５３１からなる群から選択される残基の置換である、請求項８１に記載のポリペプチド。
  83. 前記置換が、Ｅ２Ａ又はＫ又はＰ，Ｙ１８Ｄ又はＥ又はＫ又はＳ，Ｌ１９Ｙ，Ｓ２１Ｗ，Ｔ２４Ｌ又はＶ，Ｅ２６Ｃ，Ｓ２７Ｄ又はＮ，Ｅ２９Ｎ，Ｋ３７Ｃ又はＤ又はＰ又はＱ又はＳ，Ｖ４２Ｍ，Ｎ４７Ｄ又はＳ，Ｎ４８Ｄ又はＧ又はＴ，Ｅ４９Ｌ又はＶ，Ｌ５６Ｅ又はＦ又はＧ又はＩ又はＫ又はＴ又はＶ又はＹ，Ｄ８１Ｑ，Ｒ８２Ｎ又はＴ又はＶ又はＹ，Ｖ８４Ｍ，Ｔ９３Ｃ又はＦ又はＲ又はＳ，Ｋ９４Ｇ又はＰ，Ｔ９５Ｄ又はＦ又はＧ又はＩ又はＮ又はＷ，Ｓ１２０Ｃ又はＧ又はＭ又はＱ，Ｋ１２３Ｖ，Ｎ１２６Ｅ，Ｅ１３１Ｈ又はＫ又はＬ又はＭ又はＴ又はＷ又はＹ，Ｎ１３２Ｉ又はＰ，Ｋ１３４Ａ，Ｉ１３７Ｔ，Ａ１３９Ｃ又はＱ，Ｌ１４３Ｃ又はＤ又はＥ又はＨ又はＫ又はＭ又はＱ又はＴ又はＶ又はＹ，Ｌ１５１Ａ又はＦ，Ｎ１５５Ａ又はＣ又はＧ又はＨ又はＱ又はＲ又はＳ又はＷ，Ｓ１６６Ｎ，Ｈ１６７Ｆ又はＩ又はＮ又はＱ又はＶ，Ｋ１６９Ａ又はＣ又はＨ又はＮ又はＱ又はＶ，Ｅ１７０Ｌ又はＳ又はＷ又はＹ，Ｌ１７１Ａ又はＮ又はＱ又はＴ又はＶ又はＹ，Ｋ１７５Ｃ又はＦ又はＩ又はＱ又はＲ，Ｅ１７９Ｄ，Ｌ１８０Ａ又はＩ，Ｑ１９７Ｃ又はＤ又はＮ，Ｉ２２９Ｃ，Ｓ２３１Ａ，Ｔ２４０Ｃ，Ｒ２４２Ｇ，Ｒ２４５Ｃ又はＫ又はＭ又はＱ又はＴ又はＶ，Ｒ２４６Ｎ，Ｖ２４７Ｌ又はＭ，Ｔ２５１Ｄ又はＥ又はＮ又はＰ又はＱ又はＳ，Ａ２７１Ｔ，Ｓ２８２Ｙ，Ｌ３０６Ｃ，Ｄ３１７Ｎ，Ｎ３１９Ｍ，Ｆ３６９Ｃ又はＤ又はＥ又はＧ又はＳ，Ｑ３７１Ｆ，Ｌ３７６Ｉ又はＭ，Ｋ３７９Ｇ又はＱ，Ｓ３８０Ｅ，Ｇ３８９Ａ又はＤ又はＥ又はＫ又はＮ又はＱ又はＳ又はＶ，Ｗ３９２Ｙ，Ｋ３９３Ｃ又はＩ又はＴ又はＶ，Ｖ４０８Ｔ，Ｖ４０９Ｔ，Ｑ４２１Ｈ，Ｋ４２２Ｄ，Ｙ４２３Ｎ又はＳ，Ｒ４２９Ｅ又はＦ又はＱ，Ｃ４３７Ｍ，Ｓ４４４Ｄ又はＥ，Ｉ４４７Ｔ，Ｓ４５５Ａ，Ｃ４５８Ｔ，Ｒ４６１Ａ，Ｇ４６４Ｃ又はＭ又はＮ又はＱ又はＳ，Ｓ４６６Ｄ，Ａ４７０Ｉ又はＬ，Ｓ４７３Ｉ，Ｖ５００Ａ又はＣ，Ｔ５０２Ｍ，Ｌ５０６Ｍ，Ｔ５１３Ｃ又はＧ又はＫ又はＮ，Ｅ５２５Ｆ又はＲ，Ｖ５３１Ｅ又はＨ又はＫ又はＱ又はＲ又はＳからなる群から選択される、請求項８２に記載のポリペプチド。
  84. イソプレン合成酵素特性の改良された単離ポリペプチドであって、配列番号１と対応する：Ｘ２，Ｘ６，Ｘ１８，Ｘ２０，Ｘ２２，Ｘ２３，Ｘ２４，Ｘ２５，Ｘ２６，Ｘ２７，Ｘ２８，Ｘ２９，Ｘ３０，Ｘ３１，Ｘ３２，Ｘ３６，Ｘ３７，Ｘ４２，Ｘ４４，Ｘ４７，Ｘ４８，Ｘ４９，Ｘ５０，Ｘ５３，Ｘ５４，Ｘ５５，Ｘ５６，Ｘ５８，Ｘ５９，Ｘ６８，Ｘ７１，Ｘ７４，Ｘ７７，Ｘ７８，Ｘ７９，Ｘ８１，Ｘ８２，Ｘ８３，Ｘ８４，Ｘ８６，Ｘ８７，Ｘ９１，Ｘ９３，Ｘ９４，Ｘ９５，Ｘ９７，Ｘ９８，Ｘ９９，Ｘ１０９，Ｘ１１５，Ｘ１１６，Ｘ１１７，Ｘ１１８，Ｘ１２０，Ｘ１２３，Ｘ１２５，Ｘ１２６，Ｘ１２７，Ｘ１２８，Ｘ１３０，Ｘ１３１，Ｘ１３２，Ｘ１３３，Ｘ１３４，Ｘ１３６，Ｘ１３７，Ｘ１３８，Ｘ１３９，Ｘ１４０，Ｘ１４３，Ｘ１５１，Ｘ１５３，Ｘ１５５，Ｘ１５６，Ｘ１５９，Ｘ１６０，Ｘ１６１，Ｘ１６２，Ｘ１６３，Ｘ１６４，Ｘ１６６，Ｘ１６７，Ｘ１６９，Ｘ１７０，Ｘ１７１，Ｘ１７２，Ｘ１７５，Ｘ１７６，Ｘ１７７，Ｘ１７８，Ｘ１７９，Ｘ１８０，Ｘ１８１，Ｘ１８２，Ｘ１９０，Ｘ１９４，Ｘ１９７，Ｘ２０４，Ｘ２１１，Ｘ２１５，Ｘ２１７，Ｘ２１９，Ｘ２２１，Ｘ２２８，Ｘ２２９，Ｘ２３１，Ｘ２３２，Ｘ２３５，Ｘ２４１，Ｘ２４２，Ｘ２４５，Ｘ２４６，Ｘ２４７，Ｘ２５１，Ｘ２５４，Ｘ２７１，Ｘ２７２，Ｘ２７８，Ｘ２７９，Ｘ２８２，Ｘ２９６，Ｘ３０２，Ｘ３１７，Ｘ３１９，Ｘ３２０，Ｘ３２７，Ｘ３３１，Ｘ３４８，Ｘ３５１，Ｘ３５７，Ｘ３６１，Ｘ３６４，Ｘ３６５，Ｘ３６８，Ｘ３６９，Ｘ３７０，Ｘ３７１，Ｘ３７３，Ｘ３７７，Ｘ３８０，Ｘ３８３，Ｘ３８６，Ｘ３８９，Ｘ３９２，Ｘ３９３，Ｘ４０７，Ｘ４０８，Ｘ４０９，Ｘ４１０，Ｘ４１１，Ｘ４１４，Ｘ４２２，Ｘ４２３，Ｘ４２４，Ｘ４２８，Ｘ４２９，Ｘ４３２，Ｘ４３６，Ｘ４３７，Ｘ４４０，Ｘ４４３，Ｘ４４４，Ｘ４４７，Ｘ４４８，Ｘ４５７，Ｘ４６０，Ｘ４６１，Ｘ４６２，Ｘ４６３，Ｘ４６４，Ｘ４６５，Ｘ４６６，Ｘ４６８，Ｘ４７０，Ｘ４７１，Ｘ４７２，Ｘ４７３，Ｘ４７５，Ｘ４８０，Ｘ４９０，Ｘ４９１，Ｘ４９２，Ｘ４９４，Ｘ４９６，Ｘ５００，Ｘ５０１，Ｘ５０２，Ｘ５０３，Ｘ５１０，Ｘ５１３，Ｘ５１５，Ｘ５１９，Ｘ５２５，Ｘ５３１，Ｘ５３６，Ｘ５３７，Ｘ５４０，Ｘ５４１，Ｘ５４２，及びＸ５４４からなる群から選択される残基の１つ以上に置換を含み、（ａ）配列番号１のポリペプチドに対する比活性及び発現性の最小性能指数は０．