MX2011000072A - Polimeros de isopreno a partir de recursos renovables. - Google Patents

Polimeros de isopreno a partir de recursos renovables.

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MX2011000072A MX2011000072A MX2011000072A MX2011000072A MX 2011000072 A MX2011000072 A MX 2011000072A MX 2011000072 A MX2011000072 A MX 2011000072A MX 2011000072 A MX2011000072 A MX 2011000072A MX 2011000072 A MX2011000072 A MX 2011000072A
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Gregory M Whited
Joseph C Mcauliffe
Gopal K Chotani
Andrei Miasnikov
Marguerite Cervin
Karl J Sanford
Frank J Feher
Aaron S Puhala
Caroline Peres
Richard La Duca
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Abstract

Se ha encontrado que ciertas células en cultivo pueden convertir el carbono disponible en el medio de cultivo de células en isopreno. Estas células tienen un ácido nucleico heterólogo que está enlazado operablemente a un promotor y que codifica para un polipéptido de isopreno sintasa. El isopreno producido en este medio cultivado puede ser después recuperado y polimerizado en cauchos sintéticos y otros materiales poliméricos útiles. Los polímeros que contienen isopreno sintético de esta invención ofrecen el beneficio de ser verificables en cuanto a si se derivan de recursos no a base de petroquímicos. También pueden ser distinguidos analíticamente de cauchos que provengan de fuentes naturales. La presente invención describe más específicamente un polímero de poliisopreno que comprende unidades de repetición que se derivan de monómero de isopreno, en donde el polímero de poliisopreno tiene un valor delta 13C de más de -22%. Este tipo de poliisopreno puede ser un caucho de homopolímero de as-1 A-poliisopreno.

Description

POLIMEROS DE ISOPRENO A PARTIR DE RECURSOS RENOVABLES Antecedentes de la invención El isopreno (2-metil-buta-l , 3-dieno) es un compuesto orgánico extremadamente importante que se usa en una amplia variedad de aplicaciones. Por ejemplo, el isopreno se emplea como un intermediario o un material de partida en la síntesis de numerosas composiciones químicas y polímeros. El isopreno también es un importante material biológico que es sintetizado naturalmente por muchas plantas y animales, incluyendo humanos. El isopreno es un líquido incoloro a temperatura ambiente y es altamente inflamable.
La fórmula estructural del isopreno es: El isopreno se volvió un monómero importante para su utilización en la síntesis de cis- 1 , 4 -polibutadieno cuando su polimerización estéreo-regulada se volvió comercialmente posible a principios de los 60. Cis- 1 , 4 -poliisopreno elaborado mediante esta polimerización estéreo-regulada es similar en la estructura y propiedades al caucho natural. Incluso a pesar de que no es idéntico al caucho natural se puede usar como un sustituto del caucho natural en muchas aplicaciones. Por ejemplo, el caucho de cis- 1 , 4 -poliisopreno sintético se usa ampliamente en la fabricación de neumáticos REF . : 216679 y otros productos de caucho. Esta demanda por caucho de cis-1 , 4 -poliisopreno sintético consume una mayoría del isopreno disponible en el mercado mundial. El isopreno restante se usa para la elaboración de otros cauchos sintéticos, copolímeros de bloques y otros productos químicos. Por ejemplo, el isopreno se usa para elaborar cauchos de butadieno- isopreno, cauchos de copolímero de estireno-isopreno, cauchos de estireno- isopreno-butadieno, copolímeros de bloques de estireno- isopreno-estireno, y copolímeros de bloques de estireno- isopreno.
Durante años muchas rutas de síntesis para producir isopreno han sido investigadas. Por ejemplo, la síntesis de isopreno al hacer reaccionar isobutileno con formaldehído en presencia de un catalizador se describe en la patente de Estados Unidos 3,146,278, patente de Estados Unidos 3,437,711, patente de Estados Unidos 3,621,072, patente de Estados Unidos 3,662,016, patente de Estados Unidos 3,972,955, patente de Estados Unidos 4,000,209, patente de Estados Unidos 4,014,952, patente de Estados Unidos 4,067,923 y patente de Estados Unidos 4,511,751. La patente de Estados Unidos 3,574,780 describe otro proceso para la fabricación de isopreno al pasar una mezcla de éter metil- ter-butílico y catalizadores de óxido sobre mezclados en aire. El éter metil- ter-butílico es luego craqueado para formar isobutileno y metanol sobre el catalizador. El metanol producido es oxidado en formaldehído el cual reacciona después con el isobutileno sobre el mismo catalizador para producir el isopreno. La patente de Estados Unidos 5,177,290 describe un proceso para producir dienos, incluyendo isopreno, que incluye hacer reaccionar una mezcla de reacción de un éter alquilico terciario y una fuente de oxígeno sobre dos catalizadores funcionalmente distintos bajo condiciones de reacción suficientes para producir altos rendimientos de los dienos con mínima recirculación del éter.
El isopreno usado en aplicaciones industriales se produce típicamente como un subproducto del craqueo térmico del petróleo o nafta o es de otra manera extraído de flujos petroquímicos . Es un proceso de energía intensa y relativamente costosa. Con la demanda mundial de productos a base de petroquímicos constantemente incrementándose, el costo del isopreno se espera que se eleve a niveles mucho más altos a largo plazo y su disponibilidad es limitada en cualquier caso. En otras palabras, existe una preocupación de que los futuros suministros de isopreno a partir de fuentes de base petroquímica sean inadecuados para satisfacer las necesidades proyectadas y que los precios se eleven a niveles sin precedentes. En consecuencia, existe una necesidad actual por producir una fuente de isopreno a partir de una fuente renovable y de bajo costo que sea ambientalmente amigable.
Breve descripción de la invención Se ha encontrado que ciertas células en cultivo pueden convertir más de aproximadamente 0.002 por ciento del carbono disponible en el medio de cultivo de células en isopreno. Estas células tienen un ácido nucleico heterólogo que (i) codifica para un polipéptido de isopreno sintasa y (ii) está enlazado operablemente a un promotor. En algunos casos, estas células se cultivan en un medio de cultivo que incluye una fuente de carbono, tal como, pero no limitada a, un carbohidrato, glicerol, glicerina, dihidroxiacetona , fuente de un carbono, aceite, grasa animal, aceite animal, ácido graso, lípido, fosfolípido, glicerolípido, monoglicérido, diglicérido, triglicérido, fuente de carbono renovable, polipéptido (por ejemplo, una proteína o péptido microbiano o vegetal) , extracto de levadura, componente de un extracto de levadura o cualquier combinación de dos o más de los anteriores. El isopreno producido en este medio de cultivo puede ser después recuperado y polimerizado en cauchos sintéticos y otros materiales poliméricos útiles.
Se anticipa que habrá una demanda significativa por caucho sintético y otros polímeros que contengan isopreno que sean sintetizados usando isopreno de este tipo el cual se elabora a partir de recursos renovables y no a base de petroquímicos . De hecho, se cree que los clientes industriales y los consumidores preferirán comprar polímeros que contengan isopreno que se deriven de estas fuentes ambientalmente amigables a aquellos que se elaboren con isopreno derivado de un proceso petroquímico . Se cree además que los clientes desearían pagar precios mínimos por estos productos ambientalmente amigables que se elaboren con recursos renovables. Sin embargo, es importante poder verificar que estos polímeros que contengan isopreno en realidad se elaboren a partir de recursos no a base de petroquímicos . Los polímeros que contienen isopreno sintético de esta invención ofrecen el beneficio de ser verificables en cuanto a que se derivan de recursos no a base de petroquímicos. También pueden ser distinguidos analíticamente de cauchos que provienen de fuentes naturales.
La presente invención describe más específicamente un polímero de poliisopreno que comprende unidades de repetición que se derivan de monómero de isopreno, en donde el polímero de poliisopreno tiene un valor 613C de más de -22¾,. Este tipo de poliisopreno puede ser un homopolímero de poliisopreno .
La presente invención revela además un polímero de poliisopreno que comprende unidades de repetición que se derivan de monómero de isopreno, en donde el polímero de poliisopreno tiene un valor 613C que está dentro de la escala de -30&. a -28.5&>. Este tipo de poliisopreno también puede ser un homopolímero de poliisopreno.
La presente invención describe también un polímero de ' poliisopreno que comprende unidades de repetición que se derivan de monómero de isopreno, en donde el poliisopreno está libre de proteína, y en donde el polímero de poliisopreno tiene un valor 813C que está dentro de la escala de -34& a -24¾>.
Esta invención revela además un polímero de poliisopreno que comprende unidades de repetición que se derivan de monómero de isopreno, en donde el polímero de poliisopreno tiene un contenido de microestructura cis-1,4-de menos de 99.9%, en donde el polímero de poliisopreno tiene un contenido de microestructura trans-1,4- de menos de 99.9%, y en donde el polímero de poliisopreno tiene un valor 613C el cual está dentro de la escala de -34&> a -24¾>.
La presente invención describe también un polímero de poliisopreno que comprende unidades de repetición que se derivan de monómero de isopreno, en donde el polímero de poliisopreno tiene un contenido de microestructura 3,4- mayor de 2%, y en donde el polímero de poliisopreno tiene un valor 513C el cual está dentro de la escala de -34¾> a -24¾>.
La presente invención revela además un polímero de poliisopreno que comprende unidades de repetición que se derivan de monómero de isopreno, en donde el polímero de poliisopreno tiene un contenido de 1 , 2 -microestructura de más de 2%, y en donde el polímero de poliisopreno tiene un valor 613C el cual está dentro de la escala de -34¾> a -24¾>.
La presente invención describe también un polímero que comprende unidades de repetición que se derivan de monómero de isopreno y al menos un monómero adicional, en donde el polímero incluye bloques de unidades de repetición que se derivan de isopreno, y en donde los bloques de unidades de repetición que se derivan de isopreno tienen un valor 613C de más de -22S¾.
La presente invención revela además un polímero que comprende unidades de repetición que se derivan de monómero de isopreno y al menos un monómero adicional, en donde el polímero incluye bloques de unidades de repetición que se derivan de isopreno, y en donde los bloques de unidades de repetición que se derivan de isopreno tienen un valor 513C que está dentro de la escala de -34&, a -24¾>.
La presente invención describe también un polímero de poliisopreno líquido que comprende unidades de repetición que se derivan de monómero de isopreno, en donde el polímero de poliisopreno tiene un peso molecular promedio en peso que está dentro de la escala de 5,000 a 100,000, y en donde el polímero de poliisopreno líquido tiene un valor 513C el cual está dentro de la escala de -34%. a -24¾>.
La presente invención revela además un polímero de poliisopreno líquido que comprende unidades de repetición que se derivan de monómero de isopreno, en donde el polímero de poliisopreno líquido tiene un peso molecular promedio en peso que está dentro de la escala de 5,000 a 100,000, y en donde el polímero de poliisopreno líquido tiene un valor 613C el cual está dentro de la escala de -34t¿ a -24¾,.
La presente invención describe también un método para verificar que un homopolímero de poliisopreno provenga de una fuente no derivada de petróleo renovable sostenible que comprenda: (I) determinar el valor 513C del homopolímero de poliisopreno, (II) si el homopolímero de poliisopreno tiene un valor 513C dentro de la escala de -34¾> a -30%> o dentro de la escala de -28.5¾> a -24¾> analizar adicionalmente el homopolímero de poliisopreno para determinar¦ (1) su contenido de microestructura cis-, (2) su contenido de microestructura 3,4-, (3) su contenido de microestructura 1,2-, (4) su peso molecular promedio en peso, o (5) la presencia o ausencia de proteínas, jabones, lípidos, resinas o azúcares residuales que son indicadores de caucho natural; y (III) verificar que el homopolímero de poliisopreno sea de una fuente no derivada de petróleo renovable y sostenible si tiene (i) un valor 513C de más de -22¾>, (ii) un valor 513C que esté dentro de la escala de -30t¾ a -28.5&>, o (iii) un valor 513C dentro de la escala de -34¾> a -30¾> o dentro de la escala de -28.5¾> a -24t¾ y si (a) tiene un contenido de microestructura cis- de menos de 100%, (b) contiene microestructura 3,4-, (c) contiene microestructura 1,2-, (d) tiene un peso molecular promedio en peso de menos de 100,000, o (e) está libre de proteínas, jabones, lípidos, resinas o azúcares residuales indicadores de caucho natural.
La presente invención revela además un método para verificar que un copolímero que tenga unidades de repetición que se deriven de isopreno contenga isopreno que provenga de una fuente no derivada de petróleo renovable y sostenible, el método comprende: (I) determinar el valor 613C de por lo menos un bloque de poliisopreno en el copolímero; y (II) verificar que el isopreno en el copolímero provenga de una fuente no derivada de petróleo renovable sostenible si el bloque de poliisopreno tiene (i) un valor 613C de más de -22¾¾, o (ii) un valor 613C que esté dentro de la escala de -34%, a -28.5¾>.
Breve descripción de las figuras La figura 1 es la secuencia de nucleótidos de un codón de gen de isopreno sintasa de kudzu optimizado para expresión en E. coli (SEQ ID NO:l). El codón de inicio atg está en cursivas, el codón de paro está en negritas y el sitio PstI añadido está subrayado.
La figura 2 es un mapa de pTrcKudzu.
Las figuras 3A, 3B y 3C son una secuencia de nucleótidos de pTrcKudzu (SEQ ID NO: 2) . La RBS está subrayada, el codón de inicio de isopreno sintasa de kudzu está en negritas mayúsculas y el codón de paro está en cursivas mayúsculas y negritas. La estructura básica del vector es pTrcHis2B.
La figura 4 es un mapa de pETNHisKudzu.
Las figuras 5A, 5B y 5C son la secuencia de nucleótidos de pETNHisKudzu (SEQ ID NO: 5) .
La figura 6 es un mapa de pCL-lac-Kudzu.
Las figuras 7A, 7B y 7C son la secuencia de nucleótidos de pCL- lac-Kudzu (SEQ ID NO : 7) .
La figura 8A es una gráfica que muestra la producción de isopreno en células BL21 de E. coli sin vector.
La figura 8B es una gráfica que muestra la producción de isopreno en células BL21 de E. coli con pCL-lac-Kudzu .
La figura 8C es una gráfica que muestra la producción de isopreno en células BL21 de E. coli con pCL-lac-Kudzu.
La figura 8D es una gráfica que muestra la producción de isopreno en células BL21 de E. coli con pETNHisKudzu .
La figura 9A es una gráfica que muestra OD con el tiempo de fermentación de BL21/pTrcKudzu de E. coli en una fermentación intermitente con alimentación de 14 litros.
La figura 9B es una gráfica que muestra la producción de isopreno con el tiempo de fermentación de BL2l/pTrcKudzu de E. coli en una fermentación intermitente de alimentación de 14 litros.
La figura 10A es una gráfica que muestra la producción de isopreno en Panteoa citrea. Células de control sin isopreno sintasa de kudzu recombinante . Los diamantes grises representan síntesis de isopreno, los cuadrados negros representan OD600.
La figura 10B es una gráfica que muestra la producción de isopreno en Panteoa citrea que expresa pCL-lac Kudzu. Los diamantes grises representan síntesis de isopreno, los cuadrados negros representan OD600.
La figura 10C es una gráfica que muestra la producción de isopreno en Panteoa citrea que expresa pTrcKudzu. Los diamantes grises representan síntesis de isopreno, los cuadrados negros representan OD600.
La figura 11 es una gráfica que muestra la producción de isopreno en Bacillus subtilis que expresa isopreno sintasa recombinante. BG3594comK es una cepa de B. subtilis sin plásmido (producción de isopreno nativo) . CF443-BG3594comK es una cepa de B. subtilis con pBSKudzu (producción de isopreno recombinante) . IS en el eje y indica isopreno.
Las figuras 12A, 12B y 12C son la secuencia de nucleótidos de pBS Kudzu #2 (SEQ ID NO: 57) .
La figura 13 es la secuencia de nucleótidos de isopreno sintasa de kudzu optimizada en codones para expresión en Yarrowia (SEQ ID NO: 8) .
La figura 14 es un mapa de pTrex3g que comprende un gen de isopreno, sintasa de kudzu optimizado en codones para la expresión en Yarrowia.
Las figuras 15A, 15B y 15C son la secuencia de nucleótidos del vector pSPZl (MAP29Spb) (SEQ ID NO: 11).
La figura 16 es la secuencia de nucleótidos del gen de kudzu isopreno (Pueraria montana) sintético optimizado en codones para expresión en Yarrowia (SEQ ID NO : 12) .
La figura 17 es la secuencia de nucleótidos del gen de isopreno sintasa (Populus alba x Populus trémula) popular híbrido sintético (SEQ ID NO: 13) . El codón de inicio ATG está en negritas y el codón de paro está subrayado.
La figura 18A muestra una construcción de delineado esquemático de vectores pYLA 1, pYLl y pYL2.
La figura 18B muestra una construcción de delineado esquemático del vector pYLA(POPl).
La figura 18C muestra una construcción de delineado esquemático del vector pYLA(KZl) .
La figura 18D muestra una construcción de delineado esquemático del vector pYLl(KZl) .
La figura 18E muestra una construcción de delineado esquemático del vector pYLI(MAP29) .
La figura 18F muestra una construcción de delineado esquemático del vector pYLA (MAP29) .
Las figuras 19A y 19B muestran las vías metabólicas MVA y DXP para isopreno (con base en F. Bouvier et al., Progress in Lipid Res. 44:357-429, 2005). La siguiente descripción incluye nombres alternativos para cada polipéptido en las vías y una referencia que describe un ensayo para medir la actividad del polipéptido indicado (cada una de estas referencias se incorporan cada una en la presente a manera de referencia en sus totalidades, particularmente con respecto a ensayos para actividad de polipéptido para polipéptidos en las vías MVA y DXP) . Vía de mevalonato: AACT; Acetyl-CoA acetiltransferasa , MvaE, EC 2.3.1.9. Ensayo: J. Bacteriol . , 184: 2116-2122, 2002; HMGS ; Hidroximetilglutaril-CoA sintasa, MvaS, EC 2.3.3.10. Ensayo: J. Bacteriol., 184: 4065-4070, 2002; HMGR; 3-Hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa, MvaE, EC 1.1.1.34. Ensayo: J. Bacteriol., 184: 2116-2122, 2002; MVK; Mevalonato cinasa, ERG12, EC 2.7.1.36. Ensayo: Curr Genet 19:9-14, 1991. PMK; Fosfomevalonato cinasa, ERG8, EC 2.7.4.2, Ensayo: Mol Cell Biol., 11:620-631, 1991; DPMDC; Difosfomevalonato descarboxilasa, MVD1, EC 4.1.1.33. Ensayo: Biochemistry, 33:13355-13362, 1994; IDI ; Isopentenil -difosfato delta-isomerasa, IDII, EC 5.3.3.2. Ensayo: J. Biol. Chem. 264:19169-19175, 1989. Vía de DXP: DXS ; 1-Desoxixilulosa- 5 -fosfato sintasa, dxs, EC 2.2.1.7. Ensayo: PNAS, 94:12857-62, 1997; DXR; 1-Desoxi -D-xilulosa 5-fosfato reductoisomerasa , dxr, EC 2.2.1.7. Ensayo: Eur. J. Biochem. 269:4446-4457, 2002; MCT; 4-Difosfocitidil-2C-metil-D-eritritol sintasa, IspD, EC 2.7.7.60. Ensayo: PNAS , 97:6451-6456, 2000; CMK; 4-Difosfocitidil-2-C-metil-D-eritritol cinasa, IspE, EC 2.7.1.148. Ensayo: PNAS, 97:1062-1067, 2000; MCS ; 2C-Metil-D-eritritol 2 , -ciclodifosfato sintasa, IspF, EC 4.6.1.12. Ensayo: PNAS, 96:11758-11763, 1999; HDS ; 1 -Hidroxi - 2 -met il- 2 -(E) -butenil 4-difosfato sintasa, ispG, EC 1.17.4.3. Ensayo: J. Org. Chem. , 70:9168-9174, 2005; HDR; l-Hidroxi-2-metil-2- (E) -butenil 4-difosfato reductasa, IspH, EC 1.17.1.2. Ensayo: JACS, 126:12847-12855, 2004.
Las figuras 20A a 20B muestran gráficas que representan resultados del análisis GC-MS de la producción de isopreno con cepas de Y. lipolytica recombinantes sin (figura 20A) o con (figura 20B) un gen de isopreno sintasa de kudzu. Las flechas indican el tiempo de elución de estándar de isopreno auténtico.
La figura 21 es un mapa de pTrcKudzu yIDI DXS Kan. Las figuras 22A, 22B, 22C y 22D son una secuencia de nucleótidos de yIDI DXS Kan (SEQ ID NO: 20) .
La figura 23A es una gráfica que muestra la producción der*^isopreno a partir de glucosa en BL21/pTrcKudzukan. El tiempo 0 es el tiempo de inducción con IPTG (400 ymoles) . El eje x es el tiempo después de inducción; el eje y es OD600 y el eje y2 es productividad total de isopreno (ig/L) de espacio superior o productividad específica (ug/L de espacio superior/OD) . Los diamantes representan OD600, los círculos representan productividad de isopreno total {]ig/h) y los cuadrados representan productividad específica de isopreno ^g/L/OD) .
La figura 23B es una gráfica que muestra la producción de isopreno a partir de glucosa en BL21/pTrcKudzu yiDi kan. El tiempo 0 es el tiempo de inducción con IPTG (400 µ??????ß) . El eje x es el tiempo después de inducción; el eje y es OD600 y el eje y2 es productividad total de isopreno (ug/L de espacio superior o productividad específica (ig/L espacio superior/OD) . Los diamantes representan OD600, los círculos representan productividad de isopreno total (]ig/L) y los cuadrados representan productividad específica de isopreno ^g/L/OD) .
La figura 23C es una gráfica que muestra la producción de isopreno a partir de glucosa en BL21/pTrcKudzu DXS kan. El tiempo 0 es el tiempo de inducción con IPTG (400 pmoles) . El eje x es el tiempo después de inducción; el eje y es OD600 y el eje y2 es productividad total de isopreno (ug/L de espacio superior o productividad específica (ug/L de espacio superior/OD)) . Los diamantes representan OD600, los círculos representan productividad de isopreno total ( g/L) y los cuadrados representan productividad específica de isopreno ^g/L/OD) .
La figura 23D es una gráfica que muestra la producción de isopreno a partir de glucosa en BL21/pTrcKudzu yIDI DXS kan. El tiempo 0 es el tiempo de inducción con IPTG (400 µt???) . El eje x es tiempo después de inducción; el eje y es OD600 y el eje y2 es productividad total de isopreno (ug/L de espacio superior o productividad especifica (ug/L de espacio superior/OD) ) . Los diamantes representan OD600, los círculos representan productividad de isopreno total (ug/L) y los cuadrados representan productividad específica de isopreno (ig/L/0O) .
La figura 23E es una gráfica que muestra la producción de isopreno a partir de glucosa en BL21/pCL PtrcKudzu. El tiempo 0 es el tiempo de inducción con IPTG (400 µ????) . El eje x es el tiempo después de la inducción; el eje y es OD600 y el eje y2 es productividad total de isopreno (ug/L de espacio superior o productividad específica (ug/L de espacio superior/OD)) . Los diamantes representan OD600, los círculos representan productividad de isopreno total ^g/L) y los cuadrados representan productividad específica de isopreno ^g/L/OD) .
La figura 23F es una gráfica que muestra la producción de isopreno a partir de glucosa en BL2l/pCL PtrcKudzu yIDI . El tiempo 0 es el tiempo de inducción con IPTG (400 µ????) . El eje x es el tiempo después de inducción; el eje y es OD600 y el eje y2 es productividad total de isopreno (ug/L de espacio superior o productividad específica (ug/L de espacio superiór/OD) . Los diamantes representan OD600, los círculos representan productividad de isopreno total (ug/L) y los cuadrados representan productividad específica de isopreno ^g/L/OD) .
La figura 23G es una gráfica que muestra la producción de isopreno a partir de glucosa en BL21/pCL PtrcKudzu DXS . El tiempo 0 es el tiempo de inducción con IPTG (400 µp???) . El eje x es el tiempo después de inducción; el eje y es OD600 y el eje y2 es productividad total de isopreno {]ig/l¡ de espacio superior o productividad- específica (ug/L de espacio superior/OD) . Los diamantes representan OD600, los círculos representan productividad de isopreno total ^g/L) y los cuadrados representan productividad específica de isopreno ^g/L/OD) .
La figura 23H es una gráfica que muestra la producción de isopreno a partir de glucosa en BL21/pTrcKudzuIDIDXSkan. La flecha indica el tiempo de inducción con IPTG (400 µ????) . El eje x es el tiempo después de inducción; el eje y es OD600 y el eje y2 es productividad total de isopreno (ug/L de espacio superior o productividad específica (ug/L de espacio superior/OD) . Los diamantes negros representan OD600, los triángulos negros representan productividad de isopreno ( g/L) y los cuadrados blancos representan productividad específica de isopreno ( g/L/OD) .
La figura 24 es un mapa de pTrcKKDyIkIS kan.
Las figuras 25A, 25B, 25C y 25D son una secuencia de nucleótidos de pTrcKKDylklS kan (SEQ ID NO: 33) .
La figura 26 es un mapa de pCL PtrcUpperPathway. Las figuras 27A, 27B, 27C y 27D son una secuencia de nucleótidos de pCL PtrcUpperPathway (SEQ ID NO: 46) .
La figura 28 muestra un mapa del c sete que contiene la vía de MVA inferior e idi de levadura para su integración en el cromosoma de B. subtilis en el locus nprE. nprE hacia el extremo 5 '/extremo 3' indica 1 kb cada uno de la secuencia de locus de nprE para integración. El promotor de aprE (promotor de serina proteasa alcalina) indica el promotor (sitio de inicio de transcripción -35, -10, +1, RBS) del gen aprE. MVK1 indica el gen de levadura mevalonato cinasa. RBS-PMK indica el gen de levadura fosfomevalonato cinasa con una RBS de Bacillus hacia el extremo 5' del sitio de inicio. RBS-MPD indica el gen de difosfomevalonato descarboxilasa de levadura con un RBS de Bacillus hacia el extremo 5' del sitio de inicio. RBS- IDI indica el gen idi de levadura con un RBS de Bacillus hacia el extremo 5' del sitio de inicio. El terminador indica el terminador de transcripción de serina proteasa alcalina terminadora a partir de B. amyliquefaciens. SpecR indica el marcador de resistencia a espectinomicina . "Repetición hacia el extremo 5' de nprE para amp" , indica una repetición directa de la región hacia el extremo 5' usada para amplificación.
Las figuras 29A, 29B, 29C y 29D son una secuencia de nucleótidos del cásete que contiene la vía de MVA inferior e idi de levadura para su integración en el cromosoma de 23. subtilis en el locus de nprE (SEQ ID NO: 47) .
La figura 30 es un mapa de p9796-álamo.
Las figuras 31A y 31B son una secuencia de nucleótidos de p9796-álamo (SEQ ID NO: 48) .
La figura 32 es un mapa de pTrcPoplar.
Las figuras 33A, 33B y 33C son una secuencia de nucleótidos de pTrcPoplar (SEQ ID NO: 49).
La figura 34 es un mapa de pTrcKudzu yIDI kan.
Las figuras 35A, 35B y 35C son una secuencia de nucleótidos de pTrcKudzu yIDI Kan (SEQ ID NO: 50) .
La figura 36 es un mapa de pTrcKudzuDXS Kan.
Las figuras 37A, 37B y 37C son una secuencia de nucleótidos de pTrcKudzuDXS Kan (SEQ ID NO: 51) .
La figura 38 es un mapa de pCL PtrcKudzu.
Las figuras 39A, 39B y 39C son una secuencia de nucleótidos de pCL PtrcKudzu (SEQ ID NO: 52) .
La figura 40 es un mapa de pCL PtrcKudzu A3.
Las figuras 41A, 4 IB y 41C son una secuencia de nucleótidos de pCL PtrcKudzu A3 (SEQ ID NO: 53) .
La figura 42 es un mapa de pCL PtrcKudzu yIDI .
Las figuras 43A, 43B y 43C son una secuencia de nucleótidos de pCL PtrcKudzu yIDI (SEQ ID NO: 54) .
La figura 44 es un mapa de pCL PtrcKudzu DXS .
Las figuras 45A, 45B, 45C y 45D es una secuencia de nucleótidos de pCL PtrcKudzu DXS (SEQ ID NO: 55) .
Las figuras 46A, 46B, 46C, 46D y 46E muestran gráficas que representan la producción de isopreno a partir de corrientes de alimentación de biomasa. La figura 46A muestra la producción de isopreno a partir de hojas y troncos de maíz, .La figura 46B muestra la producción de isopreno a partir de bagazo, La figura 46C muestra la producción de isopreno a partir de pulpa de madera blanda, La figura 46D muestra la producción de isopreno a partir de glucosa y La figura 46E muestra la producción de isopreno de células sin corriente de alimentación adicional. Los cuadrados grises representan mediciones OD600 de los cultivos en los tiempos indicados después de inoculación y los triángulos negros representan la producción de isopreno en los tiempos después de inoculación indicados.
La figura 47A muestra una gráfica que representa la producción de isopreno por bL21 ( DE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan) en un cultivo sin glucosa añadida. Los cuadrados representan OD600, y los triángulos representan isopreno producido ( g/ml) .
La figura 47B muestra una gráfica que representa la producción de isopreno a partir de 1% de azúcar invertido de corriente de alimentación de glucosa mediante BL21 (???3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan) . Los cuadrados representa OD600, y los triángulos representan el isopreno producido .
La figura 47C muestra una gráfica que representa la producción de isopreno a partir de 1% de corriente de alimentación de azúcar invertido por BL21 (???3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan) . Los cuadrados representan OD600, y los triángulos representan isopreno producido (]ig/ml) .
La figura 47D muestra una gráfica que representa la producción de isopreno a partir de 1% de corriente de alimentación de hojas y troncos de maíz AFEX por BL21 (???3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan) . Los cuadrados representan OD600, y los triángulos representan isopreno producido (ug/ml) .
Las figuras 48A, 48B y 48C muestran gráficas que demuestran el efecto de extracto de levadura en la producción de isopreno. La figura 48A muestra el curso de tiempo de densidad óptica dentro de termentadores alimentados con cantidades variables de extracto de levadura. La figura 48B muestra el curso de tiempo del título de isopreno dentro de termentadores alimentados con cantidades variables de extracto de levadura. El título se define como la cantidad de isopreno producida por litro de caldo de fermentación. La figura 48C muestra el efecto del extracto de levadura en la producción de isopreno en E. coli cultivadas en cultivo de alimentación intermitente.
Las figuras 49A, 49B y 49C muestran gráficas que demuestran la producción de isopreno a partir de un biorreactor de 500 L con células de E. coli que contienen el plásmido pTrcKudzu + yIDI + DXS . La figura 49A muestra el curso de tiempo de densidad óptica dentro del biorreactor de 500 L alimentado con glucosa y extracto de levadura. La figura 49B muestra el curso de tiempo del título de isopreno dentro del biorreactor de 500 L alimentado con extracto de glucosa y levadura. El título se define como la cantidad de isopreno producida por litro de caldo de fermentación. La figura 49C muestra el curso de tiempo de isopreno total producido a partir del biorreactor de 500 L alimentado con glucosa y extracto de levadura.
La figura 50 es un mapa de pJMupperpathway2.
Las figuras 51A, 51B y 51C son la secuencia de nucleótidos de pIMupperpathway2 (SEQ ID NO: 56) .
La figura 52 es un mapa de pBS Kudzu #2.
La figura 53A es una gráfica que muestra el tiempo de crecimiento durante fermentación de Bacillus que expresa isopreno sintasa de kudzu recombinante en fermentación de alimentación intermitente de 14 litros. Los diamantes negros representan una cepa de control (BG3594comK) sin isopreno sintasa recombinante (producción de isopreno nativa) y los triángulos grises representan Bacillus con pBSKudzu (producción de isopreno recombinante) .
La figura 53B es una gráfica que muestra la producción de isopreno durante el tiempo de fermentación de Bacillus que expresa Isopreno sintasa de kudzu recombinante en fermentación de alimentación intermitente de 14 litros. Los diamantes negros representan una cepa de control (BG3594comK) sin isopreno sintasa recombinante (producción de isopreno nativa) y los triángulos grises representan Bacillus con pBSKudzu (producción de isopreno recombinante) .
La figura 54 es un mapa del plásmido pET24 P.alba HGS .
Las figuras 55A y 55B son la secuencia de nucleótidos del plásmido pET24 P.alba HGS (SEQ ID NO: 87) .
La figura 56 es un diagrama esquemático que muestra sitios de restricción usados para la digestión con endonucleasa para construir el plásmido EWL230 y extremos cohesivos compatibles entre los sitios BspHI y Ncol.
La figura 57 es un mapa del plásmido E L230.
Las figuras 58A y 58B son la secuencia de nucleótidos del plásmido EWL230 (SEQ ID NO: 88) La figura 59 es un diagrama esquemático que muestra sitios de restricción usados para la digestión con endonucleasas para construir el plásmido E L244 y extremos cohesivos compatibles entre los sitios Nsil y PstI .
La figura 60 es un mapa de EWL244.
Las figuras 61A y 61B son la secuencia de nucleótidos del plásmido EWL244 (SEQ ID NO: 89) .
La figura 62 es un mapa de los plásmidos MCM484- ¦··¾ 487.
Las figuras 63A, 63B y 63C son la secuencia de nucleótidos del plásmido MCM484 (SEQ ID NO: 90) . 5 Las figuras 64A, 64B y 66C son la secuencia de nucleótidos del plásmido MCM485 (SEQ ID NO: 91) .
Las figuras 65A, 65B y 65C son la secuencia de nucleótidos del plásmido MCM486 (SEQ ID NO : 92) .
Las figuras 66A, 66B y 66C son la secuencia de 10 nucleótidos del plásmido MCM487 (SEQ ID NO : 93) .
Las figuras 67A, 67B, 67C y 67D son gráficas de la producción de isopreno por genes que expresan la cepa de E. coli (EWL256) de la vía de MVA y cultivados en cultivo de alimentación intermitente a la escala de 15 L sin 15 alimentación de extracto de levadura. La figura 67A muestra el curso de tiempo de densidad óptica dentro del biorreactor de 15 L alimentado con glucosa. La figura 67B muestra el curso de tiempo de título de isopreno dentro del biorreactor de 15 L alimentado con glucosa. El título se define como la 20 cantidad de isopreno producida por litro de caldo de fermentación. La ' figura 67C muestra el curso de tiempo de isopreno total producido a partir del biorreactor de 15 L alimentado con glucosa. La figura 67D muestra la velocidad de evolución de dióxido de carbono total (TCER) , o el perfil 25 de actividad metabólica, dentro del biorreactor de 15 L alimentado con glucosa.
Las figuras 68A, 68B, 68C, 68D y 68E son gráficas de la producción de isopreno por genes que expresan cepa de E. coli (E L256) a partir de la vía de MVA y cultivadas en cultivo de alimentación intermitente a la escala de 15 L con alimentación de extracto de levadura. La figura 68A muestra el curso de tiempo de densidad óptica dentro del biorreactor de 15 L alimentado con glucosa. La figura 68B muestra el curso de tiempo de título de isopreno dentro del biorreactor de 15 L alimentado con glucosa. El título se define como la cantidad de isopreno producida por litro de caldo de fermentación. La figura 68C muestra el curso de tiempo de isopreno total producido a partir del biorreactor de 15 L alimentado con glucosa. La figura 68D muestra la productividad volumétrica dentro del biorreactor de 15 L alimentado con glucosa. Un valor promedio de 1.1 g/L/hr se mantuvo durante un periodo de 40 horas (23-63 horas) con alimentación de extracto de levadura. La figura 68E muestra la velocidad de evolución de dióxido de carbono (CER) , o perfil de actividad metabólica, dentro del biorreactor de 15 L alimentado con glucosa.
Las figuras 69A, 69B, 69C y 69D muestran la producción de isopreno a partir de diferentes fuentes de carbono por la MVA (vía) . La figura 69A muestra el crecimiento de EWL256 de E. coli, el cual contiene tanto la vía de MVA como isopreno sintasa, ya sea en glucosa, hidrolizado de biomasa, glicerol o acetato como la única fuente de carbono. Las diferentes fuentes de carbono fueron añadidas a una concentración de 1% en los medios. Un control negativo sin fuente de carbono añadida fue incluido. El crecimiento se midió como densidad óptica a 600 nM. La figura 69B muestra la productividad específica de isopreno a partir de EWL256 de E. coli que contiene tanto la vía de MVA como la isopreno sintasa cuando se cultiva ya sea en glucosa, hidrolizado de biomasa, glicerol o acetato como única fuente de carbono. Las diferentes fuentes de carbono fueron añadidas hasta una concentración de 1% en el medio. Un control negativo sin fuente de carbono añadida fue incluido. Las muestras se tomaron 190 minutos, 255 minutos y 317 minutos después de la inoculación el isopreno producido por las bacterias se midió usando GC-MS. La figura 69C muestra el crecimiento de E. coli EWL256 ya sea en glucosa o xilosa como la única fuente de carbono. Las diferentes fuentes de carbono fueron añadidas hasta una concentración de 1% en el medio. Un control negativo sin fuente de carbono añadida fue incluido. El crecimiento se midió como densidad óptica a 600 nM. La figura 69D muestra la productividad específica de isopreno a partir de E. coli EWL256 cuando se cultiva ya sea en glucosa o xilosa como única fuente de carbono. Las fuentes de carbono son añadidas hasta una concentración de 1% en el medio. Un control negativo sin fuente de carbono añadida fue incluido. Se tomaron muestras 260 minutos, 322 minutos y 383 minutos después de la inoculación y el isopreno producido por las bacterias se midió usando GC-MS.
Las figuras 70A y 70B muestran la producción de isopreno por cepas de E. coli a partir de glucosa y a partir de ácido graso, respectivamente. Para la figura 70A, once colonias de la transformación de W 4 con pMCM118, el plásmido que porta la vía de ácido mevalónico interior, se recogieron para verificar la presencia de la vía inferior. Células de las colonias fueron cultivadas en medio TM3 que contenía 0.1% de extracto de levadura y 2% de glucosa. Alícuotas de cultivo inducido fueron ensayadas para producción de isopreno después de 4 horas de inducción. Todas las colonias mostraron la producción de isopreno. El inductor IPTG tuvo un fuerte efecto inhibidor como fue evidente a partir de la densidad celular reducida de 3 a 4.6 veces en ir de una concentración de 50 a 900 uM del inductor (datos no mostrados) . La gráfica muestra que una inducción más alta, produce un título específico más alto de isopreno. Para la figura 70B, el cultivo de producción fue inoculado a partir de un cultivo nocturno lavado a una dilución de 1 a 10. El cultivo se llevó a cabo durante varias horas y se indujo con 50 µ? de IPTG. La barra izquierda muestra los resultados del ensayo de isopreno cuatro horas después de la inducción seguida por un ensayo de acumulación de isopreno de 1 hora. La barra media muestra el valor normalizado a una hora para el mismo cultivo con el mismo periodo de inducción pero "analizado por - un ensayo de acum^tación de isopreno a 12 horas. La barra derecha muestra el valor para un ensayo de acumulación de isopreno a una hora del cultivo que se indujo durante 13 horas .
La figura 71 es un mapa del vector promiscuo de E. coli-Streptomyces pUWL201PW (6400 pb) usado para clonar isopreno sintasa a partir de Kudzu. Tsr, gen de resistencia a tiostrepton. La imagen se toma de Doumith et al., Mol. Gen. Genet. 264:477-485,2000.
La figura 72 muestra la formación de isopreno por Streptomyces albus cepa tipo silvestre ( "wt" ) y cepas que portan el plásmido pUWL201PW (control negativo) o pUWL201_iso (que codifica para isopreno sintasa de Kudzu) .
La figura 73A es un mapa del operón de la vía inferior de M. mazei .
Las figuras 73B y 73C son la secuencia de nucleótidos del operón de la vía inferior de M. mazei archaeal (SEQ ID NO: 113) .
La figura 74A es un mapa de MCM376 -MVK del M. mazei archaeal Lowerin pET200D.
Las figuras 74B y 74C son la secuencia de nucleótidos de MCM376-MVK de M. mazei archaeal Lowerin pET200D (SEQ ID NO: 114) .
Las figuras 75A, 75B, 75C y 75D muestran el crecimiento y productividad específica de la producción de isopreno para EWL256 en comparación con RM11608-2. El crecimiento (OD550) es representado por los diamantes blancos; la productividad específica de isopreno se representa por las barras sólidas. El eje x es tiempo (horas) después de inducción ya sea con 200 (figuras 75A y 75B) o 400 (figuras 75C y 75D) uM IPTG. El eje y-1 es la productividad de isopreno (ug/L/OD/hr) y y-2 es unidades arbitrarias de densidad óptica a una longitud de onda de 550. Estos valores para la OD550 deben multiplicarse por 6.66 para obtener la OD real del cultivo.
La figura 76 es un mapa del plásmido pBBRCMPGIl .5-pgr.
Las figuras 77A y 77B son la secuencia de nucleótidos del plásmido pBBRCMPGIl .5-pgl (SEQ ID NO: 122).
Las figuras 78A, 78B, 78C, 78D, 78E y 78F son gráficas de la producción de isopreno por una cepa de E. coli que expresa mevalonato cinasa de M. mazei, isopreno sintasa de P. alba y pgl (RHM111608-2) , y cultivadas en cultivo de alimentación intermitente a la escala de 15 L. La figura 78A muestra el curso de tiempo de densidad óptica dentro del biorreactor de 15 L alimentado con glucosa. La figura 78B muestra el curso de tiempo del título de isopreno dentro del biorreactor de 15 L alimentado con glucosa. El título se define como la cantidad de isopreno producida por litro de caldo de fermentación. Método para calcular isopreno: Isopreno acumulativo producido a 59 horas, g/volumen de fermentador a 59 horas, L[=]g/L de caldo. La figura 78C muestra el curso de tiempo de título de isopreno dentro del biorreactor de 15 L alimentado con glucosa. Método para calcular isopreno: {(velocidad de producción de isopreno instantánea, g/L/hr)dt a partir t = 0 a 59 horas [=] g/L de caldo. La figura 78D muestra el curso de tiempo de isopreno total producido a partir del biorreactor de 15 L alimentado con glucosa. La figura 78E muestra la productividad volumétrica dentro del biorreactor de 15 L alimentado con glucosa. La figura 78F muestra la velocidad de evolución de dióxido de carbono (CER) , o perfil de actividad metabólica, dentro del biorreactor de 15 L alimentado con glucosa.
La figura 79A es un mapa del plásmido pJ201: 19813. La figura 79B y 79C son la secuencia de nucleótidos de pJ201:19813 (SEQ ID NO: 123).
La figura 80 muestra el curso de tiempo de densidad óptica dentro del biorreactor de 15 L alimentado con glucosa.
La figura 81 muestra el curso de tiempo de título de isopreno dentro del biorreactor de 15 L alimentado con glucosa. El título se define como la cantidad de isopreno producida por litro de caldo de fermentación.
La figura 82 muestra el curso de tiempo de isopreno total producido a partir del biorreactor de 15 L alimentado con glucosa.
La figura 83 es una gráfica que muestra el curso de tiempo de densidad óptica dentro del biorreactor de 500 L alimentado con glucosa y extracto de levadura.
La figura 84 es una gráfica que ilustra el curso de tiempo de título de isopreno dentro del biorreactor de 500 L alimentado con glucosa y extracto de levadura. El título se define como la cantidad de isopreno producida por litro de caldo de fermentación.
La figura 85 es una gráfica que ilustra el curso de tiempo de isopreno total producido a partir del biorreactor de 500 L alimentado con glucosa y extracto de levadura.
Descripción detallada de la invención Una técnica para producir isopreno en un cultivo de células que producen isopreno se describe en la patente de Estados Unidos provisional No. de Serie 61/013,574, presentada el 13 de diciembre de 2007, y en la patente de Estados Unidos provisional No. de serie 61/013,386, presentada el 13 de diciembre de 2007 y en la solicitud patente de Estados Unidos No. de serie 12/335,071. Las enseñanzas de la solicitud de patente provisional de Estados Unidos No. de serie 61/013,574, la solicitud de patente provisional de Estados Unidos No. de serie 61/013,386 y la solicitud de patente de Estados Unidos No. de serie 12/335,071 se incorporan en la presente a manera de referencia con el propósito de enseñar técnicas para producir y recuperar isopreno mediante ese procedimiento. En cualquier caso, las solicitud de patente provisional de Estados Unidos No. de serie 61/013,574, solicitud de patente provisional de Estados Unidos No. de serie 61/013,386 y la solicitud de patente de Estados Unidos No. de serie 12/335,071 enseñan composiciones y métodos para la producción de cantidades incrementadas de isopreno en cultivos de células. En particular, estas composiciones y métodos incrementan la velocidad de producción de isopreno e incrementan la cantidad total de isopreno que se produce. Por ejemplo, sistemas de cultivo de células que generan 4.8 x 104 nmoles/gwcm/hr de isopreno han sido producidos (tabla 1) . La eficiencia de estos sistemas es demostrada por la conversión de alrededor de un rendimiento de -23.6% molar (rendimiento de 10.7% en peso) del carbono que las células consumen a partir de un medio de cultivo de células en isopreno (% de rendimiento de carbono) . Como se muestra en los ejemplos y tabla 2, aproximadamente 60.5 g de isopreno por litro de caldo se generaron. Se produjo isopreno a una velocidad específica máxima de 1.88 x 105 nmoles/OD/hr (1.88 x 105 nmoles/gwcm/hr) . Si se desea, cantidades todavía mayores de isopreno pueden obtenerse usando otras condiciones, tales ·· como aquellas descritas en la presente. En algunas modalidades, se usa una fuente de carbono renovable para la producción de isopreno. Las composiciones y métodos de la presente invención son deseables toda vez que permiten alto rendimiento de isopreno por célula, alto rendimiento de carbono, alta pureza de isopreno, alta productividad, bajo uso de energía, bajos costos de producción e inversión y reacciones secundarias mínimas. El proceso biosintético eficiente y a gran escala para la producción de isopreno proporciona una fuente de isopreno para caucho a base de isopreno sintético y proporciona una alternativa deseable y de bajo costo para usar caucho natural .
Como se describe más abajo, la cantidad de isopreno producida por células puede ser ampliamente incrementada al introducir un ácido nucleico heterólogo que codifique para un polipéptido de isopreno sintasa (por ejemplo, un polipéptido de isopreno sintasa vegetal) en las células. Los polipéptidos de isopreno sintasa convierten difosfato de dimetilalilo (DMAPP) en isopreno. Como se muestra en los ejemplos, un polipéptido de isopreno sintasa de Pueraria Montana heterólogo (kudzu) o Populus alba (Álamo) fue expresado en una variedad de células hospederas, tales como Escherichia coli, Panteoa citrea, Bacillus subtilis, Yarrowia lipolytica y Trichoderma reesei . Como también se muestra en los ejemplos, una mevalonato cinasa (MVK) de Methanosarcina mazei (M. mazei) heteróloga se expresó en células hospederas tales como Escherichia coli para incrementar la producción de isopreno. Todas estas células produjeron más isopreno que las células correspondientes sin un polipéptido de isopreno sintasa heterologo. Como se ilustra en las tablas 1 y 2, grandes cantidades de isopreno se producen usando los métodos descritos en la presente. Por ejemplo, células de B. subtilis con un ácido nucleico de isopreno sintasa heterologo produjeron aproximadamente 10 veces más isopreno en un fermentador de 14 litros que las células de B. subtilis de control correspondientes sin el ácido nucleico heterologo (tabla 2) . La producción de 60.5 g de isopreno por litro de caldo (Mg/L, en donde el volumen de caldo incluye tanto el volumen del medio de células como el volumen de las células) por E. coli y 30 mg/1 por B. subtilis en termentadores indica que cantidades significativas de isopreno pueden generarse (tabla 2). Si se desea, puede producirse isopreno en una escala todavía mayor u otras condiciones descritas en la presente pueden usarse para incrementar más la cantidad de isopreno. Los vectores listados en las tablas 1 y 2 y las condiciones experimentales se describen en mayor detalle abajo y en la sección de ejemplos.
Tabla 1 Rendimientos ejemplares de isopreno a partir de un matraz de cultivo usando los cultivos de células y métodos de la invención El ensayo para medir la producción de isopreno se describe en el ejemplo 1, parte II. Para este ensayo, se retiró una muestra en uno o más puntos de tiempo del matraz de cultivo y se cultivó durante 30 minutos. La cantidad de isopreno producida en esta muestra se emitió después. La concentración de espacio superior y la velocidad específica de la producción de isopreno se listan en la tabla 1 y se describen más en la presente.
*Normalizado a 1 mL de 1 OD60o, cultivado durante 1 hora en un frasco de espacio superior sellado con una relación de volumen de líquido a espacio superior de 1:19.
Tabla 2 Rendimientos ejemplares de isopreno en un fermentador usando los cultivos de células y métodos de la invención El ensayo para medir la producción de isopreno se describe en el ejemplo 1, parte II. Para este ensayo, una muestra del gas de evolución del fermentador de tomó y se analizó para la cantidad de isopreno. La concentración en espacio superior máxima (que es la concentración de espacio superior más alta durante la fermentación) , título (el cual es la cantidad total acumulativa de isopreno producida por litro de caldo) y velocidad específica máxima de producción de isopreno (que es la velocidad específica más alta durante la fermentación) se listan en la tabla 2 y se describen más en la presente .
E . col i /MCM127 1094 250 875 con Kudzu IS y (1.28 x 104) vía de MVA completa Bacillus subtilis 1.5 2.5 0.8 tipo silvestre (11.7) Bacillus pBS 16.6 -30 5 kudzu IS (durante 100 (73.4) horas) Bacillus Marburg 2.04 0.61 24.5 6051 [Wagner and (359.8) Fall (1999)] Bacillus Marburg 0.7 0.15 6.8 6051 Fall US (100) 5849970 E. col i 2.03 X 10" 3.22 x 104 5.9 X 103 BL21/pCLPtrcUpper (8.66 x 104) Vía y gil .2KKDyI y pTrcAlba-mMV E. col i 3.22 X 10" 6.05 x 104 1.28 X 10" BL21/pCLPtrcUpper (1.88 x 105) Vía y gil.2KKDyI y pTrcAlba-mMVK más pBBRCMPGIl .5pgl **Normalizado a una velocidad de flujo de gas de evolución de 1 wm (1 volumen de gas de evolución por 1 Lcaido por minuto) .
Además, la producción de isopreno por células que contienen un ácido nucleico de isopreno sintasa heterólogo puede incrementarse al aumentar la cantidad de un polipéptido de l-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato sintasa (DXS) y/o un polipéptido de isopentenil difosfato isomerasa (IDI) expresado por las células. Por ejemplo, un ácido nucleico de DXS y/o un ácido nucleico de IDI puede introducirse en las células. El ácido nucleico de DXS puede ser un ácido nucleico heterólogo o una copia duplicada de un ácido nucleico endógeno. Similarmente , el ácido nucleico de IDI puede ser un ácido nucleico heterólogo o una copia duplicada de un ácido nucleico endógeno. En algunas modalidades, la cantidad de polipéptido de DXS y/o IDI se incrementa al reemplazar los promotores de DXS y/o IDI endógenos o regiones reguladoras con otros promotores y/o regiones reguladoras que den como resultado una mayor transcripción de los ácidos nucleicos de DXS y/o IDI. En algunas modalidades, las células contienen tanto un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de isopreno sintasa (por ejemplo, un ácido nucleico de isopreno sintasa vegetal) como una copia duplicada de un ácido nucleico endógeno que codifica para un polipéptido de isopreno sintasa.
Los polipéptidos de DXS e IDI codificados son parte de la vía DXP para la biosíntesis de isopreno (figura 19A) . Los polipéptidos de DXS convierten piruvato y D-gliceraldehído-3-fosfato en l-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato . Aunque no se intenta ser limitados por ninguna teoría particular, se cree que incrementar la cantidad de polipéptido de DXS incrementa el flujo de carbono a través de la vía de DXP, llevando a una mayor producción de isopreno. Los polipéptidos de IDI catalizan la interconversión de fosfato de isopentenilo (IPP) y difosfato de dimetilalilo (DMAPP) . Aunque no se desea ser limitados por ninguna teoría particular, se cree que incrementar la cantidad de polipéptido IDI en células incrementa la cantidad de IPP que se convierte en DMAPP, el cual a su vez se convierte en isopreno.
Por ejemplo, la fermentación de células de E. coli con ácidos nucleicos de una isopreno sintasa de kudzu, IDI de S. cerevisia y DXS de E. coli se usó para producir isopreno. Los niveles de isopreno variaron de 50 a 300 ug/L durante un periodo de tiempo de 15 horas (ejemplo 7, parte VII). Como otro ejemplo, la fermentación de E. coli sin mevalonato cinasa de M. mazei (MVK) , isopreno sintasa de P. alba, la vía de MVA superior y la vía de MVA inferior integrada se usó para producir isopreno. Los niveles de isopreno variaron de 32 a 35.6 g/L durante un periodo de tiempo de 67 horas (ejemplo 10, parte III) .
En otro ejemplo más, la fermentación de E. coli con mevalonato cinasa de M. mazei (MVK) , isopreno sintasa de P. alia, sobre-expresión en pgl (RHM111608-2) , la vía de MVA superior y la vía de MVA inferior integrada se usaron para producir isopreno. Los niveles de isopreno varían de 33.2 g/L a 40.0 g/L durante un periodo de tiempo de 40 horas o 48.6 g/L a 60.5 g/L durante un periodo de tiempo de 59 horas (ejemplo 13, parte (ii)) .
En algunas modalidades, la presencia de ácidos nucleicos de isopreno sintasa, IDI y DXS heterólogos o endógenos extra causa que las células crezcan más reproduciblemente o permanezcan viables durante más tiempo en comparación con la célula correspondiente sólo con uno o dos de estos ácidos nucleicos heterologos o endógenos extra. Por ejemplo, las células que contienen ácidos nucleicos de isopreno sintasa, IDI y DXS heterologos crecieron mejor que las células sólo con ácidos nucleicos de isopreno sintasa y DXS heterologos o sólo con un ácido nucleico de isopreno sintasa heterólogo. Asimismo, los ácidos nucleicos de isopreno sintasa, IDI y DXS heterologos se enlazaron operablemente en forma exitosa a un promotor fuerte en un plásmido de alta copia que se mantuvo por células de E. coli, sugiriendo que grandes cantidades de esos polipéptidos podrían ser expresadas en las células sin causar una cantidad excesiva de toxicidad para las células. Aunque no se desea ser limitados a ninguna teoría particular, se cree que la presencia de ácidos nucleicos de isopreno sintasa e IDI heterologos o endógenos extra puede reducir la cantidad de uno o más intermediarios potencialmente tóxicos que de otra manera podrían acumularse si sólo un ácido nucleico de DXS heterólogo o extra endógeno estuviera presente en las células .
En algunas modalidades, la producción de isopreno por células que contienen un ácido nucleico de isopreno sintasa heterólogo es incrementada al aumentar la cantidad de polipéptido MVA expresada por las células (figura 19A y 19B) . Polipéptidos de vías MVA ejemplares incluyen cualquiera de los siguientes polipéptidos: polipéptidos de acetil-CoA acetiltransferasa (AA-CoA tiolasa) , polipéptidos de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA sintasa (HMG-CoA sintasa) , polipéptidos de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa (HMG-CoA reductasa) , polipéptidos de mevalonato cinasa (MVK) , polipéptidos de fosfomevalonato cinasa (PMK) , polipéptidos de difosfomevalonato descarboxilasa (MVD) , polipéptidos de fosfomevalonato descarboxilasa (PMDC) , polipéptidos de isopentenil fosfato cinasa (IPK) , polipéptidos de IDI y polipéptidos (por ejemplo, polipéptidos de fusión) que tengan una actividad de dos o más polipéptidos de la vía de MVA. Por ejemplo, uno o más ácidos nucleicos de la vía de MVA pueden ser introducidos en las células . En algunas modalidades, las células contienen la vía de MVA superior, la cual incluye ácidos nucleicos de AA-CoA tiolasa, HMG-CoA sintasa y HMG-CoA reductasa. En algunas modalidades, las células contienen la vía de MVA inferior, la cual incluye ácidos nucleicos de MVK, PMK, MVD e IDI. En algunas modalidades, las células contienen la vía de MVA completa, la cual incluye ácidos nucleicos de AA-CoA tiolasa, HMG-CoA sintasa, HMG-CoA reductasa, MVK, PMK, MVD e IDI. En algunas modalidades, las células contienen una vía de MVA completa que incluye ácidos nucleicos de AA-CoA tiolaasa, HMG-CoA sintasa, HMG-CoA reductasa, MVK, PMDC, IPK e IDI. Los ácidos nucleicos de la vía de MVA pueden ser ácidos nucleicos heterólogos o copias duplicadas de ácidos nucleicos endógenos. En algunas modalidades, la cantidad de uno o más polipéptidos de la vía de MVA se incrementa al reemplazar los promotores endógenos o regiones reguladoras para los ácidos nucleicos de la vía de MVA con otros promotores y/o regiones reguladoras que se traducen en mayor transcripción de los ácidos nucleicos de la vía de MVA. En algunas modalidades, las células contienen tanto un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de isopreno sintasa (por ejemplo, un ácido nucleico de isopreno sintasa vegetal) como una copia duplicada de un ácido nucleico endógeno que codifica para un polipéptido de isopreno sintasa.
Por ejemplo, células de E. coli que contienen un ácido nucleico que codifica para un polipéptido de isopreno sintasa de kudzu y ácidos nucleicos que codifican para Saccharomyces cerevisia polipéptidos MVK, PMK, MVD e IDI generaron isopreno a una velocidad de 6.67 x 104 nmoles/Lcaido/OD6oo/hr (véase ejemplo 8). Además, una fermentación de 14 litros de células de E. coli con ácidos nucleicos que . codifican para polipéptidos de AA-CoA tiolasa, HMG-CoA sintasa y HMG-CoA reductasa de Enterococcus faecalis produjo 22 gramos de ácido mevalónico (un intermediario de la vía de MVA) . Un matraz de agitación de estas células produjo 2-4 gramos de ácido mevalónico por litro. Estos resultados indican que los ácidos nucleicos de las vías de MVA heterólogos son activados en E. coli. Células de E. coli que contienen ácidos nucleicos tanto para la vía de MVA superior como para la vía de MVA inferior así como isopreno sintasa de kudzu (cepa MCM 127) produjeron significativamente más isopreno (874 g/Lcaido/hr/OD) en comparación con células de B. coli con ácidos nucleicos sólo para la vía de MVA inferior y la isopreno sintasa de kudzu (cepa MCM 131) (véase tabla 3 en polipéptido de isopreno sintasa y un ácido nucleico que codifica para polipéptido de MVK de M. mazei generó 320.6 g (a una velocidad específica máxima de 9.54 x 104 nmoles/Lcaido/OD6oo/hr (es decir, 9.5 x 10"5 moles/Lcaid0/OD6oo/hr) ) de isopreno durante una fermentación de 67 horas en ausencia de alimentación de extracto de levadura o 395.5 g (a una velocidad específica máxima de 8.66 x 104 nmoles/Lcaid0/OD6oo/hr) durante una fermentación de 68 horas en presencia de alimentación de extracto de levadura (véase ejemplo 10) .
En algunas modalidades, por lo menos una porción de las células mantienen el ácido nucleico de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI y/o MVA heterólogo durante al menos aproximadamente 5, 10, 20, 50, 75, 100, 200, 300, o más divisiones celulares en un cultivo continuo (tal como un cultivo continuo sin dilución) . En algunas modalidades de cualquiera de los aspectos de la invención, el ácido nucleico que comprende la copia heteróloga o duplicada de un ácido nucleico de la vía de MVA y/o DXS, IDI o isopreno sintasa endógeno también comprende un marcador selectivo, tal como ácido nucleico de resistencia a antibióticos de canamicina, ampicilina, carbenicilina, gentamicina, higromicina, fleomicina, bleomicina, neomicina o cloranfenicol .
Como se indica en el ejemplo 7, parte VI, la cantidad de isopreno producida puede incrementarse más al añadir extracto de levadura al medio de cultivo de células usando células de E. coli con isopreno sintasa de kudzu, IDI de S. cerevisiae y ácidos nucleicos DXS de E. coli para producir isopreno. En particular, la cantidad de isopreno producida fue linealmente proporcional a la cantidad de extracto de levadura en el medio de células para las concentraciones probadas (figura 48C) . Además, alrededor de 0.11 gramos de isopreno por litro de caldo se produjeron a partir de un medio de células con extracto de levadura y glucosa (ejemplo 7, parte VIII) . Incrementar la cantidad de extracto de levadura en presencia de glucosa se tradujo en mayor producción de isopreno que incrementar la cantidad de glucosa en presencia de extracto de levadura. Asimismo, incrementar la cantidad de extracto de levadura permitió a las células producir un alto nivel de isopreno durante una longitud de tiempo más larga y mejorar la salud de las células .
La producción de isopreno se demostró también usando tres tipos de biomasa hidrolizada (bagazo, hojas y troncos de maíz y pulpa de madera blanda) como la fuente de carbono (figuras 46A-C y figuras 69A y 69B) . Células de E. coli con ácidos nucleicos de isopreno sintasa de kudzu, IDI de S. cerevisiae y DXS de E. coli produjeron tanto isopreno a partir de estas fuentes de carbono de biomasa hidrolizada como la cantidad de equivalente de glucosa (por ejemplo, 1% de glucosa, p/v) . Células de E. coli que expresaban isopreno sintasa de P. alba y la vía de MVA produjeron isopreno a una velocidad de crecimiento inicial más alta a partir de hojas y troncos de maíz pretratados con expansión de fibra de amoniaco (AFEX) a partir de la cantidad equivalente de glucosa. (Figuras 69A y 69B) . Si se desea, cualquier otra fuente de carbono de biomasa se puede usar en las composiciones y métodos de la invención. Las fuentes de carbono de biomasa son deseables toda vez que son más baratas que muchos medios de células convencionales, facilitando así la producción económica de isopreno.
Además, el azúcar invertido mostró funcionar como una fuente de carbono para la generación de isopreno (figura 47D) .
Además, xilosa, acetato y glicerol también mostraron funcionar como una fuente de carbono para la generación de isopreno (figura 69A-69D) . Por ejemplo, células de E. coli con isopreno sintasa de P. al¿a y la vía de MVA cultivadas en acetato como la única fuente de carbono tuvieron una productividad específica de isopreno aproximadamente el doble de alto que durante el crecimiento en glucosa (ejemplo 10, parte IV; figuras 69A y 69B) .
En algunas modalidades, se incluye un aceite en el medio de células. Por ejemplo, células de B. subtilis que contienen un ácido nucleico de isopreno sintasa de kudzu produjeron isopreno cuando se cultivaron en un medio de células que contenía un aceite y una fuente de glucosa (ejemplo 4, parte III) . Como otro ejemplo, células mutantes fadR atoC de E. coli que contenían las vías MVA superior e inferior más isopreno sintasa de kudzu produjeron isopreno cuando se cultivaron en un medio de células que contenía aceite de palma y una fuente de glucosa (ejemplo 12, parte II) . En algunas modalidades, más de un aceite (tal como 2, 3, 4, 5 ó más aceites) se incluyen en medio de células. Aunque no se intenta ser limitados a ninguna teoría particular, se cree que (i) el aceite puede incrementar la cantidad de carbono en las células que esté disponible para su conversión en isopreno, (ii) el aceite puede incrementar la cantidad de acetil-CoA en las células, incrementando así el flujo de carbono a través de la vía de MVA, y/o (ii) el aceite puede proporcionar nutrientes adicionales a las células, lo cual es deseable toda vez que gran parte del carbono en las células es convertido en isopreno más que otros productos. En algunas modalidades, las células que se cultivan en un medio de células que .. contiene aceite usan naturalmente la vía de MVA para producir isopreno o son genéticamente modificadas para contener ácidos nucleicos para la vía de MVA completa. En algunas modalidades, el aceite es parcial o completamente hidrolizado antes de ser añadido al medio de cultivo de células para facilitar el uso del aceite por las células hospederas.
Polipéptidos y ácidos nucleicos ejemplares Varios polipéptidos y ácidos nucleicos de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI y/o MVA pueden ser usados en las composiciones y métodos de la invención.
Según se usa en la presente, "polipéptidos" incluye polipéptidos, proteínas, péptidos, fragmentos de polipéptidos y polipéptidos de , fusión que incluyen parte o todo de un primer polipéptido (por ejemplo, un polipéptido de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI o MVA) y parte o todo de un segundo polipéptido (por ejemplo, un péptido que facilita la purificación o detección del polipéptido de fusión, tal como un marcador His) . En algunas modalidades, el polipéptido de fusión tiene una actividad de dos o más polipéptidos de la vía de MVA (tales como polipéptidos de AA-CoA tiolasa y HMG-CoA reductasa) . En algunas modalidades, el polipéptido es un polipéptido de origen natural (tal como el polipéptido codificado por un ácido nucleico mvaE de Enterococcus faecalis) que tiene una actividad de dos o más polipéptidos de la vía de MVA.
En varias modalidades, un polipéptido tiene por lo menos o aproximadamente 50, 100, 150, 175, 200, 250, 300, 350, 400, o más aminoácidos. En algunas modalidades, el fragmento de polipéptido contiene al menos o alrededor de 25, 50, 75, 100, 150, 200, 300 o más aminoácidos contiguos a partir de un polipéptido de longitud completa y tiene por lo menos o aproximadamente 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o 100% de una actividad de un polipéptido de longitud completa correspondiente. En modalidades particulares, el polipéptido incluye un segmento de o la secuencia de aminoácidos completa de un polipéptido de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI o MVA de origen natural. En algunas modalidades, el polipéptido tiene una o más mutaciones en comparación con la secuencia de un polipéptido de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI o MVA tipo silvestre (es decir, una secuencia de origen natural) .
En algunas modalidades, el polipéptido es un polipéptido aislado. Según se usa en la presente, un "polipéptido aislado" no es parte de una biblioteca de polipéptidos, tal como una biblioteca de 2 , 5, 10, 20, 50 o más polipéptidos diferentes y se separa de al menos un componente con el que ocurre en la naturaleza. Un polipéptido aislado puede ser obtenido, por ejemplo, mediante expresión de un ácido nucleico recombinante que codifique para el polipéptido.
En algunas modalidades, el polipéptido es un polipéptido heterólogo. Por "polipéptido heterólogo" se intenta decir un polipéptido cuya secuencia de aminoácidos no es idéntica a aquella de otro polipéptido expresado naturalmente en la misma célula hospedera.
Según se usa en la presente, un "ácido nucleico" se refiere a dos o más desoxirribonucleótidos y/o ribonucleótidos ya sea en forma de una sola o de doble cadena. En algunas modalidades, el ácido nucleico es un ácido nucleico recombinante. Por "ácido nucleico recombinante" significa un ácido nucleico de interés que está libre de uno o más ácidos nucleicos (por ejemplo, genes) los cuales, en el genoma de origen natural del organismo del cual se deriva el ácido nucleico de interés, flanquean al ácido nucleico de interés. El término incluye por lo tanto, por ejemplo, un ADN recombinante que es incorporado en un vector, en un plásmido o virus de replicación autónoma o en el ADN genómico de un procariota o eucariota, o el cual existe como una molécula separada (por ejemplo, un ADNc, un fragmento de ADN genómico o un fragmento de ADNc producido por PCR o digestión con endonucleasa de restricción) independientemente de las demás secuencias. En algunas modalidades, un ácido nucleico de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI o MVA es enlazado operablemente a otro ácido nucleico que codifica para toda o una porción de otro polipéptido de tal manera que el ácido nucleico recombinante codifique para un polipéptido de fusión que incluya un polipéptido de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI o MVA y todo o parte de otro polipéptido (por ejemplo, un péptido que facilite la purificación o detección del polipéptido de fusión, tal como un marcador His) . En algunas modalidades, parte o todo de un ácido nucleico recombinante se sintetiza químicamente.
En algunas modalidades, el ácido nucleico es un ácido nucleico heterólogo. Por "ácido nucleico heterólogo" se intenta decir un ácido nucleico cuya secuencia de ácido nucleico no es idéntica a aquella de otro ácido nucleico que se encuentra naturalmente en la misma célula hospedera. En modalidades particulares, el ácido nucleico incluye un segmento de o la secuencia de ácido nucleico completa de cualquier ácido nucleico de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI o MVA de origen natural. En algunas modalidades, el ácido nucleico incluye por lo menos o aproximadamente 50, 100, 150, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, o más nucleótidos contiguos de cualquiera de un ácido nucleico de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI o MVA de origen natural. En algunas modalidades, el ácido nucleico tiene una o más mutaciones en comparación con la secuencia de un ácido nucleico de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI o MVA tipo silvestre (es decir, una secuencia de origen natural) . En algunas modalidades, . el ..ácido nucleico tiene una o más mutaciones (por ejemplo, una mutación silenciosa) que incrementan la transcripción o traducción del ácido nucleico de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI o MVA. En algunas modalidades, el ácido nucleico es una variante degenerada de cualquier ácido nucleico que codifica para un polipéptido de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI o MVA.
"Degeneración de codones" se refiere a la divergencia en el código genético que permite la variación de la secuencia de nucleótidos sin afectar la secuencia de aminoácidos de un polipéptido codificado. La persona capacitada está consciente de la "polarización de codones" exhibida por una célula hospedera específica en uso de codones de nucleótidos para especificar un aminoácido dado. Por lo tanto, cuando se sintetiza un ácido nucleico para expresión mejorada en una célula hospedera, es deseable en algunas modalidades diseñar el ácido nucleico de tal manera que su frecuencia de uso de codones se acerque a la frecuencia del uso de codones preferida de la célula hospedera .
Los números de registro de los polipéptidos y ácidos nucleicos de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI y/o MVA ejemplares se listan en el Apéndice 1 (los números de registro del Apéndice 1 y sus secuencias correspondientes se incorporan en la presente a manera de referencia en sus totalidades, particularmente con respecto a las secuencias de aminoácidos y ácido nucleico de los polipéptidos y ácidos nucleicos de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI y/o MVA) . La base de datos Kegg contiene también las secuencias de aminoácidos y ácido nucleico de numerosos polipéptidos y ácidos nucleicos de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI y/o MVA ejemplares (véase, por ejemplo, el sitio de red en "genome.jp/kegg/pathway/map/map00100.html" y las secuencias ahí, las cuales se incorporan cada una en la presente a manera de referencia en sus totalidades, particularmente con respecto a las secuencias de aminoácidos y ácidos nucleicos de polipéptidos y ácidos nucleicos de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI y/o MVA) . En algunas modalidades, uno o más de los polipéptidos y ácidos nucleicos de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI y/o MVA tienen una secuencia idéntica a una secuencia disponible públicamente el 12 de diciembre de 2007 u 11 de diciembre de 2008, tales como cualquiera de las secuencias que corresponden a cualquiera de los números de registro den el Apéndice 1 o cualquiera de las secuencias presentes en la base de datos Kegg. Polipéptidos y ácidos nucleicos de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI y/o MVA ejemplares adicionales se describen más abajo.
Polipéptidos y ácidos nucleicos de isopreno sintasa ejemplares ... . ..
Como se indicó arriba, los polipéptidos de isopren sintasa convierten fosfato de dimetilalilo (DMAPP) en isopreno. Los polipéptidos de isopreno sintasa ejemplares incluyen polipéptidos, fragmentos de polipéptidos, péptidos y polipéptidos de fusión que tienen al menos una actividad de un polipéptido de isopreno sintasa. Pueden usarse métodos estándares para determinar si un polipéptido tiene actividad de polipéptido de isopreno sintasa al medir la capacidad del polipéptido para convertir DMAPP en isopreno in vitro en un extracto de células, o in vivo. En un ensayo ejemplar, se preparan extractos de células al cultivar una cepa (por ejemplo, la cepa E. coli/pTrcKudzu descrita en la presente) en el método de matraz de agitación como se describe en el ejemplo 1. Después de que se completa la inducción, aproximadamente 10 mLs de células se sedimentan por centrifugación a 7,000 xg durante 10 minutos y se resuspenden en 5 mi de PEB sin glicerol. Las células son lisadas usando una célula de prensa francesa utilizando procedimientos estándares. Como alternativa las células son tratadas con lisozima Ready-Lyse; EpiCentre) después de una congelación/descongelación a -80°C.
La actividad del polipéptido de isopreno sintasa en el extracto de células puede medirse, por ejemplo, como se describe en Silver et al., J. Biol. Chem. 270:13010-13016, 1995 y referencias ahí, los cuales se incorporan cada uno en la presente a manera de referencia en sus totalidades, particularmente con respecto a ensayos para la actividad del polipéptido de isopreno sintasa. DMAPP (Sigma) es eyajporada hasta la sequedad bajo una corriente de nitrógeno y rehidratada hasta una concentración de 100 mM en 100 mM de regulador de pH de fosfato de potasio, pH 8.2 y se almacena a -20°C. Para llevar a cabo el ensayo, una solución de 5 µ? de MgCl2 1M, 1 mM (250 ug/ml) de DMAPP, 65 µ? de regulador de pH de extracto vegetal (PEB) (50 mM de Tris-HCl, pH 8.0 , 20 mM de MgCl2, 5% de glicerol y 2 mM de DTT) se añaden a 25 µ? de extracto de células en un frasco de espacio superior de 20 mi con una tapa de rosca metálica y septo de silicón recubierto con teflón (Agilent Technologies) y se cultiva a 37°C durante 15 minutos con agitación. La reacción se inactiva al añadir 200 µ? de 250 mM de EDTA y se cuantifica mediante GC/MS como se describió en el ejemplo 1, parte II.
Los ácidos nucleicos de isopreno sintasa ejemplares incluyen ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido, fragmento de un polipéptido, péptido o polipéptido de fusión que tiene por lo menos una actividad de un polipéptido de isopreno sintasa. Los polipéptidos y ácidos nucleicos de isopreno sintasa ejemplares incluyen polipéptidos y ácidos nucleicos de origen natural de cualquiera de los organismos de origen descritos en la presente así como polipéptidos mutantes y ácidos nucleicos derivados de cualquiera de los organismos originales descritos en la presente.
En algunas modalidades, el polipétido o ácido nucleico de isopreno sintasa es de la familia de las fabáceas, tales como la subfamilia Faboideae. En algunas modalidades, el polipéptido o ácido nucleico de isopreno sintasa es un polipéptido o ácido nucleico de Pueraria montana (kudzu) (Sharkey et al., Plant Physiology 137:700-712, 2005), Pueraria lobata, álamo (tal como Populus alba, Populus nigra, Populus trichocarpa, Populus alba x trémula (CAC35696) , o Populus alba) (Sasaki et al., FEBS Letters 579 (11) :2514-2518, 2005; Miller, et al., Planta 213:483-487, 2001), chopo (tal como Populus tremuloides) (Silver et al., JBC 270(22): 13010-1316, 1995), o roble inglés (Quercus ro£>ur) (Zimmer et al. O 98/02550), los cuales se incorporan cada uno en la presente a manera de referencia en sus totalidades, particularmente con respecto a ácidos nucleicos de isopreno sintasa y la expresión de polipéptidos de isopreno sintasa. Las isopreno sintasa adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, aquellas identificadas por los números de registro en Genbank AY341431, AY316691, AY279379, AJ457070 y AY182241, las cuales se incorporan cada una en la presente a manera de referencia en sus totalidades, particularmente con respecto a secuencias de ácidos nucleicos y polipéptidos de isopreno sintasa. En algunas modalidades, el polipéptido o ácido nucleico de isopreno sintasa no es un polipéptido o ácido nucleico de origen natural de Quercus robur (es decir, el polipéptido o ácido nucleico de isopreno sintasa es un polipéptido o ácido nucleico de isopreno sintasa que no es un polipéptido o ácido nucleico de origen natural de Quercus robur) . En algunas modalidades, el ácido nucleico o polipéptido de isopreno sintasa es un polipéptido o ácido nucleico de origen natural de álamo. En algunas modalidades, el ácido nucleico o polipéptido de isopreno sintasa no es un polipéptido o ácido nucleico de origen natural de álamo.
Polipéptidos y ácidos nucleicos de DXS ejemplares Como se indicó arriba, los polipéptidos de 1-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato sintasa (DXS) convierten piruvato y D-gliceraldehído-3-fosfato en l-desoxi-D-xilulosa-5-fosfato. Los polipéptidos de DXS ejemplares incluyen polipéptidos, fragmentos de polipéptidos, péptidos y polipéptidos de fusión que tienen al menos una actividad de un polipéptido de DXS. Los métodos estándares (tales como aquellos descritos en la presente) pueden usarse para determinar si un polipéptido tiene actividad de polipéptido de DXS al medir la capacidad del polipéptido para convertir piruvato y D-gliceraldehído-3-fosfato en 1-desoxi-D-xilulosa-5- fosfato in vitro, en un extracto de células, o in vivo.
Los ácidos nucleicos de DXS ejemplares incluyen ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido, fragmento de un polipéptido, péptido o polipéptido de fusión que tiene al menos una actividad de un polipéptido de DXS. Los polipéptidos y ácidos nucleicos de DXS ejemplares incluyen polipéptidos y ácidos nucleicos de origen natural- de cualquiera de los organismos de origen descritos en la presente así como polipéptidos y ácidos nucleicos mutantes derivados de cualquiera de los organismos de origen descritos aquí.
Polipéptidos y ácidos nucleicos de IDI ejemplares Los polipéptidos de isopentenil difosfato isomerasa ( isopentenil-difosfato delta- isomerasa o IDI) catalizan la interconversión de difosfato de isopentenilo (IPP) y difosfato de dimetilalilo (DMAPP) (por ejemplo, convirtiendo IPP en DMAPP y/o convirtieñdo DMAPP en IPP) . Los polipéptidos de IDI ejemplares incluyen polipéptidos, fragmentos de polipéptidos y polipéptidos de fusión que tienen al menos una actividad de un polipéptido de IDI. Los métodos estándares (tales como aquellos descritos en la presente) , se pueden usar para determinar si un polipéptido tiene actividad de polipéptido de IDI al medir la capacidad de polipéptido para interconvertir IPP y DMAPP in vitro, en un extracto de células, o in vivo. Los ácidos nucleicos de IDI ejemplares incluyen ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido, fragmento de un polipéptido, péptido o polipéptido de fusión que tiene al menos una actividad de un polipéptido de IDI . Los polipéptidos de IDI ejemplares y ácidos nucleicos incluyen polipéptidos y ácidos nucleicos de origen natural de cualquiera de los organismos de origen descritos en la presente así como polipéptidos y ácidos nucleicos mutantes derivados de cualquiera de los organismos de origen descritos en la presente.
Polipéptidos y ácidos nucleicos de la vía de MVA ejemplares Los polipéptidos de la vía de MVA ejemplares incluyen polipéptidos de acetil-CoA acetiltransferasa (AA-CoA tiolasa) , polipéptidos de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA sintasa (HMG-CoA sintasa) , polipéptidos de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa (HMG-CoA reductasa) , polipéptidos de mevalonato cinasa (MVK) , polipéptidos de fosfomevalonato cinasa (PMK) , polipéptidos de difosfomevalonato descarboxilasa (MVD) , polipéptidos de fosfomevalonato descarboxilasa (PMDC) , polipéptidos de isopentenil fosfato cinasa (IPK) , polipéptidos de IDI y polipéptidos (por ejemplo, polipéptidos de fusión) que tienen una actividad de dos o más polipéptidos de la vía de MVA. En particular, los polipéptidos de la vía de MVA incluyen polipéptidos, fragmentos de polipéptidos, péptidos y polipéptidos de fusión que tienen al menos una actividad de un polipéptido de la vía de MVA. Los ácidos nucleicos de la vía de MVA ejemplares incluyen ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido, fragmento de un polipéptido, péptido o polipéptido de fusión que tiene al menos una actividad de un polipéptido de la vía de MVA. Los polipéptidos y ácidos nucleicos de la vía de MVA ejemplares incluyen polipéptidos y ácidos nucleicos de origen natural de cualquiera de los organismos de origen descritos en la presente así como polipéptidos y ácidos nucleicos tnutantes derivados de cualquiera de los organismos de origen descritos en la presente.
En particular, polipéptidos de acetil-CoA acetiltransferasa (AA-CoA tiolasa o AACT) convierten dos moléculas de acetil-CoA en acetoacetil-CoA. Métodos estándares (tales como aquellos descritos en la presente) pueden usarse para determinar si un polipéptido tiene actividad del polipéptido de AA-CoA tiolasa al medir la capacidad del polipéptido para convertir dos moléculas de acetil-CoA en acetoacetil-CoA in vitro, en un extracto de células o in vivo.
Los polipéptidos de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA sintasa (HMG-CoA sintasa o HMGS) convierten acetoacetil -CoA en 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA. Métodos estándares (tales como aquellos descritos en la presente) pueden usarse para determinar si un polipéptido tiene actividad de polipéptido HMG-CoA sintasa al medir la capacidad del polipéptido para convertir acetoacetil-CoA en 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA in vitro, en un extracto celular, o in vivo.
Los polipéptidos de 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA reductasa (HMG-CoA reductasa o HMGR) convierten 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA en mevalonato. Métodos estándares (tales como aquellos descritos en la presente) pueden usarse para determinar si un polipéptido tiene actividad de polipéptido de HMG-CoA reductasa al medir la capacidad del polipéptido para convertir 3-hidroxi-3-metilglutaril-CoA en mevalonato in vitro, en un extracto de células o in vivo. El polipéptido de mevalonato cinasa (MVK) fosforila mevalonato para formar mevalonato- 5 -fosfato. Pueden usarse métodos estándares (tales como aquellos descritos en la presente) para determinar si un polipéptido tiene actividad de polipéptido MVK al medir la capacidad del polipéptido para convertir mevalonato en mevalonato-5- osfato in vitro, en un extracto de células o in vivo.
Los polipéptidos de fosfomevalonato cinasa (PMK) fosforilan mevalonato-5 - fosfato para formar mevalonato-5-difosfato. Métodos estándares (tales como aquellos descritos en la presente) pueden usarse para determinar si un polipéptido tiene actividad de polipéptido PMK al medir la capacidad del polipéptido para convertir mevalonato-5- fosfato en mevalonato-5-difosfato in vitro, en un extracto de células o in vivo.
Polipéptidos de difosfomevalonato descarboxilasa (MVD o DPMDC) convierten mevalonato-5-difosfato en difosfato de isopentenilo (IPP) . Métodos estándares (tales como aquellos descritos en la presente) pueden usarse para determinar si un polipéptido tiene actividad de polipéptido MVD al medir la capacidad del polipéptido para convertir mevalonato- 5-difosfato en IPP in vitro, en un extracto de células o in vivo.
Los polipéptidos de fosfomevalonato descarboxilasa (PMDC) convierten mevalonato- 5 - fosfato en fosfato de isopentenilo (IP). Métodos estándares (tales como aquellos descritos en la presente se pueden usar para determinar si un polipéptido tiene actividad de polipéptido PMDC al medir la capacidad del polipéptido para convertir mevalonato- 5 -fosfato en IP in vitro, en un extracto de células o in vi o .
Polipéptidos de isopentenil fosfato cinasa (IPK) fosforilan fosfato de isopentilo (IP) para formar difosfato de isopentenilo (IPP) . Métodos estándares (tales como aquellos descritos en la presente) se pueden usar para determinar si un polipéptido tiene actividad de polipéptido IPK al medir la capacidad del polipéptido para convertir IP en IPP in vitro, en un extracto de células o in vivo.
Los polipéptidos y ácidos nucleicos de IDI ejemplares se describen arriba.
Métodos ejemplares para aislar ácidos nucleicos Ácidos nucleicos de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI y/o MVA pueden ser aislados usando métodos estándares. Los métodos para obtener ácidos nucleicos deseados a partir de un organismo de origen de interés (tal como un genoma bacteriano) son comunes y se .conocen bien en la técnica de biología molecular (véase, por ejemplo, WO 2004/033646 y referencias citadas en el mismo, los cuales se incorporan en la presente a manera de referencia en sus totalidades, particularmente con respecto al aislamiento de ácidos nucleicos de interés) . Por ejemplo, si la secuencia del ácido nucleico se conoce (tal como cualquiera de los ácidos nucleicos conocidos descritos en la presente) , bibliotecas genómicas adecuadas pueden crearse mediante digestión con endonucleasa de restricción y pueden tamizarse con sondas complementarias a la secuencia de ácido nucleico deseada. Una vez que la secuencia es aislada, el ADN puede ser amplificado usando métodos de amplificación dirigida por cebador estándares tales como reacción en cadena de polimerasa (PCR) (patente de E.U.A. No. 4,683,202, la cual se incorpora a manera de referencia en su totalidad, particularmente con respecto a métodos de PCR) para obtener cantidades de ADN adecuadas para la transformación usando vectores adecuados .
Como alternativa, los ácidos nucleicos de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI y/o MVA (tales como cualquier ácido nucleico de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI y/o MVA con una secuencia de ácido nucleico conocida) pueden sintetizarse químicamente usando métodos estándares.
Polipéptidos y ácidos nucleicos de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI o MVA adicionales que pueden ser adecuados para usarse en las composiciones y métodos descritos en la presente se pueden identificar usando métodos estándares. Por ejemplo, bibliotecas de cósmidos del ADN cromosómico de organismos que se sepa produzcan isopreno naturalmente pueden construirse en organismos tales como E. coli, y luego tamizarse para la producción de isopreno. En particular, bibliotecas de cósmidos pueden crearse en las que grandes segmentos de ADN genómico (35-45 kb) sean empacados en vectores y usados para transformar anfitriones adecuados. Los vectores cósmidos son únicos porque son capaces de recibir grandes cantidades de ADN. Generalmente los vectores cósmidos - tienen por lo menos una copia de la secuencia de ADN eos que se requiere para el empaque y posterior circularización del ADN heteróloga. Además de la secuencia eos, estos vectores también' contienen un origen de replicación tal como ColEI y marcadores de resistencia a fármacos tales como un ácido nucleico resistente a ampicilina o neomicina. Los métodos para usar vectores cósmidos para la transformación de anfitriones bacterianos adecuados se describen bien en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor, 1989, el cual se incorpora en la presente a manera de referencia en su totalidad, particularmente con respecto a métodos de transformación. Típicamente para clonar cósmidos, ADN heterologo se aisla usando las endonucleasas de restricción adecuadas y se liga adyacente a la región eos del vector cósmido usando las ligasas adecuadas. Los vectores cósmidos que contienen el ADN heterologo linealizado son luego hechos reaccionar con un vehículo de empaque de ADN tal como un bacteriófago. Durante el proceso de empaque, los sitios eos son cortados y el ADN heterologo es empacado en la porción de cabeza de la partícula viral bacteriana. Estas partículas se usan después para transfectar células anfitrionas adecuadas tales como E. coli. Una vez inyectado en la célula, el ADN heterologo circulariza bajo la influencia de los extremos pegajosos eos. De esta manera, grandes segmentos de ADN heterologo pueden introducirse y expresarse en células hospederas .
Los métodos adicionales para obtener ácidos nucleicos de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI y/o MVA incluyen tamizar una biblioteca metagenómica mediante ensayo (tal como el ensayo de espacio superior descrito en la presente) o por PCR usando cebadores dirigidos contra nucleótidos que codifiquen para una longitud de aminoácidos conservados (por ejemplo, al menos 3 aminoácidos conservados) . Los aminoácidos conservados pueden identificarse al alinear secuencias de aminoácidos de polipéptidos de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI y/o MVA conocidos. Los aminoácidos conservados para polipéptidos de isopreno sintasa pueden identificarse con base en secuencias alineadas de polipéptidos de isopreno sintasa conocidos. Un organismo que se ha encontrado produce isopreno naturalmente puede ser sujeto a métodos de purificación de proteínas estándares (los cuales se conocen bien en la técnica) y el polipéptido purificado resultante puede ser secuenciado usando métodos estándares. Otros métodos se encuentran en la literatura (véase, por ejemplo, Julsing et al., Applied. Microbiol . Biotechnol . 75:1377-84, 2007; Withers et al., Appl Environ Microbiol. 73 ( 19 ) : 6277 - 83 , 2007, las cuales se incorporan cada una en la presente a manera de referencia en sus totalidades, particularmente con respecto a la identif cación de ácidos nucleicos implicados en la síntesis de isopreno) .
Además, programas estándares de alineación de secuencia y/o predicción de estructura pueden usarse para identificar polipéptidos y ácidos nucleicos de la vía de DXS, IDI o MVA adicionales con base en la similitud de su estructura secundaria de polipéptido primaria y/o predicha con aquella de polipéptidos y ácidos nucleicos de la vía de DXS, IDI o MVA conocidos. Bases de datos estándares tales como la base de datos swissprot-trembl (en la red mundial en "expasy.org", Swiss Institute of Bioinformatics Swiss-Prot group CMU-1 rué Michel Servet CH-1211 Geneva 4, Suiza) también se pueden usar para identificar polipéptidos y ácidos nucleicos de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI o MVA. La estructura secundaria y/o terciaria de un polipéptido de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI o MVA puede predecirse usando los ajustes preestablecidos de programas de predicción de estructura estándares, tales como PredictProtein (630 West, 168 Street, BB217, Nueva York, N.Y. 10032, E.U.A.). Como alternativa, la estructura secundaria y/o terciaria real de un polipéptido de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI o MVA puede determinarse usando métodos estándares. Ácidos nucleicos de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI o MVA también se pueden identificar mediante hibridación a sondas generadas a partir de ácidos nucleicos de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI o MVA conocidos.
Promotores y vectores ejemplares Cualquiera de los ácidos nucleicos de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI o MVA descritos en la presente puede incluirse en uno o más vectores. En consecuencia, la invención incorpora también vectores con uno o más ácidos nucleicos que codifican para cualquiera de los polipéptidos de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI o MVA que se describen en la presente. Según se usa en la presente, un "vector" significa una construcción que es capaz de suministrar, y deseablemente de expresar uno o más ácidos nucleicos de interés en una célula hospedera. Ejemplos de vectores incluyen, pero no están limitados a, plásmidos, vectores virales, vectores de expresión de ADN o AR , cósmidos y vectores fagos. En algunas modalidades, el vector contiene un ácido nucleico bajo el control de una secuencia de control de expresión.
Según se usa en la presente, una "secuencia de control de expresión" significa una secuencia de ácido nucleico que dirige la transcripción de un ácido nucleico de interés. Una secuencia de control de expresión puede ser un promotor, tal como un promotor constitutivo o inducible, o un potenciador. Un "promotor inducible" es un promotor que es activo bajo regulación ambiental o de desarrollo. La secuencia de control de expresión está enlazada operablemente al segmento de ácido nucleico que será transcrito.
En algunas modalidades, el vector contiene un marcador selectivo. El término "marcador selectivo" se refiere a un ácido nucleico capaz de expresión en una célula hospedera que permite la facilidad en selección de esas células hospederas que contengan un ácido nucleico o vector introducido. Ejemplos de marcadores seleccionables incluyen, pero no están limitados a, ácidos nucleicos de resistencia a antibióticos (por ejemplo, canamicina, ampicilina, carbenicilina, gentamicina, higromicina, fleomicina, bleomicina, neomicina o cloranfenicol) y/o ácidos nucleicos que confieren una ventaja metabólica, tales como una ventaja nutricional a la célula hospedera. Los marcadores selectivos nutricionales ejemplares incluyen aquellos marcadores conocidos en la técnica como amdS, argB y pyr4. Los marcadores útiles en sistemas de vectores para la transformación de Trichoderma se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Finkelstein, capítulo 6 en Biotechnology of Filamentous Fungi, Finkelstein et al., Eds . , Butterworth-Heinemann, Boston, MA, capítulo 6, 1992; y Kinghorn et al., Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi, Blackie Academic and Professional , Chapman and Hall, Londres, 1992, los cuales se incorporan cada uno en la presente a manera de referencia en sus totalidades, particularmente con respecto a marcadores selectivos) . En algunas modalidades, el marcador selectivo es el ácido nucleico amdS , el cual codifica para la enzima acetamidasa, permitiendo a las células transformadas crecer en acetamida como una fuente de nitrógeno. El uso de un ácido nucleico amdS de A. nidulans como un marcador selectivo se describe en Kelley et al., EMBO J. 4:475-479, 1985 y Penttila et al., Gene 61:155-164, 1987 (los cuales se incorporan cada uno en la presente a manera de referencia en sus totalidades, particularmente con respecto a marcadores selectivos) . En algunas modalidades, un ácido nucleico de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI o MVA se integra en un cromosoma de las células sin un marcador selectivo.
Los vectores adecuados son aquellos que son compatibles con la célula hospedera empleada. Vectores adecuados pueden derivarse, por ejemplo, de una bacteria, un virus (tal como bacteriófago T7 o un fago derivado de M-13) , un cósmido, una levadura o una planta. Los protocolos para obtener y usar estos vectores se conocen por aquellos expertos en la técnica (véase, por ejemplo, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor, 1989, la cual se incorpora en la presente a manera de referencia en su totalidad, particularmente con respecto al uso de vectores) .
Los promotores , se conocen bien en la técnica. Cualquier promotor que funcione en la célula hospedera puede usarse para la expresión de un ácido nucleico de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI o MVA en la célula hospedera. Regiones de control de inicio o promotores, los cuales son útiles para conducir la expresión de ácidos nucleicos de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI o MVA en varias células hospederas son numerosos y familiares para aquellos expertos en la técnica (véase, por ejemplo, WO 2004/033646 y referencias citadas ahí, las cuales se incorporan cada una a manera de referencia en sus totalidades, particularmente con respecto a vectores para la expresión de ácidos nucleicos de interés) . Virtualmente cualquier promotor capaz de conducir estos ácidos nucleicos es adecuado para la presente invención incluyendo, pero no limitado a, CYC1, HIS3, GAL1 , GALIO, ADH1, PGK, PH05, GAPDH, ADCI , TRP1, URA3 , LEU2 , ENO y TPI (útiles para la expresión en Saccharomyces) ; AOX1 (útiles para la expresión en Pichia) ; y lac, trp, SPL, [--]??, T7, tac y trc (útiles para la expresión en E. coli) .
En algunas modalidades, se usa un promotor de glucosa isomerasa (véase, por ejemplo, patente de E.U.A. No. 7,132,527 y referencias citadas ahí, las cuales se incorporan cada una en la presente a manera de referencia en sus totalidades, particularmente con respecto a promotores y sistemas de plásmidos para expresar polipéptidos de interés) . Los imitantes del promotor de glucosa isomerasa reportados pueden usarse para variar el nivel de expresión del polipéptido codificado por un ácido nucleico enlazado operablemente al promotor de glucosa isomerasa (patente de E.U.A. No. 7,132,527). En varias modalidades, el promotor de glucosa isomerasa está contenido en un plásmido de bajo, medio o alto número de copias (patente de E.U.A. No. 7, 132, 527) .
En varias modalidades, un ácido nucleico de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI y/o MVA está contenido en un plásmido de baja copia) por ejemplo, un plásmido que se mantiene a alrededor de 1 a aproximadamente 4 copias por célula) , plásmido de media copia (por ejemplo, un plásmido que se mantiene a alrededor de 10 a aproximadamente 15 copias por célula) o un plásmido de alta copia (por ejemplo, un plásmido que se mantiene a alrededor de 50 o más copias por célula) . En algunas modalidades, el ácido nucleico de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI o MVA heterólogo o extra endógeno, se enlaza operablemente a un promotor T7. En algunas modalidades, el ácido nucleico de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI o MVA heterólogo o extra endógeno operablemente enlazado a un promotor T7 está contenido en un plásmido de media o alta copia. En algunas modalidades, el ácido nucleico de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI o MVA heterólogo o extra endógeno está enlazado operablemente a un promotor Trc . En algunas modalidades, el ácido nucleico de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI o MVA heterólogo o extra endógeno está enlazado operablemente a un promotor Trc contenido en un plásmido de media o alta copia. En algunas modalidades, el el ácido nucleico de la · vía de isopreno sintasa, DXS, IDI o MVA heterólogo o extra endógeno está enlazado operablemente a un promotor Lac . En algunas modalidades, el ácido nucleico de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI o MVA heterólogo o extra endógeno enlazado operablemente a un promotor Lac está contenido en un plásmido de baja copia. En algunas modalidades, el ácido nucleico de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI o MVA heterólogo o extra endógeno está enlazado operablemente a un promotor endógeno, tal como un promotor endógeno de Escherichia, Pantoea, Bacillus, Yarrowia, Streptomyces o Trichoderma o un promotor endógeno de la vía de serina proteasa alcalina, serina proteasa alcalina, isopreno sintasa, DXS, IDI o MVA. En algunas modalidades, el ácido nucleico de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI o MVA heterólogo o extra endógeno enlazado operablemente a un promotor endógeno está contenido en un plásmido de alta copia. En algunas modalidades, el vector es un plásmido de replicación que no se integra en un cromosoma en las células. En algunas modalidades, parte o todo el vector se integra en un cromosoma en las células.
En algunas modalidades, el vector es cualquier vector que cuando sea introducido en una célula hospedera fúngica sea integrado en el genoma de la célula hospedera y se replique. Se hace referencia al Catálogo del Centro de Almacenamiento de Genética Fúngica de Cepas (FGSC, en la red mundial "fgsc.net" y las referencias citadas ahí, las cuales se incorporan cada una en la presente a manera de referencia en sus totalidades, particularmente con respecto a vectores) para una lista de vectores. Ejemplos adicionales de vectores de expresión y/o integración adecuados se proporcionan en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor, 1989, Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al. (eds.) More Gene Manipulations in Fungí, Academic Press pág. 396-428, 1991; y patente de E.U.A. No. 5,874,276, las cuales se incorporan cada una en la presente a manera de referencia en sus totalidades, particularmente con respecto a vectores. Los vectores particularmente útiles incluyen pFB6 , pBR322, PUC18, pUClOO y pENTR/D.
En algunas modalidades, un ácido nucleico de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI o MVA está enlazado operablemente a un promotor adecuado que muestra actividad de transcripción en una célula hospedera fúngica. El promotor puede derivarse de uno o más ácidos nucleicos que codifiquen para un polipéptido que sea ya sea endógeno o heterólogo para la célula hospedera. En algunas modalidades, el promotor es útil en un hospedero de Trichoderma . Ejemplos no limitativos adecuados de promotores incluyen cjb l, cbh2 , egll , egl2 , pepA, hfbl, hbf2, xynl, y amy. En algunas modalidades, el promotor es uno que es nativo para la célula hospedera. Por ejemplo, en algunas modalidades cuando T. reesei es el anfitrión, el promotor es un promotor de T. reesei nativo. En algunas modalidades, el promotor es T. reesei cbhl , el cual es un promotor inducible y ha sido depositado en BenBank con el número de registro D86235, el cual se incorpora en la presente a manera de referencia en su totalidad, particularmente con respecto a promotores. En algunas modalidades, el promotor es uno que es heterólogo para la célula hospedera fúngica. Otros ejemplos de promotores útiles incluyen promotores de los genes de glucoamilasa de A. awamori y A. niger (glaA) (Nunberg et al., Mol. Cell Biol . 4:2306-2315, 1984 y Boel et al., EMBO J. 3:1581-1585, 1984, los cuales se incorporan cada uno en la presente a manera de referencia en sus totalidades, particularmente con respecto a promotores) ; alfa amilasas de Aspergillus niger, TAKA amilasa de Aspergillus oryzae, xlnl de T. reesei y la celobiohidrolasa 1 de T. reesei (EP .137280, el cual se incorpora a manera de referencia en su totalidad, particularmente con respecto a promotores) .
En algunas modalidades, el vector de expresión incluye también una secuencia de terminación. Las regiones de control de terminación también pueden derivarse de varios genes nativos para la célula hospedera. En algunas modalidades, la secuencia de terminación y la secuencia promotora se derivan de la misma fuente. En otra modalidad, la secuencia de terminación es endógena a la célula hospedera. Una secuencia terminadora particularmente adecuada es c¿ l derivada de una cepa de Trichoderma (tal como T. reesei) . Otros terminadores fúngicos útiles incluyen el terminador de un ácido nucleico de glucoamilasa de A. niger o A. awamori (Nunberg et al., Mol. Cell Biol 4:2306-2315, 1984 y Boel et al., EMBO J. 3:1581-1585, 1984; los cuales se incorporan cada uno a manera de referencia en sus totalidades, particularmente con respecto a terminadores fúngicos) . Opcionalmente , puede incluirse un sitio de terminación. Para la expresión efectiva de los polipéptidos , ADN que codifica para el polipéptido se enlaza operablemente a través de codones de inicio a regiones de control de expresión seleccionadas de tal manera que la expresión se I traduzca en la formación del ARN mensajero adecuado.
En algunas modalidades, el promotor, codificación, región y terminador se originan todos del ácido nucleico de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI o MVA que será expresado. En algunas modalidades, la región de codificación para un ácido nucleico de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI o MVA se inserta en un vector de expresión de propósitos generales de tal manera que esté bajo el control de transcripción del promotor de la construcción de expresión y las secuencias terminadoras . En algunas modalidades, genes o partes de los mismos se insertan hacia el extremo tres prima del promotor cb l fuerte.
Un ácido nucleico de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI o MVA puede ser incorporado en un vector, tal como un vector de expresión, usando técnicas estándares (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982, el cual se incorpora en la presente a manera de referencia en su totalidad, particularmente con respecto al tamizado de secuencias de ADN adecuadas y la construcción de vectores) . Los métodos usados para ligar la construcción de ADN que comprende un ácido nucleico de interés (tal como un ácido nucleico de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI o MVA) , un promotor, un terminador y otras secuencias y para insertarlos en un vector adecuado se conocen en la técnica. Por ejemplo, se pueden usar enzimas de restricción para cortar el ácido nucleico de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI o MVA y el vector. Después, los extremos compatibles del ácido nucleico de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI o MVA cortado y el vector cortado pueden ser ligados. El enlace se logra generalmente mediante ligación en sitios de restricción convenientes. Si estos sitios no existen, los enlazadores de oligonucleótido sintético se usan de acuerdo con la práctica convencional (véase, Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor, 1989, y Bennett y Lasure, More Gene Manipulations in Fungí, Academic Press, San Diego, pág. 70-76, 1991, los cuales se incorporan cada uno en la presente a manera de referencia en sus totalidades, particularmente con respecto a enlazadores de oligonucleótidos) . Además, se pueden construir vectores usando técnicas de recombinación conocidas (por ejemplo, Invitrogen Life Technologies, Gateway Technology) .
En algunas modalidades, puede ser deseable sobre-expresar ácidos nucleicos de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI o MVA a niveles mucho más altos que los encontrados actualmente en las células de origen natural . Este resultado puede lograrse mediante la clonación selectiva de los ácidos nucleicos que codifiquen para los polipéptidos en plásmidos de varias copias o poniendo sus ácidos nucleicos bajo un fuerte promotor inducible constitutivo. Los métodos para sobre-expresar polipéptidos deseados son comunes y bien conocidos en la técnica de biología molecular y ejemplos pueden encontrarse en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor, 1989, el cual se incorpora en la presente a manera de referencia en su totalidad, particularmente con respecto a técnicas de clonación .
Los siguientes recursos incluyen descripciones de metodología general adicional útil de acuerdo con la invención: Kreigler, Gene Transfer and Expression; A Laboratory Manual, 1990 y Ausubel et al., Eds . Current Protocols in Molecular Biology, 1994, los cuales se incorporan cada uno en la presente a manera de referencia en sus totalidades, particularmente con respecto a técnicas de biología molecular y clonación.
Organismos de origen ejemplares Ácidos nucleicos de la vía de isopreno sintasa, ¦DXS, IDI o MVA (y sus polipéptidos codificados) pueden obtenerse de cualquier organismo que contenga naturalmente ácidos nucleicos de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI o MVA. Como se indicó arriba, se forma isopreno naturalmente mediante una variedad de organismos, tales como bacterias, levadura, plantas y animales. Los organismos contienen la vía de MVA, vía DXP o tanto las vías de MVA como DXP para producir isopreno (figura 19). Así, ácidos nucleicos DXS pueden ser obtenidos, por ejemplo, de cualquier organismo que contenga la vía DXP o contenga las vías tanto MVA como DXP. Ácidos nucleicos de IDI o isopreno sintasa pueden obtenerse, por ejemplo, de cualquier organismo que contenga la vía de MVA, vía DXP o tanto las vías de MVA como DXP. Ácidos nucleicos de la vía de MVA pueden obtenerse, por ejemplo, de cualquier organismo que contenga la vía de MVA o contenga tanto las vías de MVA como DXP.
En algunas modalidades, la secuencia de ácido nucleico del ácido nucleico de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI o MVA es idéntica a la secuencia de un ácido nucleico que se produce mediante cualquiera de los siguientes organismos en la naturaleza. En algunas modalidades, la secuencia de aminoácidos del polipéptido de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI o MVA es idéntica a la secuencia de un polipéptido que se produce mediante cualquiera de los siguientes organismos en la naturaleza. En algunas modalidades, el ácido nucleico o polipéptido de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI o MVA es un ácido nucleico o polipéptido mutante derivado de cualquiera de los organismos descritos en la presente. Según se usa en la presente, "derivado de" se refiere a la fuente del ácido nucleico o polipéptido en la cual se introduce una o más mutaciones. Por ejemplo, un polipéptido que se "deriva de un polipéptido vegetal" se refiere a un polipéptido de interés que resulta de introducir una o más mutaciones en la secuencia de un polipéptido vegetal tipo silvestre (es decir, una secuencia de origen natural) .
En algunas modalidades, el organismo de origen es un hongo, ejemplos de los cuales son especies de Aspergillus tales como A. oryzae y A. niger, especies de Saccharomyces tales como S. cerevisiae, especies de Schizosaccharomyces tales como S. pombe y especies de Trichoderma tales como T. reesei . En algunas modalidades, el organismo de origen es una célula fúngica filamentosa. El término "hongos filamentosos" se refiere a todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycotina (véase, Alexopoulos, C. J. (1962) , Introductory Mycoloy, iley, Nueva York) . Estos hongos se caracterizan por un micelio vegetativo con una pared celular compuesta de quitina, celulosa y otros polisacáridos complejos. Los hongos filamentosos son morfológicamente, fisiológicamente y genéticamente distintos de las levaduras. El crecimiento vegetativo por hongos filamentosos es mediante la elongación hifal y catabolismo de carbono es obligatoriamente aeróbico. La célula progenitora fúngica puede ser una célula de una especie de, pero no limitada a, Trichoderma, (por ejemplo, Trichoderma reesei, el morfo asexual de Hypocrea jecorina, clasificado previamente como T. longibrachiatum, Trichoderma viride, Trichoderma koningii , Trichoderma harzianum) (Sheir-Neirs et al., Appl . Microbiol . Biotechnol 20:46-53, 1984; ATCC No. 56765 y ATCC No. 26921); Penicillium sp . , Humicola sp. (por ejemplo, H. insolens, H. lanuginose, o H. grísea); Chrysosporium sp. (por ejemplo, C. luc/nowense) , Gliocladium sp., Aspergillus sp . (por ejemplo, A. oryzae, A. niger, A sojae, A japonicus, A. nidulans o A. awamori) (Ward et al., Appl. Microbiol. Biotechnol. 39:7380743, 1993 y Goedegebuur et al., Genet 41:89-98, 2002), Fusarium sp., (por ejemplo, F. roseum, F. gramimum, F. ceréalis, F. oxysporuim o F. venenatum) , Neurospora sp . , (por ejemplo, N. crassa) , Hypocrea sp., Mucor sp . , (por ejemplo, M. miehei) , Rhizopus sp. y Emericella sp. (véase también, Innis et al., Sci . 228:21-26, 1985). El término "Trichoderma" o "Trichoderma sp." o "Trichoderma spp." se refiere a cualquier género fúngico clasificado previamente o actualmente como Trichoderma.
En algunas modalidades, el hongo es A. nidulans, A. awamori, A. oryzae, A. aculeatus, A. niger, A. japonicus, T. reesei, T. viride, F. oxysporum o F. solani . Las cepas de Aspergillus se describen en Ward et al., Appl. Microbiol.
Biotechnol. 39:738-743, 1993 y Goedegebuur et al., Curr Gene 41:89-98, 2002, los cuales se incorporan en la presente a manera de referencia cada uno en sus totalidades, particularmente con respecto a hongos". En modalidades particulares, el hongo es una cepa de Trichoderma, tal como una cepa de T. reesei . Las cepas de T. reesei se conocen y ejemplos no limitativos incluyen ATCC No. 13631, ATCC No. 26921, ATCC No. 56764, ATCC No. 56765, ATCC No. 56767 y NRRL 15709, los cuales se incorporan cada uno en la presente a manera de referencia en sus totalidades, particularmente con respecto a cepas de T. reesei. En algunas modalidades, la cepa hospedera es un derivado de RL-P37. RL-P37 descrito en Sheir-Neiss et al., Ap l . Microbiol . Biotechnology 20:46-53, 1984, el cual se incorpora en la presente a manera de referencia en su totalidad, particularmente con respecto a cepas de T. reesei.
En algunas modalidades, el organismo de origen es una levadura, tal como Saccharomyces sp. , Schizosaccharomyces sp., Pichia sp . , o Candida sp. En algunas modalidades, el organismo de origen es una bacteria, tal como cepas de Bacillus tales como B. lichenformis o B. subtilis, cepas de Pantoea tal como P. citrea, cepas de Pseudomonas tal como P. alcaligenes, cepas de Streptomyces tales como S. albus, S. lividans o S. rubiginosus o cepas de Escherichia tal como E. coli.
Según se usa en la presente, "el género Bacillus" incluye todas las especies dentro del género "Bacillus" , como se conoce por aquellos expertos en la técnica, incluyendo pero no limitados a B. subtilis, B. licheniformis, B. lentus, B. brevis, B. stearothermophilus, B. alkalophilus, B. amyloliquefaciens, B. clausii, B. halodurans, B. megaterium, B. coagulans, B. circulans, B. lautus y B. thuringiensis . Se reconoce que el género Bacillus continúa sufriendo de organización taxonómica. De esta manera, se intenta que el género incluya especies que hayan sido reclasificadas , incluyendo pero no limitados a organismos tales como B. stearothermophilus, el cual se llama ahora "Geobacillus stearothermophilus" . La producción de endosporas resistentes en presencia de oxígeno se considera la característica distintiva del género Bacillus, aunque esta característica aplica también a los recientemente nombrados Alicyclobacillus, Amphibacillus, Aneurinibacillus, Anoxybacillus, Brevibacillus, Filobacillus, Gracilibacillus, Halobacillus, Paenibacillus, Salibacillus, Thermobacillus, Ureibacillus y Virgibacillus .
En algunas modalidades, el organismo de origen es una bacteria gran-positiva . Ejemplos no limitativos incluyen cepas de Streptomyces (por ejemplo, S. albus, S. lividans, S. coelicolor o S. griseus) y Bacillus . En algunas modalidades, el organismo de origen es una bacteria gran-negativa, tal como E. coli o Pseudomonas sp.
En algunas modalidades, el organismo de origen es una planta, tal como una planta de la familia Fabáceas, tales como la subfamilia Faboideae . En algunas modalidades, el organismo de origen es kudzu, poplar (tal como Populus alba x trémula CAC35696 o Populus alba) (Sasaki et al., FEBS Letters 579 (11) : 2514-2518 , 2005), aspen (tal como Populus tremuloides) o Quercus roi>ur.
En algunas modalidades, el organismo de origen es un alga, tal como un alga verde, alga roja, glaucofites, cloraracniofites , euglenidos, cromista o dinoflagelados .
En algunas modalidades, el organismo de . origen es una cianobacteria, tal como cianobacteria clasificada en cualquiera de los siguientes grupos con base en la morfología: Chroococcales, Pleurocapsales, Oscillatoriales, Nostocales o Stigonematales .
Células hospederas ejemplares Se puede usar una variedad de células hospederas para expresar polipéptidos de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI y/o MVA y para producir isopreno en los métodos de la, invención reclamada. Las células hospederas ejemplares incluyen células de cualquiera de los organismos listados en la sección anterior bajo el título "Organismos de origen ejemplares" . La célula hospedera puede ser una célula que produzca naturalmente isopreno o una célula que no produzca naturalmente isopreno. En algunas modalidades, la célula hospedera produce naturalmente isopreno usando la vía de DXP, y ácido nucleico de isopreno sintasa, DXS y/o IDI se añade para incrementar la producción de isopreno usando esta vía. En algunas modalidades, la célula hospedera produce naturalmente isopreno usando la vía de MVA, y una isopreno sintasa y/o uno o más ácidos nucleicos de la vía de MVA se añaden para incrementar la producción de isopreno usando estadía. En algunas modalidades, la célula hospedera produce naturalmente isopreno usando la vía de DXP y uno o más ácidos nucleicos de la vía de MVA se añaden para producir isopreno usando parte o toda la vía de MVA así como la vía de DXP. En algunas modalidades, la célula hospedera produce naturalmente isopreno usando las vías tanto de DXP como de MVA y uno o más ácidos nucleicos de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI o MVA se añaden para incrementar la producción de isopreno por una o ambas de estas vías.
Métodos de transformación ejemplares Ácidos nucleicos de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI o MVA o vectores que los contienen pueden ser insertados en una célula hospedera (por ejemplo, una célula vegetal, una célula fúngica, una célula de levadura o una célula bacteriana descrita en la presente) usando técnicas estándares para la expresión del polipéptido de isopreno sintasa, DXS, IDI y/o MVA codificado. La introducción de una construcción de ADN o vector en una célula hospedera se puede llevar a cabo usando técnicas tales como transformación, electroporación, microinyección nuclear, transducción, transfeccion (por ejemplo, transfeccion mediada por lipofección o mediada por DEAE-dextrina o transfeccion usando un virus de fago recombinante) , incubación con precipitado de ADN de fosfato de calcio, bombardeo de alta velocidad con microproyectiles recubiertos con ADN y fusión de protoplastos . Las técnicas de transformación generales se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al. (eds) capítulo 9, 1987; Sambrook et al., Molecular Cloning: A. Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor, 1989; y Campbell et al., Curr. Genet . 16:53-56, 1989, los cuales se incorporan cada uno en la presente a manera de referencia en sus totalidades, particularmente con respecto a métodos de transformación) . La expresión de polipéptido heterólogo en Trichoderma se describe en la patente de Estados Unidos 6,022,725; patente de Estados Unidos 6,268,328; patente de Estados Unidos 7,262,041; WO 2005/001036; Harkki et al., Enzyme Microb. Technol . 13:227-233, 1991; Harkki et al., Bio Technol. 7:596-603, 1989; EP 244,234; EP 215,594 y Nevalainen et al., "The Molecular Biology oí Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous and Jíeterologous Genes", in Molecular Industrial Mycology, Eds., Leong and Berka,- Marcel Dekker Inc., NY pág. 129-148, 1992, los cuales se -incorporan cada uno en la presente a manera de referencia en sus totalidades, particularmente con respecto a métodos de transformación y expresión) . También se hace referencia a Cao et al. (Sci. 9:991-1001, 2000; EP 238023 y Yelton et al., Proceedings . Nati. Acad. Sci. E.U.A. 81:1470-1474, 1984 (los cuales se incorporan cada uno en la presente a manera de referencia en sus totalidades, particularmente con respecto a métodos de transformación) para la transformación de cepas de Aspergillus . Los ácidos nucleicos introducidos pueden ser integrados en ADN cromosómico o mantenerse como secuencias de replicación extracromosómicas .
Cualquier método conocido, en la técnica puede usarse para seleccionar transformantes. En un ejemplo no limitativo, transformantes estables que incluyen un marcador amdS se distinguen de transformantes inestables por su velocidad de crecimiento más rápida y la formación de colonias circulares con un contorno liso, más que arrugado en medio de cultivo sólido que contiene acetamida. Además, en algunos casos una prueba de estabilidad adicional se lleva a cabo al cultivar los transformantes en un medio no selectivo sólido (por ejemplo, un medio que carezca de acetamida) , cosechando esporas de este medio de cultivo y determinando el porcentaje de estas esporas que son subsecuentemente germinarán y crecerán en medio selectivo que contenga acetamida .
En algunas modalidades, células fúngicas se transforman mediante un proceso que incluye formación de protoplastos y transformación de los protoplastos seguida por la regeneración de la pared celular de una manera conocida. En una modalidad específica, la preparación de Trichoderma sp. para transformación incluye la preparación de protoplastos de micelios fúngicos (véase, Campbell et al., Curr. Genet . 16:53-56, 1989, el cual se incorpora a manera de referencia en su totalidad, particularmente con respecto a métodos de transformación) . En algunas modalidades, los micelios se obtienen de esporas vegetativas germinadas. Los micelios se tratan con una enzima que digiera la pared celular dando como resultado protoplastos. Los protoplastos se protegen después mediante la presencia de un estabilizador osmótico en el medio de suspensión. Estos estabilizadores incluyen sorbitol, manitol, cloruro de potasio, sulfato de magnesio y similares. Usualmente, la concentración de estos estabilizadores varía entre 0.8 M y 1.2 M. Es deseable usar una solución de alrededor de 1.2 M de sorbitol en el medio de suspensión.
La absorción de ADN en la cepa de Trichoderma sp. hospedera depende de la concentración de iones de calcio. Generalmente, entre alrededor de 10 mM de CaCl2 y 50 mM de CaCl2 se usan en una solución de absorción. Además del ión de calcio en la solución de absorción, otros compuestos incluidos generalmente son un sistema de regulación de pH tal como regulador de pH TE (10 mM de tris, pH 7.4; 1 mM de EDTA) o 10 m de MOPS, regulador de pH, pH 6.0 (ácido morfolinopropansulfónico) y polietilenglicol (PEG) . Aunque no se desea sr limitados a ninguna teoría particular, se cree que el polietilenglicol actúa para fusionar las membranas celulares, permitiendo así a los contenidos del medio ser suministrados en el citoplasma de la cepa de Trichoderma sp. y el ADN plasmídico ser transferido al núcleo. Esta fusión frecuentemente deja varias copias del ADN plasmídico integrado en el cromosoma hospedero.
Usualmente una suspensión que contiene los protoplastos de Trichoderma sp. o células que hayan sido sujetas a un tratamiento de permeabilidad a una densidad de 105 a 107/mL (tal como 2 x 106/mL) se usan en la transformación. Un volumen de 100 ]ih de estos protoplastos o células en una solución adecuada (por ejemplo, sorbítol 1.2 M y 50 mM de CaCl2) se mezcla con el ADN deseado. Generalmente, se añade una alta concentración de PEG a la solución de absorción. De 0.1 a 1 en volumen de 25% de PEG 4000 se pueden añadir a la solución de protoplastos. En algunas modalidades, se añaden alrededor de 0.25 volúmenes a la suspensión de protoplastos. Aditivos tales como sulfóxido de dimetilo, heparina, espermidina, cloruro de potasio y similares también pueden añadirse a la solución de absorción y ayudar a la transformación. Procedimientos similares están disponibles para otras células hospederas fúngicas (véase, por ejemplo, patente de Estados Unidos 6,022,725 y patente de Estados Unidos 6,268,328, las cuales se incorporan cada una en la presente a manera de referencia en sus totalidades, particularmente con respecto a métodos de transformación) .
Generalmente, la mezcla se cultiva después a aproximadamente 0°C durante un periodo de entre 10 a 30 minutos. PEG adicional se añade después a la mezcla para incrementar más la absorción de la secuencia de ácido nucleico deseada. El 25% de PEG 4000 se añade generalmente en volúmenes de 5 a 15 veces el volumen de la mezcla de transformación; sin embargo, pueden ser adecuados volúmenes mayores o menores. El 25% de PEG4000 es deseablemente alrededor de 10 veces el volumen de la mezcla de transformación. Después de que se añade el PEG, la mezcla de transformación se cultiva entonces ya sea a temperatura ambiente o sobre hielo antes de la adición de una solución de sorbitol y CaCl2. La suspensión de protoplastos se añade después además a alícuotas fundidas de un medio de crecimiento. Cuando el medio de crecimiento incluye una selección de crecimiento (por ejemplo, acetamida o un antibiótico) permite el crecimiento de transformantes únicamente .
La transformación de células bacteriales puede llevarse a cabo de acuerdo con métodos convencionales, por ejemplo, como se describe en Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, 1982, el cual se incorpora en la presente a manera de referencia en su totalidad, particularmente con respecto a métodos de transformación .
Medios de cultivo de células ejemplares La invención incluye también una célula o una población de células en cultivo que producen isopreno. Por "células en cultivo" se intenta decir dos o más células en una solución (por ejemplo, un medio de células) que permite a las células sufrir una o más divisiones celulares. "Células en cultivo" no incluyen células vegetales que son parte de una planta viva multicelular que contiene células que han sido diferenciadas en tejidos vegetales. En varias modalidades, el cultivo de células incluye al menos o alrededor de 10, 20, 50, 100, 200, 500, 1,000, 5,000, 10,000 o más células.
Cualquier fuente de carbono puede usarse para cultivar las células hospederas. El término "fuente de carbono" se refiere a uno o más compuestos que contienen carbono capaces de ser metabolizados por una célula u organismo hospedero. Por ejemplo, el medio de células usado para cultivar las células hospederas puede incluir cualquier fuente de carbono adecuada para mantener la viabilidad o cultivar las células hospederas.