９以上であり、かつ配列番号１のポリペプチドに対する比活性又は増殖性のＰＩのうち少なくとも１つは１．０以上であり、（ｂ）配列番号１のポリペプチドに対する比活性及び発現性の最小性能指数（ＰＩ）は０．８以上であり、かつ配列番号１のポリペプチドに対する比活性又は増殖性のＰＩのうち少なくとも１つは１．２以上である、単離ポリペプチド。
  85. 前記置換が、Ｅ２，Ｓ６，Ｙ１８，Ｌ２０，Ｓ２２，Ｄ２３，Ｔ２４，Ｄ２５，Ｅ２６，Ｓ２７，Ｉ２８，Ｅ２９，Ｙ３１，Ｋ３２，Ｋ３６，Ｋ３７，Ｖ４２，Ｒ４４，Ｎ４７，Ｎ４８，Ｅ４９，Ｋ５０，Ｆ５３，Ｌ５４，Ｔ５５，Ｌ５６，Ｅ５８，Ｌ５９，Ｌ６８，Ｒ７１，Ｓ７４，Ｒ７７，Ｇ７８，Ａ７９，Ｄ８１，Ｒ８２，Ｆ８３，Ｖ８４，Ｓ８６，Ｇ８７，Ａ９１，Ｔ９３，Ｋ９４，Ｔ９５，Ｌ９７，Ｈ９８，Ｇ９９，Ｑ１０９，Ｓ１１５，Ｑ１１６，Ｅ１１７，Ａ１１８，Ｓ１２０，Ｋ１２３，Ｑ１２５，Ｎ１２６，Ｇ１２７，Ｎ１２８，Ｌ１３０，Ｅ１３１，Ｎ１３２，Ｌ１３３，Ｋ１３４，Ｄ１３６，Ｉ１３７，Ｋ１３８，Ａ１３９，Ｉ１４０，Ｌ１４３，Ｌ１５１，Ｎ１５５，Ｉ１５６，Ｅ１５９，Ａ１６０，Ｋ１６１，Ｖ１６２，Ｆ１６３，Ａ１６４，Ｓ１６６，Ｈ１６７，Ｋ１６９，Ｅ１７０，Ｌ１７１，Ｓ１７２，Ｋ１７５，Ｉ１７６，Ｇ１７７，Ｋ１７８，Ｅ１７９，Ｌ１８０，Ａ１８１，Ｅ１８２，Ｌ１９０，Ｒ１９４，Ｑ１９７，Ｓ２０４，Ｋ２１１，Ｎ２１５，Ｖ２１７，Ｌ２１９，Ｌ２２１，Ｍ２２８，Ｉ２２９，Ｓ２３１，Ｖ２３２，Ｒ２３５，Ｓ２４１，Ｒ２４２，Ｒ２４５，Ｒ２４６，Ｖ２４７，Ｔ２５１，Ｈ２５４，Ａ２７１，Ｆ２７２，Ｄ２７８，Ｃ２７９，Ｓ２８２，Ｉ２９６，Ｔ３０２，Ｄ３１７，Ｎ３１９，Ａ３２０，Ｙ３２７，Ｃ３３１，Ｋ３４８，Ｇ３５１，Ｙ３５７，Ａ３６１，Ｄ３６４，Ｌ３６５，Ａ３６８，Ｆ３６９，Ｌ３７０，Ｑ３７１，Ａ３７３，Ｙ３７７，Ｓ３８０，Ｔ３８３，Ｄ３８６，Ｇ３８９，Ｗ３９２，Ｋ３９３，Ａ４０７，Ｖ４０８，Ｖ４０９，Ｑ４１０，Ｎ４１１，Ｋ４１４，Ｋ４２２，Ｙ４２３，Ｈ４２４，Ｓ４２８，Ｒ４２９，Ｈ４３２，Ｌ４３６，Ｃ４３７，Ｌ４４０，Ｓ４４４，Ｉ４４７，Ａ４４８，Ｓ４５７，Ｍ４６０，Ｒ４６１，Ｔ４６２，Ｋ４６３，Ｇ４６４，Ｉ４６５，Ｓ４６６，Ｅ４６８，Ａ４７０，Ｔ４７１，Ｅ４７２，Ｓ４７３，Ｍ４７５，Ｅ４８０，Ｌ４９０，Ｇ４９２，Ｌ４９４，Ａ４９６，Ｖ５００，Ｅ５０１，Ｔ５０２，Ａ５０３，Ｓ５１０，Ｔ５１３，Ｈ５１５，Ａ５１９，Ｅ５２５，Ｖ５３１，Ｔ５３６，Ｅ５３７，Ｌ５４０，Ｐ５４１，Ｆ５４２，及びＲ５４４からなる群から選択される残基の置換である、請求項８４に記載のポリペプチド。
  86. 前記置換が、Ｅ２Ｃ又はＤ又はＮ又はＴ又はＶ、Ｓ６Ｎ又はＴ、Ｙ１８Ａ又はＱ又はＲ、Ｌ２０Ｔ，Ｓ２２Ｑ，Ｄ２３Ｎ，Ｔ２４Ｃ，Ｄ２５Ｔ，Ｅ２６Ｄ又はＨ又はＫ又はＭ又はＲ又はＳ又はＶ、Ｓ２７Ａ又はＣ又はＧ又はＨ又はＩ又はＬ又はＭ又はＰ又はＱ、Ｉ２８Ｄ又はＮ、Ｅ２９Ｑ，Ｖ３０Ａ又はＤ又はＥ又はＭ又はＲ又はＴ、Ｙ３１Ｎ，Ｋ３２Ｅ，Ｋ３６Ａ又はＣ又はＤ又はＥ又はＭ又はＮ又はＰ又はＱ、Ｋ３７Ａ又はＥ又はＧ又はＨ又はＭ又はＮ又はＲ又はＴ、Ｖ４２Ｆ又はＩ、Ｒ４４Ｎ又はＱ、Ｎ４７Ａ又はＧ又はＨ又はＭ又はＱ又はＴ又はＷ、Ｎ４８Ｈ又はＩ又はＫ、Ｅ４９Ａ又はＣ、Ｋ５０Ａ又はＤ又はＥ又はＦ又はＨ又はＳ又はＹ、Ｆ５３Ｅ又はＨ又はＮ又はＰ又はＱ又はＶ、Ｌ５４Ｍ，Ｔ５５Ｃ又はＤ又はＥ、Ｌ５６Ｃ又はＮ、Ｅ５８Ｎ，Ｌ５９Ｈ又はＴ、Ｌ６８Ｉ，Ｒ７１Ｋ又はＭ、Ｓ７４Ｄ又はＥ又はＮ又はＹ、Ｒ７７Ｌ，Ｇ７８Ａ又はＤ又はＦ又はＬ又はＭ、Ａ７９Ｑ又はＴ、Ｄ８１Ａ又はＦ又はＧ又はＭ又はＲ又はＳ又はＴ又はＶ、Ｒ８２Ａ又はＥ又はＨ又はＩ又はＫ又はＭ又はＱ又はＳ、Ｆ８３Ｗ，Ｖ８４Ａ，Ｓ８６Ａ又はＤ又はＭ、Ｇ８７Ｄ又はＰ、Ａ９１Ｋ又はＷ、Ｔ９３Ａ又はＤ又はＥ又はＧ又はＬ又はＮ又はＰ又はＹ、Ｋ９４Ａ又はＤ又はＥ又はＨ又はＩ又はＬ又はＭ又はＮ又はＲ又はＳ又はＴ、Ｔ９５Ａ又はＥ又はＰ又はＱ又はＳ又はＶ又はＹ、Ｌ９７Ｆ，Ｈ９８Ａ又はＤ又はＦ又はＧ又はＩ又はＬ又はＭ又はＮ又はＱ、Ｇ９９Ｅ又はＦ又はＭ、Ｑ１０９Ｅ，Ｓ１１５Ａ，Ｑ１１６Ａ又はＣ又はＤ又はＥ又はＩ又はＰ、Ｅ１１７Ｃ又はＦ又はＬ又はＭ又はＶ、Ａ１１８Ｍ，Ｓ１２０Ｈ又はＴ又はＶ、Ｋ１２３Ｌ又はＴ、Ｑ１２５Ｅ又はＩ又はＹ、Ｎ１２６Ａ又はＣ又はＤ又はＭ又はＴ又はＶ、Ｇ１２７Ｃ，Ｎ１２８Ｃ又はＤ又はＰ又はＱ、Ｌ１３０Ｅ，Ｅ１３１Ａ又はＣ又はＰ又はＱ又はＳ又はＶ、Ｎ１３２Ｃ又はＤ又はＦ又はＨ又はＬ又はＲ又はＷ又はＹ、Ｌ１３３Ｄ，Ｋ１３４Ｅ又はＭ又はＱ又はＳ又はＴ又はＶ、Ｄ１３６Ｅ，Ｉ１３７Ｅ又はＨ又はＮ、Ｋ１３８Ｉ又はＮ、Ａ１３９Ｎ，Ｉ１４０Ｍ又はＷ、Ｌ１４３Ｓ，Ｌ１５１Ｃ又はＨ又はＩ、Ｇ１５３Ｃ，Ｎ１５５Ｉ又はＴ又はＶ又はＹ、Ｉ１５６Ｄ又はＮ又はＴ、Ｅ１５９Ｍ，Ａ１６０Ｉ，Ｋ１６１Ａ又はＣ又はＮ又はＱ、Ｖ１６２Ｓ，Ｆ１６３Ｅ又はＱ、Ａ１６４Ｔ，Ｓ１６６Ａ又はＤ又はＧ、Ｈ１６７Ａ又はＥ又はＧ又はＫ又はＭ又はＲ又はＳ又はＴ又はＷ、Ｋ１６９Ｄ又はＩ又はＭ又はＳ又はＴ、Ｅ１７０Ｈ又はＫ又はＭ又はＱ又はＴ又はＶ、Ｌ１７１Ｈ又はＫ又はＲ又はＳ、Ｓ１７２Ａ又はＣ、Ｋ１７５Ｓ，Ｉ１７６Ｍ，Ｇ１７７Ａ又はＣ、Ｋ１７８Ａ又はＦ又はＲ又はＳ又はＴ、Ｅ１７９Ａ又はＣ又はＬ又はＭ又はＮ、Ｌ１８０Ｃ又はＱ又はＴ、Ａ１８１Ｈ又はＱ又はＳ又はＶ、Ｅ１８２Ｓ，Ｌ１９０Ｉ又はＭ、Ｒ１９４Ｌ，Ｑ１９７Ｓ，Ｓ２０４Ｃ，Ｋ２１１Ａ又はＮ又はＱ、Ｎ２１５Ｃ又はＨ、Ｖ２１７Ｉ，Ｌ２１９Ｃ，Ｌ２２１Ｍ，Ｍ２２８Ｆ又はＹ、Ｉ２２９Ｖ，Ｓ２３１Ｋ又はＱ又はＴ、Ｖ２３２Ｉ，Ｒ２３５Ｋ，Ｓ２４１Ａ又はＭ又はＴ、Ｒ２４２Ａ又はＤ又はＥ又はＨ又はＩ又はＭ又はＮ又はＱ又はＳ又はＴ、Ｒ２４５Ｉ又はＬ、Ｒ２４６Ｄ又はＫ、Ｖ２４７Ｔ，Ｔ２５１Ａ又はＧ又はＫ又はＲ、Ｈ２５４Ｄ，Ａ２７１Ｃ又はＶ、Ｆ２７２Ｄ又はＧ又はＰ又はＷ、Ｄ２７８Ａ又はＥ又はＮ又はＱ又はＳ又はＴ又はＶ又はＷ、Ｃ２７９Ａ，Ｓ２８２Ａ又はＱ、Ｉ２９６Ｖ，Ｔ３０２Ｈ，Ｄ３１７Ｅ又はＱ、Ｎ３１９Ｆ，Ａ３２０Ｃ，Ｙ３２７Ｍ，Ｃ３３１Ｐ，Ｋ３４８Ｒ又はＹ、Ｇ３５１Ｄ又はＮ、Ｙ３５７Ｍ，Ａ３６１Ｔ，Ｄ３６４Ｅ又はＶ、Ｌ３６５Ｃ又はＭ、Ａ３６８Ｎ，Ｆ３６９Ｍ又はＮ又はＲ又はＴ又はＶ、Ｌ３７０Ｇ又はＱ、Ｑ３７１Ｃ又はＳ、Ａ３７３Ｇ，Ｙ３７７Ｗ，Ｓ３８０Ａ又はＣ又はＤ又はＱ又はＴ又はＶ、Ｔ３８３Ｓ，Ｄ３８６Ｅ又はＮ、Ｇ３８９Ｈ又はＩ、Ｗ３９２Ｉ又はＳ又はＴ又はＶ、Ｋ３９３Ｑ，Ａ４０７Ｇ，Ｖ４０８Ｉ，Ｖ４０９Ｈ又はＩ、Ｑ４１０Ｃ又はＤ又はＫ又はＬ又はＭ又はＴ、Ｎ４１１Ｇ，Ｋ４１４Ｅ又はＧ又はＬ又はＮ又はＰ、Ｋ４２２Ａ又はＮ又はＴ、Ｙ４２３Ｑ，Ｈ４２４Ｅ又はＰ又はＱ又はＶ、Ｓ４２８Ｅ又はＱ、Ｒ４２９Ｉ又はＬ又はＴ又はＷ又はＹ、Ｈ４３２Ｅ，Ｌ４３６Ｍ又はＹ、Ｃ４３７Ｋ又はＴ、Ｌ４４０Ｉ，Ｓ４４４Ｐ，Ｉ４４７Ａ又はＥ又はＭ又はＱ又はＳ、Ａ４４８Ｅ又はＭ又はＮ又はＰ又はＱ又はＶ、Ｓ４５７Ｎ又はＴ、Ｍ４６０Ｑ又はＲ又はＳ、Ｒ４６１Ｄ又はＥ又はＧ又はＱ又はＳ又はＴ、Ｔ４６２Ｑ，Ｋ４６３Ａ又はＤ又はＥ、Ｇ４６４Ｌ又はＲ、Ｉ４６５Ａ又はＣ又はＧ又はＳ又はＴ、Ｓ４６６Ｐ，Ｅ４６８Ｄ，Ａ４７０Ｍ，Ｔ４７１Ｅ又はＨ又はＱ、Ｅ４７２Ｄ又はＳ、Ｓ４７３Ｌ又はＶ、Ｍ４７５Ｔ，Ｅ４８０Ｎ，Ｌ４９０Ａ又はＤ又はＥ又はＦ又はＨ又はＭ、Ｇ４９２Ｃ，Ｌ４９４Ｄ，Ａ４９６Ｐ又はＴ、Ｖ５００Ｌ又はＭ、Ｅ５０１Ｄ，Ｔ５０２Ａ又はＣ又はＲ又はＶ、Ａ５０３Ｉ，Ｓ５１０Ｃ又はＶ、Ｔ５１３Ｖ，Ｈ５１５Ｎ，Ａ５１９Ｓ又はＴ、Ｅ５２５Ａ又はＣ又はＰ又はＱ又はＳ、Ｖ５３１Ａ又はＭ又はＴ、Ｔ５３６Ａ又はＦ又はＧ、Ｅ５３７Ｋ又はＴ、Ｌ５４０Ａ又はＰ、Ｐ５４１Ｍ，Ｆ５４２Ｐ，及びＲ５４４Ｃからなる群から請求項８５に記載のポリペプチド。