En algunas modalidades, la fuente de carbono es un carbohidrato (tal como monosacárido, disacárido, oligosacárido o polisacáridos) , azúcar invertido (por ejemplo, jarabe de sucrosa tratado enzimáticamente) , glicerol, glicerina (por ejemplo, un subproducto de glicerina de un proceso de fabricación de biodiesel o jabón) , dihidroxiacetona, fuente de un carbono, aceite (por ejemplo, un aceite de plantas o vegetal, tal como aceite de maíz, palma o soya), acetato, grasa animal, aceite animal, ácido graso (por ejemplo, un ácido graso saturado, ácido graso insaturado o ácido graso poliinsaturado) , lípido, fosfolípido, glicerolípido, monoglicérido, diglicérido, triglicérido, polipéptido (por ejemplo, una proteína o péptido microbiano o vegetal) , fuente de carbono renovable (por ejemplo, una fuente de carbono de biomasa tal como una fuente de carbono de biomasa hidrolizada) , extracto de levadura, componentes de un extracto de levadura, polímero, ácido, alcohol, aldehido, cetona, aminoácido, succinato, lactato, acetato, etanol o cualquier combinación de dos o más de los anteriores. En algunas modalidades, la fuente de carbono es un producto de fotosíntesis, incluyendo, pero no limitado a, glucosa. En alguna modalidad, el carbohidrato es xilosa o glucosa.
Los monosacáridos ejemplares incluyen glucosa y fructosa; oligosacáridos ejemplares incluyen lactosa y sucrosa, y polisacáridos ejemplares incluyen almidón y celulosa. Los carbohidratos ejemplares incluyen azúcares de C6 (por ejemplo, fructosa, mañosa, galactosa o glucosa) y azúcares de C5 (por ejemplo, xilosa o arabinosa) . En algunas modalidades, el medio celular incluye un carbohidrato así como una fuente de carbono que no es un carbohidrato (por ejemplo, glicerol, glicerina, dihidroxiacetona, fuente de un carbono, aceite, grasa animal, aceite animal, ácido graso, lípido, fosfolípido, glicerolípido, monoglicérido, diglicérido, triglicérido, fuente de carbono renovable o un componente de un extracto de levadura) . En algunas modalidades, el medio celular incluye un carbohidrato así como un polipéptido (por ejemplo, una proteína o péptido microbiano o vegetal) . En algunas modalidades, el polipéptido microbiano es un polipéptido de levadura o bacterias. En algunas modalidades, el polipéptido vegetal es un polipéptido de soya, maíz, cañóla, jatrofa, palma, cacahuate, girasol, coco, mostaza, colza, semilla de algodón, semilla de palma, oliva, cártamo, ajonjolí o linasa.
En algunas modalidades, la concentración del carbohidrato es de al menos de o aproximadamente 5 gramos por litro de caldo (g/L, en donde el volumen de caldo incluye tanto el volumen del medio celular comoel volumen de las células), tal como al menos o aproximadamente 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 300, 400 o más g/L. En algunas modalidades, la concentración del carbohidrato es de entre aproximadamente 50 y alrededor de 400 g/L, tal como entre aproximadamente 100 y alrededor de 360 g/L, entre alrededor de 120 y aproximadamente 360 g/L, o entre aproximadamente 200 y alrededor de 300 g/L. En algunas modalidades, esta concentración de carbohidrato incluye la cantidad total de carbohidrato que se añade antes y/o durante el cultivo de las células hospederas.
Los lípidos ejemplares son cualquier sustancia que contenga uno o más ácidos grasos que sean de C4 y ácidos grasos superiores que sean saturados, insaturados o ramificados .
Los aceites ejemplares son lípidos que son líquidos a temperatura ambiente. En algunas modalidades, el lípido contiene uno o más ácidos grasos de C4 o superiores (por ejemplo, contiene uno o más ácidos grasos saturados, insaturados o ramificados con cuatro o más carbonos) . En algunas modalidades, el aceite se obtiene de soya, maíz, cañóla, jatrofa, palma, cacahuate, girasol, coco, mostaza, colza, semilla de algodón, corteza de palma, oliva, cártamo, ajonjolí, linaza, células microbianas oleaginosas, sebo chino o cualquier combinación de dos o más de los anteriores.
Los ácidos grasos ejemplares incluyen compuestos de la fórmula RCOOH, en donde "R" es un hidrocarburo. Ácidos grasos insaturados ejemplares incluyen compuestos en los que "R" incluye al menos un doble enlace carbono- carbono . Los ácidos grasos insaturados ejemplares incluyen, pero no están limitados a, ácido oleico, ácido vaccénico, ácido linoleico, ácido palmitelaídico y ácido araquidónico . Los ácidos grasos poli insaturados ejemplares incluyen componentes en los que "R" incluye una pluralidad de dobles enlaces carbono-carbono . Los ácidos grasos saturados ejemplares incluyen compuestos en los que "R" es un grupo alifático saturado. En algunas modalidades, la fuente de carbono incluye uno o más ácidos grasos de C12-C22 , tales como un ácido graso saturado de C12, un ácido graso saturado de Ci4, un ácido graso saturado de Ci6, un ácido graso saturado de Ci8, un ácido graso saturado de C2o o un ácido graso saturado de C22¦ En una modalidad ejemplar, el ácido graso es ácido palmítico. En algunas modalidades, la fuente de carbono es una sal de un ácido graso (por ejemplo, un ácido graso insaturado) , un derivado de un ácido graso (por ejemplo, un ácido graso insaturado) o una sal de un derivado de ácido graso (por ejemplo, un ácido graso insaturado) . Las sales adecuadas incluyen, pero no están limitadas a, sales litio, sales potasio, sales sodio y similares. Di- y trigliceroles son ásteres de ácido graso de glicerol .
En algunas modalidades, la concentración del lípido, aceite, grasa, ácido graso, monoglicérido , diglicérido o triglicérido es de al menos de o aproximadamente 1 gramo por litro de caldo (g/L, en donde el volumen de caldo incluye tanto el volumen del medio celular como el volumen de las células) , tal como al menos o aproximadamente 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 300, 400 o más g/L. En algunas modalidades, la concentración de lípido, aceite, grasa, ácido graso, monoglicérido, diglicérido o triglicérido está entre alrededor de 10 y aproximadamente 400 g/L, tal como entre aproximadamente 25 y alrededor de 300 g/L, entre alrededor de 60 y aproximadamente 180 g/L, o entre aproximadamente 75 y alrededor de 150 g/L. En algunas modalidades, la concentración incluye la cantidad total del lípido, aceite, grasa, ácido graso, monoglicérido, diglicérido o triglicérido que se añade antes y/o durante el cultivo de las células hospederas. En algunas modalidades, la fuente de carbono incluye tanto (i) un lípido, aceite, grasa, ácido graso, monoglicérido, diglicérido o triglicérido como (ii) un carbohidrato, tal como glucosa. En algunas modalidades, la relación del lípido, aceite, grasa, ácido graso, monoglicérido, diglicérido o triglicérido al carbohidrato es de aproximadamente 1:1 sobre una base de carbono (es decir, un carbono en el lípido, aceite, grasa, ácido graso, monoglicérido, diglicérido o triglicérido por carbono de carbohidrato) . En algunas modalidades particulares, la cantidad de lípido, aceite, grasa, ácido graso, monoglicérido, diglicérido o triglicérido es de entre alrededor de 60 y 180 g/L, y la cantidad del carbohidrato es de entre alrededor de 120 y 360 g/L.
Las fuentes de carbono de polipéptidos microbianos ejemplares incluyen uno o más polipéptidos de levadura o bacterias. Las fuentes de carbono de polipéptidos vegetales ejemplares incluyen uno o más polipéptidos de soya, maíz, cañóla, jatrofa, palma, cacahuate, girasol, coco, mostaza, colza, semilla de algodón, corteza de palma, oliva, cártamo, ajonjolí o linaza.
Las fuentes de carbono renovables ejemplares incluyen permeado de suero de queso, licor agrio de maíz, melaza de remolacha de azúcar, malta de cebada y componentes de cualquiera de los anteriores. Las fuentes de carbono renovables ejemplares incluyen también acetato, glucosa, hexosa, pentosa y xilosa presentes en biomasa, tales como maíz, césped, caña de azúcar, residuos celulares de procesos de fermentación y subproductos de proteínas de la molienda de soya, maíz o trigo. En algunas modalidades, la fuente de carbono de biomasa es un material lignocelulósico, hemicelulósico o celulósico tal como, pero no limitado a, un césped, trigo, paja de trigo, bagazo, bagazo de caña de azúcar, pulpa de madera blanda, maíz, mazorca o cáscara de maíz, grano de maíz, fibra de granos de maíz, hojas y troncos de maíz, césped, producto de cáscara de arroz o un subproducto de la molienda en seco o en húmedo de granos (por ejemplo, maíz, sorgo, centeno, tritical, cebada, trigo y/o granos de destilería) . Los materiales celulósicos ejemplares incluyen residuos de madera, papel y pulpa, plantas herbáceas y pulpa de frutas. En algunas modalidades, la fuente de carbono incluye cualquier parte vegetal, tal como tallos, granos, raíces o tubérculos. En algunas modalidades, toda o parte de las siguientes plantas se usan como una fuente de carbono: maíz, trigo, centeno, sorgo, tritical, arroz, mijo, cebada, mandioca, legumbres tales como frijoles y chícharos, papas, boniatos, plátanos, caña de azúcar y/o tapioca. En algunas modalidades, la fuente de carbono es un hidrol izado de biomasa, tal como un hidrolizado de biomasa que incluye tanto xilosa como glucosa o que incluye tanto sucrosa como glucosa .
En algunas modalidades, la fuente de carbono renovable (tal como biomasa) es pre-tratada antes de que se añada al medio de cultivo de células. En algunas modalidades, el pre- tratamiento incluye pre- tratamiento enzimáico, pre-tratamiento químico o una combinación de pre-tratamiento tanto enzimático como químico (véase, por ejemplo, Farzaneh et al., Bioresource Technology 96 (18) .2014-2018, 2005; patente de E.U.A. No. 6,176,176; patente de E.U.A. No. 6,106,888; los cuales se incorporan cada uno en la presente a manera de referencia en sus totalidades, particularmente con respecto al pre-tratamiento de fuentes de carbono renovables) . En algunas modalidades, la fuente de carbono renovable es parcial o completamente hidrolizada antes de que se añada al medio de cultivo de células .
En algunas modalidades, la fuente de carbono renovable (tal como hojas y troncos de maíz) sufre expansión de fibras de amoniaco (AFEX) antes de que se añada al medio de cultivo de células (véase, por ejemplo, Farzaneh et al., Bioresource Technology 96 (18) : 2014-2018, 2005). Durante el pre-tratamiento AFEX, una fuente de carbono renovable se trata con amoniaco anhidro líquido a temperaturas moderadas (tal como aproximadamente 60 a alrededor de 100°C) y alta presión (tal como alrededor de 17.5 a aproximadamente 21 kg/cm2 (aproximadamente 250 a alrededor de 300 psi) durante aproximadamente 5 minutos. Luego, la presión se libera rápidamente. En este proceso, los efectos químicos y físicos combinados de la solubilización de lignina, hidrólisis de hemicelulosa , descristalización de celulosa y el área superficial incrementada hacen posible una conversión enzimática casi completa de celulosa y hemicelulosa en azúcares fermentables . El pre-tratamiento AFEX tiene la ventaja de que casi todo el amoniaco puede recuperarse y reutilizarse , mientras que el resto sirve como fuente de nitrógeno para microbios en procesos posteriores. Asimismo, un flujo de lavado no se requiere para el pre-tratamiento AFEX. De esta manera, la recuperación de materia seca después del tratamiento AFEX es esencialmente del 100%. AFEX es básicamente un proceso de seco a seco. La fuente de carbono renovable tratada es estable durante largos periodos y puede ser alimentada a cargas de sólidos muy altas en hidrólisis enzimática o procesos de fermentación. La celulosa y hemicelulosa se conservan bien en el proceso AFEX, con muy poca o ninguna degradación. No hay necesidad de neutralización antes de la hidrólisis enzimática de una fuente de carbono renovable que haya sufrido pre-tratamiento AFEX. La hidrólisis enzimática de fuentes de carbono tratadas con AFEX produce corrientes de azúcar limpias para uso de fermentación subsecuente.
En algunas modalidades, la concentración de la fuente de carbono (por ejemplo, una fuente de carbono renovable) es equivalente a por lo menos o aproximadamente 0.1, 0.5, 1, 1.5, 2, 3, 4, 5, 10, 15, 20, 30, 40 ó 50% de glucosa (p/v) . La cantidad equivalente de glucosa puede determinarse usando métodos de HPLC estándares con glucosa como una referencia para medir la cantidad de glucosa generada de la fuente de carbono. En algunas modalidades, la concentración de la fuente de carbono (por ejemplo, una fuente de carbono renovable) es equivalente a entre aproximadamente 0.1 y alrededor de 20% de glucosa, tal como entre alrededor de 0.1 y aproximadamente 10% de glucosa, entre alrededor de 0.5 y aproximadamente 10% de glucosa, entre alrededor de 1 y aproximadamente 10% de glucosa, entre alrededor de 1 y aproximadamente 5% de glucosa, o entre aproximadamente 1 y alrededor de 2% de glucosa.
En algunas modalidades, la fuente de carbono incluye extracto de levadura o uno o más componentes de extracto de levadura. En algunas modalidades, la concentración de extracto de levadura es de al menos 1 gramo de extracto de levadura por litro de caldo (g/L, en donde el volumen de caldo incluye tanto el volumen del medio celular como el volumen de las células) , tal como al menos o aproximadamente 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 150, 200, 300 o más g/L. En algunas modalidades, la concentración de extracto de levadura es de entre aproximadamente 1 y alrededor de 300 g/L, tal como entre aproximadamente 1 y alrededor de 200 g/L, entre alrededor de 5 y aproximadamente 200 g/L, entre aproximadamente 5 y alrededor de 100 g/L, o entre alrededor de 5 y aproximadamente 60 g/L. En algunas modalidades, la concentración incluye la cantidad total de extracto de levadura que se añade antes y/o durante el cultivo de las células hospederas. En algunas modalidades, la fuente de carbono incluye tanto extracto de levadura (o uno o más componentes del mismo) como otra fuente de carbono, tal como glucosa. En algunas modalidades, la relación de extracto de levadura a la otra fuente de carbono es de aproximadamente 1:5, alrededor de 1:10, o aproximadamente 1:20 (p/p) .
Adicionalmente la fuente de carbono también puede ser substratos de un carbono tales como dióxido de carbono o metanol . La producción de glicerol a partir de fuentes de un solo carbono (por ejemplo, metanol, formaldehido o formiato) se ha reportado en levaduras metilotróficas (Yamada et al., Agrie. Biol . Chem. 53(2) 541-543, 1989, el cual se incorpora en la presente a manera de referencia en su totalidad, particularmente con respecto a fuentes de carbono) y en bacterias (Hunter et al., Biochemistry, 24, 4148-4155, 1985, el cual se incorpora en la presente a manera de referencia en su totalidad, particularmente con respecto a fuentes de carbono) . Estos organismos pueden asimilar compuestos de un solo carbono, variando en estado de oxidación de metano a formiato, y produce el gicerol . La vía de asimilación de carbono puede ser a través de monofosfato de ribulosa, a través de serina o a través de monofosfato de xilulosa (Gottschalk, Bacterial Metabolism, segunda edición, Springer-Verlag; Nueva York, 1986, el cual se incorpora en. la presente a manera de referencia en su totalidad, particularmente con respecto a fuentes de carbono) . La vía de monofosfato de ribulosa incluye la condensación de formiato con ribulosa-5-fosfato para formar un azúcar de seis carbonos que se vuelve fructosa y eventualmente el producto de tres carbonos gliceraldehído-3 -fosfato . Asimismo, la vía de serina asimila el compuesto de un carbono en la vía glucolítica mediante tetrahidrofolato de metileno.
Además de los substratos de uno y de dos carbonos, los organismos metilotróficos también se sabe que utilizan un número de otros compuestos que contienen carbono tales como metilamina, glucosamina y una variedad de aminoácidos para la actividad metabólica. Por ejemplo, se sabe que las levaduras metilotróficas utilizan el carbono de metilamina para formar trihalosa o glicerol (Bellion et al., Microb. Growth Cl Compd. , [Int. Sym . ] , 7a edición, 415-32. Editores: Murell et al., Publisher: Intercept, Andover, Reino Unido, 1993, el cual se incorpora en la presente a manera de referencia en su totalidad, particularmente con respecto a fuentes de carbono) . Similarmente, varias especies de Candida metabolizan alanina o ácido oleico (Sulter et al., Arch. Microbiol . 153(5), 485-9, 1990, el cual se incorpora en la presente a manera de referencia en su totalidad, particularmente con respecto a fuentes de carbono) .
En algunas modalidades, las células se cultivan en un medio estándar que contiene sales fisiológicas y nutrientes (véase, por ejemplo, Pourquie, J. et al., Biochemistry and Genetics of Cellulose Degradation, eds . , Aubert et al . , Academic Préss, pág. 71-86, 1988 e limen et al., App. Environ. Microbiol . 63:1298-1306, 1-997, los cuales se incorporan cada uno en la presente a manera de referencia en sus totalidades, particularmente con respecto a medios de células) . Los medios de crecimiento ejemplares son medios preparados comercialmente comunes tales como caldo Luria Bertani (LB) , caldo de Dextrosa Sabouraud (SD) o caldo de medio de levadura (YM) . Otros medios de crecimiento definidos o sintéticos también pueden ser usados, y el medio adecuado para crecimiento de células hospederas particulares se conocen por alguien de capacidad en la técnica de microbiología o ciencia de fermentación.
Además de una fuente de carbono adecuada, el medio de células contiene deseablemente minerales, sales, cofactores, reguladores adecuados, y otros componentes que se conozcan por los expertos en la técnica como adecuados para el crecimiento de los cultivos o la mejora de la producción de isopreno (por ejemplo, véase WO 2004/033646 y referencias citadas ahí y WO 96/35796 y referencias citadas ahí, los cuales se incorporan cada uno en la presente a manera de referencia en sus totalidades, particularmente con respecto a medios celulares y condiciones de cultivo de células) . En algunas modalidades cuando un ácido nucleico de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI o MVA está bajo el control de un promotor inducible, el agente inductor (por ejemplo, un azúcar, una sal de metal o antimicrobiano) , se añade deseablemente al medio a una concentración efectiva para inducir la expresión de un polipéptido de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI y/o MVA. En algunas modalidades, medio celular tiene un antibiótico (tal como kanamicina) que corresponde al ácido nucleico de resistencia a antibióticos (tal como un ácido nucleico de resistencia a kanamicina) en un vector que tiene uno o más ácidos nucleicos de la vía de DXS, IDI o MVA.
Condiciones de cultivo de células ejemplares Los materiales y métodos adecuados para el mantenimiento y crecimiento de cultivos bacterianos se conocen bien en la técnica. Técnicas ejemplares pueden encontrarse en Manual of Methods for General Bacteriology Gerthardt et al . , eds) , American Society for Microbiology, Washington, D.C. (1994) o Brock en Biotechnology : A Textbook of Industrial Microbiology, segunda edición (1989), Sinauer Associates, Inc., Sunderland, MA, los cuales se incorporan cada uno en la presente a manera de referencia en sus totalidades, particularmente con respecto a técnicas en cultivo de células. En algunas modalidades, las células '"se cultivan en un medio de cultivo bajo condiciones que permitan la expresión de uno o más polipéptidos de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI o MVA codificados por un ácido nucleico insertado en las células hospederas.
Las condiciones de cultivo de células estándares pueden usarse para cultivar las células (véase, por ejemplo, WO 2004/033646 y referencias citadas ahí, los cuales se incorporan cada uno en la presente a manera de referencia en sus totalidades, particularmente con respecto a cultivo de células y condiciones de fermentación) . Las células se cultivan y se mantienen a una temperatura adecuada, mezcla de gas y pH (tal como alrededor de 20 a aproximadamente 37°C, alrededor de 6% a aproximadamente 84% de C02, y a un pH de entre alrededor de 5 a aproximadamente 9) . En algunas modalidades, las células se cultivan a 37 °C en un medio celular adecuado. En algunas modalidades, por ejemplo, los cultivos se hacen a alrededor de 28°C en un medio adecuado en cultivos de agitación o termentadores hasta que se logre la cantidad deseada de producción de isopreno. En algunas modalidades, las escalas de pH para la fermentación son de entre aproximadamente pH 5..0 a alrededor de pH 9.0 (tal como alrededor de 6.0 a aproximadamente pH 8.0 o aproximadamente 6.5 a alrededor de 7.0). Las reacciones se pueden llevar a cabo bajo condiciones aeróbicas, anóxicas o anaeróbicas con base en los requerimientos de las células hospederas. Las condiciones de cultivo ejemplares para un hongo filamentoso dado se conocen en la técnica y pueden encontrarse en la literatura científica y/o de la fuente de los hongos tales como la Colección Americana de Tipos de Cultivos y el Centro de Abastecimiento de Genética Fúngica.
En varias modalidades, las células se cultivan usando cualquier modo de fermentación conocido, tal como procesos intermitentes, de alimentación intermitente o continuos. En algunas modalidades, un método intermitente de fermentación es usado. La fermentación intermitente clásica es un sistema cerrado en donde la composición de los medios se pone al principio de la fermentación y no se somete a alteraciones artificiales durante la fermentación. De esta manera, al principio de la fermentación el medio celular es inoculado con las células hospederas deseadas y se permite que ocurra la fermentación añadiendo nada al sistema. Típicamente, sin embargo, la fermentación "intermitente" es intermitente con respecto a la adición de fuente de carbono comúnmente se hacen intentos para controlar factores tales como pH y concentración de oxígeno. En los sistemas intermitentes, las composiciones de metabolitos y biomasa del sistema cambian constantemente hasta que se detenga el tiempo de fermentación. Dentro de los cultivos intermitentes, las células moderan a través de una fase de retraso estática hasta una fase logarítmica de alto crecimiento y finalmente hasta una fase estacionaria en la que la velocidad de crecimiento se disminuye o se detiene. En algunas modalidades, las células en fase logarítmica son responsables del grueso de la producción de isopreno. En algunas modalidades, células en fase estacionaria producen isopreno.
En algunas modalidades, una variación del sistema intermitente estándar es usada, tal como el sistema de alimentación intermitente (Fed-Batch) . Los procesos de fermentación de alimentación intermitente comprenden un sistema intermitente típico con la excepción de que la fuente de carbono se añade a incrementos al progresar la fermentación. Los sistemas de alimentación intermitente son útiles cuando la represión de catabolitos es apta para inhibir el metabolismo de las células y cuando sea deseable tener cantidades limitadas de fuente de carbono en el medio celular. Las fermentaciones de alimentación intermitente pueden llevarse a cabo con la fuente de carbono (por ejemplo, glucosa) en una cantidad limitada o excesiva. La medición de la concentración de fuente de carbono real en los sistemas de alimentación intermitente es difícil y es por lo tanto sobre la base de los cambios de los factores mesurables tales como pH, oxígeno disuelto y la presión parcial de gases residuales tales como C02. Las fermentaciones intermitente y de alimentación intermitente son comunes y bien conocidas en la técnica y ejemplos pueden encontrarse en Brock, Biotechnology : A Texbook of Industrial Microbiology, segunda edición (1989) Sinauer Associates, Inc., el cual se incorpora en la presente a manera de referencia en su totalidad, particularmente con respecto a condiciones de cultivo y fermentación de células.
En algunas modalidades, se usan métodos de fermentación continuos. La fermentación continua es un sistema abierto en el que un medio de fermentación definido se añade continuamente a un biorreactor y una cantidad igual de medio acondicionado se retira simultáneamente para procesamiento. La fermentación continua generalmente mantiene a los cultivos a una densidad alta constante en donde las células están principalmente en crecimiento de fase logarítmica .
La fermentación continua permite la modulación de un factor o cualquier número de factores que afecten el crecimiento celular o producción de isopreno. Por ejemplo, un método mantiene un nutriente limitante tal como la fuente de carbono o nivel de nitrógeno a una velocidad fija y permite que todos los demás parámetros se moderen. En otros sistemas, un número de factores que afecta el crecimiento pueden alterarse continuamente mientras la concentración de células (por ejemplo, la concentración medida por turbidez del medio) se mantiene constante. Los sistemas continuos luchan por mantener condiciones de crecimiento en estado fijo. Así, la pérdida de células debido a que el medio se ha retirado se equilibra contra la velocidad de crecimiento de células en la fermentación. Los métodos para modular nutrientes y factores de crecimiento para procesos de fermentación continua así como técnicas para maximizar la velocidad de formación de producto se conocen bien en la técnica de microbiología industrial y una variedad de métodos son detallados por Brock, Biotechnology: A Textbook of Industrial Microbiology, segunda edición (1989) Sinauer Associates, Inc., el cual se incorporan en la presente a amanera de referencia en su totalidad, particularmente con respecto a condiciones de cultivo y fermentación de células.
En algunas modalidades, las células son inmovilizadas en un substrato como catalizadores celulares enteros y sometidos a condiciones de fermentación para la producción de isopreno.
En algunas modalidades, botellas de cultivo líquido se ponen en agitadores para introducir así oxígeno al líquido y mantener la uniformidad del cultivo. En algunas modalidades, se usa una incubadora para controlar la temperatura, humedad, velocidad de agitación y/u otras condiciones en las cuales se hagan cultivo. Las incubadoras más simples son cajas aisladas con un calentador adecuado, que típicamente llegan hasta ~65°C. Las incubadoras más elaboradas también pueden incluir la capacidad de reducir la temperatura (por medio de refrigeración) , o la capacidad de controlar la humedad o los niveles de C02. La mayoría de las incubadoras incluyen un temporizador; algunas también pueden programarse para establecer ciclos a través de diferentes temperaturas, niveles de humedad, etc. Las incubadoras pueden variar en tamaño para escritorio a unidades de tamaño de habitaciones pequeñas.
Si se desea, una porción o todo el medio de células puede ser cambiado para reabastecer nutrientes y/o evitar la acumulación de subproductos metabólicos potencialmente dañinos y células muertas. En el caso de cultivos en suspensión, las células pueden ser separadas del medio al centrifugar o filtrar el cultivo de suspensión y luego resuspendiendo las células en medio fresco. En el caso de cultivos adherentes, el medio puede ser removido directamente mediante aspiración y reemplazado. En algunas modalidades, el medio celular permite que al menos una porción de las células se dividan durante por lo menos o aproximadamente 5, 10, 20, 40, 50, 60, 65, o más divisiones celulares en un cultivo continuo (tal como un cultivo continuo sin dilución) .
En algunas modalidades, se usa un promotor constitutivo o con fugas (tal como un promotor Trc) y un compuesto (tal como IPTG) no se añade para inducir la expresión de los ácidos nucleicos de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI o MVA enlazados operablemente al promotor. En algunas modalidades, un compuesto (tal como IPTG) se añade para inducir la expresión de los ácidos nucleicos de la vía de isopreno sintasa, DXS, IDI o MVA enlazados operablemente al promotor.
Producción de isopreno ejemplar En algunas modalidades, las células se cultivan en un medio de cultivo bajo condiciones que permitan la producción de isopreno por las células. Por "productividad absoluta máxima" se intenta decir la cantidad absoluta máxima de isopreno en el gas de evolución durante el cultivo de células durante un periodo de tiempo particular (por ejemplo, el cultivo de células durante una corrida de fermentación particular) . Por "punto de tiempo de productividad absoluta máxima" se intenta decir el punto de tiempo durante una corrida de fermentación cuando una cantidad absoluta de isopreno en el gas de evolución está a un máximo durante el cultivo de células durante un periodo de tiempo particular (por ejemplo, el cultivo de células durante una corrida de fermentación particular) . En algunas modalidades, la cantidad de isopreno se mide en el punto de tiempo de productividad absoluta máxima. En algunas modalidades, la productividad absoluta máxima para las células es aproximadamente cualquiera de las cantidades de isopreno descritas en la presente.
Por "productividad específica máxima" se intenta decir la cantidad máxima de isopreno producida por célula durante el cultivo de células durante un periodo de tiempo particular (por ejemplo, el cultivo de células durante una corrida de fermentación particular) . Por "punto de tiempo de productividad específica máxima" se intenta decir el punto de tiempo durante el cultivo de células durante un periodo de tiempo particular (por ejemplo, el cultivo de células durante una corrida de fermentación particular) cuando la cantidad de isopreno producida por célula está a un máximo. La productividad específica máxima se determina al dividir la productividad total entre la cantidad de células, según se determina por densidad óptica a 600 nm (ODgoo) · En algunas modalidades, la cantidad de isopreno se mide en el punto de tiempo de productividad específica máxima. En algunas modalidades, la productividad específica máxima para las células es de aproximadamente cualquiera de las cantidades de isopreno por célula descritas en la presente.
Por "productividad volumétrica máxima" se intenta decir la cantidad máxima de isopreno producida por volumen de caldo (incluyendo el volumen de las células y el medio de células) durante el cultivo de células durante un periodo de tiempo particular (por ejemplo, el cultivo de células durante una corrida de fermentación particular) . Por "punto de tiempo de productividad volumétrica específica máxima" se intenta decir el punto de tiempo durante el cultivo de células durante un periodo de tiempo particular (por ejemplo, el cultivo de células durante una corrida de fermentación particular) cuando la cantidad de isopreno producida por volumen de caldo está a un máximo. La productividad volumétrica específica máxima se determina al dividir la productividad total entre el volumen de caldo y cantidad de tiempo. En algunas modalidades, la cantidad de isopreno se mide en el punto de tiempo de productividad volumétrica específica máxima. En algunas modalidades, la productividad volumétrica específica máxima para las células es aproximadamente cualquiera de las cantidades de isopreno por volumen por tiempo descritas en la presente.
Por "concentración máxima" se intenta decir la cantidad máxima de isopreno producida durante el cultivo de células durante un periodo de tiempo particular (por ejemplo, el cultivo de células durante una corrida de fermentación particular) . Por "punto de tiempo de concentración máxima" se intenta decir el punto de tiempo durante el cultivo de células durante un periodo de tiempo particular (por ejemplo, el cultivo de células durante una corrida de fermentación particular) cuando la cantidad de isopreno producida por célula está a un máximo. En algunas modalidades, la cantidad de isopreno se mide en el punto de tiempo de concentración máxima. En algunas modalidades, la concentración máxima para las células es aproximadamente cualquiera de las cantidades de isopreno descritas en la presente.
Por "productividad volumétrica promedio" se intenta decir la cantidad promedio de isopreno producida por volumen de caldo (incluyendo el volumen de las células y el medio celular) durante el cultivo de células durante un periodo de tiempo particular (por ejemplo, el cultivo de células durante una corrida de fermentación particular) . La productividad volumétrica promedio se determina al dividir la productividad total entre el volumen de caldo y cantidad de tiempo. En algunas modalidades, la productividad volumétrica específica promedio para las células es aproximadamente cualquiera de las cantidades de isopreno por volumen por tiempo descritas en la presente.
Por "productividad total acumulativa" se intenta decir la cantidad total acumulativa de isopreno producida durante el cultivo de células durante un periodo de tiempo particular (por ejemplo, el cultivo de células durante una corrida de fermentación particular). En algunas modalidades, la cantidad total acumulativa de isopreno se mide. En algunas modalidades, la productividad total acumulativa para las células es aproximadamente cualquiera de las cantidades de isopreno descritas en la presente.
En algunas modalidades, las células en cultivo producen isopreno a más de o aproximadamente 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 5,000, 10,000, 12,500, 20,000, 30,000, 40,000, 50,000, 75,000, 100,000, 125,000, 150,000, 188,000, o más nmoles de isopreno/gramo de células para el peso en húmedo de las células/hora (nmoles/gwcm/hr) . En algunas modalidades, la cantidad de isopreno es de entre aproximadamente 2 a alrededor de 200,000 nmoles/gwcm/hr , tal como entre alrededor de 2 a aproximadamente 100 nmoles/gwcm/hr, alrededor de 100 a aproximadamente 500 nmoles/gwcm/hr, alrededor de 150 a aproximadamente 500 nmoles/gWcm/hr, alrededor de 500 a aproximadamente 1,000 nmoles/gwcm/h , alrededor de 1,000 a aproximadamente 2,000 nmoles/gwcm/hr, alrededor de 2,000 a aproximadamente 5,000 nmoles/gWCm/hr, alrededor de 5,000 a aproximadamente 10,000 nmoles/gwcm/hr, alrededor de 10,000 a aproximadamente 50,000 nmoles/gwcm/hr, alrededor de 50,000 a aproximadamente 100,000 nmoles/gwcm/hr, alrededor de 100,000 a aproximadamente 150,000 nmoles/gwcm/h , alrededor de 150,000 a aproximadamente 200,000 nmoles/gwcm/hr . En algunas modalidades, la cantidad de isopreno es de entre aproximadamente 20 a alrededor de 200,000 nmoles/gwcm/hr aproximadamente 100 a alrededor de 5, 000 nmoles/gwcm/hr aproximadamente 200 a alrededor de 2 , 000 nmoles/gwcra/hr aproximadamente 200 a alrededor de 1,000 nmoles/gwcm/hr aproximadamente 300 a alrededor de 1, 000 nmoles/gwcm/hr alrededor de 400 a aproximadamente 1,000 nmoles/gwcm/hr alrededor de 1, 000 a aproximadamente 5, 000 nmoles/gwcm/hr aproximadamente 2, 000 a alrededor de 20 , 000 nmoles/gwcm/hr aproximadamente 5,000 a alrededor de 50,000 nmoles/gwcm/hr aproximadamente 10,000 a alrededor de 100 , 000. _nmo.les/gwcm/h , aproximadamente 20,000 a alrededor de 150:/ 000 nmoles/gwcm/hr o aproximadamente 20,000 a alrededor de 200,000 nmoles/gwcm/hr .
La cantidad de isopreno en unidades de nmoles/gwcm/hr se puede medir como se describe en la patente de Estados Unidos 5,849,970, la cual se incorpora en la presente a manera de referencia en su totalidad, particularmente con respecto a la medición de producción de isopreno. Por ejemplo, 2 mL de espacio superior (por ejemplo, el espacio superior de un cultivo tal como 2 mL de cultivo hecho en tubos sellados a 32°C con agitación a 200 rpm durante aproximadamente 3 horas) se analizan para isopreno usando un sistema de cromatografía de gases estándar, tal como sistema operado isotérmicamente (85°C) con una columna de n-octano/porasil C (Alltech Associates, Inc., Deerfield, III.) y acoplada a un detector de gas de reducción de óxido mercúrico RGD2 (Trace Analytical, enlo Park, CA) (véase, por ejemplo, Greenberg et al., Atmos . Environ. 27A: 2689-2692, 1993; Silver et al., Plant Physiol . 97:1588-1591, 1991, los cuales se incorporan cada uno en la presente a manera de referencia en sus totalidades, particularmente con respecto a la medición de producción de isopreno) . Las unidades de área de la cromatografía de gases se convierten en nmoles de isopreno por medio de una curva de calibración de concentración de isopreno estándar. En algunas modalidades, el valor para los gramos de células para el peso en húmedo de las células se calcula al obtener el valor A6oo para una muestra del cultivo de células, y luego convirtiendo el valor A60o en gramos de células con base en una curva de calibración de los pesos en húmedo para cultivos de células con un valor A&0o conocido. En algunas modalidades, los gramos de las células se estiman al asumir que un litro de caldo (incluyendo medio de células y células) con un valor A6oo de 1 tiene un peso de célula en húmedo de 1 gramo. El valor se divide también entre el número de horas en que el cultivo ha sido incubado, tal como tres horas.
En algunas modalidades, las células en cultivo producen isopreno a más de o aproximadamente 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 5,000, 10,000, 100,000, o más ng de isopreno/gramo de las células para el peso en húmedo de las células/hr (ng/gwcm/h) . En algunas modalidades, la cantidad de isopreno es de entre aproximadamente 2 a alrededor de 5,000 ng/gwcm/h, tal como entre aproximadamente 2 a alrededor de 100 ng/gwcra/h, aproximadamente 100 a alrededor de 500 ng/gwcm/h, aproximadamente 500 a alrededor de 1,000 ng/gwcm/h, aproximadamente 1,000 a alrededor de 2,000 ng/gwcm/h, o aproximadamente 2,000 a alrededor de 5,000 ng/gwcm/h. En algunas modalidades, la cantidad de isopreno es de entre alrededor de 20 a aproximadamente 5,000 ng/gwcm/h, alrededor de 100 a aproximadamente 5,000 ng/gwcm/h, alrededor de 200 a aproximadamente 2,000 ng/gwcm/h, alrededor de 200 a aproximadamente 1,000 ng/gwcm/h, alrededor de 300 a aproximadamente 1,000 ng/gwcm/h, o alrededor de 400 a aproximadamente 1,000 ng/gwcm/h. La cantidad de isopreno en ng/gwcm/h se puede calcular al multiplicar el valor para la producción de isopreno en las unidades de nmoles/gwcm/hr descritas arriba por 68.1 (como se describe en la ecuación 5 abajo) .
En algunas modalidades, las células en cultivo producen un título acumulativo (cantidad total) de isopreno a más de o aproximadamente 1, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1,250, 1,500, 1,750, 2,000, 2,500, 3,000, 4,000, 5,000, 10,000, 50,000, 100,000, o más mg de isopreno/L de caldo (mg/Lcaido/ en donde el volumen de caldo incluye el volumen de las células y el medio celular) . En algunas modalidades, la cantidad de isopreno es de entre aproximadamente 2 a alrededor de 5,000 mg/Lcaid0, tal como entre aproximadamente 2 a alrededor de 100 mg/LCaido, aproximadamente 100 a alrededor de 500 mg/Lcaido# aproximadamente 500 a alrededor de 1,000 mg/Lcaid0, aproximadamente 1,000 a alrededor de 2,000 mg/Lcaido/ o aproximadamente 2,000 a alrededor de 5,000 mg/Lcaido- En algunas modalidades, la cantidad de isopreno es de entre aproximadamente 20 a alrededor de 5,000 mg/Lcaido, aproximadamente 100 a alrededor de 5,000 mg/Lcaido, alrededor de 200 a aproximadamente 2,000 mg/Lcaido, alrededor de 200 a aproximadamente 1,000 mg/Lcaido, alrededor de 300 a aproximadamente 1,000 mg/Lcaido, o alrededor de 400 a aproximadamente 1, 000 mg/Lcaido.
La productividad específica de isopreno en mg de isopreno/L de espacio superior del matraz de agitación o cultivos similares puede medirse al tomar una muestra de 1 mi de cultivo de células a un valor OD60o de aproximadamente 1.0, poniéndolo en un tubo de 20 mL, incubando durante 30 minutos y luego midiendo la cantidad de isopreno en el espacio superior (como se describe, por ejemplo, en el ejemplo I, parte II) . Si el valor OD600 no es 1.0, entonces la medición puede normalizarse a un valor OD60o de 1.0 al dividir entre el valor OD60o- El valor de mg de isopreno/L de espacio superior puede convertirse en mg/Lcaido/hr/OD60o de caldo de cultivo al multiplicar por un factor de 38. El valor en unidades de mg/Lcaido/-r/OD60o puede multiplicarse por el número de horas y el valor OD60o para obtener el título acumulativo en unidades de mg de isopreno/L de caldo.
En algunas modalidades, las células en cultivo tienen una productividad volumétrica promedio de isopreno a más de o aproximadamente 0.1, 1.0, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1100, 1200, 1300, 1,400, 1,500, 1,600, 1,700, 1,800, 1,900, 2,000, 2,100, 2,200, 2,300, 2,400, 2,500, 2,600, 2,700, 2,800, 2,900, 3,000, 3,100, 3,200, 3,300, 3,400, 3,500, o más mg de isopreno/L de caldo/hr (mg/Lcaido/hr, en donde el volumen de caldo incluye el volumen de las células y el medio celular) . En algunas modalidades, la productividad volumétrica promedio de isopreno es de entre aproximadamente 0.1 a alrededor de 3,500 mg/Lcaido/hr, tal como entre alrededor de 0.1 a aproximadamente 100 mg/Lcald0/hr, alrededor de 100 a aproximadamente 500 mg/Lcaido/hr, alrededor de 500 a aproximadamente 1,000 mg/Lcaido/hr, alrededor de 1,000 a aproximadamente 1,500 mg/Lcaido/hr, alrededor de 1,500 a aproximadamente 2, 000 mg/Lcaido/hr, alrededor de 2, 000 a aproximadamente 2, 500 mg/Lcaido/hr, alrededor de 2 , 500 a aproximadamente 3,000 mg/Lcaido/hr, o alrededor de 3, 000 a aproximadamente 3,500 mg/Lcaido/hr . En algunas modalidades, la productividad volumétrica promedio de isopreno es de entre aproximadamente 10 a alrededor de 3 , 500 mg/Lcaido/hr aproximadamente 100 a alrededor de 3 , 500 mg/Lcaido/hr aproximadamente 200 a alrededor de 1, 000 mg/Lcaldo/hr aproximadamente 200 a alrededor de 1, 500 mg/LCaido/hr aproximadamente 1,000 a alrededor de 3 , 000 mg/Lcaido/hr, aproximadamente 1,500 a alrededor de 3,000 mg/Lcaido/hr .
En algunas modalidades, las células en cultivo tienen una productividad volumétrica máxima de isopreno a más de o aproximadamente 0.5, 1.0, 10, 25, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000, 1100, 1200, 1300, 1,400, 1,500, 1,600, 1,700, 1,800, 1,900, 2,000, 2,100, 2,200, 2 , 300, 2,400, 2 , 500, 2, 600, 2,700, 2,800, 2, 900, 3,000, 3, 100, 3,200, 3,300, 3,400, 3,500, 3, 750, 4, 000, 4, 250, 4,500, 4,750, 5,000, 5,250, 5,500, 5, 750, 6, 000, 6 , 250, 6, 500, 6, 750, 7,000, 7, 250, 7,500, 7,750, 8, 000, 8,250, 8,500, 8, 750, 9,000, 9,250, 9,500, 9,750, 10, 000, 12,500, 15,000, o más mg de isopreno/L de caldo/hr (mg/LCaido/hr, en donde el volumen de caldo incluye el volumen de las células y el medio celular) . En algunas modalidades, la productividad volumétrica máxima de isopreno es de entre aproximadamente 0.5 a alrededor de 15,000 mg/Lcaido/hr, tal como entre aproximadamente 0.5 a alrededor de 10 mg/Lcaido/hr/ aproximadamente 1.0 a alrededor de 100 mg/LCaido/hr, aproximadamente 100 a alrededor de 500 mg/LCaido/hr, aproximadamente 500 a alrededor de 1, 000 mg/LCaido/hr, aproximadamente 1, 000 a alrededor de 1,500 mg/LCaido/hr, aproximadamente 1, 500 a alrededor de 2 , 000 mg/LCaido/hr, aproximadamente 2, 000 a alrededor de 2,500 mg/Lcaido/hr, aproximadamente 2, 500 a alrededor de 3, 000 mg/LCaido/hr, aproximadamente 3 , 000 a alrededor de 3 , 500 mg/Lcaido/hr, aproximadamente 3, 500 a alrededor de 5,000 mg/LCaido/hr, aproximadamente 5, 000 a alrededor de 7, 500 mg/Lcaido/hr, aproximadamente 7, 500 a alrededor de 10, 000 mg/LCaido/hr, aproximadamente 10,000 a alrededor de 12,500 mg/Lcaido/hr, o aproximadamente 12,500 a alrededor de 15,000 mg/Lcaido/hr . En algunas modalidades, la productividad volumétrica máxima de isopreno es de entre aproximadamente 10 a alrededor de 15,000 mg/Lcaido/hr, aproximadamente 100 a alrededor de 2,500 mg/Lcaido/hr, aproximadamente 1,000 a alrededor de 5,000 mg/Lcaido/hr, aproximadamente 2,500 a alrededor de 7,500 mg/Lcaido/hr, aproximadamente 5,000 a alrededor de 10,000 mg/Lcaido/hr, aproximadamente 7,500 a alrededor de 12,500 mg/Lcaido/hr, o aproximadamente 10,000 a alrededor de 15,000 mg/ Lcaido/hr .
La velocidad de producción de isopreno instantánea en mg/LCaido/hr en un termentador puede medirse al tomar una muestra del gas de evolución del termentador, analizándola para la cantidad de isopreno (en unidades tales como mg de isopreno por Lgas) como se describe, por ejemplo, en el ejemplo I, parte II y multiplicando este valor por la velocidad a la cual el gas de evolución es pasado a través de cada litro de caldo (por ejemplo, a 1 wm (volumen de aire/volumen de caldo/minuto) esto es 60 Lgas por hora) . Así, un nivel de gas de evolución de 1 mg/Lgas corresponde a una velocidad de producción instantánea de 60 mg/Lcaido/hr a un flujo de aire de 1 wm. Si se desea, el valor en las unidades mg/Lcaido/hr puede dividirse entre el valor OD60o para obtener la velocidad específica en unidades de mg/LcaidO/hr/0D .
El valor promedio de mg de isopreno/Lgas puede convertirse en la productividad de producto total (gramo de isopreno por litro de caldo de fermentación, mg/Lcaido ) al multiplicar esta concentración de isoopreno de gas de evolución promedio por la cantidad total de gas de evolución burbujeada por litro de caldo de fermentación durante la fermentación. Así, una concentración de isopreno de gas de evolución promedio de 0.5 mg/ Lcaido/hr durante 10 horas a 1 wm corresponde a una concentración de producto total de 300 mg de isopreno/Lcaido · En algunas modalidades, las células en cultivo convierten más de o aproximadamente 0.0015, 0 .002, 0 .005, 0.01, 0.02, 0.05 , 0.1, 0.12, 0 .14, 0. 16, 0 • 2, 0. 3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0 • 8, 0. 9, 1.0, 1.2, 1.4, 1 .6, 2. 0, 2. 2, 2.4, 2.6, 3.0, 4.0, 5 • 0, 6. , 0, 7.0, 8.0, 9.0, 10.0, 11. .0, 12.0, 13.0, 14.0, 15.0, 16. .0, 17.0, 18.0, 19.0, 20.0, 21 • 0, 22.0, 23.0, 23.2, 23.4, 23. .6, 23.8, 24.0, 25.0, 30.0, 31 • 0, 32.0, 33.0, 35.0, 37.5, 40. .0, 45.0, 47.5, 50.0, 55.0, 60 .0, 65.0, 70.0, 75.0, 80.0, 85 • 0, o 90.0% molar del carbono en el medio de cultivo de células en isopreno. En algunas modalidades, la conversión porcentual de carbono en isopreno es de entre aproximadamente 0.002 a alrededor de 90.0% molar, tal como aproximadamente 0.002 a alrededor de 0.005%, aproximadamente 0.005 a alrededor de 0.01%, aproximadamente 0.01 a alrededor de 0.05%, aproximadamente 0.05 a alrededor de 0.15%, 0.15 a alrededor de 0.2%, aproximadamente 0.2 a alrededor 0.3%, aproximadamente 0.3 a alrededor de 0.5%, aproximadamente 0.5 a alrededor de 0.8%, aproximadamente 0.8 a alrededor de 1.0%, aproximadamente 1.0 a alrededor 1.6%, aproximadamente 1.6 a alrededor de 3.0%, aproximadamente 3.0 a alrededor de 5.0%, aproximadamente 5.0 a alrededor de 8.0%, aproximadamente 8.0 a alrededor de 10.0%, aproximadamente 10.0 a alrededor de 15.0%, aproximadamente 15.0 a alrededor de 20.0%, aproximadamente 20.0 a alrededor de 25.0%, aproximadamente 25. .0% a 30.0%, aproximadamente 30.0% a 35.0% , alrededor de 35. .0% a 40.0%, aproximadamente 45.0% a 50.0% , alrededor de 50. .0% a 55.0%, aproximadamente 55.0% a 60.0% , alrededor de 60. .0% a 65.0%, aproximadamente 65.0% a 70.0% , alrededor de 75 , .0% a 80.0%, aproximadamente 80.0% a 85.0%, o alrededor de 85 .0% a 90.0% En algunas modalidades , la conversión porcentual de carbono en isopreno es de aproximadamente 0.002 a alrededor de 0.4% molar, 0.002 a alrededor de 0.16% molar, 0.04 a aproximadamente 0.16% molar, alrededor de 0.005 a aproximadamente 0.3% molar, aproximadamente 0.01 a alrededor de 0.3% molar, aproximadamente 0.05 a alrededor de 0.3% molar, aproximadamente 0.1 a 0.3% molar, alrededor de 0.3 a aproximadamente 1.0% molar, alrededor de 1.0 a aproximadamente 5.0% molar, alrededor de 2 a aproximadamente 5.0% molar, alrededor de 5.0 a aproximadamente 10.0% molar, alrededor de 7 a aproximadamente 10.0% molar, alrededor de 10.0 a aproximadamente 20.0% molar, alrededor de 12 a aproximadamente 20.0% molar, alrededor de 16 a aproximadamente 20.0% molar, alrededor de 18 a aproximadamente 20.0% molar, alrededor de 18 a 23.2% molar, aproximadamente 18 a 23.6% molar, alrededor de 18 a aproximadamente 23.8% molar, aproximadamente 18 a alrededor de 24.0% molar, aproximadamente 18 a alrededor de 25.0% molar, aproximadamente 20 a alrededor de 30.0% molar, aproximadamente 30 a alrededor de 40. .0% molar, aproximadamente 30 a alrededor de 50. .0% molar, aproximadamente 30 a alrededor de 60. .0% molar, aproximadamente 30 a alrededor de 70. .0% molar, aproximadamente 30 a alrededor de 80. .0% molar, o aproximadamente alrededor de 30 a aproximadamente 90.0% molar.
La conversión porcentual de carbono en isopreno (conocida también como "% de rendimiento de carbono") puede medirse al dividir las moles de carbono en el isopreno producido entre las moles de carbono en la fuente de carbono (tales como las moles de carbono en glucosa y extracto de levadura or lotes y de alimentados) . Este número se multiplica por 100% para dar un valor porcentual (como se indica en la ecuación 1) .
Ecuación 1 moles de carbono en isopreno producido Rendimiento de Carbono = (moles de carbono en fuente de carbono) x 100 Para este cálculo, se puede asumir que el extracto de levadura contiene 50% p/p de carbono. Como un ejemplo, para los 500 litros descritos en el ejemplo 7, parte VIII, la conversión porcentual de carbono en isopreno puede calcularse como se muestra en la ecuación 2.
Ecuación 2 „ „ ,„ , 39.1g isopreno x \lf&.\mollg x 5 CImol % Rend. Carbono = [(181,221 g glucosa x 1/180 mol/g x 6 CImol) + (17,780 g ext. levadura x 0.5 x 1/12 mol/g)] x 100 = 0.042% Para las dos fermentaciones de 500 litros descritas en la presente (ejemplo 7, partes VII y VIII) , la conversión porcentual de carbono en isopreno fue de entre 0.04-0.06%. Un rendimiento de carbono de 0.11-0.16% ha sido logrado usando sistema de 14 litros como los descritos en la presente .
Un experto en la técnica puede convertir fácilmente las velocidades de producción de isopreno o la cantidad de isopreno producida en cualquier otra unidad. Ecuaciones ejemplares se listan abajo para interconvertir entre unidades .
Unidades para la velocidad de producción de isopreno (totales y específicas) Ecuación 3 1 g de isopreno/Lcaldo/hr = 14.7 mmoles de isopreno/Lcaido/hr (velocidad volumétrica total) Ecuación 4 1 nraol de isopreno/gwcm/hr = 1 nmoles de isopreno/Lcaido/hr/OD60o (Esta conversión asume que un litro de caldo con un valor de OD6oo de 1 tiene un peso de célula en húmedo de 1 gramo) Ecuación 5 1 nmol de isopreno/gwcm/hr = 68.1 ng de isopreno/gwcm/hr (dado el peso molecular de isopreno) Ecuación 6 1 nmol de isopreno/Lgas02/hr = 90 nmoles de isopreno/Lcaido/hr (a una velocidad de flujo de 02 de 90 L/hr por L de caldo de cultivo) Ecuación 7 1 ug de isopreno/Lgasisopreno en gas de evolución = 60 ug de isopreno/Lcaido/hr a una velocidad de flujo de 60 Lgas por Lcaido (1 wm) Unidades para titulación (totales y específicas) Ecuación 8 1 nmol de isopreno/mg de proteína celular = 150 nmoles de isopreno/Lcaido/OD6oo (esta conversión asume que un litro de caldo con un valor de OD60o de 1 tiene una proteína celular total de alrededor de 150 mg) (productividad específica) .
Ecuación 9 1 g de isopreno/Lcaido = 14.7 mmoles de iso reno/Lcaido (título total) Si se desea, la ecuación 10 se puede usar para convertir cualquiera de las unidades que incluyan el peso en número de las células en las unidades correspondientes que incluyan el peso en seco de las células.
Ecuación 10 Peso en seco de células = (peso en húmedo de células) /3.3 En algunas modalidades abarcadas por la invención, una célula que comprende un ácido nucleico heterologo que codifica para un polipéptido de isopreno sintasa produce una cantidad de isopreno que es al menos o alrededor de 2 veces, 3 veces, 5 veces, 10 veces, 25 veces, 50 veces, 100 veces, 150 veces, 200 veces, 400 veces o mayor que la cantidad de isopreno producida a partir de una célula correspondiente cultivada esencialmente bajo las mismas condiciones sin el ácido nucleico heterologo que codifica para el polipéptido de isopreno sintasa.
En algunas modalidades abarcadas por la invención, una célula que comprende un ácido nucleico heterologo que codifica para un polipéptido de isopreno sintasa y uno o más ácidos nucleicos heterólogos que codifican para un polipéptido de la vía DXS, IDI y/o MVA produce una cantidad de isopreno que es al menos aproximadamente 2 veces, 3 veces, 5 veces, 10 veces, 25 veces, 50 veces, 100 veces, 150 veces, 200 veces, 400 veces, o mayor que la cantidad de isopreno producida a partir de una célula correspondiente cultivada esencialmente bajo las mismas condiciones sin los ácidos nucleicos heterólogos.
Métodos de purificación de isopreno ejemplares En algunas modalidades, cualquiera de los métodos descritos en la presente incluyen además recuperar el isopreno. Por ejemplo, el isopreno producido usando las composiciones y métodos de la invención puede recuperarse usando técnicas estándares, tales como evaporación de gas, fraccionado, adsorción/desorción, pervaporación, desorción térmica o al vacío de isopreno a partir de una fase sólida, o extracción de isopreno inmovilizado o absorbido a una fase sólida con un solvente (véase, por ejemplo, patente de Estados Unidos 4,703,007 y patente de Estados Unidos 4,570,029, las cuales se incorporan cada una en la presente a manera de referencia en sus totalidades, particularmente con respecto a los métodos de recuperación y purificación de isopreno) . En algunas modalidades, la recuperación de isopreno indica el aislamiento de isopreno en una forma líquida (tal como una solución concentrada de isopreno o una solución de isopreno en un solvente) . La evaporación de gas incluye la remoción de vapor de isopreno a partir de la corriente de gas de escape de fermentación de una manera continua. Esta remoción se puede lograr en varias formas diferentes incluyendo, pero no limitadas a, adsorción a una fase sólida, división en una fase líquida, o condensación directa. En algunas modalidades, el enriquecimiento de membrana de una corriente de vapor de isopreno diluida por arriba del punto de condensación del vapor se traduce en la condensación de isopreno líquido.
La recuperación de isopreno puede implicar una etapa o varias etapas. En algunas modalidades, la remoción de vapor de isopreno del gas de escape de fermentación y la conversión de isopreno en una fase líquida se llevan a cabo simultáneamente. Por ejemplo, el isopreno puede recondensarse directamente a partir de la corriente de gas de escape para formar un líquido. En algunas modalidades, la remoción de vapor de isopreno del gas de escape de fermentación y ' la conversión de isopreno en una fase líquida se llevan a cabo secuencialmente . Por ejemplo, isopreno puede ser adsorbido a una fase sólida y luego extraído de la fase sólida con un solvente.
En algunas modalidades, cualquiera de los métodos descritos en la presente incluye además purificar el isopreno. Por ejemplo, el isopreno producido usando las composiciones y métodos de la invención se puede purificar usando técnicas estándares. Purificación se refiere a un proceso a través del cual isopreno se separa de uno o más componentes que están presentes cuando el isopreno se produce. En algunas modalidades, el isopreno se obtiene como un líquido sustancialmente puro. Ejemplos de métodos de purificación incluyen: (i) destilación a partir de una solución en un extractor líquido y (ii) cromatografía. Según se usa en la presente, "isopreno purificado" significa isopreno que ha sido separado de uno o más componentes que están presentes cuando el isopreno es producido. En algunas modalidades, el isopreno está al menos aproximadamente 20%, en peso, libre de otros componentes que están presentes cuando el isopreno se produce. En varias modalidades, el isopreno está por lo menos o alrededor de 25%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 95% o 99%, en peso, puro. La pureza puede ensayarse mediante cualquier método adecuado, por ejemplo, mediante cromatografía en columna, análisis HPLC o análisis GC-MS.
En algunas modalidades, cualquiera de los métodos descritos en la presente incluye además polimerizar el isopreno. Por ejemplo, métodos estándares pueden usarse para polimerizar el isopreno purificado para formar cis-poliisopreno u otros productos descendentes usando métodos estándares .
Métodos y composiciones adicionales se describen en la solicitud de patente de Estados Unidos provisional No. 61/097,186, presentada el 15 de septiembre de 2008, solicitud de patente provisional de Estados Unidos No. 61/097,189, presentada el 15 de septiembre de 2008, solicitud de patente provisional de Estados Unidos No. 61/097,163, presentada el 15 de septiembre de 2008 y solicitud de patente de Estados Unidos No. de serie 12/335,071 todas las cuales se incorporan a manera de referencia en sus totalidades, particularmente con respecto a composiciones y métodos para producir isopreno .
El isopreno de esta invención puede polimerizarse en polímeros útiles, incluyendo caucho sintético, utilizando las mismas técnicas que son aplicables a isopreno que se deriva de fuentes petroquímicas. La polimerización y recuperación de estos polímeros que contienen isopreno se llevan a cabo adecuadamente de acuerdo con varios métodos adecuados para los procesos de polimerización de monómeros de dienos . Esto incluye operaciones intermitentes, semi-continuas o continuas bajo condiciones que excluyan aire y otras impurezas atmosféricas, particularmente oxígeno y humedad. La polimerización del monómero de isopreno también se puede llevar a cabo en un número de sistemas reactores de polimerización diferentes, incluyendo pero no limitados a sistemas de polimerización a granel, polimerización en fase de vapor, polimerización en solución, polimerización en suspensión, polimerización en emulsión y polimerización por precipitación. Los métodos de polimerización comercialmente preferidos son típicamente polimerización en solución y polimerización en emulsión.
La reacción de polimerización también se puede iniciar usando una basta disposición de diferentes iniciadores de polimerización o sistemas catalizadores. El iniciador o sistema catalizador usado - dependerá de las características deseadas del polímero que contenga isopreno que sea sintetizado. Por ejemplo, en casos en los que caucho de cis-1 , 4 -poliisopreno se elabore se puede utilizar un sistema de catalizador de Ziegler Natta que comprende el tetracloruro de titanio y trietilaluminio . Para sintetizar otros tipos de polímeros que contengan isopreno pueden requerirse otros tipos de sistemas iniciadores. Por ejemplo, los polímeros que contienen isopreno pueden hacerse usando un iniciador de radicales libres, un iniciador de óxido reducción, un iniciador aniónico o iniciador catiónico. El sistema de inicialización o catalizador que se prefiere dependerá de la microestructura del polímero, peso molecular, distribución de peso molecular y ramificación de cadenas deseada. Los iniciadores que se prefieren también dependerán de si el isopreno se está homopolimerizando o copolimerizando con monómeros adicionales. En el caso de copolímeros el iniciador usado también dependerá de si es deseable que el polímero se elabore para tener una distribución aleatoria, no aleatoria o ahusada de unidades de repetición que se deriven de los monómeros particulares. Por ejemplo, iniciadores aniónicos o iniciadores de radicales libres controlados se usan típicamente para sintetizar copolímeros de bloques que tienen bloques de isopreno.
Es importante que el sistema iniciador o catalizador empleado sea compatible con el tipo de sistema de polimerización usado. Por ejemplo, en las polimerizaciones por emulsión se usan típicamente iniciadores de radicales libres. En las polimerizaciones en solución iniciadores aniónicos, tales como compuestos de alquil litio, se emplea típicamente para iniciar la polimerización. Una ventaja de la polimerización de radicales libres es que las reacciones típicamente pueden llevarse a cabo bajo condiciones menos rigurosas que las polimerizaciones iónicas. Los sistemas de inicio de radicales libres también exhiben una mayor tolerancia de impurezas residuales.