  87. イソプレン合成酵素特性の改良された単離ポリペプチドであって、配列番号１と対応する：Ｘ２，Ｘ３，Ｘ１３，Ｘ１７，Ｘ１８，Ｘ１９，Ｘ２０，Ｘ２３，Ｘ２５，Ｘ２６，Ｘ２７，Ｘ２８，Ｘ２９，Ｘ３０，Ｘ３１，Ｘ３２，Ｘ３３，Ｘ３４，Ｘ３６，Ｘ３７，Ｘ４０，Ｘ４１，Ｘ４２，Ｘ４３，Ｘ４４，Ｘ４５，Ｘ４６，Ｘ４７，Ｘ４８，Ｘ４９，Ｘ５０，Ｘ５１，Ｘ５３，Ｘ５４，Ｘ５５，Ｘ５６，Ｘ５７，Ｘ５９，Ｘ６０，Ｘ６２，Ｘ７１，Ｘ７３，Ｘ７４，Ｘ７５，Ｘ７７，Ｘ７８，Ｘ７９，Ｘ８１，Ｘ８２，Ｘ８３，Ｘ８４，Ｘ８５，Ｘ８６，Ｘ８７，Ｘ８８，Ｘ８９，Ｘ９１，Ｘ９２，Ｘ９３，Ｘ９４，Ｘ９５，Ｘ９７，Ｘ９８，Ｘ９９，Ｘ１００，Ｘ１０１，Ｘ１０２，Ｘ１０３，Ｘ１０７，Ｘ１０９，Ｘ１１１，Ｘ１１３，Ｘ１１４，Ｘ１１５，Ｘ１１６，Ｘ１１７，Ｘ１１８，Ｘ１１９，Ｘ１２０，Ｘ１２１，Ｘ１２３，Ｘ１２４，Ｘ１２５，Ｘ１２７，Ｘ１２８，Ｘ１２９，Ｘ１３０，Ｘ１３１，Ｘ１３３，Ｘ１３４，Ｘ１３５，Ｘ１３６，Ｘ１３７，Ｘ１３８，Ｘ１３９，Ｘ１４０，Ｘ１４３，Ｘ１４６，Ｘ１５１，Ｘ１５２，Ｘ１５３，Ｘ１５５，Ｘ１５６，Ｘ１５８，Ｘ１６０，Ｘ１６１，Ｘ１６２，Ｘ１６３，Ｘ１６６，Ｘ１６７，Ｘ１６９，Ｘ１７０，Ｘ１７１，Ｘ１７２，Ｘ１７５，Ｘ１７６，Ｘ１７７，Ｘ１７８，Ｘ１７９，Ｘ１８０，Ｘ１８１，Ｘ１８２，Ｘ１８３，Ｘ１８５，Ｘ１８７，Ｘ１９３，Ｘ１９４，Ｘ１９６，Ｘ１９７，Ｘ２０４，Ｘ２１０，Ｘ２１１，Ｘ２１２，Ｘ２１５，Ｘ２１６，Ｘ２１７，Ｘ２１８，Ｘ２１９，Ｘ２２０，Ｘ２２２，Ｘ２２３，Ｘ２２４，Ｘ２２６，Ｘ２２８，Ｘ２２９，Ｘ２３１，Ｘ２３２，Ｘ２３５，Ｘ２４０，Ｘ２４１，Ｘ２４２，Ｘ２４６，Ｘ２５１，Ｘ２５３，Ｘ２６０，Ｘ２６８，Ｘ２７０，Ｘ２７１，Ｘ２７２，Ｘ２７５，Ｘ２７６，Ｘ２７８，Ｘ２８２，Ｘ３０７，Ｘ３１４，Ｘ３１５，Ｘ３１７，Ｘ３２０，Ｘ３２１，Ｘ３２３，Ｘ３２８，Ｘ３２９，Ｘ３３１，Ｘ３３２，Ｘ３３３，Ｘ３４３，Ｘ３４５，Ｘ３４６，Ｘ３５０，Ｘ３５１，Ｘ３５２，Ｘ３５６，Ｘ３５７，Ｘ３６０，Ｘ３６１，Ｘ３６３，Ｘ３６４，Ｘ３６６，Ｘ３６７，Ｘ３６８，Ｘ３６９，Ｘ３７０，Ｘ３７１，Ｘ３７８，Ｘ３７９，Ｘ３８０，Ｘ３８３，Ｘ３８６，Ｘ３８９，Ｘ３９０，Ｘ３９２，Ｘ３９３，Ｘ４０２，Ｘ４０５，Ｘ４０８，Ｘ４０９，Ｘ４１０，Ｘ４１３，Ｘ４１４，Ｘ４１８，Ｘ４２２，Ｘ４２３，Ｘ４２４，Ｘ４２５，Ｘ４２６，Ｘ４２８，Ｘ４２９，Ｘ４３１，Ｘ４３２，Ｘ４３７，Ｘ４４４，Ｘ４４７，Ｘ４４８，Ｘ４５７，Ｘ４６０，Ｘ４６１，Ｘ４６２，Ｘ４６３，Ｘ４６４，Ｘ４６６，Ｘ４６７，Ｘ４６８，Ｘ４６９，Ｘ４７１，Ｘ４７２，Ｘ４７５，Ｘ４８４，Ｘ４８９，Ｘ４９０，Ｘ４９１，Ｘ４９２，Ｘ４９３，Ｘ４９４，Ｘ４９７，Ｘ５００，Ｘ５０１，Ｘ５０２，Ｘ５０３，Ｘ５０４，Ｘ５０６，Ｘ５０９，Ｘ５１０，Ｘ５１１，Ｘ５１３，Ｘ５１５，Ｘ５１７，Ｘ５１９，Ｘ５２２，Ｘ５２８，Ｘ５２９，Ｘ５３１，Ｘ５３４，Ｘ５３５，Ｘ５３６，Ｘ５３７，Ｘ５３９，Ｘ５４０，Ｘ５４２，及びＸ５４４からなる群から選択される残基の１つ以上に置換を含み、（ａ）配列番号１のポリペプチドに対する比活性及び発現性の最小性能指数は０．９以上であり、かつ配列番号１のポリペプチドに対する比活性又は増殖性のＰＩのうち少なくとも１つは１．０以上であり、又は
    （ｂ）配列番号１のポリペプチドに対する比活性及び発現性の最小性能指数（ＰＩ）は０．８以上であり、かつ配列番号１のポリペプチドに対する比活性又は増殖性のＰＩのうち少なくとも１つは１．２以上であり、並びに（ｃ）配列番号１のポリペプチドに対する比活性及び発現性の最小性能指数（ＰＩ）は０．５以上であり、かつ配列番号１のポリペプチドに対する比活性又は増殖性のＰＩのうち少なくとも１つは１．５以上である、単離ポリペプチド。
  88. 前記置換が、Ｅ２，Ａ３，Ｓ１３，Ｄ１７，Ｙ１８，Ｌ１９，Ｌ２０，Ｄ２３，Ｄ２５，Ｅ２６，Ｓ２７，Ｉ２８，Ｅ２９，Ｙ３１，Ｋ３２，Ｄ３３，Ｋ３４，Ｋ３６，Ｋ３７，Ａ４０，Ｅ４１，Ｖ４２，Ｒ４３，Ｒ４４，Ｅ４５，Ｉ４６，Ｎ４７，Ｎ４８，Ｅ４９，Ｋ５０，Ａ５１，Ｆ５３，Ｌ５４，Ｔ５５，Ｌ５６，Ｌ５７，Ｌ５９，Ｉ６０，Ｎ６２，Ｒ７１，Ｅ７３，Ｓ７４，Ｄ７５，Ｒ７７，Ｇ７８，Ａ７９，Ｄ８１，Ｒ８２，Ｆ８３，Ｖ８４，Ｓ８５，Ｓ８６，Ｇ８７，Ｇ８８，Ｆ８９，Ａ９１，Ｖ９２，Ｔ９３，Ｋ９４，Ｔ９５，Ｌ９７，Ｈ９８，Ｇ９９，Ｔ１００，Ａ１０１，Ｌ１０２，Ｓ１０３，Ｌ１０７，Ｑ１０９，Ｇ１１１，Ｅ１１３，Ｖ１１４，Ｓ１１５，Ｑ１１６