Las recetas de emulsiones convencionales también se pueden emplear en la polimerización de isopreno de acuerdo con la presente invención; sin embargo, algunas restricciones y modificaciones pueden originarse ya sea a partir de la inclusión con monómeros adicionales, o las restricciones en los parámetros de polimerización. Agentes de reactivos iónicos, conocidos en la técnica, incluyendo detergentes de sulfonato y jabones de carboxilato, sulfato y fosfato son útiles en esta invención. El nivel de agente tensioactivo iónico se calcula con base en el peso total de los componentes orgánicos y puede variar de alrededor de 2 a 30 partes en peso del agente tensioactivo iónico por 100 partes en peso de componentes orgánicos.
Ejemplos de los iniciadores de radicales libres que son útiles en la práctica de la presente invención son aquellos conocidos como iniciadores "redox" , tales como combinaciones de sales de hierro queladas, sulfoxilato de formaldehido de sodio e hidroperóxidos orgánicos. Los hidroperóxidos orgánicos representativos son hidroperóxido de eumeno, hidroperóxido de paramentano e hidroperóxido de butilo terciario. Se prefieren el hidroperóxido de butilo terciario (t-BHP) , peracetato de butilo terciario (t-BPA) e iniciadores "azo" , tales como azobisiobutirinonitrilo (AIBN) .
La temperatura de reacción utilizada en las polimerizaciones de radicales libres se mantienen típicamente en la escala de 0°C a 150°C. Se prefieren generalmente temperaturas de entre alrededor de 20°C y 120°C y normalmente se prefieren más temperaturas dentro de la escala de 60°C a 100°C. La presión de reacción no es crítica. Típicamente sólo es suficientemente alta como para mantener las condiciones de reacción de fase líquida; puede ser presión autogénica, la cual variará dependiendo de los componentes de la mezcla de reacción y la temperatura, o puede ser más alta, por ejemplo, hasta 70.3 kg/cm2 (1, 000 psi) .
En operaciones intermitentes, el tiempo de polimerización puede variarse como se desee de tan poco como pocos minutos a tanto como varios días. La polimerización en procesos intermitentes puede concluirse cuando el monómero ya no sea absorbido más, o antes, si se desea, por ejemplo, si la mezcla de reacción se vuelve demasiado viscosa. En operaciones continuas, la mezcla de polimerización puede pasarse a través de un reactor o serie de reactores de cualquier diseño adecuado. Las reacciones de polimerización en tales casos se ajustan adecuadamente al variar el tiempo de residencia en el sistema de reactor. Los tiempos de residencia variarán con el tipo de sistema de reactor y varían de 10 a 15 minutos a 24 o más horas. La concentración de monómero en la mezcla de reacción puede variar hacia arriba de 5 por ciento en peso de la mezcla de reacción, dependiendo de las condiciones empleadas; la escala de 20 a 80 por ciento en peso se prefiere.
La polimerización de isopreno también se puede llevar a cabo en un solvente orgánico adecuado que sea líquido bajo las condiciones de reacción y que sea relativamente inerte. El solvente puede tener el mismo número de átomos de carbono por molécula que el reactivo de dieno o puede estar en una escala de ebullición diferente. Los solventes orgánicos que se prefieren son normalmente alcanos y cicloalcanos . Los solventes pueden comprender uno o más compuestos aromáticos, parafínicos o cicloparafínicos .
Estos solventes normalmente contendrán alrededor de 4 átomos de carbono por mol a aproximadamente 10 átomos de carbono por mol y serán líquidos bajo las condiciones de la polimerización. Algunos ejemplos representativos de solventes orgánicos adecuados incluyen pentano, isooctano, ciclohexano ,¦ metilciclohexano, isohexano, n-heptano, n-octano, n-hexano, benceno, tolueno, xileno, etilbenceno, dietilbenceno, isobutilbenceno, éter de petróleo, queroseno, alcoholes de petróleo, nafta de petróleo, y similares, solos o mezclados. Hidrocarburos aromáticos, tales como benceno, tolueno, isopropilbenceno, xileno o compuestos aromáticos halogenados tales como clorobenceno, bromobenceno u ortodiclorobenceno, también pueden ser empleados, pero no se prefieren en la mayoría de los casos. Otros solventes útiles incluyen tetrahidrofurano y dioxano.
En la polimerización en solución, normalmente habrá de 5 a 30 por ciento en peso de monómeros en los medios de polimerización. Estos medios de polimerización, por supuesto, comprenden los solventes y monómeros orgánicos. En la mayoría de los casos, se preferirá que el medio de polimerización contenga de 10 a 25 por ciento en peso de monómeros. Generalmente se prefiere más que el medio de polimerización contenga 15 a 20 por ciento en peso de monómeros .
La polimerización se lleva a cabo típicamente para lograr una conversión esencialmente completa de monómeros en polímero. La adición de monómeros a incrementos, o un agente de transferencia de cadena, se pueden usar para de esta manera evitar una excesiva formación de gel. Estas modificaciones menores están dentro de la capacidad del experto. Luego de que se completa la polimerización, el polímero se recupera de una suspensión o solución del polímero. Una filtración simple puede ser adecuada para separar polímero de diluyente. Otros medios para separar polímero de diluyente pueden ser empleados. El polímero puede ser tratado, por separado o mientras se suspende en la mezcla de reacción, para separar así residuos. Este tratamiento puede ser con alcoholes tales como metanol, etanol o isopropanol, con alcoholes acidificados, o con otros líquidos polares similares. En muchos casos los polímeros se obtienen en soluciones de hidrocarburos y el polímero puede recuperarse mediante coagulación con alcohol acidificado, por ejemplo, metanol o isopropanol rápidamente agitado que contenga 2% de ácido clorhídrico. Después de esta coagulación inicial, los polímeros pueden ser lavados con un líquido adecuado, tal como metanol.
Como ya se ha indicado previamente, el isopreno también puede ser copolimerizado con uno o más comonómeros adicionales para elaborar copolímeros útiles. Algunos ajustes en la receta o condiciones de reacción de polimerización pueden ser necesarios para obtener una velocidad de información de polímero satisfactoria, dependiendo de la cantidad relativa de isopreno incluida y de los demás monómeros implicados. Ejemplos de comonómeros que son útiles en la práctica de esta invención incluyen otros monómeros de dieno, tales como 1 , 3 -butadieno y hexadienos. Los monómeros aromáticos de vinilo también pueden ser copolimerizables con isoprieno para elaborar polímeros útiles. Estos monómeros aromáticos de vinilo incluyen estireno, a-metilestireno, divinilbenceno, cloruro de vinilo, acetato de vinilo, cloruro de vinilideno, metacrilato de metilo, acrilato de etilo, vinilpiridina, acrilonitrilo, metacrilonitrilo, ácido metacrílico, ácido itacónico y ácido acrílico. Mezclas de diferentes comonómeros también se pueden emplear a diferentes niveles.
El monómero de isopreno también se puede copolimerizar con uno o más monómeros de diolefina conjugados adicionales. Aquellos que contienen de 4 a 8 átomos de carbono generalmente se prefieren para propósitos comerciales. Algunos ejemplos representativos específicos de monómeros de diolefina conjugados que pueden copolimerizarse con isopreno incluyen 1, 3 -butadieno, 2 , 3 -dimetil - 1 , 3 -butadieno, piperileno, 3 -butil -1 , 3 -octadieno, 2-fenil-l,3-butadieno y similares, solos o en mezcla.
Algunos ejemplos representativos de monómeros etilénicamente insaturados que pueden ser copolimerizados con isopreno incluyen acrilatos de alquilo, tales como acrilato de metilo, acrilato de etilo,—acrilato de butilo, metacrilato de metilo y similares; monómeros de vinilideno que tienen uno o más grupos CH2=CH- terminales; aromáticos de vinilo tales como estireno, alfa-metilestireno, bromoestireno, cloroestireno, fluoroestireno y similares; oc-olefinas tales como etileno, propileno, 1-buteno y similares; haluros de vinilo, tales como bromuro de vinilo, cloroeteno (cloruro de vinilo), fluoruro de vinilo, yoduro de vinilo, 1,2-dibromoeteno, 1 , 1-dicloroeteno (cloruro de vinilideno), 1,2-dicloroeteno y similares; esteres vinílicos tales como acetato de vinilo; nitrilos a, ß-olefínicamente insaturados, tales como acrilonitrilo y metacrilonitrilo; amidas a, ß-olefínicamente insaturadas, tales como acrilamida, N-metilacrilamida, ?,?-dimetilacrilamida, metacrilamida y similares. Los monómeros funcionarizados también se pueden copolimerizar opcionalmente con el isopreno para elaborar polímeros ahulados útiles. Los monómeros funcionarizados de este tipo y los métodos mediante los cuales pueden ser incorporados en polímeros 'ahulados se describen en la patente de Estados Unidos 6,627,721 y patente de Estados Unidos 6,936,669. Las enseñanzas de la patente de Estados Unidos 6,627,721 y patente de Estados Unidos 6,936,669 se incorpora en la presente a manera de referencia con el propósito de describir estos monómeros funcionarizados y su incorporación en polímeros que contienen isopreno.
Los polímeros ahulados que son copolímeros de uno o más monómeros de dieno con uno o más de otros monómeros etilénicamente insaturados contendrán normalmente alrededor de 50 por ciento en peso a aproximadamente 99 por ciento en peso de monómeros de diolefina conjugados (incluyendo isopreno) y alrededor de 1 por ciento en peso a aproximadamente 50 por ciento en peso de los demás monómeros etilénicamente insaturados además de los monómeros de diolefina conjugados. Por ejemplo, los copolímeros ahulados de monómero de isopreno con monómeros aromáticos de vinilo, tales como cauchos de estireno- isopreno normalmente que contienen de 50 a 95 por ciento en peso de isopreno y de 5 a 50 por ciento en peso de monómeros vinilaromáticos .
Los monómeros aromáticos de vinilo son probablemente el grupo más importante de monómeros etilénicamente insaturados que se incorporan comúnmente en cauchos que contienen isopreno. Estos monómeros aromáticos de vinilo contienen típicamente de 8 a 20 átomos de carbono. Normalmente, el monómero aromático de vinilo contendrá de 8 a 14 átomos de carbono. El monómero aromático de vinilo más ampliamente usado es estireno. Algunos ejemplos de monómeros aromáticos de vinilo que pueden utilizarse incluyen estireno, 1-vinilnaftaleno, 2 -vinilnaftaleno, oc-metilestireno, 4-fenilestireno, 3-metilestireno y similares.
Algunos ejemplos representativos de polímeros ahulados que contienen isopreno incluyen caucho de homopolímero de cis-1, 3 -poliisopreno, caucho de 3,4-poliisopreno, caucho de estireno- isopreno (SIR) , caucho de ß-metilestireno-isopreno, caucho de estireno-isopreno-butadieno (SIBR) , caucho de estireno- isopreno (SIR) , caucho de isopreno-butadieno (IBR) , caucho de a-metilestireno-estireno-butadieno y caucho de OC-metilestireno-estireno-isopreno-butadieno. En casos en los que el polímero ahulado está comprendido de unidades de repetición que se derivan de dos o más monómeros, las unidades de repetición que se derivan de los monómeros diferentes, incluyendo el isopreno, normalmente se distribuirán de una manera esencialmente aleatoria. Las unidades de repetición que se derivan de los monómeros difieren del monómero en que un doble enlace normalmente es consumido por la reacción de polimerización.
El polímero ahulado puede elaborarse mediante polimerización en solución en un proceso intermitente mediante un proceso continuo al cargar continuamente el monómero de isopreno y opcionalmente monómeros adicionales en una zona de polimerización. La zona de polimerización típicamente será un reactor de polimerización o una serie de reactores de polimerización. La zona de polimerización normalmente proporcionará agitación para mantener los monómeros, polímero, iniciador y modificador bien dispersos a lo largo del solvente orgánico en la zona de polimerización. Estas polimerizaciones continuas se llevan a cabo típicamente en un sistema de varios reactores. El polímero ahulado sintetizado es continuamente retirado de la zona de polimerización. La conversión de monómero lograda en la zona de polimerización normalmente será de al menos aproximadamente 85 por ciento. Se prefiere que la conversión de monómeros sea de al menos aproximadamente 90 por ciento.
La polimerización puede iniciarse con un iniciador aniónico, tal como un compuesto de alquil litio. Los compuestos de alquil litio que pueden usarse contendrán típicamente de 1 a aproximadamente 8 átomos de carbono, tales como n-butil litio. La cantidad del iniciador de litio utilizada variará con los monómeros que se estén polimerizando y con el peso molecular que se desee para el polímero que se esté sintetizando. Sin embargo, como una regla general, de 0.01 a 1 phm (partes por 100 partes en peso de monómero) del iniciador de litio serán utilizadas. En la mayoría de los casos, de 0.01 a 0.1 phm del iniciador de litio serán utilizados siendo preferido utilizar 0.025 a 0.07 phm del iniciador de litio.
Estas polimerizaciones aniónicas se llevan a cabo opcionalmente en presencia de modificadores polares, tales como éteres alquiltetrahidrofurfurílieos . Algunos ejemplos representativos de modificadores polares específicos que pueden usarse incluyen éter metiltetrahidrofurfurílico, éter etiltetrahidrofurfurílico, éter propiltrahidrofurfurílico, éter butiltrahidrofurfurílico, éter hexiltrahidrofurfurílico , éter octiltrahidrofurfurílico, éter dodeciltrahidrofurfurílico, éter dietílico, éter di-n-propílico, éter diisopropílico, éter di-n-butílico, tetrahidrofurano, dioxano, éter dimetílico de etilen glicol, éter dietílico de etilen glicol, éter dimetílico de dietilen glicol, éter dietílico de dietilen glicol, éter dimetílico de trietilen glicol, trimetilamina, trietilamina, ?,?,?',?'-tetrametiletilendiamina, N-metil morfolina, N-etil morfolina o N-fenil morfolina.
El modificador polar se empleará típicamente a un nivel en el que la relación molar de modificador polar al iniciador de litio esté dentro de la escala de alrededor de 0.01:1 a aproximadamente 5:1. La relación molar del modificador polar al iniciador de litio más típicamente estará dentro de la escala de aproximadamente 0.1:1 a alrededor de 4:1. Se prefiere generalmente que la relación molar de modificador polar al iniciador de litio esté dentro de la escala de alrededor de 0.25:1 a aproximadamente 3:1. Generalmente se prefiere más que la relación molar de modificador polar al iniciador de litio esté dentro de la escala de alrededor de 0.5:1 a aproximadamente 3:2.
La temperatura de polimerización utilizada en estas polimerizaciones aniónicas puede variar sobre una amplia gama de alrededor de -20°C a aproximadamente 180°C. En la mayoría de los casos, se utilizará una temperatura de polimerización dentro de la escala de aproximadamente 30°C a alrededor de 125 °C. Se prefiere típicamente que la temperatura de polimerización esté dentro de la escala de aproximadamente 45°C a alrededor de 100°C. Típicamente se prefiere más que la temperatura de polimerización esté dentro de la escala de alrededor de 60°C a aproximadamente 90°C. La presión usada normalmente será suficiente para mantener una fase sustancialmente líquida bajo las condiciones de la reacción de polimerización.
Estas polimerizaciones aniónicas de isopreno normalmente se llevan a cabo durante una longitud de tiempo suficiente para permitir la polimerización sustancialmente completa del isopreno y cualquier monomero adicional que esté presente. En otras palabras, la polimerización se lleva a cabo normalmente hasta que altas conversiones de al menos aproximadamente 85 por ciento sean logradas. La polimerización es normalmente terminada después mediante la adición de un agente, tal como un etanol, un agente de terminación o un agente de acoplamiento. Por ejemplo, halogenuro de estaño y/o halogenuro de silicio pueden ser usados como un agente de acoplamiento. El halogenuro de estaño y/o el halogenuro de silicio se añaden continuamente en casos en los que se desee acoplamiento cinético. Esta adición continua de agente de acoplamiento de estaño y/o el agente de acoplamiento de silicio normalmente se lleva a cabo en una zona de reacción separada de la zona en donde está ocurriendo el grueso de la polimerización. Los agentes de acoplamiento normalmente se agregarán en un recipiente de reacción separado después de que se haya logrado el grado de conversión deseado. Los agentes de acoplamiento pueden añadirse en una solución de hidrocarburos, por ejemplo, en ciclohexano, a la mezcla de polimerización con la mezcla adecuada para distribución y reacción. En otras palabras, el acoplamiento típicamente se añadirá sólo después de que se haya logrado ya un alto grado de conversión. Por ejemplo, el agente de acoplamiento será añadido normalmente sólo después de que se haya logrado una conversión de monómero de más de aproximadamente 85%. Típicamente se preferirá que la conversión del monómero alcance al menos aproximadamente 90% antes de que se añada el agente de acoplamiento.
. Los haluros de estaño usados como agentes de acoplamiento normalmente serán tetrahaluros de estaño, tales como tetracloruro de estaño, tetrabromuro de estaño, tetrafluoruro de estaño y tetrayoduro de estaño. Sin embargo, trihaluros de estaño también pueden usarse opcionalmente . Los polímeros acoplados con trihaluros de estaño que tienen un máximo de tres brazos. Esto es, por supuesto, en contraste con polímeros acoplados con tetrahaluros de estaño que tienen un máximo de cuatro brazos. Para inducir un nivel más alto de ramificación, se prefieren normalmente los tetrahaluros de estaño. Como una regla general, se prefiere más tetracloruro de estaño.
Los agentes de acoplamiento de silicio que pueden usarse normalmente serán tetrahaluros de silicio, tales como tetracloruro de silicio, tetrabromuro de. silicio, tetrafluoruro de silicio o tetrayoduro de silicio. Sin embargo, pueden usarse también opcionalmente trihaluros de silicio. Los polímeros acoplados con trihaluros de silicio que tienen un máximo de tres brazos. Por supuesto, esto contrasta con los polímeros acoplados con tetrahaluros de silicio que tienen un máximo de cuatro brazos. Para inducir un nivel de ramificación más alto, normalmente se prefieren tetrahaluros de silicio. Como una regla general, tetracloruro de silicio es el más preferido de los agentes de acoplamiento de silicio.
Una combinación de un haluro de estaño y un haluro de silicio se puede usar opcionalmente para acoplar el polímero ahulado. Al usar esta combinación de agentes de acoplamiento de estaño y silicio propiedades mejoradas para los cauchos de neumático, tales como histéresis más baja, pueden ser logradas. Es particularmente deseable utilizar una combinación de agentes de acoplamiento de estaño y silicio en compuestos para pisos de neumáticos que contengan tanto sílice como negro de humo. En tales casos, la relación molar del haluro de estaño al haluro de silicio empleado en el acoplamiento del polímero ahulado normalmente estará dentro de la escala de 20:80 a 95:5. La relación molar del haluro de estaño al haluro de silicio empleada en el acoplamiento del polímero ahulado más típicamente estará entre la escala de 40:60 a 90:10. La relación molar del haluro de estaño al haluro de silicio empleada en el acoplamiento del polímero ahulado típicamente estará dentro de la escala de 60:40 a 85:15. La relación molar del haluro de estaño al haluro de silicio empleada en el acoplamiento del polímero ahulado muy preferiblemente estará dentro de la escala de 65:35 a 80:20.
De manera amplia y ejemplar, una escala e alrededor de 0.01 a 4.5 miliequivalentes de agente de acoplamiento de estaño (haluro de estaño y haluro de silicio) se emplea por 100 gramos del polímero ahulado. Normalmente se prefiere utilizar alrededor de 0.01 a aproximadamente 1.5 miliequivalentes del agente de acoplamiento por 100 gramos de polímero para obtener la viscosidad de Mooney deseada. Las cantidades más grandes tienden a dar como resultado la producción de polímeros que contienen grupos reactivos terminalmente o acoplamiento insuficiente. Un equivalente de agente de acoplamiento de estaño por equivalente de litios se considera una cantidad óptima para la ramificación máxima. Por ejemplo, si una mezcla de tetrahaluro de estaño y tetrahaluro de silicio se usa como el agente de acoplamiento, un mol del agente de acomplamiento podría utilizarse por cuatro moles de extremos de litio vivos. En casos en los que una mezcla de trihaluro de estaño y trihaluro de silicio se use como el agente de acoplamiento, un mol del agente de acoplamiento óptimamente se utilizará por cada tres moles de extremos de litio vivos. El agente de acoplamiento puede añadirse en una solución de hidrocarburos, por ejemplo, en ciclohexano, a la mezcla de polimerización en el reactor con mezcla adecuada para distribución y reacción.
Después de que se ha completado el acoplamiento, una 1 , 2 -etilendiamina de alquilo quelante terciaria o una sal metálica de un alcohol cíclico puede añadirse opcionalmente al cemento de polímero para estabilizar el polímero ahulado acoplado. En la mayoría de los casos, alrededor de 0.01 phr (partes en peso por 100 partes en peso de caucho seco) a aproximadamente 2 phr de la alquil 1 , 2 -etilendiamina quelante o sal metálica del alcohol cíclico se añadirán al cemento de polímero para estabilizar el polímero ahulado. Típicamente alrededor de 0.05 phr a aproximadamente 1 phr de la alquil 1 , 2 -etilendiamina quelante o sal metálica del alcohol cíclico serán añadidos. Más típicamente, alrededor de 0.1 phr a aproximadamente 0.6 phr de la alquil 1 , 2 -etilendiamina quelante o la sal metálica del alcohol cíclico se añadirán al cemento de polímero para estabilizar el polímero ahulado.
Los agentes de terminación que se pueden usar para detener la polimerización y para "terminar" el polímero ahulado vivo incluyen monohaluros de estaño, monohaluros de silicio, ?,?,?' ,?' -tetradialquildiamino-benzofenonas (tales como tetramtildiaminobenzofenona y similares) , N,N-dialquilamino-benzaldehídos (tales como dimetilaminobenzaldehído y similares), 1 , 3 -dialquil-2 -imidazolidinonas (tales como 1 , 3-dimetil-2-imidazolidinona y similares), pirrolidinonas 1-alquil sustituidas; pirrolidinonas 1-aril sustituidas, dialquil-dicicloalquil-carbodiimidas que contienen alrededor de 5 a aproximadamente 20 átomos de carbono y dicicloalquil-carbodiimidas que contienen alrededor de 5 a aproximadamente 20 átomos de carbono .
Después de que la etapa de terminación y opcionalmente la etapa de estabilización se han completado, el polímero ahulado puede recuperarse del solvente orgánico. El polímero ahulado acoplado puede ser recuperado del solvente orgánico y residuo por medios tales como coagulación química (alcohol) , desolventización térmica, u otro método adecuado. Por ejemplo, comúnmente es deseable precipitar el polímero ahulado del solvente orgánico mediante la adición de alcoholes inferiores que contengan alrededor de 1 a aproximadamente 4 átomos de carbono a .. la solución de polímero. Los alcoholes inferiores adecuados para la precipitación del caucho a partir del cemento de polímero incluyen metanol, etanol, alcohol isopropílico, alcohol propílico normal y alcohol t-butílico. La utilización de alcoholes inferiores para precipitar el polímero ahulado del cemento de polímero también "termina" cualquier polímero vivo restante al inactivar los grupos extremos de litio. Después de que el polímero ahulado acoplado se recupera de la solución, evaporación de vapor puede emplearse para reducir el nivel de compuestos orgánicos volátiles en el polímero ahulado acoplado. Además, el solvente orgánico puede ser removido del polímero ahulado mediante secado en tambor, secado en extrusor, secado al vacío y similares.
Como se ha explicado previamente, caucho de cis-1 , 3 -poliisopreno sintético que es lo suficientemente similar para permitir la sustitución libre con caucho natural puede producirse mediante polimerización en solución de isopreno con un sistema de catalizador de Ziegler Natta que comprenda tetracloruro de titanio (TiCl4) y un compuesto de organoaluminio, tal como trietilaluminio, Al- (CH2-CH3) 3. El caucho de poliisopreno que se elabora con este sistema catalizador de Ziegler Natta tiene una alta microestructura cis que contiene hasta 98 por ciento que asimila estrechamente aquella del caucho natural de Hevea Brasiliensis (el árbol del caucho común) que' tiene un contenido de microestructura cis virtualmente del 100 por ciento. Sin embargo, esta ligera diferencia en la microestructura del polímero se traduce en que las propiedades físicas sean inferiores a aquellas del caucho natural en ciertos aspectos. Por ejemplo, el caucho natural exhibe típicamente fuerza en verde que es superior a aquella del caucho de cis- 1 , 4 -poliisopreno sintético. Por otro lado, en ciertos otros aspectos caucho de cis-1, 4-poliisopreno sintético es superior al caucho natural del Hevea Brasiliensis, guayule y Taraxacum kok-Saghyz (diente de león ruso). Por ejemplo, el caucho natural contiene proteínas, jabones, resinas y azúcares residuales toda vez que proviene de las plantas. La presencia de estas impurezas residuales puede ser extremadamente dañina en algunas aplicaciones. Por ejemplo, la presencia de proteínas residuales en productos de caucho puede causar serias reacciones alérgicas en algunas personas y es una gran preocupación para los fabricantes de algunos productos que contienen caucho, tales como guantes de caucho, condones, émbolos de jeringa y similares. En cualquier caso, los cauchos de homopolímero de poliisopreno sintéticos de esta invención que están libres de proteínas, jabones, resinas y azúcares presentes en el caucho natural, incluyendo caucho natural del Hevea Brasiliensis .
La patente de Estados Unidos 3,931,136 describe un proceso para producir cis-1 , 4 -poliisopreno de alto peso molecular. El catalizador usado en este proceso es una mezcla de tres componentes de (A) un tetracloruro de titanio, (B) un compuesto de organoaluminio de la fórmula AlR3, en donde cada R representa un grupo alquilo, de preferencia un grupo alquilo que contiene 1 a 8 átomos de carbono, un grupo arilo, de preferencia un grupo fenilo o un grupo cicoalquilo, de preferencia un grupo ciclohexilo y (C) una beta-dicetona de la fórmula: en donde R' y R" pueden ser iguales o diferentes y representan un grupo alquilo o un grupo arilo. R' y R" representarán de preferencia un grupo alquilo que contenga de 1 a 5 átomos de carbono o un grupo fenilo. Las enseñanzas de la patente de Estados Unidos 4,430,487. Se incorporan en la presente a manera de referencia con el propósito de enseñar sistemas de catalizadores y técnicas de polimerización que se pueden usar para sintetizar cis- 1 , 4 -poliisopreno .
Una técnica de polimerización en solución para sintetizar cis-1, 4 -poliisopreno con un sistema de catalizador que comprende una mezcla de tetracloruro de titanio y un compuesto de trialquilaluminio se describen por la patente de Estados Unidos 4,430,487. En este proceso la polimerización se para rápido con 4 , 7-diaza-decano-l, 10-diamina. Las enseñanzas de la patente de .Estados Unidos 4,430,487 se incorpora en la presente a manera de referencia con el propósito se enseñar sistemas de catalizadores y técnicas de polimerización que se pueden usar para sintetizar cis- 1,4-poliisopreno .
La síntesis de cis-l,4-poliisopreno al polimerizar isopreno con un sistema de catalizador que comprende un tetrahaluro de titanio, un compuesto de trialquilaluminio y éter difenílico puede traducirse a la formación de gel no deseado. La patente de Estados Unidos 5,919,876 describe que la formación de gel puede reducirse al llevar a cabo estas polimerizaciones en presencia de una diarilamina, tal como difenilamina para-estirenada . La patente de Estados Unidos 5,919,876 describe más específicamente un proceso para sintetizar cis-1 , 4 -poliisopreno que tiene un bajo contenido de gel y que comprende polimerizar isopreno en un solvente orgánico inerte con un sistema de catalizador preformado que se elabore al hacer reaccionar un compuesto de organoaluminio con tetrahaluro de titanio, tal como tetracloruro de titanio, en presencia de por lo menos un éter, en donde la polimerización se lleva a cabo a una temperatura que está dentro de la escala de alrededor de 0°C a aproximadamente 100°C, y en donde la polimerización se lleva a cabo en presencia de una diarilamina. Las enseñanzas de la patente de Estados Unidos 5,919,867 se incorporan en la presente a manera de referencia con el propósito de enseñar sistemas de catalizadores y técnicas de polimerización en solución que se pueden usar para sintetizar caucho de cis- 1 , 4 -poliisopreno .
El cis-l , 4-poliisopreno puede elaborarse mediante polimerización en fase de vapor utilizando un catalizador preformado que se elabora al hacer reaccionar un compuesto de organoaluminio con tetracloruro de titanio. La patente de Estados Unidos 6,066,705 describe un método para polimerizar en fase de vapor isopreno en cis- 1 , 4 -poliisopreno en un proceso que comprende las etapas de: (1) cargar en una zona de reacción el isopreno y un sistema catalizador preformado que se elabora al hacer reaccionar un compuesto de organoaluminio con tetracloruro de titanio, de preferencia en presencia de por lo menos un éter; en donde el isopreno se mantiene en la fase de vapor en la zona de reacción mediante la combinación adecuada de temperatura y presión; (2) permitir que el isopreno se polimerice en cis-l, 4-poliisopreno a una temperatura dentro de la escala de alrededor de 35°C a aproximadamente 70°C y (3) retirar el cis-l, 4-poliisopreno de la zona de reacción. Se ha determinado que la formación de gel puede reducirse en estas polimerizaciones en fase de vapor al llevar a cabo la polimerización del monómero de isopreno en presencia de una diarilamina, tal como difenilamina para-estirenada . Las enseñanzas de la patente de Estados Unidos 6,066,705 se incorporan en la presente a manera de referencia con el propósito de enseñar sistemas de catalizador y técnicas de polimerización en fase de vapor que se pueden usar para sintetizar caucho de cis-1, 4-poliisopreno.
El caucho de poliisopreno que es claro (transparente) y de alta pureza puede sintetizarse utilizando un sistema de catalizador de neodimio. La patente de Estados Unidos 6,780,948 se refiere a este proceso para la síntesis de caucho de poliisopreno que comprende polimerizar el monómero de isopreno en presencia de un sistema de catalizador de neodimio, en donde el sistema catalizador de neodimio se prepara al (1) hacer reaccionar un carboxilato de neodimio con un compuesto de organoaluminio en presencia de isopreno durante un periodo de aproximadamente 10 minutos alrededor de 30 minutos para producir componente catalizador de neodimio-aluminio, y (2) hacer reaccionar subsecuentemente el componente catalizador de neodimio-aluminio con un cloruro de dialquilaluminio durante un periodo de al menos 30 minutos para producir el sistema catalizador de neodimio. Las enseñanzas de la patente de Estados Unidos 5,919,867 se incorporan en la presente a manera de referencia con el propósito de enseñar sistemas catalizadores y técnicas de polimerización que pueden usarse para sintetizar caucho de cis- 1 , 4 -poliisopreno que sea de alta pureza.
La patente de Estados Unidos 7,091,150 y la patente de Estados Unidos 7,199,201 describen el uso de un sistema catalizador de neodimio para polimerizar monomero de isopreno en caucho de poliisopreno sintético que tengan un contenido de microestructura cis extremadamente alto y alta regularidad estéreo. Este caucho de poliisopreno se cristalizará bajo tensión y puede mezclarse para crear formulaciones de caucho de una manera similar al caucho natural. Esta técnica describe más específicamente un proceso para la síntesis de caucho de poliisopreno que comprende polimerizar monomero de isopreno en presencia de un sistema catalizador de neodimio, en donde el sistema catalizador de neodimio se prepara durante un proceso que comprende (1) hacer reaccionar un carboxilato de neodimio con un compuesto de organoaluminio en un solvente orgánico para producir componente catalizador de neodimio-aluminio y (2) hacer reaccionar posteriormente el componente catalizador de neodimio-aluminio con un halógeno elemental para producir el sistema catalizador de neodimio. En la práctica de este proceso, el sistema catalizador de neodimio típicamente está libre de compuestos que contienen níquel .
El caucho de poliisopreno sintético elaborado mediante este proceso comprende unidades de repetición que se derivan de isopreno, en donde el caucho de poliisopreno sintético tiene un contenido de microestructura cis que está dentro de la escala de 98.0% a 99.5%, un contenido de microestructura 3,4 que está dentro de la escala de 0.5% a 2.0%, y un contenido de microestructura trans que está dentro de la escala de 0.0% a 0.5%. Las enseñanzas de la patente de Estados Unidos 7,091,150 y patente de Estados Unidos 7,199,201 se incorporan en la presente a manera de referencia con el propósito de enseñar sistemas catalizadores de neodimio y técnicas de polimerización que se pueden usar para sintetizar caucho de cis- 1 , 4 -poliisopreno de contenido de microestructura cis extremadamente alto y alta estéreo regularidad .
Catalizadores de lantánido de un solo componente, tales como diyoduros de lantánido, pueden usarse también en la síntesis de poliisopreno que tengan contenidos de microestructura cis extremadamente altos. Por ejemplo, diyoduro de tulio, diyoduro de disprosio y diyoduro de neodimio pueden iniciar la polimerización de isopreno en caucho de cis-1 , 4 -poliisopreno alto sin la necesidad de ningún componente catalizador adicional. Los diyoduros de lantánido en consecuencia pueden usarse para iniciar la polimerización de monómero de isopreno en cis-1, 4-poliisopreno alto bajo condiciones de polimerización en solución .
La patente de Estados Unidos 4,894,425 revela un proceso para sintetizar poliisopreno que puede poseer grupos funcionales y que contiene más de 70 por ciento de unidades 1,2 y 3 , 4 -estructurales . Este proceso incluye la polimerización aniónica de isopreno en un solvente de hidrocarburo inerte en presencia de un compuesto de organolitio como el catalizador y un éter como el co-catalizador, en donde el co-catalizador usado es un éter dialquílico de etilenglicol de la fórmula R^O-CHa-CI^-O-R2 en donde R1 y R2 son grupos alquilo que tienen diferentes números de átomos de carbono, seleccionado del grupo que consiste en metilo, etilo, n-propilo, iso-propilo, n-butilo, iso-butilo, sec-butilo y fcer-butilo, y en donde la suma de los átomos de carbono en los dos grupos alquilo R1 y R2 están dentro de la escala de 5 a 7. Las enseñanzas de la patente de Estados Unidos 4,894,425 se incorporan en la presente a manera de referencia con el propósito de enseñar sistemas catalizadores y técnicas de polimerización que se pueden usar para sintetizar poliisopreno que tenga un alto contenido de microestructura 1,2- y 3,4-.
El 3 , -poliisopreno cristalizable puede sintetizarse en solventes orgánicos hasta rendimientos cuantitativos después de cortos tiempos de polimerización utilizando los sistemas catalizadores descritos por la patente de Estados Unidos 5,082,906. El 3 , 4-poliisopreno elaborado utilizando este sistema de catalizador es cristalizable por tensión y puede emplearse en pisos de neumático que proporcionen tracción mejorada y resistencia al crecimiento de cortes mejorada. La patente de Estados Unidos 5,082,906 describe específicamente un proceso para la síntesis de 3 , 4-poliisopreno que comprende polimerizar monómero de isopreno en un solvente orgánico a una temperatura que está dentro de la escala de alrededor de -10°C a aproximadamente 100°C en presencia de un sistema catalizador que está compuesto de (a) un compuesto de organohierro, (b) un compuesto de organoaluminio, (c) una amina aromática quelante y (d) un compuesto protónico; en donde la relación molar de la amina quelante al compuesto de organohierro está dentro de la escala de alrededor de 0.1:1 a aproximadamente 1:1, en donde la relación molar del compuesto de organoaluminio al compuesto de organohierro está dentro de la escala de alrededor de 5:1 a aproximadamente 200:1, y en donde la relación molar del compuesto protónico al compuesto de organoaluminio está dentro de la escala de alrededor de 0.001:1 a aproximadamente 0.2:1. Las enseñanzas de la patente de Estados Unidos 5,082,906 se incorporan en la presente a manera de referencia con el propósito de enseñar sistemas catalizadores y técnicas de polimerización que se pueden usar para sintetizar poliisopreno que tenga un alto contenido de microestructura 3,4 y que sea cristalizable por tensión .
La patente de Estados Unidos 5,356,997 se refiere también a un proceso para la síntesis de 3 , 4 -poliisopreno cristalizable por tensión. Este 3 , 4-poliisopreno tiene un contenido de microestructura 3,4 que está dentro de la escala de aproximadamente 65% a alrededor de 85%, un contenido de microestructura cis-1,4 que está dentro de la escala de alrededor de 15% a aproximadamente 35%, y esencialmente ninguna microestructura Crai.s-1,4- o 1,2-. Se puede sintetizar en solventes orgánicos hasta rendimientos cuantitativos después de cortos tiempos de polimerización. La patente de Estados Unidos 5,356,997 describe específicamente un proceso para la síntesis de 3,4-poliisopreno que comprende polimerizar monómero de isopreno en un solvente orgánico a una temperatura que está dentro de la escala de alrededor de -10°C a aproximadamente 100°C en presencia de un sistema catalizador que comprende (a) un compuesto de organohierro que es soluble en el solvente orgánico, en donde el hierro en el compuesto de organohierro está en el estado de oxidación +3, (b) un compuesto de organoaluminio parcialmente hidrolizado que fue preparado al añadir un compuesto protónico seleccionado del grupo que consiste en agua, alcoholes y ácidos carboxílieos al compuesto de organoaluminio, y (c) una amina aromática quelante; en donde la relación molar de la amina quelante al compuesto de organohierro está dentro de la escala de aproximadamente 0.1:1 a alrededor de 1:1, en donde la relación molar del compuesto de organoaluminio al compuesto de organohiero está dentro de la escala de alrededor de 5:1 a aproximadamente 200:1, y en donde la relación molar del compuesto protónico al compuesto de organoaluminio está dentro de la escala de aproximadamente 0.001:1 a alrededor de 0.2:1. Las enseñanzas de la patente de Estados Unidos 5,356,997 se incorporan en la presente a manera de referencia con el propósito de enseñar sistemas catalizadores y técnicas de polimerización que pueden usarse para sintetizar poliisopreno que tenga un alto contenido de microestructura 3,4 y que sea cristalizable por tensión.
La patente de Estados Unidos 5,677,402 revela un proceso para preparar caucho de 3 , 4 -poliisopreno que comprende polimerizar monómero de isopreno con un iniciador de organolitio a una temperatura que esté dentro de la escala de aproximadamente 30°C a alrededor de 100°C en presencia de un alcóxido de sodio y un modificador polar, en donde la relación molar del alcóxido de sodio al iniciador de organolitio está dentro de la escala de alrededor de 0.05:1 a aproximadamente 3:1; y en donde la relación molar del modificador polar al iniciador de organolitio está dentro de la escala de alrededor de 0.25:1 a aproximadamente 5:1. Las enseñanzas de la patente de Estados Unidos 5,677,402 se incorporan en la presente a manera de referencia con el propósito de enseñar sistemas catalizadores y técnicas de polimerización que se pueden usar para sintetizar 3,4-poliisopreno .
La patente de Estados Unidos 7,351,768 describe la síntesis de poliisopreno líquido que tiene un peso molecular promedio en peso que está dentro de la escala de 5,000 a 100,000 y de preferencia dentro de la escala de 20,000 a 80,000. Las enseñanzas de la patente de Estados Unidos 5,677,402 se incorporan en la presente a manera de referencia con el propósito de ilustrar la síntesis de poliisopreno líquido .
La patente de Estados Unidos 6,576,728 describe un proceso para la copolimerización de estireno e isopreno para producir caucho de bajo contenido de vinilestireno-isopreno que tiene una distribución aleatoria de unidades de repetición que se derivan de estireno. Los sistemas iniciadores empleados en estas polimerizaciones comprenden (a) un iniciador de litio y (b) un miembro seleccionado del grupo que consiste en (1) un alcóxido de sodio, (2) una sal sodio de un ácido sulfónico y (3) una sal sodio de un éter glicólico. Es importante que el sistema iniciador usado en estas polimerizaciones esté libre de modificadores polares, tales como bases de Lewis. Las enseñanzas de la patente de Estados Unidos 6,576,728 se incorporan en la presente a manera de referencia con el propósito de ilustrar la síntesis de caucho de estireno- isopreno .
La patente de Estados Unidos 6,313,216 describe un proceso para sintetizar caucho de estireno-isopreno aleatorio que comprende: (1) cargar continuamente isopreno, estireno, un iniciador y un solvente en una primera zona de polimerización, (2) permitir que el isopreno y estireno se copolimericen en la primera zona de polimerización hasta una conversión total de 60 a 95 por ciento para producir un cemento de polímero que contenga cadenas de estireno-isopreno vivas, (3) cargar continuamente el cemento de polímero que contenga las cadenas de estireno-isopreno vivas y monómero de isopreno adicional en una segunda zona de polimerización, en donde de 5 a 40 por ciento de la cantidad total de isopreno cambiado se carga en la segunda zona de polimerización, (4) permitir que la copolimerizacion continúe en la segunda zona de polimerización hasta una conversión del monómero de isopreno de al menos 90%, en donde la conversión total de estireno e isopreno en la segunda zona de polimerización se limita a un máximo de 98%, (5) retirar un cemento de polímero de caucho de estireno-isopreno aleatorio que tenga extremos de cadena viva de la segunda zona de reacción, (6) matar los extremos de cadena viva en el caucho de estireno-isopreno aleatorio y (7) recuperar el caucho de estireno-isopreno aleatorio del cemento de polímero, en donde las copolimerizaciones en la primera zona de polimerización y la segunda zona de polimerización se llevan a cabo a una temperatura que está dentro de la escala de 70°C a 100°C, y en donde la cantidad de estireno cargada en la primera zona de polimerización es al menos 2% mayor que la cantidad total de estireno que se unió al caucho. Las enseñanzas de la patente de Estados Unidos 6,313,216 se incorporan en la presente a manera de referencia con el propósito de ilustrar la síntesis de caucho de estireno- isopreno .
Los copolímeros de isopreno-butadieno que tienen altos contenidos de vinilo pueden ser sintetizados en solventes orgánicos hasta altos rendimientos después de cortos tiempos de polimerización utilizando el proceso descrito en la patente de Estados Unidos 5,061,765. Los copolímeros de isopreno-butadieno elaborados utilizando este proceso tienen una alta temperatura de transición vitrea que está dentro de la escala de aproximadamente 0°C a alrededor de -60°C y pueden ser empleados en pisos de neumático que proporcionen tracción mejorada y resistencia al crecimiento de cortes mejorada. La patente de Estados Unidos 5,061,765 describe más específicamente un proceso para la síntesis de copolímeros de isopreno-butadieno que tienen un alto contenido de vinilo, que comprenden copolimerizar monómero de isopreno y monómero de butadieno en un solvente orgánico a una temperatura que esté dentro de la escala de alrededor de -10°C a aproximadamente 100°C en presencia de un sistema catalizador que comprenda (a) un compuesto de organohierro, (b) un compuesto de organoaluminio, (c) una amina aromática quelante y (d) un compuesto protónico; en donde la relación molar de la amina quelante al compuesto de organohierro está dentro de la escala de alrededor de 0.1:1 a aproximadamente 1:1, en donde la relación molar del compuesto de organoaluminio al compuesto de organohierro está dentro de la escala de alrededor de 5:1 a aproximadamente 200:1, y en donde la relación molar del compuesto protónico al compuesto de organoaluminio está dentro de la escala de alrededor de 0.001:1 a aproximadamente 0.2:1. Las enseñanzas de la patente de Estados Unidos 5,061,765 se incorporan en la presente a manera de referencia con el propósito de ilustrar la síntesis de caucho de isopreno-butadieno.
Una técnica para sintetizar terpolímeros ahulados de estireno, isopreno y butadieno se describe en la patente de Estados Unidos 5,137,998. Estos terpolímeros ahulados exhiben una excelente combinación de propiedades para su utilización en compuestos de caucho para pisos de neumáticos. Al utilizar estos terpolímeros en pisos de neumático, neumáticos que tengan mejor resistencia al derrape en húmedo pueden construirse sin sacrificar la resistencia al rodamiento o las características de desgaste del piso. La patente de Estados Unidos 5,137,998 describe más específicamente un proceso para preparar un terpolímero ahulado de estireno, isopreno y butadieno que tiene varias temperaturas de transición vitrea y que tiene una combinación excelente de propiedades para usarse en la elaboración de pisos de neumático, que comprende: terpolimerizar estireno, isopreno y 1 , 3 -butadieno en un solvente orgánico a una temperatura de no más de aproximadamente 40°C en presencia de (a) por lo menso un miembro seleccionado del grupo que consiste en óxido de tripiperidino fosfina y alcóxidos de metal alcalino y (b) un compuesto de organolitio. Las enseñanzas de la patente de Estados Unidos 5,137,998 se incorporan en la presente a manera de referencia con el propósito de ilustrar la síntesis de caucho de estireno-isopreno-butadieno .
Un caucho de isopreno-butadieno líquido (IBR) que es particularmente valioso para usarse en elaborar pisos para neumáticos de automóviles de alto desempeño, incluyendo neumáticos de carreras, que exhiben superiores características de tracción en seco y durabilidad, puede elaborarse mediante el proceso descrito en la patente de Estados Unidos 6,562,895. Este caucho de isopreno-butadieno es un líquido a temperatura ambiente y comprende unidades de repetición que se derivan de aproximadamente 5 por ciento en peso a alrededor de 95 por ciento en peso de isopreno y alrededor de 5 por ciento en peso a aproximadamente 95 por ciento en peso de 1 , 3-butadieno, en donde las unidades de repetición derivadas de isopreno y 1 , 3 -butadieno están esencialmente en orden aleatorio. Este IBR tiene también un bajo peso molecular promedio en número que está dentro de la escala de alrededor de 3,000 a aproximadamente 50,000 y tiene una alta temperatura de transición vitrea que está dentro de la escala de alrededor de -50°C a aproximadamente 20°C.
Estos copolímeros de isopreno-butadieno son sintetizados utilizando un iniciador de organolitio y un modificador polar. El nivel de iniciador de organolitio empleado dependerá del peso molecular que se desee para el polímero de isopreno-butadieno líquido que esté siendo sintetizado. Como una regla general, en todas las polimerizaciones aniónicas el peso molecular del polímero producido es inversamente proporcional a la cantidad de iniciador utilizada. Ya que el polímero de isopreno-butadieno líquido que tiene un peso molecular relativamente bajo está siendo sintetizado, la cantidad de iniciador empleada será relativamente grande. Como una regla general, alrededor de 0.1 a aproximadamente 2 phm (partes por cien partes de monómero en peso) del compuesto de organolitio se emplearán. En la mayoría de los casos, se preferirá utilizar alrededor de 0.2 a aproximadamente 1 phm del compuesto de organolitio prefiriéndose más utilizar alrededor de 0.4 phm a 0.6 phm del compuesto de organolitio. En cualquier caso, una cantidad de iniciador de organolitio se seleccionará para dar como resultado la producción del polímero de isopreno-butadieno líquido que tenga un peso molecular promedio en número que esté dentro de la escala de aproximadamente 3,000 a alrededor de 50,000.
La cantidad de iniciador de organolitio se seleccionará de preferencia para dar como resultado la producción de polímero de isopreno-butadieno líquido que tenga un peso molecular promedio en número que esté dentro de la escala de alrededor de 5,000 a aproximadamente 30,000. La cantidad de iniciador de organolitio muy preferiblemente se seleccionará para dar como resultado la producción de polímero de isopreno-butadieno líquido que tenga un peso molecular promedio en número que esté dentro de la escala de alrededor de 8,000 a aproximadamente 18,000. En cualquier caso, es crítico llevar a cabo la copolimerización de 1,3-butadieno y el estireno en presencia de un modificador polar, tal como ?,?,?' ,?' -tetrametiletilendiamina (TMEDA) , para lograr una alta temperatura de transición vitrea que esté dentro de la escala de aproximadamente -50°C a 20°C. Las enseñanzas de la patente de Estados Unidos 6,562,895 se incorporan en la presente a manera de referencia con el propósito de ilustrar la síntesis de polímeros de isopreno-butadieno líquidos.
Los copolímeros de bloques que contienen un bloque de poliisopreno pueden elaborarse mediante el proceso descrito en la patente de Estados Unidos 5,242,984. Por ejemplo, polímeros de dos bloques lineales de estireno e isopreno (copolímeros de bloque S-I) y polímeros de tres bloques lineales de estireno e isopreno (polímeros de tres bloques S-I-S) pueden elaborarse mediante este proceso. En esta técnica, los monómeros son polimerizados secuencialmente mediante polimerización aniónica en un solvente orgánico inerte. Normalmente un compuesto de metal organoalcalino, tal como compuesto de alquil litio, se usa para iniciar la polimerización que se puede llevar a cabo sobe una amplia gama de temperaturas .
Los métodos para controlar los pesos moleculares de los bloques y el polímero total se describen en la patente de Estados Unidos 3,149,182 y la patente de Estados Unidos 3,231,635 que indican que la cantidad de monómero que se puede mantener constante y los diferentes pesos moleculares que pueden lograrse al cambiar la cantidad de catalizador o que la cantidad de catalizador se puede mantener constante y diferentes pesos moleculares pueden lograrse al variar la cantidad del monómero. Después de la polimerización secuencial, el producto se termina tal como mediante la adición de un agente de terminación protónico, por ejemplo, agua, alcohol u otros reactivos o con hidrógeno, con el propósito de remover el radical de litio que forma el núcleo del producto de polímero condensado. El producto de polímero de bloques es luego reconvertido tal como mediante coagulación utilizando agua caliente o vapor o ambos. Las enseñanzas de la patente de Estados Unidos 5,242,984, patente de Estados Unidos 3,149,182 y patente de 'Estados Unidos 3,231,635 se incorporan en la presente a manera de referencia con el propósito de enseñar métodos para sintetizar copolímeros de bloques S-I y copolímeros de tres bloques S-I-S .
Todos los tipos de polímeros hechos con el isopreno de esta invención son verificables como siendo elaborados con isopreno que no se originó de una fuente petroquímica. Además, los polímeros que contienen isopreno de esta invención también se pueden distinguir de polímeros que contienen isopreno que provienen de fuentes naturales, tales como caucho natural. En consecuencia, los polímeros que contienen isopreno de esta invención son analíticamente verificables como proviniendo de fuentes bio-renovables y ambientalmente amistosas delineadas en la presente.
La relación de isótopos de carbono 13C y 12C puede usarse para identificar o descartar potenciales orígenes de muchas muestras que contengan carbono. Este método funciona bien porque: (1) ambos isótopos son estables en marcos de tiempo geológicos; (2) la relación de 13C a 12C puede medirse con alta precisión usando combinaciones de análisis de combustión, cromatografía de gases y espectrometría de masas de relación isotópica; (3) las relaciones 13C/12C para muchos materiales de origen natural- ocurren dentro de escalas limitadas características de aquellos materiales; y (4) las relaciones 13C/12C para muchos materiales cambian de maneras predecibles al sufrir estos materiales reacciones químicas.
Estudios que incluyen relaciones 13C/12C en o cerca de los niveles de abundancia naturales normalmente reportan datos isotópicos como "valores delta" , los cuales se representan por el símbolo 513C y se dan en partes por mil (¾¾) en relación a una muestra de referencia estándar. Para carbono, la muestra de referencia típicamente es Pee Dee Belemite, la cual tiene una abundancia natural de 13C de 1.112328% y es asignada 513C0.00Ss. La fórmula que se refiere a las relaciones 13C/12C con valores delta es: 513C (en ¾,) contra estándar = [ (Rmuestra- ^est ndar ) /Restándarl (1000) , en donde ^¦muestra es la relación C/ C para la muestra y Restándar es la relación para Pee Dee Belemite .
Aunque isótopos de carbono (es decir, 13C y 12C) toman parte en los mismos procesos físicos y las mismas reacciones químicas, la ligera diferencia de masa entre 13C y 12C puede manifestarse en diferencias muy ligeras en las velocidades para muchas reacciones y procesos. Esto lleva a pequeñas diferencias entre las relaciones 13C/12C para muestras sujetas a reacciones químicas o procesos físicos. Por ejemplo, procesos físicos tales como evaporación o difusión discriminan contra isótopos más pesados y típicamente llevan a un ligero enriquecimiento del isótopo más pesado en la muestra original al evaporarse el isótopo más ligero o difundirse más rápidamente. La relación 13C/12C por lo tanto se incrementa ligeramente al ocurrir la evaporación o difusión. Por razones químicas, incluyendo reacciones enzimáticas, la situación es más compleja, pero comúnmente existe una ligera discriminación de un isótopo sobre otro, lo cual puede detectarse al medir las relaciones 13C/12C o valores 613C . Por ejemplo, C02 atmosférico puede convertirse en material vegetal por medio de dos mecanismos muy diferentes para fotosíntesis: la vía de Calvin-Benson, la cual ocurre en plantas C3 y la vía de Hatch-Slack, la cual ocurre en plantas de C . Estos dos mecanismos son suficientemente diferentes para producir una diferencia mesurable en 513C a partir del mismo C02. Para plantas C4, 513C varía típicamente de -9¾> a -17¾> con una media cerca de -13¾>. Para plantas C3, 513C varía típicamente de -20fc> a -32¾> con una media cerca de -27¾>. Ya que estas escalas son tan diferentes y los valores 513C pueden medirse rutinariamente dentro de 0.02t¾, es relativamente fácil distinguir entre residuos vegetales derivados de plantas C3 contra C4. Esto tiene una miríada de aplicaciones en arqueología y otros campos en donde el análisis de residuos que contienen carbono a partir de cocción o restos esqueléticos puede ser usado para rastrear la evolución, actividades y dietas de humanos y otros animales.
Más recientemente, valores 613C han sido utilizados para detectar fraude económico, especialmente en la adulteración de alimentos por otros materiales - incluyendo sintéticos potencialmente dañinos derivados de petroquímicos . Por ejemplo, aceite de maíz se considera que es un aceite vegetal Premium y existe la tentación de los productores inescrupulosos por diluir el aceite de maíz con aceites más baratos. Afortunadamente, el aceite de maíz se deriva de una planta de C4 mientras que la mayoría de las alternativas más baratas se derivan de plantas de C3 o animales . La 613C para aceite de maíz auténtico es por lo tanto -13.7¾> a -16.4&> en comparación con -25¾> a -32&> para las alternativas. Cualquier dilución significativa de aceite de maíz por una alternativa más barata puede detectarse al medir 613C. De manera similar, la adición de azúcar de caña (un producto de la fotosíntesis de C4) a jugos de frutas, vinos, alcoholes y miel (todos productos de fotosíntesis de C3) puede detectarse al medir valores 513C. Es también posible detectar la adulteración se saborizantes naturales mediante análogos sintéticos y el uso de suplementos hormonales sintéticos ilegales por medio de valores 513C.
La presente invención utiliza la capacidad para medir en forma precisa valores 613C y de esta manera producir nuevos polímeros isoprénicos isotópicamente únicos que puedan ser fácilmente distinguidos de polímeros derivados de corrientes de alimentación a base de petróleo. La presente invención utiliza también la capacidad para medir en forma precisa valores 613C para de esta manera producir nuevos polímeros isoprénicos isotópicamente únicos que puedan distinguirse fácilmente del caucho natural. Una principal característica de la presente invención es que proporciona nuevos polímeros con una amplia gama de valores 513C que pueden ser diseñados y posteriormente verificados para autenticidad. Como se describió anteriormente, estos polímeros nuevos satisfacen una necesidad cada vez más alta de los consumidores por productos verificables que no contengan ni alérgenos proteináceos potenciales ni corrientes de alimentación derivadas de petróleo.
Los polímeros representados por la presente invención contienen unidades isopreno que son típicamente únicas en comparación con polímeros tanto de caucho natural como sintéticos que contienen isopreno derivado de petróleo. En el caso de caucho natural derivado de Hevea brasiliensis (es decir, el árbol del hule natural común) , los valores 513C típicamente varían de alrededor de -27¾> a aproximadamente -28¾>. El caucho de guayule, el cual se deriva de un arbusto desértico, tiene 513C de aproximadamente -31¾>. Ambos cauchos exhiben valores 813C esperados para productos de fotosíntesis de C3, y ambos cauchos se sabe que contienen proteínas unidas a polímero.
El poliisopreno sintético tradicional puede tener diferentes valores 513C dependiendo de la fuente de isopreno. Para isopreno derivado de destilación por extracción de flujos de C5 a partir de refinerías de petróleo, 613C es aproximadamente -22¾> a alrededor de -24¾>. Esta escala es típica para hidrocarburos insaturados ligeros derivados de petróleo, y polímeros que contienen isopreno a base de petróleo contienen típicamente unidades isoprénicas con el mismo 513C. Para polímeros que contienen isopreno derivados de la reacción de isobutileno con formaldehido, los valores 513C pueden ser aproximadamente -34.4¾> toda vez que el formaldehido se deriva comúnmente de corrientes de alimentación con valores 513C mucho más negativos.
La presente invención proporciona polímeros que contienen isopreno con valores 613C muy diferentes. Por ejemplo, la fermentación de glucosa derivada de maíz (613C-10.73¾>) con cantidades mínimas de otros nutrientes que contienen carbono (por ejemplo, extracto de levadura) produce isopreno que puede ser polimerizado en poliisopreno con 613C -14.66¾> a -14.85¾>. El 813C para este polímero claramente está en una nueva escala que está muy fuera de las escalas normales para caucho natural y todo el poliisopreno sintético previamente conocido, y está dentro de la escala normalmente asociada con productos derivados de plantas de C4. El valor 613C único para este polímero es una consecuencia directa del hecho de que el isopreno en el polímero se deriva de glucosa a base de maíz, la cual de hecho es un producto derivado de plantas de C .
Se reconoce por aquellos de capacidad ordinaria en la técnica que resultados similares pueden obtenerse usando otros azúcares o fermentables derivados de plantas de C4. Por ejemplo, sucrosa de caña de azúcar (613C-10.4¾>) , azúcar invertido de caña de azúcar (513C -15.3&), glucosa de almidón de maíz (613C -10.4¾>) y glucosa de degradación hidrolítica ya sea de hojas y troncos de maíz (613C- 11.1¾>) o bagazo de caña de azúcar (513C-13.0¾>) deben todas producir isopreno que puede usarse para producir polímeros de isopreno con valores 513C que sean menos negativos que cualquier polímero de caucho natural o sintético que contenga isopreno a base de petróleo. Los expertos en la técnica reconocerán también que debe ser posible producir isopreno y polímeros de isopreno con 513C menos negativo de aproximadamente -22& a partir de corrientes de alimentación fermentables con 613C aproximadamente más grandes (es decir, menos negativos) que alrededor de -18¾>, incluyendo mezclas de corrientes de alimentación fermentables con un 513C promedio aproximadamente más grande que alrededor de -18¾>.
Además de producir polímeros que contienen isopreno con valores 513C característicos de productos derivados de plantas de C4, los expertos en la técnica reconocerán que polímeros que contengan isopreno marcados isotópicamente en forma única pueden elaborarse a partir de corrientes de alimentación no de C4 fermentables . Por ejemplo, glucosa de pulpa de madera blanda hidrolizada (613C-23%>) debe producir isopreno y poliisopreno con 613C cerca de -27%,, la cual sea una escala única de entre las escalas normales observadas para isopreno derivado de la destilación por extracción de fracciones de C5 e isopreno derivado de la reacción de isobutileno con formaldehido . Los expertos en la técnica reconocerán también que la fermentación de otros azúcares con 513C varía de aproximadamente -20%. a alrededor de -28%, deben producir isopreno y polímeros de isopreno con 613C que varíe de alrededor de -24%, a aproximadamente -32%,. Estos otros azúcares podrían incluir (pero no están limitados a) glucosa de celulosa hidrolizada (613C -25 ± 2¾>) , azúcar invertido de azúcar de remolacha (613C -26%, a -27%,) y lactosa (513C -27%, a -28%>) . La fermentación de aceites vegetales (513C -26%, a -32%,) , incluyendo aceite de palma (613C -30%>) podría proporcionar acceso a polímeros de isopreno con 513C más negativo que -30%,.
Los expertos en la técnica reconocerán que la co-fermentación de dos o más corrientes de alimentación se puede usar para producir isopreno y por lo tanto polímeros que contengan isopreno con valores 613C intermedios. Por ejemplo, una mezcla 1:1 de sucrosa de caña de azúcar (513C -10.4¾>) y sucrosa de azúcar de remolacha (513C -26&> a -27¾>) debe producir isopreno y por lo tanto polímeros que contengan isopreno aproximadamente con el mismo valor 513C que un polímero producido a partir de sucrosa derivado de una sola fuente con el valor 613C promedio (es decir, aproximadamente -18.5¾>) . Lo mismo debe ser cierto para azúcares invertidos, derivados de azúcar y remolachas. En ambos casos, debe ser obvio que los mismos polímeros podrían ser sintetizados al mezclar y luego copolimerizar cantidades iguales de isopreno preparados por separado a partir de sucrosa o azúcar invertido derivado de caña de azúcar y remolachas. También debe ser obvio que la co-fermentación de azúcares con otras corrientes de alimentación fermentables - tales como extracto de levadura y aceites vegetales- puede usarse para producir isopreno y por lo tanto polímeros que contengan isopreno con valores 513C intermedios. Por ejemplo, la co- fermentación de glucosa (613C -10.73&.) y extracto de levadura (513C -26¾> a 27&>) en una relación de 181.2:17.6 produce isopreno que puede polimerizarse a poliisopreno con valores 613C de -18¾> a -20SÓ. En contraste, la fermentación de glucosa con una cantidad mínima de extracto de levadura y la polimerimerización subsecuente del isopreno produce poliisopreno con valores 613C de -14¾> a -15&>.
Para copolímeros de isopreno con otros monómeros, los expertos en la técnica reconocen que hay una cantidad finita de isopreno que se incorporan en el fondo de polímero como "bloques" de poliisopreno . La tendencia del isopreno a formar bloques de dos o más unidades isoprénicas - incluso en "copolímeros aleatorios" - depende de muchos factores, incluyendo la cantidad de isopreno en relación a otros monómeros, el tipo de catalizador usado para polimerización, y las condiciones de reacción específicas para polimerización. La presencia de estos bloques junto a lo largo de la estructura de base de polímero normalmente se puede detectar mediante espectroscopia de RMN. Usando una combinación de degradación química (por ejemplo, ozonólisis) y cromatografía, es posible aislar fragmentos de estos bloques para análisis químico, incluyendo la medición de los valores 513C para los bloques derivados de isopreno. Esto proporciona una manera de determinar si los copolímeros de isopreno con otros monómeros contienen isopreno derivado de corriente de alimentación renovables/sostenibles , especialmente corrientes de alimentación derivadas de plantas de C4.
Los polímeros de poliisopreno de esta invención que se elaboran con monómero de isopreno a partir de los cultivos celulares que utilizan fuentes de carbono bio-renovables pueden identificarse como tales en virtud de su valor 513C y otras características del polímero. Por ejemplo, los siguientes polímeros que contienen isopreno son verificables como conteniendo monómero de isopreno que se produjo utilizando el método de esta invención: (1) Polímero de poliisopreno que comprende unidades de repetición que se derivan de monómero de isopreno, en donde el polímero de poliisopreno tiene un valor 513C de más de -22¾>. Estos polímeros de poliisopreno pueden tener un valor 513C que sea mayor que -21¾,, y también pueden tener un valor 613C que sea mayor que -20¾>. En algunos casos, el polímero de poliisopreno tendrá un valor 513C que esté dentro de la escala de -22&> a -10¾>, y en otros casos tendrá un valor 513C que esté dentro de la escala de -21¾> a -12¾>. En aún otros casos el polímero de poliisopreno tendrá un valor 513C que esté dentro de la escala de -20¾> a -14S¾. En muchos casos, el polímero de poliisopreno será caucho de homopolímero de poliisopreno. (2) Un polímero de poliisopreno que comprende unidades de repetición que se derivan de monómero de isopreno, en donde el polímero de poliisopreno tiene un valor 613C que está dentro de la escala de -30¾> a -28.5¾>. Estos polímeros de poliisopreno pueden tener un valor 613C que esté dentro de la escala de -30¾> a -29&>. En algunos casos, el polímero de poliisopreno tendrá un valor 613C que esté dentro de la escala de -30%. a -29¾> y en otros casos el polímero de poliisopreno tendrá un valor 613C que esté dentro de la escala de -30&. a -29.5¾>. En otros casos más el polímero de poliisopreno puede tener un valor 513C que esté dentro de la escala de -29.5¾> a -28.5¾> y en otros casos adicionales el polímero de poliisopreno puede tener un . valor 513C que esté dentro de la escala de -29.0¾> a -28.5&. En muchos casos, el polímero de poliisopreno será caucho de homopolímero de poliisopreno . (3) Un polímero de poliisopreno que comprende unidades de repetición que se derivan de monómero de isopreno, en donde el poliisopreno está libre de proteína, y en donde el polímero de poliisopreno tiene un valor 513C que está dentro de la escala de -34&> a -24¾>. En algunos casos este polímero de poliisopreno tiene un valor 513C que está dentro de la escala de -34&> a -25¾>. En otros casos el polímero de poliisopreno tiene un valor 613C que está dentro de la escala de -33¾> a -25&>, y en aún otros casos el polímero de poliisopreno tiene un valor 613C que está dentro de la escala de -32¾> a -25¾>. En muchos casos, el polímero de poliisopreno será caucho de homopolímero de poliisopreno. (4) Un polímero de poliisopreno que comprende unidades de repetición que se derivan de monómero de isopreno, en donde el polímero de poliisopreno tiene un contenido de microestructura cis- 1,4- de menos de 99.9%, en donde el polímero de poliisopreno tiene un contenido de microestructura trans-1,4- de menos de 99.9%, y en donde el polímero de poliisopreno tiene un valor 813C del cual está dentro de la escala de -34¾> a -24%,. Este poliisopreno puede tener un valor 613C que esté dentro de la escala de -34¾> a -25¾>. En algunos casos el polímero de poliisopreno tendrá un valor 813C que esté dentro de la escala de -33&> a -25¾>. En otros casos el polímero de poliisopreno tendrá un valor 613C que esté dentro de la escala de -32¾> a -25¾>. El polímero de poliisopreno puede tener un contenido de microestructura cis-1,4- de menos de 99.8%. En otros casos el polímero de poliisopreno tendrá un contenido de microestructura cis- 1,4-de menos de 99.7%. En aún otros casos el polímero de poliisopreno tendrá un contenido de microestructura cis- 1,4-de menos de 99.5% o incluso menos de 99%. En muchos casos el polímero de poliisopreno tendrá un contenido de microestructura cis- 1,4- de menos de 98.5% o todavía menos de 98%. Este polímero de poliisopreno puede tener también una polidispersión de menos de 2.0 o incluso menos de 1.8.· En algunos casos el polímero de poliisopreno tiene una polidispersión de menos de 1.6 o incluso menos de 1.5. En aún otros casos el polímero de poliisopreno puede tener una polidispersión de menos de 1.4 o incluso menos de 1.2. En muchos casos, el polímero de poliisopreno tendrá una polidispersión de menos de 1.1. (5) Un polímero de poliisopreno que comprende unidades de repetición que se derivan de monómero de isopreno, en donde el polímero de poliisopreno tiene un contenido de microestructura 3,4- de más de 2%, y en donde el polímero de poliisopreno tiene un valor 513C del cual está dentro de la escala de -34t¾ a -24&>. Estos polímeros de poliisopreno pueden tener un valor 513C que esté dentro de la escala de -34¾> a -251O. En algunos casos el polímero de poliisopreno es de un valor 513C que esté entre la escala de -33¾> a -25¾>. En otros casos el polímero de poliisopreno tendrá un valor 513C que esté dentro de la escala de -32¾> a -25¾>. El polímero de poliisopreno puede tener un contenido de microestructura 3,4- de más de .5%. En algunos casos el polímero de poliisopreno tendrá un contenido de microestructura 3,4- de más de 10%. En otros casos el polímero de poliisopreno tendrá un contenido de microestructura 3,4- de más de 15%. En aún otros casos el polímero de poliisopreno tendrá un contenido de microestructura 3,4- de más de 20%. En muchos casos el polímero de poliisopreno tendrá un contenido de microestructura 3,4- de más de 25%. Este polímero de poliisopreno puede tener una polidispersión de menos de 2.0. En algunos casos el polímero de poliisopreno tendrá una polidispersión de menos de 1.8. En otros casos el polímero de poliisopreno tendrá una polidispersión de menos de 1.6. En aún otros casos el polímero de poliisopreno tendrá una polidispersión de menos de 1.5 o incluso menos de 1.4. En muchos casos el polímero de poliisopreno tendrá una polidispersión de menos de 1.2 o incluso menos de 1.1. (6) Un polímero de poliisopreno que comprende unidades de repetición que se derivan de monómero de isopreno, en donde el polímero de poliisopreno tiene un contenido de microestructura 1,2- de más de 2%, y en donde el polímero de poliisopreno tiene un valor 613C el cual está dentro de la escala de -34¾> a -24&>. Los polímeros de poliisopreno de este tipo pueden tener un valor 613C que esté dentro de la escala de -34¾> a -25&>. En algunos casos, el polímero de poliisopreno tendrá un valor 613C que esté dentro de la escala de -33&> a -25¾>. En otros casos, el polímero de poliisopreno tendrá un valor 513C que esté dentro de la escala de -32&> a -25¾>. El polímero de poliisopreno puede tener un contenido de microestructura 1,2- de más de 5%. En algunos casos, el polímero de poliisopreno tendrá un contenido de microestructura 1,2- de más de 10%. En otros casos, el polímero de poliisopreno tendrá un contenido de microestructura 1,2- de más de 15%. En aún otros casos, el polímero de poliisopreno tendrá un contenido de microestructura 1,2- de más de 20%. En muchos casos, el polímero de poliisopreno tendrá un contenido de microestructura 1,2- de más de 25%. El polímero de poliisopreno puede tener una polidispersión de menos de 2.0.
En algunos casos, el polímero de poliisopreno tendrá una •polidispersión de menos de 1.8. En otros casos, el polímero de poliisopreno tendrá una polidispersión de menos de 1.6. En aún otros casos, el polímero de poliisopreno tendrá una polidispersión de menos de 1.5. En muchos casos, el polímero de poliisopreno tendrá una polidispersión de menos de 1.4 o incluso menos de 1.2. Es posible que el polímero de poliisopreno tenga una polidispersión de menos de 1.1. (7) Un polímero que comprende unidades de repetición que se derivan de monómero de isopreno y al menos un monómero adicional, en donde el polímero incluye bloques de unidades de repetición que se derivan de isopreno, y en donde los bloques de unidades de repetición que se derivan de isopreno tienen un valor 513C de más de -22¾. Estos polímeros de poliisopreno pueden tener un valor 613C que sea mayor que - 21¾>. En algunos casos, el polímero de poliisopreno tendrá un valor 613C que sea mayor que -20¾>. En otros casos, el polímero de poliisopreno tendrá un valor 513C que esté dentro de la escala de -22&> a -10¾>. En aún otros casos, el polímero de poliisopreno tendrá un valor 513C que esté dentro de la escala de -21¾> a -12¾>. En muchos casos, el polímero de poliisopreno tendrá un valor 613C que esté dentro de la escala de -20¾, a -14¾>. (8) Un polímero que comprende unidades de repetición que se derivan de monómero de isopreno y al menos un monómero adicional, en donde el polímero incluye bloques de unidades de repetición que se derivan de isopreno, y en donde los bloques de unidades de repetición que se derivan de isopreno tienen un valor 613C que está dentro de la escala de -34%> a -24¾>. Estos copolímeros pueden tener un valor 513C que esté dentro de la escala de -34t¾ a -25¾>. En algunos casos, el copolímero de este tipo tendrá un valor 613C que esté dentro de la escala de -33¾> a -25¾>. En otros casos, copolímeros de este tipo tendrán un valor 613C que esté dentro de la escala de -32&> a -25¾>. Copolímeros de este tipo pueden ser copolímeros ahulados de isopreno y 1 , 3 -butadieno, copolímero ahulado de isopreno y estireno, copolímeros ahulados de isopreno y Ot-metilestireno, y similares. (9) Un polímero de poliisopreno líquido que comprende unidades de repetición que se derivan de monómero de isopreno, en donde el polímero de poliisopreno tiene un peso molecular promedio en peso que está dentro de la escala de 5,000 a 100,000, y en donde el polímero de poliisopreno tiene un valor 513C del cual está dentro de la escala de -34¾> a -24&>. Estos polímeros de poliisopreno líquidos pueden tener un valor 513C que esté dentro de la escala de -34¾¿ a -25¾>. En algunos casos, el polímero de poliisopreno líquido tendrá un valor 613C que esté dentro de la escala de -33t¾ a -25¾>. En otros casos, el polímero de poliisopreno líquido tendrá un valor 513C que esté dentro de la escala de -32¾> a -25¾>. Estos polímeros de poliisopreno líquidos pueden tener un peso molecular promedio en peso que esté dentro de la escala de 20,000 a 80,000. En algunos casos, el polímero de poliisopreno líquido tendrá un peso molecular promedio en peso el cual esté dentro de la escala de 30,000 a 50,000. En otros casos, el polímero de poliisopreno tendrá una polidispersión de menos de 2.0 o incluso menos de 1.8. en aún otros casos, el polímero de poliisopreno líquido tendrá una polidispersión de menos de 1.6 o incluso menos de 1.5. En muchos casos, el polímero de poliisopreno líquido tendrá una polidispersión de menos de 1.4 o incluso menos de 1.2. Es posible que el polímero de poliisopreno líquido tenga una polidispersión de menos de 1.1. (10) Un polímero de poliisopreno líquido que comprende unidades de repetición que se derivan de monómero de isopreno, en donde el polímero de poliisopreno líquido tiene un peso molecular promedio en peso que está dentro de la escala de 5,000 a 100,000, y en donde el polímero de poliisopreno líquido tiene un valor 513C al cual está dentro de la escala de -34¾> a -24&>. Estos polímeros de poliisopreno líquidos pueden tener un valor 613C que esté dentro de la escala de -34§¾ a -25§¡>. En algunos casos, el polímero de poliisopreno líquido tendrá un valor 513C que esté dentro de la escala de -33¾> a -25¾>. En aún otros casos, el polímero de poliisopreno líquido tendrá un valor 613C que esté dentro de la escala de -32¾ a -25&>. Este poliisopreno líquido puede tener un peso molecular promedio en peso que esté dentro de la escala de 20,000 a 80,000. El poliisopreno líquido tendrá un peso molecular promedio en peso que esté dentro de la escala de 30,000 a 50,000. Este poliisopreno líquido puede tener una polidispersión de menos de 2.0. En algunos casos, el polímero de poliisopreno líquido tendrá una polidispersión de menos de 1.8. En otros casos, el polímero de poliisopreno líquido tiene una polidispersión de menos de 1.6. En aún otros casos, el polímero de poliisopreno líquido tendrá una polidispersión de menos de 1.5 o incluso menos de 1.4. En muchos casos, el polímero de poliisopreno líquido tendrá una polidispersión de menos de 1.2 o incluso menos de 1.1.
Esta invención se ilustra por los siguientes ejemplos que son simplemente con el propósito de ilustración y no deben considerarse como limitando el alcance de la invención o la manera en la cual puede llevarse a la práctica. A menos que se indique específicamente lo contrario, las partes y porcentajes se dan en peso.
Ejemplos Los ejemplos, que intentan ser puramente ejemplares de la invención y por lo tanto no deben considerarse que limiten la invención de ninguna manera, también describen y detallan aspectos y modalidades de la invención descritos arriba. A menos que se indique lo contrario, la temperatura está en grados centígrados y la presión está en o cerca de la presión atmosférica. Los siguientes ejemplos y descripción detallada se ofrecen a manera de ilustración y no a manera de limitación. Todas las publicaciones, solicitudes de patente y patentes citadas en esta descripción se incorporan en la presente a manera de referencia como si cada publicación, solicitud de patente o patente individual estuviera indicada específica e individualmente como incorporada por referencia. En particular, todas las publicaciones citadas en la presente se incorporan expresamente en la presente a manera de referencia con el propósito de describir y divulgar composiciones y metodologías que pudieran ser usadas en relación con la invención. Aunque la anterior descripción ha sido descrita en cierto detalle a manera de ilustración y ejemplo por motivos de claridad o entendimiento, será fácilmente aparente para aquellos de capacidad ordinaria en la técnica en vista de las enseñanzas de esta invención, que ciertos cambios y modificaciones pueden hacerse a la misma sin alejarse del espíritu o alcance de las reivindicaciones anexas .
En la práctica de esta invención, el análisis 13C puede hacerse al cargar muestras de 0.5 a 1.0 mg en copas de estaño para el análisis isotópico de carbono usando un analizador elemental Costech ECS4010 como una entrada para un espectrómetro de masas de relación isotópica ThermoFinnigan Delta Plus XP. Las muestras son goteadas en un reactor de combustión de óxido cobaltoso/cobáltico a 1,020°C con gases de combustión siendo pasados en una corriente de helio a 85 mL/min a través de un reactor de cobre (650°C) para convertir N0X en N2. C02 y N2 son separados usando una columna de tamiz molecular 3-m de 5Á. Luego, las relaciones 13C/12C son calibradas a la escala VPDB usando dos estándares de laboratorio (Acetanilida B, -29.52 ± 0.02&. y almidón de maíz A, -11.01 ± 0.02&>) los cuales han sido cuidadosamente calibrados a la escala de VPDB por medio de combustión fuera de línea y análisis de doble entrada usando el enfoque de 2 estándares de T. B. Copien et al., New Guidelines for 613C Measurements, Anal. Chem. , 78, 2439-2441 (2006). Las enseñanzas de Copien se incorporan en la presente a manera de referencia con el propósito de enseñar la técnica para determinar valores 613C.
Ejemplo 1 Producción de isopreno en E. coli que expresa isopreno sintasa de kudzu recombinante I. Construcción de vectores para expresión de la isopreno sintasa de kudzu en E. coli La secuencia de proteínas del gen de isopreno sintasa de kudzu (Pueraria montana) (IspS) se obtuvo de GenBank (AAQ84170) . Un gen de isopreno sintasa de kudzu, optimizado para uso de codones de E. coli, se compró de DNA2.0 (SEQ ID NO: 1) . El gen de isopreno sintasa se retiró del plásmido suministrado mediante digestión con endonucleasa de restricción con BspLUlll/PstI , se purificó en gel y se ligó en pTrcHis2B (Invitrogen) que había sido digerido con Ncol/PstI . La construcción fue diseñada de tal manera que el codón de paro en el gen de isopreno sintasa 5' al sitio PstI . Como resultado, cuando la construcción fue expresada el marcador His no se fijó a la proteína isopreno sintasa. El plásmido resultante, pTrcKudzu, fue verificado por secuenciación (figuras 2 y 3) .
El gen de isopreno sintasa también fue clonado en pET16b (Novagen) . En este caso, el gen de isopreno sintasa se insertó en pET16b de tal manera que la proteína isopreno sintasa recombinante contuviera el marcador His N-terminal. El gen de isopreno sintasa se amplificó a partir de pTrcKudzu por PCR usando el conjunto de cebadores pET-His-Kudzu-2F : 5'-CGTGAGATCATATGTGTGCGACCTCTTCTCAATTTAC (SEQ ID NO : 3) y pET-His-Kudzu-R: 5 ' -CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAGCTG (SEQ ID NO: 4) . Estos cebadores añadieron un sitio Ndel en el extremo 5' y un sitio BamHl en el extremo 3' del gen respectivamente. El plásmido pTrcKuzdu, descrito arriba, se usó como ADN de plantilla, se usó polimerasa Herculase (Stratagene) de acuerdo con las direcciones del fabricante y los cebadores fueron añadidos a una concentración de 10 pMoles . La PCR se llevó a cabo en un volumen total de 25 µ? .
El producto de PCR se digirió con Ndel/BamHl y se clonó en pET16b digerido con las mismas enzimas. La mezcla de ligación se transformó en E. coli ToplO (Invitrogen) y el clon corregido se seleccionó por secuenciación . El plásmido resultante, en el cual el gen de isopreno sintasa de kudzu fue expresado del promotor T7 , fue designado pETNHisKudzu (figuras 4 y 5) .
El gen de isopreno sintasa de kudzu también fue clonado en el plásmido de bajo número de copias pCL1920. Se usaron cebadores para amplificar el gen de isopreno sintasa de kudzu de pTrcKudzu descrito arriba. El cebador hacia adelante añadió un sitio JíindIII y un RBS de consenso de E. coli al extremo 5'. El sitio de clonación PstI ya estaba presente en pTrcKudzu justo 3' del codón de paro por lo que el cebador hacia atrás fue construido de tal manera que el producto de PCR final incluyera el sitio PstI . Las secuencias de los cebadores fueron: HindlII -rbs-Kudzu F: 5'-CATATGAAAGCTTGTATCGATTAAATAAGGAGGAATAAACC (SEQ ID NO: 6) y BamHl-Kudzu R: 5 ' -CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAGCTG (SEQ ID N0:4). El producto de PCR se amplificó usando polimerasa Herculase con cebadores a una concentración de 10 pmoles y con 1 ng de ADN de plantilla (pTrcKudzu) . El protocolo de amplificación incluyó 30 ciclos de (95°C durante 1 minuto, 60°C durante 1 minuto, 72°C durante 2 minutos) . El producto fue digerido con HindIII y PstI y ligado en pCL1920 que también había sido digerido con HindIII y PstI. La mezcla de ligación se transformó en E. coli ToplO . Varios transformantes fueron verificados por secuenciación . El plásmido resultante fue designado pCL-lac-Kudzu (figuras 6 y 7) .
II. Determinación de la producción de isopreno Para los cultivos en matraz de agitación, un mi de un cultivo se transfirió de matraces de agitación a frascos con espacio superior CTC de 20 mi (Agilent tubo cat# 5188 2753; cap cat# 5188 2759). La tapa se atornilló apretadamente y los frascos se incubaron a la temperatura equivalente con agitación a 250 rpm. Después de 30 minutos los frascos fueron removidos de la incubadora y analizados como se describe abajo (véase tabla 1 para algunos valores experimentales de este ensayo) .
En casos en los que la producción de isopreno en termentadores fue determinada, se tomaron muestras del gas de evolución del termentador y se analizaron directamente como se describe abajo (véase tabla 2) para algunos valores experimentales de este ensayo) .
El análisis se llevó a cabo usando un sistema Agilent 6890 GC/MS interconectado con un automuestreador CTC Analytics (Suiza) CombiPAL que operaba en modo de espacio superior. Una columna Agilent HP-5MS GC/MS (30 mx 0.25 mm; espesor de película de 0.25 m) se usó para la separación de analitos. El muestreador se estableció para inyectar 500 µ?? de gas de espacio superior. El método GC/MS utilizó helio como el gas portador a un flujo de 1 ml/minuto. El puerto de inyección se mantuvo a 250°C con una relación de división de 50:1. La temperatura del horno se mantuvo a 37°C durante la duración de 2 minutos del análisis. El detector de selectivo de masas Agilent 5793N se corrió en modo de monitoreo de un solo ión (SIM) en m/z 67. El detector fue apagado de 1.4 a 1.7 minutos para permitir la elución de gases permanentes. Bajo estas condiciones isopreno (2-metil-l, 3-butadieno) fue observado que eluía a 1.78 minutos. Una tabla de calibración se usó para cuantificar la cantidad absoluta de isopreno y se encontró que era lineal de 1 ug/L a 200 µg/L. El límite de detección se estimó como de 50 a 100 ng/L usando esté método.
III. Producción de isopreno en matraces de agitación que contienen células de E. coli que expresan isopreno sintasa recombinante Los vectores descritos arriba fueron introducidos en la cepa BL21 de E. coli (Novagen) para producir las cepas BL2l/ptrcKudzu, BL2l/pCL-lac-Kudzu y BL2l/pETHisKudzu. Las cepas fueron dispersas para aislamiento en LA (agar Luria) y carbenicilina (50 ug/ml) y se incubaron durante la noche a 37°C. Colonias individuales fueron inoculadas en matraces de agitación con mampara de 250 mi que contenían 20 mi de caldo Luria Bertani (LB) y carbenicilina (100 . Los cultivos se hicieron durante la noche a 20°C con agitación a 200 rpm. La OD600 de los cultivos nocturnos se midió y los cultivos se diluyeron en un matraz de agitación con mamparas de 250 mi que contenían 30 mi de MagicMedia (Invitrogen) y carbenicilina (100 g/ml) hasta una OD60o -0.05. El cultivo se incubó a 30°C con agitación a 200 rpm. Cuando la OD60o fue de -0.5-0.8, 400 µ? de IPTG se añadieron y las células se incubaron durante 6 horas más a 30°C con agitación a 200 rpm. 0, 2, 4 y 6 horas después de la inducción con IPTG, alícuotas de 1 mi de los cultivos se tomaron, la OD6oo se determinó y la cantidad de isopreno producido se midió como se describió arriba. Los resultados se muestran en la figura 8.
IV Producción de isopreno a partir de BL21/ptrcKudzu en fermentación de 14 litros La producción a gran escala de isopreno a partir de E. coli que contenía el gen de isopreno sintasa de kudzu recombinante se determinó a partir de un cultivo de alimentación intermitente. La receta para el medio de fermentación (TM2) por litro de medio de fermentación fue la siguiente: K2HP04 13.6 g, KH2P04 13.6 g, MgS04*7H20 2 g, ácido cítrico monohidratado 2 g, citrato de amonio férrico 0.3 g, (NH4)2S04 3.2g, extracto de levadura 5 g, solución de metal de traza 1000X modificada 1 mi. Todos los componentes se añadieron juntos y se disolvieron en diH20. El pH se ajustó a 6.8 con hidróxido de potasio (KOH) y cantidad suficiente hasta el volumen. El producto final se filtró esterilizado con filtro de 0.22 µ (solo, no sometido a autoclave) . La receta para la solución de metales residuales modificada 1000X fue la siguiente: ácidos cítricos * H20 40 g, MnS04 * H20 30 g, NaCl 10 g, FeS04 * 7H20 1 g, CoCl2 * 6H20 1 g, ZnSO * 7H20 1 g, CuS04 * 5H20 100 mg, H3B03 100 mg, NaMo04 * 2H20 100 mg. Cada componente se disolvió uno a la vez en diH20, pH a 3.0 con HCl/NaOH, después cantidad suficiente hasta el volumen y se esterilizó por filtro, con un filtro de 0.22 µ.
Este experimento se llevó a cabo en un biorreactor de 14 L para monitorear la formación de isopreno a partir de glucosa a la fermentación deseada, pH 6.7 y temperatura de 34°C. Un inoculo de la cepa BL21 /pt rcKudzu de E. coli tomado de un tubo congelado se preparó en medio de soytone - ext racto de levadura-glucosa. Después de que el inoculo creció hasta OD550 = 0.6 , dos matraces de 600 mi se centrifugaron y los contenidos se resuspendieron en 70 mi de sobrenadante para transferir el sedimento celular (70 mi de material OD 3.1) al biorreactor. Varios momentos después de la inoculación, las muestras fueron removidas y la cantidad de isopreno producida se determinó como se describió arriba. Los resultados se muestran en la figura 9.
Ejemplo 2 Producción de isopreno en E. coli que expresa isopreno sintasa de álamo recombinante La secuencia de proteínas para la isopreno sintasa de álamo (Populus alba x Populus trémula) (Schnitzler, J-P, et al. (2005) Planta 222:777 -786) se obtuvo de GenBank (CAC35696) . Un gen, optimizado en codones para E. coli, se compró de DNA2.0 (p9796-álamo, figuras 30 y 31). El gen de isopreno sintasa se removió del plásmido suministrado por digestión con endonucleasa de restricción con BspLUIl/PstI , se purificó en gel y se ligó en pTrcHis2B que había sido digerido con NcoI/PstI. La construcción es clonada de tal manera que el codón de paro en el inserto esté antes del sitio PstI , lo cual da como resultado una construcción en la cual el marcador His no está fijado a la proteína isopreno sintasa. El plásmido resultante pTrcPoplar (figuras 32 y 33), se verificó por secuenciación .
Ejemplo 3 Producción de isopreno en Panteoa citrea que expresa isopreno sintasa de kudzu recombinante Los plásmidos pTrcKudzu y pCL-lac Kudzu descritos en el ejemplo 1 se electroporaron en P. citrea (patente de E.U.A. No. 7,241,587) . Los transformantes se seleccionaron en LA que contenía carbenicilina (200 µg/ml) o espectinomicina (50 µg/ml) respectivamente. La producción de isopreno a partir de matraces de agitación y la determinación de la cantidad de isopreno producida se llevó a cabo como se describió en el ejemplo 1 para cepas de E. coli que expresan isopreno sintasa de kudzu recombinante . Los resultados se muestran en la figura 10.
Ejemplo 4 Producción de isopreno en Bacillus subtilis que expresa isopreno sintasa de kudzu recombinante I. Construcción de un plásmido de replicación B. subtilis para la expresión del isopreno sintasa de kudzu El gen de isopreno sintasa de kudzu se expresó en la cepa Bacillus subtilis aprEnprE Pxyl-comK (BG3594comK) usando un plásmido de replicación (pBS19 con un cásete de resistencia a cloranfenicol) bajo el control del promotor aprE. El gen de isopreno sintasa, el promotor de aprE y el terminador de transcripción se amplificaron por separado y se fusionaron usando PCR. La construcción se clonó después en pBS19 y se transformó en B. subtilis . a) Amplificación del promotor aprE el promotor aprE se amplificó a partir de ADN cromosómico de Bacillus subtilis usando los siguientes cebadores : CF 797 (+) promotor aprE de inicio fel 5 ' GACATCAATTGCTCCATTTTCTTCTGCTATC (SEQ ID NO : 58) CF 07-43 (-) promotor de'aprE de fusión a Kudzu ispS 5 ' -ATTGAGAAGAGGTCGCACACACTCTTTACCCTCTCCTTTTA (SEQ ID NO: 59) b) Amplificación del gen de isopreno sintasa El gen de isopreno sintasa de kudzu se amplificó a partir del plásmido pTrcKudzu (SEQ ID NO: 2) . El gen había sido optimizado en codones para E. coli y se sintetizó mediante DNA2.0. Se usaron los siguientes cebadores : CF 07-42 ( +) fusión del promotor aprE a gen de isopreno sintasa de kudzu (codón de inicio GTG) 5 ' -TAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGTGTGCGACCTCTTCTCAAT (SEQ ID NO:60) CF 07-45 (-) fusión en el extremo 3' del gen de isopreno sintasa de kudzu al terminador 5 ' -CCAAGGCCGGTTTTTTTTAGACATACATCAGCTGGTTAATC (SEQ ID NO: 61) c) Amplificación del terminador de transcripción El terminador de la serina proteasa alcalina de Bacillus amyliquefaciens se amplificó a partir de un plásmido pJHPms382 usando los siguientes cebadores: CF 07-44 (+ ) fusión del extremo 3' de isopreno sintasa de kudzu al terminador 5' -GATTAACCAGCTGATGTATGTCTAAAAAAAACCGGCCTTGG (SEQ ID NO: 62) CF 07-46 (-) extremo de terminador de B. amyliquefaciens (BamHI) 5 ' -GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (SEQ ID NO: 63) El fragmento de kudzu se fusionó al fragmento terminador usando PCR con los siguientes cebadores: CF 07-42 (+ ) fusión del promotor aprE a gen de isopreno sintasa de kudzu (codón de inicio GTG) 5 ' -TAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGTGTGCGACCTCTTCTCAAT (SEQ ID NO: 61) CF 07-46 (-) fin de terminador de B . amyliquefanciens (BamHI) 5 ' -GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (SEQ ID NO: 63) El fragmento de kudzu-terminador se fusionó al fragmento promotor usando PCR con los siguientes cebadores: CF 07-97 (+) promotor aprE de inicio Mfel 5 ' -GACATCAATTGCTCCATTTTCTTCTGCTATC (SEQ ID NO: 64) CF 07-46 (-) Extremo de terminador de B . amyliquefanciens (BamHI) 5 ' GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (SEQ ID NO : 63) El fragmento de PCR de fusión se purificó usando un equipo Qiagen y se digirió con las enzimas de restricción Mfel y BamHI. El fragmento de ADN digerido se purificó en gel usando un equipo Qiagen y se ligó a un vector conocido como pBS19, el cual había sido digerido con EcoRI y BamHI y purificado en gel.
La mezcla de ligación se transformó en células Top 10 de E. coli y las colonias se seleccionaron en placas de LA y 50 carbenicilina . Un total de seis colonias se seleccionaron y se cultivaron durante la noche en LB y 50 carbenicilina y luego los plásmidos se aislaron usando un kit Qiagen. Los plásmidos fueron digeridos con EcoRI y BamHI para verificar insertos y tres de los plásmidos correctos fueron enviados para secuenciación con los siguientes cebadores : CF 149 (+) inicio EcoRI de promotor aprE 5 ' -GACATGAATTCCTCCATTTTCTTCTGC (SEQ ID NO : 65) CF 847 (+) secuencia en pXX 049 (extremo de promotor aprE) CF 07-45 (-) fusión del extremo 3' de isopreno sintasa de kudzu al terminador T" -CCAAGGCCGGTTTTTTTTAGACATACATCAGCTGGTTAATC (SEQ ID NO: 61) CF 07-48 (+) cebador de secuenciación para isopreno sintasa de kudzu 5' -CTTTTCCATCACCCACCTGAAG (SEQ ID NO: 67) CF 07-49 (+) secuenciamiento en isopreno sintasa de kudzu 5' -GGCGAAATGGTCCAACAACAAAATTATC (SEQ ID NO : 68) El plásmido designado pBS Kudzu #2 (figuras 52 y 12) fue correcto mediante secuenciación y se transformó en BG 3594 comK, una cepa hospedera de Bacillus subtilis . La selección se hizo en placas de LA y 5-cloranfenicol . Un transformante se seleccionó y se fijó a colonias individuales en LA y 5-cloranfenicol , luego se cultivó en LB y 5 cloranfenicol hasta que alcanzara una OD60o de 1.5. Se almacenó congelado en un tubo a -80°C en presencia de glicerol. La cepa resultante fue designada CF 443.
II. Producción de isopreno en matraces de cultivo que contienen células de B. subtilis que expresan isopreno sintasa recombinante Cultivos nocturnos fueron inoculados con una sola colonia de CF 443 de un LA y cloranfenicol (Cm, 25 µg/ml) . Los cultivos se hicieron en LB y Cm a 37°C con agitación a 200 rpm. Esos cultivos nocturnos (1 mi) se usaron para inocular matraces de agitación con mampara de 250 mi que contenían 25 mi de medio Grants II y cloranfenicol a una concentración final de 25 µg/ml . La receta del medio Grants II fue 10 g de soytone, 3 mi de K2HP04 1M, 75 g de glucosa, 3.6 g de urea, 100 mi de 10X MOPS, cantidad suficiente hasta 1 L con H20, pH 7.2; la receta de 10X MOPS fue 83.72 g de MOPS, 7.17 g de tricina, 12 g de gránulos de KOH, 10 mi de solución de K2S04 0.276M, 10 mi de solución de MgCl2 0.528M, 29.22 g de NaCl , 100 mi de micronutrientes 100X, cantidad suficiente hasta 1 L con H20; y la receta de los micronutrientes 100X fue 1.47 g de CaCl2*2H20, 0.4 g de FeS04*7H20, 0.1 g de MnS04*H20, 0.1 g de ZnS04*H20, 0.05 g de CuCl2*2H20, 0.1 g de CoCl2*6H20, 0.1 g de Na2Mo04*2H20, cantidad suficiente hasta 1 L con H20. Los matraces de agitación fueron incubados a 37 °C y se tomaron muestras 18, 24 y 44 horas después. 18 Horas después los espacios superiores de CF443 y la cepa de control fueron muestreados. Esto representó 18 horas de acumulación de isopreno. La cantidad de isopreno se determinó mediante cromatografía de gas como se describe en el ejemplo 1. La producción de isopreno se incrementó significativamente al expresar isopreno sintasa recombinante (figura 11) .
III. Producción de isopreno mediante CF443 en fermentación de 14 L La producción a gran escala de isopreno a partir de B. subtilis que contiene el gen de isopreno sintasa de kudzu recombinante en un plásmido de replicación fue determinada a partir de un cultivo de alimentación intermitente. La cepa de Bacillus CF 443, que expresa un gen de isopreno sintasa de kudzu, o la cepa de control que no expresa un gen de isopreno sintasa de kudzu se cultivaron mediante fermentación de alimentación intermitente convencional en un medio nutriente que contenía harina de soya (Cargill) , fosfato de sodio y potasio, sulfato de magnesio y una solución de ácido cítrico, cloruro férrico y cloruro de manganeso. Antes de la fermentación el medio se maceró durante 90 minutos usando una mezcla de enzimas incluyendo celulasas, hemicelulasas y pectinasas (véase, WO95/04134) . Las fermentaciones intermitentes de 14 L se alimentan con 60% p/p de glucosa (Cargill DE99 dextrosa, ADM Versadex greens o azúcar invertido Danisco) y 99% p/p de aceite (aceite de soya Western Family, en donde 99% p/p es la concentración de aceite antes de que se añadiera al medio de cultivo de células) . La alimentación se inició cuando la glucosa en el lote no era detectable . La velocidad de alimentación se elevó durante varias horas y se ajustó para añadir aceite sobre una base de carbono igual. El pH se controló a 6.8-7.4 usando 28% p/v de hidróxido de amonio. En caso de formación de espuma, se añadió un agente contra la formación de espuma al medio. La temperatura de fermentación se controló a 37°C y el cultivo de fermentación se agitó a 750 rpm. Varios otros parámetros tales como pH, DO%, flujo de aire, y presión se monitorearon a lo largo del proceso completo. El DO% se mantiene arriba de 20. Se tomaron muestras durante el curso de tiempo de 36 horas y se analizaron para crecimiento celular (OD550) y producción de isopreno. Los resultados de estos experimentos se presentan en las figuras 53A y 53B.
IV. Integración de la isopreno sintasa de kudzu (ispS) en B. subtilis El gen de isopreno sintasa de kudzu se clonó en un plásmido de integración (pJHlOl-cmpR) bajo el control del promotor de aprE. Bajo las condiciones probadas, no se detectó isopreno.
Ejemplo 5 Producción de isopreno en Trichoderma I. Construcción de vectores para la expresión de la isopreno sintasa de kudzu en Trichoderma reesei El gen IS de Kudzu optimizado en codones para Yarrowia lipolytica se sintetizó mediante DNA 2.0 (SEQ ID NO:8) (figura 13). Este plásmido sirvió como la plantilla para la siguiente reacción de amplificación por PCR: 1 µ? de plantilla de plásmido (20 ng/ul) , 1 µ? de cebador EL-945 (10 uM) 5' -GCTTATGGATCCTCTAGACTATTACACGTACATCAATTGG (SEQ ID NO: 9), 1 µ? de cebador EL-965 (10 uM) 5'-CACCATGTGTGCAACCTCCTCCCAGTTTAC (SEQ ID NO: 10), 1 µ? de dNTP (10 mM) , 5 µ? 10x de PfuUltra II Fusión de regulador de pH de polimerasa HS ADN, 1 µ? de PfuUltra II fusión de polimerasa HS ADN, 40 µ? de agua en un volumen de reacción total de 50 µ? . El cebador hacia adelante contenía 4 nucleótidos adicionales en el extremo 5' que no correspondieron al gen de isopreno sintasa de kudzu optimizado en codones de Y. lipolytica, pero se requirió para la clonación en el vector pENTR/D-TOPO. El cebador hacia atrás contenía 21 nucleótidos adicionales en el extremo 5' que no correspondían al gen de isopreno sintasa de kudzu optimizado en codones de y. lipolytica, pero fueron insertados para clonación en otras estructuras de vectores. Usando el MJ Research PTC-200 Thermocycler, la reacción de PCR se llevó a cabo como sigue: 95 °C durante 2 minutos (primer ciclo únicamente) , 95 °C durante 30 segundos, 55 °C durante 30 segundos, 72 °C durante 30 segundos (repetición durante 27 ciclos) , 72°C durante 1 minuto después del último ciclo. El producto de PCR se analizó en un gel E al 1.2% para confirmar amplificación exitosa del gen de isopreno sintasa de kudzu optimizado en codones de Y. lipolytica.
El producto de PCR se clonó después usando el kit de clonación TOPO pENTR/D-TOPO siguiendo el protocolo del fabricante: 1 µ? de reacción de PCR, 1 µ? de solución de sal, 1 µ? de vector TOPO pENTR/D-TOPO y 3 µ de agua en un volumen de reacción total de 6 µ? . La reacción se incubó a temperatura ambiente durante 5 minutos. Un microlitro de reacción TOPO se transformó en células de E. coli TOP10 químicamente competentes. Los transformantes se seleccionaron en placas de LA y 50 µg/ml de kanamicina. Se recogieron varias colonias y cada una se inoculó en un tubo de 5 mi que contenía LB y 50 µg/ml de kanamicina y los cultivos se hicieron durante la noche a 37°C con agitación a 200 rpm. Se aislaron los plásmidos de los tubos de cultivo nocturno usando QIAprep Spin Miniprep Kit, siguiendo el protocolo del fabricante. Se secuenciaron varios plásmidos para verificar que la secuencia de ADN fuera correcta.
Un solo plásmido pENTR/D-TOPO, que codificaba para un gen de isopreno sintasa de kudzu optimizado en codones de Y. lipolytica , se usó para la clonación Gateway en un vector pTrex3g hecho a la medida. La construcción de pTrex3g se describe en WO 2005/001036 A2. La reacción se llevó a cabo siguiendo el protocolo del fabricante para el Gateway LR Clonase II Enzyme Mix Kit (Invitrogen) : 1 µ? de gen de isopreno sintasa de kudzu optimizado en codones de Y. lipolytica pENTR/D-TOPO vector donador, 1 µ? de vector de destino pTrex3g, 6 µ? de regulador de pH TE, pH 8.0 en un volumen de reacción total de 8 µ? . La reacción se incubó a temperatura ambiente durante una hora y luego 1 µ? de solución de proteinasa K se añadió y la incubación continuó a 37°C durante 10 minutos. Después 1 µ? de reacción se transformó en células TOP10 de E. coli químicamente competentes. Los transformantes se seleccionaron en LA y 50 µg/ml de placas de carbenicilina . Varias colonias se recogieron y cada una fue inoculada en un tubo de 5 mi que contenía LB y 50 µg/ml de carbenicilina y los cultivos se hicieron durante la noche a 37°C con agitación a 200 rpm. Los plásmidos se aislaron de los tubos de cultivo nocturno usando el QIAprep Spin Miniprep kit (Qiagen, Inc.), siguiendo el protocolo del fabricante. Varios plásmidos se secuenciaron para verificar que la secuencia de ADN fuera correcta .
La transformación biolística de plásmido pTrex3g de isopreno sintasa de kudzu optimizado en codones de Y. lipolytica (figura 14) en una cepa de Trichoderma reesei de supresión cuádruple se llevó a cabo usando el Biolistic PDS-1000/HE Partióle Delivery System (véase O 2005/001036 A2) . El aislamiento de transformantes estables y la evaluación del matraz de agitación se llevaron a cabo usando el protocolo listado en el ejemplo 11 de la publicación de patente WO 2005/001036 A2.
II. Producción de isopreno en cepas recombinantes de T. reesei Un mi de cultivos de 15 y 36 horas de edad de transformantes de isopreno sintasa descritos arriba se transfirieron a frascos de espacio superior. Los frascos fueron sellados e incubados durante 5 horas a 30°C. El gas del espacio superior se midió y el isopreno se identificó mediante el método descrito en el ejemplo 1. Dos de los transformantes mostraron trazas de isopreno. La cantidad de isopreno pudo ser incrementada mediante una incubación de 14 horas. Las dos muestras positivas mostraron isopreno a niveles de aproximadamente 0.5 ug/L para el periodo de incubación de 14 horas. El control no transformado no mostró niveles detectables de isopreno. Este experimento muestra que T. reesei es capaz de producir isopreno a partir del precursor endógeno cuando se suministra con una isopreno sintasa exógeno .
Ejemplo 6 Producción de isopreno en Yarrowia I. Construcción de vectores para la expresión de la isopreno sintasa de kudzu en Yarrowia lipolytica El punto de partida para la construcción de vectores para la expresión del gen de isopreno sintasa de kudzu en Yarrowia lipolytica fue el vector pSPZl (MAP29Spb) . La secuencia completa de este vector (SEQ ID NO: 11) se muestra en la figura 15.
Los siguientes fragmentos fueron amplificados por PCR usando ADN cromosómico de una cepa de Y. lipolytica GICC 120285 como la plantilla: Una forma sin promotores del gen URA3 , un fragmento del gen de ARN ribosómico 18S, un terminador de transcripción del gen XPR2 de Y. lipolytica y dos fragmentos de ADN que contenían los promotores de los genes XPR2 e ICL1. Se usaron los siguientes cebadores de PCR.
ICL1 3 5' -GGTGAATTCAGTCTACTGGGGATTCCCAAATCTATATATACTGCAGGTGAC (SEQ ID NO: 69) ICL1 5 5 ' -GCAGGTGGGAAACTATGCACTCC (SEQ ID NO: 70) XPR 3 5 ' -CCTGAATTCTGTTGGATTGGAGGATTGGATAGTGGG (SEQ ID NO: 71) XPR 5 5 ' -GGTGTCGACGTACGGTCGAGCTTATTGACC (SEQ ID NO : 72) XPRT3 5 ' -GGTGGGCCCGCATTTTGCCACCTACAAGCCAG (SEQ ID NO : 73) XPRT 5 5 ' -GGTGAATTCTAGAGGATCCCAACGCTGTTGCCTACAACGG (SEQ ID NO: 74) Y18S3 5 ' -GGTGCGGCCGCTGTCTGGACCTGGTGAGTTTCCCCG (SEQ ID NO : 75) Y18S 5 5 ' -GGTGGGCCCATTAAATCAGTTATCGTTTATTTGATAG (SEQ ID NO: 76) URA3 5 ' -GGTGACCAGCAAGTCCATGGGTGGTTTGATCATGG (SEQ ID NO : 77) YURA 50 5 ' -GGTGCGGCCGCCTTTGGAGTACGACTCCAACTATG (SEQ ID NO : 78) YURA 51 5 ' -GCGGCCGCAGACTAAATTTATTTCAGTCTCC (SEQ ID NO : 79) Para la amplificación por PCR la PfuUltralI polimerasa (Stratagene) , regulador de pH proporcionado por el proveedor y d TPs, 2.5 µ? de cebadores y el ADN de plantilla indicado se usaron de acuerdo con las instrucciones del fabricante. La amplificación se hizo usando el siguiente ciclo: 95°C durante 1 minuto; 34x (95°C durante 30 segundos; 55°C durante 30 segundos; 72 °C durante 3 minutos) y 10 minutos a 72 °C seguidos por una incubación a 4°C.
Moléculas de ADN sintéticas que codificaban para el gen de isopreno sintasa de kudzu, optimizado en codones para expresión en Yarrowia, se obtuvieron de DNA 2.0 (figura 16; SEQ ID NO:12). El detalle completo del esquema de construcción de los plásmidos pYLA(KZl) y pYLI (KZ1) que portan el gen de isopreno sintasa de kudzu sintético bajo el control de los promotores XPR2 e ICL1 respectivamente se presenta en la figura 18. Plásmidos de control en los cuales un gen de factor de acoplamiento (MAP29) es insertado en el lugar de un gen de isopreno sintasa también se construyeron (figura 18E y 18F) .
Se puede usar un procedimiento de clonación similar para expresar un gen de isopreno sintasa de álamo (Populus alba x Populus trémula) . La secuencia del isopreno de álamo se describe en Miller B. et al. (2001) Planta 213, 483-487 y como se muestra en la figura 17 (SEQ ID NO: 13) . Un esquema de construcción para la generación de los plásmidos pYLA (POPI) y pYLI(POPl) que portan el gen de isopreno sintasa de álamo sintético bajo el control de los promotores XPR2 e ICL1 respectivamente se presenta en las figuras 18A y 18B.
II. Producción de isopreno mediante cepas recombinantes de Y. lipolytica Los vectores pYLA(KZl) , pYLI(KZl), pYLA(MAP29) y pYLI(MAP29) se digirieron con SacII y se usaron para transformar la cepa Y. lipolytica CLIB 122 mediante un procedimiento estándar de acetato de litio/polietilenglicol a prototrofia de uridina. Brevemente, las células de levadura cultivadas en YEPD (1% de extracto de levadura, 2% de peptona, 2% de glucosa) durante la noche, fueron recogidos por centrifugación (4000 rpm, 10 minutos) , lavados una vez con agua estéril y suspendidos en acetato de litio 0.1 M, pH 6.0. Alícuotas de 200 µ? de la suspensión se mezclaron con solución de ADN plasmídico linearizado (10-20 ug) , se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente y se mezclaron con 1 mi de 50% de PEG 4000 en el mismo regulador de pH. Las suspensiones fueron incubadas más durante 1 hora a temperatura ambiente seguidas por un choque térmico de 2 minutos a 42 °C. Las células se colocaron después sobre placas SC his leu (0.67% de base de nitrógeno de levadura, 2% de glucosa, 100 mg/1 cada uno de leucina e histidina) . Los transformantes aparecieron después de 3-4 días de incubación a 30°C.
Tres aislados de la transformación de pYLA(KZl) , tres aislados de la transformación de pYLI (KZl) , dos aislados de la transformación de pYLA(MAP29) y dos aislados de la transformación de pYLI (MAP29) se cultivaron durante 24 horas en medio YEP7 (1% de extracto de levadura, 2% de peptona, pH 7.0) a 30°C con agitación. Células de 10 mi de cultivo se recogieron por centrifugación, se resuspendieron en 3 mi de YEP 7 fresco y se pusieron en frascos de tapa roscada de 15 mi . Los frascos se incubaron durante la noche a temperatura ambiente con agitación suave (60 rpm) . El contenido de isopreno en el espacio superior de estos frascos se analizó mediante cromatografía de gases usando el detector espectrométrico de masas como se describió en el ejemplo 1. Todos los transformantes obtenidos con pYLA(KZl) y pYLI(KZl) produjeron cantidades fácilmente detectables de isopreno (0.5 µg/L a 1 ug/L, figuras 20A-20B) . No se detectó isopreno en el espacio superior de las cepas de control que portaban el gen de fitasa en lugar de un gen de isopreno sintasa.
Ejemplo 7 Producción de isopreno en E. coli que expresa isopreno sintasa de kudzu e idi o dxs o idi y dxs I. Construcción de vectores que codifican para isopreno sintasa de kudzu e di o dxs o idi y dxs para la producción de isopreno en E. coli i ) Construcción de pTrcKudzuKan El gen bla de pTrcKudzu (descrito en el ejemplo 1) se reemplazó con el gen que confiere resistencia a kanamicina. Para remover el gen bla, pTrcKudzu se digirió con BspEI , tratado con Fosfatasa Alcalina de Camarón (SAP), inactivado con calor a 65°C, luego relleno en los extremos con fragmento Klenow y d TPs . El fragmento grande de 5 kpb se purificó a partir de un gen de agarosa y se ligó en el gen kanr que había sido amplificado por PCR a partir de pCR-Blunt-II-TOPO usando los cebadores MCM22 5'- GATCAAGCTTAACCGGAATTGCCAGCTG (SEQ ID NO: 14) y MCM23 5'-GATCCGATCGTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGC (SEQ ID NO: 15), digerido con HindIII y Pvul , y relleno en los extremos. Un transformante que portaba un plásmido que confiere resistencia a kanamicina (pTrcKudzuKan) se seleccionó en LA que contenía kanamicina 50 yg/ml . ii) Construcción de pTrcKudzu yIDI Kan pTrcKudzuKan se digirió con PstI, se trató con SAP, se eliminó con calor y se purificó en gel. Fue ligado a un producto de PCR que codificaba para idi de S. cerevisiae con un RBS sintético. Los cebadores de PCR fueron Nsil-YIDI 1 F 5 ' -CATCAATGCATCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAAAATGAC (SEQ ID NO: 16) y PstI-YIDI 1 R 5 ' -CCTTCTGCAGGACGCGTTGTTATAGC (SEQ ID NO: 17); y la plantilla fue ADN genómico de S. cerevisiae . El producto de PCR se digirió con Nsil y PstI y se purificó en gel antes de la ligación. La mezcla de ligación se transformó en células TOP10 químicamente competentes y se seleccionó en LA que contenía 50 pg/ml de kanamicina. Se aislaron varios transformantes y se secuenciaron y el plásmido resultante fue llamado pTrcKudzu-yIDI (kan) (figuras 34 y 35) . iii) Construcción de pTrcKudzu DXS Kan El plásmido pTrcKudzuKan fue digerido con PstI , tratado con SAP, inactivado con calor y purificado en gel . Fue ligado a un producto de PCR que codificaba para dxs de E. coli con un RBS sintético. Los cebadores para PCR fueron MCM13 5'-GATCATGCATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGAGTTTTGATATTGCCAAATACCCG (SEQ ID NO: 18) y MCM14 5 ' -CATGCTGCAGTTATGCCAGCCAGGCCTTGAT (SEQ ID NO: 19); y la plantilla fue ADN genómico de E. coli. El producto de PCR fue digerido con Nsil y PstI y purificado en gel antes de la ligación. La reacción de transformación resultante se transformó en células TOP10 y se seleccionó en LA con kanamicina 50 pg/ml. Se aislaron y secuenciaron varios transformantes y el plásmido resultante fue llamado pTrcKudzu-DXS (kan) (figuras 36 y 37). iv) Construcción de pTrcKudzu-yl l-dxs (kan) pTrcKudzu-yIDI (kan) fue digerido con PstI, tratado con SAP, inactivado con calor y purificado en gel. Se ligó a un producto de PCR que codificaba para dxs de E. coli con un RBS sintético (cebadores MCM13 5'- GATCATGCATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGAGTTTTGATATTGCCAAATACCCG (SEQ ID ?0: 18) y MCM14 5 ' -CATGCTGCAGTTATGCCAGCCAGGCCTTGAT (SEQ ID NO: 19); células TOP10 de plantilla) el cual había sido digerido con Nsil y PstI y purificado en gel. El plásmido final fue llamado pTrcKudzu-yIDI -dxs (kan) (figuras 21 y 22) . v) Construcción de pCL PtrcKudzu Un fragmento de ADN que contenía el gen estructural promotor y terminador del ejemplo 1 anterior fue digerido a partir de pTrcKudzu usando SspI y purificado en gel. Fue ligado a pCL1920 que había sido digerido con PvuII, tratado con SAP y inactivado con calor. La mezcla de ligación resultante se transformó en células TOP10 y se seleccionó en LA que contenía espectinomicina 50 ug/ml. Varios clones fueron aislados y secuenciados y dos fueron seleccionados. pCL PtrcKudzu y pCL PtrcKudzu (A3) tienen el inserto en orientaciones opuestas (figuras 38-41) . vi) Construcción de pCL PtrcKudzu yIDI El amplicón IDI PCR purificado en gel y digerido con Nsil-PstI , del (ii) anterior fue ligado en pCL PtrcKudzu el cual había sido digerido con PstI, tratado con SAP y inactivado con calor. La mezcla de ligación se transformó en células TOP10 y se seleccionó en LA que contenía espectinomicina 50 µg/ml . Varios clones fueron aislados y secuenciados y el plásmido resultante se llamó pCL PtrcKudzu yIDI (figuras 42 y 43) . vii) Construcción de pCL PtrcKudzu DXS el amplicón DXS PCR purificado en gel y digerido con Nsil-Pstl , de (iii) anterior fue ligado en pCL PtrcKudzu (A3) el cual había sido digerido con PstI, tratado con SAP e inactivado con calor. La mezcla de ligación se transformó en células TOP10 y se seleccionó en LA que contenía espectinomicina 50 µg/ml. Varios clones fueron aislados y secuenciados y el plásmido resultante es llamado pCL PtrcKudzu DXS (figuras 44 y 45) .
II. Medición de isopreno en espacio superior de cultivos que expresan isopreno sintasa de kudzu, idi y/o dxs a diferentes números de copias Cultivos de E. coli BL21^DE3) previamente transformados con plásmidos pTrcKudzu (kan) (A), pTrcKudzu-ylDI kan (B) , pTrcKudzu-DXS kan (C) , pTrcKudzu-yIDI -DXS kan (D) fueron hechos en LB kanamicina 50 Los cultivos de pCL PtrcKudzu (E) , pCL PtrcKudzu, pCL PtrcKudzu-yIDI (F) y pCL PtrcKudzu-DXS (G) se hicieron en LB espectinomicina 50 Ug/mL. Los cultivos fueron inducidos con 400 µ? de IPTG en el tiempo 0 (OD60o de aproximadamente 0.5) y se tomaron muestras para medición del espacio superior de isopreno (véase ejemplo 1) . Los resultados se muestran en las figuras 23A-23G.
El plásmido pTrcKudzu-yIDI -dxs (kan) fue introducido en la cepa BL21 de E. coli por transformación. La cepa resultante BL21/pTrc Kudzu IDI DXS se cultivó durante la noche en LB que contenía kanamicina (50 µg/ml) a 20°C y se usó para inocular matraces de agitación de TM3 (13.6 g, K2P04, 13.6 g de KH2P04, 2.0 g de MgS04*7H20) , 2.0 g de ácido cítrico monohidratado, 0.3 g de citrato de amonio férrico, 3.2 g de (NH4)2S04, 0.2 g de extracto de levadura, 1.0 mi de solución de metal residual modificada lOOOx, ajustada a pH 6.8 y cantidad suficiente para H20, y esterilizada con filtro) que contenía 1% de glucosa. Los matraces fueron incubados a 30°C hasta que se alcanzara una OD60o a 0.8, y luego se indujeron con 400 µ? de IPTG. Se tomaron muestras en varios tiempos después de la inducción y la cantidad de isopreno en el espacio superior se midió como se describió en el ejemplo 1. Los resultados se muestran en la figura 23H.
III. Producción de isopreno a partir de biomasa en E. coli/pTrcKudzu yIDI DXS La cepa BL21 pTrcKudzuIDIDXS se probó para la capacidad para generar isopreno a partir de tres tipos de biomasa; bagazo, hojas y troncos de maíz y pulpa de madera suave con glucosa como un control. Hidrolizados de la biomasa se prepararon mediante hidrólisis enzimática (Brown, L y Torget, R. , 1996, NREL standard assay method Lap-009 "Enzymatic Saccharification of Lignocellulosic Biomass") y se usaron a una dilución con base en equivalentes de glucosa. En este ejemplo, los equivalentes de glucosa fueron iguales a 1% de glucosa. Una sola colonia de una placa recién transformada de células de BL21 (DE3) pTrcKudzu yIDI DXS (kan) se usó para inocular 5 mi de LB más kanamicina (50 Ug/ml) . El cultivo se incubó durante la noche a 25°C con agitación. Al día siguiente el cultivo nocturno se diluyó hasta una OD600 de 0.05 en 25 mi de TM3 y 0.2% de YE y 1% de solución de alimentación. La solución de alimentación fue hojas y troncos de maíz, bagazo o pulpa de madera blanda. Se usó glucosa como un control positivo y no se usó glucosa como un control negativo. Los cultivos se incubaron a 30°C con agitación a 180 rpm. El cultivo se monitoreó para OD60o y cuando alcanzó una OD60o de alrededor de 0.8, los cultivos se analizaron a 1 y 3 horas para producción de isopreno como se describió en el ejemplo 1. Los cultivos no son inducidos. Todos los cultivos que contenían solución de alimentación añadida producen isopreno equivalente a aquellos del control positivo de glucosa. Se hicieron experimentos por duplicado y se muestran en la figura 46.
IV. Producción de isopreno a partir de azúcar invertido en E. coli/pTrcKudzuIDIDXS Una sola colonia de una placa recién transformada con células de BL21 (???3 ) /pTrcKudzu yIDI DXS (kan) se usó para inocular 5 mL de LB y kanamicina (50 µg/ml) . El cultivo se incubó durante la noche a 25 °C con agitación. Al día siguiente el cultivo nocturno se diluyó hasta una OD6oo de 0.05 en 25 mi de TM3 y 0.2% de YE y 1% de solución de abastecimiento. La solución de abastecimiento fue glucosa, glucosa invertida u hojas y troncos de maíz. La corriente de alimentación de azúcar invertido (Danisco Invert Sugar) se preparó al tratar enzimáticamente jarabe de sucrosa. Las hojas y troncos AFEX se prepararon como se describe abajo (parte V) . Las células fueron cultivadas a 30°C y la primera muestra se midió cuando los cultivos alcanzaron una OD60o de alrededor de 0.8-1.0 (0 hora). Los cultivos se analizaron para crecimiento según se mide por la OD6oo y para producción de isopreno como en el ejemplo 1 después de 0 , 1 y 3 horas. Los resultados se muestran en la figura 47.
V. Preparación de hidrolizado a partir de hojas y troncos de maíz pre-tratados AFEX Hojas y troncos de maíz pre-tratados AFEX se obtuvieron de Michigan Biotechnology Institute. Las condiciones de pre-tratamiento fueron 60% de humedad, 1:1 de carga de amoniaco y 90°C durante 30 minutos, luego se secaron con aire. El contenido de humedad en las hojas y troncos de maíz pre-tratados AFEX fue de 21.27%. Los contenidos de glucano y xilano en las hojas y troncos de maíz pre-tratados AFEX fueron de 31.7% y 19.1% (base seca), respectivamente. El proceso de sacarificación fue el siguiente: 20 g de hojas y troncos de maíz pre-tratados AFEX se añadieron a un matraz de 500 mi con 5 mL de regulador de pH de citrato de sodio 1M, pH 4.8, 2.25 mi de Accellerase 1000, 0.1 mi de Grindamyl H121 (producto de xilanasa Danisco de Aspergillus niger para la industria de la repostería), y 72.65 mi de agua desionizada. El matraz se puso en un agitador orbital y se incubó a 50°C durante 96 horas. Se tomó una muestra del agitador y se analizó usando HPLC. El hidrolizado contenía 38.5 g/1 de glucosa, 21.8 g/1 de xilosa y 10.3 g/1 de oligómeros de glucosa y/o xilosa.
VI . El efecto de extracto de levadura en la producción de isopreno en E. coli cultivadas en cultivo de alimentación intermitente La fermentación se llevó a cabo en la escala de 14 L como se describió previamente con células de E. coli que contenían el plasmado pTrcKudzu yIDI DXS descrito arriba. Extracto de levadura (Bio Springer, Montreal, Quebec, Canadá) se alimentó a una velocidad exponencial. La cantidad total de extracto de levadura suministrada al fermentador varió entre 70-830 g durante la fermentación de 40 horas. La densidad óptica del caldo de fermentación se midió a una longitud de onda de 550 nm. La densidad óptica final dentro de los termentadores fue proporcional a la cantidad de extracto de levadura añadida (figura 48A) . El nivel de isopreno en el gas de evolución del fermentador se determinó como se describió previamente. El título de isopreno que se incrementó durante el curso de la fermentación (figura 48B) . La cantidad de isopreno producida fue linealmente proporcional a la cantidad de extracto de levadura alimentada (figura 48C) VII. Producción de isopreno en fermentación de 500 L de pTrcKudzu DXS yIDI Una fermentación de 500 litros de células de E. coli con ácidos nucleicos de isopreno sintasa.de kudzu, IDI de S. cerevisiae, y DXS de E. coli (E. coli BL21 (???3) pTrc Kudzu dxs yidi) se usó para producir isopreno. Los niveles de isopreno variaron de 50 a 300 ug/L durante un periodo de tiempo de 15 horas. Con base en las concentraciones de isopreno promedio, el flujo promedio a través del dispositivo y el grado de saturación de isopreno, la cantidad de isopreno recogida se calculó como de aproximadamente 17 g.
VIII. Producción de isopreno en 500 L de fermentación de E. coli cultivado en cultivo de alimentación intermitente Receta del medio (por litro de medio de fermentación) : K2HP04 7.5 g, MgS04 * 7H20 2 g, ácido cítrico monohidratado 2 g, citrato de amonio férrico 0.3 g, extracto de levadura 0.5 g, solución de metal residual modificada 1000X 1 mi. Todos los componentes se añadieron juntos y se disolvieron en diH20. Esta solución se sometió a autoclave. El pH se ajustó a 7.0 con gas amonio (NH3) y cantidad suficiente hasta volumen. Se añadieron glucosa 10 g, tiamina * HC1 0.1 g y antibiótico después de la esterilización y ajuste del H.
Solución de metal residual modificada 1000X: Ácidos cítricos * H20 40 g, MnS04 * H20 30 g, NaCl 10 g, FeS04 * 7H20 1 g, CoCl2 * 6H20 1 g, ZnS04 * 7H20 1 g, CuS04 * 5H20 100 mg, H3B03 100 mg, NaMo04 * 2H20 100 mg. Cada componente se disuelve uno a la vez en DI H20, pH a 3.0 con HCl/NaOH, luego cantidad suficiente hasta volumen y se esterilizan por filtro con un filtro de 0.22 mieras.
La fermentación se llevó a cabo en un biorreactor de 500 L con células de E. coli que contenían el plásmido pTrcKudzu yIDI DXS . Este experimento se llevó a cabo para monitorear la formación de isopreno a partir de glucosa y extracto de levadura al pH de fermentación deseado de 7.0 y temperatura de 30°C. Un inoculo de la cepa de E. coli tomado de un frasco congelado se preparó en medio de soytone-extracto de levadura-glucosa. Después de que el inoculo creció hasta OD 0.15, medida a 550 nm, se usaron 20 mi para inocular un biorreactor que contenía 2.5 L de medio de soytone-extracto de levadura-glucosa. El biorreactor de 2.5 L se cultivó a 30°C hasta OD 1.0 y 2.0 L se transfirieron al biorreactor de 500 L.
El extracto de levadura (Bio Springer, Montreal, Quebec, Canadá) y glucosa se alimentaron a velocidades exponenciales. La cantidad total de glucosa y extracto de levadura suministrada al reactor durante la fermentación de 50 horas fue de 181.2 kg y 17.6 kg, respectivamente. La densidad óptica dentro del biorreactor con el tiempo se muestra en la figura 49A. El nivel de isopreno en el gas de evolución del biorreactor se determinó como se describió previamente. El título de isopreno se incrementó durante el curso de la fermentación (figura 49B) . La cantidad total de isopreno producida durante la fermentación de 50 horas fue de 55.1 g y el curso de tiempo de producción se muestra en la figura 49C.
Ejemplo 8 Producción de isopreno en E. coli que expresa isopreno sintasa de kudzu y genes de la vía de ácido mevalónico recombinantes I . Clonación de , la vía de MVA inferior La estrategia para clonar la vía mevalónica inferior fue la siguiente. Cuatro genes de la vía de biosíntesis de ácido mevalónico; genes de mevalonato cinasa (MVK) , fosfomevalonato cinasa (PMK) , difosfomevalonato descarboxilasa (MVD) e isopentenil difosfato isomerasa fueron amplificados por PCR a partir de ADN cromosómico de S. cerevisiae y clonados individualmente en el plásmido pCR BluntlI TOPO (Invitrogen) . En algunos casos, el gen idi fue amplificado a partir de ADN cromosómico de E. coli. Los cebadores fueron diseñados de tal manera que una RBS de consenso de E. coli (AGGAGGT (SEQ ID NO: 80) o AAGGAGG (SEQ ID NO: 81)) se insertara en el extremo 5', 8 pb hacia el extremo 5' del codón de inicio y un sitio PstI se añadiera en el extremo 3'. Los genes fueron después clonados uno por uno en el vector pTrcHis2B hasta que se ensamblara la vía completa.
ADN cromosómico de S288C de S. cerevisiae se obtuvo de ATCC (ATCC 204508D) . El gen MVK se amplificó a partir del cromosoma de S. cerevisiae usando los cebadores MVKF (5'-AGGAGGTAAAAAAACATGTCATTACCGTTCTTAACTTCTGC, SEQ ID NO: 21) y MVK-PstI-R (5'-ATGGCTGCAGGCCTATCGCAAATTAGCTTATGAAGTCCATGGTAAATTCGTG, SEQ ID NO: 22) y usando PfuTurbo según las instrucciones del fabricante. El producto de PCR de tamaño correcto (1370 pb) fue identificado mediante electroforesis a través de un gel E al 1.2% (Invitrogen) y clonado en pZeroBLUNT TOPO. El plásmido resultante fue designado pMVKl . El plásmido pMVKl fue digerido con endonucleasas de restricción SacI y Taql y el fragmento se purificó en gel y se ligó en pTrcHis2B digerido con SacI y Bs BI . El plásmido resultante fue nombrado pTrcMVKl .
El segundo gen en la vía de biosíntesis de ácido mevalónico, PMK, fue amplificado por PCR usando los cebadores: PstI-PMKl R ( 5 ' -GAATTCGCCCTTCTGCAGCTACC, SEQ ID NO: 23) y BsiHKA I-PMK1 F (5'- CGACTGGTGCACCCTTAAGGAGGAAAAAAACATGTCAG, SEQ ID NO: 24) . La reacción de PCR se llevó a cabo usando polimerasa Pfu Turbo (Stratagene) según las instrucciones del fabricante. El producto de tamaño correcto (1387 pb) fue digerido con PstI y BsiHKI y ligado en pTrcMVKl digerido con PstI . El plásmido resultante fue nombrado pTrcKK. El MVD y los genes de idi fueron clonados de la misma manera. Se llevó a cabo la PCR usando los pares de cebadores: PstI-MVD 1 R (5'-GTGCTGGAATTCGCCCTTCTGCAGC, SEQ ID NO:25) y Nsil-MVD 1 F (5'-GTAGATGCATGCAGAATTCGCCCTTAAGGAGG, SEQ ID NO: 26) para amplificar el gen MVD y PstI-YIDI 1 R (5'-CCTTCTGCAGGACGCGTTGTTATAGC, SEQ ID NO: 27) y Nsil-YIDI 1 F ( 5 ' -CATCAATGCATCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAAAATGAC, SEQ ID NO : 28 ) para amplificar el gen yIDI . En algunos casos el gen de IPP isomerasa, idi de E. coli fue usado. Para amplificar idi de ADN cromosómico de E. coli, se usó el siguiente conjunto de cebadores: PstI-CIDI 1 R (5 ' -GTGTGATGGATATCTGCAGAATTCG, SEQ ID NO:29) y Nsil-CIDI 1 F (5'- CATCAATGCATCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATG, SEQ ID NO: 30) . ADN de plantilla fue ADN cromosómico aislado mediante métodos estándares a partir de E. coli FM5 (WO 96/35796 y WO 2004/033646, las cuales se incorporan cada una en la presente a manera de referencia en sus totalidades, particularmente con respecto a aislamiento de ácidos nucleicos) . Los plásmidos finales fueron llamados pKKDIy para la construcción que codificaba para el gen idi de levadura o p KDIc para la construcción que codificaba para el gen idi de E. coli. Los plásmidos se transformaron en BL21 hospederos de E. coli para análisis subsecuente. En algunos casos la isopreno sintasa de kudzu se clonó en pKKDIy produciendo el plásmido de pKKDIyIS.
La vía de MVA inferior también se clonó en pTrc que contenía un marcador de resistencia al antibiótico kanamicina. El plásmido pTrcKKDIy fue digerido con endonucleasas de restricción Apal y PstI , el fragmento de 5930 pb se separó en un gel E de agarosa al 1.2% y se purificó usando el kit de purificación en gel Qiagen de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El plásmido pTrcKudzuKan , descrito en el ejemplo 7, fue digerido con endonucleasas de restricción Apal y PstI, y el fragmento de 3338 pb que contenía el vector se purificó a partir de un gel E al 1.2% usando el kit de purificación de gel Qiagen. El fragmento de vector de 3338 pb y el fragmento de la vía de MVA inferior de 5930 pb fueron ligados usando el kit de ligación Quick Roche. La mezcla de ligación se transformó en células TOP10 de E. coli y los transformantes se cultivaron a 37°C durante la noche con selección en LA que contenía kanamicina (50 pg/ml) . Los transformantes se verificaron mediante digestión con enzimas de restricción y uno se congeló como una solución. El plásmido se designó pTrcKanKKDIy .
II. Clonación de un gen de isopreno sintasa de kudzu en pTrcKanKKDIy El gen de isopreno sintasa de kudzu se amplificó mediante PCR a partir de pTrcKudzu, descrito en el ejemplo 1, usando los cebadores MCM50 5'- GATCATGCATTCGCCCTTAGGAGGTAAAAAAACATGTGTGCGACCTCTTCTCAATTTACT (SEQ ID NO: 31) y MCM53 5'- CGGTCGACGGATCCCTGCAGTTAGACATACATCAGCTG (SEQ ID NO: 32). El fragmento de PCR resultante se clonó en pCR2.1 y se transformó en TOP10 de E. coli. Este fragmento contiene la secuencia de codificación para isopreno sintasa de kudzu y una región hacia el extremo 5' que contiene un RBS de E. coli. Los transformantes se incubaron durante la noche a 37°C con selección en LA que contenía carbenicilina (50 ug/ml) . La inserción correcta del fragmento se verificó por secuenciación y esta cepa fue designada MCM93.
El plásmido de la cepa MCM93 fue digerido con endonucleasas de restricción Nsil y PstI para liberar un inserto de 1724 pb que contenía el RBS e isopreno sintasa de kudzu. El fragmento de 1724 pb se separó en un gel E de agarosa al 1.2% y se purificó usando el kit de purificación en gel Qiagen de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El plásmido pTrcKanKKDIy fue digerido con la endonucelasa de restricción PstI, tratado con SAP durante 30 minutos a 37°C y purificado usando el kit de limpieza de PCR Qiagen. El plásmido isopreno sintasa de kudzu que codificaban para fragmento de ADN fueron ligados usando el kit Roche Quick. La mezcla de ligación se transformó en células TOP10 de E. coli y los transformantes se cultivaron durante la noche a 37°C con selección en LA que contenía kanamicina a 50 ug/ml. El transformante correcto se verificó mediante digestión de restricción y el plásmido fue designado pTrcKKDylklSKan (figuras 24 y 25) . Este plásmido se transformó en células BL21^DE3) (Invitrogen) .
III. Producción de isopreno a partir de mevalonato en E. coli que expresa la vía de mevalonato inferior recombinante e isopreno sintasa de kudzi La cepa BL2l/pTrcKKDyIkISKan se cultivó en medio MOPS (Neidhardt et al., (1974) J. Bacteriology 119:736-747) ajustado a pH 7.1 y complementado con 0.5% de glucosa y 0.5% de ácido mevalónico. Un cultivo de control también se estableció usando condiciones idénticas pero sin la adición de 0.5% de ácido mevalónico. El cultivo se inició a partir de un cultivo de siembra nocturno con un inoculo de 1% y se indujo con 500 µ? de IPTG cuando el cultivo había alcanzado una OD6oo de 0.3 a 0.5. Los cultivos se hicieron a 30°C con agitación a 250 rpm. La producción de isopreno se analizó 3 horas después de la inducción usando el ensayo de espacio superior descrito en el ejemplo 1. La producción máxima de isopreno fue de 6.67 x 104 nmoles/Lcaido/OD6oo/hr en donde Lcaido es el volumen de caldo e incluye tanto el volumen del medio de células como el volumen de las células. El cultivo de control no complementado con ácido mevalónico no produjo isopreno mesurable.
IV. Clonación de la vía de MVA superior La vía biosintética de mevalonato superior, que comprende dos genes que codifican para tres actividades enzimáticas, se clonó a partir de Enterococcus faecalis . El gen mvaE codifica para una proteína con las actividades enzimáticas tanto de acetil-CoA acetiltransferasa como de 3-hidroxi-3 -metilglutaril-CoA (H G-CoA) reductasa, la primera y tercera proteínas en la vía, y el gen mvaS codifica para una segunda enzima en la vía, HMG-CoA sintasa. El gen mvaE fue amplificado a partir de ADN genómico de E. faecalis (ATCC 700802D-5) con un sitio de unión a ribosoma de E. coli y un separador enfrente usando los siguientes cebadores: CF 07-60 (+) Inicio de mvaE w/RBS+ATG codín de inicio SacI 5' -GAGACATGAGCTCAGGAGGTAAAAAAACATGAAAACAGTAGTTATTATTG (SEQ ID NO: 34) CF 07-62 (-) fusión de mvaE a vaS con RBS intermedio 5' -TTTATCAATCCCAATTGTCATGTTTTTTTACCTCCTTTATTGTTTTCTTAAATC (SEQ ID NO:35) El gen mvaS fue amplificado a partir de ADN genómico de E. faecalis (ATCC 700802D-5) con un RBS y un separador de E. coli enfrente usando los siguientes cebadores : CF 07-61 (+) fusión de mvaE a mvaS con RBS intermedio 5 ' - GATTTAAGAAAACAATAAAGGAGGTAAAAAACATGACAATTGGGATTGATAAA (SEQ ID NO: 36) CF 07-102 (-) Fin de mvaS gen BglII 5' -GACATGACATAGATCTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID NO:37) Los fragmentos de PCR fueron fusionados juntos con PCR usando los siguientes cebadores: CF 07-60 (+ ) Inicio de mvaE w/RBS + ATG codón de inicio SacI 5' - GAGACATGAGCTCAGGAGGTAAAAAAACATGAAAACAGTAGTTATTATTG (SEQ ID NO: 34) CF 07-102 (-) Fin de mvaS gen BglII 5 ' GACATGACATAGATCTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID NO : 37 ) El fragmento de PCR de fusión se purificó usnado un kit Qiagen y se digirió con enzimas de restricción SacI y BglII. Este fragmento de ADN digerido fue purificado en gel usando un kit de Qiagen y se ligó en el vector disponible comercialmente pTrcHis2A, el cual había sido digerido con SacI y BglII y purificado en gel.
La mezcla de ligación se transformó en células Top 10 de E. coli y las colonias se seleccionaron en placas de LA y 50 ug/ml de carbenicilina. Un total de seis colonias se seleccionaron y se cultivaron durante la noche en LB y 50 µg/ml de carbenicilina y los plásmidos fueron aislados usando un equipo Qiagen. Los plásmidos fueron digeridos con SacI y BglII para verificar insertos y un plásmido correcto se secuenció con los siguientes cebadores: CF 07-58 (+) Inicio del gen mvaE 5 ' -ATGAAAACAGTAGTTATTATTGATGC (SEQ ID NO : 38) CF 07-59 (-) Fin del gen mvaE 5 ' -ATGTTATTGTTTTCTTAAATCATTTAAAATAGC (SEQ ID NO: 39) CF 07-82 (+) Inicio del gen mvaS 5 ' -ATGACAATTGGGATTGATAAAATTAG (SEQ ID NO : 40 ) CF 07-83 (-) Fin del gen mvaS 5 ' -TTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID NO: 41) CF 07-86 (+) Secuencia en mvaE 5 ' -GAAATAGCCCCATTAGAAGTATC (SEQ ID NO: 42) CF 07-87 (+) Secuencia en mvaE 5 ' -TTGCCAATCATATGATTGAAAATC (SEQ ID NO: 43) CF 07-88 (+) Secuencia en mvaE 5 ' -GCTATGCTTCATTAGATCCTTATCG (SEQ ID NO : 44 ) CF 07-89 (+) Secuencia mvaS 5 ' -GAAACCTACATCCAATCTTTTGCCC (SEQ ID NO:45) El plásmido llamado pTrcHis2AUpperPathway#l fue correcto por secuenciación y se transformó en la cepa BL21 de E. coli disponible comercialmente . La selección se hizo en LA y 50 g/ml de carbenicilina . Se seleccionaron dos transformantes y se cultivaron en LB y 50 ug/ml de carbenicilina hasta que alcanzaran una OD60o de 1.5. Ambas cepas fueron congeladas en un frasco a -80°C en presencia de glicerol. Las cepas fueron designadas CF 449 para pTrcHis2AUpperPathway#l en BL21, aislado #1 y CF 450 para pTrcHis2AUpperPathway#l en BL21, aislado #2. Ambos clones se encontró que se comportaban idénticamente cuando fueron analizados.
V. Clonación de UpperMVAPathway en pCL1920 El plásmido pTrcHis2AUpperPathway fue digerido con la endonucleasa de restricción SspI para liberar un fragmento que contenía el pTrc-ravaE-mvaS- (His tag) -terminador . En este fragmento, el marcador His no fue traducido. Este fragmento de 4.5 kpb de extremos rasurados fue purificado a partir de un gel E al 1.2% usando el kit de purificación en gel Qiagen. Un fragmento de 4.2 kpb de extremos rasurados y desfosforilado de pCL1920 fue preparado al digerir el vector con la endonucleasa de restricción pvull, tratando con SAP y purificando en gel a partir de uñ gel E de 1.2% usando el kit de purificación en gel Qiagen. Los dos fragmentos fueron ligados usando el Roche Quick Ligation Kit y transformados en células TOP10 químicamente competentes. Los transformantes se seleccionaron en LA que contenía espectinomicina (50 µ9/p?1) . Una colonia correcta se identificó al tamizar para la presencia del inserto por PCR. El plásmido fue designado pCL PtrcUpperPathway (figuras 26 y 27) .
VI. Cepas que expresan las vías de ácido mevalónico superior e inferior combinadas Para obtener una cepa con una vía de ácido mevalónico completa más isopreno sintasa de kudzu, los plásmidos pTrcKKDylklSkan y pCLpTrcUpperPathway fueron ambos transformados en células competentes BL21^DE3) (Invitrogen) y los transformantes fueron seleccionados en LA que contenía kanamicina (50 ug/ml) y espectinomicina (50 pg/ml) . Los transformantes se verificaron mediante preparación de plásmidos para asegurar que ambos plásmidos fueran retenidos en el hospedero. La cepa fue designada MCM127.
VII. Producción de ácido mevalónico a partir de glucosa en E. coli/pUpperpathway Colonias individuales del BL21/pTrcHis2A-mvaE/mvaS o FM5/p pTrcHis2A-mvaE/ vaS son inoculadas en LB y carbenicilina (100 g/ml) y se cultivan durante la noche a 37°C con agitación a 200 rpm. Estos cultivos se diluyeron en 50 mi de medio en matraces con mamparas de 250 mi hasta una OD600 de 0.1. El medio fue TM3 , 1 ó 2% de glucosa, carbenicilina (100 ug/ml) o TM3 , 1% en glucosa, aceite de soya hidrolizado y carbenicilina (100 ug/ml) o TM3 y biomasa (bagazo, hojas y troncos de maíz o césped preparados) . Los cultivos se hicieron a 30°C con agitación a 200 rpm durante aproximadamente 2-3 horas hasta que se alcanzara una OD6oo de 0.4. En este punto la expresión a partir de la construcción mvaE mvaS fue inducida por la adición de IPTG (400 µ?) . Los cultivos se incubaron durante 20 ó 40 horas más con muestras tomadas a intervalos de 2 horas hasta 6 horas después de la inducción y luego 24, 36 y 48 horas después según se requiriera. El muestreo se llevó a cabo al remover 1 mi de cultivo, midiendo la OD60o, sedimentando las células en una microcentrífuga, removiendo el sobrenadante y añadiéndolo para ácido mevalónico.
Una fermentación de 14 litros de células de E. coli con ácidos nucleicos que codificaban para polipéptidos de AA-CoA tiolasa, HMG-CoA sintasa y HMG-CoA reductasa de Enterococcus faecalis produjo 22 gramos de ácido mevalónico con medio TM3 y 2% en glucosa como el medio de células. Un matraz de agitación de estas células produjo 2-4 gramos de ácido mevalónico por litro con medio LB y 1% de glucosa como el medio de cultivo de células. La producción de ácido mevalónico en estas cepas indicó que la vía de MVA era funcional en E. coli.
VIII. Producción de isopreno a partir de BL21 de E. coli que contiene la vía de MVA superior e inferior más isopreno sintasa de kudzu Se crearon las siguientes cepas al transformar en varias combinaciones de plásmidos que contenían la vía de MVA superior e inferior y el gen de isopreno sintasa de kudzu como se describió arriba y los plásmidos que contenían los genes idi, dxs y dxr e isopreno sintasa descritos en el ejemplo 7. Las células hospederas fueron BL21( DE3) químicamente competentes y las transformaciones se hicieron mediante métodos estándares. Los transformantes fueron seleccionados en agar L que contenía kanamicina (50 µg/ml) o kanamicina más espectinomicina (ambas a una concentración de 50 pg/ml) . Las placas se cultivaron a 37°C. Las cepas resultantes se designaron como sigue: Cultivadas en kanamicina más espectinomicina (50 µg/ml cada una) MCM127-pCL Upper MVA y pTrcKKDylkls (kan) en ??.21(???3) MCM131-pCL1920 y pTrcKKDyIkIS (kan) en BL21( DE3) MCM125-pCL Upper MVA y pTrcHis2B (kan) en BL21 (???3) Cultivadas en kanamicina (50 µg/ml) MCM64-pTrcKudzu yIDI DXS (kan) en BL21^DE3) CM50-pTrcKudzu (kan) en BL21( DE3) MCM123-pTrcKudzu Yidi DXS DXR (kan) en BL21( üE3) Las cepas anteriores fueron veteadas a partir de soluciones en congelador a LA y antibiótico adecuado y se cultivaron durante la noche a 37 °C. Una sola colonia de cada placa se usó para inocular matraces de agitación (25 mi de LB y el antibiótico adecuado) . Los matraces fueron incubados a 22°C durante la noche con agitación a 200 rpm. La mañana siguiente los matraces fueron transferidos a una incubadora a 37°C y se cultivaron durante 4.5 horas más con agitación a 200 rpm. Los cultivos de 25 mi fueron centrifugados para sedimentar las células y las células fueron resuspendidas en 5 mi de LB y el antibiótico adecuado. Los cultivos se diluyeron después en 25 mi de LB, % de glucosa y el antibiótico adecuado hasta una OD60o de 0.1. Dos matraces por cada cepa fueron establecidos, un conjunto para inducción con IPTG (800 µ?) y el segundo conjunto no fue inducido. Los cultivos se incubaron a 37°C con agitación a 250 rpm. Un conjunto de los cultivos se indujo después de 1.50 horas (inmediatamente después del punto de muestreo 1). En cada punto de tiempo de muestreo, la ODSoo se midió y la cantidad de isopreno se determinó como se describió en el ejemplo 1. Los resultados se presentan en la tabla 3. La cantidad de isopreno elaborada se presenta como la cantidad en la producción máxima para la cepa particular.
Tabla 3 Producción de isopreno en cepas de E. coli ND : no detectado Traza: pico presente pero no integrable.
IX. Análisis de ácido mevalónico Mevalonolactona (1.0 g, 7.7 mmoles) (CAS# 503-48-0) fue suministrada por Sigma-Aldrich ( I , E.U.A.) como un jarabe que se disolvió en agua (7.7 mL) y se trató con hidróxido de potasio (7.7 mmoles) para generar la sal potasio de ácido mevalónico. La conversión en ácido mevalónico se confirmó mediante análisis 1H RMN. Las muestras para el análisis HPLC se prepararon por centrifugación a 14,000 rpm durante 5 minutos para remover células, seguido por la adición de una alícuota de 300 µ? de sobrenadante a 900 µ? de H20. Después se añadió ácido perclórico (36 µ? de una solución al 70%) seguido por mezclado y enfriamiento en hielo durante 5 minutos. Las muestras se centrifugaron después nuevamente (14,000 rpm durante 5 minutos) y el sobrenadante se transfirió a HPLC. Estándares de ácido mevalónico (20, 10, 5, 1 y 0.5 g/L) fueron preparados de la misma manera. El análisis de ácido mevalónico (20 uL de volumen de inyección) se llevó a cabo medrante HPLC usando una columna BioRad Aminex 87-H+ (300 mm por 7.0 mm) eluida con 5 mM de ácido sulfúrico a 0.6 mL/min con detección de índice de refracción (RI) . Bajo estas condiciones el ácido mevalónico eluyó como la forma lactona después de 18.5 minutos.
Ejemplo 9 Construcción de la vía de MVA superior e inferior para integración en Bacillus subtilis I . Construcción de la vía de MVA superior en Bacillus subtilis La vía superior de Enterococcus faecalis es integrada en 23. subtilis bajo el control del promotor aprE. La vía superior consiste en dos genes: mvaE, el cual codifica para AACT y HMGR, y mvaS, el cual codifica para HMGS . Los dos genes se fusionan juntos con un codón de paro entre los mismos, un sitio RBS en frente de mvaS y están bajo el control del promotor de aprE. Un terminador se sitúa después del gen mvaE. El marcador de resistencia a cloranfenicol se clona después del gen mvaE y la construcción se integra en el locus aprE mediante doble cruza usando regiones de flanqueo de homología .
Cuatro fragmentos de ADN son amplificados por PCR de tal manera que contengan salientes que les permitan ser fusionados juntos por una reacción de PCR. Las amplificaciones de PCR se llevan a cabo usando polimerasa Herculase de acuerdo con las instrucciones del fabricante. 1 : PaprE CF 07-134 (+) Inicio del promotor aprE PstI 5' -GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC (SEQ ID No : 82) CF 07-94 (-) Fusión de PaprE a mvaE 5 ' -CAATAATAACTACTGTTTTCACTCTTTACCCTCTCCTTTTAA (SEQ ID NO: 83) Plantilla: ADN cromosómico de Bacillus subtilis 2 : mvaE CF 07-93 (+) Fusión de mvaE al promotor aprE (GTG codón de inicio) 5 ' -TTAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGAAAACAGTAGTTATTATTG (SEQ ID NO: 84) CF 07-62 (-) Fusión de mvaE a mvaS con RBS intermedio 5' - TTTATCAATCCCAATTGTCATGTTTTTTTACCTCCTTTATTGTTTTCTTAAATC (SEQ ID NO: 35) Plantilla: ADN cromosómico de Enterococcus faecalis (a partir de ATCC) 3. mvaS CF 07-61 (+) Fusión de mvaE a mvaS con RBS intermedio 5' - GATTTAAGAAAACAATAAAGGAGGTAAAAAAACATGACAATTGGGATTGATAAA (SEQ ID NO:36) CF 07-124 (-) Fusión del extremo de mvaS al terminador 5 ' -CGGGGCCAAGGCCGGTTTTTTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID NO: 85) Plantilla: ADN cromosómico de Enterococcus faecalis 4. terminador de serina proteasa alcalina de B. amyliquefaciens CF 07-123 (+ ) Fusión del extremo de mvaS al terminador 5 ' ACCGTTCGTTCTTATCGAAACTAAAAAAAACCGGCCTTGGCCCCG (SEQ ID NO: 86) CF 07-46 (-) Extremo del terminado BamHI de B. amyliquefaciens 5 ' -GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (SEQ ID NO: 63) Plantilla: ADN cromosómico de Bacillus amyliquefaciens Reacciones de fusión de PCR 5. Fusión de mvaE a mvaS CF 07-93 (+) fusión de mvaE al promotor aprE (codón de inicio de GTG) 5' -TTAAAAGGAGAGGGTAAAGAGTGAAAACAGTAGTTATTATTG (SEQ ID NO: 84) CF 07-124 (-) Fusión del extremo de mvaS al terminador 5 ' -CGGGGCCAAGGCCGGTTTTTTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID NO: 85) Plantilla: #2 y 3 de arriba 6. Fusión de mvaE-mvaS al promotor aprE CF 07-134 (+) Inicio del promotor aprE PstI 5' -GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC (SEQ ID NO: 82) CF 07-124 (-) Fusión del extremo de mvaS al terminador 5 ' -CGGGGCCAAGGCCGGTTTTTTTTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID NO: 85) Plantila #1 y #4 de arriba 7. Fusión de PaprE-mvaE-mvaS al terminador CF 07-134 (+) Inicio del promotor aprE PstI 5' -GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC (SEQ ID NO: 82) CF 07-46 (-) Extremo del terminador BamHI de B . amyliquefaciens 5 ' -GACATGACGGATCCGATTACGAATGCCGTCTC (SEQ ID NO: 63) Plantilla: #4 y #6 El producto se digiere con endonucleasas de restricción PstI/BanülI y se liga en pJM102 (Perego, M. 1993. Integrational vectors for genetic manipulation in Bacillus subtilis, pág. 615-624. En A. L. Sonenshein, J.A. Hoch, and R. Losick (ed.), Bacillus subtilis and other gram-positive bacteria: biochemistry, physiology, and molecular genetics. American Society for Microbiology, Washington, D.C.) el cual se digiere con PstI/BamHI. La ligación se transforma en células químicamente competentes TOP10 de E. coli, y los transformantes se seleccionan en LA que contiene carbenicilina (50 pg/ml) . El plásmido correcto se identifica por secuenciación y se designa pJ Upperpathway2 (figuras 50 y 51) . ADN plasmídico purificado se transforma en Bacillus subtilis aprE Pxyl-comí y los transformantes se seleccionan en agar L que contiene cloranfenicol (5 µg/ml) . Una colonia correcta se selecciona y se plaquea secuencialmente en agar L que contiene cloranfenicol 10, 15 y 25 ug/ml para amplificar el número de copias del cásete que contiene la vía superior.
La cepa resultante se prueba para producción de ácido mevalónico al cultivar en LB que contiene 1% de glucosa y 1%. Los cultivos se analizan mediante GC para la producción de ácido mevalónico.
Esta cepa se usa subsecuentemente como un hospedero para la integración de la vía de ácido mevalónico inferior.
Se usan los siguientes cebadores para secuenciar las diferentes construcciones anteriores.
Cebadores de secuenciación: CF 07-134 (+) Inicio del promotor aprE PstI 5' -GACATCTGCAGCTCCATTTTCTTCTGC (SEQ ID NO: 82) CF 07-58 (+ ) Inicio del gen mvaE 5 ' -ATGAAAACAGTAGTTATTATTGATGC (SEQ ID NO: 38) CF 07-59 (-) Fin del gen mvaE 5 ' -ATGTTATTGTTTTCTTAAATCATTTAAAATAGC (SEQ ID NO : 39) CF 07-82 (+) Inicio del gen mvaS 5 ' -ATGACAATTGGGATTGATAAAATTAG (SEQ ID NO: 40) CF 07-83 (-) Fin del gen mvaS 5 ' -TTAGTTTCGATAAGAACGAACGGT (SEQ ID NO : 41) CF 07-86 (+) Secuencia en mvaE 5' -GAAATAGCCCCATTAGAAGTATC (SEQ ID NO : 42) CF 07-87 (+) Secuencia -en mvaE 5 ' -TTGCCAATCATATGATTGAAAATC (SEQ ID NO : 43 ) CF 07-88 (+) Secuencia en mvaE 5 ' -GCTATGCTTCATTAGATCCTTATCG (SEQ ID NO: 44) CF 07-89 (+) Secuecia mvaS 5 ' -GAAACCTACATCCAATCTTTTGCCC (SEQ ID NO: 45) Los transformantes se seleccionan en LA que contienen cloranfenicol a una concentración de 5 pg/ml . Se confirma que una colonia tiene la integración correcta por secuenciación y se plaquea en LA que contiene concentraciones cada vez más altas de cloranfenicol durante varios días, hasta un nivel final de 25 pg/ml . Esto se traduce en la amplificación del cásete que contiene los genes de interés. La cepa resultante es designada CF 455: pJMupperpathway #1 X Bacillus subtilis aprEnprE Pxyl comK (amplificada para crecer en LA que contiene cloranfenicol , 25 µg/ml) .
II. Construcción de la vía de MVA inferior en Bacillus subtilis La vía de MVA inferior, que consiste en los genes mvkl, pmk, mpd e idi se combinan en un cásete que consiste en regiones de ADN de flanqueo de la región nprE del cromosoma de B. subtilis (sitio de integración) , el promotor aprE y el marcador de resistencia a espectinomicina (véanse figuras 28 y 29). Este cásete es sintetizado por DNA2.0 y se integra en el cromosoma de B. subtilis que contiene la vía de MVA superior integrada en el locus aprE. El gen de isopreno sintasa de kudzu es expresado a partir del plásmido replicante descrito en el ejemplo 4 y se transforma en la cepa con ambas vías superior e inferior integradas .
Ejemplo 10 Producción de isopreno en E. colí que expresa mevalonato cinasa de M. mazei e isopreno sintasa de P. alba I. Construcción de vectores y cepas que codifican para mevalonato cinasa de M. mazei (MVK) e isopreno sintasa de P. alba ( i ) Construcción de la cepa E L201 (BL21, Cm-GI1.2- KKDyl) BL21 de E. coli (Novagen brand, EMD Biosciences, Inc.) fue una cepa receptora, transducida con lisado de MCM331 Pl (lisado preparado de acuerdo con el método descrito en Ausubel, et al., Current Protocols in Molecular Biology.
Jhn iley and Sons, Inc.) . Los transductores fueron seleccionados al esparcir células en agar L y 20 yg/µ? de cloranfenicol . Las placas fueron incubadas durante la noche a 30°C. El análisis de los transductores no mostró colonias en las placas de control (placa de control de agua + células para reversión y placa de control de agua y lisado Pl para contaminación de lisado) .
Cuatro transductores son recogidos y usados para inocular 5 mL de caldo L y 20 g/µ? de cloranfenicol . Los cultivos se hicieron durante la noche a 30°C con agitación a 200 rpm. Para elaborar preparaciones de ADN genómico para cada transductor para el análisis de PCR, 1.5 mL de cultivo de células nocturno fueron centrifugados. El sedimento celular fue resuspendido con 400 µ? de regulador de pH de resuspensión (20 mM de Tris, 1 m de EDTA, 50 mM de NaCl , pH 7.5) y 4 µ? de R ase, libre de DNase (Roche) fueron añadidos. Los tubos se incubaron a 37°C durante 30 minutos seguidos por la adición de 4 µ? de SDS al 10% y 4 µ? de solución de abastecimiento de proteinasa K de 10 mg/ml (Sigma-Aldrich) . Los tubos fueron incubados a 37°C durante 1 hora. El lisado de células fue transferido a tubos Phase Lock Light Gel de 2 mi (Eppendorf) y 200 µ? cada uno de fenol saturado, pH 7.9 (Ambion Inc . ) y cloroformo fueron añadidos . Los tubos se mezclaron bien y se microcentrifugaron durante 5 minutos. Se hizo una segunda extracción con 400 µ? de cloroformo y la capa acuosa se transfirió a un tubo Eppendorf nuevo. El ADN genómico se precipitó mediante la adición de 1 mi de etanol al 100% y centrifugación durante 5 minutos. El sedimento de ADN genómico fue lavado con 1 mi de etanol al 70%. El etanol se retiró y el sedimento de ADN genómico se dejó secar al aire brevemente. El sedimento de ADN genómico se resuspendió con 200 µ? de TE.
Usando Pfu Ultra II DNA Polimerase (Stratagene) y 200 ng/µ? de ADN genómico como plantilla, 2 conjuntos diferentes de tubos de reacción de PCR se prepararon de acuerdo con el protocolo del fabricante. Para el conjunto 1, los cebadores MCM130 y GB Cm-Rev (tabla 4) se usaron para asegurar que los transductores se integraran exitosamente en el locus attTn7. Los parámetros de PCR para el conjunto 1 fueron 95°C durante 2 minutos (primer ciclo únicamente) , 95°C durante 25 segundos, 55°C durante 25 segundos, 72°C durante 25 segundos (repetir etapas 2-4 para 28 ciclos) , 72°C durante 1 minutos. Para el conjunto 2, los cebadores MVD For y MVD Rev (tabla 4) se usaron para asegurar que el operón gil.2-KKDyl se integrara adecuadamente. Los parámetros de PCR para el conjunto 2 fueron 95°C durante 2 minutos (primer ciclo únicamente) , 95°C durante 25 segundos, 55°C durante 25 segundos, 72°C durante 10 segundos (repetir etapas 2-4 para 28 ciclos), 72°C durante 1 minuto. El análisis de amplicones de PCR en un gel E al 1.2% (Invitrogen Corp.) mostró que los 4 clones transductores eran correctos (se seleccionó uno y se designó la cepa EWL201) . ii) Construcción de la cepa EWL204 (BL21, desenrollamiento-GIl .2-KKDyI) El marcador de cloranfenicol fue desenrollado de la cepa EWL201 usando el plásmido pCP20 como se describió por Datsenko y Wanner (2000) (Datsenko et al., Proc Nati. Acad. Sci . E.U.A. 97:6640-6645, 2000). One-step inactivation de chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products. (Datsenko et al., PNAS, 97:6640-6645, 2000). Las células EWL201 se cultivaron- en caldo L hasta fase logarítmica media y después se lavaron tres veces en agua estéril helada. Una alícuota de 50 µ? de suspensión de células se mezcló con 1 µ? de pCP20 y la mezcla de suspensión celular se electroporó en una cubeta de 2 mm (Invitrogen Corp.) a 2.5 voltios y 25uFd usando un Gene Pulser Electroporator (Bio-Rad Inc.) . 1 mi de LB se añadió inmediatamente a las células, luego se transfirió a un tubo de polipropileno de 14 mi (Sarstedt) con una tapa de metal.
Las células se dejaron recuperar por crecimiento durante 1 hora a 30°C. Los transformantes se seleccionaron en agar L y 20 pg/^L de cloranfenicol y 50 ug/µ? de carbenicilina y se incubaron a 30°C durante la noche. Al día siguiente, un solo clon se cultivó en 10 mi de caldo L y 50 µg/µl de carbenicilina a 30°C hasta casi la fase logarítmica.
La temperatura del cultivo del crecimiento se desplazó después a 42 °C durante 2 horas. Se hicieron diluciones en serie, las células se dispersaron después sobre placas LA (sin selección de antibiótico) , y se incubaron durante la noche a 30°C. Al día siguiente, 20 colonias se recogieron y se pusieron en placas de agar L (sin antibióticos) y LA y 20 µg/µl de cloranfenicol . Las placas se incubaron después durante la noche a 30°C. Las células capaces de crecer en placas LA, pero no en placas de LA y 20 µg/µl de cloranfenicol , se consideró que tenían el marcador de cloranfenicol desarrollado (se recogió una y se designó como cepa EWL204) . iii) Construcción del plásmidos pEWL230 (pTrc P. alba) La generación de un gen sintético que codifica para isopreno sintasa de Populus alba (P. alba HGS) se llevó a DNA2.0 Inc. ( enlo Park, CA) con base en su método de optimización de codones para expresión de E. coli. El gen sintético se clonó a la medida en el plásmido pET24a (Novagen brand, EMD Biosciences, Inc.) y se suministró liofilizado (figuras 54, 55A y 55B) .
Se llevó a cabo una reacción de PCR para amplificar el gen de isopreno sintasa de P. alba (P. aljba HGS) usando pET24 P. alba HGS como la plantilla, cebadores MCM182 y MCM192, y Herculase II Fusión DNA polymerase (Stratagene) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las condiciones de PCR fueron las siguientes: 95°C durante 2 minutos (primer ciclo únicamente) , 95°C durante 25 segundos, 55°C durante 20 segundos, 72°C durante 1 minuto, repetir para 25 ciclos, con extensión final a 72 °C durante 3 minutos. El producto de PCR de isopreno sintasa de P. alba se purificó usando QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen Inc.).
El producto de PCR de isopreno sintasa de P. alba se digirió después en una reacción de 20 µ? que contenía 1 µ? de endonucleasa BspHI (New England Biolabs) con 2 µ? de regulador de pH NEB 4 10X. La reacción se incubó durante 2 horas a 37°C. El fragmento de PCR digerido se purificó después usando el QIAquick PCR Purification Kit. Una digestión de restricción secundaria se llevó a cabo en una reacción de 20 ul que contenía 1 µ? de endonucleasa PstI (Roche) con regulador de H H 10X 2 µ? . La reacción se incubó durante 2 horas a 37°C. El fragmento de PCR digerido fue después purificado usando el QIAquick PCR Purification Kit. El plásmido pTrcHis2B (Invitrogen Corp.) se digirió en una reacción de 20 µ? que contenía 1 µ? de endonucleasa Ncol (Roche) , 1 µ? de endonucleasa PstI y 2 µ? de regulador de pH H 10X. La reacción se incubó durante 2 horas a 37°C. El vector pTrcHis2B digerido fue purificado en gel usando un gel E al 1.2% (Invitrogen Corp.) y se extrajo usando el QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) (figura 56) . Usando los extremos cohesivos compatibles de los sitios BspRI y Ncol , una reacción de ligación de 20 µ? se preparó que contenía 5 µ? de inserto de isopreno sintasa de P. alba, 2µ1 de vector pTrc, ?µ? de T4 ADN ligasa (New England Biolabs) , 2µ1 de regulador de pH de ligasa 10X y ??µ? de ddH20. La mezcla de ligación se incubó a temperatura ambiente durante 40 minutos. La mezcla de ligación se desaló al flotar un filtro de membrana de nitrocelulosa de 0.025 µp? ( illipore) en una caja de Petri de ddH20 y aplicando la mezcla de ligación suavemente encima del filtro de membrana de nitrocelulosa durante 30 minutos a temperatura ambiente. Células MCM446 (véase sección II) se cultivaron en LB a fase logarítmica media y luego se lavaron tres veces en agua helada y estéril. Una alícuota de 50 µ? de suspensión celular se mezcló con 5 µ? de mezcla de ligación pTrc P.alba HGS desalada. La mezcla de suspensión celular se electroporó en una cubeta de 2 mm a 2.5 voltios y 25 uFd usando un Gene Pulser Eletroporato . 1 mi de LB se añadió inmediatamente a las células, luego se transfirió a un tubo de polipropileno de 14 mi (Sarstedt) con una tapa de metal.
Las células se dejaron recuperar al crecer durante 2 horas a 30°C. Los transformantes se seleccionaron en agar L y 50 µg/µl de carbenicilina y 10 mM de ácido mevalónico y se incubaron a 30°C. Al día siguiente, 6 transformantes se recogieron y se cultivaron en 5 mi de caldo L y se 50 µg/µl de tubos de carbenicilina durante la noche a 30°C. Las preparaciones de plásmido se llevaron a cabo en los cultivos nocturnos usando QIAquick Spin Miniprep Kit (Qiagen) . Debido al uso de células BL21 para propagar plásmidos, una modificación de lavado de las columnas centrífugas con regulador de pH PB 5X y regulador de pH PE 3X se incorporó al protocolo del fabricante estándar para lograr ADN plasmídico de alta calidad. Los plásmidos fueron digeridos con PstI en una reacción de 20 µ? para asegurar el fragmento linear de tamaño correcto. Los 6 plásmidos tuvieron el tamaño correcto y se enviaron a Quintara Biosciences (Berkeley, CA) para secuenciarlos con los cebadores MCM65, MCM66, EL1000 (tabla 4) . Los resultados de la secuenciación de ADN mostraron que los 6 plásmidos estaban correctos. Se recogió uno y se designó plásmido EWL230 (figuras 57, 58A y 58B) . iv) Construcción de plásmido pEWL244 (pTrc P. alba-mMVK) Se llevó a cabo una reacción de PCR para amplificar el gen Methanosarcina mazei (M. mazei) usando MCM376 como la plantilla (véase sección v) , cebadores MCM165 y MCM177 (véase tabla 4) ,. y Pfu Ultra II Fusión DNA poly erase (Stratagene) de acuerdo con el protocolo del fabricante. Las condiciones de PCR fueron las siguientes: 95°C durante 2 minutos (primer ciclo únicamente), 95°C durante 25 segundos, 55°C durante 25 segundos, 72°C durante 18 segundos, repetir durante 28 ciclos con extensión final a 72 °C durante 1 minuto. El producto de PCR MVK de M. mazei se purificó usando el QIAquick PCR Purification Kit (Qiagen Inc.).
El producto de PCR MVK de M. mazei se digirió después en una reacción de 40 µ? que contenía 8 µ? de producto de PCR, 2 µ? de endonucleasa Pmel (New England Biolabs) , 4 µ? de regulador de H EB 10X 4, 4 µ? de 10X NEB BSA y 22µ1 de ddH20. La reacción se incubó durante 3 horas a 37°C. El fragmento de PCR digerido se purificó después usando el QIAquick PCR Purification Kit. Una digestión de restricción secundaria se llevó a cabo en una reacción de 47 µ? que contenía 2µ1 de endonucleasa Nsil (Roche), 4.7µ1 de regulador de pH 10X H, y 40µ1 de fragmento MVK de M. mazei digerido con Pmel. La reacción se incubó durante 3 horas a 37°C. El fragmento de PCR digerido se purificó en gel después usando un gel E al 1.2% y se extrajo usando el QIAquick Gel Extraction Kit. El plásmido E L230 fue digerido en una reacción de 40 µ? que contenía 10 µ? de plásmido, 2µ1 de endonucleasa Pmel, 4µ1 de regulador de pH 10X NEB 4, 4µ de 10X NEB BSA, y 20µ1 de ddH20. La reacción se incubó durante 3 horas a 37°C. El fragmento de PCR digerido se purificó después usando el QIAquick PCR Purification Kit. Se llevó a cabo una segunda digestión de restricción en una reacción de 47 µ? que contenía 2µ1 de endonucleasa PstI, 4.7µ1 de regulador de pH 10X H y 40µ1 de fragmento lineal E L230 digerido con Pmel . La reacción se incubó durante 3 horas a 37°C. El fragmento de PCR digerido se purificó después usando un gel E al 1.2% y se extrajo usando el QIAquick Gel Extraction Kit (figura 59) . Usando los extremos cohesivos compatibles de los sitios Nsil y PstI, una reacción de ligación de 20µ1 se preparó que contenía 8µ1 de inserto MVK de M. mazei, 3µ1 de plásmido EWL230, ?µ? de T4 DNA ligasa, 2µ1 de regulador de pH de ligasa 10X y 6µ1 de ddH20. La mezcla de ligación se incubó durante la noche a 16°C. Al día siguiente, la mezcla de ligación se desaló al flotar un filtro de membrana de nitrocelulosa de 0.025µp? en una caja de petri de ddH20 y aplicar la mezcla de ligación suavemente encima del filtro de membrana de nitrocelulosa durante 30 minutos a temperatura ambiente. Las células MCM446 se cultivaron en LB hasta fase logarítmica media y luego se lavaron tres veces en agua estéril helada. Una alícuota de 50µ1 de suspensión celular se mezcló con 5µ1 de mezcla de ligación pTrc P.aljba-mMVK desalada. La mezcla de suspensión celular se electroporó en una cubeta de 2mm a 2.5 voltios y 25uFd usando un Gene Pulser Electroporator . 1 mi de LB se añadieron inmediatamente a las células, después las células se transfirieron a un tubo de polipropileno de 14 mi con una tapa metálica. Se dejó que las células se recuperaran al cultivar durante 2 horas a 30°C. Los transformantes se seleccionaron en LA y 50 de carbenicilina y placas de 5 mM de ácido mevalónico y se incubaron a 30°C. Al día siguiente, se recogieron 6 transíorinantes y se cultivaron en 5 mi de tubos de LB y 50ug/ul de carbenicilina durante la noche a 30°C. Las preparaciones del plásmido se llevaron a cabo en los cultivos nocturnos usando QIAquick Spin Miniprep Kit . Debido al uso de células BL21 para propagar plásmidos, una modificación de lavado de las columnas centrífugas con regulador de pH PB 5X y regulador de pH PE 3X se incorporó al protocolo del fabricante estándar para lograr ADN plasmídico de alta calidad. Los plásmidos fueron digeridos con PstI en una reacción de 20µ1 para asegurar el fragmento lineal de tamaño correcto. Tres de los 6 plásmidos tuvieron el tamaño correcto y se enviaron a Quintara Biosciences para secuenciación con los cebadores CM65, MCM66, EL1000, EL1003 y EL1006 (tabla 4) . Los resultados de secuenciación de ADN mostraron que los 3 plásmidos estaban correctos. Se recogió uno y se designó el plásmido EWL244 (figuras 60 y 61A-B) . v) Construcción del plásmido MCM376-MVK de M. mazei archaeal Lower en pET200D El ORF MVK del operón de la vía inferior de M. mazei archaeal (figuras 73A-C) se amplificó por PCR usando los cebadores MCM161 y MCM162 (tabla 4) usando la mezcla Invitrogen Platinum HiFi PCR. 45 uL de mezcla de PCR se combinaron con 1 uL de plantilla, 1 uL de cada cebador a 10 uM y 2 uL de agua. La reacción se ciclizó como sigue: 94°C durante 2:00 minutos; 30 ciclos de 94°C durante 0:30 minutos, 55 °C durante 0:30 minutos y 68 °C durante 1:15 minutos; y luego 72°C durante 7:00 minutos y 4°C hasta enfriar. 3 uL de esta reacción de PCR se ligaron al plásmido Invitrogen pET200D de acuerdo con el protocolo del fabricante. 3 uL de esta ligación se introdujeron en células TOP10 Invitrogen, y los transformantes se seleccionaron en LA/kan50. Un plásmido de un transformante se aisló y el inserto se secuenció, dando como resultado MCM376 (figuras 74A-C) . vi) Construcción de la cepa EWL251 (BL21(DE3), Cm-GIl .2 -KKDyl , pTrc P.alba-mMVK) Células MCM331 (las cuales contienen la construcción cromosómica gil.2KKDyI que codifica para mevalonato cinasa, mevalonato fosfato cinasa, mevalonato pirofosfato descarboxilasa e IPP isomerasa de S. cerevisiae) se cultivaron en LB hasta fase logarítmica media y luego se lavaron tres veces en agua helada y estéril. Se mezclaron 50 µ? de suspensión celular con ?µ? de plásmido EWL244. La mezcla de suspensión celular se electroporó en una cubeta de 2 mm a 2.5 voltios y 25uFd usando un Gene Pulser Electroporator . 1 mi de LB se añadió inmediatamente a las células, después las células se transfirieron a un tubo de polipropileno de 14 mi con una tapa de metal. Las células se dejaron recuperar al cultivar durante 2 horas a 30°C. Los transformantes se seleccionaron en LA y 50 µ9/µ1 de carbenicilina y placas de 5 mM de ácido mevalónico y se incubaron a 37°C. Se seleccionó una colonia y se designó la cepa EWL251. vi i) Construcción de la cepa E L256 (BL21(DE3), Cm-GIl .2-KKDyI , pTrc P.alba-mmK, pCL Upper MVA) Células EWL251 se cultivaron en LB hasta fase logarítmica media y luego se lavaron tres veces en agua helada y estéril. Se mezclaron 50 µ? de suspensión celular con ?µ? del plásmido MCM82 (el cual es pCL PtrcUpperPathway que codifica para mvaE y mvaS de E. faecalis) . La mezcla de suspensión celular se electroporó en una cubeta de 2 mm a 2.5 voltios y 25 uFd usando un Gene Pulser Electroporator. 1 mi de LB se añadió inmediatamente a las células, luego se transfirió a un tubo de polipropileno de 14 mi con una tapa metálica. Las células se dejaron recuperar al crecer durante 2 horas a 30°C. Los transformantes se seleccionaron en LA y 50 µg/µl de carbenicilina y 50 µg/µl de placas de espectinomicina y se incubaron a 37°C. Se recogió una colonia y se designó como la cepa E L256.
Tabla 4 Secuencias cebadoras II. Construcción de MCM442-449 :BL21 y BL2KDE3) con FRT-cmR-FRT-gil . x-mKKDyl i ) Construcción de plantilla para recombinación Casetes de recombinación a base de FRT, y plásmidos para integración mediada por Red/ET y desenrollamiento de marcador de antibiótico se obtuvieron de Gene Bridges GmbH (Alemania) . Los procedimientos que usan estos materiales se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos de Gene Bridges. Se usaro los cebadores MCM193 y MCM195 para amplificar el cásete de resistencia a partir de la plantilla FRT-gb2 -Cm-FRT usando el kit Stratagene Herculase II Fusión de acuerdo con el protocolo del fabricante. La reacción de 50 uL se ciclizó como sigue: 95°C, 2 minutos; (95°C, 20 segundos, 55° C, 20 segundos, 72 °C, 1 minuto) x 5, (95°C, 20 segundos, 60°C, 20 segundos, 72°C, 1 minuto) x 25; 72°C, 3 minutos, 4°C hasta enfriar. El amplicón se purificó mediante una columna de PCR Qiagen de acuerdo con el protocolo del fabricante y se eluyó en 30 uL de EB (regulador de pH de elución) . ADN fue digerido con Ndel y Pcil en una reacción de 20 uL con regulador de pH lx Roche H y 0.5 uL de BSA. El plásmido MCM376 se digirió en una reacción de 10 uL que contenía luL cada una de Ndel, Ncol y regulador de pH Roche H. Las reacciones procedieron durante la noche a 37 °C, y luego ADN cortado se purificó en columnas de PCR Qiagen y se eluyó en 30 uL de EB . El producto de PCR se ligó en MCM376 en una reacción que contenía luL de vector, 3uL de producto de PCR, 1 uL de regulador de pH de ligasa Quick Roche 2, 5 uL de regulador de pH 1 y 1 uL de ligasa. La reacción procedió a temperatura ambiente durante 3 horas y después 5 uL se transformaron en células TOP10 Invitrogen de acuerdo con el protocolo del fabricante. Los transformantes se seleccionaron en agar L (LA) y cloranfenicol (10 ug/mLO) a 37°C durante la noche.
Colonias de transformantes se colocaron en el cloranfenicol que contenía LA (30 ug/mL) y kanamicina (50 ug/ml) y se enviaron a Quintara (Berkeley, CA) para secuenciación. Cuatro clones, uno cada uno con los 4 nucleótidos diferentes en el "N" en el cebador MCM195, se encontró que tenían la secuencia correcta para el promotor insertado. Los clones se cultivaron en 5 mL de LB que contenía cloranfenicol (30 ug/mL) y kanamicina (50 ug/mL) y se usaron para la preparación de ADN plasmídico. Este plásmido fue retransformado en células TOP10 y las células se congelaron como: Tabla 5 MCM484-487 CM484 cmR-gil .6-MVK(mazei) en pET (clon Al-3, nt variable A) MCM485 cmR-gil .0-MVK (mazei) en pET (clon B4-6, nt variable C) CM486 cmR-gil .2-MVK (mazei) en pET (clon Cl-5, nt variable G) MCM487 cmR-gil .5-MVK (mazei) en pET (clon C3-3, nt variable T) ii ) Creación de cepas objetivo de recombinación MCM349 y MCM441 El marcador de resistencia en cloranfenicol (cmR) fue desenrollado de la cepa MCM331 usando el plásmido pGB706 (GeneBridges) de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Células MCM331 se cultivaron hasta logaritmo medio en LB y se lavaron 3 veces en agua estéril y fría. Una alícuota de 1 uL de ADN pGB706 se añadió a 50 uL de suspensión celular y esta mezcla se electroporó en una cubeta de 2 mm a 2.5 voltios, 25 uFd seguida inmediatamente por recuperación en 500 uL de LB durante 1 hora a 30°C. Los transformantes se seleccionaron en LB que contenía tetraciclina (5 ug/ml) a 30°C. Al día siguiente, se cultivó un clon a 30°C en LB que contenía tetraciclina (5 ug/ml) hasta ser visiblemente turbio (OD600 - 0.5 - 0.8 ) . Este cultivo fue rayado sobre LB y cultivado durante la noche a 37 °C. Un clon que fue incapaz de crecer en LB que contenía cloranfenicol (10 ug/mL) o LB que contenía tetraciclina (5 ug/mL) se congeló como MCM348. El plásmido MCM356 (pRedET carbencillin; GeneBridges) se electroporó como en el ejemplo anterior y los transformantes se seleccionaron en LB que contenía carbenicilina (50 ug/mL) a 30°C. Un clon se cultivó en LB carbenicilina (50 ug/mL) a 30°C y se congeló como MCM349.
La cepa MCM441 se creó al electrotransformar el plásmido MCM356 en EWL204 como arriba. iii) Recombinación de FRT-cmR-FT-gil . x-mMVK en MCM349 y MCM441 Los plásmidos MCM484-487 se usaron como plantilla para amplificación por PCR con cebadores MCM120 y MCM196 y Herculase II Fusión kit, de acuerdo con el protocolo del fabricante. Tres reacciones por plantilla se llevaron a cabo, con 0, 1 ó 3 uL de DMSO. Las reacciones de 50 uL fueron ciclizadas como sigue: 95°C, 2 minutos; (95°C, 20 segundos; 55 °C, 20 segundos; 72 °C, 1.5 minutos) para cinco ciclos; (95°C, 20 segundos; 60°C, 20 segundos; 72°C, 1.5 minutos) para 25 ciclos; 72°C durante 3 minutos; 4°C, durante la noche. Las 3 reacciones de una plantilla dada fueron agrupadas y purificadas en columnas de PCR Qiagen y eluidas con 30 uL de EB a 60°C. 5 uL de ADN fueron digeridos con 1 uL de Dpnl en regulador de pH Roche lx A durante 3 horas a 37°C. Este ADN fue después microdializado contra exceso de agua durante 30 minutos.
Las cepas se cultivaron en' 5 mL de LB que contenía carbenicilina (50 ug/mL) a partir de rayados frescos a 30°C hasta una OD600 de -0.5. Se añadieron 40 mM de L-arabinosa y los cultivos se incubaron a 37°C durante 1.5 horas. Las células fueron cosechadas y electroporadas con 3 uL de amplicones dializados como arriba, y luego se recuperaron en 500 uL de SOC a 37°C durante 1.5-3 horas. Los transformantes se seleccionaron en placas LA que contenían cloranfenicol (5 ug/mL) a 37°C.
Clones sensibles a kanamicina fueron tamizados mediante PCR para inserción del amplicón. Los productos de PCR de clones positivos fueron secuenciados para verificar la secuencia de ADN insertado. Los amplicones concordaban con el FRT-gil .2 -yKKDyl a attTn7 en MCM441 y 348 siendo reemplazado por FRT-cmR-FRT-gil . x-mKKDyl (las designaciones yK y mK se refieren a la mevalonato cinasa de Saccharomyces cerevisiae y Methanosarcina mazei, respectivamente) .
Tabla 6A Las siguientes cepas se cultivaron en LB que contenía cloranfenicol (5 ug/mL) y se congelaron.