，Ｅ１１７，Ａ１１８，Ｆ１１９，Ｓ１２０，Ｇ１２１，Ｋ１２３，Ｄ１２４，Ｑ１２５，Ｇ１２７，Ｎ１２８，Ｆ１２９，Ｌ１３０，Ｅ１３１，Ｌ１３３，Ｋ１３４，Ｅ１３５，Ｄ１３６，Ｉ１３７，Ｋ１３８，Ａ１３９，Ｉ１４０，Ｌ１４３，Ａ１４６，Ｌ１５１，Ｅ１５２，Ｎ１５５，Ｉ１５６，Ｄ１５８，Ａ１６０，Ｋ１６１，Ｖ１６２，Ｆ１６３，Ｓ１６６，Ｈ１６７，Ｋ１６９，Ｅ１７０，Ｌ１７１，Ｓ１７２，Ｋ１７５，Ｉ１７６，Ｇ１７７，Ｋ１７８，Ｅ１７９，Ｌ１８０，Ａ１８１，Ｅ１８２，Ｑ１８３，Ｎ１８５，Ａ１８７，Ｈ１９３，Ｒ１９４，Ｔ１９６，Ｑ１９７，Ｓ２０４，Ｋ２１０，Ｋ２１１，Ｅ２１２，Ｎ２１５，Ｑ２１６，Ｖ２１７，Ｌ２１８，Ｌ２１９，Ｅ２２０，Ａ２２２，Ｉ２２３，Ｌ２２４，Ｙ２２６，Ｍ２２８，Ｉ２２９，Ｓ２３１，Ｖ２３２，Ｒ２３５，Ｔ２４０，Ｓ２４１，Ｒ２４２，Ｒ２４６，Ｔ２５１，Ｌ２５３，Ｌ２６０，Ｖ２６８，Ｖ２７０，Ａ２７１，Ｆ２７２，Ｑ２７５，Ｙ２７６，Ｄ２７８，Ｓ２８２，Ｅ３０７，Ｅ３１４，Ｒ３１５，Ｄ３１７，Ａ３２０，Ｉ３２１，Ｄ３２３，Ｍ３２８，Ｋ３２９，Ｃ３３１，Ｆ３３２，Ｌ３３３，Ａ３４３，Ｄ３４５，Ｎ３４６，Ｋ３５０，Ｇ３５１，Ｅ３５２，Ｐ３５６，Ｙ３５７，Ｋ３６０，Ａ３６１，Ａ３６３，Ｄ３６４，Ｃ３６６，Ｎ３６７，Ａ３６８，Ｆ３６９，Ｌ３７０，Ｑ３７１，Ｎ３７８，Ｋ３７９，Ｓ３８０，Ｔ３８３，Ｄ３８６，Ｇ３８９，Ｎ３９０，Ｗ３９２，Ｋ３９３，Ｖ４０２，Ｙ４０５，Ｖ４０８，Ｖ４０９，Ｑ４１０，Ｋ４１３，Ｋ４１４，Ｅ４１８，Ｋ４２２，Ｙ４２３，Ｈ４２４，Ｄ４２５，Ｔ４２６，Ｓ４２８，Ｒ４２９，Ｓ４３１，Ｈ４３２，Ｃ４３７，Ｓ４４４，Ｉ４４７，Ａ４４８，Ｓ４５７，Ｍ４６０，Ｒ４６１，Ｔ４６２，Ｋ４６３，Ｇ４６４，Ｓ４６６，Ｅ４６７，Ｅ４６８，Ｌ４６９，Ｔ４７１，Ｅ４７２，Ｍ４７５，Ｋ４８４，Ｋ４８９，Ｌ４９０，Ｇ４９２，Ｓ４９３，Ｌ４９４，Ｋ４９７，Ｖ５００，Ｅ５０１，Ｔ５０２，Ａ５０３，Ｉ５０４，Ｌ５０６，Ｑ５０９，Ｓ５１０，Ｈ５１１，Ｔ５１３，Ｈ５１５，Ｇ５１７，Ａ５１９，Ｓ５２２，Ｒ５２８，Ｋ５２９，Ｖ５３１，Ｖ５３４，Ｉ５３５，Ｔ５３６，Ｅ５３７，Ｉ５３９，Ｌ５４０，Ｆ５４２，及びＲ５４４からなる群から選択される残基に生じる、請求項８７に記載のポリペプチド。
  89. 前記置換が、Ｅ２Ｈ又はＩ又はＳ、Ａ３Ｅ又はＧ又はＫ又はＮ又はＱ又はＲ又はＴ，Ｓ１３Ｑ又はＴ，Ｄ１７Ｅ，Ｙ１８Ｆ又はＭ又はＮ、Ｌ１９Ｆ，Ｌ２０Ｉ又はＶ、Ｄ２３Ｔ，Ｄ２５Ａ又はＥ又はＳ，Ｅ２６Ｇ又はＮ又はＱ又はＴ，Ｓ２７Ｅ又はＦ又はＫ又はＶ、Ｉ２８Ｅ又はＦ又はＭ又はＰ、Ｅ２９Ｄ又はＰ又はＲ又はＴ，Ｖ３０Ｎ又はＱ，Ｙ３１Ｑ又はＷ、Ｋ３２Ｄ又はＧ又はＮ又はＲ，Ｄ３３Ｎ，Ｋ３４Ｄ又はＥ又はＱ又はＳ，Ｋ３６Ｆ又はＲ，Ｋ３７Ｆ又はＩ、Ａ４０Ｃ又はＤ又はＥ又はＦ又はＭ又はＮ又はＰ又はＱ又はＶ、Ｅ４１Ｃ又はＤ又はＦ又はＮ又はＱ又はＳ又はＶ、Ｖ４２Ａ又はＳ又はＴ，Ｒ４３Ｉ又はＱ，Ｒ４４Ａ又はＤ又はＫ又はＭ又はＹ，Ｅ４５Ｃ又はＭ又はＮ又はＱ，Ｉ４６Ｆ又はＶ、Ｎ４７Ｅ又はＩ又はＫ又はＲ又はＶ、Ｎ４８Ａ又はＣ又はＥ又はＦ又はＬ又はＱ又はＲ又はＳ，Ｅ４９Ｇ又はＨ又はＩ又はＲ又はＳ又はＷ、Ｋ５０Ｃ又はＧ又はＭ又はＮ又はＰ又はＲ，Ａ５１Ｅ又はＧ又はＬ又はＱ又はＴ，Ｆ５３Ｄ，Ｌ５４Ａ又はＣ又はＥ又はＨ又はＩ又はＱ，Ｔ５５Ａ又はＨ又はＮ又はＱ又はＳ又はＹ，Ｌ５６Ｈ又はＱ又はＲ又はＳ，Ｌ５７Ｉ，Ｌ５９Ｆ又はＭ又はＳ又はＶ又はＹ，Ｉ６０Ｃ又はＶ、Ｎ６２Ｖ，Ｒ７１Ｉ，Ｅ７３Ｄ，Ｓ７４Ｇ又はＭ又はＰ、Ｄ７５Ｅ，Ｒ７７Ａ又はＮ又はＴ又はＶ、Ｇ７８Ｅ又はＩ又はＫ又はＮ又はＰ又はＱ又はＶ又はＷ、Ａ７９Ｍ又はＲ又はＹ，Ｄ８１Ｃ又はＥ又はＨ又はＬ又はＮ、Ｒ８２Ｃ又はＦ又はＧ又はＬ又はＷ、Ｆ８３Ｇ又はＨ又はＩ又はＬ又はＶ、Ｖ８４Ｆ又はＨ又はＬ又はＮ又はＱ又はＲ又はＳ又はＴ又はＷ又はＹ，Ｓ８５Ｃ又はＬ又はＮ又はＲ，Ｓ８６Ｃ又はＮ、Ｇ８７Ｃ又はＥ又はＦ又はＫ又はＬ又はＮ又はＴ，Ｇ８８Ｃ又はＤ又はＩ又はＶ又はＷ又はＹ，又はＹ、又はＩ、Ａ９１Ｃ又はＤ又はＥ又はＧ又はＨ又はＬ又はＲ又はＳ又はＴ又はＶ又はＹ，Ｖ９２Ａ又はＣ又はＥ又はＦ又はＧ又はＩ又はＬ又はＱ又はＷ、Ｔ９３Ｈ又はＩ又はＱ又はＶ又はＷ、Ｋ９４Ｃ又はＶ又はＹ，Ｔ９５Ｃ又はＨ又はＫ又はＭ，Ｌ９７Ａ又はＭ又はＰ、Ｈ９８Ｃ又はＳ又はＴ又はＶ又はＷ、Ｇ９９Ａ又はＣ又はＨ又はＰ又はＱ又はＴ，Ｔ１００Ａ又はＩ又はＬ又はＭ又はＶ、Ａ１０１Ｓ，Ｌ１０２Ｍ，Ｓ１０３Ａ又はＣ又はＧ又はＬ，Ｌ１０７Ｃ又はＦ，Ｑ１０９Ｃ又はＮ又はＳ，Ｇ１１１Ａ，Ｅ１１３Ｃ又はＨ又はＶ、Ｖ１１４Ｃ，Ｓ１１５Ｄ又はＹ，Ｑ１１６Ｇ又はＨ又はＬ又はＳ又はＴ又はＶ、Ｅ１１７Ａ又はＤ又はＩ、Ａ１１８Ｉ又はＶ、Ｆ１１９Ｌ又はＭ，Ｓ１２０Ａ又はＤ又はＥ又はＦ又はＫ又はＮ又はＲ又はＷ又はＹ，Ｇ１２１Ｄ又はＬ又はＶ又はＷ、Ｋ１２３Ｉ又はＳ又はＷ又はＹ，Ｄ１２４Ｃ又はＥ，Ｑ１２５Ａ又はＤ又はＧ又はＨ又はＫ又はＬ又はＮ又はＳ又はＴ又はＶ又はＷ、Ｇ１２７Ｄ又はＦ又はＷ、Ｎ１２８Ａ，Ｆ１２９Ｌ又はＹ，Ｌ１３０Ａ又はＣ又はＤ又はＱ又はＶ又はＹ，Ｅ１３１Ｄ又はＦ又はＧ又はＲ，Ｌ１３３Ｅ又はＧ又はＩ又はＰ又はＱ又はＴ又はＶ又はＹ，Ｋ１３４Ｄ又はＧ又はＨ又はＩ又はＬ又はＮ又はＲ又はＷ又はＹ，Ｅ１３５Ｈ又はＳ，Ｄ１３６Ｎ，Ｉ１３７Ａ又はＣ又はＤ又はＧ又はＰ又はＱ又はＳ又はＶ、Ｋ１３８Ｃ又はＤ又はＥ又はＰ又はＲ又はＳ又はＶ、Ａ１３９Ｐ又はＳ又はＴ又はＶ、Ｉ１４０Ｎ又はＱ又はＳ又はＴ又はＶ、Ｌ１４３Ａ又はＦ又はＧ又はＮ又はＲ又はＷ、Ａ１４６Ｍ，Ｌ１５１Ｅ又はＧ又はＭ又はＮ又はＱ又はＲ又はＳ又はＴ又はＶ又はＷ、Ｅ１５２Ａ又はＤ又はＩ又はＭ又はＰ、Ｇ１５３Ｄ，Ｎ１５５Ｅ又はＫ又はＭ，Ｉ１５６Ｅ又はＫ又はＬ又はＲ又はＹ，Ｄ１５８Ｅ，Ａ１６０Ｆ又はＨ又はＳ，Ｋ１６１Ｌ又はＲ又はＳ又はＹ，Ｖ１６２Ｄ又はＦ又はＮ又はＰ又はＴ，Ｆ１６３Ｃ又はＨ又はＩ又はＭ又はＶ又はＷ又はＹ，Ｓ１６６Ｃ又はＥ又はＨ又はＫ又はＰ又はＱ又はＶ又はＷ、Ｈ１６７Ｃ又はＬ又はＰ、Ｋ１６９Ｅ又はＧ又はＲ，Ｅ１７０Ｇ又はＩ又はＮ又はＲ，Ｌ１７１Ｃ又はＥ又はＧ又はＩ又はＭ又はＷ、Ｓ１７２Ｇ又はＮ又はＱ又はＲ、Ｋ１７５Ａ又はＧ又はＨ又はＮ又はＰ又はＴ又はＶ、Ｉ１７６Ａ又はＣ又はＮ又はＱ又はＶ、Ｇ１７７Ｄ又はＥ又はＨ又はＮ又はＰ又はＴ，Ｋ１７８Ｄ又はＥ又はＧ又はＩ又はＬ又はＭ又はＮ又はＰ又はＱ又はＶ又はＹ，Ｅ１７９Ｇ又はＩ又はＰ又はＱ又はＳ又はＴ又はＶ又はＷ又はＹ，Ｌ１８０Ｆ又はＨ又はＶ又はＷ、Ａ１８１Ｆ又はＭ又はＮ又はＷ、Ｅ１８２Ｈ又はＮ、Ｑ１８３Ａ又はＬ，Ｎ１８５Ｄ，Ａ１８７Ｃ又はＳ，Ｈ１９３Ｗ，Ｒ１９４Ｉ，Ｔ１９６Ｖ，Ｑ１９７Ｇ，Ｓ２０４Ａ又はＦ又はＭ又はＷ又はＹ，Ｋ２１０Ｍ，Ｋ２１１Ｄ又はＥ又はＦ又はＧ又はＨ又はＩ又はＭ又はＲ又はＳ又はＴ又はＶ、Ｅ２１２Ａ又はＤ又はＭ又はＰ又はＱ又はＴ，Ｎ２１５Ｄ又はＹ，Ｑ２１６Ａ又はＥ又はＮ、Ｖ２１７Ｃ又はＥ又はＫ又はＮ又はＰ又はＱ又はＴ，Ｌ２１８Ｖ，Ｌ２１９Ｉ又はＭ又はＶ、Ｅ２２０Ｄ又はＮ、Ａ２２２Ｓ，Ｉ２２３Ｃ，Ｌ２２４Ａ又はＣ又はＴ又はＶ、Ｙ２２６Ｆ，Ｍ２２８Ｈ又はＲ，Ｉ２２９Ａ，Ｓ２３１Ｄ又はＧ又はＨ又はＲ又はＶ、Ｖ２３２Ｑ，Ｒ２３５Ａ又はＤ又はＮ、Ｔ２４０Ｖ，Ｓ２４１Ｃ，Ｒ２４２Ｋ又はＬ，Ｒ２４６Ｈ又はＱ，Ｔ２５１Ｈ，Ｌ２５３Ｍ，Ｌ２６０Ｍ，Ｖ２６８Ｉ，Ｖ２７０Ｉ，Ａ２７１Ｓ，Ｆ２７２Ｑ，Ｑ２７５Ｅ，Ｙ２７６Ｆ又はＨ又はＱ，Ｄ２７８Ｌ又はＭ又はＲ又はＹ，Ｓ２８２Ｃ，Ｅ３０７Ｑ又はＲ，Ｅ３１４Ｈ，Ｒ３１５Ｇ又はＫ，Ｄ３１７Ｓ，Ａ３２０Ｎ又はＴ，Ｉ３２１Ｌ又はＭ，Ｄ３２３Ｉ又はＴ，Ｍ３２８Ｌ，Ｋ３２９Ｇ又はＱ又はＲ、Ｃ３３１Ｔ，Ｆ３３２Ｙ，Ｌ３３３Ｆ，Ａ３４３Ｉ又はＶ、Ｄ３４５Ｙ，Ｎ３４６Ａ，Ｋ３５０Ｈ又はＷ又はＹ，Ｇ３５１Ｅ又はＭ，Ｅ３５２Ｆ又はＩ又はＭ又はＶ、Ｐ３５６Ｍ又はＳ，Ｙ３５７Ｅ，Ｋ３６０Ｑ，Ａ３６１Ｑ又はＳ又はＶ、Ａ３６３Ｓ，Ｄ３６４Ｎ又はＴ，Ｃ３６６Ａ，Ｎ３６７Ｄ又はＥ又はＭ，Ａ３６８Ｄ又はＱ，Ｆ３６９Ｈ又はＱ，Ｌ３７０Ａ又はＤ又はＥ又はＦ又はＨ又はＮ又はＲ又はＳ又はＴ又はＶ、Ｑ３７１Ｇ又はＨ又はＩ又はＮ又はＰ又はＲ又はＴ又はＷ又はＹ，Ｎ３７８Ｄ，Ｋ３７９Ｅ又はＲ又はＳ，Ｓ３８０Ｋ又はＮ、Ｔ３８３Ｑ，Ｄ３８６Ｋ又はＳ，Ｇ３８９Ｃ又はＭ又はＰ又はＲ又はＴ，Ｎ３９０Ｓ，Ｗ３９２Ｆ又はＭ，Ｋ３９３Ｈ又はＲ，Ｖ４０２Ｆ又はＩ又はＬ，Ｙ４０５Ｆ，Ｖ４０８Ｑ又はＳ，Ｖ４０９Ｃ又はＱ又はＳ，Ｑ４１０Ｅ又はＧ又はＨ又はＩ又はＲ，Ｋ４１３Ｐ，Ｋ４１４Ｃ又はＨ又はＩ又はＱ，Ｅ４１８Ｎ，Ｋ４２２Ｇ又はＨ又はＱ又はＲ、Ｙ４２３Ｇ，Ｈ４２４Ｄ又はＧ又はＩ又はＳ又はＴ，Ｄ４２５Ｐ，Ｔ４２６Ａ又はＭ又はＱ，Ｓ４２８Ｖ，Ｒ４２９Ａ又はＣ又はＤ又はＧ又はＨ又はＫ又はＮ、Ｓ４３１Ｇ，Ｈ４３２Ａ又はＭ，Ｃ４３７Ｎ，Ｓ４４４Ｎ又はＱ又はＴ，Ｉ４４７Ｋ又はＲ，Ａ４４８Ｈ又はＳ又はＴ，Ｓ４５７Ｄ，Ｍ４６０Ａ又はＥ又はＧ、Ｒ４６１Ｎ，Ｔ４６２Ｓ，Ｋ４６３Ｇ又はＮ、Ｇ４６４Ａ又はＤ又はＥ又はＦ又はＨ又はＶ又はＹ，Ｓ４６６Ｅ又はＧ又はＫ又はＮ又はＴ，Ｅ４６７Ｎ，Ｅ４６８Ａ又はＮ又はＰ又はＱ，Ｌ４６９Ａ又はＮ、Ｔ４７１Ｎ，Ｅ４７２Ａ又はＧ又はＮ、Ｍ４７５Ｉ，Ｋ４８４Ａ，Ｋ４８９Ｒ，Ｌ４９０Ｉ又はＹ，Ｇ４９２Ｔ又はＶ、Ｓ４９３Ｃ又はＧ又はＫ又はＶ、Ｌ４９４Ｇ又はＩ又はＱ又はＶ、Ｋ４９７Ｍ又はＴ，Ｖ５００Ｉ又はＹ，Ｅ５０１Ｎ，Ｔ５０２Ｈ，Ａ５０３Ｌ又はＭ，Ｉ５０４Ｌ，Ｌ５０６ Ｉ又はＶ、Ｑ５０９Ａ，Ｓ５１０Ｔ，Ｈ５１１Ｉ又はＭ，Ｔ５１３Ｓ，Ｈ５１５Ｑ，Ｇ５１７Ｐ，Ａ５１９Ｃ，Ｓ５２２Ａ又はＫ，Ｒ５２８Ｋ，Ｋ５２９Ａ，Ｖ５３１Ｇ又はＮ、Ｖ５３４Ａ又はＳ，Ｉ５３５Ｃ又はＳ又はＴ，Ｔ５３６Ｍ，Ｅ５３７Ｈ又はＮ又はＱ，Ｉ５３９Ｖ，Ｌ５４０Ｅ又はＱ又はＲ又はＶ、Ｆ５４２Ｍ，及びＲ５４４Ｇ又はＮ又はＰ又はＱ又はＳからなる群から選択される、請求項８８に記載のポリペプチド。
  90. イソプレン合成酵素活性の改良された単離ポリペプチドであって、配列番号１と対応する：Ｘ２２，Ｘ３６，Ｘ４３，Ｘ５８，Ｘ８７，Ｘ８９，Ｘ１１８，Ｘ１５１，Ｘ２３４，Ｘ２４７，Ｘ２５４，Ｘ２８２，Ｘ２８８，Ｘ３９１，Ｘ３９２，Ｘ４３７，Ｘ４４３，Ｘ４４７，Ｘ４８１，Ｘ４８８，Ｘ５０２，及びＸ５４２からなる群から選択される残基の１つ以上に置換を含み、かつここで前記ポリペプチドは、配列番号１の野生型イソプレン合成酵素と比較して、イソプレン合成酵素の比活性が少なくとも３０％上昇している、単離ポリペプチド。
  91. 前記置換が、Ｓ２２，Ｋ３６，Ｒ４３，Ｅ５８，Ｇ８７，Ｆ８９，Ａ１１８，Ｌ１５１，Ｑ２３４，Ｖ２４７，Ｈ２５４，Ｓ２８２，Ｓ２８８，Ａ３９１，Ｗ３９２，Ｃ４３７，Ｉ４４７，Ｔ４８１，Ｅ４８８，Ｔ５０２及びＦ５４２からなる群から選択される残基の置換である、請求項９０に記載のポリペプチド。
  92. 前記置換が、Ｓ２２Ｋ又はＲ、Ｋ３６Ｈ又はＷ、Ｒ４３Ｅ，Ｅ５８Ｆ，Ｇ８７Ｓ又はＲ、Ｆ８９Ｄ，Ａ１１８Ｅ，Ｌ１５１Ｙ，Ｇ１５３Ｐ，Ｑ２３４Ｒ，Ｖ２４７Ｉ，Ｈ２５４Ｃ，Ｓ２８２Ｈ又はＷ、Ｓ２８８Ａ又はＴ又はＹ、Ａ３９１Ｇ，Ｗ３９２Ｃ，Ｃ４３７Ｌ，Ｉ４４７Ｖ，Ｔ４８１Ｙ，Ｅ４８８Ｌ，Ｔ５０２Ｆ及びＦ５４２Ｎからなる群から選択される、請求項９１に記載のポリペプチド。
  93. イソプレン合成酵素活性を有し、かつ宿主細胞で発現させた場合に宿主細胞の増殖活性が上昇する単離ポリペプチドであって、配列番号１と対応する：Ｘ３０，Ｘ１３４，Ｘ１４３，Ｘ１５６，Ｘ１５９，Ｘ１７２，Ｘ４１４，及びＸ４２１，からなる群から選択される残基の１つ以上に置換を含み、かつここで、前記ポリペプチドを発現している宿主細胞の増殖性は、同様の増殖条件下で配列番号１の野生型イソプレン合成酵素を発現している宿主細胞の増殖性と比較して、少なくとも２０％上昇している、単離ポリペプチド。
  94. 前記置換が、Ｋ１３４，Ｌ１４３，Ｉ１５６，Ｅ１５９，Ｓ１７２，Ｋ４１４，及びＱ４２１からなる群から選択される残基の置換である、請求項９３に記載のポリペプチド。
  95. 前記置換が、Ｖ３０Ｋ，Ｋ１３４Ｃ又はＰ、Ｌ１４３Ｉ，Ｉ１５６Ｇ，Ｅ１５９Ｄ，Ｓ１７２Ｖ，Ｋ４１４Ｆ，及びＱ４２１Ｒ又はＤからなる群から選択される残基の置換である、請求項９４に記載のポリペプチド。
  96. 請求項４に記載のポリペプチドを含む、組み換え宿主細胞。
  97. 請求項７に記載のポリペプチドを含む、組み換え宿主細胞。
  98. 請求項１０に記載のポリペプチドを含む、組み換え宿主細胞。
  99. 請求項１５に記載のポリペプチドを含む、組み換え宿主細胞。
  100. 請求項１９に記載のポリペプチドを含む、組み換え宿主細胞。
  101. 請求項２２に記載のポリペプチドを含む、組み換え宿主細胞。