ID de Nombre Progeni - Plantilla de Cepa tor amplicón de recombinación MCM442 BL21(DE3) cmR-gil .6mKKDyI MCM349 MCM484 Al, clon37 (A) MCM443 BL21 (DE3 ) cmR-gil. OmKKDyl MCM349 MCM485 B4, clon27 (C) MCM444 BL21 (DE3 ) cmR-gil .2mKKDyI MCM349 MCM486 Cl, clon 16 (G) MCM445 BL21 (DE3) cmR- MCM349 MC 487 gil.5mKKDyI C3, clon7 (T) CM446 BL21 cmR-gil .6mKKDyI Al-3 MCM441 MCM484 (A) MCM447 BL21 cmR-gil. OmKKDyl B4-6 MCM441 CM485 (C) MCM448 BL21 cmR-gil .2mKKDyI Cl-5 MCM441 MCM486 (G) MCM449 BL21 cmR-gil.5mKKDyI C3-3 MCM441 MCM487 (T) Tabla 6B Cebadores III. El efecto de levadura en la producción de isopreno en genes que expresan E. coli de la vía de ácido mevalónico y cultivados en un cultivo de alimentación intermitente a la escala de 15-L Receta de medio (por litro de medio de fermentación) : K2HP04 7.5 g, MgS0 * 7H20 2 g, ácido cítrico monohidratado 2g, citrato de amonio férrico 0.3 g, extracto de levadura 0.5 g, solución metálica residual modificada 1000X 1 mi. Todos los componentes se añadieron juntos y se disolvieron en diH20. Esta solución se sometió a autoclave. El pH se ajustó a 7.0 con hidróxido de amonio (30%) y cantidad suficiente hasta volumen. Glucosa 10 g, tiamina * HC1 0.1 g, y antibióticos fueron añadidos después de la esterilización y ajuste de pH.
Solución metálica residual modificada 1000X Ácidos cítricos *"H20 40 g, MnS04 * H20 30 g, NaCl 10 g, FeS04 * 7H20 1 g, CoCl2 * 6H20 1 g, ZnS04 * 7H20 1 g, CuS04 * 5H20 100 mg, H3B03 100 mg, NaMo04 * 2H20 100 mg. Cada componente se disuelve uno a la vez en Di H20, pH a 3.0 con HCl/NaOH, después cantidad suficiente hasta volumen y se esterilizan por filtro con un filtro de 0.22 mieras.
La fermentación se llevó a cabo en un biorreactor de 15 L con células de E. coli BL21 (DE3) que contenían la vía de ácido mevalónico superior (MVA) (pCL Upper) , la vía de MVA inferior integrada (gil .2KKDyI ) , y alta expresión de mevalonato cinasa de M. mazei e isopreno sintasa de P. alba (pTrcAlba-mMVK) . Este experimento se llevó a cabo para monitorear la formación de isopreno a partir de glucosa al pH de fermentación deseado 7.0 y temperatura de 30°C. Un frasco congelado de la cepa de E. coli fue descongelado e inoculado en medio de triptona-extracto de levadura. Después de que el inoculo creció hasta OD 1.0, medida a 550 nm, se usaron 500 mL para inocular un biorreactor de 15 L llevando el volumen inicial a 5 L. — «es i) Producción de isopreno en células de E. coli (EL256) cultivadas en un cultivo de alimentación intermitente sin alimentación de extracto de levadura Se alimentó glucosa a una velocidad exponenci hasta que las células alcanzaran la fase estacionaria. Después de este tiempo la alimentación de glucosa se redujo para satisfacer las demandas metabólicas. La cantidad total de glucosa suministrada al biorreactor durante la fermentación de 67 horas fue de 3.9 kg . La inducción se logró al añadir isopropil -beta-D- 1 -t iogalactopiranósido (IPTG) . La concentración de IPTG se llevó a 102 uM cuando la densidad óptica a 550 nm (OD550) alcanzó un valor de 9. La concentración de IPTG se elevó a 192 uM cuando la OD550 alcanzó 140. El perfil OD550 dentro del biorreactor con el tiempo se muestra en la figura 67A. El nivel de isopreno en el gas de evolución del biorreactor se determinó usando un espectrómetro de masas Hiden. El título de isopreno se incrementó durante el curso de la fermentación hasta un valor final de 35.6 g/L (figura 67B) . La cantidad total de isopreno producida durante la fermentación de 67 horas fue de 320.6 g y el curso de tiempo de producción se muestra en la figura 67C. El perfil de actividad metabólica, medido mediante TCER , se muestra en la figura 67D. El rendimiento molar de carbono utilizado que apareció para producir isopreno durante la fermentación fue de 17.9%. El rendimiento porcentual en peso de isopreno a partir de glucosa fue de 8.1%.
Producción de isopreno en células de E. coli (EL256) cultivadas en un cultivo de alimentación intermitente con alimentación de extracto de levadura Se alimentó glucosa a una velocidad exponencial hasta que las células alcanzaran la fase estacionaria. Después de este tiempo la alimentación de glucosa se redujo para satisfacer las demandas metabólicas. La cantidad total de glucosa suministrada al biorreactor durante una fermentación de 68 horas fue de 7.1 kg. Un total de 1.06 kg de extracto de levadura se alimentaron también durante la fermentación. La inducción se logró al añadir IPTG. La concentración de IPTG se llevó a 208 uM cuando la densidad óptica a 550 nm (OD550) alcanzó un valor de 7. La concentración de IPTG se elevó a 193 uM cuando la OD550 alcanzó 180. El perfil OD550 dentro del biorreactor con el tiempo se muestra en la figura 68A. El nivel de isopreno en el gas de evolución del biorreactor se determinó usando un espectrómetro de masas Hiden. El título de isopreno se incrementó durante el curso de la fermentación hasta un valor máximo de 32.2 g/L (figura 68B) . La cantidad total de isopreno producida durante la fermentación de 68 horas fue de 395.5 g y el curso de tiempo de producción se muestra en la figura 68C. El curso de tiempo de productividad volumétrica se muestra en la figura 68D y muestra que una velocidad promedio de 1.1 g/L/hr se mantuvo durante entre 23 y 63 horas. El perfil de actividad metabólica, medido por CER, se muestra en la figura 68E. El rendimiento molar de carbono utilizado que se transformó produciendo isopreno durante la fermentación fue de 10.3%. El rendimiento porcentual en peso de isopreno a partir de glucosa fue de 5.2%.
IV. Producción de isopreno a partir de diferentes fuentes de carbono en E. coli que porta la vía de ácido mevalónico (MVA) e isopreno sintasa (EWL256) Receta de medio (por litro de medio de fermentación) : K2HP04 13.6 g, KH2PO4 13.6 g, MgS04 * 7H20 2 g, ácido cítrico monohidratado 2 g, citrato de amonio férrico 0.3 g, (NH4)2S04 3.2 g, extracto de levadura 0.2 g, solución metálica residual modificada 1000X 1 mi. Todos los componentes fueron disueltos secuencialmente en diH20. El pH se ajustó a 6.8 con hidróxido de amonio (30%) y se llevó a volumen. El medio se esterilizó con filtro con un filtro de 0.22 mieras. La fuente de carbono se añadió hasta una concentración final de 1% . Los antibióticos requeridos fueron añadidos después de la esterilización y ajuste de pH.
Solución metálica residual 1000X (por litro de medio de fermentación) : Ácidos cítricos * H20 40 g, MnS04 * H20 30 g( NaCl 10 g, FeS04 * 7H20 1 g, CoCl2 * 6H20 1 g, ZnS04 * 7H20 1 g, CuS04 * 5H20 100 mg, H3BO3 100 mg, NaMo04 * 2H20 100 mg. Cada componente se disolvió uno a la vez en diH20, pH a 3.0 con HCl/NaOH, y luego se llevó a un volumen y se esterilizó con un filtro de 0.22 mieras. i ) Preparación de hidrolizado de biomasa AFEX Hojas y troncos de maíz pre-tratados AFEX fueron hidrolizados para preparar hidrolizado- de biomasa que contenía xilosa, glucosa y acetato.
Se usaron hojas y troncos de maíz pre-tratados AFEX, recibidos de Michigan Biotechnology Institute. Las condiciones de pre-tratamiento fueron, 60% de humedad, 1:1 de carga de amoniaco y 90°C durante 30 minutos, después secado al aire. El contenido de humedad en las hojas y troncos de maíz pre-tratados AFEX fue de 21.27%. El contenido de glucanos y xilanos en las hojas y troncos de maíz pre-tratados AFEX fue de 31.7% y 19.1% (base seca) respectivamente. La enzima usada fue acelerasa 1000, Grindamyl H121 (producto xilanasa de Danisco de Aspergillus niger para la industria de la repostería) .
Para la sacarificación, 20 g de hojas y troncos de maíz pre-tratados AFEX se añadieron a un matraz de 500 mi, junto con 5 mi de regulador de pH de citrato de sodio 1 M pH 4.8, 2.25 mi de Accellerase 1000, 0.1 mi de Grindamyl H121 y 72.65 mi de agua DI. El matraz se puso en un agitador orbital y se incubó a 50°C durante 96 horas.
Para el análisis, se tomó una muestra del agitador y se analizó usando HPLC. El hidrlizado contenía 37.2 g/1 de glucosa y 24.3 g/L de xilosa, y 7.6 g/L de oligómeros de glucosa y/o xilosa. Además, el hidrolizado también contiene 1.17 g/L de acetato. ii) Procedimiento experimental un inoculo de la cepa de E. coli EWL256 que contenía la vía MVA e isopreno sintasa se tomó de un frasco congelado y se ralló sobre una placa de agar de caldo LB que contenía espectinomicina (50 ug/mL) y carbenicilina (50 ug/mL) y se incubó a 30°C durante la noche. Una sola colonia fue inoculada en medio TM3 que contenía glucosa, xilosa, glicerol, acetato o biomasa como única fuente de carbono y se cultivó durante la noche a 30°C. Las células que crecieron sobre acetato alcanzaron una densidad óptica significativamente inferior. Las células que crecieron en glucosa, glicerol, hidrolizado de biomasa o acetato fueron diluidas en 20 mL de medio TM3 que contenía las fuentes de carbono respectivas para alcanzar una densidad óptica de entre 0.1 medida a 600 n . Un control negativo que no contenía ninguna fuente de carbono se preparó a partir del cultivo nocturno de glucosa. Se llevó a cabo un experimento separado con glucosa y xilosa, en donde los cultivos fueron diluidos hasta una densidad óptica de 0.05. todas las condiciones de cultivo (excepto para acetato y glicerol) fueron probadas por duplicado y los resultados presentados se promedian entre estos cultivos. La producción de isopreno se indujo con 200 µ? de IPTG a partir del inicio del experimento. Los matraces fueron incubados a 30°C en un agitador orbital (200 rpm) y el crecimiento fue seguido por medición de la densidad óptica. Después de que los cultivos alimentados con glucosa hubieron alcanzado una densidad óptica de. aproximadamente 0.4, se analizaron muestras para producción de isopreno de todas las fuentes de carbono probadas cada hora durante 3 horas. Muestras de 100 µL fueron transferidas por duplicado a frascos de vidrio de 2 mL, sellados e incubados durante 30 minutos a 30°C. Las bacterias fueron después eliminadas mediante incubación a 80°C durante 8 minutos. La cantidad de isopreno producida se midió usando GC-MS y se calculó la productividad específica (ug/L*hr) . iii) Resultados Una producción significativa de isopreno pudo demostrarse durante el crecimiento en todas las fuentes de carbono probadas. Estas fuentes de carbono son ejemplos de alcoholes comunes, ácidos orgánicos, azúcares que contienen 5 ó 6 unidades de carbono (C5 o C6) e hidrolizado de biomasa.
La velocidad de crecimiento inicial en hidrolizado de biomasa fue comparable a la velocidad de crecimiento en glucosa (figura 69A) . La productividad específica inicial durante el crecimiento en hidrolizado de biomasa fue significativamente más alta que durante el crecimiento en glucosa. Esto demuestra que el hidrolizado de biomasa se puede usar como una fuente eficiente de carbono para la producción de isopreno. La productividad específica declinó después de 255 minutos de crecimiento en hidrolizado de biomasa (figura 69B) . Las bacterias tuvieron una velocidad de crecimiento más lenta con xilosa como única fuente de carbono cuando se les comparó con glucosa (figura 69C) , pero una productividad de isopreno específica significativa fue medida (figura 69D) . Esto muestra que ambos azúcares de C5 y C6 pueden utilizarse para la producción de isopreno por medio de la vía de ácido mevalónico.
Sorprendentemente, las bacterias que crecieron en acetato como la única fuente de carbono tuvieron una productividad específica de isopreno aproximadamente el doble de alto que durante el crecimiento en glucosa (figura 69A) . Las bacterias crecieron más lento en acetato en comparación con glucosa (figura 69B) , pero el experimento llevado a cabo demuestra que también se puede usar acetato como una fuente de carbono para la producción de isopreno. También estuvo presente acetato en el hidrolizado de biomasa según se mide por HPLC.
Las bacterias crecieron bien con glicerol como única fuente de carbono (figura 69A) y se demostró una producción significativa de isopreno (figura 69B) . Esto muestra que pueden usarse alcoholes comunes también como fuentes de carbono para la producción de isopreno por medio de la vía de ácido mevalónico.
Ejemplo 11 Expresión de isopreno sintasa a partir de plantas Streptomyces sp.
El gen para isopreno sintasa Kudzu fue obtenido del plásmido pJ201: 19813. El plásmido pJ201: 19813 codifica para isopreno sintasa de Pueraia lobata (planta Kudzu) y fue optimizado en codones para Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Rhodopseudomonas palustris y Corynebacterium (figuras 79A-79C (SEQ ID NO: 123)). La digestión del plásmido pJ201: 19813 con enzimas de restricción Ndel y BamHI liberó el gen siol9813 que fue ligado en el vector promiscuo pUWL201PW (Doumith et al., Mol. Gen. Genet . 264:477-485, 2000; figura 71) para generar pU L201_iso. Una clonación exitosa se verificó mediante análisis de restricción de pUWL201_iso. La expresión de isopreno sintasa isol9813 fue bajo el control del promotor erra que permite la expresión constitutiva en especies de Strepfcomycetes, pero no la expresión en E. coli.
PUWL201PW (sin inserto) y pUWL201_iso también fueron introducidos en Streptomyces aljbus J1074 (Sánchez et al., C em. Biol . 9:519-531, 2002) mediante transformación de protoplastos como se describe por Hopwood et al., The John innes Foundation, Norwich, 1985.
Una alícuota de 200 µ? de suspensiones de protoplastos se transformó con 1.9 µg de pUWL201P o 2.9 ug de pUWL201_iso. Después de la incubación nocturna a 28°C en placas de agar R5 no selectivas, se seleccionaron los transformantes positivos mediante incubación adicional durante 4 días en agar de cubierta R3 que contenía tiostreptón (250 g/ml) . Transformantes resistentes a tiostreptón fueron examinados para la presencia de los plásmidos pU L mediante la preparación de plásmidos usando Plasmid Mini Kit (Qiagen) . El ADN plasmídico preparado se volvió a introducir en DH5a de E. coli para generar cantidades suficientes de ADN plasmídico que sería analizado mediante análisis de restricción. Los transformantes positivos fueron seleccionados en placas de agar L que contenía ampicilina y el análisis del inserto se llevó a cabo por digestión del ADN plasmídico con endonucleasas Ndel y BamHI. Isopreno sintasa se identificó como un fragmento de 1.7 kb en clones pUWL201 positivos mientras que en las cepas de control (pUWL201PW) no se observó este fragmento.
Cepa tipo silvestre y transformantes de S. albus que contenían plásmido de control pUWL201PW o isopreno sintasa que codificaba para pUWL201_iso también se analizaron para la formación de isopreno. Las cepas fueron cultivadas por duplicado en medio sólido (agar de caldo de soya tríptico, TSB; 2.5 mi) en presencia o ausencia de tiostreptón (200 9/p?1) y se incubaron durante 4 días a 28°C en frascos con espacio superior sellado (volumen total 20 mi) . Muestras de espacio superior de 500 µ? (mediciones de punto final) fueron analizadas mediante GC-MS en modo SIM y el isopreno se identificó de acuerdo con los tipos de retención de referencia y masas moleculares (67 m/z). El isopreno presente en las muestras de espacio superior se cuantificó por curvas de calibración generadas previamente. Mientras que S. albus tipo silvestre y las cepas de control que portaban pUWL201P produjeron isopreno a concentraciones ligeramente más altas que el límite de detección (0.04-0.07 ppm) , S. albus que portaba pUWL201_iso produjo isopreno en un exceso de al menos 10 veces en comparación con los controles (0.75 ppm; figura 72) . Los resultados demuestran una expresión exitosa de isopreno sintasa derivada de plantas en organismos procarióticos del grupo Actinomycetes.
Ejemplo 12 Producción de isopreno o mevalonato a partir de ácido graso o aceite de palma en fadR atoC LS5218 de E. coli que contiene la vía de ácido mevalónico superior o superior e inferior más isopreno sintasa de kudzu La cepa Escherichia coli fadR atoC LS5218 (#6966) se obtuvo del Coli Genetic Stock Center. FadR codifica para un represor de transcripción que regula negativamente la expresión de los genes que codifican para las enzimas de degradación de ácidos grasos (Campbell et al., J. Bacteriol . 183:5982-5990, 2001). AtoC es un regulador de respuesta en un sistema regulador de dos componentes en el que AtoS regula el metabolismo de acetolactato . La cepa fadR atoC permite la expresión constitutiva de los genes de degradación de ácido graso e incorpora ácidos grasos de cadena larga en polihidroxialcanoatos de longitud de cadena larga. Cuando se usa aceite de palma como una fuente de carbono para la producción ya sea de mevalonato o isopreno, el aceite de palma se convierte en glicerol más ácido graso. Los métodos para éstos se conocen bien en la técnica, y se pueden llevar a cabo ya sea enzimáticamente mediante la incubación con una lipasa (por ejemplo, lipasa pancreática porcina, lipasa de Candida rugosa u otras lipasas similares) o químicamente mediante saponificación con una base tal como hidróxido de sodio . i ) La cepa fadR atoC de E. coli expresa la vía de ácido mevalónico superior La cepa WW4 fue creada al electroporar pCLPtrcUpperPathway en LS5218 usando métodos estándar (Sambrooke et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a edición, Cold Spring Harbor, 1989). La incorporación del plásmido se demostró por la producción de ácido mevalónico (MVA) cuando las células se cultivaron en medio TM3 complementado ya sea con ácido graso de C12 (MVA) o aceite de palma como la fuente de carbono. Para demostrar la producción de MVA por W4 a partir de ácido graso, células de un cultivo nocturno se diluyeron 1 a 100 en 5 mL de medio TM3 modificado (TM3 sin extracto de levadura) complementado con 0.25% de C12 FA (Sigma cat# L9755) . El primer signo de producción de MVA (24 mg/L) fue aparente después de la incubación nocturna a 30 °C del cultivo inducido con IPTG.
La producción se incrementó después de 3 días con el nivel final de 194 mg/L de MVA producido. Para demostrar la producción de MVA por 4 de aceite, células de un cultivo nocturno se diluyeron 1 a 100 en medio TM3 modificado complementado con 200 mg de aceite de palma digerido por 5 mL de medio TM3. La primera señal de producción de MVA (50 mg/L) fue aparente después de la incubación nocturna del cultivo inducido con IPTG a 30°C. La producción se incrementó después de 3 días con un nivel final de 500 mg/L de MVA producido. ii ) Cepa FadR atoC de E. coli que expresa la vía MVA superior e inferior más isopreno sintasa de kudzu La cepa de Escherichia coli W 4 (LS5218 fadR atoC pCLPtrcUpperPathway) se transformó con pMCM118 [pTrcKKDylklS] para producir WW10. La incorporación del plásmido fue demostrada por la evidencia de producción de isopreno cuando la cepa se cultivó en TM3 y glucosa y se indujo con IPTG (100, 300 ó 900uM) . La cepa fue relativamente sensible a IPTG y mostró un defecto de crecimiento significativo incluso a 100 uM de IPTG. Estos resultados se muestran en la figura 70A.
Para probar la producción de isopreno a partir de ácido dodecanoico, WW10 se cultivó durante la noche en caldo L que contenía espectinomicina (50 ug/ml) , y kanamicina (50 ug/ml) a 37°C con agitación a 200 rpm. Las células se lavaron con medio TM3 modificado por centrifugación y resuspensión en su volumen de cultivo original con este medio. Las células lavadas y resuspendidas de este cultivo de inicio se diluyeron 1 a 100 y 1 a 10 en 5 mL de medio TM3 modificado que contenía 0.125% de ácido graso C12 (Sigma cat #L9755) .
Para demostrar la producción de mevanolato a partir de aceite de palma, el aceite fue predigerido con lipasa a 37°C y 250 rpm durante varios días para liberar los ácidos grasos (evidencia de hidrólisis fue juzgada por la espuma que se formó cuando los tubos fueron agitados) .
Además, se instaló un cultivo al diluir las células lavadas a 1 a 10 en medio TM3 modificado contenido en tubos de ensayo con aceite de palma. Un tubo adiciona fue establecido mediante la adición de 0.125% de C12FA al resto (2.5 mL) de las células lavadas sin dilución adicional (bioconversión) . Después de 3.75 horas de crecimiento a 30°C con agitación a 250 rpm todos los cultivos fueron inducidos mediante la adición de 50 uM de IPTG. Se continuó incubando durante 4 horas, tiempo después del cual 200 uL de cada uno de los cultivos fueron ensayados para acumulación de isopreno con un ensayo de espacio superior modificado (acumulación de 1. hora a 30 °C con agitación a 500 rpm) . Un ensayo de isopreno adicional se llevó a cabo mediante una incubación de 12 horas del bloque de vidrio de ensayo antes del análisis GCMS . La incubación de los cultivos inducidos se continuó durante la noche y alícuotas de 200 uL fueron nuevamente ensayados para producción de isopreno (1 hora, 30 grados, agitador Shel-Lab de 500rpm) a la mañana siguiente. El análisis de estos cultivos mostró la producción de niveles significativos de isopreno. Los niveles más altos de isopreno fueron observados en el cultivo que se sembró a una dilución 1/10 a partir del cultivo de inicio nocturno después de que había sido incubado e inducido durante la noche. Este resultado sugiere que este cultivo continuó creciendo y .se incrementó en densidad celular. Estos resultados se muestran en la figura 70B. La densidad celular no pudo haber sido medida directamente toda vez que la suspensión de ácido graso tenía una apariencia turbia. La densidad celular de este cultivo fue por lo tanto determinada al colocar una alícuota del cultivo en placas y mostrar 8 x 107 unidades formadoras de colonia. Esto corresponde aproximadamente a una OD60o de 0.1. No obstante, este cultivo proporcionó una producción de isopreno significativa; ningún isopreno se observa para cepas similares sin la vía descrita en este ejemplo.
Ejemplo 13 Mejora de la producción de isopreno por medio de la expresión constitutiva de ybhE en E. coli Este ejemplo muestra la producción de isopreno en una cepa que expresa constitutivamente ybhE (pgl) en comparación con una cepa de control con ybhE tipo silvestre. El gen ybhE (pgl) codifica para una 6-fosfogluconolactonasa que suprime la gluconilación después de la traducción de proteínas expresadas heterólogamente y mejora la solubilidad y rendimiento del producto mejorando también el rendimiento de biomasa y el flujo a través de la vía de fosfato de pentosa (Aon et al. Applied and Environmental Microbiology, 74 (4) : 950-958, 2008) .
La cepa BL21 de E. coli que produce isopreno (EWL256) fue construida con la expresión constitutiva del gen ybhE en un plásmido en replicación pBBRlMCS5 (Gentamycin) (obtenido de Dr. K. Peterson, Louisiana State University) .
Casetes de recombinación a base de FRT y plásmidos para la integración mediada por Red/ET y desenrollamiento de marcador de antibióticos fueron obtenidos de Gene Bridges GmbH (Alemania) . Los procedimientos usando estos materiales se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos de Gene Bridges. Los cebadores Pgl-F y PglGI1.5-R también se usaron para amplificar el cásete de resistencia a partir de la plantilla FRT-gb2 -Cm-FRT usando el kit Stratagene Herculase II Fusión de acuerdo con el protocolo del fabricante. La reacción de PCR (50 uL de volumen final) contenía: 5 uL de regulador de pH, 1 uL de ADN de plantilla (FRT-gb2 -Cm-F de Gene Bridges), 10 pmoles de cada cebador, y 1.5 uL de mezcla de dNTP 25 mM, hecha a 50 uL con dH20. La reacción fue ciclizada como sigue: 1 x 2 minutos, 95°C después 30 ciclos de (30 segundos a 95°C; 30 segundos a 63°C; 3 minutos a 72°C) .
El producto de PCR resultante se purificó usando el kit de purificación de PCR QiaQick (Qiagen) y se electroporó en células MG1655 electrocompetentes que portaban el plásmido que contenía recombinasa pRed-ET como sigue. Las células se prepararon al cultivar en 5 mLs de caldo L hasta una OD600 de -0.6 a 30°C. Estas células fueron inducidas para expresión de recombinasa mediante la adición de 4% de arabinosa y se les dejó crecer durante 30 minutos a 30°C seguidas por 30 minutos de crecimiento a 37°C. Una alícuota de 1.5 mLs de las células se lavó 3-4 veces en dH20 enfriado con hielo. El sedimento celular final fue resuspendido en 40 uL de dH20 helado y 2-5 uL de producto de PCR fueron añadidos. La electroporación se llevó a cabo en cubetas con espacio de 1 mm, a 1.3 kV en un Gene Pulser Electroporator (Bio-Rad Inc.) .
Las células se recuperaron durante 1-2 horas a 30°C y se pusieron en placas de agar L que contenía cloranfenicol (5 ug/mL) . Cinco transformantes se analizaron mediante PCR y secuenciación usando cebadores que flanqueaban el sitio de integración (2 juegos de cebadores: pgl y 49 rev y 3' EcoRV-pglstop; Bottom Pgb2 y Top GB's CMP (946)). Un transformante correcto fue seleccionado y estas cepas se designó MG1655 Gil .5-pgl : :CMP.
El ADN cromosómico de MG1655 Gil .5 -pgl :: CMP se usó como plantilla para generar un fragmento de PCR que contenía la construcción FRT-CMP-FRT-GIl .5-ybhE . Esta construcción se clonó en pBBRlMCS5 (Gentamycin) como sigue. El fragmento, en adelante referido como CMP-GI1.5 -pgl , fue amplificado usando el cebador 5' Pglconfirm-F y el cebador 3' 3 ' EcoRV-pglsto . El fragmento resultante se clonó usando el kit de clonación Invitrogen TOPO-Blunt en el vector plasmídico pCR-Blunt II-TOPO como lo sugiere el fabricante. El fragmento Nsil que portaba al fragmento CMP-GI1.5-pgl se clonó en el sitio PstI de pBBRlMCS5 (Gentamycin) . Una reacción de ligación de 20 µ? se preparó que contenía 5 µ? de inserto CMP-GI1.5-pgl , 2 µ? de vector pBBRlMCS5 (Gentamycin) , 1 µ? de ADN ligasa T4 (New England Biolabs) , 2 µ? de regulador de pH de ligasa 10X y 10 µ? de ddH20. La mezcla de ligación se incubó a temperatura ambiente durante 40 minutos después 2-4 uL fueron electroporados en células ToplO electrocompetentes (Invitrogen) usando los parámetros descritos arriba. Los transformantes se seleccionaron en agar L que contenía 10 ug/ml de cloranfenicol y 5 ug/ml de gentamicina. La secuencia del clon seleccionado se determinó usando un número de cebadores descritos arriba así como con los cebadores T3 e inverso de casa proporcionados por Sequetech, CA. Este plásmido fue designado pBBRCMPGIl .5-pgl (figuras 77A-B y SEQ ID NO: 122) .
El plásmido pBBRCMPGIl .5-pgl fue electroporado en E L256, como se describió arriba en el ejemplo 10 y los transformantes fueron colocados en placas de agar L que contenía cloranfenicol (10 ug/mL) , gentamicina (5 ug/mL) , espectinomicina (50 ug/mL) y carbenicilina (50 ug/mL) . Se seleccionó un transformante y se seleccionó RM11608-2.
Cebadores: Pgl-F 5' - ACCGCCAAAAGCGACTAATTTTAGCTGTTACAGTCAGTTGAATTAACCCTCACTAAAGGGC GGCCGC-3' (SEQ ID NO: 115) PglGI1.5-R 5' - GCTGGCGATATAAACTGTTTGCTTCATGAATGCTCCTTTGGGTTACCTCCGGGAAACGCGG TTGATTTGTTTAGTGGTTGAATTATTTGCTCAGGATGTGGCATAGTCAAGGGCGTGACGGC TCGCTAATACGACTCACTATAGGGCTCGAG-3 ' (SEQ ID NO: 116) 3 'EcoRV-pglstop : 5'CTT GATA TC TTA GTG TGC GTT AAC CAC CAC (SEQ ID N0:117) Pgl+49 rev: CGTGAATTTGCTGGCTCTCAG (SEQ ID NO: 118) Bottom Pgb2: GGTTTAGTTCCTCACCTTGTC (SEQ ID NO:119) Top GB'S CMP (946): ACTGAAACGTTTTCATCGCTC (SEQ ID NO: 120) Pglconfirm-F 5' -ACCGCCAAAAGCGACTAATTTTAGCT-3' (SEQ ID NO: 121) i ) Análisis a pequeña escala Receta de medio (por litro de medio de fermentación) : K2HP04 13.6 g, KH2PO4 13.6 g, MgS04 *"7H20 2 g, ácido cítrico monohidratado 2 g, citrato de amonio férrico 0.3 g, (NH4)2S04 3.2 g, extracto de levadura 1 g, solución de metales residuales 1000X 1 mi. Todos los componentes se añadieron juntos y se disolvieron en diH20. El pH se ajustó a 6.8 con hidróxido de amonio (30%) y se llevó a volumen. El medio se esterilizó con filtro con un filtro de 0.22 mieras. Glucosa 5.0 g y antibióticos se añadieron después de la esterilización y ajuste de pH.
Solución metálica residual 1000X (por litro de medio de fermentación) : Ácido cítrico * H20 40 g, MnS04 * H20 30 g, NaCl 10 g, FeS04 * 7H20 lg, CoCl2 * 6H20 lg, ZnS04 * 7H20 lg, CuS04 *"5H20 100 mg, H3B03 lOOmg, NaMo04 * 2H20 100 mg. Cada componente se disuelve uno a la vez en diH20. El pH se ajusta a 3.0 con HCl/NaOH, y luego la solución se lleva a volumen y se esteriliza por filtración con un filtro de 0.22 mieras . a) Procedimiento experimental La producción de isopreno se analizó al cultivar las cepas en un Cellerator™ de MicroReactor Technologies, Inc. El volumen de trabajo en cada uno de los 24 pocilios fue de 4.5 mL . La temperatura se mantuvo a 30°C, el punto de ajuste de pH fue 7.0, el punto de ajuste de flujo de oxígeno fue 20 sccm y la velocidad de agitación fue 800 rpm. Un inoculo de la cepa de E. coli tomada de un frasco congelado se ralló sobre una placa de agar de caldo LB (con antibióticos) y se incubó a 30°C. Una sola colonia fue inoculada en medio con antibióticos y cultivada durante la noche. Las bacterias se diluyeron en 4.5 mL de medio con antibióticos para alcanzar una densidad óptica de 0.05 medida a 550 nm.
El análisis de gas de evolución de isopreno se llevó a cabo usando un ensayo de espacio superior con cromatógrafo de gases-espectrómetro de masas (GC-MS) (Agilent) . La preparación de la muestra fue como sigue: 100 µL de caldo entero se pusieron en un frasco GC sellado y se incubaron a 30°C durante un tiempo fijo de 30 minutos. Después de una etapa de eliminación con calor, que consistía en incubación a 70°C durante 5 minutos, la muestra fue cargada en el GC.
La densidad óptica (OD) a una longitud de onda de 550 nm se obtuvo usando un lector de microplaca (Spectramax) durante el curso de la corrida. La productividad específica se obtuvo al dividir la concentración de isopreno (ug/L) entre la lectura de OD y el tiempo (hora) .
Las dos cepas E L256 y RM11608-2 fueron evaluadas a 200 y 400 uM de niveles de inducción de IPTG. Las muestras se analizaron para producción de isopreno y crecimiento de células (OD550) 1, 2.5, 4.75 y 8 horas después de la inducción. Las muestras se hicieron por duplicado. b) Resultados El experimento demostró que a 2 concentraciones diferentes de IPTG la cepa que expresa el ybhE (pgl) tuvo un dramático incremento de 2-3 veces en productividad específica de isopreno en comparación con la cepa de control. ii ) Fermentación de isopreno a partir de E. coli que expresa mevalonato cinasa de M. mazei, isopreno sintasa de P. alija y sobre-expresión de pgl (RHM111608-2) y cultivada en un cultivo de alimentación intermitente a la escala de 15 L Receta del medio (por litro de medio de fermentación) K2HP04 7.5 g, MgS04 * 7H20 2 g, ácido cítrico monohidratado 2 g, citrato de amonio férrico 0.3 g, extracto de levadura 0.5 g, solución de metal residual modificada 1000X 1 mi. Todos los componentes se añadieron juntos y se disolvieron en diH20. Esta solución se sometió a autoclave. El pH se ajustó a 7.0 con hidróxido de amonio (30%) y cantidad suficiente hasta volumen. Glucosa 10 g, tiamina * HC1 0.1 g, y antibióticos fueron añadidos después de la esterilización y ajuste del pH.
Solución.de metal residual modificada 1000X: Ácidos cítricos * H20 40 g, MnS04 * H20 30 g, NaCl 10 g, FeS04 * 7H20 1 g, CoCl2 * 6H20 1 g, ZnS04 * 7H20 1 g, CuS04 * 5H20 100 mg, H3B03 100 mg, NaMO04 * 2H20 100 mg . Cada componente se disuelve uno a la vez en Di H20, pH a 3.0 con HCl/NaOH, después cantidad suficiente hasta el volumen y se esteriliza en el filtro con un filtro de 0.22 mieras .
La fermentación se llevó a cabo en un biorreactor de 15 L con células de E. coli BL21 (DE3) que. contienen la vía de ácido mevalónico superior (MVA) (pCL Upper) , la vía de MVA inferior integrada (gil .2KKDyI ) , alta expresión de mevalonato cinasa de M. mazei e isopreno sintasa de P. alba (pTrcAlba-mMVK) , y alta expresión de pgl (pBBR-pgl) . Este experimento se llevó a cabo para monitorear la formación de isopreno a partir de glucosa al pH de fermentación deseada 7.0 y temperatura de 34 °C. Un frasco congelado de la cepa de E. coli se descongeló y se inoculó con medio de triptona-extracto de levadura. Después de que el inoculo creció a OD 1.0, medida a 550 mL, se usaron 500 mL para inocular un biorreactor de 15 L llevando el volumen inicial a 5 L.
Se alimentó glucosa a una velocidad exponencial hasta que las células alcanzaran la fase estacionaria. Después de este tiempo la alimentación de glucosa se redujo para satisfacer las demandas metabólicas. La cantidad total de glucosa suministrada al biorreactor durante la fermentación de 40 horas (59 horas) fue de 3.1 kg (4.2 kg a 59 horas) . La inducción se logró al añadir IPTG. La concentración de IPTG se llevó a 110 uM cuando la densidad óptica a 550 nm (OD550) alcanzó un valor de 4. La concentración de IPTG se elevó a 192 uM cuando la OD550 alcanzó 150. El perfil OD550 dentro del biorreactor con el tiempo se muestra en la figura 78A. El nivel de isopreno en el gas de evolución del biorreactor se determinó usando un espectrómetro de masas Hiden. El título de isopreno se incrementó durante el curso de la fermentación hasta un valor máximo de 33.2 g/L 40 horas después (48.6 g/L 59 horas después) (figura 78B) . El título de isopreno se incrementó durante el curso de la fermentación hasta un valor máximo de 40.0 g/L después de 40 horas (60.5 g/L después de 59 horas) (figura 78C) . La cantidad total de isopreno producida durante la fermentación de 40 horas (59 horas) fue de 281.3 g (451.0 g después de 59 horas) y el curso de tiempo de producción se muestra en la figura 78D. El curso de tiempo de productividad volumétrica se muestra en la figura 78E y muestra que una velocidad promedio de 1.0 g/L/hr se mantuvo entre 0 y 40 horas (1.4 g/L/hora entre 19 y 59 horas) . El perfil de actividad metabólica, medido por CER, se muestra en la figura 78F. El rendimiento molar de carbono utilizado que se introdujo produciendo isopreno durante al fermentación fue de 19.6% después de 40 horas (23.6% después de 59 horas) . El rendimiento porcentual en peso de isopreno. a partir de glucosa fue de 8.9% después de 40 horas (10.7% después de 59 horas) .
Preparación de muestras de isopreno para pol imeri zación (a) Preparación de solución metálica residual modificada 1000X: Cada uno de los siguientes componentes se disuelve uno a la vez en Di H20 : ácido cítrico * H20 (40 g) , MnS04 * H20 (30 g) , NaCl (10 g) , FeS04 * 7H20 (1 g) , CoCl2 * 6H20 (1 g) , ZnSO * 7H20 (1 g) , CuS04 * 5H20 (100 mg) , H3BO3 (100 mg) , NaMo04 * 2H20 (lOOmg). El pH se ajustó a 3.0 con HCl/NaOH, luego cantidad suficiente hasta el volumen y se esterilizó por filtración con un filtro de 0.22 mieras. (b) Preparación de medio de fermentación: Cada litro de medio de fermentación contenía K2HP04 (7.5 g) , MgS04 * 7H20 (2 g) , ácido cítrico monohidratado (2 g) , citrato de amonio férrico (0.3 g) , extracto de levadura (0.5 g) , solución metálica résidual modificada 1000X (1 mi) . Todos los componentes se añadieron juntos y se disolvieron en diH20. Esta solución se sometió a autoclave. El pH se ajustó a 7.0 con gas amonio (NH3) y cantidad suficiente hasta volumen. Glucosa (10 g) , tiamina * HCl (0.1 g) , y antibiótico fueron añadidos después de la esterilización y ajuste del pH. ( c ) Recolección de muestras de isopreno para purificación y polimerización: Se recogió isopreno mediante adsorción sobre carbón activado al pasar el escape de fermentación a través de latas de carbón activado dispuestas en paralelo en un distribuidor de escape. (d) Preparación de polimerización de isopreno muestra A a partir de glucosa usando E. coli Se llevó a cabo la fermentación a un pH de 7.0 y 30°C en un biorreactor de 15 L con células de E. coli BL21 (DE3) que contenían los plásmidos pCL PtrcUpperMVA y pTrc KKDyIkIS. Un inoculo de cepa de E. coli tomado de un frasco congelado se ralló sobre una placa de agar de caldo LB (con antibióticos) y se incubó a 37°C. Una sola colonia fue inoculada en medio de triptona-extracto de levadura. Después de que el inoculo creció a OD 1.0, medida a 550 nm, se usaron 500 mL para inocular un biorreactor de 5 L.
Se alimentó glucosa a una velocidad exponencial hasta que las células alcanzaran la fase estacionaria. Después de este tiempo la alimentación de glucosa se redujo para satisfacer demandas metabólicas. La cantidad total de glucosa suministrada al biorreactor durante la fermentación de 54 horas fue de 3.7 kg . La inducción se logró al añadir isopropil -beta-D- 1 - t iogalactopiranós ida (IPTG) . La concentración de IPTG se llevó a 25 µ cuando la densidad óptica a 550 nm (OD550) alcanzó un valor de 10. La concentración de IPTG se elevó a 50 uM cuando la OD550 alcanzó 190. La concentración de IPTG se elevó a 100 uM después de 38 horas de fermentación. El perfil OD550 dentro del biorreactor con el tiempo se muestra en la figura 1. El título de isopreno se incrementó durante el curso de la fermentación hasta un valor final de 2.2 g/L (figura 2) . La cantidad total de isopreno producida durante la fermentación de 54 horas fue de 15.9 g y el curso de tiempo de producción se muestra en la figura 3. El rendimiento molar de carbono utilizado que se creó al producir isopreno durante la fermentación fue de 1.53%. (Véanse figuras 80, 81 y 82). ( e ) Preparación de la muestra B de polimerización de isopreno a partir de glucosa y extracto de levadura usando E. coli La formación de isopreno a partir de glucosa y extracto de levadura se llevó a cabo a pH 7.0 y 30°C en un biorreactor de 500 L con células de E. coli que contenían el plásmido pTrcKudzu + yIDI + DXS . Un inoculo de cepa de E. coli tomado de un frasco congelado se preparó en medio de soytone -extracto de levadura-glucosa. Después de que el inoculo creció hasta OD 0.15, medida a 550 nm, se usaron 20 mL para inocular un biorreactor que contenía 2.5 L de medio de tryptone - extracto de levadura. El biorreactor de 2.5 L se cultivó a 30°C hasta OD 1.0 y 2.0 L se transfirieron al biorreactor de 500 L. Extracto de levadura (Bio Springer, Montreal, Quebec, Canadá) y glucosa se alimentaron a velocidades exponenciales. La cantidad total de glucosa y extracto de levadura suministrada al biorreactor durante la fermentación de 50 horas fue de 181.2 kg y 17.6 kg, respectivamente. La densidad óptica dentro del biorreactor con el tiempo se muestra en la figura 4. El título de isopreno se incrementó durante el curso de la fermentación (figura 5) . La cantidad total de isopreno producida durante la fermentación de 50 horas fue de 55.1 g y el curso de tiempo de producción se muestra en la figura 6.
Desorción de isopreno a partir de carbón activado (método A) Carbón activado (130 g) , el cual había sido expuesto a una corriente de gas de escape de termentador, se puso en un matraz de 1000 mL junto con una varilla de agitación. Se añadió ciclohexano (563 mL) al matraz y la suspensión se agitó durante 2 horas. Se aplicó vacío (100 mbares) por medio de una trampa criogénica en línea (capacidad de 30 mL, sumergida en nitrógeno líquido) . Se recogieron 4 fracciones y se combinaron para producir una solución de isopreno/ciclohexano (2.1% en peso de isopreno, volumen total = 53.1 g) . Esta solución se destiló al vacío a 100 mbares y una nueva solución de isopreno/ciclohexano fue recogida (rendimiento = 10.1 g) , la cual se secó sobre tamices moleculares 3A. El análisis GC de esta solución indicó un contenido de isopreno de 7.7% en peso.
Desorción de isopreno a partir de carbón activado (método B) Carbón activado (65 g) , el cual había sido expuesto a una corriente de gas de escape de termentador, se puso en un matraz de 500 mL junto con una varilla de agitación. Se añadió Jarytherm DBT (250 g) al carbón y la suspensión se agitó durante 2 horas. Se aplicó vacío (5 mbares) por medio de una trampa criogénica en línea (30 mL de capacidad, sumergida en nitrógeno líquido) . Después de 1 hora la trampa se calentó a la temperatura ambiente. Estuvieron presentes dos fases líquidas en la trampa (peso total 1.82 g) . La fase orgánica se diluyó con ciclohexano (3.26 g) , se decantó y se secó sobre tamices moleculares 3A. El análisis GC de esta solución indicó un contenido de isopreno de 27.35 en peso, o 1.22 g) .
Preparación de catalizador de neodimio Versatato de neodimio (2.68 mL, 0.51 M en hexano) , triisobutilaluminio (54 mL, 1.0 M en hexano) y cloruro de dietilaluminio (3.40 mL, 1.0 M en hexano), se extrajeron en jeringas de plástico equipadas con una cánula de acero. Los primeros dos componentes se añadieron a una solución de 1,3-butadieno en hexano (22.4 mL, 15% en peso de 1, 3 -butadieno, puestas en un recipiente de vidrio de 100 mL con parte superior tapada y se agitaron durante 0.5 horas a temperatura ambiente. El último componente se añadió a la solución después de lo cual se añejó por calor durante 0.5 horas a 65°C. La solución final era transparente y amarilla. La concentración de la solución a base de neodimio fue de 0.0164 M .
Preparación de catalizador de titanio Un recipiente de reacción de vidrio de 100 mL con entrada de septo y que contenía una varilla de agitación magnética se puso en un baño de hielo a 0°C, se cargó con n-hexano (5.07 mL, anhidro), y con TiCl4 concentrado (1.5 mL, 13.7 mmoles) bajo agitación vigorosa. Por separado, se generó una solución que consistía en éter difenílico (1.2 mL, 7.6 mmoles) y triisobutilaluminio (14.6 mL, 12.6 mmoles, solución al 25% en peso en hexano) . La solución se añadió al recipiente de reacción durante el curso de 5 minutos. Se formó un precipitado café durante la adición. La suspensión se agitó durante 10 minutos y después se almacenó a -40°C para uso futuro.
Polimerización Muestras de poliisopreno derivado principalmente de glucosa se produjeron al polimerizar la muestra A de polimerización de isopreno con catalizador de neodimio y n-BuLi . Muestras de poliisopreno derivado de la co-fermentación de glucosa y extracto de levadura se produjeron al polimerizar la muestra B de polimerización de isopreno con catalizador de neodimio, catalizador de titanio, catalizador de n-BuLi y polimerización de radical libre en emulsión. Las condiciones de polimerización representativas se describen abajo.
Polimerización en solución de isopreno con catalizador de neodimio Un frasco de vidrio con parte superior roscada de 4 mL con varilla de agitación recubierta con teflón se templó en un horno durante 3 horas a 150°C. El frasco se equipó con un tapón de silicón y superficie de teflón y una tapa de parte superior abierta. Usando una jeringa, se cargó después con una solución de isopreno (1.5 g, 7.7% en peso en ciclohexano, anhidro) . Solución de catalizador de neodimio (60 uL) se inyectó en el frasco con una micro- j eringa . El frasco se puso en un agitador/placa caliente regulado a 65°C, con la varilla de agitación girando a 500 rpm . Después de 15 minutos la solución se volvió notablemente más viscosa. Después de un tiempo de reacción de 1.5 horas la reacción se inactivo con una solución de isopropanol e hidroxitolueno butilado, (BHT) , (30 uL, 10% en peso de BHT) . Una muestra de 100 mg del cemento se retiró para análisis GPC . El cemento de polímero restante se secó bajo condiciones ambiente. El polímero aislado pesaba 110 mg, se determinó que tenía un peso molecular promedio en peso de 935,000 (por GPC) y un contenido de microestructura cis de más de 90% (por 13C-RMN) .
Polimerización en solución de isopreno con catalizador de Ti Un frasco de vidrio con parte superior roscada de 4 mL y varilla de agitación recubierta con teflón se templó en un horno durante 3 horas a 150°C. El frasco se equipó con un tapón de silicón con superficie de teflón pre-ranurado y tapa de parte superior abierta. Usando una jeringa, se cargó de-spués con una solución de isopreno (1.5 g, 7.7% en peso en ciclohexano, anhidro) . La suspensión catalizadora de titanio se agitó magnéticamente y se retiró una muestra (70 uL) con una pipeta de punta desechable, la cual fue después añadida al frasco de reacción a través del septo pre-ranurado. El septo del frasco de reacción se reemplazó con una tapa sólida, y el frasco se puso sobre un agitador/placa caliente regulado a 65°C, con la varilla de agitación girando a 500 rpm . Después de 5 minutos la solución se volvió notablemente más viscosa. Después de un tiempo de reacción de 1.5 horas la reacción se inactivo con una solución de isopropanol e hidroxitolueno butilado (BHT) , (30 uL, 10% en peso de BHT) . Una muestra de lOOmg del cemento se removió para análisis GPC. El cemento de polímero restante se secó bajo condiciones ambiente. El polímero aislado pesada 108 mg, tenía un peso molecular promedioen peso de 221,000 (mediante GPC) , y tenía un contenido de microestructura cis de más de 94% (por 13C-RMN) .
Polimerización en emulsión de isopreno Se usó un frasco de 20 mL como un recipiente de polimerización. La tapa metálica se perforó dos veces con un punzón y el forro de cartón se reemplazó con un empaque de hule y forro de teflón. El frasco se enjuagó con agua desionizada y se secó bajo nitrógeno.
Al frasco se le añadieron 7.05 g de agua desionizada, 1.14 g de jabón al 10% (sal potásica de ácidos grasos mixtos), 174 mg de solución de persulfato de amonio al 10% y 24 mg de n-dodecano tiol. El frasco se purgó durante 30 segundos con nitrógeno y se tapó. Al frasco a través del empaque de hule/teflón se le cargaron 3 mL de bio-HG (2.033 gramos de isopreno) . El frasco se puso en un baño de polimerización de botella estándar (un segundo frasco testigo permite al frasco caber en un sostenedor de botella de 118 mi (4 onzas) ) . La mezcla se hizo girar durante 25.5 horas a 65°C (+/- 0.2°C) .
Tratamiento : El látex se transfirió a un matraz en forma de pera de 50 mL y se diluyó con 10 mL de agua. Material orgánico volátil que no reaccionó se removió al evaporar 2 mL de agua al vacío (64 mmHg, 40-50°C) . Al látex se le añadió una dispersión antioxidante, 140 mg de polifenólico activo al 50% AO (Bostex 24) . El látex se coaguló al añadirlo a una solución de ácido diluida (12 mL de ácido sulfúrico al 18% en 150 mL de agua RO) . El polímero se coaguló en una sola pieza grande que se prensó y se lavó con agua RO . La muestra era una masa ahulada suave blanquecina. El rendimiento fue de 1.24 gramos de masa húmeda.
El contenido de sólidos total final (TSC = 100*peso en seco/peso en húmedo) fue de 18.9% en peso o una conversión aproximada de 84%.
Polimerización de isopreno con butil litio Butil litio (1.6 M en hexano) se diluyó con n-hexano (anhidro) en una relación de 1:10. La solución se tituló contra un estándar N-pivaloil -o-bencilanilina en THF . Una solución de isopreno en ciclohexano (4 mL) se secó al pasarlo a través de una pequeña columna que contenía gel de sílice tratado con calor .
Un frasco de vidrio de 4 mL (secado en horno a 150°C) se cargó con una pequeña varilla de agitación magnética recubierta con teflón y una solución de isopreno en ciclohexano (1.35 g, 21.5% en peso) . Se añadió butil litio (0.14 M, hexano) mediante una jeringa y el frasco se calentó a 65°C en un agitador/placa caliente durante 3 horas. La reacción de polímero se inactivo con una solución de BHT/iso-propanol (10% en peso de BHT en iso-propanol ) . Todos los volátiles se removieron al vacío. Este procedimiento dio 290 mg de polímero lo cual representa un rendimiento teórico de aproximadamente 100%. Este polímero se determinó mediante análisis GPC que tenía un peso molecular promedio en peso (Mw) de 17,880 y se determinó mediante 13C RMN que tenía un contenido de microestructura cis de 67%; un contenido de microest ructura trans de 25% y un contenido de microest ructura 3,4- de 8%.
Análisis GPC de polímeros Cromatografía de exclusión de tamaño (SEC) es una técnica bien establecida para medir el peso molecular y la polidispersión de un polímero (Mw/Mn) . Dos columnas de microgel Polymer Laboratories C en serie se utilizaron con tetrahidrofurano como el solvente portador a una velocidad de flujo de 0.7 ml/min y una temperatura de columna de 40°C. SEC se llevó a cabo usando un detector de dispersión dé luz Wyatt Technologies miniDawn acoplado a un detector de índice de refracción Hewlett Packard 1047A. Estándares de poliestireno se usaron para calibrar el instrumento .
Análisis RMN de los polímeros Las microestructuras poliméricas se determinaron mediante análisis 13C-RMN en un espectrómetro Varían Unity-Plus 400 MHz en solvente de cloroformo-dl .
Datos de los análisis de isótopos 13C/12C.
Entrada Muestra (nota: PI = poliisopreno) 513c 1 PI de azúcar invertido de remolacha dulce -34.98 2 PI comercial de isobutileno -34.43 3 PI comercial de isobutileno -34.42 4 Caucho de guayule -31.10 5 Aceite de palma -30.03. 6 Aceite de palma -30.00 7 Caucho natural (Ñeco) -28.11 8 Caucho natural (Pumpic) -27.92 9 Caucho natural (Negato) -27.86 10 Caucho natural (Niveo) -27.79 11 Caucho natural (Naplo) -27.74 12 Caucho natural (Krado 1) -27.68 13 Caucho natural (Krado 1) -27.55 14 Caucho natural (Krado 2) -27.54 15 Caucho natural (Krado 2) -27.52 16 Caucho natural (Krado 2) -27.49 17 Caucho natural (Nolo) -27.38 18 Extracto de levadura -25.70 19 Extracto de levadura -25.68 20 PI comercial de destilación extractiva (muestra -23.83 2) 21 PI comercial de destilación extractiva (muestra -23.83 2) 22 Azúcar de pulpa de madera blanda (muestra 2) -23.25 23 Azúcar de pulpa de madera blanda (muestra 1) -23.00 24 Azúcar de pulpa de madera blanda (muestra 1) -22.96 25 PI comercial de destilación extractiva (muestra 3) -22.95 26 PI comercial de destilación extractiva (muestra 3) -22.95 27 PI comercial de destilación extractiva (muestra 3) -22.94 28 PI comercial de destilación extractiva (muestra 3) -22.92 29 PI comercial de destilación extractiva (muestra 3) -22.90 30 PI. comercial de destilación extractiva (muestra 3) -22.89 31 PI comercial de destilación extractiva (muestra 3) -22.89 32 PI comercial de destilación extractiva (muestra 3) -22.89 33 PI comercial de destilación extractiva (muestra 3) -22.87 34 PI comercial de destilación extractiva (muestra 3) -22.84 35 PI comercial de destilación extractiva (muestra 1) -22.63 36 PI comercial de destilación extractiva (muestra 1) -22.62 37 PI comercial de destilación extractiva (muestra 1) -22.54 38 PI de muestra B de isopreno (polimerización en -19.67 emulsión) 39 PI de muestra B de isopreno (catalizador de -19.14 neodimio) 40 PI de muestra B de isopreno (catalizador de -18.80 neodimio) 41 PI de muestra B de isopreno (catalizador de -18.37 neodimio) 42 PI de muestra B de isopreno (catalizador de n- -18.12 BuLi) 43 PI de muestra B de isopreno (catalizador de n- -18.12 BuLi) 44 Azúcar invertido (muestra 1) -15.37 45 Azúcar invertido (muestra 2) -15.36 46 Azúcar invertido (muestra 1) -15.34 47 Azúcar invertido (muestra 1) -15.31 48 Azúcar invertido (muestra l) -15.25 49 PI de muestra A de isopreno (catalizador de -14.85 neodimio) 50 PI de muestra A de isopreno (catalizador de n- -14.69 BuLi) 51 PI de muestra A de isopreno (catalizador de n- -14.69 BuLi) 52 PI de muestra A de isopreno (catalizador de n- -14.66 BuLi) 53 Glucosa de bagazo (muestra 2) -13.19 54 Glucosa de bagazo (muestra 1) -13.00 55 Glucosa de bagazo (muestra 1) -12.93 56 Glucosa de hojas y troncos de maíz (muestra 2) -11.42 57 Glucosa de hojas y troncos de maíz (muestra 1) -11.23 58 Glucosa de hojas y troncos de maíz (muestra 1) -11.20 59 Almidón de maíz -11.12 60 Almidón de maíz -11.11 61 Almidón de maíz -11.10 62 Almidón de maíz -11.07 63 Glucosa -10.73 A menos que se defina lo contrario, los significados de todos los términos técnicos y científicos usados en la presente son aquellos entendidos comúnmente por alguien de capacidad en la técnica a la cual esta invención pertenece. Singleton, et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, 2a edición, John Wiley and Sons, Nueva York (1994) , y Hale & Marham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, N.Y. (1991) proporcionan definiciones generales para muchos de los términos usados en la presente .
Los encabezados proporcionados en la presente no son limitaciones de los diferentes aspectos o- modalidades de la invención que pueden haber tenido referencia a la descripción completa. Para uso en la presente, a menos que se indique claramente lo contrario, el uso de los términos "un", "uno" y "una" y similares se refiere a uno o más. La referencia a "aproximadamente" un valor o parámetro en la presente incluye (y describe) modalidades que están dirigidas a un valor o parámetro per se. Por ejemplo, la descripción que se refiere a "aproximadamente X" incluye la descripción de "X" . Las escalas numéricas son inclusivas de los números que definen la escala. Se entiende que los aspectos y modalidades de la invención descritos en la presente incluyen los aspectos y modalidades "que comprende" , "que consiste" y "que consiste esencialmente en" .
Aunque ciertas modalidades representativas y detalles han sido ilustrados con el propósito de ilustrar la presente invención, será aparente para aquellos expertos en esta técnica que se pueden hacer a la misma varios cambios y modificaciones sin alejarse del alcance de la presente invención. Debe entenderse que esta invención no está limitada a la metodología, protocolos y reactivos particulares descritos, toda vez que éstos pueden variar. Alguien de capacidad en la técnica apreciará también que muchos métodos y materiales similares o equivalentes a aquellos descritos en la presente también se pueden usar para llevar a la práctica o probar la invención.
Apéndice 1 Ácidos nucleicos y polipéptidos de l-desoxi-D-xilulosa-5- fosfato sintasa ejemplares ATH: AT3G21500(DXPS1) AT4G15560(CLA1) AT5G11380(DXPS3) OSA: 4338768 43400904342 14 CME: CMF089C PFA: MAL13P1.186 TAN: TA20470 TPV: TP01_0516 ECO: b0420(dxs) ECJ: JW0410(dxs) ECE: Z0523(dxs) ECS: ECs0474 ECC: c0531(dxs) ECI: UTI89_C0443(dxs) ECP: ECP_0479 ECV: APECOl_1590(dxs) ECW: EcE24377A_0451(dxs) ECX: EcHS_A0491 STY: STY0461(dxs) STT: t2441(dxs) SPT: SPA2301(dxs) SEC: SC0463(dxs) STM: STM0422(dxs) YPE: YP03177(dxs) YPK: yl008(dxs) YPM: YP_0754(dxs) YPA: YPA_2671 YPN: YPN_0911 YPP: YPDSF 2812 YPS: YPTB0939(dxs) YPI: YpsIP31758_3112(dxs) SFL: SF0357(dxs) SFX: S0365(dxs) SFV: SFV_0385(dxs) SSN: SSON_0397(dxs) SBO: SBO_0314(dxs) SDY: SDY_0310(dxs) ECA: ECA1131(dxs) PLU: plu3887(dxs) BUC: BU464(dxs) BAS: BUsg448(dxs) WBR: WGLpl44(dxs) SGL: SG0656 KPN: KPN_00372(dxs) BFL: Bfl238(dxs) BPN: BPEN_244(dxs) HIN: HI1439(dxs) HIT: NTHI1691(dxs) HIP: CGSHiEE_04795 fflQ: CGSHiGG_01080 HDU: HD0441(dxs) HSO: HS_0905(dxs) PMU: PM0532(dxs) MSU: MS1059(dxs) APL: APL_0207(dxs) XFA: XF2249 XFT: PD1293(dxs) XCC: XCC2434(dxs) XCB: XC .1678 XCV: XCV2764(dxs) XAC: XAC2565(dxs) XOO: XOO2017(dxs) XOM: XOO_1900(XOO1900) VCH: VC0889 VVU: VV1_0315 VVY: VV0868 VPA: VP0686 VFI: VF0711 PPR: PBPRAO805 PAE: PA4044(dxs) PAU: PA14_11550(dxs) PAP: PSPA7_1057(dxs) PPU: PP_0527(dxs) PST: PSPTO_0698(dxs) PSB: Psyr_0604 PSP: PSPPH_0599(dxs) PFL: PFL_5510(dxs) PFO: Pfl_5007 PEN: PSEEN0600(dxs) PMY: Pmen_3844 PAR: Psyc_0221(dxs) PCR: Pcryo_0245 ACI: ACIAD3247(dxs) SON: SO_1525(dxs) SDN: Sden_2571 SFR: Sfri_2790 SAZ: Sama_2436 SBL: Sbal 1357 SLO: Shew_2771 SHE: Shewmr4_2731 SH : Shewmr7_2804 SHN: Shewana3_2901 SHW: Sputw3181_2831 ?.?: IL2138(dxs) CPS: CPS_1088(dxs) PHA: PSHAa2366(dxs) PAT: Patl_1319 SDE: Sde_338l PIN: Ping_2240 MAQ: Maqu_2438 MCA: MCA0817(dxs) FTU: FTT1018c(dxs) FTF: FTF1018c(dxs) FTW: FTW_0925(dxs) FTL: FTL_1072 FTH: FTH_1047(dxs) FTA: FTA_1131(dxs) FTN: FTN_0896(dxs) NOC: Noc_1743 AEH: M1&.1381 HCH: HCH_05866(dxs) CSA: Csal_0099 ABO: ABO_2l66(dxs) AHA: AHA_3321(dxs) BCI: BCI_0275(dxs) RMA: Rmag_0386 VOK: COSY_0360(dxs) NME: NMB1867 MA: NMA0589(dxs) NMC: NMC0352(dxs) NGO: NGO0036 CVI: CV_2692(dxs) RSO: RSc2221(dxs) REU: Reut_A0882 REH: H16_A2732(dxs) RME: Rmet_2615 BMA: BMAA0330(dxs) BMV: BMASAVPl_1512(dxs) BML: BMA10299_1706(dxs) BMN: BMA10247_A0364(dxs) BXE: Bxe_B2827 BUR: Bcepl8194_B2211 BCN: Bcen_4486 BCH: Bcen2424_3879 BAM: Bamb_3250 BPS: BPSS1762(dxs) BPM: BURPS1710b_A0842(dxs) BPL: BURPS1106A_A2392(dxs) BPD: BURPS668_A2534(dxs) BTE: BTH_ü0614(dxs) BPE: BP2798(dxs) BPA: BPP2464(dxs) BBR: BB1912(dxs) RFR: Rfer_2875 POL: Bpro_1747 PNA: Pnap_1501 AJS: Ajs_1038 MPT: Mpe_A2631 ?, ^ HAR: HEAR0279(dxs) MMS: mma_0331 NEU: NE1161(dxs) NET: Neut_1501 NMU: Nmul_A0236 EBA: ebA4439(dxs) AZO: azol l98(dxs) DAR: Daro_3061 TBD: Tbd_0879 MFA: Mfla_2133 HPY: HP0354(dxs) HPJ: jhp0328(dxs) HPA: HPAG1_0349 HHE: HH0608(dxs) HAC: Hac_0968(dxs) WSU: WS1996 TDN: Tmden_0475 CJE: Cj0321(dxs) CJR: CJE0366(dxs) CJJ: CJJ81176_0343(dxs) CJU: C8J_0298(dxs) CJD: JJD26997_1642(dxs) CFF: CFF8240_0264(dxs) CCV: CCV52592_1671(dxs) CCV52592_1722 CHA: CHAB381_1297(dxs) CCO: CCC13826_1594(dxs) ABU: Abu_2139(dxs) NIS: NIS_0391(dxs) SUN: SUN_2055(dxs) GSU. GSU0686(dxs-l) GSU1764(dxs-2) GME: Gmet_1934 Gmet_2822 PCA: Pcar_1667 PPD: Ppro_1191 Ppro_2403 DVU: DVU1350(dxs) DVL: Dvul_1718 DDE: Dde_2200 LIP: LI0408(dsx) DPS: DP2700 ADE: Adeh_1097 MXA: MXAN_4643(dxs) SAT: SYN_02456 SFU: Sfum_1418 PUB: SARll_0611(dxs) MLO: mlr7474 MES: Meso_0735 SME: SMc00972(dxs) ATU: Atu0745(dxs) ATC: AGR_C_1351 RET: RHE_CH00913(dxs) RLE: RL0973(dxs) BME: BMEI1498 BMF: BABl_0462(dxs) BMS: BR0436(dxs) BMB: BruAbl_0458(dxs) BOV: BOV_0443(dxs) BJA: bll2651(dxs) BRA: BRAD02161(dxs) BBT: BBta_2479(dxs) RPA: RPA0952(dxs) RPB: RPB 4460 RPC: RPC_1149 RPD: RPD_4305 RPE: RPE_1067 NWI: Nwi_0633 NHA: Nham_0778 BHE: BH04350(dxs) BQU: BQ03540(dxs) BBK: BARBAKC583_0400(dxs) CCR: CC_2068 SIL: SPO0247(dxs) SIT: TM1040_2920 RSP: RSP_0254(dxsA) RSP_1134(dxs) JAN: Jann_0088 Jann_0170 RDE: RDl_0101(dxs) RDl_0548(dxs) MMR: MmarlO_0849 HNE: HNE_1838(dxs) ZMO: ZM01234(dxs) ZM01598(dxs) NAR: Saro_0161 SAL: Sala_2354 ELI: ELI_12520 GOX: GOX0252 GBE: GbCGDNIHl_0221 GbCGDNIHl_2404 RRU: Rru_A0054 Rru_A2619 MAG: amb2904 MGM: Mmcl_1048 SUS: Acid_1783 BSU: BG11715(dxs) BHA: BH2779 BAN: BA4400(dxs) BAR: GBAA4400(dxs) BAA: BA_4853 BAT: BAS4081 BCE: BC4176(dxs) BCA: BCE_4249(dxs) BCZ: BCZK3930(dxs) BTK: BT9727_3919(dxs) BTL: BALH_3785(dxs) BLI: BL01523(dxs) BLD: BLi02598(dxs) BCL: ABC2462(dxs) BAY: RBAM_022600 BPU: BPUM .2159 GKA: GK2392 GTN: GTNG_2322 LMO: lmol365(tktB) L F: LMOf2365_1382(dxs) LIN: Hnl402(tktB) LWE: lwel380(tktB) LLA: L108911(dxsA) L123365(dxsB) LLC: LACR_1572 LACR_1843 LLM: llmg_0749(dxsB) SAK: SAK_0263 LPL: lp_2610(dxs) O: U0406 LAC: LBA0356 LSL: LSL_0209(dxs) LGA: LGAS_0350 STH: STH1842 CAC: CAC2077 CA_P0106(dxs) CPE: CPE1819 CPF: CPF_2073(dxs) CPR: CPR_1787(dxs) CTC: CTC01575 CNO: NT01CX_1983 CTH: Cthe_0828 CDF: CDl207(dxs) CBO: CB01881(dxs) CBA: CLB_1818(dxs) CBH: CLC_1825(dxs) CBF: CLI_1945(dxs) CKL: CKL_1231(dxs) CHY: CHY_1985(dxs) DSY: DSY2348 DRM: Dred_1078 PTH: PTH_1196(dxs) SWO: Swol_0582 CSC: Csac_1853 TTE: TTE1298(dxs) MTA: Moth_1511 MPE: MYPE730 MGA: MGA_1268(dxs) MTU: Rv2682c(dxsl) Rv3379c(dxs2) MTC: MT2756(dxs) MBO: Mb2701c(dxsl) Mb3413c(dxs2) MLE: ML1038(dxs) MPA: MAP2803c(dxs) MAV: MAV_3577(dxs) MSM: MSMEG_2776(dxs) MMC: Mmcs_2208 CGL: NCgU827(cgU902) CGB: cg2083(dxs) CEF: CE1796 CDI: DIP1397(dxs) CJ : jkl078(dxs) NFA: nfa37410(dxs) RHA: RHAl_ro06843 SCO: SCO6013(SClC3.01) SC06768(SC6A5.17) SMA: SAV1646(dxsl) SAV2244(dxs2) TWH: TWT484 TWS: TW280(Dxs) LXX: Lxxl0450(dxs) CMI: CMM_1660(dxsA) AAU: AAur_1790(dxs) PAC: PPA1062 TFU: Tfu_1917 FRA: Francci3_1326 FAL: FRAAL2088(dxs) ACE: Acel_1393 SEN: SACE_1815(dxs) SACE_4351 BLO: BL1132(dxs) BAD: BAD_0513(dxs) FNU: FN1208 FN1464 RBA: RB2143(dxs) CTR: CT331(dxs) CTA: CTA_0359(dxs) C U: TC0608 CPN: CPnl060(tktB_2) CPA: CP0790 CPJ: CPjl060(tktB_2) CPT: CpB1102 CCA: CCA00304(dxs) CAB: CAB301(dxs) CFE: CF0699(dxs) PCU: pc0619(dxs) TPA: TP0824 TDE: TDE1910(dxs) LIL: LA3285(dxs) LIC: LIC10863(dxs) LBJ: LBJ_0917(dxs) LBL: LBL_0932(dxs) SYN: slll945(dxs) SYW: SYN 1292(Dxs) SYC: sycl087_c(dxs) SYF: Synpcc7942_0430 SYD: Syncc9605_1430 SYE: Syncc9902_1069 SYG: sync_1410(dxs) SYR: SynRCC307_1390(dxs) SYX: SynWH7803_1223(dxs) CYA: CYA_1701(dxs) CYB: CYB_1983(dxs) TEL: U10623 GVI: gll0194 ANA: ali0599 AVA: Ava_4532 PMA: Pro0928(dxs) PMM: PMM0907(Dxs) PMT: PMT0685(dxs) PMN: PMN2A_0300 PMI: PMT9312 0893 PMB: A9601_09541(dxs) PMC: P9515_09901(dxs) PMF: P9303_15371(dxs) PMG: P9301_09521(dxs) PMH: P9215_09851 PMJ: P9211_08521 PME: NATLl_09721(dxs) TER: Tery_3042 BTH: BT_1403 BT_4099 BFR: BF0873 BF4306 BFS: BF0796(dxs) BF4114 PGI: PG2217(dxs) CHU: CHU_3643(dxs) GFO: GFO_3470(dxs) FPS: FP0279(dxs) CTE: CT0337(dxs) CPH: Cpha266_0671 PVI: Cvib_0498 PLT: Plut_0450 DET: DET0745(dxs) DEH: cbdb_A720(dxs) DRA: DR_1475 DGE: Dgeo_0994 TTH: TTC1614 TTJ: TTHA0006 AAE: aq_881 TMA: TM1770 PMO: Pmob_1001 Ácidos nucleicos y polipéptidos de acetil -CoA- acetiltransf erasa ej emplares HSA: 38(ACAT1) 39(ACAT2) PTR: 451528(ACAT1) MCC: 707653(ACAT1) 708750(ACAT2) MMU: 110446(Acatl) 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Franeanl_2711 Franeanl_2726 Franeanl_3929 Franeanl_4037 Franeanl_4577 FAL: FRAAL2514 FRAAL2618 FRAAL5910(atoB) ACE: Acel_0626 Acel_0672 SEN: SACE_1192(mmgA) SACE_2736(fadA6) SACE_4011(catF) SACE_6236(fadA4) STP: Strop_3610 SAQ: Sare_1316 Sare_3991 RXY: Rxyl_1582 Rxyl_1842 Rxyl_2389 Rxyl_2530 FNU: FN0495 BGA: BGOllO(fadA) BAF: BAPKO_0110(fadA) LIL: LA0457(thiLl) LA0828(thiL2) LA4139(fadA) LIC: LIC10396(phbA) LBJ: LBJ_2862(paaJ-4) LBL: LBL_0209(paaJ-4) SYN: slrl993(phaA) SRU: SRU_1211(atoB) SRU_1547 CHU: CHU_1910(atoB) GFO: GFO_1507(atoB) FJO: Fjoh_4612 FPS: FP0770 FP1586 FP1725 RRS: RoseRS_3911 RoseRS_4348 RCA: Rcas_0702 Rcas_3206 HAU: Haur_0522 DRA: DR_1072 DR_1428 DR_1960 DR_2480 DR_A0053 DGE: Dgeo_0755 Dgeo_1305 Dgeo_1441 Dgeo_1883 TTH: TTC0191 TTC0330 TTJ: TTHA0559 TME: Tmel_1134 FNO: Fnod_0314 PMO: Pmob_0515 HMA: rrnAC0896(acaB3) rrnAC2815(aca2) rrnAC3497(yqeF) rmB0240(acal) rmB0242(acaB2) rrnB0309(acaBl) TAC:.Ta0582 TVO: TVN0649 PTO: PTO1505 APE: APE_2108 SSO: SS02377(acaB-4) STO: ST0514 SAI: Saci_0963 Saci_1361(acaBl) MSE: Msed_0656 PAI: PAE1220 PIS: Pisl_0029 Pisl_1301 PCL: Pcal_0781 PAS: Pars_0309 Pars_1071 CMA: Cmaq_1941 Ácidos nucleicos y polipéptidos de HMG-CoA sintasa ejemplares HSA: 3157(HMGCS1) 3158(HMGCS2) PTR: 457169(HMGCS2) 461892(HMGCS1) MCC: 702553(HMGCS1) 713541(HMGCS2) MMU: 15360(Hmgcs2) 208715(Hmgcsl) RNO: 24450(Hmgcs2) 29637(Hmgcsl) CFA: 479344(HMGCS1) 607923 (HMGCS2) BTA: 407767(HMGCS1) SSC: 397673(CH242-38B5.1) GGA: 396379(HMGCS1) XLA: 380091(hmgcsl) 447204(MGC80816) DRE: 394060(hmgcsl) SPU: 578259(LOC578259) DME: Dmel_CG4311(Hmgs) CEL: F25B4.6 ATH: AT4G11820(BAP1) OSA: 4331418 4347614 CME: CMM189C SCE: YML126C(ERG13) AGO: AGOS_ADL356C PIC: PICST_83020 CAL: Ca019_7312(Ca019.7312) CGR: CAGL0H04081g SPO: SPAC4F8.14c(hcs) MGR: MGG_01026 ANI: AN4923.2 AFM: AFUA_3G10660 AFUA_8G07210 AOR: AO090003000611 AO090010000487 CNE: CNC05080 CNG02670 UMA: UM05362.1 ECU: ECU10_0510 DDI: DDBDRAFT_0217522 DDB_0219924(hgsA) TET: TTHERM_00691190 TBR: Tb927.8.6110 5 YPE: YP01457 YPK: y2712(pksG) YPM: YP_1349(pksG) YPA: YPA_0750 YPN: YPN_2521 YPP: YPDSF_1517 ? 0 YPS: YPTB1475 CBD: COXBU7E912_1931 TCX: Tcr_1719 DNO: DNO.0799 BMA: BMAA1212 BPS: BPSS1002 15 BPM: BURPS1710b_A2613 BPL: BURPS 1106A_A 1384 BPD: BURPS668_A1470 BTE: ???_?1670 MXA: MXAN_3948(tac) MXAN_4267(mvaS) BSU: BG10926(pksG) 20 OIH: OB2248 SAU: SA2334(mvaS) SAV: SAV2546(mvaS) SAM: MW2467(mvaS) SAR: SAR2626(mvaS) SAS: SAS2432 9? SAC: SACOL2561 SAB: SAB2420(mvaS) SAA: SAUSA300_2484 SAO: SAOUHSC_02860 SAJ: SaurJH9_2569 SAH: SaurJHl_2622 SEP: SE2110 SER: SERP2122 SHA: SH0508(mvaS) SSP: SSP0324 LMO: lmol415 LMF: LMOf2365_1434(mvaS) LIN: linl454 LWE: lwel432(mvaS) LLA: L13187(hmcM) LLC: LACR.1666 LLM: llmg_0929(hmcM) SPY: SPy_0881(mvaS.2) SPZ: M5005_Spy_0687(mvaS.l) SPM: spyM18_0942(mvaS2) SPG: SpyM3_0600(mvaS.2) SPS: SPsl253 SPH: MGAS10270_Spy0745(mvaSl) SPI: MGAS10750_Spy0779(mvaSl) SPJ: MGAS2096_SpyO759(mvaSl) SPK: MGAS9429_Spy0743(mvaSl) SPF: SpyM51121(mvaS) SPA: M6_Spy0704 SPB: M28_Spy0667(mvaS.l) SPN: SP_1727 SPR: sprl571(mvaS) SPD: SPD_1537(mvaS) SAG: SAG1316 SAN: gbsl386 SAK: SAK_1347 STC: str0577(mvaS) STL: stu0577(mvaS) STE: STER_0621 SSA: SSA_0338(mvaS) SSU: SSU05_1641 SSV: SSU98_1652 SGO: SGO_0244 LPL: lp_2067(mvaS) UO: LJ1607 LAC: LBA0628(hmcS) LSA: LSA1484(mvaS) LSL: LSL_0526 LDB: Ldb0881(mvaS) LBU: LBUL_0806 LBR: LVIS_1363 LCA: LSEI_1785 LGA: LGAS_1372 LRE: Lreu_0676 PPE: PEPE_0868 EFA: EF1363 OOE. OEOE_0968 LME: LEUM_U84 NFA: nfa22120 SEN: SACE_4570(pksG) BBU: BB0683 BGA: BG0706 BAF: BAPKO_0727 FJO: Fjoh_0678 HAL: VNG1615G(mvaB) HMA: rrnAC1740(mvaS) HWA: HQ2868A(mvaB) NPH: NP2608A(mvaB_l) NP4836A(mvaB_2) Ácidos nucleicos y polipéptidos de hidroximetilglutaril-CoA reductasa ejemplares HSA: 3156(HMGCR) PTR: 471516(HMGCR) MCC: 705479(HMGCR) MMU: 15357(Hmgcr) RNO: 25675(Hmgcr) CFA: 479182(HMGCR) BTA: 407159(HMGCR) GGA: 395145(RCJMB04_14m24) SPU: 373355(LOC373355) DME: Dmel_CG10367(Hmgcr) CEL: F08F8.2 OSA: 4347443 SCE: YLR450W(HMG2) YML075C(HMG1) AGO: AGOS_AER152W CGR: CAGL0L11506g SPO: SPCC162.09c(hmgl) ANI: AN3817.2 AFM: AFUA_1G11230 AFUA_2G03700 AOR: AO090103000311 AO090120000217 C E: CNF04830 UMA: UM03014.1 ECU: ECU10_1720 DDI: DDB_0191125(hmgA) DDB_0215357(hmgB) TBR: Tb927.6.4540 TCR: 506831.40 509167.20 LMA: LmjF30.3190 VCH: VCA0723 VCO: VC0395_0662 VVU: VV2_0117 VVY: VVA0625 VPA: VPA0968 VFI: VFA0841 PAT: Patl_0427 5 CBU: CBU_0030 CBU_0610 CBD: COXBU7E912_0151 COXBU7E912_0622(hmgA) TCX: Tcr_1717 DNO: DNO_0797 CVI: CV_1806 SUS: Acid_5728 Acid_6132 10 SAU: SA2333(mvaA) SAV: SAV2545(mvaA) SAM: MW2466(mvaA) SAB: SAB2419c(mvaA) SEP: SE2109 LWE: lwe0819(mvaA) 15 LLA: L10433(mvaA) LLC: LACR_1664 LLM: Hmg_0931(mvaA) SPY: SPy_0880(mvaS.l) SPM: spyM18_0941(mvaSl) SPG: SpyM3_0599(mvaS.l) 20 SPS: SPsl254 SPH: MGAS10270_Spy0744 SPI: MGAS10750_Spy0778 SPJ: MGAS2096_Spy0758 SPK: MGAS9429_Spy0742 SPA: M6_Spy0703 SPN: SP— 1726 SAG: SAG1317 SAN: gbsl387 STC: str0576(mvaA) STL: stu0576(mvaA) STE: STER_0620 SSA: SSA_0337(mvaA) LPL: lp_0447(mvaA) UO: LJ1608 LSL: LSL_0224 LBR: LVIS_0450 LGA: LGAS_1373 EFA: EF1364 NFA: nfa22110 BGA: BGO708(mvaA) SRU: SRU .2422 FPS: FP2341 MMP: MMP0087(hmgA) MMQ: MmarC5_1589 MAC: MA3073(hmgA) MBA: Mbar_A1972 M A: MM_0335 MBU: Mbur_1098 MHU: Mhun_3004 MEM: Memar_2365 MBN: Mboo_0137 MTH: MTH562 MST: Msp_0584(hmgA) MSI: Msm_0227 MKA: MK0355(HMG1) AFU: AF1736(mvaA) HAL: VNG1875G(mvaA) HMA: rmAC3412(mvaA) HWA: HQ3215A(hmgR) NPH: NP0368A(mvaA_2) NP2422A(mvaA_l) TAC: Ta0406m TVO: TVN1168 PTO: PT01143 PAB: PAB2106(mvaA PFU: PF1848 TKO: TK0914 RCI: RCIX1027(hmgA) RCIX376(hmgA) APE: APE_1869 IHO: Igni_0476 HBU. Hbut_1531 SSO: SSO0531 STO: ST1352 SAI: Saci_1359 PAI: PAE2182 PIS: Pisl_0814 PCL: Pcal_1085 PAS: Pars 0796 Ácidos nucleicos y polipéptidos de mevalonato cinasa ejemplares HSA: 4598(MVK) MCC: 707645(MVK) MMU: 17855(Mvk) RNO: 81727(Mvk) CFA: 486309(MVK) BTA: 505792(MVK) GGA: 768555(MVK) DRE: 492477(zgc: 103473) SPU: 585785(LOC585785) DME: Dmel_CG33671 OSA: 4348331 SCE: YMR208W(ERG12) AGO: AGOS_AER335W PIC: PICST_40742(ERG12) CGR: CAGL0F03861g SPO: SPAC13G6.1 1C MGR: MGG_06946 ANI: AN3869.2 AFM: AFUA_4G07780 AOR: AO090023000793 CNE: CNK01740 ECU: ECU09_1780 DDI: DDBDRAFT_0168621 TET: TTHERM_00637680 TBR: Tb927.4.4070 TCR: 436521.9 509237.10 LMA: LmjF31.0560 CBU: CBU_0608 CBU_0609 CBD: COXBU7E912_0620(mvk) LPN: 1pg2039 LPF: lpl2017 LPP: lpp2022 BBA: Bdl027(lmbP) Bdl630(mvk) MXA: MXAN_5019(mvk) OIH: OB0225 SAU: SA0547(mvaKl) SAV: SAV0590(mvaKl) SAM: MW0545(mvaKl) SAR: SAR0596(mvaKl) SAS: SAS0549 SAC: SACOL0636(mvk) SAB: SAB0540(mvaKl) SAA: SAUSA300_0572(mvk) SAO: SAOUHSC_00577 SEP: SE0361 SER: SERP0238(mvk) SHA: SH2402(mvaKl) SSP: SSP2122 LMO: lmoOOlO LMF: LMOf2365_0011 LIN: HnOOlO LWE: lweOOl l(mvk) LLA: L7866(yeaG) LLC: LACR_0454 LLM: llm&_0425(mvk) SPY: SPy_0876(mvaKl) SPZ: M5005_Spy_0682(mvaKl) SPM: spyM18_0937(mvaKl) SPG: SpyM3_0595(mvaKl) SPS: SPsl258 SPH: MGAS10270_Spy0740(mvaKl) SPI: MGAS 10750_Spy0774(m vaK 1 ) SPJ: MGAS2096_Spy0753(mvaKl) SPK: MGAS9429_Spy0737(mvaKl) SPF: SpyM51126(mvaKl) SPA: M6_Spy0699 SPB: M28_Spy0662(mvaKl) SPN: SP_0381 SPR: spr0338(mvk) SPD: SPD_0346(mvk) SAG: SAG1326 SAN: gbsl396 SAK: SAK_1357(mvk) SMU: SMU.181 STC: sti0559(mvaKl) STL: stu0559(mvaKl) STE: STER_0598 SSA: SSA_0333(mvaKl) SSU: SSU05_0289 SSV: SSU98_0285 SGO: SGO_0239(mvk) LPL: lp_1735(mvaKl) UO: LJ1205 LAC: LBA1167(mva ) LSA: LSA0908(mvaKl) LSL: LSL_0685(eRG) LDB: Ldb0999(mvk) LBU: LBUL_0906 LBR: LVIS_0858 LCA: LSEI_1491 LGA: LGAS_1033 LRE: Lreu_0915 PPE: PEPE_0927 EFA: EF0904(mvk) OOE: OEOE_1100 LME: LEUM_1385 NFA: nfa22070 BGA: BG0711 BAF: BAPKO_0732 FPS: FP0313 MMP: MMP1335 MAE: Maeo_0775 MAC: MA0602(mvk) MBA: Mbar_A1421 MMA: MM_1762 MBU: Mbur_2395 MHU: Mhun_2890 MEM: emar_1812 MBN: Mboo_2213 MST: Msp_0858(mvk) MSI: Msm_1439 MKA: MK0993(ERG12) HAL: VNG1145G(mvk) HMA: rrnAC0077(mvk) HWA: HQ2925A(mvk) NPH: NP2850A(mvk) PTO: PT01352 PHO: PH1625 PAB: PAB0372(mvk) PFU: PF1637(mvk) TKO: TK1474 RCI: LRC399(mvk) APE: APE_2439 HBU: Hbut_0877 SSO: SSO0383 STO: ST2185 SAI: Saci_2365(mvk) MSE: Msed_1602 PAI: PAE3108 PIS: Pisl_0467 PCL: Peal 1835 Ácidos nucleicos y polipéptidos de fosfomevalonato cinasa ejemplares HSA: 10654(PMVK) PTR: 457350(PMVK) MCC: 717014(PMVK) MMU: 68603(Pmvk) CFA: 612251(PMVK) BTA: 513533(PMV ) DME: Dmel_CG10268 ATH: AT1G31910 OSA: 4332275 SCE: YMR220W(ERG8) AGO: AGOS_AER354W PIC: PICST_52257(ERG8) CGR: CAGL0F03993g SPO: SPAC343.01C MGR: MGG_05812 ANL AN2311.2 AFM: AFUA_5G 10680 AOR: AO090010000471 CNE: CNM00100 UMA: UM00760.1 DDI: DDBDRAFT_0184512 TBR: Tb09.160.3690 TCR: 507913.20 508277.140 LMA: LmjF15.1460 MXA: MXAN_5017 OIH: OB0227 SAU: SA0549(mvaK2) SAV: SAV0592(mvaK2) SAM: MW0547(mvaK2) ..
SAR: SAR0598(mvaK2) SAS: SAS0551 SAC: SACOL0638 SAB: SAB0542(mvaK2) SAA: SAUSA300_0574 SAO: SAOUHSC_00579 SAJ: SaurJH9_0615 SEP: SE0363 SER: SERP0240 SHA: SH2400(mvaK2) SSP: SSP2120 LMO: lmo0012 LMF: LMOf2365_0013 LEN: lin0012 LWE: lwe0013 LLA: L10014(yebA) LLC: LACR_0456 LLM: llmg_0427 SPY: SPy_0878(mvaK2) SPZ: M5005_Spy_0684(mvaK2) SPM: spyM18_0939 SPG: SpyM3_0597(mvaK2) SPS: SPsl256 SPH: MGAS10270_Spy0742(mvaK2) SPI: MGAS10750_Spy0776(mvaK2) SPJ: MGAS2096_Spy0755(mvaK2) SPK: MGAS9429_Spy0739(mvaK2) SPF: SpyM51124(mvaK2) SPA: M6_Spy0701 SPB: M28_Spy0664(mvaK2) SPN: SP_0383 SPR: sprí)340(mvaK2) SPD: SPD_0348(mvaK2) SAG: SAG1324 SAN: gbsl394 SAK: SAK_1355 SMU: SMU.938 STL: stu0561(mvaK2) STE: STER_0600 SSA: SSA_0335(mvaK2) SSU: SSU05_0291 SSV: SSU98_0287 SGO: SGO_0241 LPL: lp_1733(mvaK2) UO: LJ1207 LAC: LBA1169 LSA: LSA0906(mvaK2) LSL: LSL_0683 LDB: Ldb0997(mvaK) LBU: LBUL_0904 LBR: LVIS_0860 LCA: LSEI_1092 LGA: LGAS_1035 LRE: Lreu_0913 PPE: PEPE_0925 EFA: EF0902 NFA: nfa22090 BGA: BG0710 BAF: BAPKO_0731 NPH: NP2852A SSO: SS02988 STO: ST0978 SAI: Saci 1244 Ácidos nucleicos y polipeptidos de difosfomevalonato descarboxilasa ejemplares HSA: 4597(MVD) PTR: 468069(MVD) MCC: 696865(MVD) MMU: 192156(Mvd) RNO: 81726(Mvd) CFA: 489663(MVD) GGA: 425359(MVD) DME: Dmel_CG8239 SCE: YNR043W(MVD1) AGO: AGOS_AGL232C PIC: PICST_90752 CGR: CAGL0C03630g SPO: SPAC24C9.03 MGR: MGG_09750 A NI: AN4414.2 AFM. AFUA_4G07130 AOR: AO090023000862 CNE: C L04950 UMA: UM05179.1 DDI: DDBDRAFT_0218058 TET: TTHERM_00849200 TBR: TblO.05.0010 TblO.61.2745 TCR: 507993.330 511281.40 LMA: LmjF18.0020 CBU: CBU_0607(mvaD) CBD: COXBU7E912_0619(mvaD) LPN: lpg2040 LPF: Ipl2018 LPP: 1??2023 TCX: Tcr_1734 DNO: DNO_0504(mvaD) BBA: Bdl629 MXA: MXAN_5018(mvaD) OIH: OB0226 SAU: SA0548(mvaD) SAV: SAV0591(mvaD) SAM: MW0546(mvaD) SAR: SAR0597(mvaD) SAS: SAS0550 SAC: SACOL0637(mvaD) SAB: SAB0541(mvaD) SAA: SAUSA3OO_0573(mvaD) SAO: SAOUHSC_00578 SAJ: SaurJH9_0614 SAH: SaurJHl_0629 SEP: SE0362 SER: SERP0239(mvaD) SHA: SH2401(mvaD) SSP: SSP2121 LMO: lmoOOl l LMF: LMOf2365_0012(mvaD) LIN: linOOl l LWE: lwe0012(mvaD) LLA: L9089(yeaH) LLC: LACR_0455 LLM: llmg_0426(mvaD) SPY: SPy_0877(mvaD) SPZ. M5005_Spy_0683(mvaD) SPM: spy 18_0938(mvd) SPG: SpyM3_0596(mvaD) SPS: SPsl257 SPH: MGAS10270_Spy0741(mvaD) SPI: MGAS10750_SpyO775(mvaD) SPJ: MGAS2096_Spy0754(mvaD) SPK: MGAS9429_Spy0738(mvaD) SPF: SpyM51125(mvaD) SPA: M6_SpyO700 SPB: M28_Spy0663(mvaD) SPN: SP_0382 SPD: SPD_0347(mvaD) SAG: SAG1325(mvaD) SAN: gbsl395 SAK: SAK_1356(mvaD) SMU: SMU.937 STC: strO560(mvaD) STL: stu0560(mvaD) STE: STER_0599 SSA: SSA_0334(mvaD) SSU: SSU05_0290 SSV: SSU98_0286 SGO: SGO_0240(mvaD) LPL: lp_1734(mvaD) UO: LJ1206 LAC: LBA1168(mvaD) LSA: LSA0907(mvaD) LSL: LSL_0684 LDB: Ldb0998(mvaD) LBU: LBUL 0905 LBR: LVIS_0859 LCA: LSEI_1492 LGA: LGAS_1034 LRE: Lreu_0914 PPE: PEPE_0926 EFA: EF0903(mvaD) LME: LEUM_1386 NFA: nfa22080 BBU: BB0686 BGA: BG0709 BAF: BAPKO_0730 GFO: GFO_3632 FPS: FP0310(mvaD) HAU: Haur_1612 HAL: VNG0593G(dmd) HMA: rmAC1489(dmd) HWA: HQ1525A(mvaD) NPH: NP1580A(mvaD) PTO: PTO0478 PT01356 SSO: SS02989 STO: ST0977 SAI: Saci_1245(mvd) MSE: Msed_1576 Ácidos nucleicos y polipéptidos de isopentenil fosfato cinasas (IPK) ejemplares Methanobacterium thermoautotrophicum gi|2621082 Methanococcus jannaschii OSM 2661 gi|1590842 ; Methanocaldococcus jannaschii gi11590842 Methanothermobacter thermautotrophicus gi ¡2621082 Picrophilus torridus DSM9790 (IG-57) gi|48477569 Pyrococcus abyssi gi|14520758 Pyrococcus horikoshii OT3 gi|3258052 Archaeoglobus fulgidus DSM4304 gi |2648231 Ácidos nucleicos y polipéptidos de isopentenil-difosfato ««--¾«¦ Delta-isomerasa (IDI) ejemplares HSA: 3422(IDI1) 91734(IDI2) PTR: 450262(IDI2) 450263(IDI1) MCC: 710052(LOC710052) 721730(LOC721730) MMU: 319554(Idil) RNO: 89784(Idil) GGA: 420459(EDI1) XLA: 49467 l(LOC494671) XTR: 496783(idi2) SPU: 586184(LOC586184) CEL: 06H7.9(idi-l) ATH: AT3G02780(IPP2) OSA: 4338791 4343523 CME: CMB062C SCE: YPL117C(IDI1) AGO: AGOS_ADL268C PIC: PICST_68990(IDI1) CGR: CAGL0J06952g SPO: SPBC106.15(idil) ANI: AN0579.2 AFM: AFUA_6G11160 AOR: AO090023000500 CNE: CNA02550 UMA: UM04838.1 ECU: ECU02_0230 DDI: DDB_0191342(ipi) TET. TTHERM_00237280 TTHERM_00438860 TBR: Tb09.211.0700 TCR: 408799.19 510431.10 LMA: LmjF35.5330 EHI: 46.t00025 ECO: b2889(idi) ECJ: JW2857(idi) ECE: Z4227 ECS: ECs3761 ECC: C3467 ECI: UTI89_C3274 ECP: ECP_2882 ECV: APEC01_3638 ECW: EcE24377A_3215(idi) ECX: EcHS_A3048 STY: STY3195 STT: t2957 SPT: SPA2907(idi) SEC: SC2979(idi) STM: STM3039(idi) SFL: SF2875(idi) SFX: S3074 SFV: SFV.2937 SSN: SSON_3042 SSON_3489(yhfK) SBO: SBO_3103 SDY: SDY.3193 ECA: ECA2789 PLU: plu3987 ENT: Ent638_3307 SPE: Spro_2201 VPA: VPA0278 VFI: VF0403 PPR: PBPRA0469(mvaD) PEN: PSEEN4850 CBU: CBU_0607(mvaD) CBD: COXBU7E912_0619(mvaD) LPN: lpg2051 LPF: lpl2029 LPP: lpp2034 TCX: Tcr_1718 HHA: Hhal_1623 DNO: DNO_0798 EBA: ebA5678 p2A143 DVU: DVU1679(idi) DDE: Dde_1991 LIP: LI1134 BBA: Bdl626 AFW: Anael09_4082 MXA: MXAN_5021(fni) RPR: RP452 RTY: RT0439(idi) RCO: RC0744 RFE: RF_0785(fni) RBE: RBE_0731(fni) RAK: A1C_04190 RBO: A1I_04755 RCM: A1E_02555 RRI: A1G_04195 MLO: mlró371 RET: RHEJPD00245(ypd00046) XAU: Xaut_4134 SEL: SPO0131 SIT: TM1040_3442 RSP: RSP_0276 RSH: Rsphl7029_19l9 RSQ: Rsphl7025_1019 JAN: Jann_0168 RDE: RDl_0147(idi) DSH: Dshi_3527 BSU: BG11440(ypgA) BAN: BA1520 BAR: GBAA1520 BAA: BA_2041 BAT: BAS1409 BCE: BC1499 BCA: BCE_1626 BCZ: BCZK1380(fni) BCY: Bcer98_1222 BTK: BT9727_1381(fni) BTL: BALH_1354 BLI: BL02217(fni) BLD: BLÍ02426 BAY: RBAM_021020(fni) BPU: BPUM_2020(fni) OIH: OB0537 SAU: SA2136(fni) SAV: SAV2346(fni) SAM: MW2267(fni) SAR: SAR2431(fni) SAS: SAS2237 SAC: SACOL2341(fni) SAB: SAB2225c(fni) SAA: SAUSA300_2292(fni) SAO: SAOUHSC_02623 SEP: SE1925 SER: SERP1937(fni-2) SHA: SH0712(fni) SSP: SSP0556 LMO: lmol383 LMF: LMOf2365_1402(fni) LIN: Hnl420 LWE: lwel399(fni) LLA: L11083(yebB) LLC: LACR_0457 LLM: llmg_0428(fni) SPY: SPy_0879 SPZ: M5005_Spy_0685 SPM: spyM18_0940 SPG: SpyM3_0598 SPS: SPsl255 SPH: MGAS10270_Spy0743 SPI: MGAS10750_Spy0777 SPJ: MGAS2096_Spy0756 SPK: MGAS9429_Spy0740 SPF: SpyM51123(fni) SPA: M6_Spy0702 SPB: M28_Spy0665 SPN: SP_0384 SPR: sprt)341(fni) SPD: SPD_0349(fni) SAG: SAG1323 SAN: gbsl393 SAK: SAK_1354(fni) SMU: SMU.939 STC: str0562(idi) STL: stu0562(idi) STE: STER_0601 SSA: SSA_0336 SGO: SGO_0242 LPL: lp_1732(idil) UO: LT1208 LAC: LBA1171 LSA: LSA0905(idi) LSL: LSL_0682 LDB: Ldb0996(fni) LBU: LBUL_0903 LBR: LVIS_0861 LCA: LSEI.1493 LGA: LGAS_1036 LRE: Lreu_0912 EFA: EF0901 OOE: OEOE_1103 STH: STH1674 CBE: Cbei_3081 DRM: Dred_0474 SWO: Swol_1341 MTA: Moth_1328 MTU: Rvl745c(idi) MTC: MT1787(idi) MBO: Mbl774c(idi) MBB: BCG_1784c(idi) MPA: MAP3079C MAV: MAV_3894(fni) MSM: MSMEG_1057(fni) MSMEG_2337(fni) MUL: MUL_0380(idi2) MVA: Mvan_1582 Mvan_2176 MGI: Mflv_1842 Mflv_4187 MMC: Mmcs_1954 MKM: Mkms_2000 MJL: Mjls_1934 CGL: NCgl2223(cgl2305) CGB: cg2531(idi) CEF: CE2207 CDI: DIP1730(idi) NFA: nfal9790 nfa22100 RHA: RHAl_ro00239 SCO: SCO6750(SC5F2A.33c) SMA: SAV1663(idi) LXX: Lxx23810(idi) CMI: CMM_2889(idiA) AAU: AAur_0321(idi) PAC: PPA2115 FRA: Francci3_4188 FRE: Franeanl_5570 FAL: FRAAL6504(idi) KRA: Krad_3991 SEN: SACE_2627(idiB_2) SACE_5210(idi) STP: Strop_4438 SAQ: Sare_4564 Sare_4928 RXY: Rxyl_0400 BBU: BB0684 BGA: BG0707 SYN: S111556 SYC: syc216l_c SYF: Synpcc7942_1933 CYA: CYA_2395(fni) CYB: CYB_2691(fni) TEL: 1111403 ANA: all4591 AVA: Ava_2461 Ava_B0346 TER: Tery_1589 SRU: SRU_1900(idi) CHU: CHU_0674(idi) GFO: GFO_2363(idi) FJO: Fjoh_0269 FPS: FP1792(idi) CTE: CT0257 CCH: Cag_1445 CPH: Cpha266_0385 PVI: Cvib_1545 PLT: Plut_1764 RRS: RoseRS_2437 RCA: Rcas_2215 HAU: Haur_4687 DRA: DR_1087 DGE: Dgeo_1381 TTH: TT_P0067 TTJ: TTHB110 MJA: MJ0862 MMP: MMP0043 MMQ: MmarC5_1637 MMX: MmaiC6_0906 MMZ: MmaiC7_1040 MAE: Maeo_1184 MVN: Mevan_1058 MAC: MA0604(idi) MBA: Mbar_A1419 MMA: MM_1764 MBU: Mbur_2397 MTP: Mthe_0474 MHU: Mhun_2888 MLA: Mlab_1665 MEM: Memar_1814 MBN: Mboo_2211 MTH: MTH48 MST: Msp_0856(fni) MSI: Msm_1441 MKA: MK0776(lldD) AFU: AF2287 HAL: VNG1818G(idi) VNG6081G(crt_l) VNG6445G(crt_2) VNG7060 VNG7149 HMA: rrnAC3484(idi) HWA: HQ2772A(idiA) HQ2847A(idiB) NPH: NP0360A(idiB_l) NP4826A(idiA) NP5124A(idiB_2) TAC: Ta0102 TVO: TVN0179 PTO: PTO0496 PHO: PH1202 PAB: PAB1662 PFU: PF0856 TKO: TK1470 RCI: LRC397(fni) APE: APE_1765.1 SMR: Smar_0822 IHO: Igni_0804 HBU: Hbut_0539 SSO: SSO0063 STO: ST2059 SAI: Saci_0091 MSE: Msed_2136 PAI: PAE0801 PIS: Pisl_1093 PCL: Pcal_0017 PAS: Pars_0051 TPE: Tpen_0272 Ácidos nucleicos y polipéptidos de isopreno sintasa ej emplares Genbank Nos. de registro AY341431 AY316691 AY279379 AJ457070 AY182241 Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (15)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :
1. Un polímero de poliisopreno que comprende unidades de repetición que se derivan de isopreno, caracterizado porque: (A) tiene un valor 513C de más de -22¾> o el cual está dentro de la escala de -30&> a -28.5¾>; o (B) tiene un valor 513C que está dentro de la escala de -34¾> a -24¾>, y en donde el polímero de poliisopreno (i) está libre de proteína, o (ii) tiene un contenido de microestructura cis-1,4- de menos de aproximadamente 99.9% y un contenido de microestructura trans-1,4- de menos de 99.9%, o (iii) tiene un contenido de microestructura 3,4- de más de 2%, o (iv) tiene un contenido de microestructura 1,2- de más de 2%, o (v) tiene un peso molecular promedio en peso que está dentro de la escala de 5,000 a 100,000; o (C) tiene un valor 513C de más de -22¾> o el cual está dentro de la escala de -34ti a -24¾>, en donde el polímero de poliisopreno incluye al menos un bloque de unidades de repetición que se derivan de isopreno.
2. El polímero de poliisopreno de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque tiene un valor 613C que está dentro de la escala de -21& a -12&>.
3. El polímero de poliisopreno de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque tiene un valor 513C de más de -22¾> o el cual está dentro de la escala de -30¾> a -28.5t¾, en donde el polímero de poliisopreno es un homopolímero .
4. El polímero de poliisopreno de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque tiene un valor 513C que está dentro de la escala de -33¾> a -25¾>, y en donde el polímero de poliisopreno (i) está libre de proteína, o (ii) tiene un contenido de microestructura cis-1,4- de menos de aproximadamente 99.9% y un contenido de microestructura trans-1,4- de menos de 99.9%, o (iii) tiene un contenido de microestructura 3,4- de más de 2%, o (iv) tiene un contenido de microestructura 1,2- de más de 2%, o (v) tiene un peso molecular promedio en peso que está dentro de la escala de 5, 000 a 100, 000.
5. El polímero de poliisopreno de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque tiene un contenido de microestructura 1,2- de más de 5%, y en donde el polímero de poliisopreno tiene una polidispersión de menos de 2.0.
6. El polímero de poliisopreno de conformidad con la reivindicación 4, caracterizado porque tiene (i) un valor 513C que está dentro de la escala de -33¾> a -25¾Ó, y (ii) un peso molecular promedio en peso que está dentro de la escala de 30,000 a 50,000 y/o una polidispersión de menos de 1.8.
7. Un polímero que comprende unidades de repetición que se derivan de isopreno, caracterizado porque el isopreno se produce al (a) cultivar células que comprenden un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de isopreno sintasa bajo condiciones de cultivo adecuadas para la producción del isopreno, (b) producir el isopreno, y (c) recuperar el isopreno del cultivo.
8. El polímero de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque comprende unidades de repetición que se derivan de isopreno, en donde el isopreno se produce al (a) cultivar células que comprenden un ácido nucleico heterólogo que codifica para un polipéptido de isopreno sintasa bajo condiciones de cultivo adecuadas para la producción del isopreno, (b) producir el isopreno, y (c) recuperar el isopreno del cultivo.
9. El polímero de conformidad con la reivindicación 8, caracterizado porque el polipéptido de isopreno sintasa se deriva de un polipéptido de isopreno sintasa vegetal.
10. Un método para verificar que isopreno en un polímero de poliisopreno sea de una fuente no derivada de petróleo renovable y sostenible, caracterizado porque: (A) en el caso de un homopolímero de poliisopreno : (I) determinar el valor 613C del homopolímero de poliisopreno; (II) si el homopolímero de poliisopreno tiene un valor 513C dentro de la escala de -34&> a -30¾> o dentro de la escala de -28.5¾> a -24¾>, analizar adicionalmente el homopolímero de poliisopreno para determinar (1) su contenido de microestructura cis, (2) su contenido de microestructura 3,4-, (3) su contenido de microestructura 1,2-, (4) su peso molecular promedio en peso o (5) la presencia o ausencia de proteínas, jabones, lípidos, resinas y/o azúcares residuales que indican caucho natural; y (III) verificar que el homopolímero de poliisopreno sea de una fuente no derivada de petróleo renovable y sostenible si tiene (i) un valor 513C de más de -22&>, (ii) un valor 613C que está dentro de la escala de -30¾> a -28.5¾>, o (iii) un valor 613C dentro de la escala de -34¾> a -30¾> o dentro de la escala de -28.5%> a -24¾> y si (a) tiene un contenido de microestructura cis de menos de 100%, (b) contiene microestructura 3,4-, (c) contiene microestructura 1,2-, (d) tiene un peso molecular promedio en peso de menos de 100,000, o (e) está libre de proteínas, jabones, lípidos, resinas y/o azúcares residuales que indican caucho natural; y (B) en el caso de un copolímero que contenga isopreno: (I) determinar el valor 613C de al menos un bloque de poliisopreno en el copolímero; y (II) verificar que el isopreno en el copolímero sea de una fuente no derivada de petróleo renovable y sostenible si el bloque de poliisopreno tiene (i) un valor 513C de más de -22¾>, o (ii) un valor 513C que está dentro de la escala de -34&> a - 28.5fe .
11. El polímero de poliisopreno de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque tiene un valor 513C que está dentro de la escala de -29.5. a -28.5&.
12. El polímero de poliisopreno de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque tiene un valor 613C que está dentro de la escala de -30¾¡ a -29¾>.
13. El polímero de poliisopreno de conformidad con la reivindicación 1, caracterizado porque tiene un valor 513C de más de -22¾> o el cual está dentro de la escala de -34§Ó a -24&>, en donde el polímero de poliisopreno incluye al menos un bloque de unidades de repetición que se derivan de isopreno, y en donde el polímero de poliisopreno es un copolímero seleccionado del grupo que consiste en (i) un copolímero de isopreno y 1,3-butadieno, (ii) un copolímero de isopreno y estireno, (iii) un copolímero de isopreno, 1 , 3 -butadieno y estireno, y (iv) un copolímero de isopreno y oc-metil estireno.
14. El polímero de conformidad con la reivindicación 7, caracterizado porque se sintetiza al polimerizar el isopreno recuperado en la etapa (c) .
15. El método de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la verificación se hace al demostrar que el homopolímero de poliisopreno tenga un valor 613C que esté dentro de la escala de -34¾> a -30¾» y al demostrar que' el homopolímero de poliisopreno esté libre de proteínas, jabones, lípidos, resinas y/o azúcares residuales que indican caucho natural.
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Families Citing this family (46)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG191671A1 (en) 2007-12-13 2013-07-31 Danisco Us Inc Cultured cells that produce isoprene and methods for producing isoprene
AU2009240505B2 (en) 2008-04-23 2013-09-05 Danisco Us Inc. Isoprene synthase variants for improved microbial production of isoprene
AU2009269147B2 (en) * 2008-06-30 2013-08-22 Danisco Us Inc. Polymers of isoprene from renewable resources
GB0812186D0 (en) 2008-07-03 2008-08-13 Dow Corning Modified polyolefins
GB0812185D0 (en) 2008-07-03 2008-08-13 Dow Corning Polymers modified by silanes
MY169163A (en) 2008-09-15 2019-02-19 Danisco Us Inc Increased isoprene production using the archaeal lower mevalonate pathway
ZA201102111B (en) * 2008-09-15 2013-10-30 Danisco Us Inc Reduction of carbon dioxide emission during isoprene production by fermentation
CA2759700A1 (en) 2009-04-23 2010-10-28 Danisco Us Inc. Three-dimensional structure of isoprene synthase and its use thereof for generating variants
CN102414033A (zh) 2009-04-30 2012-04-11 道康宁公司 硅烷改性的弹性体组合物
TW201120213A (en) * 2009-06-17 2011-06-16 Danisco Us Inc Polymerization of isoprene from renewable resources
TWI434921B (zh) 2009-06-17 2014-04-21 Danisco Us Inc 從生物異戊二烯組合物製造燃料成分之方法及系統
SG181605A1 (en) * 2009-12-18 2012-07-30 Danisco Us Inc Purification of isoprene from renewable resources
GB201000120D0 (en) 2010-01-06 2010-02-17 Dow Corning Process for forming crosslinked and branched polymers
GB201000117D0 (en) 2010-01-06 2010-02-17 Dow Corning Organopolysiloxanes containing an unsaturated group
GB201000121D0 (en) 2010-01-06 2010-02-17 Dow Corning Modified polyolefins
BR112012028049A2 (pt) * 2010-05-05 2015-11-24 Genomatica Inc organismo microbiano de ocorrência não natural e método para produzir butadieno, meio de cultura, butadieno biossintetizado, composição, produto químico orgânico, polímero e uso de butadieno biossintetizado
EP2582649A1 (en) 2010-06-17 2013-04-24 Danisco US Inc. Fuel compositions comprising isoprene derivatives
US8651403B2 (en) * 2010-07-21 2014-02-18 E I Du Pont De Nemours And Company Anhydrous ammonia treatment for improved milling of biomass
EP2633043A2 (en) 2010-10-27 2013-09-04 Danisco US Inc. Isoprene synthase variants for improved production of isoprene
US20120206714A1 (en) * 2011-02-10 2012-08-16 DIRAmed Shutter Assembly with Calibration Material
US11066682B2 (en) * 2011-04-01 2021-07-20 Genomatica, Inc. Methods and compositions for improved production of fatty acids and derivatives thereof
US9778243B2 (en) * 2011-06-14 2017-10-03 The Coca-Cola Company Methods for measuring renewable bio-source content in renewable bioplastic materials
EP2771460B1 (en) 2011-10-27 2017-04-26 Danisco US Inc. Isoprene synthase variants with improved solubility for production of isoprene
US9163263B2 (en) 2012-05-02 2015-10-20 The Goodyear Tire & Rubber Company Identification of isoprene synthase variants with improved properties for the production of isoprene
JP6010343B2 (ja) * 2012-05-21 2016-10-19 株式会社ブリヂストン イソプレン−ブタジエン共重合体、イソプレン−ブタジエン共重合体の製造方法、ゴム組成物及びタイヤ
JP6010342B2 (ja) * 2012-05-21 2016-10-19 株式会社ブリヂストン イソプレン−ブタジエン共重合体、イソプレン−ブタジエン共重合体の製造方法、ゴム組成物及びタイヤ
JP6074160B2 (ja) * 2012-05-22 2017-02-01 株式会社ブリヂストン ゴム組成物およびタイヤの製造方法
JP6074161B2 (ja) * 2012-05-22 2017-02-01 株式会社ブリヂストン ゴム組成物およびタイヤの製造方法
JP6010347B2 (ja) * 2012-05-30 2016-10-19 株式会社ブリヂストン イソプレン重合体の製造方法
JP5997939B2 (ja) * 2012-05-31 2016-09-28 株式会社ブリヂストン 共役ジエン系重合体の製造方法
JP5997938B2 (ja) * 2012-05-31 2016-09-28 株式会社ブリヂストン ブタジエン重合体の製造方法及びタイヤの製造方法
JP6025413B2 (ja) * 2012-06-15 2016-11-16 株式会社ブリヂストン 共役ジエン化合物と非共役オレフィンとの共重合体、該共重合体の製造方法、ゴム組成物及びタイヤ
JP6025412B2 (ja) * 2012-06-15 2016-11-16 株式会社ブリヂストン 共役ジエン化合物と非共役オレフィンとの共重合体、該共重合体の製造方法、ゴム組成物及びタイヤ
JP5638041B2 (ja) 2012-07-25 2014-12-10 住友ゴム工業株式会社 タイヤ用ゴム組成物、タイヤ部材、及び空気入りタイヤ
WO2014074872A1 (en) 2012-11-09 2014-05-15 Bridgestone Corporation Uses of biobased styryene
US9850512B2 (en) 2013-03-15 2017-12-26 The Research Foundation For The State University Of New York Hydrolysis of cellulosic fines in primary clarified sludge of paper mills and the addition of a surfactant to increase the yield
US9951363B2 (en) 2014-03-14 2018-04-24 The Research Foundation for the State University of New York College of Environmental Science and Forestry Enzymatic hydrolysis of old corrugated cardboard (OCC) fines from recycled linerboard mill waste rejects
WO2016015021A1 (en) 2014-07-24 2016-01-28 The Regents Of The University Of California Oxidative starch degradation by a new family of pmos
KR20170116159A (ko) * 2015-02-19 2017-10-18 다니스코 유에스 인크. 향상된 단백질 발현
CN107531821A (zh) * 2015-04-30 2018-01-02 株式会社普利司通 聚异戊二烯的生产方法
JP6557102B2 (ja) * 2015-09-17 2019-08-07 日立造船株式会社 ポリイソプレンの製造方法
US10859650B2 (en) 2016-06-29 2020-12-08 Bridgestone Corporation Methods for determining plant rubber content with low field NMR
CN110668538B (zh) * 2019-09-20 2021-10-22 济南大学 一种聚合氯化钛的制备方法
CN113634357B (zh) * 2021-08-23 2024-02-13 云南国钛金属股份有限公司 一种四氯化钛收尘渣的回收方法
US11350694B1 (en) * 2021-08-27 2022-06-07 Cole Haan Llc Article of footwear comprising dandelion foam latex materials
CN116790018A (zh) 2022-03-16 2023-09-22 可汉有限责任公司 制造蒲公英乳胶鞋部件的方法

Family Cites Families (54)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2331635A (en) * 1941-01-03 1943-10-12 Cincinnati Time Recorder Co Form issuing machine
US3149182A (en) 1957-10-28 1964-09-15 Shell Oil Co Process for preparing block copolymers utilizing organolithium catalysts
US3146278A (en) 1958-04-29 1964-08-25 British Hydrocarbon Chem Ltd Production of conjugated diolefins
GB1025432A (en) 1963-05-13 1966-04-06 Rikagaku Kenkyusho Process for producing isoprene
US3231635A (en) 1963-10-07 1966-01-25 Shell Oil Co Process for the preparation of block copolymers
US3621072A (en) * 1967-12-23 1971-11-16 Sumitomo Chemical Co Process for producing isoprene
US3931136A (en) * 1969-04-11 1976-01-06 Japan Synthetic Rubber Co., Ltd. Catalytic production of a high molecular weight cis-1,4-polyisoprene
JPS493962B1 (es) 1969-08-02 1974-01-29
US3574780A (en) 1969-08-08 1971-04-13 Sumitomo Chemical Co Method for producing isoprene
US3972955A (en) * 1973-09-22 1976-08-03 Bayer Aktiengesellschaft Process for preparation of isoprene
NL7409855A (nl) 1974-07-22 1976-01-26 Stamicarbon Werkwijze voor de bereiding van isopreen.
US4000209A (en) * 1975-11-05 1976-12-28 Monsanto Company Isoprene production and catalyst therefor
US4067923A (en) 1976-01-21 1978-01-10 Vladimir Alexandrovich Belyaev Process for producing isoprene
US4385151A (en) * 1980-12-05 1983-05-24 Sumitomo Rubber Industries, Ltd. Composition containing isoprene polymer
US4430487A (en) * 1982-09-16 1984-02-07 The Goodyear Tire & Rubber Company Shortstop for synthetic cis-1,4-polyisoprene
US4511751A (en) 1982-10-14 1985-04-16 Kuraray Company, Ltd. Process for producing isoprene
DE3707434A1 (de) * 1986-05-31 1987-12-03 Huels Chemische Werke Ag Polyisoprene mit einem hohen anteil von 1,2- und 3,4-struktureinheiten, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
JPS6317911A (ja) * 1986-05-31 1988-01-25 ヒユ−ルス・アクチエンゲゼルシヤフト １、２−および３、４−構造単位の割合の多いポリイソプレン、その製造方法およびその用途
CA2035229A1 (en) * 1990-10-22 1992-04-23 Wen-Liang Hsu Process for preparing a rubbery terpolymer of styrene, isoprene and butadiene
US5061765A (en) * 1990-10-22 1991-10-29 The Goodyear Tire & Rubber Company Process for the synthesis of a high vinyl isoprene-butadiene copolymer
US5082906A (en) 1990-10-24 1992-01-21 The Goodyear Tire & Rubber Company Catalyst for the synthesis of crystalline 3,4-polyisoprene
US5177290A (en) * 1991-01-10 1993-01-05 Exxon Chemical Patents Inc. Isoprene process
RU2027760C1 (ru) * 1991-02-01 1995-01-27 Казанский институт биологии Способ получения жидких углеводородов
US5242984A (en) * 1991-07-29 1993-09-07 Shell Oil Company Sequentially polymerized styrene-isoprene-styrene block copolymer adhesive composition
US6239253B1 (en) * 1992-08-05 2001-05-29 Kao Corporation Deproteinized natural rubber and process for producing the same
MY137265A (en) * 1992-08-05 2009-01-30 Kao Corp Methods for elevating or lowering the green strength of a natural rubber
WO1995004134A1 (en) 1993-08-02 1995-02-09 Genencor International, Inc. Method of reducing complex carbohydrates in fermentation products
DE69515697T2 (de) * 1994-12-22 2000-11-02 Mitsubishi Rayon Co Blockcopolymere und verfahren zur herstellung
US5849970A (en) * 1995-06-23 1998-12-15 The Regents Of The University Of Colorado Materials and methods for the bacterial production of isoprene
US5652304A (en) * 1995-08-31 1997-07-29 The Goodyear Tire & Rubber Company Vapor phase synthesis of rubbery polymers
US5919876A (en) * 1995-08-31 1999-07-06 The Goodyear Tire & Rubber Company Synthesis of cis-1,4-polyisoprene rubber
US5677402A (en) * 1995-09-22 1997-10-14 The Goodyear Tire & Rubber Company Process for preparing 3,4-polyisoprene rubber
US6204320B1 (en) * 1999-02-12 2001-03-20 The Goodyear Tire & Rubber Company Liquid isoprene-butadiene rubber
US6313216B1 (en) * 2000-09-01 2001-11-06 The Goodyear Tire & Rubber Company Synthesis of styrene-isoprene rubber
US6627721B1 (en) * 2002-09-19 2003-09-30 The Goodyear Tire & Rubber Company Functionalized elastomers
CN1272351C (zh) * 2000-12-14 2006-08-30 米其林技术公司 获得具有高顺式－1,4键含量的聚异戊二烯的方法
EP2055773B1 (en) 2001-04-04 2011-06-15 Danisco US Inc. Uncoupled productive and catabolic host cell pathways
US6576728B1 (en) * 2001-10-31 2003-06-10 The Goodyear Tire & Rubber Company Process for preparing styrene-isoprene rubber
US6780948B2 (en) * 2002-03-28 2004-08-24 The Goodyear Tire & Rubber Company Synthesis of polyisoprene with neodymium catalyst
US6933358B2 (en) * 2002-08-16 2005-08-23 The Goodyear Tire & Rubber Company Functionalized monomers for synthesis of rubbery polymers
MXPA05003382A (es) 2002-10-04 2005-06-22 Du Pont Proceso para la produccion biologica de 1,3-propanodiol con alto rendimiento.
EP1862540B1 (en) 2003-05-29 2011-09-14 Genencor International, Inc. Novel trichoderma genes
US7091150B2 (en) * 2003-12-19 2006-08-15 The Goodyear Tire & Rubber Company Synthetic polyisoprene rubber
US7183089B2 (en) * 2004-05-21 2007-02-27 The Regents Of The University Of California Method for enhancing production of isoprenoid compounds
US7271218B2 (en) * 2004-06-25 2007-09-18 The Goodyear Tire & Rubber Company Liquid polymer
RU2005130843A (ru) * 2005-10-04 2007-04-10 Евгений Иванович Багаев (RU) Способ получения углеводородов нормального и разветвленного строения
SG191671A1 (en) * 2007-12-13 2013-07-31 Danisco Us Inc Cultured cells that produce isoprene and methods for producing isoprene
US20090246430A1 (en) * 2008-03-28 2009-10-01 The Coca-Cola Company Bio-based polyethylene terephthalate polymer and method of making same
AU2009240505B2 (en) * 2008-04-23 2013-09-05 Danisco Us Inc. Isoprene synthase variants for improved microbial production of isoprene
AU2009269147B2 (en) * 2008-06-30 2013-08-22 Danisco Us Inc. Polymers of isoprene from renewable resources
WO2010031076A2 (en) * 2008-09-15 2010-03-18 Danisco Us Inc. Conversion of prenyl derivatives to isoprene
MY169163A (en) * 2008-09-15 2019-02-19 Danisco Us Inc Increased isoprene production using the archaeal lower mevalonate pathway
ZA201102111B (en) * 2008-09-15 2013-10-30 Danisco Us Inc Reduction of carbon dioxide emission during isoprene production by fermentation
WO2010031077A1 (en) * 2008-09-15 2010-03-18 Danisco Us Inc. Increased isoprene production using mevalonate kinase and isoprene synthase

Also Published As

Publication number Publication date
WO2010005525A1 (en) 2010-01-14
RU2011103204A (ru) 2012-08-10
RU2505605C2 (ru) 2014-01-27
KR20110038087A (ko) 2011-04-13
ZA201100028B (en) 2012-03-28
BRPI0913875A2 (pt) 2017-01-17
EP2307552B1 (en) 2022-10-26
AU2009269147A1 (en) 2010-01-14
EP2307552A4 (en) 2011-12-28
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