  102. 請求項３１に記載のポリペプチドを含む、組み換え宿主細胞。
  103. 請求項３５に記載のポリペプチドを含む、組み換え宿主細胞。
  104. 請求項６３に記載のポリペプチドを含む、組み換え宿主細胞。
  105. 請求項６６に記載のポリペプチドを含む、組み換え宿主細胞。
  106. 請求項６９に記載のポリペプチドを含む、組み換え宿主細胞。
  107. 請求項７２に記載のポリペプチドを含む、組み換え宿主細胞。
  108. 請求項７９に記載のポリペプチドを含む、組み換え宿主細胞。
  109. 請求項８３に記載のポリペプチドを含む、組み換え宿主細胞。
  110. 請求項８６に記載のポリペプチドを含む、組み換え宿主細胞。
  111. 請求項９２に記載のポリペプチドを含む、組み換え宿主細胞。
  112. 請求項９５に記載のポリペプチドを含む、組み換え宿主細胞。
  113. 前記宿主細胞が、バクテリア細胞、藻類細胞、真菌細胞、酵母細胞、ラン藻細胞、又はクロストリジウムからなる群から選択される、請求項９６〜１１２のいずれか一項に記載の宿主細胞。
  114. 前記宿主細胞がバクテリア細胞である、請求項１１３に記載の組み換え宿主細胞。
  115. 前記バクテリア細胞がグラム陽性バクテリア細胞、又はグラム陰性バクテリア細胞である、請求項１１４に記載の宿主細胞。
  116. 前記バクテリア細胞が、大腸菌、アシドフィルス菌、Ｐ．シトレア（P. citrea）、枯草菌、Ｂ．リケニフォルミス（B. licheniformis）、Ｂ．レンタス（B. lentus）、ブレビバチルス、Ｂ．ステアロサーモフィルス（B. stearothermophilus）、Ｂ．アルカロフィルス（B. alkalophilus）、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．クラウシイ（B. clausii）、Ｂ．ハロデュランス（B. halodurans）、Ｂ．メガテリウム（B. megaterium）、Ｂ．コアギュランス（B. coagulans）、Ｂ．サーキュランス（B. circulans）、Ｂ．ロータス（B. lautus）、Ｂ．チューリンゲンシス（B. thuringiensis）、Ｓ．アルバス（S. albus）、Ｓ．リビダンス（S. lividans）、Ｓ．セリカラー（S. coelicolor）、Ｓ．グリセウス（S. griseus）、シュードモナス属、Ｐ．アルカリゲネス（P. alcaligenes）、クロストリジウム属、コリネバクテリウム属、及びＣ．グルタミクム（C. glutamicum）からなる群から選択される、請求項１１５に記載の宿主細胞。
  117. 前記宿主細胞が藻類細胞である、請求項１３に記載の宿主細胞。
  118. 前記藻類細胞が、緑藻類、紅藻類、灰色藻類、クロララクニオン藻類、ミドリムシ類、クロミスタ類、又は渦鞭毛藻類からなる群から選択される、請求項１１７に記載の宿主細胞。
  119. 前記宿主細胞が真菌細胞である、請求項１１８に記載の組み換え宿主細胞。
  120. 前記真菌細胞が糸状菌である、請求項１１９に記載の組み換え宿主細胞。
  121. 前記宿主細胞が酵母細胞である、請求項１１３に記載の組み換え宿主細胞。
  122. 前記酵母細胞が、酵母菌属、シゾサッカロミセス属、ピキア属、又はカンジダ属からなる群から選択される、請求項１２１に記載の宿主細胞。
  123. 前記酵母細胞が、出芽酵母細胞である、請求項１２２に記載の宿主細胞。
  124. イソプレン合成酵素活性が改良されており、及び／又は宿主細胞に発現させた場合に増殖性が上昇するポリペプチドを同定する方法であって、配列番号１の野生型イソプレン合成酵素の比活性及び配列番号１の野生型イソプレン合成酵素を発現している宿主細胞の増殖性と比較した場合に、宿主細胞の比活性が改良される及び／又は前記宿主細胞の増殖性が上昇する、ポリペプチド中の１つ以上の置換について、部位評価ライブラリ又はコンビナトリアルライブラリをスクリーニングする工程を含む、方法。
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